KR101073145B1

KR101073145B1 - 고수율 에탄올 생산효모인 사카로마이세스 세레비지애 kk1과 이를 이용한 에탄올발효법

Info

Publication number: KR101073145B1
Application number: KR1020090066590A
Authority: KR
Inventors: 김근
Original assignee: 수원대학교산학협력단
Priority date: 2009-07-22
Filing date: 2009-07-22
Publication date: 2011-10-12
Also published as: KR20110009275A

Abstract

본 발명은 다양한 종류의 작물로부터 고농도의 에탄올을 고수율로 생산할 수 있는 효모 균주를 이용하여 고농도의 에탄올을 고수율로 생산하는 발효방법에 관한 것이다. 본 발명은 12％ 이상의 고농도 에탄올 발효 시 발효 후 잔당이 적고, 에탄올 생산 수율이 10％ 에탄올 발효 생산 시 보다 같거나 더 높은 에탄올 생산 방법을 제공하는데 그 목적이 있다. 현재 에탄올 발효에서는 높은 기질 농도로부터 발효 시 오랫동안 발효를 해도 더 이상 발효되지 않고 당이 많이 남게 되고, 사용된 원료기질 단위 무게 당 에탄올 생산수율은 낮아지는 결과를 나타낸다.

이를 위하여 본 발명은 에탄올을 발효 생산할 때, 고농도 기질의 발효 후 잔당이 적고, 고농도의 에탄올을 고수율로 생산할 수 있는 효모균주를 사용하는 것에 특징이 있다. 현재의 에탄올생산방식은 에너지 수지면에서 개선이 필요하며, 또한 단위 발효용적당 생산성도 좋지 않고, 에탄올 함량이 낮아 증류비용이 많이 요구된다. 고농도 고수율 에탄올 생산 우수 균주의 확보는 에탄올생산성 향상 뿐 아니라 공정개선, 증류비용 감소의 효과가 있다.

에탄올, 고농도, 고수율, 곡류, 효모

Description

고수율 에탄올 생산효모인 사카로마이세스 세레비지애 KK1과 이를 이용한 에탄올발효법{Yeast Saccharomyces cerevisiae KK1 producing ethanol with high yield and the method of ethanol fermentation using the yeast}

본 발명은 고농도의 에탄올을 고수율로 생산하기 위한 발효방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 다양한 종류의 곡물로부터 고농도의 에탄올을 고수율로 생산할 수 있는 효모 균주를 이용하여 고농도의 에탄올을 고수율로 생산하는 발효방법에 관한 것이다.

우리나라에서는 에탄올이 주로 희석식 소주원료로 쓰이는 데 반해, 전 세계적으로는 전체 생산량의 3분의 2가 자동차 등의 수송용 연료로 사용되며, 5분의 1이 산업용이고, 음료용으로는 단지 7분의 1 정도만 사용되고 있다. 에탄올은 현미·보리·밀·옥수수·고구마·감자와 같은 전분질계 작물, 사탕수수와 같은 당질계 원료로부터 생산되어 음료용과 산업용으로 사용되어 왔다. 1970년대 석유파동 때부터 전 세계적으로 석유 대체 연료로서 자동차 수송 연료용 에탄올에 관한 관심이 고조되어 왔는데, 이와 더불어 에탄올 산업은 더욱 활성화될 것으로 전망된다.

현재 주정생산업체의 에탄올 생산은 회분식 발효로서 곡물, 타피오카 등으로 부터 3일간 발효시 에탄올 8-10％(v/v)를 생산하고 있으며, 더 높은 기질 농도로부터 발효 시에는 오랫동안 발효를 해도 더 이상 발효되지 않고 잔당이 많이 남게 된다. 즉 종래의 에탄올 발효에서는 10％ 이상의 고농도에탄올 발효시 기질 농도를 높이면 발효액내에 어느 정도 에탄올 생산 농도는 높아지나, 높은 기질농도와 생성된 에탄올에 의해 효모세포의 대사가 억제를 받아 발효가 저하되어 발효되지 않은 당이 많이 남게 되고, 따라서 사용된 원료기질 단위 무게 당 에탄올 생산수율은 낮아지는 결과를 나타낸다. 따라서 주정업체에서는 발효기질을 최대한 에탄올로 전환하기 위한 적정 농도인 10％ 내외의 에탄올을 생산해오고 있다.

