KR100955945B1

KR100955945B1 - 알코올 생산성이 높은 사카로미세스 세레비시아 및 이를이용한 에탄올 제조방법

Info

Publication number: KR100955945B1
Application number: KR1020070140882A
Authority: KR
Inventors: 최기욱; 김율; 강현우
Original assignee: 주식회사 창해에탄올
Priority date: 2007-12-28
Filing date: 2007-12-28
Publication date: 2010-05-03
Also published as: KR20090072689A

Abstract

본 발명은 고온에서 에탄올 생산능력이 우수한 사카로미세스속 균주 및 균체의 응집성이 뛰어나고, 발효능이 우수한 사카로미세스 속 균주과 상기 균주들을 이용한 에탄올 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 사카로미세스 속 균주는 고온에서 에탄올 생산능력이 우수하여 에탄올 제조방법에 이용하는 경우, 그 효율이 뛰어나고, 특히, 발효능과 응집성 모두 우수한 사카로미세스 세레비시아 속 균주인 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321를 이용하여 균체 고정화 연속식 공정으로 에탄올을 제조하는 경우에는 고농도의 균체 확보가 가능하므로, 산업적 유용성이 매우 크다 할 것이다.

사카로미세스 세레비시아, 에탄올, 발효

Description

알코올 생산성이 높은 사카로미세스 세레비시아 및 이를 이용한 에탄올 제조방법{A HIGHLY PRODUCTIVE SACCAROMYCES CEREVISIAE AND METHOD OF PREPARING ETHANOL USING BY THE SAME}

본 발명은 고온에서 에탄올 생산능력이 우수하거나, 또는 균체의 응집성이 뛰어나고 에탄올 생산능력이 우수한 사카로미세스 세레비시아 균주 및 이를 이용한 에탄올 제조방법에 관한 것이다.

발효는 기원전부터 시작된 기술이나, 1866년 이르러서야, 파스퇴르(Pasteur)의 연구 결과로부터 과학적으로 분석되고 산업적으로 개발되게 되었다. 또한, 전통적으로 에탄올 발효란 과당과 같은 당분이 효모에 의하여 이산화탄소와 에탄올로 분해하여 이루어지는 발효를 의미한다.

상기 에탄올 발효를 이용하여 전분질로부터 에탄올을 제조하기 위한 공정이 산업적으로 이용되어 왔다. 통상적으로 상기 에탄올 생산 공정은 전분질의 전처리, 당화, 발효 및 정제공정으로 실시되며, 보다 구체적으로는 전처리 공정에서는 전분질의 호화 및 액화반응이 진행되고, 당화공정은 당화효소를 이용하여 수행하며, 상기 발효공정은 당화된 전분질의 발효와 당화되지 못한 전분질의 당화를 수행 하는 단계로 효모세포를 이용하여 수행하고, 상기 발효공정에서 수득한 에탄올을 정제공정을 통하여 고순도의 에탄올로 제조된다.

바이오 에탄올은 연료용, 음료용으로 사용될 뿐만 아니라, 의약품, 화장품 및 공업용 원료 등의 많은 용도로 사용되고 있어, 해마다 그 제조량이 증가되고 있다. 이 때문에 보다 값싸고 생산성이 높은 에탄올 제조 기술의 개발이 요구되고 있다.

바이오 에탄올의 산업적 생산방법으로는 회분 발효 방식, 반연속식 발효 방식 및 연속식 발효 방식이 있고, 연속식 발효조법에는 단일 연속식 방식, 직열 연속식 방식 및 균체재순환 연속발효 방식 등이 있다.

종래에 음료용 에탄올의 산업적 생산은 전통적인 배치 발효 방식(Batch Process) 또는 회분 발효 방식을 이용하여 수행하였다

상기 배치 발효 방식은 효모세포를 이용하여 발효를 수행한 후, 효모세포를 회수, 재사용하기 위해서는 방대한 작업과 경비를 필요로 하는 것이므로, 경제적으로 불리한 것이었다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여, 근래에는 연속식 공정에 의한 방식(Continuous process)이 제공되었으며, 일 예로, 원심분리기를 이용한 반송 회분 발효 방식이나 균체를 순환 혹은 순환하지 않는 다단계 연속 발효법이 주로 사용되고 있다.

통상적으로 사카로미세스 속 균주인 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)의 경우, 최적생장 조건은 30 ℃ 전후이고, 최적 에탄올 발효 조건은 약 33℃이고 이 보다 높은 온도에서는 급격히 발효능이 저하되는 문제점이 있다. 기존에 고온에서 생산성이 높은 균주를 개발하기 위한 시도가 여러 번 있었으나, 실제 개발된 균주의 발효수율이 낮아 실제 공정에 적용할 수 없다는 문제점이 있다.

따라서, 상기 에탄올 발효를 이용하여 에탄올을 제조하는 제조방법의 공정 전체의 생산성은 에탄올 발효 균주의 생산성에 의해 결정된다. 따라서, 고농도 및 고온 조건(약 38 ℃)에서 높은 생산성을 가지는 효모의 개발이 요구된다.

또한, 상기 연속식 공정을 이용하는 기존의 발효 방식은 효모의 배양과 발효를 동시에 진행하거나 발효를 수행한 후, 효모세포를 회수하고 재사용하여 생산성을 증가시키는 방법을 수행하고 있으나, 기존의 방식은 효모의 계속적인 사용이 불가능하여 생산성이 저하되는 문제점을 갖고 있다. 이러한 문제점을 극복하기 제공된 방법이 자체고정화균체 연속식 공정 또는 고정화균체 연속식 공정에 의한 방식이다.

상기 연속식 공정에 의하는 경우, 응집성이 낮은 균주는 발효과정에서 균체의 유지가 어려워 고농도의 균체 확보 및 유지가 용이하지 아니하므로, 연속식 공정에 의한 에탄올 제조방법의 경우 응집성이 높은 균주의 개발이 요구된다.

통상적으로 사카로미세스 속 균주 중 사카로미세스 세레비시아의 경우 균체의 계속적인 사용과 농축을 위해 요구되는 응집성이 낮아, 고정화 균체의 연속식 공정에 적합하지 않다는 문제점이 있다. 한편, 사카로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus)의 경우, 응집성이 우수하다는 점에서는 연속식 공정에 적합하나, 사카로미세스 세레비시아에 비하여 에탄올 발효의 수율이 낮으므로 전체 에탄올 제조 공정의 수율이 떨어진다는 문제점이 있다.

따라서, 에탄올 발효의 생산성과 균체의 계속적인 사용을 위해 요구되는 응집성이 모두 우수한 균주의 개발이 요구된다.

