MXPA06014165A

MXPA06014165A - Cepas de saccharomyces no recombinantes que se desarrolan sobre xilosa.

Info

Publication number: MXPA06014165A
Application number: MXPA06014165A
Authority: MX
Inventors: Philip John Livingston Bell; Paul Victor Attfield
Original assignee: Microbiogen Pty Ltd
Priority date: 2004-06-08
Filing date: 2005-06-08
Publication date: 2007-04-25
Also published as: EP1766007A1; BRPI0511921A; CA2567849A1; DK1766007T3; ZA200610223B; US20130065270A1; US8735138B2; EP1766007A4; PL1766007T3; JP2008501348A; US20100068790A1; JP5826447B2; EA200602194A1; JP5872520B2; US20150064772A1; NZ552213A; JP2014054256A; CN1977042B; US20080009047A1; EA010892B1

Abstract

La presente invencion se refiere a los metodos para producir cepas de Saccharomyces que son capaces de desarrollarse sobre xilosa como fuente unica de carbono a una velocidad de crecimiento deseada, (tal como al menos una generacion por 48 horas), las cepas elaboradas mediante tales metodos, y las cepas de Saccharomyces que se desarrollan a una velocidad de crecimiento de al menos una generacion por 48 horas utilizando xilosa como una fuente unica de carbono para el desarrollo realizado por los metodos no recombinantes.

Description

CEPAS DE SACCHAROMYCES NO RECOMBINANTES QUE SE DESARROLLAN SOBRE XILOSA CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a los métodos para producir cepas no recombinantes de Saccharomyces, cepas de Saccharomyces , y usos de las mismas. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Todas las referencias, incluyendo cualesquiera patentes o solicitudes de patente, citadas en esta especificación son incorporadas por referencia en la misma. No se realiza ninguna admisión de que alguna referencia constituya técnica anterior. La descripción de las referencias establece lo que sus autores aseveran, y los solicitantes se reservan el derecho de retar la precisión y pertinencia de los documentos citados. Se entenderá claramente que, aunque son referidas en la presente un número de publicaciones de la técnica anterior, esta referencia no constituye una admisión de que algunos de estos documentos forme parte del conocimiento general común en la técnica, en Australia o en cualquier otro país. Uno de los grupos económicos más importantes de las levaduras son del género Saccharomyces, cepas de las cuales son empleadas en la producción de cerveza, en panadería, en elaboración de vino, en destilación y otras diversas Ref.: 177998 industrias dependientes de las levaduras. Las especies de Saccharomyces son filogenéticamente definidas por Kurtzman (2003) FEMS Yeast Research 3: 417-432, e incluyen S cerevisiae, S. paradoxus, S. mikatae, S. cariocanus, S. kudriavzevii , S . pastorianus y S. bayanus . Saccharomyces spp. son algunos de los microorganismos más efectivos para convertir azúcares tales como glucosa, fructosa, sucrosa y maltosa a biomasa, y para fermentar estos azúcares a etanol. Como consecuencia, Saccharomyces spp., y en particular Saccharomyces cerevisiae, es uno de los microorganismos más ampliamente utilizados en los procesos industriales. Por ejemplo, en la elaboración de cerveza, en la destilación y en industrias vinícolas, los Saccharomyces son utilizados para fermentar azúcares, tales glucosa, fructosa, sucrosa y/o maltosa a etanol. En la industria del etanol como combustible, las cepas de Saccharomyces cerevisiae son elegidas por su habilidad para convertir rápidamente altas concentraciones de azúcares tales como glucosa, fructosa, sucrosa, y/o maltosa en altas cantidades de etanol. En la industria de la panadería, las cepas de Saccharomyces cerevisiae son utilizadas principalmente por su habilidad para producir dióxido de carbono a partir de azúcares tales como glucosa, fructosa, sucrosa y/o maltosa, con el fin de elevar el pan. Otras aplicaciones de Saccharomyces cerevisiae incluyen la producción de extractos de levadura y otros productos saborizantes y aromáticos, fuentes de enzimas tales como invertasa, la producción de diversos productos bioquímicos, intermediarios, proteínas, aminoácidos, ácido ribonucleico y factores nucleotídicos y vitaminas. Millones de toneladas de levadura son desarrollados cada año en procesos industriales. Por lo tanto, la habilidad de Saccharomyces para desarrollarse sobre fuentes de carbono abundantes y renovables, es importante en términos de la producción económica de la biomasa de levadura, para fines industriales y para la producción económica de subproductos provenientes de metabolismo de la levadura. En particular, la habilidad de Saccharomyces para desarrollarse sobre subproductos de desecho de otros procesos industriales es de valor ambiental y económico. De este modo, por ejemplo, la biomasa de levadura de panadero es a menudo producida por el desarrollo de las levaduras sobre melasas, que es un producto de desecho del proceso de producción de azúcar, o sobre jarabes ricos en glucosa y en maltosa derivados de la industria de hidrólisis del almidón. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención proporciona los métodos para producir una cepa de Saccharomyces que es capaz de desarrollarse a una velocidad de crecimiento deseada (tal como al menos una generación por 48 horas) , utilizando xilosa como una fuente de carbono única, y cepas de Saccharomyces que se desarrollan sobre xiloxa bajo estas velocidades de crecimiento, y los usos de las mismas. La xilosa es un ejemplo de un azúcar abundante y renovable, de origen natural, disponible de la biosama vegetal de modo que Saccharomyces fue previamente considerado no capaz de utilizarse. Ver por ejemplo Barnett et al.

"Yeasts Characteristics and Identification" 2a edición (1990) , Cambridge University Press, que establece que la levadura de la especies Saccharomyces cerevisiae no es capaz de utilizar xilosa como una fuente de carbono única para el crecimiento. La xilosa representa una fuente potencial mayor para el desarrollo de levaduras y para la fabricación de productos, incluyendo etanol, a partir de levaduras. El uso de xilosa como una fuente azúcar para levaduras podría proporcionar ventajas económicas y ambientales mayores. Por ejemplo, la producción de etanol combustible a partir de materiales ricos en xilosa, sería una fuerte mayor de energía renovable . En un primer aspecto, la invención proporciona un método para producir una cepa de Saccharomyces que es capaz de desarrollarse a una velocidad de crecimiento deseada utilizando xilosa como única fuente de carbono para el crecimiento, que comprende: (a) proporcionar una población de células de levadura no recombinantes, genéticamente diversas, de Saccharomyces; (b) cultivar las células de levadura bajo condiciones que permiten la combinación del ADN entre las células de levadura; (c) clasificar o seleccionar las células de levadura para las células de levadura que tienen velocidad de crecimiento incrementado utilizando xilosa como única fuente de carbono para el crecimiento; (d) el aislamiento de una o más células de levadura que tienen la velocidad de crecimiento deseada. Típicamente, las células de levadura son cultivadas bajo condiciones que permiten la combinación de ADN entre pares de células de levadura. Típicamente, la velocidad de crecimiento deseada es un incremento en la velocidad de crecimiento con relación a aquella de las células de levadura de las cepas de Saccharomyces a las cuales no ha sido aplicado el método.

Por ejemplo, las cepas de Saccharomyces tales como la cepa NL67. Más típicamente, la velocidad de crecimiento deseada es al menos una generación por 48 horas, más típicamente al menos una generación por 24 horas. Típicamente, las células de levadura son clasificadas o seleccionadas para las células de levadura que tienen la velocidad de crecimiento deseada al incubar las células de levadura en o sobre un medio que contiene xilosa. Típicamente, el medio que contiene xilosa es medio de cultivo que contiene xilosa. El medio de cultivo puede contener xilosa como la única fuente de carbono, o la xilosa puede ser una de una pluralidad de fuentes de carbono. Típicamente, la xilosa es la única fuente de carbono en el medio que contiene xilosa. Típicamente, el medio de cultivo que contiene xilosa es medio mineral mínimo de xilosa. Las células de levadura son típicamente incubadas sobre o en el medio que contiene xilosa, por tiempo suficiente para permitir que las células de levadura que tienen la velocidad de crecimiento deseada, utilizando xilosa como una fuente de carbono, se desarrollen. En una modalidad, las células de levadura clasificadas o seleccionadas forman la población de células de levadura no recombinantes genéticamente diversas, y los pasos (b) y (c) son repetidos hasta que son obtenidas las células de levadura que tienen la velocidad de crecimiento deseada. En una modalidad, el paso (b) es realizado antes del paso (c) . En otra modalidad más, el paso (c) es realizado antes del paso (b) . En otra modalidad más, los pasos (b) y (c) son realizados simultáneamente. En un segundo aspecto, la invención proporciona un método para producir una cepa de Saccharomyces en cultivo, que es capaz de tener una velocidad de crecimiento deseada utilizando xilosa como única fuente de carbono para el crecimiento, que comprende: (a) proporcionar una población de células de levadura no recombinantes, genéticamente diversas, de Saccharomyces; (b) cultivar las células de levadura bajo condiciones que permiten la combinación del ADN entre las células de levadura; (c) clasificar o seleccionar las células de levadura mediante incubación de células de levadura sobre o en un medio que contiene xilosa; (d) la repetición de los pasos (b) y (c) con las células seleccionadas o clasificadas que forman la población de células de levadura no recombinante genéticamente diversas de Saccharomyces, hasta que una o más de las células de levadura han adquirido la habilidad para desarrollarse a una velocidad de crecimiento deseada utilizando xilosa como única fuente de carbono para el crecimiento. Típicamente, el método comprende el paso adicional (e) de aislar una o más células de levadura que tienen la velocidad de crecimiento deseada. En una modalidad, una o más células de levadura que son aisladas son una cepa simple de Saccharomyces . En otra modalidad, una o más células de levadura que son aisladas es una población de células de levadura genéticamente diversas.

En una modalidad, las células de levadura son seleccionadas en el paso (c) . Las células de levadura pueden ser seleccionadas en el paso (c) al incubar las células de levadura sobre o en medio que contiene xilosa, por tiempo suficiente para que las células de levadura capaces de desarrollarse sobre xilosa como única fuente de carbono, se desarrollen utilizando xilosa como la única fuente de carbono, y después de esto se recolectan las células de levadura que se desarrollan. Las células de levadura pueden ser seleccionadas en el paso (c) al incubar las células de levadura sobre o en el medio que contiene xilosa por tiempo suficiente para permitir que las células de levadura que tienen una velocidad de crecimiento incrementada utilizando xilosa como la única fuente de carbono, se desarrollen utilizando xilosa como la fuente de carbono, y después de esto se recolectan las células de levadura que se desarrollan. En otra modalidad, las células de levadura son seleccionadas en el paso (c) . Las células de levadura pueden ser seleccionadas en el paso (c) mediante incubación de las células de levadura sobre o en el medio que contiene xilosa, por un tiempo suficiente para permitir que las células de levadura que tienen una velocidad de crecimiento incrementada utilizando xilosa como fuente única de carbono, se desarrollen utilizando xilosa como la fuente de carbono, y después de esto se recolectan las células de levadura que tiene una velocidad de crecimiento incrementada, utilizando la xilosa como una fuente de carbono. Se considera también que en una porción de las repeticiones de los pasos (b) y (c) , las células de levadura serán seleccionadas, y en una porción de las repeticiones de los pasos (b) y (c) , las células de levadura serán clasificadas . Los pasos (b) y (c) pueden ser repetidos cualquier número de veces que sea suficiente para obtener una cepa de levadura que sea capaz de desarrollarse a la velocidad deseada utilizando xilosa como la única fuente de carbono para el crecimiento. Podrá ser apreciado por las personas expertas en la técnica que el número de veces que los pasos (b) y (c) serán repetidos, dependerá del medio que es utilizado, de las cepas de levadura iniciales, de las condiciones de cultivo, etc. En una modalidad, los pasos (b) y (c) son repetidos al menos una vez, típicamente al menos 2 veces, más típicamente al menos 5 veces, aún más típicamente al menos 10 veces, todavía más típicamente al menos 20 veces, adecuadamente al menos 30 veces. Las células de levadura pueden ser seleccionadas o clasificadas sobre medio sólido o líquido que contiene xilosa. En una modalidad, las células son seleccionadas o clasificadas sobre medio que contiene xilosa sólido. En otra modalidad más, las células son seleccionadas o clasificadas en el medio líquido que contiene xilosa. En otra modalidad más, las células son seleccionadas o clasificadas sobre medio sólido que contiene xilosa, seguido por la selección o clasificación en el medio líquido que contiene xilosa. Por ejemplo, las células de levadura pueden ser seleccionadas o clasificadas por una pluralidad de veces al repetir los pasos (b) y (c) utilizando el medio sólido que contiene xilosa, seguido por la selección o clasificación por una pluralidad de veces al repetir los pasos (b) y (c) utilizando el medio líquido que contiene xilosa. El medio sólido que contiene xilosa puede ser cualquier medio sólido que contenga xilosa como única fuente de carbono, y que proporciona una ventaja selectiva para una cepa que es capaz de utilizar xilosa como una única fuente de carbono. Por ejemplo, el medio sólido que contiene xilosa puede ser un medio sólido complejo en el cual la xilosa es una de una pluralidad de fuentes de carbono, o el medio sólido que contiene xilosa puede ser un medio sólido mínimo en el cual la xilosa es la única fuente de carbono. Típicamente, el medio sólido que contiene xilosa será medio mínimo sólido que contiene xilosa como la única fuente de carbono . El medio líquido que contiene xilosa puede ser cualquier medio líquido que contenga xilosa como una fuente de carbono. Por ejemplo, el medio líquido que contiene xilosa puede ser un medio líquido complejo en el cual la xilosa es una de una pluralidad de fuentes de carbono, o el medio líquido que contiene xilosa puede ser un medio líquido mínimo en el cual la xilosa es la única fuente de carbono. Típicamente, el medio líquido que contiene xilosa será un medio mínimo líquido que contiene xilosa como la única fuente de carbono. Típicamente el medio mínimo líquido es medio mineral mínimo que contiene xilosa como la única fuente de carbono. La velocidad de crecimiento deseada es típicamente de al menos una generación por 48 horas. La velocidad de crecimiento deseada puede ser mayor que una generación por 24 horas. La velocidad de crecimiento deseada puede ser mayor que una generación por 12 horas. La velocidad de crecimiento deseada puede ser mayor que una generación por 10 horas. La velocidad de crecimiento deseada puede ser mayor que una generación por 8 horas. La velocidad de crecimiento deseada puede ser mayor que una generación por 4 horas. La velocidad de crecimiento deseada puede ser mayor que una generación por 2 horas. La cepa Saccharomyces que es producida puede ser una cepa de cualquier especie del género Saccharomyces que es capaz de desarrollarse a una velocidad de desarrollo deseada utilizando xilosa como la única fuente de carbono para el crecimiento. Será apreciado por aquellos expertos en la técnica que la cepa que es producida dependerá de la especie que forma la población genéticamente diversa de las células de levadura no recombinantes de Saccharomyces . Los ejemplos de especies adecuadas de levadura incluyen S. cerevisiae, S, paradoxus, S. mikatae, S. cariocanus, S. kudriavzevii , S. pastorianus y S . bayanus . Típicamente, la cepa es de la especie Saccharomyces cerevisiae . Típicamente, la cepa será capaz de equipararse con el Saccharomyces de la misma especie. Típicamente, la cepa será capaz de equipararse con Saccharomyces cerevisiae . La levadura puede ser cultivada bajo cualesquiera condiciones que permitan la combinación del ADN entre las células de levadura, con la condición de que la combinación del ADN no sea mediante métodos recombinantes. Las células de levadura pueden ser cultivadas bajo condiciones que permiten la combinación del ADN entre las células de levadura mediante, por ejemplo, copulación o citoducción, o cualesquiera otros métodos conocidos en la técnica para combinar el ADN de las células de levadura, diferentes de los métodos recombinantes. En una modalidad, las células de levadura son cultivadas bajo condiciones que permiten la copulación de las células de levadura. Típicamente, la copulación de la levadura comprende la esporulación de la levadura para producir esporas, la germinación de las esporas, y el apareamiento de las esporas germinadas. Los métodos para aparear levaduras son conocidos por aquellos expertos en la técnica y son descritos en, por ejemplo, Fowell (1969) "Sporulation and hybridization of yeast", en The yeasts (AH Rose y JS Harrison, eds.), Academic Press; Patente Europea EP-0,511,108 B; Attfield y Bell (2003) "Genetics and clasical genetic manipulations of industrial yeasts" en, Topics in Current Genetics, Vol. 2. Functional Genetics Industrial Yeasts (J.H. de Winde, ed. ) , Springer-Verlag Berlín Heidelberg o combinaciones de las mismas. La población de células de levadura no recombinantes, genéticamente diversas pueden ser aisladas de origen natural de Saccharomyces de cualquier fuente, aisladas espontáneamente mutadas de Saccharomyces , o pueden ser obtenidas mediante la exposición de una o más cepas de Saccharomyces a un mutágeno . La población de células de levadura no recombinantes genéticamente diversas, pueden ser cepas de una especie simple, o pueden ser cepas de una pluralidad de especies. Las especies adecuadas para el uso como población genéticamente diversa de las células de levadura no recombinantes incluye S. cerevisiae, S. paradoxus, S. mikatae, S. cariocanus, S. kudriavzevii , S. pastorianus y S. bayanus . Típicamente, las cepas son de la especie Saccharomyces cerevisiae . Típicamente, las cepas son capaces de aparearse con Saccharomyces de la misma especie.

