PT103331A - Expressão dum transportador activo de xilose em saccharomyces cerevisiae modificada geneticamente - Google Patents

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO PROPORCIONA À LEVEDURA FERMENTATIVA SACCHAROMYCES CEREVISÍAE, GENETICAMENTE MODIFICADA POR INTRODUÇÃO DUMA SEQUÊNCIA DE ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICA UM TRANSPORTADOR ACTIVO DE XILOSE E GLUCOSE, A CAPACIDADE PARA CONSUMIR XILOSE UTILIZANDO UM SISTEMA DE CO-TRANSPORTE COM PROTÕES QUE EXIBE ALTA AFINIDADE PARA XILOSE. A INVENÇÃO É ÚTIL PARA A PRODUÇÃO DE BIOETANOL A PARTIR DE BIOMASSA VEGETAL E DE OUTROS MATERIAIS LENHO-CELULÓSICOS, UTILIZANDO MICRORGANISMOS MODIFICADOS GENETICAMENTE PARA CONSUMIR E FERMENTAR XILOSE NA MISTURA DE HEXOSES E PENTOSES RESULTANTES DE MATÉRIAS-PRIMAS DE INTERESSE INDUSTRIAL.

Description

1

DESCRIÇÃO

"FRAGMENTO DE DNA ISOLADO QUE CODIFICA UM TRANSPORTADOR ACTIVO DE XILOSE/GLUCOSE, MOLÉCULA DE cDNA, PLASMÍDEO COMPREENDENDO 0 REFERIDO FRAGMENTO DE DNA, CÉLULA HOSPEDEIRA TRANSFORMADA COM ESSE PLASMÍDEO E UTILIZAÇÃO DA MESMA PARA A PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DE SUSBTRATOS COMPREENDENDO XILOSE"

OBJECTO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a uma levedura modificada, preferencialmente Saccharomyces cerevisiae, com a introdução dum novo gene correspondente a um transportador activo para xilose. É também objecto da presente invenção o co-transporte de xilose/protão por leveduras na presença de glucose. É ainda objecto da presente invenção a utilização de leveduras recombinantes, com o mesmo sistema de transporte para xilose, na fermentação de hidrolisados lenho-celulósicos. 0 objectivo da presente invenção é dotar a área de produção de bioetanol com uma levedura capaz de consumir xilose mais rapidamente em misturas com glucose e de fermentar xilose com maior eficiência e produtividade especifica mais elevada.

ESTADO DA TÉCNICA

Planos de acção em todo o Mundo visam a produção de biocombustiveis, com relevância para bioetanol, como energia alternativa e renovável. Visam estas medidas diminuir a dependência do petróleo e reduzir a emissão de gases e as consequentes alterações climáticas. Actualmente, são utilizados cereais ou outros substratos de origem 2 agrícola ricos em glucose para a produção industrial de etanol pela levedura Saccharomyces cerevisiae. Os materiais lenho-celulósicos são os mais abundantes na biomassa vegetal. Constituem o principal produto florestal e uma fracção considerável dos desperdícios da exploração agrícola. 0 desenvolvimento de processos para a sua bioconversão em etanol é potencialmente muito importante e fortemente estimulado. A componente celulósica dos materiais lenho-celulósicos é exclusivamente formada por polímeros de glucose, enquanto a fracção hemicelulósica é composta por polímeros que contêm uma mistura de hexoses (glucose, galactose, manose) e de pentoses (xilose, arabinose e ribose). A xilose é a principal pentose presente nas hemiceluloses, constituindo 17% a 31% do seu peso seco. Cerca de 80% da xilose total é passível de ser recuperada como açúcar fermentável nos hidrolisados de hemicelulose. A utilização de materiais lenho-celulósicos para uma produção economicamente rentável de etanol por Saccharomyces requer que a xilose seja totalmente fermentada. No entanto, esta levedura não tem capacidade natural para converter xilose em etanol. Existem outras leveduras que podem fermentar xilose, mas os hidrolisados de hemicelulose contêm vários compostos (ácidos orgânicos, furanos e fenólicos) que inibem o processt) fermentativo. 5. cerevisiae é o único microrganismo conhecido que consegue fermentar com eficiência neste ambiente agreste (Olsson and Hahn-Hágerdal, "Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production", Enzyme Microbial Technol 18: 312-331, 1996) . 3 Têm sido produzidas estirpes recombinantes de S. cerevisiae nas quais foram introduzidos dois genes para o catabolismo de xilose: xilose redutase (XR), que reduz a xilose a xilitol, e xilitol desidrogenase (XDH), que oxida xilitol a xilulose. Este composto já é naturalmente metabolisado por S. cerevisiae seguindo a via das pentoses e a via glicolítica para a produção de etanol. Os genes para os enzimas XR e XDH foram obtidos da levedura Pichia stipitis que fermenta naturalmente xilose. Com estes genes S. cerevisiae metabolisa xilose, mas não produz etanol em concentrações significativas. Nesta levedura, a xilulose é fosforilada a xilulose-5-fosfato por uma xilulose cinase (XK). 0 gene nativo XK foi sobre-expresso em estirpes de S. cerevisiae contendo XR e XDH heterólogos. A nova combinação de genes foi objecto de integração cromossómica para produzir estirpes com um fenótipo estável e que podem ser cultivadas em substratos industriais (WO9742307). As estirpes resultantes produzem concentrações muito apreciáveis de etanol, mas com valores de produtividade baixos.