본 발명은 발효능이 우수하여 효모를 이용한 에탄올 발효에 의한 에탄올 제조방법에 적합한 사카로미세스 속 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 발효능이 우수하고 균체의 응집성이 뛰어난 연속식 공정에 의한 에탄올 제조방법에 적합한 사카로미세스 속 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 사카로미세스 속 균주를 이용한 에탄올 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 토양으로부터 분리되고, 고온에서도 에탄올 생산성이 우수한 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)와 사카로미세스 바야누스 (Saccharomyces bayanus) 균주를 원형질 융합하여 제조되고, 고온에서도 에탄올 생산성이 우수하며, 응집성이 뛰어난 사카로미세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 상기 균주를 이용하여 에탄올 발효를 수행하는 단계를 포함하는 에탄올 제조방법을 제공한다.

본 발명자들은 사카로미세스 속 균주의 경우, EMS를 이용하여 돌연변이를 유 도하거나, 원형질 융합을 통하여 두 종류의 균주의 우수한 형질을 모두 가진 새로운 우량형질의 잡종세포를 제조할 수 있다는 사실로부터 착안하여, 상기 EMS를 이용한 돌연변이 유도 기술 또는 원형질 융합 기술로 제조된 미생물 중에서 응집성이 뛰어나고 에탄올 발효능이 우수한 신규한 사카로미세스 세레비시아 균주를 검출하여 미생물을 검출하여 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 있어서, 에탄올 발효란 과당과 같은 당분이 효모에 의하여 이산화탄소와 에탄올로 분해하여 이루어지는 발효를 의미한다.

본 발명에 있어서, 원형질 융합(protoplast fusion)이란 서로 다른 형질을 가진 두 세포를 융합하여 두 세포의 좋은 형질을 모두 가진 새로운 우량형질의 잡종 세포를 만드는 기술로, 일분 원생동물에서 핵의 융합이 없이 두 개의 반수체 세포의 원형질이 결합하는 경우도 이에 해당된다. 주로 효모에 있어서, 고온내성, 에탄올 내성 및 당 내성 등을 증가시키기 위해 많이 사용된다. 상기 원형질 융합은 두 균주를 대수기 상태로 배양한 후, 각각 적정 완충액(buffer) 조건 하에서 라이티케이즈(Lyticase) 등의 효소로 처리하여 세포벽을 제거한 후, 원형질(protoplast) 상태의 두 세포를 융합 완충액(buffer) 조건에서 혼합하여 융합을 유도하는 방법으로 수행한다.

본 발명은 대한민국 전라북도에 위치한 에탄올 생산 공장의 토양으로부터 분리되고, 종래의 균주에 비하여 고온, 보다 상세하게는 35 내지 38℃의 조건에서도 에탄올 생산성이 우수한 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)인 사 카로미세스 세레비시아 CHY 1011(Saccharomyces cerevisiae CHY 1011)에 관한 것이다.

상기 사카로미세스 세레비시아 CHY 1011는 대전광역시 유성구 어은동 52번지 305-333에 위치한 한국생명공학연구원에 2007년 12월 21일자로 기탁되어, 수탁번호 KCTC 11250BP를 부여받았다.

본 발명의 발명자는 효모 균주로 분리된 균주에 대하여 EMS(ethyl methane sulfonate)로 변이시킨 돌연변이 중에서, 40℃에서 배양가능한 균주를 선별하였고, 상기 선별된 균주 중에서 에탄올 발효 속도 및 발효능이 가장 우수한 것으로 최종 선별된 균주를 CHY 1011라고 지칭하였다.

상기 CHY 1011 균주는 26S rDNA D1/D2 염기서열 및 ITS 염기서열을 분석하고, 기존 균주와의 상동성을 검색한 결과, 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)로 확인되었으며, 이에 본 발명의 균주를 사카로미세스 세레비시아 CHY 1011(Saccharomyces cerevisiae CHY 1011)라고 명명하였다.

보다 구체적으로는, 서열번호 5 및 도 1에 기재된 사카로미세스 세레비시아 CHY 1011의 26S rDNA D1/D2 염기서열 및 ITS 염기서열을 이용하여 계통발생론적으로 분석한 결과 상기 CHY 1011는 사카로미세스 세레비시아로 동정되었으며, 그 결과를 계통발생론적 관계를 나타낸 도 2 및 도 5에 나타내었다.

상기 사카로미세스 세레비시아 CHY 1011의 형태학 및 생태학적 측정 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 균주는 타원형이고, 통성 혐기성이며, 상기 균주는 10 내지 45℃, 바람직하게는 15 내지 40℃와 pH 2.5 내지 7, 바람직하게는 pH 4 내 지 6, 더욱 바람직하게는 pH 4 내지 5에서 생육할 수 있고, 생육 최적 온도가 26 내지 35℃, 바람직하게는 28 내지 32℃이며, 발효 최적 온도가 30 내지 40℃, 바람직하게는 33 내지 38℃이다. 상기 균주는 30 내지 40℃에서 발효비율이 80% 내지 95%일 수 있고, 바람직하게는 35 내지 40℃에서 발효비율이 87% 내지 91%, 더욱 발람직하게는 37 내지 40℃에서 발효비율이 88% 내지 90%일 수 있다.

본 발명의 사카로미세스 세레비시아 CHY 1011는 에탄올 발효과정에 있어서 현저하게 우수한 에탄올 생산성을 나타낼 뿐만 아니라, 종래의 균주와 달리38℃의 고온에서도 우수한 에탄올 생산성을 유지할 수 있는 것으로 확인되었다.

또한, 본 발명은 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)와 사카로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus) 균주를 원형질 융합하여 제조되고, 사카로미세스 바야누스 보다 발효능이 우수하고, 사카로미세스 세레비시아 CHY 1011(Saccharomyces cerevisiae CHY 1011)와 발효능이 대등하며, 사카로미세스 바야누스(Saccharomyces bayanus) 균주와 대등한 정도의 우수한 응집성을 갖는 사카로미세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae)인 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321(Saccharomyces cerevisiae CHFY 0321)에 관한 것이다.

상기 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321는 대전광역시 유성구 어은동 52번지 305-333에 위치한 한국생명공학연구원에 2007년 12월 18일자로 기탁되어, 수탁번호 KCTC 11249BP를 부여받았다.

본 발명의 발명자는 사카로미세스 세레비시아 CHY 1011와 사카로미세스 바야누스 KCCM 12633을 원형질 융합하여 제조한 균주 중에서, 응집성이 뛰어나고 에탄 올 생산성도 우수한 균주를 선별하였고, 상기 균주를 CHFY 0321라고 지칭하였다.

상기 CHFY 0321 균주는 26S rDNA D1/D2 염기서열 및 ITS 염기서열을 분석하고, 기존 균주와의 상동성을 검색한 결과, 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)로 확인되었으며, 이에 본 발명의 균주를 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321(Saccharomyces cerevisiae CHFY 0321)라고 명명하였다.