Típicamente, las cepas son capaces de aparearse con Saccharomyces cerevisiae. Podrá ser comprendido por las personas expertas en la técnica que además de la población de células de levadura no recombinantes genéticamente divergentes, las células de levadura recombinantes pueden ser incluidas en los pasos (b) y (c) como una población separada. En un tercer aspecto, la invención proporciona un método para generar un derivado de una cepa de Saccharomyces con una velocidad de crecimiento incrementada utilizando xilosa como una fuente única de carbono para el crecimiento, que comprende : (a) la provisión de células de levadura de la cepa como una porción de una población de células de levadura genéticamente diversas de Saccharomyces ; (b) el cultivo de la población de las células de levadura no recombinantes, genéticamente diversas de Saccharomyces bajo condiciones que permiten la combinación de ADN entre las células de levadura de la población; (c) la clasificación o selección de células de levadura para derivados de la cepa que tienen una velocidad de crecimiento incrementada sobre xilosa; (d) el aislamiento de uno o más derivados de la cepa que tienen una velocidad de crecimiento incrementada utilizando xilosa como fuente única de carbono para el crecimiento con relación a la velocidad de crecimiento de la cepa utilizando xilosa como una fuente única de carbono para el crecimiento. Las células de levadura son típicamente clasificadas o seleccionadas por la incubación de las células de levadura sobre o en el medio que contiene xilosa. En una modalidad, las células de levadura se seleccionan en el paso (c) . Las células de levadura pueden ser seleccionadas en el paso (c) mediante la incubación de células de levadura sobre o en el medio que contiene xilosa, por un tiempo suficiente para permitir que las células de levadura capaces de desarrollarse sobre xilosa como una fuente única de carbono, se desarrollen utilizando xilosa como la fuente de carbono. Las células de levadura pueden ser seleccionadas en el paso (c) mediante la incubación de las células de levadura sobre o en el medio que contiene xilosa por un tiempo suficiente para permitir que las células de levadura que tengan una velocidad de crecimiento incrementada utilizando xilosa como fuente única de carbono, se desarrolle utilizando xilosa como la fuente de carbono. En otra modalidad más, las células de levadura son seleccionadas en el paso (c) . Las células de levadura pueden ser seleccionadas en el paso (c) mediante la incubación de las células de levadura sobre o en el medio que contiene xilosa por un tiempo suficiente para permitir que las células de levadura que tengan una velocidad de crecimiento incrementada utilizando xilosa como fuente única de carbono, se desarrolle utilizando xilosa como la fuente de carbono., y después de esto se recolectan las células de levadura que se desarrollan más rápido utilizando la xilosa como una fuente de carbono . Los pasos (b) y (c) pueden ser típicamente repetidos, con lo cual los derivados forman al menos una porción de la población de las cepas de Saccharomyces , genéticamente diversas, hasta que uno o más derivados han adquirido una velocidad incrementada de crecimiento sobre xilosa como una fuente única de carbono para el crecimiento. En el pasado, para enfrentar el problema de la incapacidad de Saccharomyces cerevisiae para utilizar xilosa, otros han utilizado procedimientos de ADN recombinante para introducir genes obtenidos a partir de levadura que pueden utilizar xilosa como una fuente de carbono para conferirle a Saccharomyces la habilidad para utilizar xilosa (por ejemplo Sonderegger y Sauer (2003). Applied and Environmental Microbiology 69: 1990-1998). En estos procedimientos, los genes para la utilización de la xilosa han sido clonados a partir de organismos que son capaces de utilizar xilosa para el crecimiento, y subsecuentemente introducidos dentro de Saccharomyces cerevisiae . Por ejemplo, la xilosa-isomerasa fúngica proveniente de Piromyces spp. ha sido integrada dentro del genoma de Saccharomyces cerevisiae para generar cepas que crecen lentamente sobre xilosa como una fuente única de carbono (Kuyper et al. 2003). La xilosa-reductasa de Pichia stipi tis ha sido también clonada dentro de Saccharomyces cerevisiae para generar la levadura que puede utilizar xilosa como una fuente única de carbono para el crecimiento (Wahlbom et al. 2003) . La Saccharomyces cerevisiae no recombinante es "en general considerada como segura" (GRAS) y si son utilizadas técnicas recombinantes para desarrollar Saccharomyces cerevisiae que utilizan xilosa, éstas pierden el estatus de GRAS. Por lo tanto, no es necesariamente industrial o económicamente útil, deseable, o adecuado utilizar cepas de Saccharomyces cerevisiae que contengan genes provenientes de otros géneros o especies, o que sean producidas utilizando métodos de ADN recombinante. Por supuesto, las cepas que son derivadas a través de los procedimientos de ADN recombinante no son industrialmente útiles donde existen barreras socio-políticas o ambiental-políticas para el uso de tales cepas. El uso de las técnicas de ADN recombinante reducen las oportunidades y el deseo de utilizar levaduras en alimentos humanos, etc., mientras que las cepas no recombinantes podrían ser ventajosamente utilizadas para alimentos humanos, etc. La habilidad para utilizar levadura no recombinante simultáneamente para etanol y para alimentos humanos, proporciona oportunidades para mejorar eficiencias de costo de los procesos basados en levadura. Por ejemplo, es posible utilizar levaduras no recombinantes para convertir la xilosa a etanol y biomasa de levadura. El etanol puede ser utilizado para combustible y otras aplicaciones, mientras que la levadura producida puede ser utilizada en otras aplicaciones valiosas tales como la producción de extractos u otros subproductos . Los inventores han encontrado que cuando las cepas tipo silvestre no recombinantes de Saccharomyces son incubadas sobre el medio que comprende xilosa como una fuente única de carbono, es detectable un crecimiento muy lento sobre la xilosa. Esto es contrario a la técnica anterior, la cual indica claramente que Saccharomyces no es capaz de desarrollarse sobre xilosa. Los inventores creen que el crecimiento de Saccharomyces sobre xilosa es tan lento que éste no ha sido previamente detectado. Como se describe en la presente, los inventores han encontrado que cuando el medio mineral mínimo sólido que contiene xilosa como una fuente única de carbono, fue inoculado con cepas de Saccharomyces cerevisiae tipo silvestre, el crecimiento fue detectable por examen microscópico de las colonias después de la incubación por 2 meses a 30°C. Aunque el crecimiento detectable permitió la aplicación de estrategias no recombinantes para ser utilizadas para derivar levaduras con velocidades mejoradas de crecimiento, la velocidad de crecimiento muy lenta observada no tiene utilidad industrial. Los inventores han extendido su hallazgo de que Saccharomyces es capaz de desarrollarse muy lentamente sobre xilosa como una fuente de carbono única para desarrollar cepas de Saccharomyces que sean capaces de desarrollarse sobre xilosa como una fuente única de carbono, a velocidades mucho más altas que las cepas de Saccharomyces a las cuales no ha sido aplicado el método de la presente invención. Previamente al hallazgo de los inventores, no se pensaba que fuera posible que la incubación de las células de levadura de Saccharomyces en o sobre el medio que contiene xilosa como fuente única de carbono, pudiera dar como resultado alguna selección o enriquecimiento de las células de levadura que sean capaces de desarrollarse sobre xilosa, ya que se creía que la levadura no podría desarrollarse en el medio debido a que la xilosa era considerada como una fuente de carbono no utilizable para Saccharomyces . No obstante, mediante el uso de sus hallazgos y una combinación de las estrategias de selección y los métodos tales como el apareamiento de poblaciones de cepas genéticamente diversas de Saccharomyces , adecuadamente, las cepas de Saccharomyces cerevisiae, los inventores han encontrado que las cepas de Saccharomyces pueden ser producidas, las cuales son capaces de desarrollarse sobre medio sólido, y/o en medio líquido que contiene xilosa como una fuente única de carbono, a velocidades que son más altas que aquellas de las cepas de Saccharomyces a las cuales no ha sido aplicado el método de la presente invención. Además, los inventores han encontrado que mediante el empleo de las estrategias de selección y los métodos tales como el apareamiento de cepas genéticamente diversas de Saccharomyces , pueden ser producidas cepas de Saccharomyces que tienen una velocidad de crecimiento utilizando xilosa como una fuente única de carbono, que es al menos una generación por 48 horas, y en algunas modalidades ventajosas, puede ser mayor de una generación por 4 horas. De este modo, mediante el uso de métodos no recombinante, los inventores han sido capaces de generar cepas de Saccharomyces que son capaces de desarrollarse en medios líquidos y en medios sólidos que contienen xilosa como una fuente única de carbono a velocidades industrialmente útiles. En un cuarto aspecto, la invención proporciona una cepa de Saccharomyces producida mediante el método del primero al tercer aspectos de la invención. En un quinto aspecto, la invención proporciona una cepa aislada de Saccharomyces que es capaz de tener una velocidad de crecimiento de al menos una generación por 48 horas utilizando xilosa como una fuente única de carbono para el crecimiento, en donde la cepa produce: (i) un incremento de 5 veces en la biomasa cuando se desarrolla bajo las condiciones especificadas en la Prueba TI; y (ii) al menos 10 mg de peso seco de biomasa cuando se desarrolla bajo las condiciones especificadas en la Prueba T2, y en donde la cepa es producida mediante el método del primero al tercer aspectos . En un sexto aspecto, la invención proporciona una cepa aislada de Saccharomyces que es capaz de tener una velocidad de crecimiento de al menos una generación por 48 horas utilizando xilosa como fuente única de carbono para el crecimiento, en donde: (i) la cepa produce un incremento de 10 veces en la biomasa cuando se desarrolla bajo las condiciones especificadas en la Prueba TI; y (ii) la cepa produce al menos 50 mg de peso seco de biomasa cuando se desarrolla bajo las condiciones especificadas en la Prueba T2 ; y (iii) se detecta al menos 0.1 g/litro de etanol bajo las condiciones especificadas en la Prueba T3 ; y (iv) al menos un nanomol de NAD(P)H es reducido u oxidado por minuto por mg de extracto de proteína, a 30°C bajo las condiciones especificadas en la Prueba T4; y (v) al menos un nanomol de NAD(P)H es reducido u oxidado por minuto por mg de extracto de proteína, a 30°C bajo las condiciones especificadas en la Prueba T5 ; y en donde la cepa es producida mediante el método del primero al tercer aspectos. En un séptimo aspecto, la invención proporciona una cepa aislada de Saccharomyces que es capaz de tener una velocidad de crecimiento de al menos una generación por 48 horas utilizando xilosa como una fuente única de carbono, en donde : (i) la cepa produce un incremento de 5 veces en la biomasa cuando se desarrolla bajo las condiciones especificadas en la Prueba Ti; y (ii) la cepa produce al menos 40 mg de peso seco de biomasa cuando se desarrolla bajo las condiciones especificadas en la Prueba T2 ; y (iii) al menos un nanomol de NAD(P)H es reducido u oxidado por minuto por mg de extracto de proteína, a 30°C bajo las condiciones especificadas en la Prueba T4 ; y (iv) al menos un nanomol de NAD(P)H es reducido u oxidado por minuto por mg de extracto de proteína, a 30°C bajo las condiciones especificadas en la Prueba T5 ; y (v) la cepa produce al menos un incremento de 5 veces en la biomasa bajo las condiciones especificadas en la Prueba T7 ; (vi) es detectada una concentración de al menos 0.04 g/litro de etanol bajo las condiciones especificadas en la Prueba T8 ; y en donde la cepa es producida mediante el método del primero al tercer aspecto. En una modalidad del cuarto al séptimo aspecto, la cepa produce al menos 0.2 gramos de etanol por litro, dentro de un periodo de 4 meses bajo las condiciones especificados en la Prueba T9. En un octavo aspecto, la invención proporciona una cepa aislada de Saccharomyces que es capaz de desarrollarse a una velocidad de al menos una generación por 48 horas utilizando xilosa como una fuente única de carbono para el crecimiento, en donde la capacidad de la cepa para utilizar xilosa como una fuente única de carbono es obtenida mediante métodos no recombinantes. La velocidad de crecimiento de la cepa puede ser cualquier velocidad que sea al menos una generación por 48 horas. La velocidad de crecimiento puede ser al menos una generación por 36 horas. La velocidad de crecimiento puede ser mayor de una generación por 24 horas. La velocidad de crecimiento puede ser mayor de una generación por 12 horas. La velocidad de crecimiento puede ser mayor de una generación por 10 horas. La velocidad de crecimiento puede ser mayor de una generación por 8 horas. La velocidad de crecimiento puede ser mayor de una generación por 6 horas. La velocidad de crecimiento puede ser mayor de una generación por 4 horas. La velocidad de crecimiento puede ser mayor de una generación por 2 horas . La velocidad de crecimiento puede ser mayor de una generación por 80 minutos . En una modalidad, la cepa es capaz de desarrollarse utilizando xilosa como la fuente única de carbono a una velocidad que es sustancialmente la misma que la velocidad de crecimiento de la cepa utilizando glucosa como una fuente única de carbono para el crecimiento. En una modalidad, la cepa tiene una velocidad de crecimiento de al menos una generación por 48 horas sobre medio mineral mínimo de xilosa. En una modalidad, la cepa produce un incremento de 2 veces en la biomasa cuando se desarrolla bajo las condiciones especificadas en la Prueba Ti. Típicamente, la cepa produce al menos un incremento de 5 veces en la biomasa cuando se desarrolla bajo las condiciones especificadas en la Prueba TI. Adecuadamente, la cepa produce al menos un incremento de 10 veces en la biomasa cuando se desarrolla bajo las condiciones especificadas en la Prueba Ti. En una modalidad, la cepa produce al menos 0.01 g de peso seco de biomasa por 50 ml de cultivo, cuando se desarrolla bajo las condiciones especificadas en la Prueba T2. En las diversas modalidades: (i) la cepa expresa una enzima no recombinante que tiene al menos 1 unidad de actividad de xilosa-reductasa bajo las condiciones especificadas en la Prueba T4; (ii) la cepa expresa una enzima no recombinante que tiene al menos una unidad de actividad de xilitol-deshidrogenasa bajo las condiciones especificadas en la Prueba T5 ; (iii) la cepa expresa una enzima no recombinante que tiene al menos una unidad de actividad de xilosa-reductasa bajo las condiciones especificadas en la Prueba T4 , una enzima no recombinante que tiene al menos una unidad de actividad de xilitol-deshidrogenasa bajo las condiciones especificadas en la Prueba T5. En un noveno aspecto, la invención proporciona una cepa aislada de Saccharomyces que es capaz de tener una velocidad de crecimiento de al menos una generación por 48 horas utilizando xilosa como una fuente única de carbono para el crecimiento, y que es capaz de expresar la enzima no recombinante que tiene una actividad seleccionada del grupo que consiste de xilosa-reductasa y xilitol-deshidrogenasa, en donde la actividad de xilosa-reductasa es al menos de 1 unidad cuando es determinada por la Prueba T4 , y la actividad de xilitol-deshidrogenasa es al menos de 1 unidad cuando se determina bajo las condiciones especificadas en la Prueba T5. La cepa puede ser capaz de expresar una enzima no recombinante que tiene actividad de xilosa-reductasa y una enzima no recombinante que tiene actividad de xilitol-deshidrogenasa. En una modalidad, la cepa es capaz de expresar una enzima no recombinante que tiene actividad de xilulosa-cinasa, además de una o más enzimas no recombinante que tienen una actividad seleccionada del grupo que consiste de xilosa-reductosa y xilitol-deshidrogenasa. Típicamente, la actividad de xilulosa-cinasa es al menos 5 unidades cuando es determinada por la Prueba T6. Típicamente, la cepa del noveno aspecto tiene una velocidad de crecimiento de al menos una generación por 48 horas utilizando xilosa como una fuente única de carbono. En una modalidad, la cepa produce al menos un incremento de 2 veces en la biomasa cuando se desarrolla bajo las condiciones especificadas en la Prueba Ti. Típicamente, la cepa produce al menos un incremento de 5 veces en la biomasa cuando se desarrolla bajo las condiciones especificadas en la Prueba TI. Más típicamente, la cepa produce al menos un incremento de 5 veces en la biomasa cuando se desarrolla bajo las condiciones especificadas en la Prueba TI . La cepa puede producir al menos 10 mg de peso seco de la biomasa bajo las condiciones especificadas en la Prueba T2. La cepa puede producir al menos 30 mg de peso seco de la biomasa bajo las condiciones especificadas en la Prueba T2.

La cepa puede producir al menos 40 mg de peso seco de la biomasa bajo las condiciones especificadas en la Prueba T2. Típicamente, la cepa puede producir al menos 50 mg de peso seco de la biomasa bajo las condiciones especificadas en la Prueba T2. La cepa puede producir al menos 0.01 g de peso seco de la biomasa por 50 ml de cultivo cuando se desarrolla bajo las condiciones especificadas en la Prueba T2. La cepa de Saccharomyces puede además ser capaz de utilizar xilitol como una fuente única de carbono para el crecimiento. Típicamente, la capacidad de la cepa para utilizar xilitol como una fuente única de carbono, es obtenida a través de métodos no recombinantes . En una modalidad, la cepa produce al menos un incremento de 5 veces en la biomasa cuando se desarrolla bajo las condiciones especificadas en la Prueba T7. La cepa de Saccharomyces puede ser capaz de desarrollarse aeróbica o anaeróbicamente utilizando xilosa como una fuente única de carbono. Típicamente, el crecimiento es el crecimiento aeróbico. No obstante, la cepa de Saccharomyces puede también desarrollarse anaeróbicamente o microaerofílicamente utilizando xilosa como una fuente única de carbono. La cepa de Saccharomyces puede ser capaz de desarrollarse sobre glucosa bajo condiciones anaeróbicas.

La cepa de Saccharomyces puede además ser capaz de utilizar xilosa para producir uno o más de un compuesto basado en carbono. Los ejemplos de compuestos basados en carbono, adecuados, incluyen alcoholes, xilitol, ácidos orgánicos tales como ácido acético, glicerol, dióxido de carbono, u otros componentes de levadura, metabolitos y subproductos que incluyen extractos de levadura, proteínas, péptidos, aminoácidos, RNA, nucleótidos, glucanos, etc., típicamente, el alcohol es etanol. La cepa puede producir etanol cuando se desarrolla sobre xilosa. La cepa puede utilizar la xilosa para producir etanol sin desarrollarse sobre la xilosa. La cepa puede producir etanol a partir de la xilosa. Típicamente, la cepa fermenta la xilosa para producir etanol. La cepa puede producir etanol a una concentración de al menos 0.1 g/litro bajo las condiciones especificadas en la Prueba T3. La cepa puede producir etanol a una concentración de al menos 0.4 g/litro bajo las condiciones especificadas en la Prueba T8. La cepa puede producir etanol a una concentración de al menos 0.2 g/litro dentro de un periodo de 4 meses bajo las condiciones especificadas en la Prueba T9. La cepa puede producir al menos 0.5 g de etanol por litro cuando es inoculada a una densidad celular de al menos 5 x 108 células por ml en el medio mineral que contiene xilosa. El medio mineral mínimo que contiene xilosa puede contener glucosa. Típicamente, la cepa produce 0.5 g/litro de etanol dentro de 5 horas de inoculación del medio. En una modalidad, la cepa fermenta la xilosa para producir al menos 0.05 gramos de etanol por litro de cultivo bajo las condiciones especificadas en la Prueba T3. La cepa puede ser capaz de utilizar xilosa como una fuente única de carbono para desarrollarse sobre el medio sólido, y/o en el medio líquido. En una modalidad, la cepa es capaz de desarrollarse en medio líquido que contiene xilosa como una fuente única de carbono. El medio líquido puede ser un medio mineral líquido que contiene xilosa como una fuente única de carbono. La cepa de Saccharomyces puede ser una cepa de cualquier especie del género Saccharomyces . Los ejemplos de especies adecuadas de levaduras incluyen S cerevisiae, S . paradoxus, S. mikatae, S. cariocanus, S . kudriavzevii , S. pastorianus y S . bayanus . Típicamente, la especie es Saccharomyces cerevisiae . Típicamente la cepa será capaz de aparearse con Saccharomyces de la misma especie. Típicamente, la cepa será capaz de aparearse con Saccharomyces cerevisiae . Típicamente, la cepa es Saccharomyces cerevisiae . En una modalidad del octavo a noveno aspecto, la cepa de Saccharomyces es recombinante . En un décimo aspecto, la invención proporciona una cepa de Saccharomyces no recombinante aislada, que produce un incremento en la biomasa de al menos dos veces bajo las condiciones especificadas en la Prueba Ti. En una modalidad, el incremento en la biomasa es al menos de 5 veces, típicamente al menos de 10 veces. En un décimo primer aspecto, la invención proporciona una cepa de Saccharomyces no recombinante, aislada, que tiene las siguientes características: (a) la biomasa de la cepa se incrementa al menos 5 veces bajo las condiciones especificadas en la Prueba TI; (b) se producen al menos 10 mg de peso seco de biomasa bajo las condiciones especificadas en la Prueba T2. En un duodécimo aspecto, la invención proporciona una cepa de Saccharomyces no recombinante, aislada, que tiene las siguientes características: (a) la biomasa de la cepa se incrementa al menos 10 veces bajo las condiciones especificadas en la Prueba TI; (b) se producen al menos 50 mg de peso seco de biomasa bajo las condiciones especificadas en la Prueba T2. (c) una concentración de al menos 0.1 g/litro de etanol es detectada bajo las condiciones especificadas en la Prueba T3 ; (d) al menos un nanomol de NAD(P)H es reducido u oxidado por minuto por mg de extracto de proteína, a 30°C bajo las condiciones especificadas en la Prueba T4 ; y (e) al menos un nanomol de NAD(P)H es reducido u oxidado por minuto por mg de extracto de proteína, a 30°C bajo las condiciones especificadas en la Prueba T5. En un décimo tercer aspecto, la invención proporciona una cepa de Saccharomyces no recombinante, aislada, que tiene las siguientes características: (a) la biomasa de la cepa se incrementa al menos 5 veces bajo las condiciones especificadas en la Prueba Ti; (b) se producen al menos 40 mg de peso seco de biomasa bajo las condiciones especificadas en la Prueba T2. (c) la biomasa de la cepa se incrementa al menos 5 veces bajo las condiciones especificadas en la Prueba T7 ; (d) es detectada una concentración de al menos 0.04 g/litro de etanol bajo las condiciones especificadas en la Prueba T8 ; (e) al menos un nanomol de NAD(P)H es reducido u oxidado por minuto por mg de extracto de proteína, a 30°C bajo las condiciones especificadas en la Prueba T4 ; y (f) al menos un nanomol de NAD(P)H es reducido u oxidado por minuto por mg de extracto de proteína, a 30°C bajo las condiciones especificadas en la Prueba T5. Los ejemplos de cepas adecuadas de Saccharomyces que son capaces de desarrollarse a una velocidad de al menos una generación por 48 horas utilizando xilosa como una fuente única de carbono para el crecimiento, son aquellas que son depositadas bajo el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para Fines de Procedimientos de Patente en los Laboratorios Analíticos del Gobierno Australiano, 1 Suakin Street, Pymble, NSW 2073, Australia, bajo el depósito número de acceso NM04/41257, NM04/41258, NM05/45177 (ISO 10) y NM05/45178 (ISO 7) . Los número de acceso de depósito NM04/41257 y NM04/41258 fueron depositados el 12 de mayo del 2004. Los números de acceso de depósito NM05/45177 y NM05/45178 fueron depositados el 16 de mayo de 2005. La cepa de Saccharomyces puede ser obtenida mediante cualquier método referido en la presente, en la cual es obtenida la habilidad de utilizar xilosa como una fuente única de carbono para el crecimiento, mediante métodos no recombinantes . Los métodos que pueden ser empleados para obtener la cepa incluyen combinaciones de, la selección natural, procedimientos de apareamiento, mutagénesis, u otros métodos genéticos denominados clásicos, conocidos por aquellos expertos en la técnica y discutidos y referidos en, por ejemplo, Attfield y Bell (2003) "Genetics and classical genetic manipulations of industrial yeasts" en, Topics in Current Genetics, Vol. 2. Functional Genetics Industrial yeasts (J.H. de Winde, ed. ) , Springer-Verlag Berlín Heidelberg o combinaciones de las mismas. La habilidad para desarrollarse a una velocidad de al menos una generación por 48 horas utilizando xilosa como una fuente única de carbono, es típicamente obtenida mediante el apareamiento entre las cepas de Saccharomyces y la clasificación o selección para la velocidad incrementada de crecimiento utilizando xilosa como una fuente única de carbono . Por ejemplo, la cepa puede ser obtenida al conducir apareamientos raros o dirigidos o en masa entre las cepas de Saccharomyces sexualmente compatibles, seguido por la selección para cepas que son capaces de utilizar xilosa como una fuente única de carbono. La cepa puede ser derivada de uno o más aislados de origen natural de Saccharomyces , aislados espontáneamente mutados, o puede ser obtenida mediante la exposición de una o más cepas de Saccharomyces a un mutágeno, y subsecuentemente utilizada en estrategias de apareamiento y selección para clasificar o seleccionar una cepa mutante que es capaz de utilizar xilosa como una fuente única de carbono. La cepa obtenida puede ser seleccionada mediante cualquiera de los métodos de selección a los que se hace referencia en la presente. En un décimo cuarto aspecto, la invención proporciona un derivado de una cepa del cuarto al décimo tercer aspectos.

