KR100770607B1 - 내당성 및 내알코올성이 우수한 사카로마이세스 세레비제 ａｄｓ-１１ ｋａｃｃ ９３０４３ｐ 및 그를 이용한 알코올 발효 - Google Patents

내당성 및 내알코올성이 우수한 사카로마이세스 세레비제 ａｄｓ-１１ ｋａｃｃ ９３０４３ｐ 및 그를 이용한 알코올 발효 Download PDF

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Abstract

본 발명은 내당성, 내알코올성이 우수한 사카로마이세스 세레비제 ADS-11 KACC 93043P 및 그를 이용한 알코올 발효에 관한 것으로, 전통 발효주에서 분리한 에이디이스-11 균주는 고농도의 포도당 또는 고농도의 알코올 조건에서도 생육할 수 있는 내당성 및 내알코올성이 우수하며, 상기 균주를 발효시켜 고농도의 에탄올을 생산할 수 있는 효과가 있다. 따라서, 본 발명의 균주는 통상의 알코올 발효뿐만 아니라, 고농도 당 조건, 또는 고농도 알코올 조건에서 에탄올을 생산하는데 사용할 수 있다. 또한 이러한 균주는 향후 균주개발을 위한 연구시스템 또는 균주개량을 위한 유전자 제공의 역할에서도 매우 유용하다.
사카로마이세스 세레비제, 알코올 발효, 내당성, 내알코올성

Description

내당성 및 내알코올성이 우수한 사카로마이세스 세레비제 ＡＤＳ-１１ ＫＡＣＣ ９３０４３Ｐ 및 그를 이용한 알코올 발효{Yeast new strain, Saccharomyces cerevisiae ADS-11 KACC 93043P and a method for preparing fermented liquor using the same}
도 1은 전통 발효주에서 신규 분리된 4종의 발효 효모의 현미경 사진이다.
도 2는 분리된 효모를 동정하기 위한 탄소원 자화능 분석 키트의 분석도이다.
도 3은 분리된 효모의 26S rDNA 유전자 서열에 따른 분류학적 계통분류도를 나타낸 도이다.
본 발명은 내당성 및 내알코올성이 우수한 사카로마이세스 세레비제 ADS-11 KACC 93043P 및 그를 이용한 알코올 발효에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 고농도의 포도당 조건 또는 고농도의 알코올 조건에서도 생육할 수 있는 전통 발효주에서 분리한 내당성 및 내알코올성이 우수한 신규 효모 균주와 상기 균주를 발효시켜 에탄올을 생산하는 방법에 관한 것이다.
효모를 이용하여 알코올을 발효할 때, 발효조 내에 고농도 알코올을 생산하는 것은 알코올 생산성 향상뿐만 아니라, 알코올을 회수하는 증류단계의 경제성 향상에도 중요하다. 고농도 알코올을 생산하기 위해서는, 생산된 알코올에 발효 효모가 사멸되지 않아야 하며, 또한 첨가된 고농도 발효기질에 삼투압 현상에 의한 사멸이 나타나지 않아야 한다. 따라서, 고농도 알코올 생산을 위한 효모균주의 특성으로 높은 내당성 및 내알코올성은 절대적 특성이다.
효모의 내알코올성은 발효조의 배지조성과 발효조건의 변화를 통해 증대시킬 수 있다는 보고(노민정 외, 1991, 한국응용생명화학회지 34, 61-66; 노민정 외, 1991, 한국응용생명화학회지 34, 67-74))가 있으며, 실제 발효조에 불포화지방산, 단백질, 대두분말, 특정의 비타민 및 금속이온을 첨가하여 내알코올성을 증대하고자 하는 연구가 지속적으로 이루어져 왔다. 그러나, 이러한 시도는 경제성 측면과 대량의 산업적 규모에서 적용의 어려움으로 인해 한계를 나타내었으며, 결국 효모 자체의 균학적 특성으로 내알코올성 균주를 선별, 개발하는 것이 유리하다고 판단되고 있다(안병학, 생물산업, 1997, 10, 33-35). 또한 고농도 알코올을 생산하기 위해서는 고농도의 당이 필요하며, 이 경우 삼투압 증대에 따른 균주 사멸이 나타나며, 고농도의 당과 고농도의 알코올이 같이 존재하는 경우 효모의 사멸은 더욱 빠르게 진행되므로, 실제적 이용을 위해서는 우수한 내당성과 내알코올성을 동시에 가지는 균주가 필요한 실정이다.