보다 구체적으로는 서열번호 6 및 도 4에 기재된 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321의 26S rDNA D1/D2 염기서열 및 ITS 염기서열을 이용하여 계통발생론적으로 분석한 결과 상기 CHFY 0321는 사카로미세스 세레비시아로 동정되었으며, 그 결과를 계통발생론적 관계를 나타낸 도 2 및 도 5에 나타내었다.

상기 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321의 형태학 및 생태학적 측정 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 상기 균주는 난형 또는 타원형이고, 액체 배양시 응집성으로 인해 수십개에서 수백개의 개체가 군락을 이루고 자라며, YPD agar(yeast extract + peptone) 배지상에서 약간 융기된 유배색의 매끄러운 표면을 갖는 집락을 형성하여 단단하게 뭉쳐있고, 통성 혐기성이다. 상기 균주는 10 내지 45℃, 바람직하게는 15 내지 39℃와 pH 2.5 내지 7, 바람직하게는 pH 4 내지 6, 더욱 바람직하게는 pH 4 내지 5에서 생육할 수 있고, 생육 최적 온도가 26 내지 35℃, 바람직하게는 28 내지 32℃이며, 발효 최적 온도가 30 내지 40℃, 바람직하게는 33 내지 38℃, 더욱 바람직하게는 32 내지 36℃이며, 최적 응집 pH가 pH 4 내지 6, 바람직하게는 pH 4 내지 5이다. 상기 균주는 30 내지 40℃에서 발효비율이 80% 내지 92%일 수 있고, 바람직하게는 35 내지 39℃에서 발효비율이 86% 내지 90%, 더욱 발 람직하게는 36 내지 38℃에서 발효비율이 87% 내지 89%일 수 있다.

본 발명의 균주는 높은 온도에서 우수한 에탄올 생성능을 유지할 수 있어서, 당화과정을 동시에 수행할 수 있으며, 발효과정에서 최적온도를 유지하기 위한 냉각비용을 절감할 수 있다는 유리한 효과가 있다.

본 발명의 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321은 에탄올 발효과정에 있어서 현저하게 우수한 에탄올 생산성을 나타내고, 고온에서도 사카로미세스 세레비시아 CHY1011과 같이 우수한 에탄올 생산성을 유지할 뿐만 아니라, 응집성이 매우 우수한 것으로 확인되었다.

또한, 본 발명은 본 발명의 사카로미세스 세레비시아를 이용하여 에탄올 발효를 수행하는 단계를 포함하는 에탄올 제조방법을 제공한다.

상기 제조방법은 사카로미세스 세레비시아 균주를 이용하여 전분 및 포도당으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 기질로부터 에탄올을 생산하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 에탄올 제조방법은 효모, 구체적으로는 사카로미세스 세레비시아 균주를 이용하는 에탄올 제조방법일 수 있으며, 일 예로 회분식 공정, 반연속식 공정 및 연속식 공정으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있고, 사카로미세스 세레비시아 균주를 이용하여 전분, 다당류, 이당류 및 포도당으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상, 바람직하게는 전분, 이당류 및 포도당으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 기질로부터 에탄올을 생산하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 이당류는 설탕(sucrose)일 수 있다.

본 발명의 에탄올 제조방법은 상기 사카로미세스 세레비시아 균주가 사카로미세스 세레비시아 CHY1011이고, 상기 에탄올 제조방법이 회분식 또는 반연속식 공정에 의한 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 다른 에탄올 제조방법은 상기 사카로미세스 세레비시아 균주가 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321이고, 상기 에탄올 제조방법이 연속식 제조 공정, 바람직하게는 자체고정화균체 연속식 공정에 의한 것일 수 있다. 상기 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321는 에탄올 생산성이 우수할 뿐만 아니라 응집성이 뛰어나, 상기 자체고정화균체 연속식 공정에 적합하기 때문에, 상기 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321를 이용하여 자체고정화균체 연속식 공정으로 에탄올을 제조하는 경우, 우수한 에탄올 생산성을 나타낼 수 있다.

일 예로, 상기 연속식 공정은 전분질의 전처리 공정, 당화공정, 발효공정 및 정제공정을 포함하는 에탄올 제조방법일 수 있다.

상기 전분질의 전처리 공정에서는 전분질의 호화단계, 액화단계 및 고형물 분리단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 호화반응은 전분질 원료와 액화효소를 담금수에 혼합한 후 증기를 투입하여 실시할 수 있으며, 상기 액화반응은 호화된 전분질을 액화 탱크에서 온도 및 시간을 조절하여 액화시킬 수 있다.

상기 발효공정은 상기 사카로미세스 세레비시아를 이용하여 에탄올 발효를 수행하는 것일 수 있다. 상기 발효공정에서는 당화된 전분질이 발효되며, 당화되지 못한 전분질의 경우, 당화가 지속된다. 상기 효모의 성질을 이용하여 상기 당화단계와 발효단계는 동시에 수행할 수 있다.

또한, 상기 발효 공정의 경우 실질적으로 발효뿐 아니라 당화도 진행되기 때 문에 당화공정이 생략 가능하다.

또한, 상기 제조방법의 구체적인 예로는 에탄올 발효조 내에 전분 및 포도당으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 기질을 연속적으로 공급하고, 상기 기질 및 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321즉, 사카로미세스 세레비시아 균주(기탁번호 KCTC 11249BP)를 이용하여 에탄올 발효를 수행하여 에탄올을 생산하고, 상기 에탄올을 포함하는 발효액을 연속적으로 배출하는 단계를 포함하는 연속식 공정으로 수행하고 사카로미세스 세레비시아 균주(기탁번호 KCTC 11249BP)를 이용하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 사카로미세스 세레비시아 균주(기탁번호 KCTC 11249BP)의 응집 최적 조건에서 반응을 수행하여, 연속식 공정에서 균주의 손실을 최소화하기 위하여, 상기 반응을 pH 4 내지 6, 바람직하게는 pH 4 내지 5에서 수행할 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 사카로미세스 세레비시아 CHY 1011 고온에서 발효능이 매우 우수하고, 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321는 고온에서 발효능이 우수하여 사카로미세스 세레비시아 CHY 1011 발효능과 대등할 뿐만 아니라, 사카로미세스 세레비시아에 비하여 응집성이 매우 우수하므로, 이를 이용하여 에탄올을 제조하는 경우, 특히 연속식 공정으로 에탄올 발효를 통하여 에탄올을 제조하는 경우, 발효능이 우수할 뿐만 아니라 연속식 공정에서도 고농도의 균체 확보가 가능하여 그 산업적 이용가치가 매우 크다 할 것이다.

