JPWO2011086985A1 - 耐塩性、耐熱性、エタノール耐性、凝集沈降性に優れたエタノール発酵性酵母およびその利用 - Google Patents
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Abstract
Description
[1](a)2.0MのKClを含有するYPD培地で生育可能であり、(b)糖分15%(w/w)、灰分5〜6%(w/w)を含有する廃糖蜜希釈液を原料として、培養温度40℃で7〜10%(v/v)のエタノールを生産し、(c)グルコース5%含有YPD培地にて35℃で12時間攪拌培養後、攪拌を停止してから1分以内に凝集沈降することを特徴とする酵母。
[2]糖分15%(w/w)、灰分5〜6%(w/w)を含有する廃糖蜜希釈液を原料として、培養温度38℃で8回以上の繰り返し回分培養が可能であることを特徴とする前記[1]に記載の酵母。
[3]糖分15%(w/w)、灰分5〜6%(w/w)を含有する廃糖蜜希釈液を原料として、培養温度40℃で4回以上の繰り返し回分培養が可能であることを特徴とする前記[1]または[2]に記載の酵母。
[4]サッカロミセス セレビシエに属することを特徴とする前記[1]〜[3]のいずれかに記載の酵母。
[5]サッカロミセス セレビシエBA11株(受託番号NITE BP−793)またはサッカロミセス セレビシエBA16株(受託番号NITE BP−794)である前記[4]に記載の酵母。
[6]前記[1]〜[5]のいずれかに記載の酵母を用いることを特徴とするエタノール製造方法。
[7]廃糖蜜を含有する原料を用いることを特徴とする前記[6]に記載のエタノール製造方法。
本発明の酵母は、以下の(a)、(b)、(c)の特性を有するものであればよい。
(a)2.0MのKClを含有するYPD培地で生育できる。
(b)糖分15%(w/w)、灰分5〜6%(w/w)を含有する廃糖蜜希釈液を原料として、培養温度40℃で7〜10%(v/v)のエタノールを生産する。
(c)グルコース5%含有YPD培地にて35℃で12時間攪拌培養後、攪拌を停止してから1分以内に凝集沈降する。
(d)糖分15%(w/w)、灰分5〜6%(w/w)を含有する廃糖蜜希釈液を原料として、培養温度38℃で8回以上の繰り返し回分培養が可能である。
(e)糖分15%(w/w)、灰分5〜6%(w/w)を含有する廃糖蜜希釈液を原料として、培養温度40℃で4回以上の繰り返し回分培養が可能である。
(1)前培養;500mlバッフル付三角フラスコを用いて、5%グルコースを含むYPD培地100mLに凍結保存酵母株(例えば、15%グリセロール中で−80℃保存した酵母株)を2白金耳分植菌し、38℃、170rpmで24時間振盪培養する。続いて、5%グルコース含有YPD培地3Lを入れた5Lジャーファーメンターに、培養液の全量を投入し、38℃、200rpm撹拌、0.5VVM通気の条件で24時間培養する。
(2)本培養;100L酒母槽に、糖分10%(w/w)となるように水で希釈した廃糖蜜希釈液(最終濃度0.8%の硫安添加したもの)60Lを入れ、その中に前培養液3Lを投入し、38℃、20HZ撹拌、0.5VVM通気の条件下で24時間培養する。
(3)発酵;10,000L発酵槽に糖分15%(w/w)、灰分5〜6%(w/w)となるように水で希釈した廃糖蜜(最終濃度0.8%の硫安添加したもの)4275Lを入れ、その中に214Lの上記培養菌体液を投入し、40℃、緩速撹拌(150rpm)、通気循環量15m3/hr条件下で17時間培養する。
本発明のエタノール製造方法は、上記本発明の酵母を用いるものであればよい。したがって、エタノール製造における個々の具体的な工程は特に限定されない。例えば、非特許文献1、非特許文献2等に記載された公知のバイオエタノールの製造方法から使用する原料等に応じて適宜選択し、使用することができる。