Los métodos para la producción de los derivados de las cepas de levadura son bien conocidos en la técnica, e incluyen apareamientos con otras cepas de levadura, fusiones celulares, mutagénesis y/o métodos recombinantes. En un décimo quinto aspecto, la invención proporciona el uso de una cepa de Saccharomyces del cuarto al décimo quinto aspectos, o un derivado del décimo cuarto aspecto, en la producción de biomasa de levadura. La biomasa de levadura puede ser utilizada en, por ejemplo, la industria de la panadería, para productos de biomasa. En un décimo sexto aspecto, la invención proporciona el uso de una cepa de Saccharomyces del cuarto al décimo tercer aspectos, o un derivado del décimo cuarto aspecto, para la producción de etanol a partir de xilosa. En un décimo séptimo aspecto, la invención proporciona un método para la producción de etanol que comprende incubar una cepa de Saccharomyces del cuarto al décimo tercer aspectos, o un derivado del décimo cuarto aspecto, con un medio que contiene xilosa, bajo las condiciones que permiten que la cepa fermente la xilosa para producir etanol . En un décimo octavo aspecto, la invención proporciona un método para convertir la xilosa a biomasa de levadura, que comprende cultivar una cepa de Saccharomyces del cuarto al décimo tercer aspectos, o un derivado del décimo cuarto aspecto, con un medio que contiene xilosa, bajo condiciones que permiten que la cepa se desarrolle utilizando xilosa como una fuente única de carbono para el crecimiento. En un décimo noveno aspecto, la invención proporciona un método para producir biomasa de levadura que comprende desarrollar una cepa de Saccharomyces sobre o en un medio que contiene xilosa, en donde al menos una porción de la biomasa de levadura es producida utilizando xilosa como una fuente de carbono para el crecimiento. En un vigésimo aspecto, la invención proporciona un método para producir un compuesto a partir de una cepa de Saccharomyces , que comprende cultivar la cepa de Saccharomyces sobre o en un medio que contiene xilosa, bajo condiciones que permiten la producción del compuesto, en donde el compuesto es producido por la cepa utilizando xilosa como una fuente de carbono. En una modalidad, el compuesto es producido por la cepa durante el crecimiento utilizando xilosa como una fuente de carbono . En una modalidad, el método comprende el paso adicional de recuperar el compuesto. El compuesto puede ser cualquier compuesto que pueda ser producido por la cepa de Saccharomyces . Los ejemplos de compuestos adecuados incluyen etanol, C02, enzimas, enzimas recombinantes, proteínas recombinantes, subproductos de levadura, vitaminas, nucleótidos, ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, lípidos, proteínas de levadura, xilitol. Podrá ser apreciado por aquellos expertos en la técnica que el desarrollo de las células de levadura produce biomasa, y por lo tanto cualquier método que de cómo resultado el crecimiento, dará como resultado producción de biomasa. De este modo, por ejemplo, la producción etanol a partir del crecimiento sobre el medio que contiene xilosa producirá además biomasa. En una modalidad, los compuestos están contenidos dentro de las células de levadura en biomasa y los compuestos pueden ser recuperados de las células de levadura utilizando métodos bien conocidos en la técnica para extraer compuestos de las células de levadura. En un vigésimo primer aspecto, la invención proporciona un compuesto producido mediante el método del décimo octavo aspecto. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA FIGURA La Figura 1 muestra una gráfica del tiempo de duplicación promedio de una población de cepas de Saccharomyces cerevisiae sobre el tiempo, después de la aplicación del método de la invención. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La práctica de la presente invención emplea, a no ser que se indique de otro modo, microbiología convencional y genética clásica. Tales técnicas son conocidas para el experto en la materia, y son explicadas completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, Sherman et al. "Methods in Yeast Genetics" (1981) Cold Spring Harbor Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Patente Europea EP-0,511,108 B. Se debe entender también que la terminología utilizada en la presente es para fines de describir las modalidades particulares únicamente, y no se pretende que limite el alcance de la presente invención la cual será limitada únicamente por las reivindicaciones anexas. Se debe notar que como se utiliza en la presente y en las reivindicaciones anexas, las formas singular "un, uno, una" y "el, la" incluyen la referencia plural, a no ser que el contexto lo indique claramente de otro modo. De este modo, por ejemplo, una referencia a "una célula" incluye una pluralidad de tales células. A no ser que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que es comúnmente entendido por alguien que tenga experiencia ordinaria en la técnica a la cual pertenece esta invención. Aunque pueden ser utilizados cualesquiera materiales y métodos similares o equivalente a aquellos descritos aquí, para practicar o probar la presente invención, son ahora descritos los métodos y materiales preferidos. Todas las publicaciones mencionadas en la presente son citadas para fines de describir y detallar los protocolos y reactivos que son reportados en las publicaciones y que puedan ser utilizados en conexión con la invención. Nada en la presente debe ser considerado como una admisión de que la invención no está autorizada para antefechar tal descripción en virtud de la invención previa. La xilosa es un azúcar que es barata, puede ser obtenida a partir de una fuente renovable, y está disponible en grandes cantidades. La xilosa puede representar una porción significativa de la biomasa vegetal hemicelulósica. La biomasa vegetal incluye residuos agrícolas, desechos de papel, troceados de madera y similares, y es renovable, y disponible a bajo costo en grandes cantidades. La xilosa está principalmente presente en la biomasa vegetal hemicelulósica como polímeros conocidos como xilano y hemicelulosa . Los polímeros de xilosa pueden ser fácilmente escindidos en azúcares monoméricos ya sea por medios químicos tales como hidrólisis acida, o por medios enzimáticos utilizando enzimas tales como xilanasa. En la fabricación de papel por ejemplo, la xilosa es uno de los azúcares principales en la corriente de desecho, donde ésta contribuye a la demanda biológica de oxígeno (BOD) y por ende hace la disposición del agua de desecho, ambientalmente difícil. Por cada kilogramo de papel producido a partir de madera dura, son producidos típicamente 100 gramos de azúcar, 35 gramos de los cuales es xilosa. Debido a su abundancia, la xilosa presenta una fuente de carbono potencial mayor para producir biomasa de levadura y subproductos del metabolismo de levaduras, tales como etanol. En un aspecto, se proporciona una cepa de Saccharomyces que es capaz de desarrollarse a una velocidad de al menos una generación por 48 horas utilizando xilosa como una fuente única de carbono. Los inventores han encontrado que es posible obtener cepas de Sa ccharomyces que son capaces de desarrollarse de manera relativamente rápida utilizando xilosa como una fuente única de carbono sin la necesidad de utilizar tecnología de ADN recombinante. Éste es un resultado inesperado ya que se creía previamente que las cepas de Sa ccharomyces no eran capaces de desarrollarse sobre xilosa como una fuente única de carbono. Hasta la presente invención, las cepas de Sa ccharomyces capaces de desarrollarse a velocidades de al menos una generación por 48 horas utilizando xilosa como fuente única de carbono, han sido únicamente obtenidas por introducción dentro de las cepas de Saccharomyces , de genes de utilización de xilosa, clonados, provenientes de otros organismos que son capaces de desarrollarse sobre xilosa. Alternativamente, las combinaciones no de origen natural de los promotores génicos de Saccharomyces clonados y las secuencias de ADN de Sa ccharomyces clonadas, han sido generadas utilizando métodos recombinantes e introducidas dentro de las cepas de Sa ccharomyces . De este modo, antes de la presente invención, no había sido posible la obtención de cepas de Sa ccharomyces capaces de utilizar xilosa como una fuente única de carbono, a no ser que los genes de utilización de xilosa provenientes de otros organismos que son capaces de desarrollarse sobre xilosa, hayan sido clonados e introducidos dentro de la cepa de Sa ccharomyces , o promotores de genes fuertes de Sa ccharomyces han sido operablemente enlazados a otras secuencias de ADN de Sa ccharomyces e introducidas dentro de la cepa de Sa ccharomyces utilizando métodos de ADN recombinante. Antes de la presente invención, ninguna levadura no recombinante proveniente del género Saccharomyces era capaz de tener una velocidad de crecimiento de al menos una generación por 48 horas utilizando xilosa como una fuente única de carbono. La Patente de los Estados Unidos No. 4,511,656 describe la levadura cepa ATCC No. 20618 que es un mutante de levadura no recombinante, que es capaz de producir etanol cuando se incuba en medio que contiene xilosa. No obstante, ATCC 20618 no es proveniente del género Saccharomyces . La morfología de las colonias producidas por ATCC No. 20618 no es consistente con aquellas producidas por Saccharomyces . ATCC No. 20618 no se esporula, tampoco se aparea con las cepas estándares de Saccharomyces cerevisiae, y el secuenciamiento de las regiones ITS y la región intergénica de histona H3-H4 de ATCC No. 20618, revela que ésta no es del género Saccharomyces , sino que está estrechamente relacionada a Candi da tropi cal i s . En consecuencia, ATCC No. 20618 es filogenéticamente distante de Sa ccharomyces , como es definido por Kurtz an (2003) FEMS Yeast Research 4: 233-245 y como se define en la presente. Candi da tropi ca l i s es bien conocida por utilizar xilosa. Además, los mutantes descritos en la Patente de los Estados Unidos No. 4,511,656 fueron únicamente demostrados como productores de etanol cuando son provistos con nutrientes adecuados tales como extracto de levadura, extracto de malta y peptona en el medio de crecimiento. Estos nutrientes del crecimiento proporcionan fuentes de carbono fermentables alternativas a la xilosa. De este modo, la Patente de los Estados Unidos No. 4,511,656 no describe las cepas de Sa ccharomyces que sean capaces de desarrollarse sobre, o que fermenten, la xilosa como una fuente única de carbono.

Además, la Patente de los Estados Unidos No. 4,511,656 enseña que las levaduras capaces de producir etanol son seleccionadas, las cuales forman colonias sobre la xilosa, pero no sobre el xilitol. Sin desear estar comprometidos por alguna teoría, los inventores creen que de manera contraria a la enseñanza de la Patente de los Estados Unidos No. 4,511,656, el metabolismo del xilitol, el cual es un intermediario en la utilización de la xilosa, puede esperarse que sea ventajoso para desarrollarse sobre xilosa y producción de etanol a partir de xilosa. Los inventores, han encontrado, de manera contraria a la enseñanza de la técnica anterior, que no solamente son las cepas de Sa ccharomyces capaces de desarrollarse muy lentamente sobre xilosa como una fuente única de carbono, sino que la velocidad de crecimiento utilizando xilosa como una fuente única de carbono de las cepas de Saccharomyces , puede ser incrementada sin introducir genes clonados de utilización de xilosa. En un aspecto, se proporciona una cepa aislada de Sa ccharomyces que es capaz de desarrollarse a una velocidad de al menos una generación por 48 horas, utilizando xilosa como una fuente única de carbono. Como se utiliza en la presente, una cepa de Saccharomyces es una cepa del género Saccharomyces como se define en Kurtzman (2003) FEMS Yeast Research Vol. 4, p. 233-245. Como se utiliza en la presente, la expresión "capaz de desarrollarse a una velocidad de al menos una generación por 48 horas utilizando xilosa como una fuente única de carbono para el crecimiento" significa que la cepa es capaz de utilizar xilosa como la fuente única de carbono para la generación de energía, y la síntesis de moléculas que son necesarias para el desarrollo de la cepa, para alcanzar una velocidad de crecimiento de al menos una generación por 48 horas. El término "una generación" será claro para aquellos expertos en la técnica lo cual significa un ciclo de división celular. La cepa será capaz preferentemente de desarrollarse en medio sólido y líquido en el cual la xilosa es la fuente única de carbono. Podrá ser apreciado por las personas expertas en la técnica que una cepa que es capaz de desarrollarse a una velocidad de al menos una generación por 48 horas utilizando xilosa como fuente única de carbono, será capaz de desarrollarse sobre medio mineral mínimo sólido y/o líguido, en el cual la xilosa es la fuente única de carbono. Un ejemplo de un medio líquido adecuado es la base de nitrógeno de levadura de DIFCO Laboratories, comercialmente disponible, sin aminoácidos, que contiene todas las sales inorgánicas esenciales y las vitaminas necesarias para el cultivo de las levaduras excepto una fuente de carbohidrato o aminoácidos, suplementada con entre 0.01% y 50% de xilosa, típicamente 1% y 10% de xilosa, adecuadamente 5% de xilosa. Típicamente, el medio sólido es el medio líquido que ha sido solidificado por la adición de un agente gelificante tal como agar. Podrá ser apreciado también por las personas expertas en la técnica que una cepa que es capaz de desarrollarse utilizando xilosa como una fuente única de carbono, puede ser también capaz de desarrollarse sobre otros muchos azúcares. La capacidad de la cepa para utilizar xilosa como una fuente única de carbono, es obtenida por métodos no recombinantes. Como se utiliza en la presente, la expresión "métodos no recombinante" se refiere a cualesquiera métodos que no utilizan tecnología de ADN recombinante para producir en la cepa de Saccharomyces la habilidad para utilizar xilosa. En otras palabras, los genes que confieren a la cepa la habilidad para utilizar xilosa para el desarrollo, no han sido introducidos dentro de la cepa utilizando métodos recombinantes. Como se utiliza en la presente, un "método recombinante" es un método en el cual uno o más genes son introducidos dentro de un organismo utilizando técnicas de ADN recombinantes. Como se utiliza en la presente, las técnicas de ADN recombinantes se refieren a las técnicas en las cuales la información genética es manipulada in vi tro, tal como cuando los genes son aislados y clonados a partir de un organismo. De este modo, los métodos no recombinantes son métodos que no involucran la manipulación de información genética in vi tro . Una cepa no recombinante es una cepa dentro de la cual no ha sido introducido ácido nucleico recombinante. Los métodos no recombinantes pueden incluir, por ejemplo, mutagénesis, apareamiento clásico, citoducción, fusión celular tal como fusión de protoplastos, y combinaciones de los mismos. El método no recombinante puede comprender el cultivo de una población de células de levadura genéticamente diversas de Saccharomyces bajo condiciones que permiten la combinación del ADN entre las células de levadura in vivo, y clasificando o seleccionando las células de levadura que tengan una velocidad de crecimiento incrementada utilizando xilosa como una fuente única de carbono, típicamente mediante la incubación de una población genéticamente diversa de células de levadura en o sobre medio que contiene xilosa, por un tiempo suficiente para seleccionar las células de levadura que tengan una velocidad de crecimiento incrementada utilizando xilosa como una fuente única de carbono. Podrá ser comprendido por aquellos expertos en la técnica que la información genética que confiere la habilidad de la cepa de Saccharomyces para desarrollarse a una velocidad de al menos una generación por 48 horas utilizando xilosa como una fuente única de carbono, es obtenida a partir del género Saccharomyces . En otras palabras, toda la información genética necesaria para el desarrollo a una velocidad de al menos una generación por 48 horas, es obtenida dentro del combinado génico del género Saccharomyces . Típicamente, la información genética que confiere la habilidad de la cepa de Saccharomyces para desarrollarse a una velocidad de al menos una generación por 48 horas, utilizando xilosa como una fuente única de carbono, para el desarrollo, es obtenida a partir de una población genéticamente diversa de las cepas no recombinantes de Saccharomyces . Como se discutió anteriormente, antes de la presente invención, el combinado génico del género Saccharomyces se pensaba que no contenía la información genética para conferir la habilidad para utilizar xilosa como una fuente única de carbono para el crecimiento. En otro aspecto más, se proporcionan cepas aisladas de Saccharomyces que tienen la habilidad para desarrollarse sobre xilosa como una fuente única de carbono, a una velocidad de crecimiento de al menos una generación por 48 horas, y que son capaces de expresar la enzima no recombinante que tiene una actividad seleccionada del grupo que consiste de xilosa-reductosa y xilitol-deshidrogenasa. La enzima tiene una actividad de al menos una unidad como es determinado por la Prueba T4 para la xilosa-reductasa, y la Prueba T5 para la xilitol-deshidrogenasa. Las Pruebas T4 y T5 son definidas en la presente. En una modalidad, la actividad de xilosa-reductasa es de al menos 1.5 unidades, adecuadamente al menos 3 unidades. En una modalidad, la actividad de xilitol-deshidrogenasa es al menos de 5 unidades, adecuadamente al menos de 8 unidades. Se proporciona también un método para producir una cepa de Saccharomyces que es capaz de desarrollarse a una velocidad de crecimiento deseada utilizando xilosa como una fuente única de carbono. La "velocidad de crecimiento deseada" puede ser cualquier velocidad de crecimiento que sea mayor que la velocidad de crecimiento de las células de levadura de Saccharomyces , antes de la aplicación del método de la invención. La velocidad de crecimiento deseada será mayor que la velocidad de crecimiento de la cepa de Saccharomyces cerevisiae NL67 sobre xilosa como una fuente única de carbono. La velocidad de crecimiento deseada puede ser al menos una generación por 48 horas, adecuadamente más de una generación por 24 horas, adecuadamente más de una generación por 12 horas, típicamente mayor de una generación por 10 horas, más típicamente mayor de una generación por 8 horas, y puede ser tan alta como la velocidad de crecimiento de Saccharomyces sobre glucosa, la cual es de aproximadamente una generación por 80 minutos. El método comprende la provisión de una población de células de levaduras no recombinantes, genéticamente diversas de Saccharomyces . Como se utiliza en la presente, la expresión "células de levadura no recombinantes, genéticamente diversas" se refiere al menos a dos células de levadura no recombinante que tienen genotipos distintos. Las células de levadura no recombinantes, genéticamente diversas pueden ser una mezcla de células de levadura de diferentes cepas de Saccharomyces obtenidas de la naturaleza, del vino, de la destilación y de la fermentación de cerveza, a partir de aplicaciones panadería, o de cualquier otra fuente de Saccharomyces . La población de células de levadura no recombinantes, genéticamente diversas de Saccharomyces puede ser derivada de una cepa simple que es esporulada para derivar progenie genéticamente diversa. La población genéticamente diversa de las células de levadura no recombinantes de Saccharomyces, puede incluir una o más células de levadura de las cepas de Saccharomyces que han sido expuestas a un mutágeno físico o químico tal como, por ejemplo, luz ultravioleta, rayos X o rayos Gamma, o etilmetansulfonato, nitrosoguanidina, mitomicina C, bleomicina, o cualesquiera otros agentes que provocan alteraciones a las secuencias de base de ADN. De este modo, las células de levadura no recombinantes, genéticamente diversas incluyen dentro de su alcance las células de levadura de cepas que han sido generadas por mutagénesis.