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> CHY 1011의 분리 및 동정

1-1. 돌연변이 및 발효눙이 우수한 균주의 분리

대한민국 전라북도에 소재한 에탄올 생산 공장의 토양 샘플을 채취 후, 효모 균주들을 분리하였다. 상기 토양 샘플을 멸균된 증류수에 1:1 비율로 혼합하여 토양속에 있는 미생물이 증류수 안에 부유하도록 하여 상등액을 100 마이크로리터 피펫을 사용하여 항생제, 구체적으로 테트라사이크린 50 ppm과 암피실린 50 ppm을 첨가한 YPD 배지(Yeast Extract(Difco): 3.0 g/L, Peptone(Difco): 5.0 g/L, Glocose(대상): 110.0 g/L)에 배양하여 기포가 발생한 시험구를 다시 항생제 처리한 YPD 아가 배지(Yeast Extract(Difco): 3.0 g/L, Peptone(Difco): 5.0 g/L, Glocose(대상): 110.0 g/L, Agar: 20 g/L(Junsei))에 도말하여 배지 위에 생성된 미생물 집락을 현미경으로 관찰하여 형태학적 특징으로 효모여부를 구분하여, 효모를 분리하였다.

상기 분리된 효모들은 5% 에탄올이 첨가된 YPD 배지에서 배양하여, 에탄올 내성을 가진 균주를 선별하였고, 상기 선별된 에탄올 내성을 가진 균주를 타피오카 분말을 이용한 발효배지에서 발효하여 에탄올 생성 속도와 생성량이 우수한 균주를 분리하였다.　 상기 타피오카 분말을 이용한 배지는 230 g/L의 농도로 타피오카 분 말을 포함하는 것으로 전처리과정(호화, 액화 및 당화)를 통하여 생산된 상업용 발효배지이고, 상기 발효는 35℃에서 96시간 동안 수행하였다.

상기 에탄올 생산능력이 우수한 것으로 확인되어 분리된 균주는 1mg/ml 농도의 EMS로 1시간 동안 처리하여 돌연변이를 유도하였고,　상기 화학적 처리로 돌연변이가 유도된 균주는 YPD agar plate에 도말(spreading)하고, 40℃에서 배양하여, 고온조건에서 생장가능한 균주만을 선별하였다.

상기 고온조건에서 생장한 콜로니로부터 수득한 균주를 3회 계대 배양하고, 동일 고온조건에서 안정적으로 생장할 수 있는 균주만을 선별하였으며, 상기 고온조건에서 안정적으로 생장 가능한 것으로 확인된 돌연변이 균주에 대하여 에탄올 발효 실험을 수행하였다.

상기 에탄올 발효 실험은 산업적 균주로의 활용여부를 확인하기 위하여, 산업적 에탄올 발효 배지인　카사바 분말을 이용한 발효배지와 그 당화액을 사용하였으며, 발효 속도 및 발효능이 우수한 균주를 최종적으로 선별하였으며, 그 균주를 CHY 1011로 지칭하였다.

1-2. 발효능이 우수한 균주의 동정

상기 고온에서 생장가능하고, 발효생산성이 우수한 것으로 확인된 CHY 1011 균주에 대해 형태학적 관찰 결과 및 26S rDNA D1/D2 및 ITS에 대하여 DNA sequencing을 수행한 결과를 기초로 동정하였다.

상기 형태학적 관찰 결과, 상기 균주는 타원형이고, 출아법에 의해 번식이 가능하며, 통성 혐기성이고, 생육온도가 15 내지 40℃이며, 생육 최적 온도가 28 내지 32℃이고, 발효 최적 온도가 33 내지 38℃인 것으로 확인되었다.

구체적으로, 효모 균주 동정을 위한 염기 서열의 분석은 26S rDNA D1/D2 서열 결정을 통한 분자생물학적 분류와 ITS(internal transcribed spacer) 서열 결정을 통한 분자생물학적 분류를 이용하였다. DNA sequencing은 하기와 같은 방법으로 수행하였다.

우선 상기 CHY1011 균주를 배양하고, 상기 배양액에 대해 원심분리를 수행하여 균체를 회수한 후에, 상기 균체로부터 genomic DNA 추출하였다. 상기 추출된 genomic DNA에 대하여, 서열번호 1의 ITS5 프라이머(5`-GAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3`)와 서열번호 3의 NL4 프라이머(5`-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3`)를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 26S rDNA D1/D2와 ITS 지역을 포함한 1500bp 가량의 DNA를 증폭하였다.

상기 PCR을 수행한 조건은 하기 표 1 및 표 2와 같다.

중합효소연쇄반응 Mixture 조성

	사용량(ul)
주형(10ng/ul)	1
Primer (F,R) 10pmole/ul	각 2
10X Taq pol buffer(Takara, Japan)	5
dNTP(Takara, Japan)	4
Taq polymerase(Takara, Japan)	0.3
D.W.	35.7
합계	20

중합효소연쇄반응 조건

	온도	Cycle number
Predenaturation	95 ℃ / 5 min
Amplification	95 ℃ / 30 sec	30
	54 ℃ / 30 sec
	72 ℃ / 90 sec
Final Extension	72 ℃ / 7 min

상기 PCR 산물은 T-vector를 이용하여 클로닝(cloning)하였고, sequencing 의뢰 기관인 SolGent Co.(대한민국)을 통해 염기서열을 분석하여 26S rDNA D1/D2 및 ITS 서열을 확보하였다.

보다 정확한 서열확인을 위해서, Sequencing에는 PCR product 약 1500bp 중 내부에 있는 두 프라이머인 서열번호 4의 NL1 프라이머(5`-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAG-3`) 및 서열번호 2의 ITS4 프라이머(5`-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3`)를 추가적으로 제공하여 분석하였다.

도 8에 상기 PCR 및 Sequencing을 위한 프라이머의 서열 및 그 위치를 나타내었다.

상기 분석결과, 서열번호 5 및 도 1에 나타낸 염기서열을 확인하였으며, 상기 염기서열을 이용하여, 각각 NCBI database에 등록된 타 효모 균주들의 26S rDNA D1/D2 및 ITS region의 염기서열과 상동성(homology) 분석을 수행한 결과, 통해 종과 속은 사카로미세스 세레비시아로 동정되었으며, 기존 보고된 타 사카로미세스 세레비시아의 염기서열과는 다른 고유의 26S rDNA D1/D2 및 ITS 서열을 가지고 있으므로 사카로미세스 세레비시아 CHY 1011이라 명하였다.

< 실시예 2> CHFY 0321 균주의 분리 및 동정

2-1. 돌연변이 유발 및 분리

상기 사카로미세스 세레비시아 CHY1011 은 발효능 즉, 에탄올 생산성이 우수하고, 고온에서도 우수한 에탄올 생산성이 유지되나, 응집성이 없어 자체고정화균체 연속식 공정에 적용하기 적합하지 않고, 사카로미세스 바야누스 KCCM 12633(Saccharomyces bayanus KCCM 12633)은 응집성은 우수하나, 에탄올 생산성이 상기 균주에 비하여 현저하게 낮다.