バイオアカデミア株式会社保存株のうちアルコール耐性、高温耐性、凝集沈降性に優れたサッカロミセス セレビシエBA6株に対して、公知の突然変異誘導法(大嶋泰治編、酵母の分子遺伝学実験法、学会出版センター、1996年)に従い、EMS(エチルメタンスルフォネート)処理を加え、菌体を0.1M燐酸緩衝液(pH7.0)で洗浄後、高耐塩性、耐熱性を有する株を選択する目的で1.2M KClを含むYPD培地(酵母エキス10g、ポリペプトン20g、グルコース20g、水1000mL)中、42℃の培養温度で液体培地および寒天培地でスクリーニングした。最終的にグルコース20%と1.2M KClを含むYPD培地で培養し、エタノール発酵性(発酵速度および残糖)、凝集沈降性(沈降速度の目視)を指標にしてBA11株を選択した。沖縄産廃糖蜜(サトウキビから3回砂糖を回収した廃糖蜜)を水で希釈して糖分を約15%(w/w)含有するように調整した培養液中でBA6株およびBA11株を40℃で培養したところ、エタノール発酵性および凝集沈降性においてBA11株がBA6株より優れていることを確認した。サッカロミセス セレビシエBA11株は受託番号NITE BP−793として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(〒292−0818日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)に国際寄託済みである(受託日:2009年8月11日)。
バイオアカデミア株式会社保存株のうち凝集沈降性とアルコール耐性において優れたサッカロミセス セレビシエBA5株と上記BA11株を細胞融合し、BA11株の特徴を維持しつつ凝集沈降性およびエタノール発酵能が向上した酵母株の作出を試みた。細胞融合は両菌株に別々の遺伝的マーカーをつけて、ポリエチレングリコールによって融合させ、遺伝的マーカーを相補する融合株を選択する公知の方法(大嶋泰治編、酵母の分子遺伝学実験法、学会出版センター、1996年)に従って行った。融合株を1.2M KClを含むYPD培地で42℃にて培養し、続いて同じ組成のYPD平板培地でコロニーを形成させ、生育の良いコロニーを選択した。選択したコロニーを、沖縄産廃糖蜜(サトウキビから3回砂糖を回収した廃糖蜜)を水で希釈して糖分を約15%(w/w)含有するように調整した培養液を用いて40℃で培養し、最もエタノール発酵性に優れたBA16株を選択した。BA16株は、BA11株の特徴を維持するとともに、高温でのエタノール生産能力と凝集沈降性においてBA11株より優れていることを確認した。サッカロミセス セレビシエBA16株は受託番号NITE BP−794として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(〒292−0818日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)に国際寄託済みである(受託日:2009年8月11日)。
KClを含まないYPD寒天培地および2.0MのKClを含むYPD寒天培地に、BA11株、BA16株、BA6株およびS288C株(出芽酵母遺伝学研究用の標準株)の4種類の酵母をそれぞれ接種し、35℃で24時間培養した。
2.0MのKClを含むYPD寒天培地の結果を図1に、KClを含まないYPD寒天培地の結果を図2に示した。図1および図2から明らかなように、KClを含まないYPD寒天培地ではすべての菌株が生育できたが、2.0MのKClを含むYPD寒天培地では、BA6株およびS288C株は生育できなった。この結果は、BA11株およびBA16株が非常に優れた耐塩性を有していることを示すものである。
沖縄産廃糖蜜(サトウキビから3回砂糖を回収した廃糖蜜)を水で約3倍に希釈して糖分15%(w/w)、灰分5〜6%(w/w)を含有するように調整し、この廃糖蜜希釈液を原料として、BA11株の発酵性能を検討した(培養方法の詳細は実施例6を参照)。結果を表1に示した。
BA11株を、グルコース5%含有YPD培地100mLを入れた200mLの三角フラスコ中で、恒温振とう培養機を用いて35℃、回転数150rpmの条件下で12時間攪拌培養した。攪拌を停止して100mLビーカーに移し1分後の状態を図3に示した。図3から明らかなように、BA11株は攪拌停止から1分以内に凝集沈降して液層の濁りがなくなった。
BA11株、BA16株およびS288C株(出芽酵母遺伝学研究用の標準株)を、グルコース5%含有YPD培地を入れた三角フラスコ中で、恒温振とう培養機を用いて35℃、回転数150rpmの条件下で12時間攪拌培養した。各酵母の培養液を十分混和して同時にメスシリンダーに移して静置した。静置直後(スタート)および1分経過後に写真を撮影し、沈降性を比較した。