따라서, 본 발명의 목적은 고농도의 당과 고농도의 알코올이 존재하는 조건에서 우수한 생존능을 갖는 신규 효모 균주를 분리하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 신규 효모 균주를 이용한 알코올 생산방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 상기 목적은 고농도의 알코올과 고농도의 당이 존재하는 발효주에서 발효 효모를 순수분리 및 동정하고, 상기 분리균주의 내당성, 내알코올성, 내산성, 내열성, 20% 및 40% 포도당 발효배지에서의 발효능을 평가함으로써 달성하였다.
이하, 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 발효주에서 발효 효모를 순수분리하는 단계; 상기 분리균주의 당 자화능, 생리적 특성, 및 26S rDNA의 서열을 결정하여 균주를 동정하는 단계; 상기 분리균주의 내당성, 내알코올성, 내산성 및 내열성을 평가하는 단계; 상기 분리균주를 이용하여 20% 및 40% 포도당 발효배지에서의 발효능을 평가하는 단계로 구성된다.
본 발명은 배지 내 포도당 농도가 10~40 중량%인 조건 또는 에탄올 농도가 7~11%(v/v)인 조건에서 생육할 수 있는 내당성 및 내알코올성이 우수한 사카로마이세스 세르비제(Saccharomyces cerevisiae) ADS-11 KACC 93043P를 제공함을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 포도당 2~40 중량%를 포함하는 발효배지에서 사카로마이세스 세르비제(Saccharomyces cerevisiae) ADS-11 KACC 93043P를 발효시 켜 에탄올을 제조할 수 있다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 고농도의 알코올과 당이 존재하는 발효주에서 신규 발효 효모의 분리 및 동정
내당성 및 내알코올성이 우수한 신규 효모를 분리하기 위해, 상업적으로 수십 년간 전통방식으로 발효하고 있는 민속주 안동소주(경북 안동시 수상동 소재)의 증류전 숙성 발효액에서 발효 효모를 분리하였다.
분리배지는 10%의 포도당, 1% 효모추출액(디피코, 미국), 1% 펩톤(디피코, 미국)이 포함된 고체배지를 사용하였으며, 통상의 방법으로 발효액을 도말한 후, 30℃에서 3일간 배양하여 효모 콜로니를 확인하였다. 각각의 콜로니는 상기 분리배지와 동일한 배지를 이용하여 순수배양하였으며, 콜로니의 색깔, 모양, 반사정도에 따라 총 4개의 균주를 선발하였다. 선발된 균주는 에이디에스(ADS)-9, 10, 11, 및 12번 균주로 명명하였다. 각각의 분리균주의 현미경 사진은 도 1에 나타내었다.
상기에서 분리한 발효 균주들을 동정하고자, 다양한 당 자화능 평가, 항생제 내성, 생리적 특성 및 26S rDNA 유전자 서열분석을 실시한 후, 분류학적으로 계통분류하였다.
실험예 1. 분리균주의 당 자화능 평가 및 생리적 특성 검토
본 발명에 사용된 당 자화능 평가는 비오메리으(Biomerieux) 프랑스 회사의 효모 동정용 키트인 에이피아이20 씨-옥스(api20 C AUX)를 사용하였다.
분리효모를 멸균 생리식염수를 이용하여 적당한 농도로 현탁 후, 제공된 스트립에 가하고, 이를 30℃ 배양기에서 72시간 배양 후 19종의 당의 자화성 여부를 평가하였으며, 결과는 +, 또는 -로 나타내었다(도 2).
동정 결과, 에이디에스-9, 10, 및 11번 균주는 사카로마이세스 세레비제(Saccahromyces cerevisiae)로 확인되었으며, 에이디에스-12번 균주의 경우에는 캔디다 크루세이(Candida krusei)로 동정되었다.
한편 이들 균주는 0.01% 사이클로헥시마이드가 첨가된 배지에서는 생존하지 못하였으며, 에이디에스-9, 10, 및 11번 균주는 납, 카드늄, 구리가 50ppm 포함된 포도당 배지(포도당 2%, 효모추출액 1%, 펩톤 1%)에서 생존할 수 없었다.
실험예 2. 분리균주의 26S rDNA 염기서열 결정에 의한 균주 동정
분리균주의 26S rDNA 염기서열은 기존의 보고된 방법(Kee-Sun Shin et al., International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2001, 51, 2167-2170)과 동일하게 분석하였으며, 염기서열을 결정한 결과는 다음과 같다.