따라서, 양 균주의 우수한 특성을 확보한 돌연변이 균주를 제조하기 위하여, 두 모균주를 32℃에서 대수기 상태로 배양한 후, 각각 반응완충액(0.06M phosphate buffer, 0.2% β-mercaptoethanol, 0.6M KCl, 0.8M sorbitol)에서 Lyticase(Sigma)를 이용하여 30℃에서 40분간 효소 처리하였다.

상기 각각 효소처리에 의해 세포벽이 제거되어 원형질(protoplast) 상태로 제조된 두 균주를 1:1로 혼합하고, 융합 세척 완충액(0.5M KCl, 10 mM CaCl₂, 10mM Tris-HCl buffer, pH 7.5)로 두 차례 세척한 후, 융합 완충액(40% PEG 4000, 50 mM CaCl₂, 10mM Tris-HCl buffer, pH 7.5)를 이용하여 30℃에서 20분간 처리하여 융합을 유도하였다.

상기 융합을 유도하기 위해 제조된 혼합액을 희석하여 아가 배지에 도말하고, 32℃ 조건에서 배양하였다.

상기 배양에 의해 콜로니를 형성한 균주를 수득한 후, YPD 배양액 10ml씩 담긴 시험관에 32℃ 조건에서 18시간가량 배양한 후, 5초간 볼텍싱(voltexing)하여, 각 균주의 응집 여부를 육안으로 확인하였으며, 상기 확인결과 응집성을 갖지 않은 균주를 1차 선별에서 제외시켰다.

상기 응집성을 갖고 있는 것으로 확인되어 선별된 응집성 균주들의 유전적 안정성을 확보하기 위하여, 수차례 계대 배양을 통해 한 후 그 이후에도 동일한 응집성을 갖는 균주만을 2차 선별하였다.

상기 2차 선별된 균주들에 대해, 실시예 1과 같은 방법으로 에탄올 발효 실험을 수행하였으며, 각 균주들의 발효능을 비교하여 사카로미세스 세레비시아 CHY 1011의 수준으로 우수한 에탄올 생산효율을 나타내는 균주를 최종 우수 균주로 선별하여 CHFY 0321라고 명명하였다.

2-2. 변이주의 동정

상기 CHFY 0321에 대하여 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 genomic DNA를 주형으로 하여, 26S rDNA D1/D2 및 ITS 부위를 증폭하였고, 상기 증폭된 서열에 대하여 DNA sequencing을 수행하여 유전자 서열을 확인하였으며, 그 결과를 서열번호 6 및 도 4에 나타내었다.

상기 형태학적 관찰 결과 및 생태학적 관찰 결과, 상기 균주는 난형 또는 타원형이고, 출아법에 의해 번식가능하며, 액체 배양시 응집성으로 인해 수십개에서 수백개의 개체가 군락을 이루고 자라고, YPD agar(yeast extract + peptone) 배지상에서 약간 융기된 유백색의 매끄러운 표면을 갖는 집락을 형성하여 단단하게 뭉쳐있으며, 통성 혐기성이고, 생육온도가 15 내지 39℃이며, 생육 최적 온도가 28 내지 32℃이고, 발효 최적 온도가 32 내지 36℃이며, 최적 응집 pH가 pH 4 내지 5인 것으로 확인되었다.

보다 구체적으로는 상기 분석결과, 서열번호 6 및 도 4에 나타낸 염기서열을 확인하였으며, 상기 염기서열을 이용하여, 각각 NCBI database에 등록된 타 효모 균주들과 모균주들의 26S rDNA D1/D2 및 ITS region의 염기서열과 상동성(homology) 분석을 수행한 결과, 통해 종과 속은 사카로미세스 세레비시아로 동정되었으며, 기존 보고된 타 사카로미세스 세레비시아의 염기서열 및 모 균주의 염기서열과는 다른 고유의 26S rDNA D1/D2 및 ITS 서열을 가지고 있으므로 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321이라 명하였다.

상기 NCBI database를 이용한 상기 균주들의 26S rDNA D1/D2 및 ITS region의 염기서열 분석결과 및 상기 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321와 상기 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321의 모균주인 사카로미세스 세레비시아 CHY1011와 사카로미세스 바야누스 KCCM 12633(Saccharomyces bayanus KCCM 12633)의 염기서열 분석결과를 하기 표 3 및 표 4에 나타내었다. NCBI database를 26S rDNA D1/D2 및 ITS region의 염기서열 분석결과를 표 3에 나타냈다. 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321와 모균주의 26S rDNA D1/D2 및 ITS region의 염기서열 분석결과를 표 4에 나타내었다.

< 실시예 3> CHY 1011와 CHFY 0321 균주의 발효능 확인

본 발명에서 발효능 실험은 각 3회를 실시하여 그 평균값을 최종 측정값으로 결정하였으며, 발효비율(%)은 원료에 포함된 전분으로 이론상 생성할 수 있는 에탄올 량(g)에 대한 실제발효를 통해 얻어진 에탄올 량(g)의 % 값으로 측정하였다. 상기 발효비율을 측정한 측정식은 "실제발효를 통해 얻어진 에탄올 량(g)/원료에 포함된 전분으로 이론상 생성할 수 있는 에탄올 량(g)×100(%)"이었다.

3-1. 발효능 확인

전분이 70%인 카사바 분쇄물 230g에 물을 가하여 전체량을 1L로 조절한 후, 액화효소(Termanyl 120L, NOVO 사)를 상기 카사바 분쇄물에 대하여 0.08 중량%(w/w) 첨가하고, 90℃에서 2시간 동안 반응시켜 증자한 후에, 35℃로 냉각하였다.

상기 증자 및 냉각을 수행한 반응액에 카사바 분쇄물에 대하여 0.63 중량%(w/w)의 당화효소(Asperfillus Usamii mut, Shiro-usamii, 이오엔자임, 대한민국) 를 첨가하여 최종 배지를 제조하였다.

상기 실시예 1 및 실시예2에서 수득한 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321와 상기 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321의 모균주인 사카로미세스 세레비시아 CHY1011와 사카로미세스 바야누스 KCCM 12633를 YPD 배지에서 배양한 배양액을 최종 반응액의 전체량의 7 %(v/v, 70㎖/L) 첨가하고, 38℃에서 발효반응을 수행하면서, 시간별로 에탄올 량을 측정하여 그 결과를 도 9에 나타내었다. 상기 에탄올 량의 분석은 HPLC 및 간이 증류후 밀도계로 분석하였다.

