TWI548648B - 於網黏菌門微生物中生產蛋白質之技術 - Google Patents

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Description

於網黏菌門微生物中生產蛋白質之技術 發明領域
本發明係關於網黏菌門(Labyrinthulomycota)之重組細胞及微生物及其用於異源蛋白質製造之用途。本發明也涵蓋自重組宿主細胞及微生物有效製造及選擇性地分泌多肽用的新穎啟動子、終結子、及信號序列。
發明背景
生物技術及分子生物學的進展已經允許於微生物、植物及動物細胞中製造蛋白質，其中多種蛋白質先前只可自人及其它動物的組織、血液或尿液萃取得。今日市面上可得之生物製劑典型係於哺乳動物細胞諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞製造，或於微生物細胞諸如酵母或大腸桿菌(E.coli)細胞系製造。
透過微生物發酵來製造蛋白質具有優於既有系統諸如，植物及動物細胞培養的若干優勢。舉例言之，基於微生物發酵法可提供：(i)快速製造高濃度蛋白質；(ii)可使用無菌且經良好控制之製造條件(諸如優良製造規範(GMP)條件)；(iii)可使用簡單的化學上經界定的生長培養 基，允許更單純發酵及較少雜質；(iv)不存在有污染之人或動物病原；及(v)容易回收蛋白質(例如透過自發酵培養基單離而回收)。此外，發酵設施的建造典型比細胞培養設施的建造成本低。
美國公告案第2003/0166207號(現為美國專利案 第7,001,772號)首次揭示適合用於轉形破囊壺菌(thraustochytrids)包括裂殖壺菌屬(裂殖壼菌屬)之成員之重組構成體。本公告案也揭示裂殖壺菌屬的乙醯乳酸合成酶、乙醯乳酸合成酶啟動子及終結子區、α-微管素(tubulin)啟動子、得自聚縮酮合成酶(PKS)系統之啟動子、及脂肪酸去飽和酶啟動子之核酸序列及胺基酸序列。美國專利公告案第2006/0270275904及2006/0286650號，全文皆係以引用方式併入此處，隨後揭示裂殖壺菌屬的肌動蛋白(actin)、延長因子1α(ef1α)、及甘油醛3-磷酸去氫酶(gadph)啟動子及終結子之序列。
持續需要識別於破囊壺菌微生物表現蛋白質之 額外調節控制元體，包括於不同時間點或於某些生長條件下或回應於化學刺激或環境刺激有不同表現之調節控制元體。也需要識別可有效指導自網黏菌門及破囊壺菌目(Thraustochytriales)，諸如裂殖壺菌屬及其它破囊壺菌之微生物分泌蛋白質之分泌信號序列。
發明概要
本發明係針對包含SEQ ID NO：3多核苷酸序列之 一已單離之核酸分子。
本發明也係針對包含SEQ ID NO：4多核苷酸序列 之一已單離之核酸分子。
本發明也係針對包含編碼多肽之多核苷酸序列 之一已單離之核酸分子，其中該多肽包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列。於若干實施例中，該多核苷酸序列包含SEQ ID NO：2。
本發明也係針對包含編碼多肽之多核苷酸序列 之一已單離之核酸分子，其中該多肽包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列。於若干實施例中，該多核苷酸序列包含SEQ ID NO：38。
本發明亦係針對包含SEQ ID NO：42之多核苷酸 序列之一已單離之核酸分子。於若干實施例中，該多核苷酸序列包含SEQ ID NO：43。
本發明亦係針對包含SEQ ID NO：44之多核苷酸 序列之一已單離之核酸分子。於若干實施例中，該多核苷酸序列包含SEQ ID NO：45之多核苷酸序列。
本發明亦係針對一種包含SEQ ID NO：46之多核 苷酸序列之已單離之核酸分子。
本發明亦係針對一種包含與前述任一種多核苷 酸序列完全互補之多核苷酸序列之已單離之核酸分子。
本發明亦係針對包含前述任一種已單離之核酸 分子之重組核酸分子。於若干實施例中，該重組核酸分子為載體。
於若干實施例中，該已單離之核酸分子係工作式 地鏈接至編碼蛋白質之多核苷酸序列。於若干實施例中，該蛋白質係工作式地鏈接至分泌信號。
本發明亦係針對包含前述任一種已單離之核酸 分子或重組核酸分子或其組合之宿主細胞。於若干實施例中，該宿主細胞為破囊壺菌目之一成員。於若干實施例中，該宿主細胞為裂殖壺菌屬或破囊壺菌屬(Thraustochytrium)。
本發明亦係針對一種用於製造蛋白質之方法，包 含於培養基中培養破囊壺菌目重組微生物，其中該重組微生物包含前述已單離之核酸分子中之任一種工作式地鏈接編碼該蛋白質之多核苷酸序列來製造該蛋白質。於若干實施例中，該蛋白質係自已單離之破囊壺菌目生質回收。於若干實施例中，該蛋白質係蓄積於微生物體內部。於若干實施例中，該蛋白質係蓄積於微生物之膜內。於若干實施例中，該蛋白質係自培養基中回收。於若干實施例中，該蛋白質係分泌出。
本發明亦係針對包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列 之一已單離之多肽。
本發明亦係針對包含SEQ ID NO：15之胺基酸序 列之一已單離之多肽。
第1圖顯示裂殖壺菌屬Na/Pi-IIIb2轉運子蛋白質信號肽胺基酸序列(SEQ ID NO：1)。
第2圖顯示編碼SEQ ID NO：1之信號肽之多核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。
第3圖顯示裂殖壺菌屬PUFA PKS OrfC啟動子區之多核苷酸序列(SEQ ID NO：3)。
第4圖顯示裂殖壺菌屬PUFA PKS OrfC終結子元件-1之多核苷酸序列(SEQ ID NO：4)。
第5圖顯示pSchizE之質體拼圖。
第6圖顯示pSchiz-sG之質體拼圖，也稱作為pCO0001。
第7圖顯示pSchiz-sGr之質體拼圖。
第8圖顯示pSchiz-cG之質體拼圖。
第9圖顯示於裂殖壺菌屬細胞之胞質及內質網(ER)的eGFP表現。第9A、9C及9E圖為螢光顯微相片。第9B、9D及9F圖為光學顯微相片。第9A及9B圖顯示以pSchiz-sGr轉形之細胞的相同視野。第9C及9D圖顯示以pSchiz-cG轉形之細胞的相同視野。第9E及9F圖顯示以pSchiz-E轉形之細胞的相同視野。
第10A圖顯示於經以pSchiz-sGr轉形之裂殖壺菌屬細胞中經ER靶定之eGFP及核酸專一性染色4’,6-二脒-2-苯基吲哚(DAPI)之複合螢光定位。第10B及10C圖分別顯示用於製造複合顯微相片之eGFP-ER染色及DAPI-核染色。第10D圖顯示相同視野之光學顯微相片。如第10A圖指示，ER膜包住細胞之各個核，各細胞含有多個核。指示一個細胞中一個核之相關特徵。
第11圖顯示得自四個裂殖壺菌屬轉形體純株之 不含細胞之上清液及不含細胞之萃取樣本之西方墨點及相對應之經庫馬西(Coomassie)-染色之SDS-PAGE凝膠。「sup」及「cyto」分別係指不含細胞之上清液及不含細胞之萃取物。「sG」係指得自以pSchiz-sG轉形細胞之樣本。「sGr」係指得自以pSchiz-sGr轉形細胞之樣本。「cG」係指得自以pSchiz-cG轉形細胞之樣本。「vec(-)」係指得自以pSchiz-E10轉形細胞之樣本。「GFP(+)」係指已純化之重組GFP標準品(克隆泰公司(Clontech)，加州山景市)。凝膠載荷以3微克不含細胞之上清液蛋白質及1微克不含細胞之萃取物蛋白質樣本。於各對樣本亦即重組GFP標準品與分子量標記間發現有一空白線道。
第12圖顯示裂殖壺菌屬Sec1蛋白質轉運子蛋白 質之首30個胺基酸。胺基酸1至20組成信號肽序列(SEQ ID NO：37)。
第13圖顯示編碼SEQ ID NO：37之信號肽之多核 苷酸序列(SEQ ID NO：38)。
第14圖顯示pSchiz-Cpt-sleGFP之質體拼圖，也稱 作為pCL0001。
第15A圖顯示已分泌之eGFP蛋白質之西方墨 點，及第15B圖顯示得自於不同發酵條件(例如「B26」、「B27」或「B28」發酵條件，如第15圖定義)下生長的三個裂殖壺菌屬培養之相對應經庫馬西染色之SDS-PAGE凝膠。線道1-19載荷指示量之蛋白質。LH=發酵時間，單位 為小時。第15A圖之線道20載荷10奈克，及第15B圖之線道20載荷0.5奈克已純化之重組GFP標準品；得自裂殖壺菌屬之eGFP帶由於含有聯結子序列故該帶係略大於對照帶。
第16圖顯示pSchiz-Cpt-slkappabh之質體拼圖。
第17圖顯示藉裂殖壺菌屬分泌κ抗體亞單位之西方墨點。L=不含細胞之萃取物；S=不含細胞之上清液。
第18A圖顯示表現κ抗體亞單位之西方墨點。獲得培養上清液樣本之培養時間係指示於第18圖頂。「wt」係指「野生型」(亦即未經轉形之)裂殖壺菌屬。「+cptS1kappa」係指以含有編碼人κ抗體片段之密碼子最佳化基因、ORFC啟動子及終結子、及編碼Sec1信號肽之序列之載體轉形之裂殖壺菌屬。第18B圖顯示於以cptS1kappa轉形之裂殖壺菌屬培養上清液中總蛋白質(根據布萊佛(Bradford)檢定分析)及抗體κ鏈(透過ELISA檢定分析)之蓄積。
第19圖顯示裂殖壺菌屬EF1短啟動子多核苷酸序列(SEQ ID NO：42)。
第20圖顯示裂殖壺菌屬EF1長啟動子多核苷酸序列(SEQ ID NO：43)。
第21圖顯示裂殖壺菌屬60S短啟動子多核苷酸序列(SEQ ID NO：44)。
第22圖顯示裂殖壺菌屬60S長啟動子多核苷酸序列(SEQ ID NO：45)。
第23圖顯示裂殖壺菌屬Sec1啟動子多核苷酸序列(SEQ ID NO：46)。
第24圖顯示pAB0011之質體拼圖。
第25圖顯示pAB0018之質體拼圖。
第26圖顯示pAB0022之質體拼圖。
第27圖顯示取自於以含有藉EF1啟動子(短版 本)、EF1啟動子(長版本)、60S啟動子(短版本)、60S啟動子(長版本)、SEC1啟動子、及OrfC啟動子分別驅動之eGFP基因的表現載體轉形之裂殖壺菌屬培養之不含細胞上清液樣本中之eGFP之西方墨點。
第28圖顯示與藉OrfC啟動子(pCL0001-4)或 EF1-L啟動子(AB0018-9及-10)驅動eGFP表現相關聯之轉形株細胞系之螢光顯微術。
第29圖顯示藉全甲基化N-聚糖之NSI-全MS分析 測得之於天然裂殖壺菌屬所分泌之蛋白質上檢測得之N-聚糖結構。
第30圖顯示藉全甲基化N-聚糖之NSI-全離子映 射測得之於天然裂殖壺菌屬所分泌之蛋白質上檢測得之N-聚糖結構。
第31圖顯示pSchiz-EPCT(+)-s1Suc2_CL0076之 質體拼圖也定名為pCL0076。
第32圖顯示得自於蔗糖-SSFM上生長之以 pCL0076轉形之裂殖壺菌種屬ATCC 20888培養之細胞丸粒之乾重(克/升)。轉形株稱作為1-1、1-3、1-24、3-1、3-2、3-5、3-21、4-1、4-24、及4-31。「對照組」係指於葡萄糖-SSFM上生長之野生型裂殖壺菌種屬ATCC 20888細胞。
第33圖顯示得自於蔗糖-SSFM上生長之以pCL0076轉形之裂殖壺菌種屬ATCC 20888培養之細胞丸粒之脂肪含量(以乾細菌量之重量百分比表示)。轉形株稱作為1-1、1-3、1-24、3-1、3-2、3-5、3-21、4-1、4-24、及4-31。「對照組」係指於葡萄糖-SSFM上生長之野生型裂殖壺菌種屬ATCC 20888細胞。
第34圖顯示得自於蔗糖-SSFM上生長之以pCL0076轉形之裂殖壺菌種屬ATCC 20888培養之細胞丸粒隨時間之經過測量得之乾重(克/升)。轉形株稱作為1-3及3-5。「對照組」係指於葡萄糖-SSFM上生長之野生型裂殖壺菌種屬ATCC 20888細胞。
第35圖顯示得自於蔗糖-SSFM上生長之二轉形株培養之細胞丸粒之脂肪含量(以乾細菌量之重量百分比表示)。轉形株稱作為1-3及3-5。「對照組」係指於葡萄糖-SSFM上生長之野生型裂殖壺菌種屬ATCC 20888細胞。