에이디에스 -9
Figure 112006069471579-pat00001
에이디에스 -10
Figure 112006069471579-pat00002
에이디에스 -11
Figure 112006069471579-pat00003
에이디에스 -12
Figure 112006069471579-pat00004
상기 유전자 서열을 이용하여 계통분류학적 방법으로 분석한 결과는 도 3에 나타내었으며, 에이디에스-9, 10, 및 11은 각각 사카로마이세스 세르비제(Saccahromyces cerevisiae NRRL Y-12632) 균주와 99% 동일한 서열을 가져, 사카로마이세스 세르비제로 확인하였다. 반면, 에이디에스-12 균주는 이사첸키아 오리엔탈리스(Issatchenkia orientalis NRRL Y-5396T) 균주와 100% 동일하여, 이사첸키아 오리엔탈리스로 동정하였다(도 3). 이들 균주 중 에이디에스-11 균주는 한국농업미생물자원센터에 2006년 9월 8일자로 균주기탁하였으며, 기탁번호는 KACC 93043P이다. 상기 분리균주는 내당성 및 내알코올성이 우수한 신규 유용 효모로 확인하였다.
실험예 3: 분리효모를 이용한 내당성 , 내알코올성 , 내산성 , 및 내열성 평가
분리균주의 알코올 발효에 관련되는 균학적 특성을 검토하였다. 먼저 효율적인 알코올 발효를 위해서는 고농도 기질 삽입이 가능하여야 하므로 내당성을, 한편 만들어진 알코올에 저항성을 가져야 하므로 내알코올성을, 발효중에 pH가 3 이 하로 감소하므로 내산성을, 또한 발효열로 인해 발효조 품온이 상승하므로 내열성을 각각 평가하였다.
실험실시예 1: 분리균주의 내당성 평가
효모추출액 1%, 펩톤 1%가 포함된 기본배지에 포도당 농도가 20%, 30%, 40%, 50%, 및 60%가 포함된 배지를 제조하여 멸균한 다음, 한 백금이의 각각의 균주를 접종하여 30℃에서 2일간 배양한 후 생육결과를 육안으로 확인하였다. 이때 대조구로는 일본의 상업적 알코올 발효 효모 사카로마이세스 세르비제 IF0 0233 균주와 내열성, 내알코올성 발효 효모 사카로마이세스 세르비제 KNU5377(다중적 스트레스내성을 가지는 효모균주 사카로마이세스세레비지아에 KNU5377, 특허 등록번호 제10-0392350호), 그리고 일반 유전학에 이용되는 사카로마이세스 세르비제 BY4743을 사용하였다.
표 1에 나타난 바와 같이, 대조구로 사용된 균주는 모두 40% 당 농도에서 성장 가능하였으며, 분리균주 중에서는 에이디에스-9 및 11 균주가 성장 가능하여 내당성이 우수한 균주로 확인되었다.
분리효모의 내당성 평가
농도(%) IFO 0233 BY 4743 KNU 5377 에이디에스-9 에이디에스-10 에이디에스-11 에이디에스-12
10 + + + + + + +
20 + + + + + + +
30 + + + + - + -
40 + + + + - + -
50 - - - - - - -
60 - - - - - - -
+; 성장, -; 성장 못함
실험실시예 2: 분리균주의 내알코올성 평가
분리효모의 내알코올성 평가의 경우에는 효모추출액 1%, 펩톤 1%, 포도당 2%가 포함된 배지를 제조하여 멸균한 다음, 에탄올을 각각 7%, 9%, 11%, 13%, 15%, 및 17%(v/v) 되도록 첨가하여 다양한 균주들을 한 백금이 접종하고, 30℃에서 2일간 배양한 후 생육결과를 육안으로 확인하였다.
표 2에 나타난 바와 같이, 대조구에서는 사카로마이세스 세르비제 KNU5377이 11%의 알코올 첨가시에도 성장이 확인되었으며, 에이디에스-9, 10, 및 11 균주에서 강력한 내알코올성을 확인하였다.