Estratégias variadas têm sido seguidas para melhorar a produtividade na produção de etanol a partir de xilose por estirpes recombinantes de S. cerevisiae. Três dessas estratégias tiveram sucesso. Uma consistiu em sujeitar os recombinantes de S. cerevisiae a mutagénese aleatória, utilizando EMS (etil metano sulfonato) como agente mutagénico, e seleccionando os mutantes obtidos para uma fermentação mais eficiente (US 2003/0157675 Al). Outra abordagem impôs uma forte pressão selectiva a estirpes recombinantes, utilizando cultura continua em quimiostato e anaerobiose, para seleccionar os mais aptos para fermentar xilose (WO03078643) . A terceira estratégia fez uso da via 4 catabólica para xilose que ocorre geralmente em bactérias. Neste grupo de microrganismos, a xilose é transformada directamente em xilulose por acção de uma xilose isomerase (XI). As sucessivas tentativas para expressar XI de origem bacteriana em S. cerevisiae tinham falhado. Recentemente, foi isolada e expressa em S. cerevisiae uma XI de origem fúngica (W003062430). No entanto, as produtividades obtidas na produção de etanol a partir de xilose utilizando as melhores estirpes existentes fica ainda muito aquém das obtidas quando a levedura fermenta glucose. Um possível obstáculo para atingir valores mais altos reside no passo da entrada da xilose na célula (Hahn-Hâgerdal et al, "Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for xylose utilization", Adv Biochem Eng/Biotechnol 73: 53-84, 2001; Jeffries and Jin, "Metabolic engineering for improved fermentation of pentoses by yeasts", Appl Microbiol Biotechnol 63: 495-509, 2004) A xilose é um substrato fraco dos transportadores que medeiam a entrada rápida de glucose e de outras hexoses em S. cerevisiae. Os transportadores HXT apresentam afinidades para xilose uma a duas ordens de grandeza mais baixas do que para glucose. Em consequência, na presença de glucose a xilose não é consumida. Na ausência de glucose, o consumo de xilose e, consequentemente, a capacidade fermentativa são também reduzidos. É concebível que a expressão de transportadores com maior afinidade para xilose, nomeadamente os que transportam xilose por mecanismos de transporte activo do tipo simporte com protões, possibilite a produção mais eficiente de etanol. O dispêndio de energia para o transporte de xilose para dentro da célula poderá traduzir-se, em estirpes com simporte xilose/protão, num menor coeficiente de rendimento em biomassa, aumentando 5 concomitantemente a produtividade especifica para a produção de etanol.