第36圖顯示得自以pCL0076轉形且於蔗糖-SSFM中生長2日或7日後收穫之裂殖壺菌屬株系B76-32培養之細胞丸粒之乾重(克/升)。「2118*」係指於葡萄糖-SSFM上生長之野生型裂殖壺菌種屬ATCC 20888細胞之次單離株。「B76-32**」係指於葡萄糖-SSFM上生長之B76-32親代株系。
第37圖顯示得自以pCL0076轉形且於蔗糖-SSFM中生長2日或7日後收穫之裂殖壺菌屬株系B76-32培養之細胞丸粒之脂肪含量。各樣本之最右欄顯示脂肪含量，以乾生質之重量百分比表示。各樣本之最左欄顯示由含18個或 更少個碳(淺灰)或20個或更多個碳(中灰)之醯基所組成之總脂肪百分比。「2118*」係指於葡萄糖-SSFM上生長之野生型裂殖壺菌種屬ATCC 20888細胞之次單離株。「B76-32**」係指於葡萄糖-SSFM上生長之B76-32親代株系。
第38A圖顯示反錄酶蛋白質之西方墨點及第38B圖顯示相對應之經庫馬西染色之SDS-PAGE凝膠。如西方墨點頂端指示，釀酒酵母(S.cerevisiae)反錄對照組及pCL0076轉形株1-3之3日培養之不含細胞的上清液分別係以5微克、2.5微克、1.25微克及0.625微克之數量載荷。
第39A圖顯示藉反應速率呈蔗糖濃度之函數示例顯示之反錄酶活性檢定分析。第39B圖顯示用於計算Km及Vmax之標準蘭威佛-伯克(Lineweaver-Burk)作圖。
第40A圖顯示藉全甲基化N-聚糖之NSI總離子映射測得於經裂殖壺菌屬分泌之蛋白質上檢測得之N-聚糖結構式。
第40B圖顯示經由全甲基化N-聚糖之NSI-總離子映射所得之聚糖種類列表。
第41A圖及第41B圖顯示基於使用信號P演繹法則預測得裂殖壺菌屬之天然信號序列。例如參考Bendsten等人，J,Mol.Biol.340：783-795(2004)；Nielsen及Krogh，Proc.Int.Conf.Intell.Syst.Mol.Biol.6：122-130(1998)；Nielsen等人，蛋白質基因改造12：3-9(1999)；Emanuelsson等人，自然方案2：953-971(2007)。
第42圖顯示裂殖壺菌屬之密碼子使用表。
第43圖顯示pCL0120之質體拼圖。
第44圖顯示編碼得自裂殖壺菌屬Sec1信號肽融合至得自黑麴菌(Aspergillus niger)之成熟Suc1反錄酶(基因存庫存取號碼S33920)之密碼子最佳化核酸序列(SEQ ID NO：75)。
第45圖顯示pCL0137_EPCT(+)-s1Suc1之質體拼圖，也定名為pCL0137。
較佳實施例之詳細說明
網黏菌門之成員諸如裂殖壺菌屬、破囊壺菌屬、及其它破囊壺菌類為可透過習知分泌徑路處理多肽的真核生物。瞭解此等微生物比較CHO細胞也產生較少數大量分泌的蛋白質，結果獲得使用裂殖壺菌屬優於CHO細胞之優點。此外，不似大腸桿菌，網黏菌門之成員諸如裂殖壺菌屬進行蛋白質糖化諸如N-鏈接的糖化作用，此乃某些蛋白質之生物活性所需。已經判定破囊壺菌諸如裂殖壺菌屬所具有之N-鏈接的糖化作用比較酵母糖化作用更加類似哺乳動物的糖化樣式。
重組蛋白質的有效製造也包括：(i)轉形經選定之宿主細胞之方法，(ii)用於選擇轉形株之選擇標記，及(iii)包含調節元體其可於特定宿主細胞發揮功能之表現卡匣。此種調節元體包括對於控制多核苷酸序列的表現上相當重要的啟動子及終結子序列。根據本發明，調節元體、調節 控制元體及調節序列等術語可互換使用，及包括但非限於屬於啟動子、增強子、轉錄終結子、信號序列、核糖體結合位置、阻遏物結合位置、莖-環、及內含子剪接位置之序列及/或分子。若期望蛋白質分泌入培養基，則也可利用指導蛋白質分泌之信號肽(也稱作為信號序列、分泌信號肽、或先導子序列)。
宿主細胞
本發明係針對屬於網黏菌門微生物之宿主細胞內蛋白質的製造。於若干實施例中，該網黏菌門宿主細胞係用作為蛋白質製造的生物工廠。
於若干實施例中，該網黏菌門重組宿主細胞為破囊壺菌類諸如裂殖壺菌屬或破囊壺菌屬。根據本發明，「破囊壺菌類」係指破囊壺菌目(Thraustochytriales)中之任何成員，其包括破囊壺菌科(Thraustochytriaceae)；而「網黏菌類」係指網黏菌目(Labyrinthulales)中之任何成員其包括網黏菌科(Labyrinthulaceae)。網黏菌科之成員先前被視為破囊壺菌目之成員，但更為晚近修正此等有機體之分類學類別，網黏菌科今日被視為網黏菌目之成員。網黏菌目及破囊壺菌目屬於網黏菌門之成員。分類學理論學家今日將此兩類微生物置於金黃藻菌鞭毛菌(Stramenopile)世系的藻菌或藻菌類原生生物。破囊壺菌類及網黏菌類之目前分類學位置摘述如下：界：金黃藻菌鞭毛菌界(Stramenopila)(藻菌界(Chromista))
門：網黏菌門(Labyrinthulomycota)(鞭毛菌門 (Heterokonta))
綱：網黏菌綱(Labyrinthulomycetes(Labyrinthulae))
目：網黏菌目(Labyrinthulales)
科：網黏菌科(Labyrinthulaceae)
目：破囊壺菌目(Thraustochytriales)
科：破囊壺菌科(Thraustochytriaceae)
用於本發明之目的，描述為破囊壺菌類之株系包括下列有機體：目：破囊壺菌目；科：破囊壺菌科；屬：破囊壺菌屬(Thraustochytrium)(種：種屬(sp.)、無基本(arudimentale)、金黃(aureum)、班西氏(benthicola)、球狀(globosum)、肯尼(kinnei)、運動(motivum)、多基本(multirudimentale)、巴奇氏(pachydermum)、增生(proliferum)、玫瑰(roseum)、紋狀(striatum))、吾肯氏壺菌屬(Ulkenia)(種：種屬、阿米巴(amoeboidea)、克氏(kerguelensis)、微小(minuta)、深海(profunda)、星狀(radiata)、塞氏(sailens)、沙氏(sarkariana)、裂殖(schizochytrops)、威瑟氏(visurgensis)、約肯氏(yorkensis))、裂殖壺菌屬(種：種屬、凝聚(aggregatum)、利馬(limnaceum)、蒙氏(mangrovei)、微小(minuta)、八孢節(octosporum))、日本壺菌屬(Japonochytrium)(種：種屬、海洋(marinum))、亞普蘭壺菌屬(Aplanochytrium)(種：種屬、哈里提迪(haliotidis)、克古蘭喜(Kerguelensis)、深海(profunda)、史托奇諾(stocchinoi))、亞松壺菌屬(Althornia)(種：種屬、克魯奇(crouchii))、或伊利那壺菌屬 (Elina)(種：種屬、馬里沙巴(marisalba)、希諾里菲卡(sinorifica))。用於本發明之目的，吾肯氏壺菌屬所述之種可視為屬於破囊壺菌屬之成員。奧蘭氏壺菌屬(Aurantiacochytrium)及橢孢節壺菌屬(Oblogospora)屬於本發明中網黏菌門所涵蓋之額外二菌屬。
本發明中描述為網黏菌之株係包括下列有機 體：目：網黏菌目，科：網黏菌科，屬：網黏菌屬(種：種屬、藻(algeriensis)、多核(coenocystis)、查妥奈(chattonii)、巨藻(macrocystis)、大西洋巨藻(macrocystis atlantica)、巨藻巨藻(macrocystis macrocystis)、海洋(marina)、微小(minuta)、羅可芬喜(roscoffensis)、沃卡諾威(valkanovii)、蛋黃(vitellina)、太平洋蛋黃(vitellina pacifica)、蛋黃蛋黃(vitellina vitellina)、左普菲(zopfii))、擬網黏菌屬(Labyrinthuloides)(種：種屬、哈里提迪(haliotidis)、約肯氏(yorkensis))、黏液網黏菌屬(Labyrinthomyxa)(種：種屬、海洋(marina))、二孢網黏菌屬(Diplophrys)(種：種屬、亞奇瑞(archeri))、紅網黏菌屬(pyrrhosorus)(種：種屬、海洋(marinus))、獨二孢網黏菌屬(Sorodiplophrys)(種：種屬、斯德科銳(sterocorea))或單胞網黏菌屬(Chlamydomyxa)(種：種屬、擬網黏菌(labyrinthuloides)、蒙大拿(montana))(但目前對於紅網黏菌屬、獨二孢網黏菌屬、或單胞網黏菌屬的確切分類學定位仍有爭議)。
網黏菌門之宿主細胞包括但非限於寄存株系 PTA-10212、PTA10213、PTA-10214、PTA-10215、 PTA-9695、PTA-9696、PTA-9697、PTA-9698、PTA-10208、PTA-10209、PTA-10210、PTA-10211、寄存為SAM2179之微生物(由寄存者命名為「吾肯氏壺菌屬SAM2179」)、任何破囊壺菌種屬(包括前者吾肯氏壺菌種屬諸如威瑟氏吾肯氏壺菌、阿米巴吾肯氏壺菌、沙氏吾肯氏壺菌、深海吾肯氏壺菌、星狀吾肯氏壺菌、微小吾肯氏壺菌及吾肯氏壺菌種屬BP-5601)，及包括紋狀破囊壺菌、金黃破囊壺菌、玫瑰破囊壺菌；及任何日本壺菌種屬。破囊壺菌目之株系包括但非限於破囊壺菌種屬(23B)(ATCC20891)；紋狀破囊壺菌(Schneider)(ATCC 24473)；金黃破囊壺菌(高斯坦(Goldstein))(ATCC 34304)；玫瑰破囊壺菌(高斯坦)(ATCC 28210)及日本破囊壺菌種屬(L1)(ATCC 28207)。裂殖壺菌屬包括但非限於凝聚裂殖壺菌、利馬裂殖壺菌、裂殖壺菌種屬(S31)(ATCC 20888)、裂殖壺菌種屬(S8)(ATCC 20889)、裂殖壺菌種屬(LC-RM)(ATCC 18915)、裂殖壺菌種屬(S21)、已寄存株系ATCC 28209及已寄存利馬裂殖壺菌株系IFO 32693。於若干實施例中，宿主細胞為裂殖壺菌屬或破囊壺菌。裂殖壺菌屬可藉連續二分法及經由形成孢子囊二者而複製，最終釋放出遊動孢子。但破囊壺菌屬只經由形成孢子囊複製，然後釋放出游動孢子。於若干實施例中，本發明之宿主細胞為重組宿主細胞。
本發明之宿主細胞之有效培養條件包括但非限 於允許蛋白質製造及/或重組之有效培養基、生物反應器、溫度、pH及氧氣條件。有效培養基係指破囊壺菌目細胞例 如裂殖壺菌屬宿主細胞典型培養於其中之任一種培養基。 此等培養基典型包含具有可同化碳源、氮源、及磷酸來源，以及適當鹽類、礦物質、金屬、及其它營養素諸如維生素之水性培養基。適當培養基及培養條件之非限制性實例係揭示於實例章節。適合用於破囊壺菌目微生物之非限制性培養條件也說明於美國專利案第5,340,742號，全文以引用方式併入此處。本發明之細胞可於習知發酵生物反應器、振搖瓶、試管、微力價皿、及培養平板中培養。培養可於適合用於重組細胞之溫度、pH、及氧含量進行。於若干實施例中，本發明之網黏菌門宿主細胞含有包含編碼一選擇標記之核酸序列的重組載體。於若干實施例中，該選擇標記允許選擇已轉形之微生物。顯性選擇標記之實例包括可分解具抗生素活性或殺黴菌活性化合物之酶諸如得自印度鏈異壁菌(Steptoalloteichus hindustanus)之Sh ble基因，其編碼由SEQ ID NO：5表示之「薄萊黴素(bleomycin)-結合蛋白質」。於若干實施例中，編碼顯性選擇標記之核酸序列包含破囊壺菌乙醯乳酸酯合成序列諸如SEQ ID NO：6之多核苷酸序列之突變版本。於若干實施例中，該乙醯乳酸酯合成酶已經經過改性、突變、或以其它方式選擇來對於由磺醯脲化合物、咪唑啶酮類抑制劑、及/或嘧啶基酮苯甲酸酯之抑制作用具有抗性。於若干實施例中，該乙醯乳酸酯合成酶為天然乙醯乳酸酯合成酶之同系物。於若干實施例中，已經以包含該乙醯乳酸酯合成酶之重組載體轉染之破囊壺菌微生物對磺醯脲化合物、咪唑啶酮類抑制劑、及/或嘧啶 基酮苯甲酸酯之敏感度減低。於若干實施例中，該重組載體包含編碼乙醯乳酸酯合成酶蛋白質之核酸序列，其包含之胺基酸序列與SEQ ID NO：7之差異為於下列位置中之一者或多者：116G、117A、192P、200A、251K、358M、383D、592V、595W、或599F的一個胺基酸刪失、插入、或取代。 於若干實施例中，已突變之乙醯乳酸酯合成酶蛋白質具有選自於下列所組成之組群之胺基酸序列：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、及SEQ ID NO：10。於若干實施例中，該重組載體包含與SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、或SEQ ID NO：10至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列，其中該多核苷酸序列編碼至少於破囊壺菌作為顯性選擇標記之功能之胺基酸序列。於若干實施例中，該重組載體包含編碼SEQ ID NO：7之一功能片段之多核苷酸序列，其至少於破囊壺菌係作為顯性選擇標記。於若干實施例中，該重組載體包含選自於由下列所組成之組群：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、及SEQ ID NO：13中之多核苷酸序列。