Los métodos para la mutagénesis de levadura, y en particular, la mutagénesis de Saccharomyces cerevisiae , son conocidos para las personas expertas en la técnica y se describen en, por ejemplo, Sherman et al. "Methods in Yeast Genetics" (1981) Cold Spring Harbor Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York. La población genéticamente diversa de las células de levadura no recombinantes de Saccharomyces puede incluir también células de levadura con mutaciones que ocurren espontáneamente. La población de las células de levadura no recombinantes, genéticamente diversas de Saccharomyces , pueden ser todas de la misma especie, o pueden ser de diferentes especies de Saccharomyces . Típicamente, las diferentes especies son capaces de aparearse una entre la otra. Por ejemplo, la población de células de levadura no recombinantes, genéticamente diversas, pueden comprender diferentes cepas de Saccharomyces cerevisiae , o cualquier otra especie de Saccharomyces , obtenidas de cualquiera de las fuentes anteriormente mencionadas. Los ejemplos de especies de Saccharomyces incluyen S. cerevisiae , S. paradoxus , S. mikatae , S. cariocanus , S. kud iavzevii , S. pastorianus y S. bayanus . Típicamente, la población de células de levadura, genéticamente diversas de Sa ccharomyces , son de la misma especie. Típicamente, la especie es Saccharomyces cerevisiae . Los ejemplos de levaduras que podrían ser utilizadas para proporcionar inóculos iniciales para poblaciones de células de levadura no recombinantes, genéticamente diversas, incluyen cepas de Sa ccharomyces disponibles de las colecciones de cultivo bien conocidas tales como la Colección Norteamericana de Cultivos de Especies (American Type Culture Collection (ATCC)), por ejemplo ATCC 4111, ATCC 26603, ATCC 38559, la Colección Nacional de Cultivos de Levadura (National Collection of Yeast Cultures (NCYC)) por ejemplo S . cerevi si a e NCYC 995, NCYC 996, el Central Bureau voor Schimmel Cultures (CRBS) por ejemplo S . cerevi si a e CBS 745.95, CBS 755.95 o aisladas de levaduras comercialmente disponibles vendidas por cualquier número de compañías, para el uso en formulaciones tradicionales tales como panadería, producción de cerveza, producción de vino, destilación, etc. La población de células de levadura no recombinantes, genéticamente diversas de Saccharomyces , son cultivadas bajo condiciones que permiten la combinación del ADN entre las células de levadura. La combinación del ADN entre las células de levadura puede ser mediante cualquier método adecuado para combinar el ADN de al menos dos células de levadura, con la condición de que el método no sea un método recombinante. Los ejemplos de métodos adecuados para combinar el ADN de células de levadura, incluyen el apareamiento y la citoducción. Como se utiliza en la presente, el término "apareamiento" se refiere al proceso de intercambio y recombinación de ADN entre al menos dos células de levadura, incluyendo mediante los métodos clásicos de apareamiento genético, apareamiento dirigido, apareamiento en masa, apareamiento raro, fusión de células, etc. Por ejemplo, los cruces genéticos clásicos o la fusión celular pueden ser utilizados para generar híbridos intraespecíficos o interespecíficos. En una modalidad, las células de levadura son cultivadas bajo condiciones que permiten el apareamiento entre las células de levadura. Típicamente, las células de levadura son cultivadas bajo condiciones que permiten el apareamiento por esporulación de las células de levadura y después de esto el apareamiento de la levadura esporulada. Por ejemplo, las células de levadura pueden ser apareadas por : (a) esporulación de las células de levadura; (b) germinación de las células de levadura esporuladas; (c) hibridación de los tipos de apareamiento compatibles de las células de levadura esporulada . Típicamente, las células de levadura son apareadas por: (a) combinación de la población de células de levadura no recombinantes, genéticamente diversas; (b) esporulación de las células combinadas y germinación de las esporas para producir células haploides; (c) hibridación de los tipos de apareamiento compatibles de las células haploides, para producir células de levadura híbridas . Los métodos para la esporulación, la obtención de haploides y la hibridación de los haploides para producir células de levadura híbridas, son conocidos en la técnica y son descritos en, por ejemplo, el Capítulo 7 de "Sporulation and Hybridisation of Yeast" por R.R. Fowell, en "The Yeasts", vol 1, editada por A.H. Rose y J.S. Harrison, 1969, Academic Press; EP-0,511,108 B. Típicamente, el apareamiento es apareamiento en masa. El apareamiento en masa involucra el cultivo de al menos dos y típicamente millones de diferentes células de levadura conjuntamente de una manera que permite que ocurra el apareamiento entre tipos compatibles de apareamiento. Los métodos para el apareamiento en masa son descritos en, por ejemplo, Higgins et al. (2001), Applied and Environmental Microbiology, Vol. 67, p. 4346-4348; Lindegren (1943), Journal of Bacteriology, Vol. 46, p. 405-419. En otra modalidad, las levaduras son cultivadas bajo condiciones que permiten la fusión celular. Los métodos para la generación de híbridos intraespecíficos o interespecíficos utilizando técnicas de fusión celular, se describen en, por ejemplo, Morgan (1983) Experientia suppl. 46: 155-166; Spencer et al. (1990) en Yeast Technology, Spencer JFT y Spencer DM (eds.), Springer Verlag New York. Los métodos de citoinducción son descritos en, por ejemplo, Inge-Vechtomov et al. (1986) Genetika 22: 2625-2636; Johnston (1990), en Yeast Technology, Spencer JFT y Spenser DM (Eds.), Springer Verlag New York; Polaina et al. (1993) Current Genetics 24: 369-372. Las células de levadura son seleccionadas o clasificadas para células de levadura que tienen una velocidad de crecimiento incrementada, utilizando xilosa como una fuente única de carbono para el crecimiento. Las células de levadura son clasificadas o seleccionadas para enriquecer o identificar las células de levadura que tiene una velocidad incrementada de crecimiento utilizando xilosa como una fuente única de carbono. Las células de levadura son seleccionadas o clasificadas típicamente mediante la incubación de las células de levadura sobre o en un medio que contiene xilosa. Las células de levadura son seleccionadas o clasificadas para aquellas células de levadura que tienen una habilidad mejorada para desarrollarse utilizando xilosa como una fuente única de carbono para el crecimiento. La habilidad mejorada típicamente será un incremento en la velocidad de crecimiento utilizando xilosa como una fuente única de carbono, hacia la velocidad de crecimiento deseada. Un incremento en la velocidad de crecimiento es un incremento en la velocidad de crecimiento de una célula de levadura, con relación a la velocidad de crecimiento de las células antes de cultivar las células de levadura bajo condiciones que permiten la combinación del ADN entre las células de levadura. En una modalidad, las células de levadura son seleccionadas. Los términos "seleccionada" o "selección" se refieren a un proceso en el cual las células de levadura que tienen una habilidad mejorada para desarrollarse utilizando xilosa como una fuente única de carbono para el crecimiento a la velocidad de crecimiento deseada, se llegan a enriquecer en la población. Las células de levadura pueden ser seleccionadas mediante la incubación de las células de levadura sobre o en el medio que contiene xilosa, por un tiempo suficiente para permitir que las células de levadura sean capaces de desarrollarse sobre xilosa como una fuente única de carbono para desarrollarse utilizando xilosa como la fuente de carbono, y después de esto se recolectan las células de levadura que se desarrollan. Los inventores han encontrado que al incubar las células de levadura por un tiempo suficiente para permitir que la levadura de crecimiento incluso lento se desarrolle utilizando xilosa como una fuente de carbono, y después de esto se recolectan las células de levadura que crecen, incluyendo las células de levadura que crecen lentamente, las células de levadura que crecen más rápidamente representan una mayor proporción de las células de levadura recolectadas y por lo tanto son enriquecidas en las células de levadura recolectadas, pero la diversidad genética de la población de células de levadura es sustancialmente mantenida también mediante la inclusión de células de levadura de crecimiento lento. Por ejemplo, al sembrar en placas células de levadura apareadas sobre medio mínimo sólido que contiene xilosa como una fuente única de carbono, las células capaces de utilizar más rápidamente la xilosa como una fuente única de carbono, podrían generar colonias más grandes, y como consecuencia, esas células serían seleccionadas y el o los genotipos deseados enriquecidos en la población. Sin embargo, también mediante la recolección de las colonias más pequeñas, la diversidad genética de la población podría ser sustancialmente mantenida para la siguiente repetición de los pasos (b) y (c) . De este modo, al incubar las células de levadura sobre medio que contiene xilosa, por un tiempo suficiente para permitir que las células de levadura se desarrollen utilizando xilosa como una fuente de carbono, es posible no solamente seleccionar aquellas células de levadura con velocidad de crecimiento incrementada sobre xilosa, sino también mantener la diversidad genética de la población por ciclos repetidos de los pasos (b) y (c) . La selección aumentada puede ser aplicada al reducir el tiempo en que las células de levadura son incubadas sobre el medio que contiene xilosa, tal que únicamente las células de levadura que se desarrollan utilizando la xilosa como una fuente de carbono dentro de un periodo de tiempo preseleccionado, son seleccionadas. Las células de levadura de este tipo pueden ser seleccionadas al incubar las células de levadura sobre o en el medio que contiene xilosa, por un tiempo suficiente para permitir que las células de levadura tengan una velocidad de crecimiento incrementada utilizando xilosa como una fuente única de carbono para desarrollarse utilizando xilosa como la fuente de carbono, y después de esto recolectar las células de levadura que se desarrollan. Utilizando este procedimiento, es colocada mayor presión selectiva sobre las células de levadura para desarrollarse a una velocidad incrementada, pero ya que es probable que el tiempo sea insuficiente para que se desarrolle una porción de las células de levadura que se desarrollan lentamente, puede perderse cierta diversidad genética para repeticiones posteriores de los pasos (b) y (c) . En otra modalidad más, las células de levadura son seleccionadas. Como se utiliza en la presente, los términos "seleccionado" o "selección" se refiere a un proceso en el cual las células de levadura que tienen una habilidad mejorada para desarrollarse utilizando xilosa como una fuente única de carbono para el desarrollo a la velocidad de crecimiento deseada, son primeramente identificadas, y subsecuentemente aisladas. Las células de levadura pueden ser seleccionadas mediante la incubación de las células de levadura sobre o en el medio que contiene xilosa, por un tiempo suficiente para permitir que las células de levadura que tiene una velocidad de crecimiento incrementada utilizando xilosa como una fuente única de carbono, se desarrollen utilizando xilosa como la fuente de carbono, y después de esto se recolectan las células de levadura que se desarrollan más rápidamente, utilizando la xilosa como una fuente de carbono. Por ejemplo, las células de levadura que tiene una habilidad mejorada para desarrollarse utilizando xilosa como una fuente única de carbono, pueden ser identificadas sobre medio rico que contiene xilosa, como aquellas células que se desarrollan más rápidamente, y por lo tanto forman colonias más grandes que las células de levadura que no tienen una habilidad mejorada para desarrollarse utilizando xilosa como una fuente única de carbono. Las colonias más grandes que aparecen sobre la placa pueden por lo tanto ser aisladas en preferencia a las colonias más pequeñas, para aislar por ende las células de levadura que tienen una habilidad mejorada para desarrollarse utilizando xilosa como una fuente única de carbono, para el crecimiento a una velocidad de crecimiento deseada. Como se discutió anteriormente, las células de levadura son seleccionadas o clasificadas típicamente por incubación de las células de levadura sobre o en un medio que contiene xilosa. Un "medio que contiene xilosa " puede ser cualquier medio que contenga xilosa y proporcione una ventaja selectiva a aquellas células de levadura que tengan una habilidad para desarrollarse utilizando xilosa como una fuente única de carbono, de manera más eficiente o más rápida que otras cepas. Como se utiliza en la presente, una "ventaja selectiva" es la habilidad de una célula o cepa para sufrir un mayor número de divisiones celulares de otras células o cepas, debido a cierto atributo, en este caso, la habilidad para desarrollarse eficientemente utilizando xilosa. De este modo, un medio que proporciona una ventaja selectiva a una cepa permitirá que la cepa se desarrolle más rápido en ese medio, en comparación a otras cepas para las cuales el medio no proporciona una ventaja selectiva. Podrá ser apreciado por aquellos expertos en la técnica que la levadura puede ser desarrollada sobre una amplia gama de medios que impiden al menos una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una fuente de fósforo, una fuente de sulfato, elementos en trazas y vitaminas. El medio que contiene xilosa puede ser un medio mínimo o un medio complejo. En una modalidad, el medio que contiene xilosa es un medio mínimo. Un medio minimo adecuado puede comprender, por ejemplo, la fórmula a base de nitrógeno de levadura de DIFCO (ver manual de Difco "Dehydrated culture media and reagents for microbiology" 10a Edición, Difco Labs 1984) , junto con la xilosa a una concentración de entre 0.1% y 50%, típicamente 2% y 15%, más típicamente 5%. En otra modalidad más, el medio que contiene xilosa puede ser un medio complejo. La concentración de la xilosa en el medio complejo puede estar entre 0.1% y 50%, típicamente entre 2% y 30%, más típicamente entre 2% y 15%. En una modalidad, el medio complejo es medio rico completo. Un ejemplo de medio rico completo es el medio que comprende extracto de levadura a entre 0.5 y 2%, preferentemente 0.5%, peptona a entre 0.5% y 2%, preferentemente 1%, y xilosa a una concentración de entre 0.5% y 50%, típicamente 2% y 15%, más típicamente 5%. En otra modalidad más, el medio complejo se selecciona del grupo que consiste de melasas, hidrolisados de almidón, hidrolisado de biomasa celulósica o hemicelulósica (tal como bagaso, forraje, pulpa de madera, paja, papel de desecho, etc.), y combinaciones de los mismos, opcionalmente suplementado con xilosa, y/o nutrientes. Podrá ser apreciado por las personas expertas en la técnica que el medio sólido puede ser cualquiera de los medios anteriormente mencionados, típicamente suplementados con entre 1% y 10% de agar, más típicamente entre 1% y 5% de agar, todavía más típicamente entre 1% y 2% de agar. Las células de levadura pueden ser seleccionadas o clasificadas por incubación de las células sobre medio sólido y/o líquido. En una modalidad, las células de levadura son seleccionadas o clasificadas mediante la incubación de las células sobre medio sólido. En otra modalidad más, las células de levadura son seleccionadas o clasificadas por incubación de las células de levadura en medio líquido. En una modalidad preferida, las células de levadura son seleccionadas o clasificadas por incubación de las células de levadura primeramente sobre medio sólido, y subsecuentemente sobre medio líquido. Por ejemplo, el método puede comprender: (a) provisión de una población de células de levadura no recombinantes, genéticamente diversas de Saccharomyces ; (b) el cultivo de las células de levadura bajo condiciones para permitir el apareamiento de las células de levadura; (c) la selección o clasificación de las células de levadura mediante la incubación de las células de levadura sobre un medio sólido que contiene xilosa; (d) la repetición de los pasos (b) y (c) con las células seleccionadas o clasificadas que forman la población de células de levadura no recombinantes, genéticamente diversas de Saccharomyces, hasta que una o más células de levadura han adquirido la habilidad para crecer a la velocidad de crecimiento deseada utilizando xilosa como una fuente única de carbono para el crecimiento. Típicamente, los pasos (b) y (c) son repetidos hasta que una o más células de levadura han adquirido una velocidad de crecimiento sobre xilosa que es suficiente para permitir que las células sean convenientemente desarrolladas en medio líquido que contiene xilosa, como una fuente única de carbono. Por ejemplo, la velocidad de crecimiento sobre medio mineral mínimo sólido que contiene 2% a 5% p/v de xilosa en el cual una cepa puede ser transferida para desarrollarse en el medio mineral mínimo líquido que contiene 2% a 5% p/v de xilosa como una fuente única de carbono, típicamente será alcanzado después de al menos 2 repeticiones de los pasos (b) y (c) . Más típicamente al menos 5 repeticiones de los pasos (b) y (c) . Aún más típicamente, al menos 10 repeticiones de los pasos (b) y (c) . Aquellos expertos en la técnica apreciarán que el tiempo en el cual las células de levadura pueden ser seleccionadas o clasificadas por incubación en medio líquido, variará dependiendo de la población y puede ser determinado fácilmente por incubación de una pequeña porción de la población en medio líquido en cada repetición de los pasos (b) y (c) . Después de esto, el método puede comprender: (a) provisión de una población de células de levadura no recombinantes, genéticamente diversas de Saccharomyces ; (b) el cultivo de las células de levadura bajo condiciones para permitir el apareamiento de las células de levadura; (c) la selección o clasificación de las células de levadura mediante la incubación de las células de levadura sobre un medio sólido que contiene xilosa; (d) la repetición de los pasos (b) y (c) con las células seleccionadas o clasificadas que forman la población de células de levadura no recombinantes, genéticamente diversas de Saccharomyces, hasta que una o más células de levadura han adquirido la habilidad para crecer a la velocidad de crecimiento deseada utilizando xilosa como una fuente única de carbono para el- crecimiento. Las células de levadura son típicamente incubadas sobre o en el medio que contiene xilosa, por un tiempo suficiente para permitir que las células de levadura capaces de desarrollarse utilizando la xilosa como fuente única de carbono, crezcan. Como se discute anteriormente, la longitud de tiempo será al menos una longitud suficiente de tiempo para permitir que las células de levadura que tienen una velocidad incrementada de crecimiento utilizando xilosa como una fuente única de carbono, se desarrollen. Típicamente, la longitud de tiempo será una longitud de tiempo suficiente para permitir el crecimiento de las células de levadura que no tienen una velocidad incrementada de crecimiento utilizando xilosa como una fuente única de carbono. En otras palabras, la longitud de tiempo será suficiente para permitir que sustancialmente todas las células de levadura crezcan sobre la xilosa. La longitud de tiempo puede variar dependiendo de la población de células de levadura no recombinantes, genéticamente diversas, y variará también dependiendo de los tipos de medios utilizados y cuántos ciclos o repeticiones de los pasos (b) y (c) han sido conducidos. Conforme es repetido cada ciclo, se considera que el tiempo será menor que las selecciones o clasificaciones del método para poblaciones que se desarrollan más rápido utilizando xilosa con cada repetición de los pasos (b) y (c) , independientemente de si se usa un medio sólido o líquido. Las personas expertas en la técnica podrán apreciar también que incluso en medio complejo que contiene azúcares diferentes de la xilosa, se considera que algunos o todos los azúcares diferentes de la xilosa tarde o temprano serán agotados a través del crecimiento, y que la presencia de xilosa por lo tanto tarde o temprano conferirá una ventaja selectiva a aquellas cepas que se desarrollen más rápido sobre xilosa como una fuente única de carbono. Las células de levadura pueden ser incubadas en medio líquido que contiene xilosa por una cantidad suficiente de tiempo para permitir que las células de levadura que son más eficientes al desarrollarse sobre xilosa como una fuente única de carbono, sobrepase a aquellas células de levadura que son menos eficientes para desarrollarse sobre xilosa. Típicamente, la cantidad de tiempo es suficiente para permitir el crecimiento incluso de aquellas células de levadura que no tienen una velocidad incrementada de crecimiento utilizando xilosa como fuente única de carbono. Como se discutió anteriormente, las células que crecen más rápidamente serán mayores en número y por lo tanto serán seleccionadas. De este modo, el uso de medio líquido que contiene xilosa proporciona una manera conveniente para seleccionar aquellas células de levadura que son capaces de utilizar xilosa a una velocidad más rápida que el resto de la población de células de levadura. El periodo de crecimiento en el medio líquido que contiene xilosa es típicamente reducido con cada ciclo conforme las células de levadura seleccionadas o clasificadas se vuelven más eficientes al utilizar xilosa. Después de la selección o clasificación de las células de levadura mediante el cultivo de las células en medio líquido que contiene xilosa, las células son típicamente cosechadas a partir del medio líquido y apareadas sin separación o aislamiento adicionales de las células. De este modo, las células de levadura seleccionadas o clasificadas son típicamente apareadas como un combinado. Los métodos de apareamiento son los mismos que aquellos siguiendo la selección y clasificación sobre medio sólido que contiene xilosa. Se apreciará que las células de levadura pueden ser incubadas en o sobre el medio que contiene xilosa bajo cualesquiera condiciones que seleccionen o clasifiquen las cepas de levadura que utilizan xilosa, en poblaciones. A manera de ejemplo, las poblaciones podrían ser cultivadas: (a) en o sobre un medio mínimo de xilosa bajo condiciones aeróbicas, microaerofílicas, o anaeróbicas; (b) en o sobre medio rico en xilosa, bajo condiciones aeróbicas, microaerofílicas o anaeróbicas. El medio anterior puede incluir otras fuentes de carbono (por ejemplo, azúcares tales como glucosa, galactosa, polioles tales como xilitol, glicerol, ácidos orgánicos y sus sales tales como ácido acético y acetatos, etc.) además de la xilosa. Por ejemplo, las células de levadura pueden ser expuestas a tensiones tales como pH sub- o supra-óptimo, presión hiper- o hipo-osmótica, tensiones iónicas provenientes de las sales, tensión alcohólica por la adición de etanol u otros alcoholes, tensión de otros inhibidores orgánicos tales como furfurales y sus derivados, temperaturas sub- o supra-óptimas, la presencia o ausencia de xilosa y luego subsecuentemente se seleccionan o se clasifican por su habilidad para recuperarse de las tensiones, mientras que utilizan xilosa como la fuente única de carbono. Se anticipa que las combinaciones de diferentes condiciones selectivas podrían ser aplicadas a las poblaciones. Se apreciará que el paso (c) puede ser repetido cualquier número de veces antes del aislamiento de las células de levadura o de la repetición del paso (b) . Por ejemplo, las poblaciones seleccionadas en medio líquido que contiene xilosa pueden ser continuamente subcultivadas en el medio fresco para seleccionar o clasificar adicionalmente las células de levadura que tienen la velocidad de crecimiento deseada . Podrá ser apreciado también por aquellos expertos en la técnica que los pasos (b) y (c) pueden ser repetidos cualquier número de veces para clasificar o seleccionar las células de levadura no recombinantes en las cuales la velocidad de crecimiento sobre la xilosa como fuente única de carbono es progresivamente incrementada con cada ciclo repetido. Este proceso es de este modo repetido por tantas veces como pueda ser requerido con el fin de obtener una cepa que muestre la velocidad de crecimiento deseada, utilizando xilosa como fuente única de carbono. Después de esto, el método comprende típicamente el paso de aislar una o más células de levadura que tiene la velocidad de crecimiento deseada. Podrá ser apreciado por las personas expertas en la técnica que el método genera típicamente una población de células de levadura no recombinante, genéticamente diversas de Saccharomyces, las cuales tienen la velocidad de crecimiento deseada. En consecuencia, en una modalidad, el método puede ser utilizado para producir una población de cepas de Saccharomyces que son capaces de desarrollarse utilizando xilosa como fuente única de carbono, a una velocidad de crecimiento deseada. La población puede ser aislada sin separar las cepas individuales. Esto puede ser logrado, por ejemplo, simplemente mediante la combinación de la población de cepas de Saccharomyces que son producidas por el método. En otra modalidad más, cepas individuales de Saccharomyces que son capaces de desarrollarse utilizando xilosa como una fuente única de carbono, pueden ser aisladas. Esto puede ser logrado utilizando técnicas microbiológicas estándares tales como la provisión de colonias adecuadas, el rayado de la levadura sobre placas de agar para aislados de colonias simples, o cualesquiera otros métodos para el aislamiento de cultivos puros. Tales métodos son descritos en Cruickshank et al. (1975) "Medical Microbiology", 12a edición, volumen dos: The practice of medical microbiology, publicada por Churchill Livingstone.