종래기술의 문헌정보

[문헌1] KR 10-0036711-0000 B1 1990-10-16 4쪽 도면1

[문헌2] 이경은, 이재연, 김 근. 작물의 성분함량이 바이오에탄올 생산에 미치는 영향, 한국작물학회지, 2008, Vol. 53, 339-346쪽

본 발명은 12％ 이상의 고농도 에탄올 발효시 발효 후 잔당이 적고, 에탄올 생산 수율이 10％ 에탄올 발효 생산 시 보다 같거나 더 높은 에탄올 생산 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 에탄올을 발효에 의해 생산하는 효 모 균주에 관하여, 고농도 기질 발효 후 잔당이 적고, 고농도의 에탄올을 고수율로 생산할 수 있는 효모균주를 사용하는 것에 특징이 있다.

현재 발효에 의한 바이오에탄올 생산 방식은 당질, 전분질원료를 사용하여 미생물에 의해 발효시켜 제조된다. 그러나, 현재의 에탄올생산방식은 에너지 수지면에서 개선이 필요하고, 또한 단위 발효용적당 생산성도 좋지 않고 에탄올 함량이 낮아 증류비용이 많이 요구된다. 이 때문에 최근 생산성 향상 및 생산비용 절감을 목적으로 새로운 발효기술개발이 진전되었다. 그러나 이러한 발효기술의 개발은 고수율로 고농도의 에탄올을 생산할 수 있는 균주가 요구되고 있다. 즉, 우수한 균주의 확보는 에탄올생산성 향상 뿐 아니라 공정개선, 증류비용 감소의 효과가 있다.

이하, 본 발명의 고농도 고수율 효모에 의한 고농도 고수율 에탄올발효생산을 실시하기 위한 구체적인 내용을 설명하면 다음과 같다. 에탄올 생산에서는 효모 투여에 의한 발효 공정에 앞서 곡물 전처리 공정 있어서 발효원료를 가열하지 않는 무증자 방식과 90℃이상에서 가열하여 액화시키는 증자방식의 두 가지가 있다.

먼저 무증자 방식에서는, 침지한 곡류를 분쇄하여 곡물과 물의 비율이 1:1.3이 되도록 섞은 후, 이 혼합물에 YPD 액체배지에서 배양된 Saccharomyces cerevisiae KK1의 균체를 모아 접종한다. 여기에서 사용되는 원료는 쌀, 보리, 밀, 옥수수, 호밀, 고구마 감자, 타피오카 등의 각종 전분을 함유하는 곡류와 서류가 해당된다. 이 때에 무증자효소로서 Rhizopus sp.의 곡자를 동시에 첨가하여 26℃에 서 원료 전분을 당화하는 것과 동시에 효모에 의해 발효하는 동시당화발효를 실시한다.

증자방식에서는 각 분쇄한 원료 : 증류수의 혼합비율을 1 : 3.4 (기질농도 24.3％, w/v)로부터 1:2.3 (기질농도 36.4％, w/v) 까지 다양한 비율로 혼합한다. 여기에 액화효소 Termamyl SC(Novozyme) α-amylase와 점도저하 복합효소 Viscoferm(Novozyme)을 각각 0.06 g/kg씩 첨가하여 90℃에서 1시간 후 처리 후, 다시 95℃에서 1시간 액화하고, 밀기울에서 배양하여 얻어진 Aspergillus usamii 당화효소 고체 glucoamylase 6.0 g/kg를 첨가하여 60℃에서 1시간 전당화과정을 거친 후 S. cerevisiae KK1효모 균주를 접종하여 33℃에서 3일간 병행복발효한다. 에탄올 생산 수율은 발효 후 생산된 에탄올량(％, v/v)으로부터 기질 1톤당 에탄올 생산량(Liter, 99.5％ 에탄올)의 에탄올 생산수율(Liter/Ton)을 계산한다.