根據本發明，「轉形」一詞用來指外生核酸分子 (亦即重組核酸分子)可藉此插入微生物細胞之任一種方法。於微生物系統中，「轉形」一詞係用來描述該微生物因獲得外生性核酸所繼承的變化，且大致上與「轉染」一詞為同義詞。用於將外生核酸分子導入網黏菌門宿主細胞之適當轉形技術包括但非限於粒子撞擊、電穿孔、顯微注射、 脂質體轉染、吸附、感染、及原生質體融合。於若干實施例中，包括重組載體之外生核酸分子導入於靜止期之微生物細胞。於若干實施例中，包括重組載體之外生核酸分子導入於對數生長期之微生物細胞。於若干實施例中，包括重組載體之外生核酸分子導入於600奈米達1.5至2之光密度的細胞。
本發明亦係針對一種轉形宿主細胞之方法包 含：(a)以具有蛋白酶活性之酶前處理該宿主細胞，及(b)藉電穿孔將核酸分子導入該宿主細胞。於若干實施例中，該宿主細胞係於酶前處理後而於電穿孔前以比較未經酶前處理更高效率轉形。該酶包括但非限於與蝸牛丙酮(snail acetone)粉末、蛋白酶IX、蛋白酶XIV、硫酸酶、β-葡萄糖醛酸酶、及其組合相關聯之酶活性。於若干實施例中，該宿主細胞係以約0.05毫克/毫升，約0.1毫克/毫升，約0.15毫克/毫升，約0.2毫克/毫升，約0.25毫克/毫升，約0.3毫克/毫升，約0.4毫克/毫升，約0.5毫克/毫升，約0.6毫克/毫升，0.7毫克/毫升，0.8毫克/毫升，0.9毫克/毫升，或約1毫克/毫升蝸牛丙酮粉末、蛋白酶IX、蛋白酶XIV、或其組合前處理。於若干實施例中，該宿主細胞係以約0.05毫克/毫升至約1毫克/毫升、約0.1毫克/毫升至約1毫克/毫升、約0.1毫克/毫升至約0.5毫克/毫升、或約0.05毫克/毫升至約0.5毫克/毫升蝸牛丙酮粉末、蛋白酶IX、蛋白酶XIV、或其組合處理。於若干實施例中，該宿主細胞係以0.05X、0.1X、0.2X、0.3X、0.4X、0.5X、0.6X、0.7X、0.8X、0.9X、或1X硫酸 酶、β-葡萄糖醛酸酶或其組合處理。於若干實施例中，該宿主細胞係以約0.05X至約1X、約0.1X至約1X、約0.1X至約0.5X、或約0.05X至約0.5X硫酸酶、β-葡萄糖醛酸酶或其組合處理。於若干實施例中，蛋白酶前處理包含使用於前述濃度中之任一者之蛋白酶IX、蛋白酶XIV、蝸牛丙酮粉末、硫酸酶、β-葡萄糖醛酸酶或其組合前處理。於若干實施例中，電穿孔係於約100伏特至約500伏特電壓經歷0.1厘米或0.2厘米透光管間隙距離。於若干實施例中，電穿孔係於約100伏特、150伏特、200伏特、250伏特、300伏特、350伏特、400伏特、450伏特、或500伏特電壓經歷0.1厘米或0.2厘米透光管間隙距離。
於本發明之若干實施例中，宿主細胞經基因修改 來導入或刪失與碳水化合物之轉運及/或合成相關聯之生物徑路的基因，包括涉及糖化作用的基因。舉例言之，宿主細胞可藉刪失內生性糖化基因及/或插入人或動物糖化基因而修飾來允許糖化樣式更佳類似於人類的糖化樣式。 於酵母之糖化作用修飾例如可參考美國專利案第7,029,872號及美國公告案第2004/0171826、2004/0230042、2006/0257399、2006/0029604、及2006/0040353號。本發明之宿主細胞也包括其中RNA病毒元體用來增加或調節基因表現之細胞。
表現系統
於若干實施例中，用於宿主細胞表現蛋白質之本發明之表現系統包含於藻菌細胞具有活性之調節控制元 體。於若干實施例中，用於宿主細胞表現蛋白質之本發明之表現系統包含於網黏菌門細胞具有活性之調節控制元體。於若干實施例中，用於宿主細胞表現蛋白質之本發明之表現系統包含於破囊壺菌類具有活性之調節控制元體。 於若干實施例中，用於宿主細胞表現蛋白質之本發明之表現系統包含於裂殖壺菌屬或破囊壺菌屬具有活性之調節控制元體。多種藻菌調節控制元體包括多個啟動子於多種種屬具有活性。因此，揭示作為本發明之面相之新穎調節序列可用於與其自其中單離之該細胞相同之細胞類型，或可用於與其單離之該細胞相異之細胞類型。此種表現卡匣之設計及組成係使用熟諳技藝人士已知之標準分子生物技術。例如參考Sambrook等人，2001年，分子選殖：實驗室手冊，第3版。
於若干實施例中，用於網黏菌門細胞製造蛋白質 之表現系統包含衍生自網黏菌門序列之調節元體。於若干實施例中，用於網黏菌門細胞製造蛋白質之表現系統包含衍生自非網黏菌門序列之調節元體，包括衍生自非網黏菌門藻菌序列之序列。於若干實施例中，本發明之表現系統包含編碼蛋白質之多核苷酸序列，其中該多核苷酸序列係與於網黏菌門宿主細胞有功能之任何啟動子序列、任何終結子序列、及/或任何其它調節序列相關聯。可使用可誘導的或組成性活性序列。適當調節控制元體也包括與此處所述之核苷酸分子相關聯之任一種調節控制元體。
本發明亦係針對於宿主細胞用於蛋白質表現之 表現卡匣。本發明亦係針對包含於宿主細胞表現蛋白質之表現卡匣之前述任一種宿主細胞。於若干實施例中，該表現系統包含含下列基因元體諸如至少一啟動子、一編碼序列及一終結子區工作式地聯結，因此可於宿主細胞發揮功能之一表現卡匣。於若干實施例中，該表現卡匣包含如此處所述之本發明已單離之核酸分子中之至少一者。於若干實施例中，該表現卡匣之全部基因元體皆為與該已單離之核酸分子相關聯之序列。於若干實施例中，控制序列為可誘導序列。於若干實施例中，編碼該蛋白質之核酸序列係整合入該宿主細胞之基因體。於若干實施例中，編碼該蛋白質之核酸序列係穩定地整合入該宿主細胞之基因體。
於若干實施例中，編碼欲表現之蛋白質之已單離 之核酸序列係工作式地聯結至一啟動子序列及/或一終結子序列，二者皆於該宿主細胞有功能。編碼欲表現之蛋白質之已單離的核酸序列所工作式聯結之啟動子序列及/或終結子序列可包括任一種啟動子及/或終結子序列，包括但非限於本發明之新穎核酸序列、已核發之美國專利案第7,001,722號之調節序列、美國公告案第2006/0275904及2006/0286650號所揭示之調節序列、或其中被轉形而工作式聯結至編碼蛋白質之已單離之多核苷酸序列之於宿主內有功能之其它調節序列。於若干實施例中，編碼該蛋白質之核酸序列對該特定網黏菌門宿主細胞為密碼子最佳化來提高轉譯效率。
本發明亦係針對包括本發明之表現卡匣之重組 載體。重組載體包括但非限於質體、噬菌體及病毒。於若干實施例中，該重組載體為線性化的載體。於若干實施例中，該重組載體為表現載體。如此處使用，「表現載體」一詞係指適合用於製造所編碼的產物(例如感興趣之蛋白質)之載體。於若干實施例中，編碼欲製造之產物之核酸序列係插入該重組載體來製造重組核酸分子。編碼該欲製造的蛋白質之核酸序列係以工作式聯結該核酸序列之載體內之調節序列(例如破囊壺菌目啟動子)之方式而插入該載體，允許該核酸序列於該重組微生物之轉錄及轉譯。於若干實施例中，可選擇標記包括此處所述任一種可選擇標記允許選擇其中已經成功地導入本發明之重組核酸分子之重組微生物。
於若干實施例中，藉本發明之重組宿主細胞製造 之蛋白質包括但非限於治療性蛋白質。如此處使用，「治療性蛋白質」包括可用於動物體及人體之疾病、病況或病症之治療或預防之蛋白質。「處理」及「處理」等詞係指治療性處理及預防性處理或預防措施，其中該物件可防止或減慢(減輕)非期望之生理病況、疾病或病症，或獲得有利的或期望的臨床結果。用於本發明之目的，有利的或期望的臨床結果包括但非限於與病況、疾病或病症相關聯之症狀或病徵的減輕；病況、疾病或病症程度的減少；病況、疾病或病症的穩定化(亦即該病況、疾病或病症並未惡化)；病況、疾病或病症之開始或進行延遲；病況、疾病或病症的改善；病況、疾病或病症的緩解(部分或全部緩解及包括可檢測或非可檢測)；或病況、疾病或病症之增進或改善。處 理包括提引出臨床上顯著反應而無過多副作用。處理也包括比較若未經處理之預期存活率可延長存活。
於若干實施例中，治療性蛋白質包括但非限於生 物活性蛋白質例如酶、抗體、或抗原性蛋白質。於若干實施例中，治療性蛋白質包括但非限於：蛋白質A、人生長激素、干擾素、抑肽酶、人α抗胰蛋白酶、親脂性蛋白質、人血清白蛋白、麩胺酸脫羧酶、胃脂解酶、乳鐵蛋白/溶菌酶、反錄酶、抗體(包括但非限於VEGF單株抗體(阿瓦斯汀(AVASTIN))及HER2單株抗體(賀癌平(HERCEPTIN))、人疫苗、動物疫苗、及動物治療劑。
於若干實施例中，藉本發明之重組宿主細胞製造 之蛋白質包括但非限於工業酶。工業酶包括但非限於用於製造、製備、保藏、營養素移動、或產品包括食品、藥品、化學品、機械產品、及其它工業產品加工用之酶。工業酶包括但非限於：α-澱粉酶、α-半乳糖苷酶、β-澱粉酶、纖維素、β-葡聚糖酶、右旋葡聚糖酶、糊精酶、葡萄糖澱粉酶、半纖維素酶/戊聚糖酶、木聚糖酶、反錄酶、乳酸酶、柚苷酶、果膠酶、支鏈澱粉酶、酸性蛋白酶、鹼性蛋白酶、鳳梨蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胺肽酶、內肽酶(胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、彈力蛋白酶)、凝乳酶(rennet/rennin/chymosin)、枯草桿菌蛋白酶(subtilism)、嗜熱蛋白酶(thermolysin)、胺醯化酶、麩胺酶、溶菌酶、青黴素醯化酶(penicillin acylase)、三酸甘油酯酶類、磷脂酶類、前胃酯酶類、植酸酶、醯胺酶類、異構酶類、醇去氫酶、 胺基酸氧化酶、催化酶、氯過氧化酶、過氧化酶、乙醯乳酸酯脫羧酶、天冬酸β-脫羧酶、組胺酸酶、環糊精糖基轉移酶、根毛黴菌蛋白酶(fromase)、植酸酶、及凝乳酶。
於若干實施例中，藉本發明之重組宿主細胞製造 之蛋白質包括營養缺陷型標記、涉及轉形選擇之顯性選擇標記(諸如分解抗生素活性之酶)或其它蛋白質、作為轉運子之蛋白質、涉及蛋白質糖化之酶、及涉及細胞代謝之酶。
於本發明實施例之任一個實施例中，由本發明之 宿主細胞所製造之蛋白質可為「輸出蛋白質」或「異源性輸出蛋白質」。如此處使用「輸出蛋白質」或「異源性輸出蛋白質」係指未涉及修飾可製造該蛋白質之宿主細胞且係由該宿主細胞所製造用於隨後單離之異源性重組蛋白質。 如此處定義「輸出蛋白質」不包括由通報子基因所編碼之蛋白質。