También se proporciona un método para la generación de un derivado de una cepa de Saccharomyces con velocidad de crecimiento incrementada sobre xilosa como fuente única de carbono, para el crecimiento. La cepa de Saccharomyces a partir de la cual es generado el derivado, tiene típicamente una propiedad deseada. El método comprende el paso (a) de proporcionar la cepa como parte de n una población de células de levadura no recombinantes, genéticamente diversas de Saccharomyces . En otras palabras, las células de levadura de la cepa constituyen una porción de la población. Las células de levadura de la población genéticamente diversa pueden ser provenientes de cualquiera de las fuentes anteriormente mencionadas. En el paso (b) , las células de levadura de la población de células de levadura genéticamente diversas, son cultivadas bajo cualquiera de las condiciones mencionadas anteriormente que permitan el apareamiento de las células de levadura de la población. En el paso (c) , las células de levadura son seleccionadas o clasificadas para los derivados que tiene una velocidad incrementada de crecimiento. La velocidad incrementada de crecimiento es un incremento en la velocidad del crecimiento del derivado con relación a la velocidad de crecimiento de la cepa. Típicamente, las células de levadura son seleccionadas o clasificadas por la incubación de las células de levadura en o sobre medio que contiene xilosa, como se mencionó anteriormente. El medio que contiene xilosa puede contener además factores que seleccionan o que clasifican la cepa derivada. Por ejemplo, la cepa puede comprender marcadores seleccionables tales como marcadores de resistencia a antibióticos u otros tipos de marcadores que permiten que los derivados de la cepa sean distinguidos de otras células de levadura de la población de células de levadura genéticamente diversas. Esto permite la selección o clasificación simultánea para células de levadura que tienen crecimiento velocidad incrementado utilizando xilosa como una fuente única de carbono, y que llevan el marcador seleccionable. Esto permite distinguir los derivados del resto de la población genéticamente diversa. Los marcadores seleccionables adecuados incluyen, por ejemplo, ADE2 , HIS3, LEU2 , URA3 , LYS2 , MET15, TRPl, URA4, la resistencia al sulfito o la resistencia a la p-fluoro-DL-fenilalanina (Cebollero y González (2004) Applied and Environmental Microbiology, Vol.70: 7018-7028). Los métodos para seleccionar y clasificar el crecimiento utilizando xilosa son como se mencionaron anteriormente. Los pasos (b) y (c) pueden ser repetidos cualquier número de veces hasta que un derivado es obtenido con un incremento en la velocidad de crecimiento. Una vez que ha sido incrementada la velocidad de crecimiento, el derivado es aislado. Los métodos para el aislamiento son como se mencionaron anteriormente.

También dentro del alcance de la presente invención se incluyen las cepas de Saccharomyces producidas mediante el método de la invención. La cepa de Saccharomyces puede ser cualquier especie de Saccharomyces como se define filogenéticamente por Kurtzman (2003) FEMS Yeast Research 3: 417-432, e incluyen S . cerevisiae, S. paradoxus, S. mikatae, S . cariocanus, S . kudriavzevii , S. pastorianus y S . bayanus . Los métodos para el apareamiento entre cepas de Saccharomyces cerevisiae y cepas no cerevisiae se discuten en, por ejemplo, Johnston JR y Oberman H (1979) Yeast Genetics in Industry, en Bull MJ (ed.) Progress in Industrial Microbiology, Elsevier, Ámsterdam Vol. 15, p. 151-205; Pretorius IS (2000) Tailoring wine yeast for the new millennium: novel approaches to the ancient art of wine making. Yeast. 16: 675-729; P.V. Attfield and P.J.L. Bell (2003) Genetics and classical genetic manipulations of industrial yeasts, in Topics in Current Genetics Vol. 2, J. H. de Winde (ed) Functional Genetics of Industrial Yeasts, Springer-Verlag Berlín Heidelberg. Las personas expertas en la técnica podrán apreciar que una vez que es obtenida una cepa de Saccharomyces que es capaz de utilizar xilosa como una fuente única de carbono para el crecimiento a una velocidad de crecimiento deseada, las cepas pueden ser derivadas de esa cepa utilizando métodos conocidos en la técnica para la producción de cepas que incluyen por ejemplo, métodos clásicos de cruce genético, métodos de mutagénesis, métodos recombinantes, o cualesquiera otros métodos para generar cepas de Saccharomyces . La cepa capaz de tener una velocidad de crecimiento de al menos una generación por 48 horas utilizando xilosa como una fuente única de carbono, pueden ser apareadas con otras cepas de Saccharomyces , preferentemente con otras cepas de Saccharomyces cerevisiae . Por ejemplo, se considera que los métodos anteriores pueden producir múltiples cepas de Saccharomyces que son capaces de tener una velocidad de crecimiento de al menos una generación de 48 horas, utilizando xilosa como una fuente única de carbono para el crecimiento. De este modo, una primera cepa capaz de tener una velocidad de crecimiento de al menos una generación por 48 horas utilizando xilosa como una fuente única de carbono para el crecimiento, pueden ser apareadas con una segunda cepa capaz de tener una velocidad de crecimiento de al menos una generación por 48 horas utilizando xilosa como una fuente única de carbono para el crecimiento. Los apareamientos de este tipo pueden ser realizados, por ejemplo, para obtener una cepa de Saccharomyces incluso con habilidad aumentada o mejorada para utilizar xilosa como una fuente única de carbono. Por ejemplo, se considera que diferentes cepas de Saccharomyces que son capaces de tener crecimiento rápido utilizando xilosa como una fuente única de carbono, pueden ser apareadas para obtener cepas apareadas que son capaces de desarrollarse más rápidamente sobre xilosa, o que son más eficientes al producir productos tales como etanol o dióxido de carbono cuando se utiliza xilosa como una fuente de carbono . Las cepas de Saccharomyces que son capaces de tener velocidades de crecimiento de al menos una generación por 48 horas utilizando xilosa como una fuente única de carbono, pueden ser apareadas con cepas de Saccharomyces que son menos capaces de utilizar la xilosa como una fuente única de carbono. Los apareamientos de este tipo pueden ser realizados, por ejemplo, para transferir la habilidad mejorada para utilizar la xilosa como una. fuente única de carbono, a una cepa de Saccharomyces que tiene una o más propiedades deseables no encontradas en la cepa que tiene una habilidad mejorada para utilizar la xilosa como una fuente única de carbono. Por ejemplo, una cepa de Saccharomyces cerevisiae menos capaz de utilizar xilosa como una fuente única de carbono para el crecimiento, puede tener características deseables para la industria de la panadería, y puede ser ventajoso aparear esta cepa con una cepa que sea capaz de desarrollarse a una velocidad de al menos una generación por 48 horas utilizando xilosa como fuente única de carbono, con el fin de desarrollar una levadura de panadero que pueda ser desarrollada más rápidamente o de manera eficiente sobre xilosa y utilizada subsecuentemente en aplicaciones de horneado de pan. Similarmente, las levaduras que pueden ser utilizadas para otros fines industriales tales como destilación, elaboración de vino, extractos de levadura, enzimas, proteínas heterólogas, o cualquiera otros propósitos, pueden ser apareadas con cepas que tiene una habilidad mejorada para utilizar xilosa como una fuente única de carbono con el fin de hacer posible la producción de biomasa o de subproductos de levadura sobre medio de xilosa. Mediante el apareamiento de una cepa de Saccharomyces , por ejemplo, una cepa de Saccharomyces cerevisiae, en la cual es obtenida la capacidad de desarrollarse a una velocidad de al menos una generación por 48 horas utilizando xilosa como una fuente única de carbono, mediante métodos no recombinantes con una cepa recombinante en la cual han sido introducidos uno o más genes para la utilización de la xilosa, mediante métodos recombinantes, se considera que las cepas con mejoramientos aún mayores en la utilización de la xilosa, pueden ser obtenidas. Aquellos expertos en la técnica podrán apreciar que los genes para la utilización de la xilosa que han sido introducidos recombinantemente podrían suplementar simplemente aquellos genes ya presentes en la cepa a través de métodos no recombinantes . Podrá ser apreciado también por las personas expertas en la técnica que mientras que es obtenida la habilidad para utilizar xilosa por métodos no recombinantes, la tecnología de ADN recombinante puede ser utilizada para suplementar la capacidad de la cepa para utilizar xilosa como una fuente única de carbono. Por ejemplo, uno o más genes de utilización de la xilosa provenientes de otras fuentes pueden ser introducidos dentro de la cepa para suplementar la utilización de xilosa. Por ejemplo, la xilosa-isomerasa proveniente de Piromyces sp. puede ser integrada dentro del genoma como se describe en Kuyper et al., meramente para suplementar la utilización de la xilosa. La xilosa-reductasa (XYL 1), o xilitol-deshidrogenasa (XYL2) de Pichia stipitis puede ser clonada dentro de Saccharomyces como se describe en Wahlbom et al. (2003) para suplementar la capacidad de la cepa para utilizar la xilosa. No obstante, las personas expertas en la técnica entenderán que la adición de secuencias para la utilización de xilosa por métodos recombinantes, es meramente para suplementar la capacidad existente de las cepas de una velocidad de crecimiento de al menos una generación por 48 horas, utilizando xilosa como una fuente única de carbono. En un ejemplo adicional, uno o más genes que codifican para las actividades metabólicas que pueden chocar sobre la eficiencia de utilización de xilosa por Saccharomyces diferente de a través de las acciones directas sobre xilosa, xilitol o xilulosa, podrían ser introducidas dentro de las cepas no recombinantes y su expresión modificada utilizando técnicas de ADN recombinantes. En algunos casos puede ser deseable incrementar la expresión de ciertos genes, mientras que en otros casos puede ser deseable reducir o eliminar la expresión de ciertos genes. Los genes objetivo para la expresión alterada podrían incluir aquellos que codifican para actividades citoplásmicas, mitocondriales u otras actividades metabólicas de organelos. Tales genes podrían codificar para las actividades involucradas en el transporte de azúcar, transporte de nutrientes, glucólisis, pasos terminales de la fermentación, vía del fosfato de pentosa, gluconeogénesis, la vía de los ácidos tricarboxílieos, el ciclo de glioxilato, la cadena de transporte de electrones, el balance redox intracelular, la interacción entre la fermentación y respiración, la síntesis de aminoácidos y el metabolismo, etc. Los ejemplos de genes que pueden ser modificados por las tecnologías de ADN recombinante incluyen RPE1 , RK11 , TAL1 y TKLlo cualesquiera otros genes que puedan mejorar la habilidad de las levaduras para utilizar xilosa como una fuente única de carbono. Podrá ser apreciado además por los expertos en la técnica que uno o más genes para la utilización de la xilosa pueden ser introducidos dentro de la cepa utilizando métodos recombinantes. Los métodos para la producción de levadura recombinante son bien conocidos en la técnica y son descritos por ejemplo en, Guthrie y Fink (1991) "Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology", Methods in Enzymology Vol. 194, Academic Press. Los genes o secuencias de interés pueden ser clonados dentro de vectores adecuados para la transformación dentro de la célula de levadura. El gen o secuencia de interés es clonado dentro de un vector de expresión adecuado tal como pMA91 Dobson et al. (1984) EMBO Journal 3: 1115), que comprende las regiones reguladoras apropiadas para la expresión en la cepa de levadura. Otros vectores incluyen vectores de expresión modificada episomales, centroméricos, integrativos, conocidos por aquellos expertos en la técnica (ver por ejemplo Guthrie y Fink (1991) "Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology", Methods in Enzymology Vol. 194, Academic Press). Las regiones reguladoras que pueden ser adecuadas para la expresión en levadura pueden incluir, por ejemplo, MAL, PGK1, ADH1, GAL1, GALIO, CUP1, GAP, CYC1, PH05. Alternativamente, las regiones reguladoras del gen mismo pueden ser utilizadas para expresar el gen en Saccharomyces . El gen o secuencia de interés puede ser integrado dentro del genoma de levadura, tal como dentro del locus del RNA ribosomal, por ejemplo. Para este propósito, las secuencias ribosomales de un vector adecuado (por ejemplo el plásmido pIRL9) son liberadas, y clonadas apropiadamente a un vector BS+ . El gen o secuencia de interés está operablemente enlazado al promotor de levadura adecuado y a las regiones terminadoras para formar un cásete de expresión, y el cásete de expresión es subsecuentemente clonado dentro de las secuencias ribosomales clonadas. A partir de este plásmido resultante el cásete de expresión, flanqueado por las secuencias ribosomales puede ser liberado como un fragmento simple utilizando enzimas de restricción apropiadas. El fragmento liberado puede ser cotransformado con un plásmido de replicación autónomamente que posee un marcador adecuado para la transformación dentro de una levadura, utilizando métodos conocidos en la técnica (ver por ejemplo Guthrie y fink (1991) "Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology" , Methods in Enzymology Vol . 194, Academic Press). El plásmido puede ser posteriormente removido de la célula mediante cultivo de las células en condiciones que no seleccionen el plásmido. La cepa de Saccharomyces spp. de la presente invención puede ser utilizado para cualquier uso para el cual una cepa de Saccharomyces spp. de esa especie podría ser utilizada. Por ejemplo, una cepa de Saccharomyces cerevisiae que es capaz de utilizar xilosa como una fuente única de carbono, puede ser utilizada en la elaboración de pan, elaboración de cerveza, producción de biomasa, fermentación de azúcar y producción de etanol, o cualesquiera otros usos a los cuales se utilice la cepa estándar de Saccharomyces .

La habilidad de la cepa de Saccharomyces de la presente invención para desarrollarse sobre xilosa como una fuente única de carbono, proporciona un fenotipo conveniente que puede ser utilizado para distinguir entre la cepa de Saccharomyces que es capaz de tener velocidades de crecimiento de al menos una generación por 48 horas utilizando xilosa como una fuente única de carbono, y aquellas que no son para fines de "marcación" de las cepas de levadura . En un aspecto, se proporciona un método para la elaboración de una cepa de Saccharomyces , que comprende los pasos de : (a) cultivar la cepa deseada con una cepa de la invención bajo condiciones para permitir la combinación de ADN de las cepas; (b) seleccionar o clasificar los derivados de la cepa deseada que tienen una velocidad incrementada de crecimiento, utilizando xilosa como una fuente única de carbono para el crecimiento; (c) aislar los derivados de la cepa deseada que tienen una velocidad de crecimiento incrementada, utilizando xilosa como una fuente única de carbono para el crecimiento. En una modalidad, el método comprende: (a) aparear la cepa deseada con una cepa de Saccharomyces del cuarto a décimo cuarto aspecto, bajo condiciones que permiten la combinación del ADN de las cepas; y (b) seleccionar o clasificar un derivado de la cepa deseada que sea capaz de desarrollarse a una velocidad mayor de una generación por 48 horas utilizando xilosa como una fuente única de carbono, mediante la siembra en placa de las células apareadas sobre medio sólido que contiene xilosa, o mediante el cultivo en el medio líquido que contiene xilosa, o una combinación de ambos; (c) el aislamiento de los derivados de la cepa deseada que tienen una velocidad incrementada de crecimiento utilizando xilosa como una fuente única de carbono para el crecimiento . Las cepas marcadas pueden ser detectadas mediante la incubación de la cepa sobre o en el medio mínimo que contiene xilosa, y determinando la velocidad de xilosa, o comparando la velocidad de crecimiento a aquella de una cepa estándar con velocidad de crecimiento conocida sobre o en el medio que contiene xilosa. Una prueba adecuada para detectar una cepa marcada es la Prueba TI, mediante la cual una cepa marcada muestra al menos un incremento de 2 veces en la biomasa en la Prueba Ti . En otra modalidad más, la cepa de Saccharomyces spp. de la invención puede ser utilizada para la producción de compuestos tales como etanol, xililotl, ácido acético, otros subproductos de levadura, enzimas, etc. Los métodos para la producción de compuestos pueden comprender los siguientes pasos: (a) el cultivo de la cepa de Saccharomyces en un medio que contiene xilosa, bajo condiciones que permiten que la cepa produzca el compuesto; y (b) la recuperación del o de los compuestos que son producidos por la cepa. Los compuestos pueden ser uno o más o mezclas de los mismos que son producidos por Saccharomyces cuando se utiliza xilosa como una fuente de carbono. Por ejemplo, el compuesto puede ser etanol, xilitol, ácido acético, dióxido de carbono, o cualquier componente, metabolitos y subproductos de células de levadura y su metabolismo. Los componentes de las células de levadura pueden incluir enzimas, cofactores, vitaminas, aminoácidos, péptidos, proteínas, nucleósidos, nucleótidos, oligonucleótidos, ADN, RNA, componentes de la pared celular, glucanos, mannoprotéinas, componentes de la membrana, lípidos, esteróles, carbohidratos de almacenamiento, trehalosa, glucógeno, ácidos orgánicos, ácido succínico, ácido acético, ácido láctico, polioles tales como glicerol, xilitol. Aquellos expertos en la técnica podrán apreciar que el tipo de compuestos producidos por la cepa de Saccharomyces spp. puede depender de las condiciones de crecimiento a las cuales se somete la cepa. Por ejemplo, la temperatura, el crecimiento aeróbico o anaeróbico, pH del medio, fuente de nitrógeno, la presencia de fuentes de carbono diferentes de xilosa, otros compuestos en el medio por sí solos o en combinación pueden tener impacto sobre los tipos de compuestos que son producidos por la cepa de Saccharomyces cerevisiae . No obstante, las condiciones precisas para la producción de uno o más compuestos pueden ser fácilmente determinadas por una persona experta en la técnica a través de procedimientos estándares. Podrá ser apreciado también por las personas expertas en la técnica que las cepas de Saccharomyces de la invención serán capaces de utilizar azúcares tales como glucosa, fructosa, mannosa, galactosa, maltotriosa, maltosa, sucrosa, melibiosa, raffinosa, xilosa, melizitosa, alfa-metil-glucósido, trehalosa, isomaltosa. Las cepas pueden también ser capaces de utilizar fuentes de carbono no de azúcares tales como etanol, acetato, glicerol, xilitol. La cepa de la invención será capaz típicamente de fermentar azúcares tales como glucosa, fructosa, mannosa, galactosa, maltotriosa, maltosa, sucrosa, melibiosa, raffinosa, xilosa, melizitosa, alfa-metil-glucósido, trehalosa o isomaltosa, además de la xilosa para la producción de dióxido de carbono y etanol . La xilosa en el medio que contiene xilosa puede estar en cualquier forma que pueda ser utilizada por la levadura. Por ejemplo, la xilosa puede ser purificada, o ésta puede estar en una forma cruda tal como un hidrolisado de hemicelulosa obtenido a partir de hidrólisis acida de la biomasa tal como caña de azúcar, paja, forraje de maíz, productos de madera, etc. En la producción de biomasa y compuestos, el medio inoculado que contiene xilosa es típicamente cultivado a una temperatura en el intervalo de entre 22°C y 40°C por entre 2 horas y 4 días. Los inventores han encontrado además que con el fin de producir etanol a partir de xilosa utilizando las cepas de la invención, no es necesario que las cepas muestren crecimiento sustancial sobre la xilosa. Los inventores han encontrado que inóculos pesados del medio que contiene xilosa, con las cepas de la invención, da como resultado la producción de etanol dentro de 2 horas, típicamente 4 horas, más típicamente 5 horas. Bajo tales condiciones, no es detectable el crecimiento sustancial. De este modo, se proporciona también un método para producir etanol que comprende : (a) inocular el medio que contiene xilosa con la cepa del primero a octavo, décimo o décimo tercer aspectos, a una densidad de al menos 1 x 108 células de levadura por ml de medio; (b) la incubación del medio inoculado por tiempo suficiente para permitir la producción de etanol; (c) la recuperación del etanol. El medio que contiene xilosa puede ser cualquiera de los medios que contienen xilosa mencionados anteriormente . La densidad de las células de levadura puede ser al menos de 5 x 108, típicamente al menos 6 x 108 células de levadura por ml de medio. El medio inoculado puede ser incubado por al menos 2 horas, típicamente al menos 5 horas. En otro aspecto más, se proporciona un método para producir etanol, que comprende incubar una cepa de Saccharomyces , no recombinante en el medio que contiene xilosa, bajo condiciones suficientes para producir etanol y después de esto recuperar el etanol. Definición de las Pruebas TI a T9 Ti: Crecimiento utilizando xilosa como fuente única de carbono Las cepas de levadura son cultivadas sobre un medio de peptona bacteriológica de extracto de levadura y glucosa, solidificado con 2% de agar utilizando técnicas microbiológicas estándares. Después de la incubación por 72 horas a 30°C, las células de levadura son tomadas de las placas utilizando un asa microbiológica estéril y se inoculan a una OD6oo (Densidad Óptica a 600 nm) de entre 0.1 y 0.2 unidades (OD600 a T0 ) en 50 ml de caldo. El caldo contiene xilosa (5% p/v) , base nitrogenada de levadura Difco con o sin aminoácidos (0.67% en agua destilada en un matraz Erlenmeyer de 250 ml . Los cultivos son incubados a 30°C con agitación a 220 rpm (diámetro orbital de 10 cm) por 48 horas antes de medir la OD6oo (OD a T 8 horas) • El incremento proporcional en biomasa es determinado por la ecuación: OD600 a T48 horas OD6oo a T0 . T2 : Rendimiento de la biomasa celular utilizando xilosa como fuente única de carbono Las cepas de levadura son cultivadas sobre un medio de peptona bacteriológica de extracto de levadura y glucosa, solidificado con 2% de agar utilizando técnicas microbiológicas estándares. Después de la incubación por 72 horas a 30°C, las células de levadura son tomadas de las placas utilizando un asa microbiológica estéril y se inoculan a una OD60o (Densidad Óptica a 600 nm) de entre 0.1 y 0.2 unidades en 50 ml de caldo. El caldo contiene xilosa (5% p/v) , base nitrogenada de levadura Difco con o sin aminoácidos (0.67% en agua destilada en un matraz Erlenmeyer de 250 ml . Los cultivos son incubados a 30°C con agitación a 220 rpm (diámetro orbital de 10 cm) por 72 horas antes de medir el rendimiento de la materia de levadura seca. El contenido en peso seco de la levadura es medido al transferir 5 ml de cultivo de levadura a un tubo de ensayo de vidrio prepesado (Wl) , seguido por la centrifugación a 3000 g por 10 minutos a 22 °C. El sobrenadante es retirado sin perturbar el botón de levadura, y las células son resuspendidas en 5 ml de agua destilada, antes de la re-centrifugación a 3000 g por 10 minutos a 22 °C. El sobrenadante es nuevamente retirado sin perturbar el botón de levadura, y las células son resuspendidas en 5 ml de agua destilada, antes de la recentrifugación a 3000 g por 10 minutos a 22°C. El tubo de ensayo de vidrio que contiene las células de levadura es horneado a 105°C por 24 horas y pesado (W2) . La materia de levadura seca es calculada al sustraer Wl de W2 y multiplicando el valor obtenido por 10. Los ensayos son realizados por duplicado y el promedio es calculado. T3 : Producción de etanol utilizando xilosa como fuente única de carbono . El inoculo de levadura fue preparado mediante el desarrollo de 1 cultivo microbiano estándar de células puras de la cepa por 16 horas a 30°C con agitación a 200 rpm, en un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contenía 50 ml de agua destilada: 2.5 g de xilosa, 0.5 g de extracto de levadura, 0.5 g de peptona bacteriológica. Siete cultivos de 50 ml fueron desarrollados simultáneamente. Los cultivos fueron cosechados por centrifugación a 22°C y 3,000 x g por 5 minutos . El sobrenadante fue desechado y los botones celulares fueron resuspendidos en agua destilada estéril y centrifugados nuevamente. El sobrenadante fue desechado y los botones celulares resuspendidos y combinados en 20 ml de medio mínimo de xilosa que contenía por litro de agua destilada: 50 g de xilosa, 13.4 de base nitrogenada de levadura Difco sin aminoácidos, suplementado con 0.4 mg de CuSO4»5H20, 1 mg de ZnS04»7H20, 2 mg de pantotenato de calcio, 2 mg de clorhidrato de tiamina, 2 mg de clorhidrato de piridoxina, 4 mg de inositol, 1 mg de ácido nicotínico y 0.4 mg de biotina. Las células fueron luego inoculadas en 980 ml del mismo medio mínimo de xilosa que había sido precalentado a 30°C y aireado a 20% de oxígeno en un recipiente de fermentación Braun Biostat B de 2 litros. La levadura fue desarrollada con aire bombeado a 10 litros por minuto, agitando a 1200 rpm y el pH mantenido a pH 5 utilizando adiciones de hidróxido de potasio o ácido fosfórico como se requiriera. Después de 24 horas, 300 ml del volumen de cultivo fueron retirados y reemplazados por 300 ml de medio mínimo de xilosa fresco que comprendía 50 g de xilosa más 10 g de base nitrogenada de levadura Difco sin aminoácidos, y sales en trazas y vitaminas en las cantidades descritas anteriormente. Después de un periodo adicional de 7 horas, se agregaron al cultivo 30 g de xilosa fresca y el suministro de aire fue reducido a 4 litros /minuto y la velocidad del agitador reducida a 200 rpm. El etanol fue evaluado después de un periodo adicional de 20 horas adicional mediante el uso de un Analizador de Bioquímica YSI 2700 Select equipado con una membrana 2786 de YSI para la detección de etanol (YSI Inc. Yellow Springs, Ohio, EUA) . T4 : Ensayo de la xilosa-reductasa. Las cepas de levadura fueron desarrolladas sobre glucosa, extracto de levadura y agar de peptona bacteriológica como se describe previamente, fueron inoculadas a una densidad óptica de 600 nm de entre 0.1 y 0.2 unidades en un matraz de agitación de 250 ml en 50 ml de medio que contenía 5% p/v de xilosa, 0.5% p/v de extracto de levadura y 1% p/v de peptona bacteriológica (XYP) . Los cultivos fueron incubados a 30°C y 180 rpm, hasta que éstos alcanzaron una densidad óptica a 600 nm de entre 3 y 5 unidades . Si las células no alcanzaron la densidad requerida después de 24 horas de incubación, no obstante, éstas fueron cosechadas . Las células fueron cosechadas mediante centrifugación a 3,000 x g y 4°C por 5 minutos. El sobrenadante fue desechado y el botón celular fue resuspendido en agua destilada fría y centrifugado nuevamente. El sobrenadante fue desechado y el proceso se repitió para eliminar todas las trazas del medio. Las células fueron resuspendidas en el amortiguador de desintegración y los extractos celulares preparados como se describe en Eliasson A., et al. (2000) Applied and Environmental Microbiology, Volumen 66 páginas 3381-3386. Los extractos celulares fueron luego evaluados para las actividades de xilosa-reductasa de acuerdo a los métodos descritos y referidos en Eliasson A., et al. (2000) Applied and Environmental Microbiology, Volumen 66 páginas 3381-3386. Una unidad de actividad es definida como 1 nanomol de NAD(P)H reducido u oxidado por minuto, por mg de proteína a 30°C. La proteína fue evaluada mediante el método descrito por Lowry OH, Rosenbrough NJ, Farr AL, y Randall RJ (1951) Journal of Biological Chemistry 193: 265-275, utilizando un estándar de albúmina sérica bovina. T5 : Ensayo de xilitol-deshidrogenasa. Las cepas de levadura fueron desarrolladas sobre glucosa, extracto de levadura y agar de peptona bacteriológica como se describe previamente, fueron inoculadas a una densidad óptica de 600 nm de entre 0.1 y 0.2 unidades en un matraz de agitación de 250 ml en 50 ml de medio que contenía 5% p/v de xilosa, 0.5% p/v de extracto de levadura y 1% p/v de peptona bacteriológica (XYP) . Los cultivos fueron incubados a 30°C y 180 rpm, hasta que éstos alcanzaron una densidad óptica a 600 nm de entre 3 y 5 unidades. Si las células no alcanzaron la densidad requerida después de 24 horas de incubación, no obstante, éstas fueron cosechadas. Las células fueron cosechadas mediante centrifugación a 3,000 x g y 4°C por 5 minutos. El sobrenadante fue desechado y el botón celular fue resuspendido en agua destilada fría y centrifugado nuevamente. El sobrenadante fue desechado y el proceso se repitió para eliminar todas las trazas del medio. Las células fueron resuspendidas en el amortiguador de desintegración y los extractos celulares preparados como se describe en Eliasson A., et al. (2000) Applied and Environmental Microbiology, Volumen 66 páginas 3381-3386. Los extractos celulares fueron luego evaluados para las actividades de xilitol-deshidrogenasa de acuerdo a los métodos descritos y referidos en Eliasson A., et al. (2000) Applied and Environmental Microbiology, Volumen 66 páginas 3381-3386. Una unidad de actividad es definida como 1 nanomol de NAD(P)H reducido u oxidado por minuto, por mg de proteína a 30°C. La proteína fue evaluada mediante el método descrito por Lowry OH, Rosenbrough NJ, Farr AL, y Randall RJ (1951) Journal of Biological Chemistry 193: 265-275, utilizando un estándar de albúmina sérica bovina.