분리효모의 내알코올성 평가
농도(%) v/v IFO 0233 BY 4743 KNU 5377 에이디에스-9 에이디에스-10 에이디에스-11 에이디에스-12
7 + + + + + + +
9 + + + + + + -
11 - - + + + + -
13 - - - - - - -
15 - - - - - - -
17 - - - - - - -
+; 성장, -; 성장 못함
실험실시예 3: 분리균주의 내산성 평가
효모에 의한 알코올 발효되는 발효액의 pH가 통상 3.0~3.5를 나타내므로, 이러한 산성조건에서 균주 생육이 가능한지를 검토하였다. 효모추출액 1%, 펩톤 1%, 포도당 2%가 포함된 배지를 제조하여 멸균한 다음, 0.1N 염산용액으로 각각의 배지 pH를 2, 3, 4, 5, 6, 및 7로 각각 조정하여 다양한 균주들을 한 백금이 접종하고(초기 600nm 흡광도는 0.02 이하임), 밀폐하여 휘발을 방지하였으며, 이후 30℃에서 1일간 배양한 후 생육결과를, 스펙트로포토미터(Asys Expert-96, 아시스 하이테크 게엠바하, 호주)를 이용하여 600nm에서 흡광도를 측정하여 평가하였다.
표 3에 나타난 바와 같이, pH4에서는 모든 시험균주가 성장하였으나, pH2에서는 에이디에스-12 균주를 제외하고는 모두 성장하지 못하였다. pH3에서는 사카로마이세스 세르비제 IF0 0233 균주와 BY 4743 균주는 성장하지 못한 반면, 내산성 특허균주인 사카로마이세스 세르비제 KNU5377(다중적 스트레스내성을 가지는 효모균주 사카로마이세스 세레비제 KNU5377, 특허 등록번호 제10-0392350호) 및 에이디에스-9, 10, 11, 및 12 균주들은 정상적인 성장을 나타내었다.
분리효모의 내산성 평가
pH IFO 0233 BY 4743 KNU 5377 에이디에스-9 에이디에스-10 에이디에스-11 에이디에스-12
2 - - - - - - 0.21
3 - - 0.48 0.82 0.79 0.78 0.71
4 0.48 0.41 0.62 0.82 0.80 0.80 0.51
5 0.52 0.75 0.79 0.98 0.96 0.98 0.77
6 0.98 0.85 0.94 1.21 1.12 1.10 0.98
7 1.05 1.08 1.11 1.35 1.30 1.14 1.20
-; 흡광도 0.02 이하
실험실시예 4: 분리균주의 내열성 평가
효모에 의한 알코올 발효시 발효열로 인한 발효조 품온의 상승이 나타나며, 특히 하절기 기온이 상승하는 시기에는 발효조 온도가 더욱 상승하여 조업 자체를 할 수 없게 된다. 또한 고농도의 알코올 및 당의 독성효과는 온도가 상승할수록 독성효과도 증가하므로 분리균주들의 내열성을 평가하였다. 효모추출액 1%, 펩톤 1%, 포도당 2%가 포함된 배지를 제조하여 멸균한 다음, 다양한 균주들을 한 백금이 접종하고(초기 600nm 흡광도는 0.02이하 임), 각각 20℃, 30℃, 37℃, 41℃ 및 43℃에서 1일간 배양한 후 생육결과를, 스펙트로포토미터(Asys Expert-96, 아시스 하이테크 게엠바하, 호주)를 이용하여 600nm에서 흡광도를 측정하여 평가하였다.
표 4에 나타난 바와 같이, 37℃까지 모든 균주가 성장 가능하였으나, 41℃ 및 43℃에서는 에이디에스-12 균주만이 성장하였다. 그러나 20℃에서 대조구로 사용된 균주들이 거의 성장을 하지 못한 반면, 분리균주들은 어느 정도의 성장을 나타내었으며, 특히 에이디에스-12 균주는 실험한 전 온도범위에서 매우 우수한 성장을 나타내었다. 또한 본 발명의 에이디에스-11 균주도 37℃에서 양호한 성장을 나타내어 어느 정도의 내열성은 가지고 있는 것으로 확인되었다.