다음에는 사카로마이세스 세레비지애 KK1의 균주의 특성에 대해 설명한다. 사카로마이세스 세레비지애 KK1은 토양에서 분리한 기존의 고농도 에탄올 생성능이 있는 효모를 돌연변이법을 이용하여 균주 개량하여 에탄올생성능이 우수한 균주를 선발하였다. 이와 같이 본 발명자가 개발한 효모의 균학적 성질은 다음과 같다.

(1) 형태학적 성질

말트 익스트랙트 액체배양 a. 형태 : 구형 또는 난형 b. 크기 : (4.62 ～ 7.71) x (5.14 ～ 8.99)㎛ c. 응집성 : 아주 약함

(2) 포자의 형성 : 양성

(3) 의균사의 형성 : 음성

(4) 영양증식의 형식 : 출아법

(5) 생화학적 성질 : KK1 균주는 디-글루코오스, 디-갈락토오스, 알파-메틸-디-글루코사이드, 디셀로바이오스, 디-말토오스, 디-사카로오스, 디-트레할로스, 디-라피노스 등의 당이용능이 있는 것으로 확인되었다.

이 분리된 균주의 동정을 위해 API kit를 이용한 생화학 동정과 rRNA의 ITS 염기서열에 근거한 분자 동정을 동시에 실시하였다.

API Kit를 이용한 생화학적 동정을 위하여 KK1균주는 API 20 C

Kit(BioMerieux, France)를 사용한 생화학적 방법으로 동정하였다. 얻어진 결과는 각 well에서의 최종 반응여부를 +, - 로 구분하고 이 결과를 API 분석프로그램(BioMerieux, France)을 사용하여 동정하였다. 동정결과 KK1 균주는 글루코오스, 디-갈락토오스, 알파-메틸-디-글루코사이드, 디-셀로바이오스, 디-말토오스, 디-사카로오스, 디-트레할로스, 디-라피노스 등의 당이용능이 있는 것으로 확인되었으며 (표1), 이 결과는 사카로마이세스 세레비지애와 99.9％의 상동성을 나타내었다.

ITS 염기서열에 기초한 동정에서는 KK1 균주의 rDNA의 ITS 염기서열 분석을 위해 추출한 genomic DNA를 주형으로 DNA 가닥을 증폭하였다. 사용된 primer는 IST1과 IST4로서 polymerase chain reaction을 수행하였다. 증폭된 DNA는 AccuPrep PCR Purification Kit (Bioneer Co., Lta, Korea)를 이용하여 정제되었다. 증폭 후 정제된 DNA는 Cycle Sequencing (SEQ)과 Automated DNA Sequencer (ABI 3100, Applied Bilsystem Inc., USA)를 이용하여 염기서열을 분석하였고, 상기의 염기서열을 조합하여 NCBI(The National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih)에서 제공하는 Advanced Blast search를 이용하여 Genebank의 염기서열과 비교하였다. KK1 균주의 경우 조사된 754 bp를 검색해본 결과 다양한 사카로마이세스 세레비지애 균주들과 99-100％ 유사도를 나타내었다. 따라서 본 발명자는 KK1 균주를 사카로마이세스 세레비지애 KK1이라 명명하였고, 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁번호 KACC93077P 로 기탁하였다.

＜표 1＞ Carbon utilization of KK1 determined by API 20C AUX V4.0 kit.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하지만 본 발명이 이들 실시예만 국한되는 것은 아니다.