T6: Ensayo de xilulosa-cinasa. Las cepas de levadura fueron desarrolladas sobre glucosa, extracto de levadura y agar de peptona bacteriológica como se describe previamente, fueron inoculadas a una densidad óptica de 600 nm de entre 0.1 y 0.2 unidades en un matraz de agitación de 250 ml en 50 ml de medio que contenía 5% p/v de xilosa, 0.5% p/v de extracto de levadura y 1% p/v de peptona bacteriológica (XYP) . Los cultivos fueron incubados a 30°C y 180 rpm, hasta que éstos alcanzaron una densidad óptica a 600 nm de entre 3 y 5 unidades . Si las células no alcanzaron la densidad requerida después de 24 horas de incubación, no obstante, éstas fueron cosechadas. Las células fueron cosechadas mediante centrifugación a 3,000 x g y 4°C por 5 minutos. El sobrenadante fue desechado y el botón celular fue resuspendido en agua destilada fría y centrifugado nuevamente. El sobrenadante fue desechado y el proceso se repitió para eliminar todas las trazas del medio. Las células fueron resuspendidas en el amortiguador de desintegración y los extractos celulares preparados como se describe en Eliasson A., et al. (2000) Applied and Environmental Microbiology, Volumen 66 páginas 3381-3386. Los extractos celulares fueron luego evaluados para las actividades de xilulosa-cinasa de acuerdo a los métodos descritos y referidos en Eliasson A., et al. (2000) Applied and Environmental Microbiology, Volumen 66 páginas 3381-3386. Una unidad de actividad es definida como 1 nanomol de NAD(P)H reducido u oxidado por minuto, por mg de proteína a 30°C. La proteína fue evaluada mediante el método descrito por Lowry OH, Rosenbrough NJ, Farr AL, y Randall RJ (1951) Journal of Biological Chemistry 193: 265-275, utilizando un estándar de albúmina sérica bovina. T7 : Crecimiento utilizando xilitol como fuente única de carbono. Las cepas de levadura son cultivadas sobre un medio de peptona bacteriológica de extracto de levadura y glucosa, solidificado con 2% de agar utilizando técnicas microbiológicas estándares. Después de la incubación por 72 horas a 30°C, las células de levadura son tomadas de las placas utilizando un asa microbiológica estéril y se inoculan a una ODßoo (Densidad Óptica a 600 nm) de entre 0.1 y 0.2 unidades en 50 ml de caldo. El caldo contiene xilosa (5% p/v) , base nitrogenada de levadura Difco con o sin aminoácidos (0.67% en agua destilada en un matraz Erlenmeyer de 250 ml . Los cultivos son incubados a 30°C con agitación a 220 rpm (diámetro orbital de 10 cm) por 48 horas antes de medir la OD6oo (OD a T8 horas) • El incremento proporcional en biomasa es determinado por la ecuación: OD600 a_ T48 horas OD600 T0. T8 : Producción de etanol utilizando xilosa en un medio rico. Las cepas de levadura son cultivadas sobre un medio de peptona bacteriológica de extracto de levadura y glucosa, solidificado con 2% de agar utilizando técnicas microbiológicas estándares. Después de la incubación por 96 horas a 30°C, las células de levadura son tomadas de las placas utilizando un asa microbiológica estéril y se inoculan a una OD600 (Densidad Óptica a 600 nm) de entre 1 y 2 unidades en 50 ml de caldo. El caldo contiene xilosa (5% p/v), extracto de levadura (0.5% p/v) y peptona bacteriológica (1% p/v) en agua destilada en un matraz Erlenmeyer de 250 ml . Los cultivos son incubados a 30°C con agitación a 220 rpm (diámetro orbital de 10 cm) . Las muestras del sobrenadante de cultivo son evaluadas cada hora por un periodo de 24 horas para el contenido de etanol mediante el uso de un Analizador de Bioquímica YSI 2700 Select equipado con una membrana 2786 de YSI para la detección de etanol (YSI Inc. Yellow Springs, Ohio, EUA) . Los niveles de etanol fueron expresados como gramos por litro. T9 : Producción de etanol en medio mineral mínimo de xilosa bajo condiciones anaeróbicas. Las cepas de levadura son sembradas por estrías sobre medio de 5% p/v de xilosa, 0.67% p/v de base nitrogenada de levadura Difco sin aminoácidos, solidificado con 2% de agar utilizando técnicas microbiológicas estándares. Después de la incubación por 96 horas a 30°C, las células de levadura son tomadas de las placas e inoculadas directamente dentro de 10 ml de medio estéril de 5% p/v de xilosa más 0.67% p/v de base nitrogenada de levadura Difco, sin aminoácidos, contenido en un tubo de Ensayo PP estéril de volumen de 15 ml (Cellstar, Greiner bio-one) hasta una densidad óptica a 600 nm de 0.1 a 0.4. El medio fue cubierto con 2 ml de aceite mineral estéril para inhibir la transferencia de oxígeno, las tapas roscadas fueron completamente apretadas y los tubos fueron incubados sin agitación a 30°C. Se retiraron muestras para el ensayo de etanol utilizando pipetas Pasteur estériles, sin perturbar los botones celulares que se habían formado a través del crecimiento del inoculo original. El etanol fue evaluado utilizando un Analizador de Bioquímica YSI 2700 Select equipado con una membrana 3786 de YSI para la detección de etanol (YSI Inc. Yellow Springs, Ohio, EUA). La invención será ahora descrita con detalle a manera de referencia únicamente respecto a los ejemplos no limitantes siguientes. Ejemplo 1 Saccharomyces es capaz de desarrollarse lentamente utilizando xilosa como la fuente única de carbono. La levadura de panadero Saccharomyces cerevisiae cepa NL67 (Higgins et al . (1999) Applied and Environmental Microbiology 65 : 680-685) fue inoculada sobre medio mineral mínimo solidificado con o sin xilosa como una fuente única de carbono e incubada a 30°C por dos meses . Utilizando un microscopio de luz, se observó que las colonias microscópicas aparecían sobre ambos tipos de placas, pero que las colonias sobre el medio que contenía xilosa fueron detectablemente más grandes que aquellas proporcionadas sin la fuente de carbono. Mientras que las células sobre el medio que no contenía xilosa habían progresado a través de 5 a 6 generaciones, las células sobre el medio que contenía xilosa había progresado a través de 9 a 10 generaciones . Ejemplo 2 Generación de Poblaciones que Comprenden Diversas Cepas de Saccharomyces Capaces de Desarrollarse Rápidamente sobre Xilosa como fuente única de carbono . Mediante la obtención de cepas de levadura a partir de una variedad ' de fuentes , las cuales incluyeron cepas obtenidas de la naturaleza , del vino , de desti ladores y de fermentadores de cerveza , y aplicaciones de panadería , induciéndolas a esporularse y utilizando técnicas de apareamiento en masa para generar una población genéticamente diversa , fue posible aplicar la presión de selección para enriquecer las cepas de levadura capaces de tener crecimiento más vigoroso utilizando xilosa como una fuente única de carbono . Mediante la dispersión de las poblaciones genéticamente diversas sobre medio mineral mínimo de xilosa (y simultáneamente sobre el mismo medio mineral mínimo sin una fuente de carbono) e incubando por dos meses, se observó que existía heterogeneidad en el tamaño de la colonia. Al comparar las placas con xilosa y sin xilosa, se realizó la observación de que de manera contraria al dogma aceptado, el crecimiento había sido debido a la adición de xilosa al medio, implicando que existía heterogeneidad en la habilidad de las cepas de levadura dentro de la población para desarrollarse sobre xilosa. Al cosechar la población entera desarrollada sobre xilosa, y esporulándola, fue posible generar nuevas poblaciones de levadura que fueron enriquecidas para la información genética que confiere habilidad para desarrollarse más efectivamente sobre xilosa. Mediante el uso de tamaños poblacionales grandes (al menos 100,000) y combinando las células incluyendo aquellas que no se desarrollaron óptimamente, la diversidad genética de la población fue mantenida en cada generación. Conforme se incrementó el número de ciclos de apareamiento y selección, la heterogeneidad de los tamaños de las colonias fue mantenida, pero el tamaño final de las colonias se incrementó . Después de entre 5 y veinte ciclos de selección sobre placas de agar, las poblaciones fueron introducidas en cultivo líquido que contenía medio mineral mínimo con xilosa como una fuente única de carbono, y continuamente sub-cultivado por aproximadamente 50 generaciones. Las poblaciones subsecuentes fueron esporuladas y fueron construidas nuevas poblaciones mediante apareamiento en masa. Las nuevas poblaciones de células heterogéneas de Saccharomyces fueron desarrolladas en cultivo líquido en medio mínimo de xilosa por aproximadamente 50 generaciones. Después de este tiempo algunas de las muestras fueron almacenadas y algunas de las muestras fueron esporuladas. Las esporas germinadas derivadas de la población seleccionada fueron apareadas en masa para generar una nueva población de células heterogéneas de Saccharomyces cerevisiae para desarrollarse bajo presión de selección en medio mínimo de xilosa, líquido, por aproximadamente 50 generaciones. Este proceso puede ser reiterado hasta que son alcanzadas las velocidades o proporciones de crecimiento deseadas . Para determinar si las velocidades de crecimiento de las poblaciones sobre medio mínimo de xilosa se estaban incrementando, fueron tomadas muestras después de 365, 569, 1013, 1059, 1170, y 1377 días respectivamente de la selección, fueron inoculadas en el medio mínimo de xilosa a una densidad óptica de 600 nm (OD) entre 0.1 y 0.2 con agitación a 220 rpm y 30°C. La OD fue re-evaluada después de 24 horas y utilizada para calcular el tiempo de duplicación promedio sobre el periodo de 24 horas de acuerdo al método microbiológico estándar. Los resultados fueron trazados gráficamente y son mostrados en la Figura 1. La Figura 1 muestra el mejoramiento en las velocidades de crecimiento de las poblaciones en masa es exponencial conforme éstas progresan a través de las rondas de apareamiento y selección para el crecimiento sobre xilosa como la fuente única de carbono. Se predice que este mejoramiento en la velocidad de crecimiento sobre la xilosa como fuente única de carbono continúa hasta que la velocidad de crecimiento sobre xilosa es equivalente a la velocidad de crecimiento sobre glucosa como fuente única de carbono. Ejepplo 3 Producción de Etanol en Medio Rico en Xilosa por Poblaciones Heterogéneas de Cepas de Saccharatiyces No Reccnibinantes, Correlaciona con la Velocidad de Crecimiento sobre Medio Mineral Mínimo de Xilosa Los tiempos de duplicación de las poblaciones en el medio mínimo de xilosa fueron determinadas como se describe en el Ejemplo 2, Figura 1. La producción de etanol fue determinada mediante la inoculación de las muestras de poblaciones a una densidad óptica a 600 nm de entre 1 y 2 en matraces de agitación de 250 ml en un medio de 50 ml que contenía 5% de xilosa p/v, 0.5% p/v de extracto de levadura y 1% p/v de peptona bacteriológica (XYP) . Los cultivos fueron incubados a 30°C y 220 rpm, y la producción de etanol fue monitorizada en un periodo de 2 días. Los datos obtenidos- (Tabla 1) indican que la habilidad para producir etanol en el medio rico en xilosa se incrementó conforme se reducía el tiempo de duplicación de las poblaciones heterogéneas sobre medio mínimo de xilosa. Ambas características mejoraron al unísono con el número de reiteraciones y la longitud de tiempo en que fue aplicado el proceso de apareamiento y selección.

Tabla 1. La fermentación etanólica de xilosa en medio rico mejora conforme se incrementa la velocidad de crecimiento de las poblaciones heterogéneas de Saccharomyces no recombinante en medio mineral mínimo de xilosa El número para la producción de etanol representa gramos de etanol/litro producidos al tiempo (minutos) indicado.

Ejemplo 4 Caracterización de Cepas No Recombinantes Puras de Saccharomyces Capaces de Desarrollarse como Xilosa como Fuente Única de Carbono de Acuerdo a las Pruebas TI y T2. Los aislados de la cepa de Saccharomyces fueron purificados de las poblaciones que utilizan xilosa, del Ejemplo 2, mediante procedimiento microbiológico estándar y probadas para el crecimiento y los rendimientos sobre xilosa como fuente única de carbono, de acuerdo a la Prueba Ti y T2. Las cepas CEN.PK (Karhumaa et al. (2005) Yeast 22: 259-368) y NL67 (Higgins et al. (1999) Applied and Environmental Microbiology 65: 680-685) fueron incluidas como tipos de cepas representantes que existían antes de la aplicación de los métodos descritos en la presente. Las cepas NM04/41257 y NM04/41258 (depositadas) son derivadas de las poblaciones que habían ido a través de 1059 días de corrida del protocolo descrito en el Ejemplo 2 y Figura 1. Las cepas ISO 10 (NM 05/45177) e ISO 7 (NM 05/45178) fueron obtenidas de poblaciones que habían ido a través de 1377 días, y 1431 días, respectivamente, de corrida del protocolo descrito en el Ejemplo 2 y la Figura 1. Las cepas individuales aisladas de levadura fueron confirmadas como miembros de la especie de Saccharomyces cerevisi ae mediante esporulación y apareamiento de los haploides subsecuentemente derivados, con cepas conocidas de laboratorio de Saccharomyces cerevi siae con marcadores genéticos .

Tabla 2. Crecimiento de las cepas puras de Saccharomyces cerevisiae sobre medio mínimo de xilosa como se describe en la Prueba Ti .