상기 도 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 사카로미세스 세레비시아 CHY1011 균주는 사카로미세스 바야누스 KCCM 12633에 비하여 월등히 우수한 에탄올 생산수율을 나타내는 것으로 확인되었고, 에탄올 생산 속도도 월등이 빠른 것으로 확인되었다. 또한, 본 발명의 변이균주인 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321의 경우, 모균주인 사카로미세스 세레비시아 CHY1011와 거의 동등한 에탄올 생산 수율을 나타내는 것으로 확인되었다. 상기 결과로부터, 본 발명의 사카로미세스 세레비시아 CHY1011 균주와 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321 균주는 산업적으로 매우 유용할 것으로 확인되었다.

3-2. 회분식 배양의 균체생성

상기 실시예 1 및 실시예2에서 수득한 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321와 상기 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321의 모균주인 사카로미세스 세레비시아 CHY1011와 사카로미세스 바야누스 KCCM 12633를 YPD 배지 100 ㎖에 접종하여 12시간 동안 진탕 배양한 후, 상기 균주 배양액 100 ㎖ 를 원심 분리하고, 상등액을 제거한 후에, 증류수로 3회 세척하고 55℃에서 12시간 동안 건조 후 무게를 측정하여 균체량을 측정하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다.

상기 도 10에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 사카로미세스 세레비시아 CHY1011 균주는 사카로미세스 바야누스 KCCM 12633에 비하여 회분식 균체 배양 결과가 월등히 우수한 것으로 나타나, 상기 균주는 그 우수한 에탄올 생산성과 함께 균체 배양 속도도 빨라, 회분식 에탄올 제조방법에 이용할 경우 매우 유용할 것으로 확인되었다. 또한, 본 발명의 변이균주인 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321의 경우, 모균주인 사카로미세스 세레비시아 CHY1011와 거의 동등한 균체 배양 속도가 확인되어, 본 발명의 사카로미세스 세레비시아 CHY1011 균주와 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321 균주는 산업적으로 매우 유용할 것으로 확인되었다.

3-3. 에탄올 생성을 위한 배양온도

또한, 상기 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321에 대하여 최적 온도 조건을 측정하기 위하여, 상기 조건에서 반응 온도를 각 32℃, 35℃ 및 38℃에서 수행하면서 에탄올 량을 측정하여 그 결과를 도 11 및 표 5에 나타내었다.

상기 도 11에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 변이균주인 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321의 경우, 32℃ 뿐만 아니라, 35℃ 와 38℃에서도 에탄올 생산수율이 우수한 것으로 확인되어, 고온에서도 우수한 생산수율을 나타내었으므로, 고온 발효 조건에서도 우수한 에탄올 생산 수율을 나타낼 수 있어서 그 산업적 효과가 매우 클 것으로 예상되었다.

3-4. 연속식 배양의 균체생성

상기 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321, 사카로미세스 세레비시아 CHY1011 및 사카로미세스 바야누스 KCCM 12633를 이용하여 연속식 공정 균체배양을 수행하였다. 보다 구체적으로는, 균체 배양액 70㎖를 투입 후, 1L 배양 용기에 발효용 배지를 125㎖/hr로 연속적으로 공급하면서 경과시간 별 건조균체량을 측정하여 연속식 공정 균체배양을 수행하였으며, 그 결과를 도 12에 나타내었다.

상기 도 12에 나타낸 바와 같이, 응집성이 낮은 본 발명의 사카로미세스 세레비시아 CHY1011 균주는 균체수가 감소하는 것으로 확인되었으며, 응집성이 우수한 사카로미세스 바야누스 KCCM 12633는 기존의 회분식 공정에서 균체배양을 수행한 결과 유사한 결과를 나타내었다.

한편, 본 발명의 변이균주인 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321의 경우, 응집성이 우수하여 기존의 회분식 공정에서 균체배양을 수행한 결과 유사한 결과를 나타내었으며, 응집성과 에탄올 발효능이 우수한 상기 균주의 특성을 기초로 예상한 바와 같이, 가장 우수한 배양속도 및 균체성장율을 나타내었다. 상기 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321의 배양속도 및 균체성장율은 모균주인 사카로미세스 세레비시아 CHY1011 균주와 사카로미세스 바야누스 KCCM 12633에 비하여 월등히 우수한 것으로 확인되어, 상기 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321 균주는 연속식 공정 특히, 자체고정화균체 연속식 공정으로 에탄올 발효를 수행할 경우, 그 산업적 효과가 매우 클 것으로 예상되었다.

< 실시예 4> CHY 1011와 CHFY 0321 균주의 응집성 확인

본 발명에서 응집성 실험은 각 3회를 실시하여 그 평균값을 최종 측정값으로 결정하였다.

4-1. 응집성 확인

상기 실시예 1 및 실시예2에서 수득한 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321와 상기 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321의 모균주인 사카로미세스 세레비시아 CHY1011와 사카로미세스 바야누스 KCCM 12633를 액상 YPD 배양배지를 이용하여 대수기까지 배양한 후, 원심분리기를 사용하여 균체만을 수집하고 증류수로 3회 세척하였다.

상기 세척된 균체는 증류수를 동일 부피로 채워 잘 섞은 후, 응집되 효모가 충분히 풀어지도록 강하게 볼텍싱(vortexing)하였다. 그 후, 초음파처리기(sonicator)로 약 10초간 처리하여 효모의 응집을 해체하고, 볼텍싱(vortexing)하여 응집을 유도한 후, UV spectrophotometer를 이용하여 660nm의 파장대에서 시간경과에 따른 흡광도 변화를 측정하였다. 응집이 잘되는 균주일수록 서로 응집하여 침강하므로, 상등액이 맑아져 빠른 시간에 흡광도가 감소할 것으로 예상되었다.

상기 응집성 확인을 육안으로 측정한 결과를 도 13에 나타내었다. 초음파처리기를 이용하여 효모의 응집을 해체한 후, 볼텍싱(vortexing)하여 응집을 유도한 직후의 도 13a와 시간이 경과되어 응집이 일어난 후인 도 13b를 비교한 결과, 상기 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321와 사카로미세스 바야누스 KCCM 12633는 시간이 경과한 후, 상등액이 맑아져 우수한 응집성을 나타내는 것으로 예상되었고, 상기 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321의 모균주인 사카로미세스 세레비시아 CHY1011의 경우, 상등액의 탁도가 거의 변화하지 아니하여 응집성이 현저히 떨어지는 것으로 확인되었다.

상기 응집성 확인을 660nm의 파장대에서 O.D.값을 확인하여 측정한 결과를 도 14에 나타내었다. 상기 도 14에 나타낸 바와 같이, 응집성에 대한 결과는 육안으로 측정한 결과와 같이 상기 사카로미세스 세레비시아 CHY1011의 경우, 거의 응집하지 못하는 것으로 확인되었으나, 상기 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321의 경우, 사카로미세스 바야누스 KCCM 12633에 비해서도 우수한 응집성을 나타내는 것으로 확인되었다.