由本發明之重組宿主細胞所製造之異源性輸出 蛋白質不包括可選擇標記諸如吉歐黴素(Zeocin)抗性基因(諸如得自印度鏈異壁菌之ble基因及大腸桿菌新黴素(Neomycin)磷酸轉移酶(npt)、及轉座子Tn5、得自土麴菌(Aspergillus terreus)之殺稻瘟菌素(blasticidin)去胺酶(bsdR)、得自破囊壺菌屬T23B之PUFA合成酶ORFA、得自破囊壺菌屬T23B之PUFA合成酶ORFB、得自破囊壺菌屬T23B之PUFA合成酶ORFC、衍生自維多利亞水母(Aequorea victoria)之合成eGFP、編碼與選自於由廿二碳六烯酸(DHA)、廿二碳五烯酸(DPA)、廿碳五烯酸(EPA)及花生四 烯酸(ARA)所組成之組群之脂肪酸合成相關聯之蛋白質的天然基因、脂肪酸合成酶、脂肪酸去飽和酶、脂肪酸延長酶、與聚縮酮合成酶複體相關聯之蛋白質及與脂肪酸摻混入磷脂質或摻混入三醯基甘油分子相關聯之蛋白質、ω-3脂肪酸去飽和酶、多烯脂肪酸異構酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA還原酶、鮫鯊烯合成酶、植烯合成酶、植烯去飽和酶、類胡蘿蔔素環化酶、類胡蘿蔔素羥化酶、類胡蘿蔔素酮醇酶、維生素E及硫辛酸、與類異戊間二烯生合成徑路相關聯之蛋白質，及涉及宿主細胞製造多元不飽和脂肪酸或類胡蘿蔔素之酶。
於若干實施例中，由本發明之宿主細胞所製造之 蛋白質係以商業規模生產。商業規模包括自尺寸100升、1,000升、10,000升、或100,000升之通氣發酵槽生長之微生物製造蛋白質。於若干實施例中，商業規模製造係於伴以攪動之通氣發酵槽進行。
於若干實施例中，由本發明之宿主細胞所製造之 蛋白質可蓄積於細胞內部或可呈可溶性蛋白質由細胞分泌入例如培養基。
於若干實施例中，本發明所製造之蛋白質係自細 胞、培養基或該細胞生長於其中之發酵介質回收。於若干實施例中，該蛋白質為自該培養基呈可溶性蛋白質回收之分泌蛋白質。於若干實施例中，該蛋白質為包含信號肽之分泌蛋白質。
於若干實施例中，本發明所製造之蛋白質包含指 導其保留於內質網、指導其胞外分泌或指導其至其它小器官或細胞隔間之靶定信號。於若干實施例中，該蛋白質包含信號肽。於若干實施例中，該蛋白質包含Na/Pi-IIb2轉運子信號肽或Sec 1轉運蛋白質。於若干實施例中，該信號肽包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：37之胺基酸序列。於若干實施例中，包含具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：37之胺基酸序列之信號肽的蛋白質係分泌入培養基。於若干實施例中，該信號肽係於分泌過程自該蛋白質裂解，結果獲得蛋白質之成熟形式。
於若干實施例中，由本發明之宿主細胞所製造之 蛋白質係經糖基化。於若干實施例中，由本發明所製造之蛋白質之糖基化樣式比較於酵母或大腸桿菌中所製造之蛋白質更密切類似哺乳動物糖基化樣式。於若干實施例中，由本發明之網黏菌門宿主細胞所製造之蛋白質包含N-鏈接糖化樣式。用於治療目的之糖化蛋白質當其糖化樣式類似於主角有機體內所見糖化樣式時較不可能促成抗糖型免疫反應。相反地，具有非屬主角有機體之特性的鍵聯或糖之糖化蛋白質較可能具有抗原性。效應物功能也藉特定糖型式調整。舉例言之，IgG可媒介與Fc區糖型上分別為不存在有或存在有端末唾液酸相關的促炎反應或抗炎反應(Kaneko等人，科學313(5787)：670-3(2006))。
本發明進一步係針對一種製造重組蛋白質之方 法，該方法包含於足夠表現編碼該蛋白質之多核苷酸序列之條件下培養本發明之重組網黏菌門宿主細胞。於若干實 施例中，該重組蛋白質係自該宿主細胞分泌及自該培養基中回收。於若干實施例中，自該細胞分泌之蛋白質包含分泌信號肽。依據載體及用於製造之宿主系統，本發明之重組蛋白質可維持於重組細胞內，可分泌入發酵介質內，可分泌入二細胞膜間之空間，或可保留於細胞膜外表面上。 如此處使用，「回收蛋白質」一詞係指收集含該蛋白質之發酵介質而無需暗示額外分離或純化步驟。藉本發明方法製造之蛋白質可使用多種標準蛋白質純化技術純化，諸如但非限於親和層析術、離子交換層析術、過濾、電穿孔、斥水性交互作用層析術、凝膠過濾層析術、反相層析術、刀豆蛋白A層析術、色層聚焦、及差異溶解。於若干實施例中，藉本發明方法製造之蛋白質係以「實質上純質」形式單離。 如此處使用，「實質上純質」係指允許蛋白質有效用作為商品之純度。於若干實施例中，該重組蛋白質係蓄積於細胞內部且係自細胞回收。於若干實施例中，該方法之宿主細胞為破囊壺菌。於若干實施例中，該方法之宿主細胞為裂殖壺菌屬或破囊壺菌屬。於若干實施例中，該重組蛋白質為治療性蛋白質、食物酶、或工業酶。於若干實施例中，該重組網黏菌門宿主細胞為裂殖壺菌屬，及該重組蛋白質為包含分泌信號序列之治療性蛋白質。
於若干實施例中，本發明之重組載體為靶定載 體。如此處使用「靶定載體」一詞係指用來將特定核酸分子遞送入重組細胞的載體，其中該核酸分子係用來刪失或鈍化該宿主細胞內部之內生基因(換言之，用於被靶定的基 因破壞或擊倒技術)。此種載體也稱作為「擊倒」載體。於若干實施例中，部分靶定載體具有與宿主細胞標靶基因(亦即被靶定欲刪失或鈍化之基因)之核酸序列同源的核酸序列。於若干實施例中，插入該載體之核酸分子(亦即插子)係與該標靶基因同源。於若干實施例中，該載體插子之核酸序列係設計成結合至該標靶基因，使得該標靶基因與該插子進行同源重組，藉此該內生標靶基因被刪失、鈍化或衰減(亦即藉至少部分內生標靶基因被突變或刪失而衰減)。
已單離之核酸分子
本發明亦係針對可用於重組宿主細胞調節基因表現及/或指導蛋白質分泌之已單離之核酸分子或多核苷酸序列。此處所述核酸序列包括啟動子、終結序列、及編碼信號肽之核酸序列，及可用於調節同源蛋白質或異源蛋白質之轉錄及/或分泌。
根據本發明，已單離之核酸分子為已經自其天然周圍環境移出的(亦即，已經接受人為操縱的)核酸分子，其天然周圍環境為該核酸分子天然出現於其中之基因體或染色體。如此，「已單離之」並非必要反映該核酸分子之純化程度，反而指示該分子不包括該核酸分子天然出現於其中的完整基因體或完整染色體。已單離之核酸分子可包括DNA、RNA(例如mRNA)、或DNA或RNA之衍生物(例如cDNA)。雖然「核酸分子」一詞主要係指物理核酸分子，及「核酸序列」或「多核苷酸序列」等詞主要係指核酸分子上的核苷酸序列，但特別就核酸分子、多核苷酸序列或 可編碼蛋白質之核酸序列而言，該等術語係互換使用。於若干實施例中，本發明之經單離之核酸分子係使用重組DNA技術(例如聚合酶連鎖反應(PCR)擴增、選殖)或化學合成製造。已單離之核酸分子包括天然核酸分子及其同系物，包括但非限於天然同位變異株及改性核酸分子其中已經以此等改性可提供對所編碼之肽或蛋白質之序列、功能及/或生物活性具有期望的效果之方式而插入、刪失、取代、及/或反轉核苷酸。
本發明之啟動子序列、終結子序列、信號肽序 列、或任何其它序列之核酸序列補體係指與本發明之啟動子序列、終結子序列、信號肽序列或任何其它序列之該股核酸序列互補的核酸股之核酸序列。須瞭解含有本發明之序列之雙股DNA包含單股DNA，及其互補股具有與該單股DNA互補的序列。如此，本發明之核酸分子可為雙股或單股，及包括於「苛刻」雜交條件下與本發明序列，及/或與本發明序列之補體形成穩定雜交體之該等核酸序列。推定互補序列之方法為熟諳技藝人士所已知。
「蛋白質」一詞包括單鏈多肽分子及多多肽複體，此處個別組成多肽係藉共價手段或非共價手段鏈接。「多肽」一詞包括典型具有超過5、10、或20個胺基酸長度之兩個或多個胺基酸之胜肽。
本發明之新穎核酸分子可用於其可發揮功能之任一種微生物。於若干實施例中，該等核酸分子係用於網黏菌門之重組微生物。於若干實施例中，該等重組核酸分 子係用於破囊壺菌目之重組微生物。於若干實施例中，該等重組核酸分子係用於裂殖壺菌屬或破囊壺菌屬微生物。 如此處使用，重組微生物具有使用重組技術而自其正常(亦即野生型或天然出現)形式改性(亦即突變或改變)的基因體。根據本發明之重組微生物可包括其中核酸分子已經經過插入、刪失、或改性(亦即例如經由核苷酸之插入、刪失、取代、及/或反轉而突變)使得此種改性或此等改性於微生物體內提供期望效果之一種微生物。如此處使用，可導致基因表現、基因功能或基因產物功能(亦即基因所編碼之蛋白質)減少之基因改性可稱作為基因的鈍化(完全或部分)、刪失、中斷、阻斷或向下調節。舉例言之，其中導致由該基因所編碼之蛋白質功能減低之基因中的遺傳改性可能為基因完全刪失(亦即該基因不存在於重組微生物，因此該蛋白質不存在於重組微生物)、基因突變而結果導致蛋白質未完全轉譯或未轉譯(例如蛋白質未表現)，或基因突變而減少或消除該蛋白質之天然功能(例如蛋白質之表現具有減少活性或無活性，例如酶活性或酶作用)的結果。導致基因表現或功能增加之遺傳改性可稱作為基因之擴增、過度製造、過度表現、活化、增強、加成、或向上調節。
啟動子
本發明亦係針對屬於啟動子之新穎調節控制元體。本發明之啟動子為指導相關聯編碼區轉錄之DNA之一區。
於若干實施例中，該啟動子係得自網黏菌門微生 物。於若干實施例中，該啟動子係得自破囊壺菌包括但非限於：寄存為SAM2179之微生物(由寄存者定名為「吾肯氏壺菌SAM2179」)、吾肯氏壺菌屬或破囊壺菌屬或裂殖壺菌屬微生物。裂殖壺菌屬包括但非限於凝聚裂殖壺菌、利馬裂殖壺菌、裂殖壺菌種屬(S31)(ATCC 20888)、裂殖壺菌種屬(S8)(ATCC 20889)、裂殖壺菌種屬(LC-RM)(ATCC 18915)、裂殖壺菌種屬(S21)、已寄存株系ATCC 28209及已寄存利馬裂殖壺菌株系IFO 32693。
本發明之啟動子可至少於破囊壺菌具有啟動子 活性，及包括全長啟動子序列及其功能片段、融合序列、及天然啟動子同系物。限剪酶可用於消化本發明之核酸分子，接著適當檢定分析來測定啟動子活性所需之最小序列。此等片段本身個別表示本發明之實施例。啟動子同系物與天然啟動子之差異在於至少一、二、三或數個核苷酸已經經過刪失、插入、反轉、取代及/或衍生。啟動子同系物至少於破囊壺菌可保有作為啟動子之活性，但依據某些刺激而定，活性可增高、減低或促成。本發明之啟動子可包含提供發育方面及/或組織專一性調節控制或表現的一個或多個序列元體。
於若干實施例中，本發明之已單離之核酸分子包 含PUFA PKS OrfC啟動子(「PKS OrfC啟動子」)。本發明之PKS OrfC啟動子為天然位在OrfC編碼區上游(朝向5’端)及指導OrfC轉錄之DNA一區。於若干實施例中，PKS OrfC啟動子具有SEQ ID NO：3表示之多核苷酸序列。於若干實施例 中，本發明之已單離之核酸分子包含與SEQ ID NO：3至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列，其中該多核苷酸序列具有啟動子活性(亦即至少對PUFA PKS OrfC序列具有基本啟動子轉錄活性)，至少於破囊壺菌係如此。於至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少1000、至少1500個核苷酸之序列，或完整序列發現同系度(或%相同度)。
本發明亦係針對包含雜交至SEQ ID NO：3或雜交 至與SEQ ID NO：3至少95%相同之多核苷酸序列之多核苷酸序列之一單離之核酸分子。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含與SEQ ID NO：3完全互補之多核苷酸序列或與SEQ ID NO：3至少95%相同之多核苷酸序列。於若干實施例中，本發明之PKS OrfC啟動子包括一PKS OrfC啟動子同系物，其係充分類似於天然PKS OrfC啟動子序列，因此該同系物之核酸分子可於中、高或極高苛刻條件(容後詳述)下雜交至天然PKS OrfC啟動子之核酸序列之補體。於若干實施例中，本發明之PUFA PKS OrfC啟動子序列於中、高或極高苛刻條件下雜交至SEQ ID NO：3之補體。
於若干實施例中，本發明之啟動子包含寄存於ATCC存取號碼PTA-9615之pCL0001之OrfC啟動子。