結果を図4に示した。図4から明らかなように、S288C株は全く沈降性が認められなかった。1分間の静置により、BA11株およびBA16株とも液層の濁りが目視で認められなくなり、液層と菌体層に分離した。BA16株の方がBA11株より優れた沈降性を示した。
沖縄産廃糖蜜(サトウキビから3回砂糖を回収した廃糖蜜)を水で約3倍に希釈して糖分約15%(w/w)、灰分5〜6%(w/w)を含有するように調整した廃糖蜜希釈液を原料とした。従来株Aは33℃で培養し、BA11株は38℃で培養してエタノール生産性と糖の減少を測定した。具体的には、BA11株は以下の方法で培養を行った。
(1)前培養;−80℃の冷凍庫に15%グリセロール中で保存されていたBA11株を、500mlバッフル付三角フラスコに100mlの5%グルコースを含むYPD培地に2白金耳分を植菌し38℃、170rpmで24時間振とう培養した。5Lジャーファーメンターに5%グルコース含有YPD培地3Lを入れ、その中に培養液全量を投入し38℃、200rpm撹拌、0.5VVM通気の条件下で24時間培養した。
(2)本培養;100L酒母槽に水で糖分が約10%になるように希釈した廃糖蜜(最終濃度0.8%硫安添加)60Lを入れその中に前培養液3Lを投入し、38℃、20Hz撹拌、0.5VVM通気の条件下で24時間培養した。1000L培養槽に同組成の希釈廃糖蜜600Lを入れ、その中にこの培養菌体液30Lを投入し、38℃、20Hz撹拌、0.5VVM通気の条件下で24時間培養した。
(3)発酵;10,000L発酵槽に、糖分約15%(w/w)、灰分5〜6%(w/w)になるように希釈した廃糖蜜(最終濃度0.8%硫安添加)4275Lを入れ、その中に214Lの上記培養菌体液を投入し、38℃、緩速撹拌(150rpm)、通気循環量15m3/hr条件下で17時間培養した。発酵終了後撹拌および通気を停止し約2時間清置することによって、菌体を凝集沈降させて固液を分離し、上清のもろみを抜き出した。
(4)繰り返し回分発酵(回分培養);発酵槽中の沈降菌体液720Lに廃糖蜜希釈液(糖分約15%(w/w)、灰分5〜6%(w/w)、最終濃度0.8%硫安添加)4500Lを加え、(3)と同様の条件下で発酵させた。この操作を繰り返した。
沖縄産廃糖蜜(サトウキビから3回砂糖を回収した廃糖蜜)を水で約3倍に希釈して糖分約15%(w/w)、灰分5〜6%(w/w)を含有するように調整した廃糖蜜希釈液を原料として、BA11株の40℃における繰り返し発酵性能を検討した(培養方法の詳細は実施例6を参照)。
結果を図6に示した。この結果から、BA11株を用いて40℃で4回の繰り返し回分培養が可能であることが確認できた。なお、各バッチの生産性は1バッチ目が2.33g/h・L、2バッチ目が2.35g/h・L、3バッチ目が2.11g/h・L、4バッチ目が1.67g/h・Lであった。
沖縄産廃糖蜜(サトウキビから3回砂糖を回収した廃糖蜜)を水で約3倍に希釈して糖分約15%(w/w)、灰分5〜6%(w/w)を含有するように調整した廃糖蜜希釈液を原料として、BA11株およびBA16株の発酵性能を検討した(培養方法の詳細は実施例6を参照)。1回目は30℃で21時間培養し、攪拌を止めて6時間静置して凝集沈降させた。上清を回収して新たに原料を添加し、2回目は38℃で16時間培養し、攪拌を止めて7時間静置した。
結果を図7に示した。BA11株は1コロニー(菱形)BA16株は3コロニー(丸、三角、四角)を使用した。図7から明らかなように、BA16株は、BA11株と同等以上の発酵性能を有しており、特に高温(38℃)での発酵性能はBA11株より優れていることが確認できた。
約3倍希釈した廃糖蜜を含むYPD寒天培地にBA11株を接種し、種々の温度で24時間培養して耐熱性を検討した。対照として清酒酵母K7株(日本醸造協会)を使用した。結果を図8に示した。図8から明らかなように、BA11株は43℃でも生育可能であった。
YPD寒天培地にBA11株およびBA16株を接種し、38℃または43℃で12時間培養して耐熱性を検討した。対照としてS288C株(出芽酵母遺伝学研究用の標準株)を使用した。結果を図9に示した。図9から明らかのようにBA11株およびBA16株は43℃でも生育可能であった。