4-2. PH 조건에 따른 응집성 확인

또한, 각 pH별 응집성을 측정하였다.

보다 구제척으로, pH별 응집성은 YPD 액체 배지에서 배양된 균체만을 증류수로 3회 세척한 후, 500 ㎕의 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321 균주(cell)을 pH가 조절된 2%-Glucose 10 ml에 첨가하고 상기와 같이, 초음파처리기(sonicator)로 약 10초간 처리하여 효모의 응집을 해체한 후, 볼텍싱으로 5초간 교반하고 3분간 35℃에서 보정하여 상등액의 흡광도를 UV spectrophotometer를 이용하여 660nm의 파장대에서 측정하였다.

상기 측정한 결과를 도 15에 나타내었다. 상기 측정 결과, 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321가 가장 우수한 응집성을 나타내는 pH는 pH 4 내지 5인 것으로 확인되었다. 상기 측정한 결과, 상기 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321가 가장 우수한 응집성을 나타내는 pH는 pH4 내지 5인 것으로 확인되었다.

이는 상기 균체의 연속식 공정 적용 시, 우수한 응집성을 유지하는 중요한 요인으로 작용할 수 있으므로, 공급되는 배양액의 pH를 조절하는 기준일 될 수 있다.

< 실시예 5> CHY 1011와 CHFY 0321 균주의 세대 안정성 확인

상기 실시예2에서 수득한 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321의 세대 안정성을 세대별 응집성 실험과 생장성 실험을 통하여 확인하였다. 상기 실험을 통하여 측정된 측정값은 상기 실험을 각 3회 실시하여 그 평균값을 최종 측정값으로 결정하였다.

상기 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321를 계대 배양하면서, 각 세대별 구체적으로는, 5세대, 10세대, 15세대, 20세대, 25세대 및 30세대에 대하여 상기 실시예 3-1의 회분식 균체 배양 방법과 실시예 3-2의 흡광도 변화를 이용한 응집성 측정 방법으로 생장성 및 응집성을 확인하여 세대 안정성을 확인하였다.

상기 확인된 결과를 도 16 및 도 17과 하기 표 6 및 표7에 나타내었다.

상기 도 16 및 도 17과 상기 표 6 및 표 7에 나타낸 바와 같이, 세대를 거듭하여 30세대가 된 경우에도 상기 변이 균주의 응집성 및 생장성에 변화가 없는 것으로 확인하여, 상기 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321 균주는 세대 안정성이 우수한 것으로 확인되었으며, 상기 측정 결과 상기 균주를 회분식 및 연속식 어느 방법에 의해서도 이용이 가능하고, 상기 균주의 응용이 매우 자유로워 그 산업적 효과가 매우 클 것으로 예상되었다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 사카로미세스 세레비시아 CHY 1011의 26S rDNA D1/D2 및 ITS 염기서열이다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 사카로미세스 세레비시아 CHY 1011 및 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321의 26S rDNA D1/D2 염기서열을 기초로 한 다른 미생물과의 계통발생론적 관계를 나타내는 표이다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 사카로미세스 세레비시아 CHY 1011 의 형태를 확인한 현미경 사진이다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321의 26S rDNA D1/D2 및 ITS 염기서열이다.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 사카로미세스 세레비시아 CHY 1011와 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321의 ITS 염기서열을 기초로 한 다른 미생물과의 계통발생론적 관계를 나타내는 표이다

도 6 은 본 발명의 일 실시예에 따른 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321의 형태를 확인한 현미경 사진이다.

도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 사카로미세스 바야누스 KCCM 12633의 형태를 확인한 현미경 사진이다.

도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 사카로미세스 세레비시아의 26S rDNA D1/D2 및 ITS 부위를 증폭하고 염기서열을 확인하기 위한 프라이머를 나타낸 도면이다.

도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321와 모균주의 에탄올 발효능을 측정한 그래프이다.

도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321와 모균주의 회분식 균체 배양 결과를 측정한 그래프이다.

도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 사카로미세스 세레비시아 CHFY 의 온도별 에탄올 발효능을 측정한 그래프이다.

도 12은 본 발명의 일 실시예에 따른 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321와 모균주의 연속식 공정에서의 균체 배양 결과를 측정한 그래프이다.

도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321와 모균주의 응집성을 육안으로 측정한 것으로, 도 13a는 초음파처리기를 이용하여 균체의 응집을 해체한 후, 볼텍싱하여 응집이 시작된 시점의 사진이고, 도 13b는 균체의 응집이 시작된 후 5분 경과 후 사진이다.

도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321와 모균주의 시간 경과에 따른 흡광도 변화를 통해 응집성을 확인한 그래프이다.

도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321의 pH별 응집성을 확인한 그래프이다.

도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321의 세대수 경과별 응집성을 측정한 그래프이다.

도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 사카로미세스 세레비시아 CHFY 0321의 세대수 경과별 균체 배양 정도를 측정한 그래프이다.