Entre as leveduras capazes de crescer naturalmente em xilose, Candida intermédia PYCC 4715 destacou-se pela elevada taxa especifica de crescimento. Foi demonstrado que possuía dois sistemas de transporte para xilose, um do tipo difusão facilitada e outro do tipo simporte xilose/protão, apresentando o último uma afinidade mais elevada para xilose e sendo apenas produzido quando a concentração de xilose era relativamente baixa (Gárdonyi et al, "High capacity xylose transport in Candida intermédia PYCC 4715", FEMS Yeast Res 3: 45-52, 2003). Esta levedura foi considerada adequada para isolar o gene de um transportador activo para xilose (GXS1) a ser expresso em S. cerevisiae.

Apesar dos avanços já verificados, as leveduras recombinantes até agora desenvolvidas não demonstram eficiência suficiente na produção de etanol a partir de xilose. Há necessidade de melhorar o estado da técnica para fermentar materiais lenho-celulósicos e produzir bioetanol à escala industrial.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO O problema que a presente invenção pretende resolver corresponde, por conseguinte, à disponibilização de um processo para a produção de bioetanol a partir de materiais lenho-celulósicos mais eficiente e economicamente mais rentável. A solução deste problema baseia-se no facto dos presentes inventores terem identificado e isolado um gene que codifica um transportador activo de xilose/glucose de C. 6 intermédia com uma afinidade para a xilose surpreendentemente elevada em relação aos transportadores que ocorrem naturalmente em leveduras fermentativas por excelência. Quando inserido numa célula hospedeira, este gene torna-a potencialmente mais eficiente a consumir e fermentar a xilose presente na mistura de hexoses e pentoses resultante de matérias-primas de interesse industrial para a produção de bioetanol.

Assim, um primeiro aspecto da invenção refere-se a um fragmento de DNA isolado que codifica um transportador activo de xilose/glucose, caracterizado por compreender: a) uma sequência nucleotídica SEQ ID No. 1; ou b) uma sequência nucleotídica com um grau de homologia com o fragmento de +1138 a +1315 da SEQ ID No. 1 de pelo menos 80%, ou suas sequências complementares.

Num segundo aspecto, a invenção diz respeito a uma molécula de cDNA caracterizada por compreender: a) uma sequência nucleotídica SEQ ID No. 1; ou b) uma sequência nucleotídica com um grau de homologia com o fragmento de +1138 a +1315 da SEQ ID No. 1 de pelo menos 80%, ou suas sequências complementares.

Num terceiro aspecto, a invenção diz respeito a um plasmídeo caracterizado por compreender um fragmento de DNA de acordo com a reivindicação 1.

Num quarto aspecto, a invenção refere-se a uma célula hospedeira caracterizada por ser transformada com o 7 plasmídeo de acordo com a reivindicação 3, de forma a permitir que a célula hospedeira expresse o referido transportador activo de xilose/glucose.

Num último aspecto, a invenção diz respeito à utilização de uma célula hospedeira transformada na produção de etanol por meio da fermentação de xilose a partir de um meio compreendendo uma fonte xilose.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: Electroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (10% T) de 20 pg de proteína total de membranas plasmáticas e mitocondriais isoladas a partir de células de C. intermédia cultivadas em 0,5% xilose (X), 2% glucose (G) e 4% xilose (4X) . O gel foi corado com Azul de Coomassie. M - Marcador Sigma (Wide Range), p - membranas plasmáticas ; m - membranas mitocondriais.

Figura 2: Sequência de amino ácidos da região N-terminal da proteína Gxslp e primers degenerados desenhados a partir desta região.