Los rendimientos de biomasa de las cepas puras de Saccharomyces cerevisiae sobre medio mínimo de xilosa fueron evaluados como se describe en la Prueba T2. Las cepas CEN.PK y NL67 fueron nuevamente incluidas como tipos de cepas representantes que no habían sido generadas utilizando los métodos descritos en la presente. Rendimiento de CEN.PK = 1 mg de materia seca de levadura por 50 ml de cultivo; rendimiento de NL67 = 2 mg de materia seca por 50 ml de cultivo; rendimiento de NM04/41257 = 50 mg de materia de levadura seca por 50 ml de cultivo; NM04/41258 = 55 mg de materia de levadura seca por 50 ml de cultivo; rendimiento de ISO 10 = 145 mg de materia de levadura seca por 50 ml de cultivo, rendimiento de ISO 7 = 114 mg de materia de levadura seca por 50 ml de cultivo. Los datos anteriores indican que el protocolo genera cepas que poseen la habilidad para desarrollarse rápidamente y crecer bien utilizando xilosa como una fuente única de carbono. Tomadas con los datos poblaciones en el Ejemplo 2 y en la Figura 1, los datos demuestran que el protocolo puede ser aplicado reiterativamente para derivar cepas que tienen una velocidad de crecimiento máximo posible y se desarrollan sobre xilosa, lo cual podría ser equivalente a la velocidad de crecimiento y rendimiento sobre glucosa. Ejemplo 5 Cepas de Saccharomyces No Recombinantes Capaces de Desarrollarse Rápidamente y de Producir Etanol utilizando Xilosa como la Fuente Única de Carbono El inoculo de la cepa ISO10 fue preparado mediante el crecimiento de 1 cultivo microbiano estándar de células puras de la cepa por 16 horas a 30°C, con agitación a 200 rpm en un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contenía 50 ml de agua destilada: 2.5 g de xilosa, 0.5 gramos de extracto de levadura, 0.5 g de peptona bacteriológica. Siete cultivos de 50 ml cada uno fueron desarrollados simultáneamente. Los cultivos fueron cosechados mediante centrifugación a 22°C y 3,000 x g por 5 minutos. El sobrenadante fue desechado y los botones celulares fueron resuspendidos en agua destilada estéril y centrifugados nuevamente. El sobrenadante fue desechado y los botones celulares fueron re-suspendidos y combinados en 20 ml de medio mínimo de xilosa que contenía por litro de agua destilada: 50 g de xilosa, 13.4 g de base nitrogenada de levadura Difco sin aminoácidos, suplementado con 0.4 mg de CuS0»5H20, 1 mg de ZnS0*7H20, 2 mg de MnS04«4H20, 1 mg de Na2Mo0»2H20, 1 mg de Na2B4O7«10H2O, 2 mg de pantotenato de calcio, 2 mg de cloruro de tiamina, 2 mg de cloruro de piridoxina, 4 mg de inositol, 1 mg de ácido nicotínico, y 0.4 mg de biotina. Las células fueron inoculadas luego en 980 ml del mismo medio mínimo de xilosa que había sido precalentado a 30°C y aireado a 20% de oxígeno que es un recipiente de fermentación Braun Biostat B de 2 litros. La levadura se desarrolló con aire bombeado a 10 litros por minuto, agitando a 1200 rpm y el pH se mantuvo a pH 5 utilizando las adiciones de KOH o ácido fosfórico como se requiriera. Después de 24 horas, 300 ml del volumen de cultivo se retiraron y se reemplazaron con 300 mi de medio mínimo de xilosa fresco que comprendía 50 g de xilosa más 10 g de base nitrogenada de levadura Difco sin aminoácidos, y sales en trazas, y vitaminas en las cantidades descritas anteriormente. Esto dio un cultivo de masa celular de 4 g de equivalentes de levadura seca por litro. La aireación y la agitación fueron mantenidas a 10 litros/minuto y 1200 rpm, respectivamente, y el pH se mantuvo a pH 5. Bajo estas condiciones la biomasa de levadura se duplicó en 4 horas (con base en la materia de levadura seca) con un rendimiento de 4 g de materia de levadura seca a partir de 10 g de xilosa consumida. Cuando la levadura se desarrolló mediante el procedimiento descrito anteriormente alcanzó una densidad de aproximadamente 12 g (equivalente de levadura seca) por litro, se agregaron 30 g de xilosa fresca al cultivo y el suministro de aire fue reducido a 4 litros /minuto y la velocidad del agitador se redujo a 200 rpm. Bajo estas condiciones, donde el oxígeno disuelto no era detectable se consumieron 17 g de xilosa y 1 g adicional de materia de levadura seca fue producido junto con 1.75 g de etanol/litro y 1 g de xilitol/litro en 20 horas. Ejemplo 6 Actividades de Xilosa-Redustasa (XR) , Xilitol-Deshidrogenasa (XDH) y Xilulocinasa (XK) en Cepas de Levadura No recombinantes, gue se Desarrollan Exponenc almente Las cepas de levadura fueron desarrolladas sobre glucosa, el extracto de levadura y agar de peptona bacteriológica como se describe en la Prueba TI, fueron inoculados a una densidad óptica a 600 nm de entre 0.1 y 0.2 unidades en un matraz de agitación de 250 ml en 50 ml de medio que contenía 5% p/v de xilosa, 0.5% p/v de extracto de levadura y 1% p/v de peptona bacteriológica (XYP) . Los cultivos fueron incubados a 30°C y 180 rpm hasta que alcanzaron la densidad óptica a 600 nm de entre 3 y 5 unidades. Como en el caso de las cepas tales como NL67 y CEN.PK, si las células no alcanzaban la densidad requerida después de 24 horas de incubación éstas no obstante eran cosechadas y evaluadas . Las células fueron cosechadas mediante centrifugación a 3,000 x g y 4°C por 5 minutos . El sobrenadante fue desechado y el botón celular fue resuspendido en agua destilada fría y centrifugado nuevamente. El sobrenadante fue desechado y el proceso se repitió para retirar todas las trazas del medio. Las células fueron resuspendidas en el amortiguador de desintegración y los extractos celulares preparados como se describe en Eliasson A., et al. (2000) Applied and Environmental Microbiology, Volumen 66 páginas 3381-3386. Los extractos celulares fueron luego evaluados para las actividades de XR, XDH y XK de acuerdo a los métodos descritos y referidos en Eliasson A., et al. (2000) Applied and Environmental Microbiology, Volumen 66 páginas 3381-3386. Las siguientes actividades fueron encontradas donde una unidad de actividad es definida como 1 nanomol de NAD(P)H reducido u oxidado por minuto por mg de proteína a 30°C.

Tabla 3. Unidades de actividades enzimáticas de las cepas de levadura Estos datos sugieren que el apareamiento reiterativo y la metodología de selección aplicada para obtener las levaduras que se desarrollan sobre xilosa como la fuente única de carbono, ha dado como resultado actividades mejoradas de XR y XDH que son críticas para el metabolismo de la xilosa y el xilitol . Es probable que otras enzimas y actividades tales como aquellas involucradas en la vía de fosfato de pentosa han sido también naturalmente mejoradas en las presentes cepas debido a las presiones selectivas aplicadas en los procedimientos de crianza y selección. Aquellos expertos en la técnica podrían darse cuenta que nuestras cepas podrían ser utilizadas obviamente como una base para el mejoramiento adicional utilizando selecciones y combinaciones adicionales de cruzas, mutagénesis, fusión de protoplasto, citoducción y/o técnicas de ADN recombinante que optimizan las actividades de XR, XDH, XK, o introducen y optimizan la xilosa-isomerasa, u otros cambios genéticos requeridos para mejorar el metabolismo de la xilosa, el xilitol y la xi lulosa . Ejemplo 7 Caracterización de Cepas No Recombinantes Puras de Saccharomyces Capaces de Desarrollarse Sobre Xilitol como Fuente Única de Carbono De Acuerdo a la Prueba T7. Cepas puras fueron desarrolladas sobre glucosa, extracto de levadura y agar de peptona bacteriológica como se describe en la Prueba Ti. Las colonias de la cepa fueron inoculadas a 50 ml de xilitol al 5% p/v más 0.67% de base nitrogenada de levadura Difco sin aminoácidos, y se probó para el crecimiento como se describe en la Prueba T7.

Tabla 4. Desarrollo de las cepas puras de Saccharomyces cerevi siae sobre medio mínimo de xilitol como se describe en la Prueba T7.

Estos datos sugieren que el apareamiento reiterativo y la metodología de selección aplicados para obtener las levaduras que se desarrollan sobre xilosa como la fuente única de carbono, ha dado como resultado algunas cepas que pueden también utilizar xilitol como la fuente única de carbono . Ejemplo 8 Producción de Etanol Utilizando el Medio Rico en Xilosa por Cepas No Recombinantes Puras de Saccharomyces Capaces de Desarrollarse sobre Xilosa como Fuente Única de Carbono, De Acuerdo a la Prueba T8. Aislados puros de levaduras desarrolladas sobre glucosa, extracto de levadura y agar de peptona bacteriológica como se describe en la Prueba Ti, fueron inoculados a una densidad óptica de 600 nm de entre 1 y 2 unidades en un matraz de agitación de 250 ml en 50 ml de medio que contenía 5% p/v de xilosa, 0.5% p/v de extracto de levadura y 1% p/v de peptona bacteriológica (XYP) y se evaluó como se describe en la Prueba T8. Tabla 5. Producción de etanol utilizando medio rico en xilosa Estos datos muestran que la estrategia de selección basada en el desarrollo de las levaduras sobre xilosa como la fuente única de carbono, genera cepas de levadura que son capaces de producir etanol a partir de xilosa. Estos datos aunados con los datos del Ejemplo 3 (Tabla 1) , muestran que la habilidad para desarrollarse y producir biomasa celular utilizando xilosa como la fuente única de carbono, se incrementa al unísono con la habilidad cada vez mayor para producir etanol a partir de xilosa. Además, cepas tales como NM04/41258 e ISO 7 que pueden utilizar xilitol y xilosa son capaces de producir etanol. El hallazgo de que las cepas NM04/41258 e ISO 7 (NM 05/45178) que pueden utilizar xilitol y elaborar etanol a partir de xilosa, va contra la enseñanza de la Patente de los Estados Unidos No. 4,511,656, que establece que las cepas deben ser seleccionadas para aislar la colonia o colonias específicas que utilizarán D-xilosa pero no el xili tol . Ejemplo 9 Aislamiento y Caracterización de Cepas No Recombinantes Puras de Saccharomyces Capaces de Producir Etanol utilizando Xilosa como Fuente nica de Carbono, Bajo Condiciones Anaeróbicas. Los aislados fueron purificados a partir de poblaciones que utilizan xilosa que han sufrido 1106 días de selección y fueron sometidas a la Prueba T9. Cincuenta aislados individuales fueron probados y la producción de etanol fue evaluada después de tres semanas a 4 meses, en el intervalo de 0.24 g/litro hasta 0.75 g/litro. Las cepas NM04/41257 y NM04 / 41258 fueron tambi én inc luidos en estos ensayos . Tabla 6 . Producción de etanol por las cepas puras de levadura en medio mínimo de xilosa baj o condiciones anaeróbicas .

Estos datos indican que es posible obtener cepas no recombinante de Saccharomyces que son capaces de fermentar la xilosa bajo condiciones anaeróbicas para producir etanol. Las cepas NM04/41257 y NM04/41258 fueron purificadas a partir de las poblaciones previamente seleccionadas con relación a las otras cepas en la Tabla. Estos datos muestran que el protocolo reiterativo descrito en la presente da como resultado eficiencia incrementada de la producción anaeróbica de etanol por las cepas no recombinantes . Ejemplo 10 Producción Rápida de Etanol por Saccharomyces No Recombinantes Inoculados a Alta Densidad en el Medio Mínimo, Bajo Condiciones Aeróbicas. La cepa ISO 10 desarrollada sobre glucosa, extracto de levadura, agar de peptona bacteriológica (como se describe anteriormente) fue inoculada en 50 ml de xilosa al 5% p/v, extracto de levadura al 0.5% p/v, y peptona bacteriológica al 1% p/v (XYP) contenidos en matraces Erlenmeyer de 250 ml e incubados por 72 horas a 30°C y 220 rpm. Veinte matraces fueron incubados simultáneamente. Las células fueron cosechadas mediante centrifugación a 3,000 x g y 22°C por 10 minutos . El sobrenadante fue desechado y el botón celular re-suspendido en 10 ml de agua estéril antes de la recentrifugación. El sobrenadante fue nuevamente desechado y las células resuspendidas en agua estéril destilada antes de una centrifugación adicional. Finalmente, las células fueron re-suspendidas en 20 ml de agua destilada estéril. El medio de fermentación fue preparado, esterilizado por filtración como sigue: YNB contenía 0.67% de base nitrogenada de levadura Difco sin aminoácidos; XYN fue YNB más 5% de xilosa; GXYNB fue YNB más 0.5% de glucosa y 4.5% de xilosa. Los medios estaban contenidos en matraces de vidrio cónico de 125 ml . Éstos fueron inoculados con 3 ml de la suspensión celular y colocados sobre un agitador orbital a 220 rpm a 30°C y la producción de etanol fue leída a intervalo de una hora como se describe previamente. Inmediatamente después de la inoculación se midieron las densidades ópticas a 600 nm de los cultivos y se determinó que las densidades celulares para los cultivos fueron de 5.7 a 6.1 x 108 por ml . Tabla 7. Producción de etanol por inoculo de alta densidad de células de Saccharomyces No Recombinantes Los números se refieren a los gramos de etanol por litro en el sobrenadante de cultivo al tiempo indicado después de la inoculación. La pequeña cantidad de etanol producida por las células incubadas en YNB sin una fuente de carbono, fue derivada más probablemente de la portación de azúcares de almacenamiento endógenos sintetizados y acumulados por la levadura durante la fase de preparación de inoculo de 72 horas. La declinación en la concentración de etanol de los cultivos de YNB después de 3 horas indica que los azúcares de almacenamiento fueron agotados o se llegaron a agotar, y el etanol estaba siendo consumido por las células y/o el etanol se estaba evaporando. Estos datos muestran que es posible que las cepas no recombinantes de Saccharomyces sean obtenidas, las cuales pueden fermentar xilosa para producir etanol en medio mínimo, donde la xilosa es la única fuente de carbono. Además, estas cepas son capaces de producir etanol a partir de xilosa en el medio donde el azúcar hexosa fermentable tal como glucosa fue también agregada, ya que el etanol producido por 4 horas en GXYNB estuvo en exceso de aquel esperado solamente a partir de la glucosa presente. Ejemplo 11 Biomasa de Saccharomyces No Recombinante Desarrollada Sobre Xilosa como la Fuente Única de Carbono, Muestra Características Amplias Industrialmente Útiles Aquellos expertos en la técnica sabrán que las levaduras han probado tener utilidad industrial en diversas aplicaciones de fermentación (por ejemplo pan, y etanol (potable y no potable) ) y también como una fuente de aminoácidos y proteína, nucleótidos (por ejemplo ADN y RNA) , enzimas (por ejemplo invertasa y fitasa) , antioxidantes (por ejemplo glutatión) y otros componentes celulares tales como componentes de la pared celular (por ejemplo glucanos) . Las propiedades anteriormente mencionadas son a manera de ejemplo y no se pretende que sean limitantes.

Sería útil si las levaduras pudieran desarrollarse sobre el medio que contiene xilosa, y luego subsecuentemente utilizadas para los diversos fines industriales. Por lo tanto, a manera de ejemplo la cepa ISO 10 fue probada para diversas características después del crecimiento sobre xilosa . La cepa ISO 10 fue desarrollada por litro: 50 g de xilosa, 13.4 g de base nitrogenada de levadura Difco sin aminoácidos, suplementada con 0.4 mg de CuS0«5H0, 1 mg de ZnS0«7H2o, 2 mg de MnS0»H20, 1 mg de Na2Mo0«2H20, 1 mg de Na2B?7»10H2O, 2 mg de pantotenato de calcio, 2 mg de cloruro de tiamina, 2 mg de clorhidrato de piridoxina, 4 mg de inositol, 1 mg de ácido nicotínico, y 0.4 mg de biotina. Las células fueron agitadas a 1200 rpm con suministro de aire a 12 litros por minuto y temperatura a 30°C y el pH se mantuvo a pH 5 utilizando hidróxido de potasio 1 M y ácido fosfórico 1 M. Cuando la densidad celular estuvo a A60o 14, las células fueron cosechadas mediante centrifugación a 3,000 x g y 22°C por 10 minutos. El botón celular fue resuspendido en agua destilada y centrifugado nuevamente. Este procedimiento de lavado fue llevado a cabo tres veces y la biomasa colocada sobre papel filtro Wahtman No. 1 para alcanzar una biomasa húmeda de 22 a 25% de sólidos. La biomasa fue evaluada para las siguientes características por medio de demostración de que es posible desarrollar Saccharomyces no recombinante sobre xilosa como fuente única de carbono para obtener biomasa de levadura con propiedades en general relevantes para aplicaciones industriales . Poder de fermentación etanólico . La levadura fue inoculada en un medio basado en melasas para probar el poder de fermentación etanólica, definido como la habilidad para producir etanol a partir de azúcares fermentables tales como sucrosa, glucosa y fructosa. Melasas de caña de azúcar fueron diluidas en agua y esterilizadas mediante calentamiento a 121°C por 5 minutos. Cuando se enfriaron a 22°C las melasas fueron centrifugadas a 4,000 x g a 22°C por 10 minutos para eliminar los sólidos. El sobrenadante fue diluido hasta una concentración final de 18% p/p de equivalentes de sucrosa y suplementado con la base nitrogenada de levadura Difco esterilizada por filtración, a 0.67% p/v. Cuarenta ml de este medio fueron inoculados con un equivalente de 6.8 mg de materia seca de levadura e incubados a 30°C sin agitación. El etanol fue evaluado a intervalos de 24 horas mediante el uso de un Analizador de Bioquímica YSI 2700 Select equipado con una membrana 2786 de YSI para la detección de etanol (YSI Inc. Yellow Springs, Ohio, EUA). Después de 24 horas la levadura produjo 16.8 g de etanol por litro, después de 1 semana la levadura había producido 59 g de etanol por litro.

Elevamiento de masa para pan . Para probar el poder de elevación, definido como la habilidad para fermentar azúcares tales como glucosa, fructosa y maltosa, y con esto producir dióxido de carbono que eleva una masa de harina, la levadura fue agregada a una mezcla de masa para pan y probada para su habilidad para producir pan esponjado. Fue preparada una masa la cual contenía 500 g de harina de soya entera y mezcla de pan de linasa (Kitchen Collection, Christchurch) , 300 ml de agua de la llave y 10 g de levadura (a 24% de sólidos) . La masa fue elevada y horneada utilizando un horno Breville Bakers en el ajuste 3B (HWI Electrical, Sydney Australia) . La levadura elevó (esponjó) la mezcla de masa para producir una hogaza de pan con altura de 14 cm. Contenido de glucano . Una cantidad de biomasa de levadura equivalente a 50 mg de materia seca se extrajo para los glucanos de acuerdo al método descrito por Sutherland IW, y Wilkinson JF (1971) "Chemical Extraction Methods of Microbiol Cells", en Methods in Microbiology Vol. 5B (Eds. JR Norris y DW Ribbons), Capítulo IV, páginas 345-383, Academic Press London and New York. De acuerdo a Sutherland et al. este método produce "glucano de pared celular que está libre de material contaminante" . Utilizando el procedimiento descrito se obtuvo una cantidad de 8 mg de glucano a partir de la materia inicial seca de levadura. Contenido de Aminoácidos/Proteína . Una cantidad de material de levadura equivalente a 24.6 mg de materia de levadura seca se suspendió en un tubo de ensayo de vidrio en 2.5 ml de hidróxido de sodio 1 M, y se colocó en un baño de agua a ebullición por 15 minutos. La muestra hervida fue enfriada a 22 °C y el volumen se aforó a 10 ml utilizando agua destilada. El aminoácido/proteína fue evaluado de acuerdo a Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, y Randall RJ (1951) Journal of Biological Chemistry 193: 265-275, utilizando un estándar de albúmina sérica bovina. Este ensayo indicó que la levadura contenía un equivalente de 39% de material de aminoácidos/proteína en peso de materia seca. Contenido de nucleótido . Una cantidad de material de levadura equivalente a 8.3 mg de levadura seca se resuspendieron en 1 ml de cloruro de sodio al 4% p/v y se calentó en autoclave a 121°C por 15 minutos. Después del enfriamiento a 22°C, la suspensión de levadura se centrifugó a 3,000 x g por 10 minutos a 22°C y el sobrenadante se evaluó para el contenido de nucleótido mediante el método de absorbancia espectrofotométrica de UV descrito por Herbert D, Phipps PJ, y Strange RE (1971) "Chemical Analysis of Microbial Cells", en Methods in Microbiology Vol. 5B (Eds. JR Norris y DW Ribbons), Capítulo III, páginas 209-344, Academic Press Londond and New York. La levadura contenía 1.9% de material nucleotídico por peso de material seco. Contenido de glutatión . Una cantidad de material de levadura equivalente a 6.82 mg de levadura seca se resuspendió en 0.8 ml de etanol: agua destilada 80:20, se mezcló en torbellino y se centrifugó a 10,000 x g por 2 minutos a 22°C. El sobrenadante se evaluó como sigue: el amortiguador de fosfato contenía 3.99 g de NaHP0 , 0.43 g de NaH2P04«H20, 0.59 g de EDTA disódico bi-hidratado por 250 ml a pH 7.5. La solución de NADPH contenía 26.6 mg de la sal tetra-sódica de NADPH en 100 ml de amortiguador de fosfato. El 5, 5"-ditio-bis (ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB) fue preparado al pesar 23.8 mg de DTNB en 10 ml de amortiguador de fosfato. El estándar de glutatión fue preparado en agua destilada a una concentración de reserva de 0.1 mM. La solución de reserva de glutatión-reductasa de Fluka Chemie AG contenía 162.72 unidades de actividad por ml . El ensayo fue llevado a cabo en una cubeta de espectrofotómetro de 3 ml que contenía 1.4 ml de solución de NADPH + 200 microlitros de solución de DTNB + 10 microlitros de muestra, solución estándar GSH, o agua destilada y 390 microlitros de agua destilada. La muestra fue precalentada a 30°C y la reacción comenzó por la adición de tres microlitros de glutatión-reductasa. Las cubetas fueron incubadas a 30°C por 30 minutos y luego se leyó la absorbancia contra el blanco de agua destilada a una longitud de onda de 412 nm utilizando un espectrofotómetro Shimadzu UV-1201. Este ensayo indicó que la levadura contenía 0.36% de glutatión total por peso de materia seca.