<110> Changhae Ethanol Co., Ltd <120> A HIGHLY PRODUCTIVE SACCAROMYCES CEREVISIAE AND METHOD OF PREPARING ETHANOL USING BY THE SAME <130> DPP20074001KR <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS5 primer <400> 1 gaagtaaaag tcgtaacaag g 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS4 primer <400> 2 tcctccgctt attgatatgc 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NL4 primer <400> 3 ggtccgtgtt tcaagacgg 19 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NL1 primer <400> 4 gcatatcaat aagcggagga aag 23 <210> 5 <211> 1458 <212> DNA <213> S. cerevisiae CHY1011 26S rDNA D1/D2 & ITS <400> 5 ggaagtaaaa gtcgtaacaa ggtttccgta ggtgaacctg cggaaggatc attaaagaaa 60 tttaataatt ttgaaaatgg atttttttgt tttggcaaga gtatgagagc ttttactggg 120 caagaagaca agagatggag agtccagccg ggcctgcgct caagtgcgcg gtcttgctag 180 gcttgtaagt ttctttcttg ctattccaaa cggtgagaga tttctgtgct tttgttatag 240 gacaataaaa ccgtttcaat acaacacact gtggagtttt catatctttg caactttttc 300 tttgggcatt cgagcaatcg gggcccagag gtaacaaaca caaacaattt tatttattca 360 ttaaattttt gtcaaaaaca agaattttcg taactggaaa ttttaaaata ttaaaaactt 420 tcaacaacgg atctcttggt tctcgcatcg atgaagaacg cagcgaaatg cgatacgtaa 480 tgtgaattgc agaattccgt gaatcatcga atctttgaac gcacattgcg ccccttggta 540 ttccaggggg catgcctgtt tgagcgtcat ttccttctca aacattctgt ttggtagtga 600 gtgatactct ttggagttaa cttgaaattg ctggcctttt cattggatgt tttttttcca 660 aagagaggtt tctctgcgtg cttgaggtat aatgcaagta cggtcgtttt aggttttacc 720 aactgcggct aatctttttt atactgagcg tattggaacg ttatcgataa gaagagagcg 780 tctaggcgaa caatgttctt aaagtttgac ctcaaatcag gtaggagtac ccgctgaact 840 taagcatatc aataagcgga ggaaaagaaa ccaaccggga ttgccttagt aacggcgagt 900 gaagcggcaa aagctcaaat ttgaaatctg gtaccttcgg tgcccgagtt gtaatttgga 960 gagggcaact ttggggccgt tccttgtcta tgttccttgg aacaggacgt catagagggt 1020 gagaatcccg tgtggcgagg agtgcggttc tttgtaaagt gccttcgaag agtcgagttg 1080 tttgggaatg cagctctaag tgggtggtaa attccatcta aagctaaata ttggcgagag 1140 accgatagcg aacaagtaca gtgatggaaa gatgaaaaga actttgaaaa gagagtgaaa 1200 aagtacgtga aattgttgaa agggaagggc atttgatcag acatggtgtt ttgtgccctc 1260 tgctccttgt gggtagggga atctcgcatt tcactgggcc agcatcagtt ttggtggcag 1320 gataaatcca taggaatgta gcttgcctcg gtaagtatta tagcctgtgg gaatactgcc 1380 agctgggact gaggactgcg acataagtca aggatgctgg cataatggtt atatgccgcc 1440 cgtcttgaaa cacggacc 1458 <210> 6 <211> 1459 <212> DNA <213> S. cerevisiae CHFY0321 26S rDNA D1/D2 & ITS <400> 6 ggaagtaaaa gtcgtaacaa ggtttccgta ggtgaacctg cggaaggatc attaaagaaa 60 tttaataatt ttgaaaatgg atttttttgt tttggcaaga gcatgagagc ttttactggg 120 caagaagaca agagatggag agtccagccg ggcctgcgct taagtgcgcg gtcttgctag 180 gcttgtaagt ttctttcttg ctattccaaa cggtgagaga tttctgtgct tttgttatag 240 gacaattaaa accgtttcaa tacaacacac tgtggagttt tcatatcttt gcaacttttt 300 ctttgggcat tcgagcaatc ggggcccaga ggtaacaaac acaaacaatt ttatctattc 360 attaaatttt tgtcaaaaac aagaattttc gtaactggaa attttaaaat attaaaaact 420 ttcaacaacg gatctcttgg ttctcgcatc gatgaagaac gcagcgaaat gcgatacgta 480 atgtgaattg cagaattccg tgaatcatcg aatctttgaa cgcacattgc gccccttggt 540 attccagggg gcatgcctgt ttgagcgtca tttccttctc aaacattctg tttggtagtg 600 agtgatactc tttggagtta acttgaaatt gctggccttt tcattggatg ttttttttcc 660 aaagagaggt ttctctgcgt gcttgaggta taatgcaagt acggtcgttt taggttttac 720 caactgcggc taatcttttt ttatactgag cgtattggaa cgttatcgat aagaagagag 780 cgtctaggcg aacaatgttc ttaaagttga cctcaaatca ggtaggagta cccgctgaac 840 ttaagcatat caataagcgg aggaaaagaa accaaccggg attgccttag taacggcgag 900 tggagcggca aaagctcaaa tttgaaatct ggtaccttcg gtgcccgagt tgtaatttgg 960 agagggcaac tttggggccg ttccttgtct atgttccttg gaacaggacg tcatagaggg 1020 tgagaatccc gtgtggcgag gagtgcggtt ctttgtaaag tgccttcgaa gagtcgagtt 1080 gtttgggaat gcagctctaa gtgggtggta aattccatct aaagctaaat attggcgaga 1140 gaccgatagc gaacaagtac agtgatggaa agatgaaaag aactttgaaa agagagtgaa 1200 aaagtacgtg aaattgttga aagggaaggg catttgatca gacatggtgt tttgtgccct 1260 ctgctccttg tgggtagggg aatctcgcat ttcactgggc cagcatcagt tttggtggca 1320 ggataaatcc ataggaatgt agcttgcctc ggtaagtatt atagcctgtg ggaatactgc 1380 cagctgggac tgaggactgc gacgtaagtc aaggatgctg gcataatggt tatatgccgc 1440 ccgtcttgaa acacggacc 1459

Claims

생육온도가 10 내지 45℃이고, 에탄올발효 최적온도가 30 내지 40℃이며, 26S rDNA D1/D2 및 ITS 서열이 서열번호 5인 기탁번호 KCTC 11250BP를 갖는 사카로미세스 세레비시아 주(Saccharomyces cerevisiae KCTC 11250BP).
제1항에 따른 기탁번호 KCTC 11250BP을 갖는 사카로미세스 세레비시아 균주와, 기탁번호 KCCM 12633을 갖는 사카로미세스 바야누스 균주를 원형질 융합하여 제조한 것이고, 균체 응집성과 에탄올 발효능을 가지며, 기탁번호 KCTC 11249BP을 갖는 사카로미세스 세레비시아 균주(Saccharomyces cerevisiae KCTC 11249BP).
제2항에 있어서,

상기 사카로미세스 세레비시아 KCTC 11249BP 균주는 생육온도가 15 내지 39℃이며, 에탄올발효 최적온도가 32 내지 36℃이고, 최적 응집 pH가 pH 4 내지 5인 사카로미세스 세레비시아 균주.
제 1 항 또는 제2항의 사카로미세스 세레비시아 균주를 이용하여 전분, 다당류, 이당류 및 포도당으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 기질로부터 에탄올을 생산하는 단계를 포함하는 에탄올 제조방법.
제4항에 있어서,

상기 에탄올 제조방법은 회분식 공정 또는 연속식 공정으로 수행하는 것인 에탄올 제조방법.
제5항에 있어서,

상기 에탄올 제조방법은 에탄올 발효조 내에 전분, 이당류 및 포도당으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 기질을 연속적으로 공급하고, 상기 기질 및 사카로미세스 세레비시아 균주(기탁번호 KCTC 11249BP)를 이용하여 에탄올 발효를 수행하여 에탄올을 생산하고, 상기 에탄올을 포함하는 발효액을 연속적으로 배출하는 단계를 포함하는 연속식 공정으로 수행하고 사카로미세스 세레비시아 균주(기탁번호 KCTC 11249BP)를 이용하는 것을 특징으로 하는 에탄올의 에탄올 제조방법.