於若干實施例中，本發明之已單離之核酸分子包含EF1短啟動子(「EF1短」或「EF1-S」啟動子)或EF1長啟 動子(「EF1長」或「EF1-L」啟動子)。本發明之EF1短或長啟動子為天然位在EF1編碼區上游(朝向5’端)及指導EF1轉錄之DNA的一區。於若干實施例中，該EF1短啟動子具有SEQ ID NO：42表示之多核苷酸序列。於若干實施例中，該EF1長啟動子具有SEQ ID NO：43表示之多核苷酸序列。於若干實施例中，本發明之已單離之核酸分子包含與SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：43至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列，其中該多核苷酸序列至少於破囊壺菌具有啟動子活性(亦即至少對EF1短或長啟動子序列分別具有基本啟動子轉錄活性)。於至少10，至少20，至少30，至少40，至少50，至少100，至少200，至少300，至少400，或至少500個核苷酸之序列或整個序列具有同系度(或%相同度)。
本發明亦係針對一種已單離之核酸分子其包含 雜交至SEQ ID NO：42及/或SEQ ID NO：43或雜交至與SEQ ID NO：42及/或SEQ ID NO：43至少95%相同之多核苷酸序列之一多核苷酸序列。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含與SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：43完全互補之多核苷酸序列或與SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：43至少95%相同之多核苷酸序列。於若干實施例中，本發明之EF1短啟動子或EF1長啟動子包括分別充分類似天然EF1短及/或長啟動子序列之一EF1短或長啟動子同系物，使得於中高或極高苛刻 條件(容後詳述)下，該同系物之核酸序列可雜交至該天然EF1短及/或長啟動子之核酸序列之補體。於若干實施例中，本發明之EF1短及/或長啟動子序列於中、高或極高苛刻條件下雜交至SEQ ID NO：42及/或SEQ ID NO：43分別之補體。
於若干實施例中，本發明之啟動子包含寄存於ATCC存取號碼PTA-9616之pAB0018之EF1長啟動子。
於若干實施例中，本發明之已單離之核酸分子包含60S短啟動子(「60S短」或「60S-S」啟動子)或60S長啟動子(「60S長」或「60S-L」啟動子)。本發明之60S短或長啟動子為天然位在60S編碼區下游(朝向5’端)及指導60S轉錄之DNA的一區。於若干實施例中，該60S短啟動子具有SEQ ID NO：44所表示之多核苷酸序列。於若干實施例中，該60S長啟動子具有SEQ ID NO：45所表示之多核苷酸序列。於若干實施例中，本發明之已單離之核酸分子包含多核苷酸序列其係與SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同，其中該多核苷酸序列至少於破囊壺菌具有啟動子活性(亦即至少對60S短或長啟動子序列分別具有基本啟動子轉錄活性)。同系度(或%相同度)出現於至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少100、至少200、至少300、至少400、或至少500個核苷酸之序列或整個序列。
本發明亦係針對一種已單離之核酸分子包含雜 交至SEQ ID NO：44及/或SEQ ID NO：45或雜交至與SEQ ID NO：44及/或SEQ ID NO：45至少95%相同之多核苷酸序列之一多核苷酸序列。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含與SEQ ID NO：44及/或SEQ ID NO：45完全互補或與SEQ ID NO：44及/或SEQ ID NO：45至少95%相同之多核苷酸序列互補之多核苷酸序列。於若干實施例中，本發明之60S短或60S長啟動子包括60S短或60S長啟動子同系物，其分別係充分類似天然60S短或60S長啟動子序列，使得該同系物之核酸分子可於中、高或極高苛刻條件(容後詳述)下，分別雜交至天然60S短及/或60S長啟動子之核酸序列的補體。於若干實施例中，本發明之60S短及/或60S長啟動子序列於中、高或極高苛刻條件下分別雜交至SEQ ID NO：44及/或SEQ ID NO：45之補體。
於若干實施例中，本發明之啟動子包含寄存於 ATCC存取號碼PTA-9614之pAB0011之60S長啟動子。
於若干實施例中，本發明之已單離之核酸分子包 含Sec1啟動子(「Sec1啟動子」)。本發明之Sec1啟動子為天然存在於Sec1編碼區上游(朝向5’端)及指導Sec1轉錄子DNA的一區。於若干實施例中，該Sec1啟動子具有SEQ ID NO：46表示之多核苷酸序列。於若干實施例中，本發明之已單離之核酸分子包含與SEQ ID NO：46至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至 少約99%相同之多核苷酸序列，其中該多核苷酸序列具有至少於破囊壺菌之啟動子活性(亦即至少對Sec1序列具有基本啟動子轉錄活性)。同系度(亦即%相同度)可出現於至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少100、至少200、至少300、至少400、或至少500個核苷酸之序列或整個序列。
本發明亦係針對包含一多核苷酸序列之已單離 之核酸分子，該序列係雜交至SEQ ID NO：46或雜交至與SEQ ID NO：46至少95%相同之多核苷酸序列。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含與SEQ ID NO：46完全互補之多核苷酸序列或與SEQ ID NO：46至少95%相同之多核苷酸序列完全互補之多核苷酸序列。於若干實施例中，本發明之Sec1啟動子包括Sec1啟動子同系物其係充分類似於天然Sec1啟動子序列，使得該同系物之核酸序列可於中、高或極高苛刻條件(容後詳述)下雜交至天然Sec1啟動子之核酸序列的補體。於若干實施例中，本發明之Sec1啟動子於中、高或極高苛刻條件下雜交至SEQ ID NO：46之補體。
於若干實施例中，本發明之啟動子包含寄存於ATCC存取號碼PTA-9613之pAB0022之Sec1啟動子。
終結子
本發明亦係針對屬於轉錄終結子之新穎調節控制元體。本發明之終結子區為標記基因體DNA中之基因序列轉錄終點之遺傳序列的一區段。
於若干實施例中，該終結子區係得自網黏菌門微 生物。於若干實施例中，該終結子區係得自破囊壺菌。於若干實施例中，該終結子區係得自裂殖壺菌屬或破囊壺菌屬。裂殖壺菌屬包括但非限於凝聚裂殖壺菌、利馬裂殖壺菌、裂殖壺菌種屬(S31)(ATCC 20888)、裂殖壺菌種屬(S8)(ATCC 20889)、裂殖壺菌種屬(LC-RM)(ATCC 18915)、裂殖壺菌種屬(S21)、已寄存株系ATCC 28209及已寄存利馬裂殖壺菌株系IFO 32693。
本發明之終結子區可至少於破囊壺菌具有終結 子活性，包括全長終結子序列及其功能片段、融合序列、及天然終結子區之同系物。終結子同系物與天然終結子之差異在於已經刪失、插入、反轉、取代及/或衍生至少一個或數個但非限於一個或數個核苷酸。於若干實施例中，本發明之終結子同系物保有至少於破囊壺菌作為終結子區的活性，但依據某些刺激該活性可增高、減低或促成。
於若干實施例中，本發明包含一已單離之核酸分 子其包含PUFA PKS OrfC基因之終結子區(「PKS OrfC終結子區」)。本發明之PKS OrfC終結子區為標記於基因體內DNA之OrfC基因序列轉錄終點之遺傳序列的一區段。於若干實施例中，該終結子區具有SEQ ID NO：4表示之多核苷酸序列。SEQ ID NO：4揭示之終結子區為得自破囊壺菌微生物之天然(野生型)終結子序列，特定言之為裂殖壺菌屬PKS OrfC終結子區且定名為「OrfC終結子元體1」。於若干實施例中，本發明之已單離之核酸分子包含與SEQ ID NO：4至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、 至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同且至少於破囊壺菌發揮至少作為PUFA PKS OrfC終結子區之功能的多核苷酸序列。同系度(亦即%相同度)出現於至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少100、至少150、或至少200個核苷酸序列或整個核苷酸序列。
本發明亦係針對包含一多核苷酸序列之已單離 之核酸分子，該序列係雜交至SEQ ID NO：4或雜交至與SEQ ID NO：4至少95%相同之多核苷酸序列。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含與SEQ ID NO：4完全互補之多核苷酸序列或與SEQ ID NO：4至少95%相同之多核苷酸序列完全互補之多核苷酸序列。於若干實施例中，本發明之PKS OrfC終結子區包括PKS OrfC終結子區同系物其係充分類似於天然PUFA PKS OrfC終結子區序列，使得該同系物之核酸序列可於中、高或極高苛刻條件(容後詳述)下雜交至天然PKS OrfC終結子區之核酸序列的補體。於若干實施例中，本發明之PKS OrfC終結子區於中、高或極高苛刻條件下雜交至SEQ ID NO：4之補體。
於若干實施例中，本發明之終結子包含寄存於ATCC存取號碼PTA-9614之pAB0011之OrfC終結子區。
信號肽
本發明亦係針對編碼信號肽之新穎核酸分子。
於若干實施例中，本發明係針對包含編碼得自網黏菌門微生物之分泌蛋白質的信號肽之多核苷酸序列之一 種已單離之核酸分子。於若干實施例中，該微生物為破囊壺菌。於若干實施例中，該微生物為裂殖壺菌屬或破囊壺菌屬。
本發明之信號肽可於破囊壺菌具有分泌信號活 性，及包括全長肽及其功能片段、融合肽、及天然信號肽之同系物。信號肽同系物與天然信號肽之差異在於，至少一個或數個，但非限於一個或數個胺基酸已經刪失(例如蛋白質之截頭版本，諸如肽或片段)、插入、反轉、取代及/或衍生(例如經由糖化、磷酸化、乙醯化、肉豆蔻醯化、戊二烯化、棕櫚醯化、醯胺化、及/或添加糖基磷脂基肌糖醇而衍生)。於若干實施例中，信號肽同系物至少與破囊壺菌保有作為信號之活性，但該活性可依據某些刺激增減或促成。
於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含編碼 Na/Pi-IIb2轉運子蛋白質信號肽之多核苷酸序列。Na/Pi-IIb2轉運子蛋白質信號肽可具有至少於破囊壺菌至少對Na/Pi-IIb2轉運子蛋白質之信號靶定活性，及包括全長肽及其功能片段、融合肽、及天然Na/Pi-IIb2轉運子蛋白質信號肽之同系物。於若干實施例中，該Na/Pi-IIb2轉運子蛋白質信號肽具有SEQ ID NO：1表示之胺基酸序列。於若干實施例中，該Na/Pi-IIb2轉運子蛋白質信號肽具有SEQ ID NO：15表示之胺基酸序列。於若干實施例中，本發明之已單離之核酸分子包含編碼胺基酸序列之多核苷酸序列其係與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：15為至少約60%、至少約65%、至少約 70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同，其中該多核苷酸序列編碼至少於破囊壺菌至少對Na/Pi-IIb2轉運子蛋白質作為信號肽功能之胺基酸序列。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含一多核苷酸序列，該序列編碼已單離之胺基酸序列其包含至少於破囊壺菌至少對Na/Pi-IIb2轉運子蛋白質作為信號肽功能之SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：15之功能片段。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含SEQ ID NO：2。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含雜交至下列任一者之多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：2；(ii)與SEQ ID NO：2至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列；(iii)與SEQ ID NO：1至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列；及(vi)與SEQ ID NO：15至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列。 於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含多核苷酸序列其係與下列任一者完全互補：(i)SEQ ID NO：2；(ii)與SEQ ID NO：2至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、 至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列；(iii)與SEQ ID NO：1至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列；及(vi)與SEQ ID NO：15至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列。