[실시예 1]

침지한 쌀을 분쇄하여 쌀과 물의 비율이 1:1.3이 되도록 섞은 후, 이 혼합물 1리터에 YPD 액체배지에서 2일간 배양된 공시균 사카로마이세스 세레비지애 KK1의 균체를 모아 접종하였다. 이때에 무증자효소로서 Rhizopus sp.의 곡자를 첨가하여 쌀 전분을 당화하는 것과 동시에 효모에 의해 발효하는 동시당화발효를 하였다. 26℃ 항온기에서 7일간 발효시켰으며, 3일, 5일, 7일째에 에탄올 농도를 측정하였다.

실험결과 Saccharomyces cerevisiae KK1 균주는 5일째에 18.9％, 7일째에 19.2％의 에탄올을 생산함으로써 Saf-yeast와 Superstart-yeast의 5일째 각각 15.4％와 15.9％, 7일째 각각 15.5％와 16.6％보다 월등히 높은 에탄올 생산능을 나타내었다 (표 2).

＜표 2＞ 무증자 동시당화발효에 의한 에탄올 생산

[실시예 2]

사용된 4가지 곡류 원료는 농촌진흥청 작물과학원으로부터 공급받았고, 각 분쇄한 원료 : 증류수의 혼합비율을 1 : 3.4 (기질농도 24.3％, w/v) 비율로 혼합하였다. 여기에 액화효소 Termamyl SC(Novozyme) α-amylase와 점도 저하복합효소 Viscoferm(Novozyme)을 각각 0.06 g/kg의 첨가하여 90℃에서 1시간 후 처리 후, 다 시 95℃에서 1시간 액화하고, 밀기울에서 배양하여 얻어진 Aspergillus usamii 당화 고체효소 glucoamylase 6.0 g/kg를 첨가하여 60℃에서 1시간 전당화과정을 일부 거친 후 사카로마이세스 세레비지애 KK1효모 균주를 접종하여 33℃에서 3일간 병행복발효하였다. 실험결과를 표 3에 나타내었는데, 공시균 사카로마이세스 세레비지애 KK1균주는 보리, 옥수수, 트리티케일, 밀 모두에서 대조구인 발연1호와 ATCC26603보다 더 많은 에탄올을 생산하였다.

＜표 3＞ 여러 곡물^a들로부터 효모균주의 에탄올 생산농도 및 수율비교

[실시예 3]

여러 곡물 농도가 에탄올 생산에 미치는 영향을 조사하였다. 에탄올 발효를 위하여 [실시예 2]에 나타낸 동일한 방법으로 곡류를 액화, 전당화한 후 사카로마이세스 세레비지애 KK1효모 균주를 접종하여 병행복발효하였다. 그 결과를 에탄올 수율의 경우 도1에 나타내었다. 전체적으로 볼 때 옥수수, 밀, 보리는 기질 농도 31.5％에서 36.4％로 증가함에 따라 수율이 조금 증가하다가 감소하는 경향을 보였 고, 트리티케일은 기질 농도 31.5％에서 36.4％로 증가함에 따라 수율이 감소하는 경향을 보였다. 이 네 가지 작물 중에서 옥수수가 가장 높은 에탄올 생산 수율을 보였고, 보리가 뚜렷이 가장 낮은 에탄올 생산 수율을 나타냈다. 최적 기질 농도는 보리의 경우 33.5％에서 최대 수율 375 Liter/Ton(이 때 에탄올 생산농도는 12.8％), 옥수수의 경우 32.5％에서 최대 수율 448 Liter/Ton(이 때 에탄올 생산농도는 14.1％), 트리티케일의 경우 33.5％에서 최대 수율 425 Liter/Ton(이 때 에탄올 생산농도는 13.8％), 밀의 경우 31.5％에서 최대 수율 431 Liter/Ton(이 때 에탄올 생산농도는 13.1％)이었다. 이 때 여러 곡물 발효후 남아있는 당은 0.2％이하로서 당이 모두 소진되었다. 이 최대수율은 표3에 나타낸 발연1호와 ATCC26603의 수율보다 크게 증진된 수치이다.