Figura 3: Análise por Northern hlot da expressão do gene GXS1. O RNA total foi isolado a partir de culturas de C. intermédia PYCC 4715 em meio Verduyn contendo 0,5% xilose (X) , 2% glucose (G) ou 4% xilose (4X) como única fonte de carbono e energia. Cada amostra contém 10 pg de RNA total, separado num gel desnaturante de agarose 1,2% e transferido em seguida para uma membrana de nylon (Hybond-N) . Um fragmento de 300 pb, amplificado usando os primers CiGXSLl e CÍGXSR3, foi usado como sonda específica para o gene GXS1. Um fragmento de 172 pb do gene da actina foi amplificado usando os primers ActCiLl (5'- 8

AACAGAGAGAAGATGACCCAGA) e ActCiRl (5' - GCAAAGA GAAACCAGCGTAAA) e DNA genómico de C. intermédia PYCC 4715 como molde. As sondas foram marcadas com [oí-32P]-ATP (Amersham Biosciences) usando Prime-a-Gene Labelling System (Promega) . As hibridações e lavagens foram feitas tal como descrito por Griffioen et al (1996).

Figura 4: Sequência nucleotidica do gene GXS1 (SEQ ID No. 1), do primeiro (ATG) ao último codão (TAA). A sombreado encontra-se indicada a sequência +1138 a +1315.

Figura 5: Alcalinização extracelular desencadeada pela adição de xilose (X) ou glucose (G) a uma suspensão aquosa de células da estirpe MJY2 cultivadas em meio mineral com 2% (p/v) de glucose.

Figura 6: Representação de Eadie-Hofstee das velocidades iniciais de transporte de D-[14C] xilose (♦) em células da estirpe MJY2, obtidas a partir duma cultura em meio mineral com 2% (p/v) de glucose, e de D—[ 14C] glucose (□) em células da estirpe MJY5, cultivadas em meio mineral com 2% (p/v) de glucose e 0,05% de maltose.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, foi desenvolvido um processo para expressar em Saccharomyces cerevisiae um transportador activo de xilose. Este processo inclui a introdução de DNA heterólogo em leveduras que passam a integrar um gene para um novo sistema de transporte para xilose, do tipo simporte xilose/glucose-protão. 9

Um processo foi seguido para o isolamento, clonagem e expressão do gene a que se refere esta invenção. No entanto, processos alternativos podem ser usados pelos conhecedores da arte.

Identificação do transportador activo de xilose/glucose-H+ por SDS-PAGE 0 transportador activo de xilose/glucose de C. intermédia foi identificado por comparação da abundância relativa das proteínas presentes em membranas plasmáticas isoladas de células de C. intermédia cultivadas em condições de indução e de repressão. Com este objectivo, membranas plasmáticas e membranas mitocondriais foram isoladas de células cultivadas em meio Verduyn (Verduyn et al, 1992) contendo, alternativamente, 0,5% de xilose, 2% de glucose ou 4% de xilose como única fonte de carbono e energia. As células foram recolhidas na fase exponencial de crescimento (D064o =0,8-2,0) e lavadas duas vezes com água destilada gelada e uma vez com tampão A (0,1 M glicina, 0,3 M KC1, pH 7,0) . Dez a quinze gramas de células foram depois ressuspendidos em 15 ml de tampão A contendo 0,1 mM PMSF. 0 isolamento das membranas decorreu a partir deste passo tal como foi descrito por Van Leeuwen et al (1991). Com alíquotas (20 pg) das amostras obtidas foi feita uma electroforese em gel de poliacrilamida desnaturante na presença de tricina (Tricine SDS-PAGE; Schágger, 1994). As concentrações de acrilamida e bisacrilamida usadas no gel foram de 10%T e 3%C (%T=concentração total de acrilamida+bisacrilamida e %C=percentagem de bisacrilamida relativamente ao total). As amostras de membranas plasmáticas apresentaram um padrão de bandas claramente diferente do apresentado pelas amostras correspondentes de membranas mitocondriais (Figura 1), o que indica que ocorreu uma separação eficiente dos dois 10 tipos de membranas. Concluiu-se, consequentemente, que as diferenças observadas entre os padrões de bandas das amostras de membranas plasmáticas correspondentes às diferentes fontes de carbono não são consequência de contaminação por proteínas mitocondriais. A diferença mais notória entre as três amostras de membranas plasmáticas está indicada pela seta na Figura 1. Corresponde a uma proteína de cerca de 4 0 kDa de peso molecular que parece estar presente apenas em membranas plasmáticas de células cultivadas em 0,5% de xilose. Como o peso molecular desta proteína está na gama esperada para um transportador de açúcares, consíderou-se que a banda corresponderia, provavelmente, ao transportador activo de xilose/glucose caracterizado cineticamente em C. intermédia.