比較株として、1倍体株SC288C(J. Biol. Chem. 246, 7817-7819. 1971)、2倍体株K14(清酒酵母協会14号、日本醸造協会)、4倍体株SC1333(別名NCYC1333、英国National Collection of Yeast Culture保存株)を用い、BA11株およびBA16株の倍数性を解析した。具体的には、YPD培地で30℃、16時間培養した対数増殖期の細胞をOD660が約0.1になるように希釈し、蛍光色素ヨウ化プロビジウム(PI)で染色した後、フローサイトメトリー法で1細胞あたりのDNA含量と、対応する細胞数を解析した。
結果を図10に示した。図10において各チャートの横軸はDNA含量を表し、縦軸は細胞数を表す。図10から明らかなように、BA11株およびBA16株のDNA含量の分布は、比較菌株のK14(2倍体)と同様であった。したがって、BA11株およびBA16株は、いずれも2倍体であることが確認された。
核のリボゾームRNAをコードする領域(rDNA)は、酵母では細胞あたり約150コピーの繰り返し配列を持ち、転写後スプライスで除かれるITS1、ITS2(Internal Transcribed Spacer 1, 2、図11(A)参照)領域は進化の速度が速いため、同種の中での固有の菌株で異なる場合が多い。そのためITS領域の塩基配列は菌株の識別に用いることが可能である(Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics in “PCR Protocols; A Guide to Methods and Applications”, Academic Press. 1990)。
rDNAのITS1およびITS2領域の塩基配列の決定法、これらの領域の塩基配列の決定およびクローニングに用いたプライマーの配列はKawahataらの文献(Kawahata M. et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 71,1616-1620, 2007)に従った。出芽酵母遺伝学研究用の標準株であるS288C株(1倍体)を対照とした。BA11株、BA16株およびS288C株からそれぞれDNAを抽出し、PCR法でITS1およびITS2領域のDNAを増幅した。得られたDNA断片をプラズミドにクローニングして塩基配列を解析した。
BA11株およびBA16株がヘテロな配列の領域を持つことは両株が細胞融合法で作成されたヘテロ2倍体であることと合致している。BA11株およびBA16株がITS領域において少なくとも4箇所の配列が対照株と異なること、並びに上記Kawahataらの文献で解析されたSaccharomyces cerevisiae 29株のいずれとも異なるユニークな配列を有していることが判明したので、ITS領域の塩基配列はBA11株およびBA16株の識別に極めて有効であると考えられる。
Claims (7)
- (a)2.0MのKClを含有するYPD培地で生育可能であり、
(b)糖分15%(w/w)、灰分5〜6%(w/w)を含有する廃糖蜜希釈液を原料として、培養温度40℃で7〜10%(v/v)のエタノールを生産し、
(c)グルコース5%含有YPD培地にて35℃で12時間攪拌培養後、攪拌を停止してから1分以内に凝集沈降する
ことを特徴とする酵母。 - 糖分15%(w/w)、灰分5〜6%(w/w)を含有する廃糖蜜希釈液を原料として、培養温度38℃で8回以上の繰り返し回分培養が可能であることを特徴とする請求項1に記載の酵母。
- 糖分15%(w/w)、灰分5〜6%(w/w)を含有する廃糖蜜希釈液を原料として、培養温度40℃で4回以上の繰り返し回分培養が可能であることを特徴とする請求項1または2に記載の酵母。
- サッカロミセス セレビシエに属することを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の酵母。
- サッカロミセス セレビシエBA11株(受託番号NITE BP−793)またはサッカロミセス セレビシエBA16株(受託番号NITE BP−794)である請求項4に記載の酵母。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の酵母を用いることを特徴とするエタノール製造方法。
- 廃糖蜜を含有する原料を用いることを特徴とする請求項6に記載のエタノール製造方法。
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