本發明亦係針對一種包含Na/Pi-IIb2轉運子信號 肽胺基酸序列之已單離之多肽。於若干實施例中，該已單離之多肽包含選自於由下列所組成之組群之一胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：1，(ii)SEQ ID NO：15，及(iii)與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：15至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之胺基酸序列，其係至少於破囊壺菌至少對Na/Pi-IIb2轉運子作為信號序列功能。於若干實施例中，該已單離之多肽包含SEQ ID NO：15之頭20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35個胺基酸殘基(亦即其中於此系列之C端最末1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、或18個胺基酸已經被刪失之SEQ ID NO：15)。位在SEQ ID NO：15之C端之18個胺基酸預測為成熟Na/Pi轉運子蛋白質之一部分，及信 號序列之裂解位置預測出現於SEQ ID NO：15之胺基酸殘基35與36間。但包括至多成熟Na/Pi轉運子蛋白質之全部18個胺基酸(亦即SEQ ID NO：15之最末18個胺基酸殘基)之信號肽為本發明可採用且所涵蓋。根據本發明，已單離之多肽為已經自其天然周圍環境移開(亦即已經接受人為操縱)之多肽及可包括例如已純化之蛋白質、已純化之胜肽、部分純化之蛋白質、部分純化之胜肽重組製造之蛋白質或胜肽，及天然製造之蛋白質或胜肽。如此，「已單離之」一詞並未反映該多肽之純化程度。於若干實施例中，本發明之已單離之Na/Pi-IIb2轉運子信號肽係重組製造。
於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含編碼α-1,6-甘露糖基轉移酶(ALG12)信號肽之多核苷酸序列。ALG12信號肽至少於破囊壺菌中至少對ALG12蛋白質可具有信號靶定活性，及包括天然ALG12信號肽之全長肽及其片段、融合肽及同系物。於若干實施例中，該ALG12信號肽具有SEQ ID NO：59表示之胺基酸序列。於若干實施例中，本發明之已單離之核酸分子包含編碼胺基酸序列之多核苷酸序列，該胺基酸序列係與SEQ ID NO：59至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同，其中該多核苷酸序列編碼胺基酸序列，其至少於破囊壺菌至少對ALG12蛋白質作為信號肽功能。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含多核苷酸序列其係編碼包含SEQ ID NO：59之一功 能片段的已單離之胺基酸序列，該功能片段係至少於破囊壺菌至少對ALG12蛋白質發揮作為信號肽之功能。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含SEQ ID NO：60。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含雜交至下列任一者之多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：60；(ii)與SEQ ID NO：60至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列；及(iii)與SEQ ID NO：59至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含與下列任一者完全互補之多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：60；(ii)與SEQ ID NO：60至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列；及(iii)與SEQ ID NO：59至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列。
本發明亦係針對一種包含ALG12信號肽胺基酸 序列之已單離之多肽。於若干實施例中，該已單離之多肽包含選自於由下列所組成之組群中之胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：59；及(ii)與SEQ ID NO：59至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之胺基酸序列其係至少於破囊壺菌至少對ALG12蛋白質發揮作為信號序列之功能。於若干實施例中，該已單離之多肽包含SEQ ID NO：59之首24、25、26、27、28、29、30、31、或32個胺基酸殘基。於若干實施例中，本發明之已單離之ALG12信號肽係重組製造。
於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含結合 免疫球蛋白蛋白質(BiP)信號肽之多核苷酸序列。BiP信號肽至少於破囊壺菌至少對BiP蛋白質可具有信號靶定活性，及包括天然BiP信號肽之全長肽及其片段、融合肽及同系物。 於若干實施例中，該BiP信號肽具有SEQ ID NO：61表示之胺基酸序列。於若干實施例中，本發明之已單離之核酸分子包含編碼胺基酸序列之多核苷酸序列，該胺基酸序列係與SEQ ID NO：61至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同，其中該多核苷酸序列編碼胺基酸序列，其至少於破囊壺菌至少對BiP蛋白質作為信號肽功能。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含多核苷酸序列其係編碼包含SEQ ID NO：61之一功能片段的已單離之胺基酸序列，該功能片段係至少於破囊壺菌至少對BiP蛋白質發揮作為信號肽之功能。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含SEQ ID NO：62。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含雜交至下列任一者之多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：62；(ii)與SEQ ID NO：62至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列；及(iii)與SEQ ID NO：61至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含與下列任一者完全互補之多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：62；(ii)與SEQ ID NO：62至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列；及(iii)與SEQ ID NO：61至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列。
本發明亦係針對一種包含BiP信號肽胺基酸序列 之已單離之多肽。於若干實施例中，該已單離之多肽包含選自於由下列所組成之組群中之胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：61；及(ii)與SEQ ID NO：61至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、 或至少約99%相同之胺基酸序列其係至少於破囊壺菌至少對BiP蛋白質發揮作為信號序列之功能。於若干實施例中，該已單離之多肽包含SEQ ID NO：61之首23、24、25、26、27、28、29、30、或31個胺基酸殘基。於若干實施例中，本發明之已單離之BiP信號肽係重組製造。
於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含編碼 α-1,3-葡萄糖苷酶(GLS2)信號肽之多核苷酸序列。GLS2信號肽至少於破囊壺菌至少對GLS2蛋白質可具有信號靶定活性，及包括天然GLS2信號肽之全長肽及其片段、融合肽及同系物。於若干實施例中，該GLS2信號肽具有SEQ ID NO：63表示之胺基酸序列。於若干實施例中，本發明之已單離之核酸分子包含編碼胺基酸序列之多核苷酸序列，該胺基酸序列係與SEQ ID NO：63至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同，其中該多核苷酸序列編碼胺基酸序列，其至少於破囊壺菌至少對GLS2蛋白質作為信號肽功能。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含多核苷酸序列其係編碼包含SEQ ID NO：63之一功能片段的已單離之胺基酸序列，該功能片段係至少於破囊壺菌至少對GLS2蛋白質發揮作為信號肽之功能。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含SEQ ID NO：64。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含雜交至下列任一者之多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：64；(ii)與SEQ ID NO：64至少約60%、至少約65%、至少 約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列；及(iii)與SEQ ID NO：63至少約64%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列。 於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含與下列任一者完全互補之多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：64；(ii)與SEQ ID NO：64至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列；及(iii)與SEQ ID NO：63至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列。