Clonagem do cDNA que codifica o transportador activo de xilose/glucose A proteína de membrana identificada como descrito foi isolada a partir dum gel preparativo carregado com 250 pg de proteína de membrana total de células de C. intermédia cultivadas em 0,5% de xilose. Após electroforese, as proteínas foram transferidas para uma membrana de PVDF {sequi-blot da BIO-RAD). A electroforese e a transferência foram feitas de acordo com as instruções do fabricante. A parte da membrana contendo a proteína de interesse foi excisada e utilizada para sequenciação da extremidade N-terminal da proteína (Protein Core Facílity, Columbia University, EUA) . A sequência de 15 amino ácidos obtida está indicada na Figura 2. A partir desta sequência foram desenhados primers degenerados (Figura 2). Estes primers foram usados para amplificar o cDNA através da técnica de 11 RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) a partir de RNA total de células cultivadas em 0,5% de xilose. Utilizou-se para este fim o First Choíce RLM-RACE kit (Ambion) , de acordo com as instruções do fabricante. O RNA foi extraído tal como descrito por Griffioen et al (1996) e depois purificado usando o RNA cleanup protocol (RNeasy kit, Quiagen) . Esta amostra de RNA foi usada como molde para o protocolo de 3' RACE, em combinação com os primers CiGXSLl (5'-GARGAYAAYMGIATGGTIAARMG-3') e CÍGXSL2 (5' -AARMGITTYGTIAAYGTNGG-3'; I =inosina, Y=C/T, R=A/G, M=A/C e N=A/ T/ G ou C) . Como o desenho dos primers se baseou na sequência dos primeiros amino ácidos da proteína, era de esperar que a reacção de 3' RACE produzisse o cDNA praticamente completo. De facto, obteve-se nesta reacção um produto de cerca de 1,7 kb que foi clonado no vector pMOSBlue (Amersham Biosciences) e parcialmente sequenciado usando um sequenciador automático ALF Express (Amersham Pharmacia Biotech) e primers marcados com Cy5 específicos para sequências do vector. A proteína codificada por esta molécula apresentava as propriedades características dum transportador de açúcar. Seguiu-se uma análise por Northern blot, que demonstrou que o respectivo mRNA era muito abundante em células cultivadas em 0,5% de xilose mas não era detectável em células cultivadas em 2% de glucose (Figura 3). A extremidade 5' do cDNA foi obtida através da técnica 5' RACE, usando o primer CÍGXSR3 (5’-CGTTAAGGAATGGAGCACAAAG-3 ’ ) . Os fragmentos obtidos foram clonados e sequenciados tal como descrito no parágrafo anterior, ficando demonstrado que codifica um amino ácido adicional (a metionina de iniciação) e uma sequência leader de 28 ou 31 amino ácidos, indicando que existem dois locais activos de 12 iniciação da trancrição. 0 novo gene foi designado GXSl (Glucose Xylose Symport 2). A respectiva sequência nucleotídica (SEQ ID No. 1) é apresentada na Figura 4.