분리효모의 내열성 평가
온도(℃) IFO 0233 BY 4743 KNU 5377 에이디에스-9 에이디에스-10 에이디에스-11 에이디에스-12
20 - - - 0.21 0.28 0.20 0.80
25 0.99 1.05 1.10 1.09 1.13 0.98 0.81
30 0.79 0.74 0.94 1.21 1.16 1.00 1.51
37 0.83 0.69 0.71 0.95 0.96 0.95 0.77
41 - - - - - - 0.98
43 - - - - - - 1.06
-; 흡광도 0.02 이하
실시예 2: 분리균주를 이용한 20% 및 40% 포도당 발효배지에서의 발효능 평가
상기 실시예 1의 분리균주의 발효능을 평가하기 위하여, 효모추출액 1%, 펩톤 1%, 포도당 20%가 포함된 발효 배지를 제조하여 멸균한 다음, 다양한 균주들을 한 백금이 접종하고 30℃에서 7일간 발효시킨 후, 최종 pH, 잔당, 세포량, 알코올양을 측정하였다. 발효액의 최종 pH는 pH 측정기(하나 인스루먼트 8519, 이탈리아)를 사용하였으며, 세포량은 발효액 10㎖를 멸균 증류수로 수세 후, 0.45㎛의 필터(밀리포아, 아일랜드)로 회수 후, 통상의 건조방법으로 건조하여 건조중량(g/L)으로 나타내었다. 잔당의 경우 환원당 측정법(Miller, Analytical Chemistry, 1959, 31, 426-428)으로, 알코올양은 발효액을 증류하여 알코올 비중계로 측정하였다. 측정자료를 바탕으로 발효율을 계산하였다.
표 5에 나타난 바와 같이, 에이디에스-11 균주에서 가장 우수한 발효율을 확인하였다.
분리균주를 이용한 20% 포도당 발효배지에서의 발효능 평가
분석항목 IFO 0233 BY 4743 KNU 5377 에이디에스-9 에이디에스-10 에이디에스-11 에이디에스-12
최종 pH 4.4 4.3 4.5 4.4 4.3 4.1 3.9
잔당 (g/100㎖) 1.67 3.42 0.54 1.35 1.22 2.24 3.21
사용 당 (g/100㎖) 18.33 16.58 19.46 18.65 18.78 17.76 11.79
세포량 (g/L) 1.08 0.98 1.08 1.29 1.20 1.19 1.14
알코올 %(v/v) 10.25 8.68 10.82 10.32 10.22 10.32 4.61
*발효율 (%) 84.37 81.12 86.15 85.73 84.32 90.03 60.49
*발효율: [생성된 알코올양(g/L) / 사용된 기질 양으로부터 이론적 알코올 생산량(g/L)] x 100
또한, 고농도 당 조건에서 발효가능성 및 발효 효율성을 검토하기 위해 효모추출액 1%, 펩톤 1%, 포도당 40%가 포함된 발효 배지를 제조하여 멸균 후, 동일한 발효 실험을 수행하고 발효율을 측정하였다.
분리균주를 이용한 40% 포도당 발효배지에서의 발효능 평가
분석항목 IFO 0233 BY 4743 KNU 5377 에이디에스-9 에이디에스-10 에이디에스-11 에이디에스-12
최종 pH 4.4 4.3 4.5 4.4 4.3 4.1 3.9
알코올 %(v/v) 7.71 - 9.45 9.81 10.38 12.33 4.24
*발효율 (%) 29.84 - 36.58 38.01 40.20 47.76 16.43
**발효율: [생성된 알코올양(g/L) / 이론적 알코올 생산량(g/L)] x 100
표 6에 나타난 바와 같이, 40% 고당 조건에서 에이디에스-11 균주에서 가장 우수한 발효능을 확인하였다.
상기 실시예 및 실험예를 통해 살펴본 바와 같이, 본 발명은 내당성, 내알코올성이 우수한 사카로마이세스 세레비제 ADS-11 KACC 93043P 및 그를 이용한 알코올 발효에 관한 것으로, 전통 발효주에서 분리한 에이디이스-11 균주는 고농도의 포도당 또는 고농도의 알코올 조건에서도 생육할 수 있는 내당성 및 내알코올성이 우수하며, 상기 균주를 발효시켜 고농도의 에탄올을 생산할 수 있는 효과가 있다. 따라서, 본 발명의 균주는 통상의 알코올 발효뿐만 아니라, 고농도 당 조건, 또는 고농도 알코올 조건에서 에탄올을 생산하는데 사용할 수 있어 발효산업상 매우 유용한 발명이다.

Claims (2)

  1. 배지 내 포도당 농도가 10~40 중량%인 조건 또는 에탄올 농도가 7~11%(v/v)인 조건에서 생육할 수 있는 내당성 및 내알코올성이 우수한 사카로마이세스 세르비제(Saccharomyces cerevisiae) ADS-11 KACC 93043P.
  2. 효모를 이용한 알코올 제조방법에 있어서,
    포도당 2~40 중량%를 포함하는 발효배지에서 사카로마이세스 세르비제(Saccharomyces cerevisiae) ADS-11 KACC 93043P를 배양하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 에탄올 제조방법.
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