Actividad de fitasa. Una cantidad de material de levadura equivalente a 13.5 mg de levadura seca se resuspendieron en 0.5 mi de amortiguador de acetato de sodio 0.2 M a pH 4.9. El sustrato de fosfatasa de Sigma-Aldrich Chemie GmbH fue constituido a 1 mg por ml en amortiguador de acetato de sodio 0.2 M a pH 4.9, y la enzima fitasa proveniente de Sigma-Aldrich Chemie GmbH (definida por el proveedor como poseedora de 1.1 unidades de actividad de fitasa por mg de material sólido) se llevó a 0.909 unidades por ml en amortiguador de acetato de sodio 0.2 M a pH 4.9. El ensayo fue realizado en una cubeta que contenía 500 microlitros de amortiguador de acetato de sodio + 250 microlitros de solución de sustrato de fosfatasa y 250 microlitros ya sea de la suspensión de levadura, la enzima fitasa o bien agua destilada. Las cubetas fueron incubadas por 20 minutos a 30°C, tiempo en el cual se agregaron 30 microlitros de hidróxido de sodio 10 M. La absorbancia a 405 nm fue leída contra el blanco de agua destilada. La actividad de fitasa de la levadura fue de 0.068 unidades por mg de materia seca de levadura. Actividad de invertasa. Una cantidad de material de levadura equivalente a 14.48 mg de levadura seca se resuspendieron en 1 ml de agua destilada. La suspensión se diluyó adicionalmente a un céntimo en agua destilada. La actividad de invertasa fue evaluada de acuerdo al método colorimétrico descrito en la Prueba T3 de las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,396,632 y 5,741,695. La levadura produjo 0.93 unidades de actividad de invertasa donde una unidad de actividad es definida como 1 micromol de glucosa liberado a partir de sucrosa por minuto a 30°C y pH 4.9 por mg de levadura seca. Estos datos indican el potencial para que Saccharomyces cerevisiae no recombinante sea desarrollada sobre xilosa como la fuente única de carbono para producir biomasa, metabolismo, componentes celulares y/o actividades enzimáticas que son relevantes para amplios tipos de aplicaciones industriales. Aquellos expertos en la técnica sabrán que los niveles exactos o las cantidades exactas de estas características pueden ser manipuladas no solamente a través de métodos genéticos clásicos y recombinantes, sino también a través de medios para alterar las condiciones de cultivo, tales que los resultados dados anteriormente son meramente indicativos. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método para producir una cepa de Saccharomyces que es capaz de desarrollarse a una velocidad de crecimiento deseada utilizando xilosa como una fuente única de carbono para el crecimiento, caracterizado porque comprende los pasos de: (a) proporcionar una población de células de levadura no recombinantes, genéticamente diversas de Sa echar omyces ; (b) cultivar las células de levadura bajo condiciones que permiten la combinación de ADN entre las células de levadura; (c) clasificar o seleccionar las células de levadura para las células de levadura que tienen velocidad de crecimiento incrementado utilizando xilosa como una fuente única de carbono para el crecimiento; (d) aislar una o más células de levadura que tienen la velocidad de crecimiento deseada.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células clasificadas o seleccionadas forman una población de células de levadura no recombinantes, genéticamente diversas y los pasos (b) y (c) son repetidos hasta que es obtenida la velocidad de crecimiento deseada.

3. Un método para producir una cepa de Saccharomyces en un cultivo que es capaz de desarrollarse a una velocidad de crecimiento de al menos una generación por 48 horas utilizando xilosa como fuente única de carbono para el crecimiento, caracterizado porque comprende los pasos de: (a) proporcionar una población de células de levadura no recombinantes, genéticamente diversas de Saccharomyces ; (b) cultivar las células de levadura bajo condiciones que permiten la combinación de ADN entre las células de levadura; (c) clasificar o seleccionar las células de levadura mediante la incubación de las células de levadura sobre o en el medio que contiene xilosa; (d) repetir los pasos (b) y (c) con las células clasificadas o seleccionadas que forman la población de células de levadura no recombinantes, genéticamente diversas de Saccharomyces , hasta que una o más células de levadura han adquirido la habilidad para crecer a una velocidad de crecimiento de al menos una generación por 48 horas utilizando xilosa como una fuente única de carbono para el crecimiento.

4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque las células de levadura en el paso (c) son seleccionadas mediante la incubación de las células de levadura sobre el medio que contiene xilosa.

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el medio que contiene xilosa contiene xilosa como una fuente única de carbono .

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones l a 5, caracterizado porque el medio que contiene xilosa es medio mínimo de xilosa.

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el medio que contiene xilosa contiene xilosa como una de la pluralidad de fuentes de carbono.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque las células de levadura son incubadas sobre o en el medio que contiene xilosa, por un periodo de tiempo suficiente para permitir que las células de levadura que no tienen una velocidad de crecimiento incrementada utilizando xilosa como una fuente única de carbono se desarrollen sobre la xilosa.

9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la combinación del ADN entre las células de levadura es mediante apareamiento .

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el apareamiento es mediante esporulación de las células de levadura e hibridación de la progenie sexualmente competente.

11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la población de células de levadura genéticamente diversas comprende al menos dos cepas de levadura genéticamente diferentes.

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la población de células de levadura comprende cepas de Saccharomyces de origen natural .

13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la población de células de levadura no recombinantes, genéticamente diversas, comprende cepas de Saccharomyces generadas mediante uno o más de mutagénesis física o química fusión de protoplastos, esporulación, hibridación y citoducción.

14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque la población de células de levadura genéticamente diversas comprende la especie Saccharomyces cerevisiae .

15. Una cepa, caracterizada porque es producida mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

16. Un derivado, caracterizado porque es de la cepa de conformidad con la reivindicación 15.

17. Una cepa aislada de Saccharomyces, caracterizada porque es capaz de tener una velocidad de crecimiento de una generación por 48 horas utilizando xilosa como una fuente única de carbono para el crecimiento, en donde la cepa produce : (i) un incremento de 5 veces en la biomasa cuando se desarrolla bajo las condiciones especificadas en la Prueba TI; y (ii) al menos 10 mg de peso seco de biomasa cuando se desarrolla bajo las condiciones especificadas en la Prueba T2, y en donde la cepa es producida mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

18. Una cepa aislada de Saccharomyces que es capaz de tener una velocidad de crecimiento de una generación por 48 horas utilizando xilosa como fuente única de carbono para el crecimiento, caracterizada porque : (i) la cepa produce un incremento de 10 veces en la biomasa cuando se desarrolla bajo las condiciones especificadas en la Prueba TI; y (ii) la cepa produce al menos 50 mg de peso seco de biomasa cuando se desarrolla bajo las condiciones especificadas en la Prueba T2 ; y (iii) se detecta al menos 0.1 g/litro de etanol bajo las condiciones especificadas en la Prueba T3 ; y (iv) al menos un nanomol de NAD(P)H es reducido u oxidado por minuto por mg de extracto de proteína, a 30°C bajo las condiciones especificadas en la Prueba T4 ; y (v) al menos un nanomol de NAD(P)H es reducido u oxidado por minuto por mg de extracto de proteína, a 30°C bajo las condiciones especificadas en la Prueba T5 ; y en donde la cepa es producida mediante el método de conformidad con las reivindicaciones 1 a 14.

19. Una cepa aislada de Saccharomyces que es capaz de tener una velocidad de crecimiento de una generación por 48 horas utilizando xilosa como una fuente única de carbono para el crecimiento, caracterizada porque: (i) la cepa produce un incremento de 5 veces en la biomasa cuando se desarrolla bajo las condiciones especificadas en la Prueba TI; y (ii) la cepa produce al menos 40 mg de peso seco de biomasa cuando se desarrolla bajo las condiciones especificadas en la Prueba T2 ; y (iii) al menos un nanomol de NAD(P)H es reducido u oxidado por minuto por mg de extracto de proteína, a 30°C bajo las condiciones especificadas en la Prueba T4 ; y (iv) al menos un nanomol de NAD(P)H es reducido u oxidado por minuto por mg de extracto de proteína, a 30°C bajo las condiciones especificadas en la Prueba T5 ; y (v) la cepa produce al menos un incremento de 5 veces en la biomasa bajo las condiciones especificadas en la Prueba T7 ; (vi) es detectada una concentración de al menos 0.04 g/litro de etanol bajo las condiciones especificadas en la Prueba T8 ; y en donde la cepa es producida mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

20. Una cepa aislada de Saccharomyces que es capaz de desarrollarse a una velocidad de al menos una generación por 48 horas utilizando xilosa como una fuente única de carbono para el crecimiento, caracterizada porque la capacidad de la cepa para utilizar xilosa como una fuente única de carbono, es obtenida a través de métodos no recombinantes .

21. La cepa de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque la velocidad de crecimiento es mayor de una generación por 24 horas.

22. La cepa de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque la velocidad de crecimiento es mayor de una generación por 8 horas.

23. La cepa de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque la velocidad de crecimiento es mayor de una generación por 4 horas.

24. La cepa de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque la velocidad de crecimiento es mayor de una generación por 2 horas.

25. La cepa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, caracterizada porque la cepa produce al menos un incremento de 2 veces en la biomasa cuando se desarrolla bajo las condiciones especificadas en la Prueba TI.

26. La cepa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 25, caracterizada porque la cepa produce al menos un incremento de 5 veces en la biomasa cuando se desarrolla bajo las condiciones especificadas en la Prueba Ti.

27. La cepa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 26, caracterizada porque la cepa produce al menos 0.01 g de peso seco de la biomasa por 50 ml de cultivo, cuando se desarrolla bajo las condiciones especificadas en la Prueba T2.

28. La cepa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 27, caracterizada porque la cepa expresa una enzima no recombinante que tiene al menos 1 unidad de actividad de xilosa-reductasa cuando es determinada por la Prueba T4.

29. La cepa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 28, caracterizada porque la cepa expresa una enzima no recombinante que tiene al menos 1 unidad de actividad de xilitol-deshidrogenasa cuando es determinada por la Prueba T5.

30. La cepa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 29, caracterizada porque la cepa expresa una enzima no recombinante que tiene al menos 10 unidades de actividad de xilulosa-cinasa cuando es determinada por la Prueba T6.

31. La cepa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 30, caracterizada porque la cepa expresa una enzima no recombinante que tiene al menos una unidad de actividad de xilosa-reductasa como es determinada por la Prueba T4 , y la enzima no recombinante que tiene al menos una unidad de actividad de xilitol-deshidrogenasa como es determinada por la Prueba T5.

32. Una cepa aislada de Saccharomyces, caracterizada porque tiene la habilidad para desarrollarse sobre xilosa como una fuente única de carbono a una velocidad de al menos una generación por 48 horas, y que es capaz de expresar la enzima no recombinante que tiene una actividad seleccionada del grupo que consiste de xilosa-reductasa y xilitol-deshidrogenasa, en donde la actividad de xilosa-reductasa es al menos una unidad, cuando es determinada por la Prueba T4, y la actividad de xilitol-deshidrogenasa cuando es determinada por la Prueba T5.

33. La cepa de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque la cepa es capaz de expresar una enzima no recombinante que tiene actividad de xilosa-reductasa y una enzima no recombinante que tiene actividad de xilitol-deshidrogenasa .

34. La cepa de conformidad con la reivindicación 32 ó 33, caracterizada porque la cepa es capaz de expresar una enzima no recombinante que tiene actividad de xilulosa-cinasa además de una o más enzimas no recombinantes que tienen una actividad seleccionada del grupo que consiste de xilosa-reductasa y xilitol-deshidrogenasa.

35. La cepa de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque la actividad de xilulosa-cinasa es al menos de 10 unidades cuando es determinada por la Prueba T6.

36. La cepa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32 a 35, caracterizada porque la cepa se desarrolla a una velocidad mayor que una generación por 24 horas utilizando xilosa como una fuente única de carbono para el crecimiento.

37. La cepa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32 a 36, caracterizada porque la biomasa de la cepa se incrementa al menos 2 veces en la Prueba TI.

38. La cepa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32 a 37, caracterizada porque la biomasa de la cepa se incrementa al menos 5 veces en la Prueba Ti.

39. La cepa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32 a 38, caracterizada porque la biomasa de la cepa se incrementa al menos 10 veces en la Prueba TI.

40. La cepa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 39, caracterizada porque la biomasa de la cepa se incrementa al menos 5 veces en la Prueba T7.

41. La cepa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 39, caracterizada porque son producidos al menos 10 mg de peso seco de la biomasa en la Prueba T2.

42. La cepa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 39, caracterizada porque son producidos al menos 30 mg de peso seco de la biomasa en la Prueba T2.

43. La cepa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 39, caracterizada porque son producidos al menos 40 mg de peso seco de la biomasa en la Prueba T2.

44. La cepa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 39, caracterizada porque son producidos al menos 50 mg de peso seco de la biomasa en la Prueba T2.

45. La cepa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 44, caracterizada porque la cepa es capaz de producir etanol cuando se desarrolla sobre xilosa.

46. La cepa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 44, caracterizada porque la cepa fermenta xilosa para producir etanol.

47. La cepa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 46, caracterizada porque la cepa es capaz de producir etanol a una concentración de al menos 0.1 g/litro en la Prueba T3.

48. La cepa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 46, caracterizada porque la cepa es capaz de producir etanol a una concentración de al menos 0.4 g/litro en la Prueba T8.

49. Una cepa aislada de Saccharomyces no recombinante, caracterizada porque produce un incremento en la biomasa de al menos 2 veces bajo las condiciones especificadas en la Prueba Ti.

50. Una cepa aislada de Saccharomyces no recombinante, caracterizada porque tiene las siguientes características : (a) un incremento en la biomasa de al menos 5 veces bajo las condiciones especificadas en la Prueba TI; (b) al menos 10 mg de peso seco de biomasa bajo la condición especificada en la Prueba T2.

51. Una cepa aislada de Saccharomyces no recombinante, caracterizada porque tiene las siguientes características : (a) la biomasa de la cepa se incrementa al menos 10 veces en la Prueba Ti; (b) se producen al menos 50 mg de peso seco de la biomasa en la Prueba T2 ; (c) es detectada una concentración de al menos 0.1 g/litro de etanol en la Prueba T3 ; (d) es detectada al menos una unidad de actividad de xilosa-reductasa bajo la condición especificada en la Prueba T4 ; (e) es detectada al menos una unidad de actividad de xilitol-deshidrogenasa bajo la condición especificada en la Prueba T5.

52. Una cepa aislada de Saccharomyces no recombinante, caracterizada porque tiene las siguientes características : (a) la biomasa de la cepa se incrementa al menos 5 veces en la Prueba TI; (b) se producen al menos 40 mg de peso seco de la biomasa en la Prueba T2 ; (c) la biomasa de la cepa se incrementa al menos 5 veces en la Prueba T7 ; (d) es detectada una concentración de al menos 0.04 g/litro de etanol bajo las condiciones establecidas en la Prueba T8 ; (e) es detectada al menos 1 unidad de actividad de xilosa-reductasa bajo la condición especificada en la Prueba T4; (f) es detectada al menos una unidad de actividad de xilitol-deshidrogenasa bajo la condición especificada en la Prueba T5.

53. La cepa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 52, caracterizada porque la cepa produce al menos 0.2 g de etanol por litro dentro de un periodo de 4 meses bajo las condiciones especificadas en la Prueba T9.

54. La cepa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 52, caracterizada porque la cepa produce al menos 0.5 g de etanol por litro cuando es inoculada a una densidad celular de al menos 5 x 108 células por ml dentro del medio mineral mínimo que contiene xilosa.

55. La cepa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 54, caracterizada porque la cepa es una cepa de Saccharomyces cerevisiae.

56. Una cepa de Saccharomyces no recombinante, caracterizada porque está depositada bajo el depósito de la AGAL número de acceso NM04/41257.

57. Una cepa de Saccharomyces no recombinante, caracterizada porque está depositada bajo el depósito de la AGAL número de acceso NM04/41258.

58. Una cepa de Saccharomyces no recombinante, caracterizada porque está depositada bajo el depósito de la AGAL número de acceso NM05/45177. 59. Una cepa de Saccharomyces no recombinante, caracterizada porque está depositada bajo el depósito de la AGAL número de acceso NM05/45178. 60. Un derivado de la cepa caracterizado porque es de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a

59. 61. El derivado de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque es un derivado recombinante. 62. Una población de células de levadura de Saccharomyces, caracterizada porque es producida mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14. 63. El uso de la cepa de Saccharomyces de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 59, el derivado de conformidad con la reivindicación 60, o la población de conformidad con la reivindicación 62, en la producción de biomasa de levadura. 64. El uso de la cepa de Saccharomyces de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 59, el derivado de conformidad con la reivindicación 60, o la población de conformidad con la reivindicación 62, en la producción de etanol. 65. Un método para convertir la xilosa a biomasa de levadura, caracterizado porque comprende cultivar una cepa de Saccharomyces de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 56, el derivado de conformidad con la reivindicación 57, o la población de conformidad con la reivindicación 59, con un medio que contiene xilosa, bajo condiciones que permiten que la cepa se desarrolle utilizando la xilosa como una fuente de carbono para el crecimiento. 66. Un método para producir biomasa de levadura, caracterizado porque comprende el desarrollo de una cepa de Saccharomyces de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 59, el derivado de conformidad con la reivindicación 60, o la población de conformidad con la reivindicación 62, sobre o en un medio que contiene xilosa, en donde al menos una porción de la biomasa de levadura es producida utilizando xilosa como una fuente de carbono para el crecimiento. 67. Un método para producir un compuesto a partir de una cepa de Saccharomyces , caracterizado porque comprende el cultivo de la cepa de Saccharomyces de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 59, el derivado de conformidad con la reivindicación 60, o la población de conformidad con la reivindicación 62, sobre o en el medio que contiene xilosa, bajo las condiciones que permiten la producción del compuesto, en donde el compuesto es producido por la cepa durante el crecimiento utilizando xilosa como una fuente de carbono . 68. Un método para producir etanol, caracterizado porque comprende los pasos de : (a) incubar la cepa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 59, el derivado de conformidad con la reivindicación 60, o la población de conformidad con la reivindicación 62, en el medio bajo las condiciones que permiten la producción de etanol; (b) el aislamiento del etanol producido. 69. El método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque el medio es medio que contiene xilosa . 70. El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque el medio que contiene xilosa comprende además de la xilosa, uno o más azúcares seleccionados del grupo que consiste de glucosa, fructosa, mannosa, galactosa, maltotriosa, maltosa, sucrosa, melibiosa, raffinosa, xilosa, melizitosa, alfa-metil-glucósido, trehalosa, isomaltosa, dióxido de carbono. 71. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 68 a 70, caracterizado porque la cepa es incubada bajo condiciones anaeróbicas. 72. Un método para producir etanol, caracterizado porque comprende : (a) inocular el medio que contiene xilosa con una cepa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 59, un derivado de conformidad con la reivindicación 60, o una población de conformidad con la reivindicación 62, a una densidad de al menos 1 x 108 levadura por ml ; (b) incubar el medio inoculado por un tiempo suficiente para permitir la producción de etanol; (c) recuperar el etanol. 73. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque la densidad es al menos de 5 x 108 por ml . 74. El etanol, caracterizado porque es producido mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 68 a 73. 75. Un método para marcar una cepa de Saccharomyces deseada, caracterizado porque comprende: (a) cultivar la cepa deseada con una cepa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 59, un derivado de conformidad con la reivindicación 60, o una población de conformidad con la reivindicación 62, bajo condiciones para permitir la combinación de ADN de las cepas; (b) clasificar o seleccionar las células de levadura para las cepas deseadas, modificadas que tienen un crecimiento incrementado utilizando xilosa como una fuente única de carbono; (c) aislar la cepa modificada de Saccharomyces deseada, con una velocidad de crecimiento incrementada utilizando xilosa como una fuente única de carbono.