本發明亦係針對一種包含GLS2信號肽胺基酸序 列之已單離之多肽。於若干實施例中，該已單離之多肽包含選自於由下列所組成之組群中之胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：63；及(ii)與SEQ ID NO：63至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之胺基酸序列其係至少於破囊壺菌至少對GLS2蛋白質發揮作為信號序列之功能。於若干實施例中，該已單離之多肽包含SEQ ID NO：63之首30、31、32、 33、34、35、36、37或38個胺基酸殘基。於若干實施例中，本發明之已單離之GLS2信號肽係重組製造。
於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含編碼 仿α-1,3-1,6-甘露糖苷酶信號肽之多核苷酸序列。仿α-1,3-1,6-甘露糖苷酶信號肽至少於破囊壺菌至少對仿α-1,3-1,6-甘露糖苷酶蛋白質可具有信號靶定活性，及包括天然仿α-1,3-1,6-甘露糖苷酶信號肽之全長肽及其片段、融合肽及同系物。於若干實施例中，該仿α-1,3-1,6-甘露糖苷酶信號肽具有SEQ ID NO：65表示之胺基酸序列。於若干實施例中，本發明之已單離之核酸分子包含編碼胺基酸序列之多核苷酸序列，該胺基酸序列係與SEQ ID NO：65至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同，其中該多核苷酸序列編碼胺基酸序列，其至少於破囊壺菌至少對仿α-1,3-1,6-甘露糖苷酶蛋白質作為信號肽功能。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含多核苷酸序列其係編碼包含SEQ ID NO：65之一功能片段的已單離之胺基酸序列，該功能片段係至少於破囊壺菌至少對仿α-1,3-1,6-甘露糖苷酶蛋白質發揮作為信號肽之功能。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含SEQ ID NO：66。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含雜交至下列任一者之多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：66；(ii)與SEQ ID NO：66至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、 至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列；及(iii)與SEQ ID NO：65至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含與下列任一者完全互補之多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：66；(ii)與SEQ ID NO：66至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列；及(iii)與SEQ ID NO：65至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列。
本發明亦係針對一種包含仿α-1,3-1,6-甘露糖苷 酶信號肽胺基酸序列之已單離之多肽。於若干實施例中，該已單離之多肽包含選自於由下列所組成之組群中之胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：65；及(ii)與SEQ ID NO：65至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之胺基酸序列其係至少於破囊壺菌至少對仿α-1,3-1,6-甘露糖苷酶蛋白質發揮作為信號序列之功能。於若干實施例中，該已單離之多肽包含SEQ ID NO：65之首24、25、26、27、28、29、30、31、 32、33或34個胺基酸殘基。於若干實施例中，本發明之已單離之仿α-1,3-1,6-甘露糖苷酶信號肽係重組製造。
於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含編碼 仿α-1,3-1,6-甘露糖苷酶#1信號肽之多核苷酸序列。仿α-1,3-1,6-甘露糖苷酶#1信號肽至少於破囊壺菌至少對仿α-1,3-1,6-甘露糖苷酶#1蛋白質可具有信號靶定活性，及包括天然仿α-1,3-1,6-甘露糖苷酶#1信號肽之全長肽及其片段、融合肽及同系物。於若干實施例中，該仿α-1,3-1,6-甘露糖苷酶#1信號肽具有SEQ ID NO：67表示之胺基酸序列。 於若干實施例中，本發明之已單離之核酸分子包含編碼胺基酸序列之多核苷酸序列，該胺基酸序列係與SEQ ID NO：67至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同，其中該多核苷酸序列編碼胺基酸序列，其至少於破囊壺菌至少對仿α-1,3-1,6-甘露糖苷酶#1蛋白質作為信號肽功能。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含多核苷酸序列其係編碼包含SEQ ID NO：67之一功能片段的已單離之胺基酸序列，該功能片段係至少於破囊壺菌至少對仿α-1,3-1,6-甘露糖苷酶#1蛋白質發揮作為信號肽之功能。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含SEQ ID NO：68。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含雜交至下列任一者之多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：68；(ii)與SEQ ID NO：68至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、 至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列；及(iii)與SEQ ID NO：67至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含與下列任一者完全互補之多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：68；(ii)與SEQ ID NO：68至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列；及(iii)與SEQ ID NO：67至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列。
本發明亦係針對一種包含仿α-1,3-1,6-甘露糖苷 酶#1信號肽胺基酸序列之已單離之多肽。於若干實施例中，該已單離之多肽包含選自於由下列所組成之組群中之胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：67；及(ii)與SEQ ID NO：67至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之胺基酸序列其係至少於破囊壺菌至少對仿α-1,3-1,6-甘露糖苷酶#1蛋白質發揮作為信號序列之功能。於若干實施例中，該已單離 之多肽包含SEQ ID NO：67之首23、24、25、26、27、28、或29個胺基酸殘基。於若干實施例中，本發明之已單離之仿α-1,3-1,6-甘露糖苷酶#1信號肽係重組製造。
於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含編碼 仿α-1,2-甘露糖苷酶信號肽之多核苷酸序列。仿α-1,2-甘露糖苷酶信號肽至少於破囊壺菌至少對仿α-1,2-甘露糖苷酶蛋白質可具有信號靶定活性，及包括天然仿α-1,2-甘露糖苷酶信號肽之全長肽及其片段、融合肽及同系物。於若干實施例中，該仿α-1,2-甘露糖苷酶信號肽具有SEQ ID NO：69表示之胺基酸序列。於若干實施例中，本發明之已單離之核酸分子包含編碼胺基酸序列之多核苷酸序列，該胺基酸序列係與SEQ ID NO：69至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同，其中該多核苷酸序列編碼胺基酸序列，其至少於破囊壺菌至少對仿α-1,2-甘露糖苷酶蛋白質作為信號肽功能。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含多核苷酸序列其係編碼包含SEQ ID NO：69之一功能片段的已單離之胺基酸序列，該功能片段係至少於破囊壺菌至少對仿α-1,2-甘露糖苷酶蛋白質發揮作為信號肽之功能。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含SEQ ID NO：66。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含雜交至下列任一者之多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：66；(ii)與SEQ ID NO：66至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少 約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列；及(iii)與SEQ ID NO：69至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含與下列任一者完全互補之多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：66；(ii)與SEQ ID NO：66至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列；及(iii)與SEQ ID NO：69至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列。
本發明亦係針對一種包含仿α-1,2-甘露糖苷酶信 號肽胺基酸序列之已單離之多肽。於若干實施例中，該已單離之多肽包含選自於由下列所組成之組群中之胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：69；及(ii)與SEQ ID NO：69至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之胺基酸序列其係至少於破囊壺菌至少對仿α-1,2-甘露糖苷酶蛋白質發揮作為信號序列之功能。於若干實施例中，該已單離之多肽包含SEQ ID NO：69之首26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36個胺基酸殘基。於若干實施例中，本發明之已單離之仿α-1,2-甘露糖苷酶信號肽係重組製造。