Expressão funcional em S. cerevisiae

Para confirmar que o novo transportador codificado pelo gene GXSl era um transportador de glucose e xilose, foram construídos diversos plasmídeos que permitem a expressão do cDNA em S. cerevisiae. Um vector de elevado número de cópias (pMA91; Kingsman et al, 1990), contendo as regiões promotora e terminadora do gene PGK1, foi usado para clonar o cDNA de GXSl da seguinte forma: a região codificante completa do gene GXSl foi amplificada por PCR usando os primers GXS1P1 (5 ' -ATAGCAGATCTCATATGGGTTTGGAGGACAATAGAATG-3') e GXS1P2 (5' -ATAGCAGATCTTCTAGATTAAACAGAAGCTTCTTCAGAC-3' ) . Ambos os primers têm uma sequência de reconhecimento para Bgill na extremidade 5'e, adicionalmente, têm também sequências de reconhecimento para NdeI e XbaI. O plasmídeo pMA91 foi em seguida digerido com BglII e ligado com o fragmento contendo a região codificante de GXSl digerido com a mesma enzima, dando origem ao plasmídeo pPGK-GXSl.

Um gene quimérico diferente foi construído usando o promotor truncado do gene HXT7 e foi clonado nos vectores YEpLac 195 (multi-copy) e YCpLac 111 (single-copy) (Gietz et al, 1988). Um fragmento de DNA compreendendo os nucleótidos -392 a -1 do promotor de HXT7 foi amplificado por PCR usando os primers HXT7proml (5'-AACCTGCAGCTCGTAGGAACAATTTCGG-3') e HXT7prom2 (5'-GGACGGGACATATGCTGATTAAAATTAAAAAAACTT-3') e o plasmídeo YEpkHXT7 (Krampe et al, 1998) como molde. 0 fragmento foi em seguida digerido com PstI e NdeI, uma vez que os primers contêm locais de reconhecimento para estas enzimas, tendo sido depois ligado com o plasmídeo YEpLac 195 digerido com 13

PstI and Xbal, dando origem ao plasmídeo pHGXSl. Em seguida, um fragmento de 0,3 kb contendo a região terminadora do gene PGK foi amplificada usando os primers PGKlterml (5'-ACCGTGTCTAGATAAATTGAATTGAATTGAAATCGATAG-3') e PGKlterm2 (5'-TAATTAGAGCTCTCGAAAGCTTTAACGAACGCAGAA-3') e o plasmídeo pMA91 como molde. Os primers têm nas extremidades 5' locais de reconhecimento para as enzimas Xbal e Saci, respectivamente. O fragmento contendo a região terminadora do gene PGK foi em seguida digerido com estas enzimas e ligado entre os locais Xbal e Saci do plasmídeo pHGXSl, dando origem ao plasmídeo pHXT7-GXSl.

Finalmente, o plasmídeo pHXT7-GXSl foi digerido com PstI e Saci gerando um fragmento contendo o gene quimérico completo, que foi em seguida inserido no vector YCplac 111 (Gietz et al, 1988) digerido com as mesmas enzimas, dando origem ao plasmídeo pHXT7-GXSls.

Os três plasmídeos foram em seguida usados para transformar S. cerevisiae TMB 3201 (MATa Ahxtl-17 Agal2 Astll Aagtl A mph2 Amph3 leu2-3,112 ura3-52 trpl-289 his3~A 1: : YIpXR/XDH/XK MAL2-8c SUC2; Hamacher et al, 2002). Esta estirpe não é capaz de utilizar glucose ou xilose como fonte de carbono e energia por não expressar qualquer sistema de transporte para estes açúcares. As transformações deram origem às estirpes MJY2-4: MJY2 (TMB 3201 + pHXT7-GXSl), MJY3 (TMB 3201 + pPGK-GXSl) e MJY4 (TMB 3201 + pHXT7-GXSl-s). A incapacidade de crescer em glucose ou xilose foi ultrapassada por complementação em ambas as estirpes que contêm plasmídeos de elevado número de cópias (MJY2 e MJY3), mas o crescimento em xilose como única fonte de 14 carbono e energia foi muito fraco e apenas em meio de cultura sólido. A estirpe MJY 4, contendo um plasmideo de baixo número de cópias, apresenta crescimento muito fraco em glucose e ausência de crescimento em xilose, o que sugere que a ocorrência de complementação é dependente duma expressão mais forte do gene do que a que é possível obter com este plasmideo.