[실시예 4]

타피오카를 grinding mill (Straub Co. Model 4-E, USA)에서 입자의 크기가 20 mesh (850 ㎛2)이하가 되도록 분쇄한 후 삼각플라스크에 타피오카와 물의 혼합비 1:4, 1:3.4, 1:2.8, 즉 초기 당농도 18, 21.5, 25％(w/v)인 타피오카 슬러리로 혼합한 후 Termamyl 120 L(Novozyme) α-amylase를 타피오카 기준으로 0.1％(v/w)가 되도록 넣어주었다. 혼합된 원료를 무압증자로에서 처음 20분 동안 5분 간격으로 잘 흔들어주고 그 후 2시간 동안 증자시켰다. 이 때의 온도는 95-110℃정도이며 액화가 충분히 이루어지도록 하였다. 두 시간의 증자가 끝난 후 삼각 플라스크를 60℃ 넣고 2시간 당화하였다. 여기에 2000-3,000 SP의 곡자(Creastase, Japan)를 투입된 타피오카 분말 그램당 30 SP가 되도록 첨가하여 α-amylase와 glucoamylase 가 충분히 작용하도록 하였다. 이를 식힌 후 여기에 S. cerevisiae KK1효모 균주를 접종하여 33℃에서 3일간 발효하였고 그 결과를 도2에 나타내었다. 여기에서 사카로마이세스 세레비지애 KK1균주는 발연1호에 비해 에탄올 생산능이 우수하였다. 특히 발연1호는 기질 당 농도가 18％에서 25％로 증가함에 따라 에탄올 생산량이 급격히 감소하였으나, KK1균주는 기질 농도가 18％에서 21.5％로 증가 할 때 약간 수율이 감소하였으나 25％에서는 수율이 더 이상 감소하지 않는 우수한 에탄올 생산능을 보였다.

제1도는 KK1균주의 여러 곡류기질농도에서의 에탄올 생산수율비교

제2도는 두 균주의 여러 농도의 타피오카로부터 에탄올 생산수율 비교

<110> University - Industry Collaboration & Consulting Foundation of the University of Suwon <120> Yeast Saccharomyces cerevisiae KK1 producing ethanol with high yield and the method of ethanol fermentation using the yeast <130> 090722 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 754 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 aaatggattt tttttgtttt ggcaagagca tgagagcttt tactgggcaa gaagacaaga 60 gatggagagt ccagccgggc ctgcgcttaa gtgcgcggtc ttgctaggct tgtaagtttc 120 tttcttgcta ttccaaacgg tgagagattt ctgtgctttt gttataggac aattaaaacc 180 gtttcaatac aacacactgt ggagttttca tatctttgca actttttctt tgggcattcg 240 agcaatcggg gcccagaggt aacaaacaca aacaatttta tttattcatt aaatttttgt 300 caaaaacaag aattttcgta actggaaatt ttaaaatatt aaaaactttc aacaacggat 360 ctcttggttc tcgcatcgat gaagaacgca gcgaaatgcg atacgtaatg tgaattgcag 420 aattccgtga atcatcgaat ctttgaacgc acattgcgcc ccttggtatt ccagggggca 480 tgcctgtttg agcgtcattt ccttctcaaa cattctgttt ggtagtgagt gatactcttt 540 ggagttaact tgaaattgct ggccttttca ttggatgttt ttttttccaa agagaggttt 600 ctctgcgtgc ttgaggtata atgcaagtac ggtcgtttta ggttttacca actgcggcta 660 atctttttta tactgagcgt attggaacgt tatcgataag aagagagcgt ctaggcgaac 720 aatgttctta aagtttgacc tcaaatcagg tagg 754

Claims

고농도 및 고수율 에탄올을 생산할 수 있는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) KK1 균주(국립농업과학원 농업유전자원센터 KACC93077P호).
고농도 및 고수율 에탄올을 생산할 수 있는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) KK1(기탁번호 KACC93077P호)를 발효균주로 이용한 에탄올 생산방법.