Utilizou-se a estirpe MJY2 para investigar a presença de transporte activo de xilose e glucose. A adição de D-glucose ou D-xilose (concentração final de 6,7 mM) a uma suspensão aquosa de células (cerca de 30 mg peso seco/ml) da estirpe MJY2, cultivada em meio YNB (Yeast Nitrogen Base) suplementado com 2%(p/v) de glucose, leucina e triptofano, desencadeia um aumento do pH extracelular em ambos os casos, indicando que existe um influxo de protões associado ao transporte e, portanto, está em funcionamento um sistema de transporte activo que co-transporta açúcar e H+ (Figura 4). Este ensaio demonstra que o gene GXS1 codifica um transportador com um mecanismo de transporte activo, que aceita como substrato tanto glucose como xilose.

Cinética do transporte de açúcares por Gxslp

As constantes cinéticas do transporte mediado por Gxslp foram determinadas na estirpe MJY2, expressando apenas o sistema de transporte activo. No entanto, apesar da sua elevada afinidade, a capacidade deste transportador não permite velocidades de transporte comparáveis ao sistema de difusão facilitada. Assim, para dar maior significado aos valores a obter nos ensaios de cinética com 14C-D-glucose (Spencer-Martins et al, 1985), substrato para o qual as afinidades dos dois tipos de transporte diferem apenas duma 15 ordem de grandeza (difusão facilitada: Km = 2-4 mM; simporte: Km = 0,2 mM; 25°C, pH 5) e não de duas como para a xilose (difusão facilitada: Km = 49 mM; simporte: Km = 0,4 mM; 25°C, pH 5), utilizou-se para este efeito a estirpe MJY5 que expressa os dois tipos de transporte presentes em C. intermédia. Pode observar-se na Figura 5 uma clara cinética bifásica para a glucose, indicativa da presença simultânea dum sistema de transporte do tipo difusão facilitada e do agora identificado e clonado transportador activo do tipo simporte xilose/glucose-H+, com elevada afinidade relativa. Os parâmetros cinéticos determinados nestas condições em S. cerevísiae foram semelhantes aos obtidos em C. intermédia, origem do gene GXS1.

Homologia com outros transportadores A caracterização de GXS1 permitiu descobrir uma família de proteínas com alguma homologia com Gxslp e que estão presentes noutras leveduras (Debaryomyces hanseníi, Yarrowia lipolytica e Candida albicans, números de acesso no GenBank: CAG86664, EAL01541 e CAG81819, respectivamente). Para nenhuma destas proteínas existe registo de estudo funcional (estão registadas nas bases de dados como possíveis transportadores de açúcares).

Lisboa, 18 NOV. 2005

Claims (7)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um fragmento de DNA isolado que codifica um transportador activo de xilose/glucose, caracterizado por compreender: a) uma sequência nucleotidica SEQ ID No. 1; ou b) uma sequência nucleotidica com um grau de homologia com o fragmento de +1138 a +1315 da SEQ ID No. 1 de pelo menos 80%, ou suas sequências complementares.

2. Uma molécula de cDNA caracterizada por compreender: a) uma sequência nucleotidica SEQ ID No. 1; ou a) uma sequência nucleotidica com um grau de homologia com o fragmento de +1138 a +1315 da SEQ ID No. 1 de pelo menos 80%, ou suas sequências complementares.

3. Um plasmideo caracterizado por compreender um fragmento de DNA de acordo com a reivindicação 1.

4. Uma célula hospedeira caracterizada por ser transformada com o plasmideo de acordo com a reivindicação 3, de forma a permitir que a célula hospedeira expresse o referido transportador activo de xilose/glucose.

5. A célula hospedeira de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por ser uma levedura.

6. A célula hospedeira de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por a levedura ser Saccharomyces cerevisiae. 2

7. Utilização de uma célula hospedeira transformada de acordo com a reivindicação 4 a 6, caracterizada por permitir a produção de etanol por meio da fermentação de xilose a partir de um meio compreendendo uma fonte de xilose. Lisboa, i g kov. 2005