於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含編碼 仿β-木糖苷酶信號肽之多核苷酸序列。仿β-木糖苷酶信號肽至少於破囊壺菌至少對仿β-木糖苷酶蛋白質可具有信號靶定活性，及包括天然仿β-木糖苷酶信號肽之全長肽及其片段、融合肽及同系物。於若干實施例中，該仿β-木糖苷酶信號肽具有SEQ ID NO：71表示之胺基酸序列。於若干實施例中，本發明之已單離之核酸分子包含編碼胺基酸序列之多核苷酸序列，該胺基酸序列係與SEQ ID NO：71至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同，其中該多核苷酸序列編碼胺基酸序列，其至少於破囊壺菌至少對仿β-木糖苷酶蛋白質作為信號肽功能。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含多核苷酸序列其係編碼包含SEQ ID NO：71之一功能片段的已單離之胺基酸序列，該功能片段係至少於破囊壺菌至少對仿β-木糖苷酶蛋白質發揮作為信號肽之功能。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含SEQ ID NO：72。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含雜交至下列任一者之多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：72；(ii)與SEQ ID NO：72至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、 至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列；及(iii)與SEQ ID NO：71至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含與下列任一者完全互補之多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：72；(ii)與SEQ ID NO：72至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列；及(iii)與SEQ ID NO：71至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列。
本發明亦係針對一種包含仿β-木糖苷酶信號肽 胺基酸序列之已單離之多肽。於若干實施例中，該已單離之多肽包含選自於由下列所組成之組群中之胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：71；及(ii)與SEQ ID NO：71至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之胺基酸序列其係至少於破囊壺菌至少對仿β-木糖苷酶蛋白質發揮作為信號序列之功能。 於若干實施例中，該已單離之多肽包含SEQ ID NO：71之首24、25、26、27、28、29、或30個胺基酸殘基。於若干實 施例中，本發明之已單離之仿β-木糖苷酶信號肽係重組製造。
於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含編碼 胡蘿蔔素合成酶信號肽之多核苷酸序列。胡蘿蔔素合成酶信號肽至少於破囊壺菌至少對胡蘿蔔素合成酶蛋白質可具有信號靶定活性，及包括天然胡蘿蔔素合成酶信號肽之全長肽及其片段、融合肽及同系物。於若干實施例中，該胡蘿蔔素合成酶信號肽具有SEQ ID NO：73表示之胺基酸序列。於若干實施例中，本發明之已單離之核酸分子包含編碼胺基酸序列之多核苷酸序列，該胺基酸序列係與SEQ ID NO：73至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同，其中該多核苷酸序列編碼胺基酸序列，其至少於破囊壺菌至少對胡蘿蔔素合成酶蛋白質作為信號肽功能。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含多核苷酸序列其係編碼包含SEQ ID NO：73之一功能片段的已單離之胺基酸序列，該功能片段係至少於破囊壺菌至少對胡蘿蔔素合成酶蛋白質發揮作為信號肽之功能。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含SEQ ID NO：74。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含雜交至下列任一者之多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：74；(ii)與SEQ ID NO：74至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、 或至少約99%相同之多核苷酸序列；及(iii)與SEQ ID NO：73至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含與下列任一者完全互補之多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：74；(ii)與SEQ ID NO：74至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列；及(iii)與SEQ ID NO：73至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列。
本發明亦係針對一種包含胡蘿蔔素合成酶信號 肽胺基酸序列之已單離之多肽。於若干實施例中，該已單離之多肽包含選自於由下列所組成之組群中之胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：73；及(ii)與SEQ ID NO：73至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之胺基酸序列其係至少於破囊壺菌至少對胡蘿蔔素合成酶蛋白質發揮作為信號序列之功能。於若干實施例中，該已單離之多肽包含SEQ ID NO：73之首15、16、17、18、19、20、21、29、30、31、32、33或34個胺基酸殘基。於若干實施例中，本發明之已單離之 胡蘿蔔素合成酶信號肽係重組製造。
於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含編碼 Sec1蛋白質(「Sec1」)信號肽之多核苷酸序列。Sec1信號肽至少於破囊壺菌至少對Sec1蛋白質可具有信號靶定活性，及包括天然Sec1信號肽之全長肽及其片段、融合肽及同系物。於若干實施例中，該Sec1信號肽具有SEQ ID NO：37表示之胺基酸序列。於若干實施例中，本發明之已單離之核酸分子包含編碼胺基酸序列之多核苷酸序列，該胺基酸序列係與SEQ ID NO：37至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同，其中該多核苷酸序列編碼胺基酸序列，其至少於破囊壺菌至少對Sec1蛋白質作為信號肽功能。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含多核苷酸序列其係編碼包含SEQ ID NO：37之一功能片段的已單離之胺基酸序列，該功能片段係至少於破囊壺菌至少對Sec1蛋白質發揮作為信號肽之功能。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含SEQ ID NO：38。於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含雜交至下列任一者之多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：38；(ii)與SEQ ID NO：38至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列；及(iii)與SEQ ID NO：37至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、 至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列。 於若干實施例中，該已單離之核酸分子包含與下列任一者完全互補之多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：38；(ii)與SEQ ID NO：38至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列；及(iii)與SEQ ID NO：37至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之多核苷酸序列。
本發明亦係針對一種包含Sec1信號肽胺基酸序 列之已單離之多肽。於若干實施例中，該已單離之多肽包含選自於由下列所組成之組群中之胺基酸序列：(i)SEQ ID NO：37；及(ii)與SEQ ID NO：37至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%相同之胺基酸序列其係至少於破囊壺菌至少對Sec1蛋白質發揮作為信號序列之功能。於若干實施例中，該已單離之多肽包含SEQ ID NO：37之首18或19個胺基酸殘基(亦即SEQ ID NO：37，其中於本系列C端之末1或2個胺基酸經刪失)。於若干實施例中，本發明之已單離之Sec1信號肽係重組製造。
於若干實施例中，本發明之已單離之核酸分子包 含本發明之OrfC啟動子、EF1短啟動子、EF1長啟動子、60S短啟動子、60S長啟動子、Sec1啟動子、Na/Pi-IIb轉運子蛋白質信號肽之編碼序列、或Sec1轉運蛋白質信號肽之編碼序列其係工作式鏈接至編碼蛋白質之核酸序列的5’端。本發明也涵蓋重組載體(包括但非限於表現載體)、表現卡匣及宿主細胞包含本發明之OrfC啟動子、EF1短啟動子、EF1長啟動子、60S短啟動子、60S長啟動子、Sec1啟動子、Na/Pi-IIb轉運子蛋白質信號肽之編碼序列、或Sec1轉運蛋白質信號肽之編碼序列其係工作式鏈接至編碼蛋白質之核酸序列的5’端。
包含前述本發明之已單離之核酸分子中之任一 者(例如包含OrfC啟動子、EF1短啟動子、EF1長啟動子、60S短啟動子、60S長啟動子、Sec1啟動子、Na/Pi-IIb轉運子蛋白質信號肽之編碼序列、或Sec1轉運蛋白質信號肽之編碼序列之核酸分子)的重組載體(包括但非限於表現載體)、表現卡匣、宿主細胞及微生物係涵蓋於本發明之範圍；將該等載體及/或表現卡匣導入宿主細胞及重組微生物之方法也係涵蓋於本發明之範圍。適當載體及表現卡匣可經選擇或組成，因而含有適宜的調節序列、終結子片段、聚腺苷酸化序列、增強子序列、標記基因、及其它適當序列。有關載體、表現卡匣、及宿主細胞之額外細節係說明於此處。
除非另行載明，否則如此處使用，述及百分比(%) 相同度(及%相同)係指使用下列所進行之同系度評估：(1)以標準內設值參數，使用blastp用於胺基酸搜尋及blastn用 於核酸搜尋進行BLAST 2.0基本BLAST同系度搜尋，其中查詢序列藉內設值過濾低複雜度區(例如參考Altschul S.等人，核酸研究25：3389-3402(1997)，全文以引用方式併入此處)；(2)使用下述參數做BLAST 2校準；(3)及/或以標準內設值參數進行PSI-BLAST(位置專一性迭代BLAST)。須注意BLAST 2.0基本BLAST與BLAST 2之標準參數間有若干差異，兩個特定序列須使用BLAST 2程式辨識為具有顯著同系度，而使用該等序列中之一者作為查詢序列於BLAST 2.0基本BLAST進行搜尋可能無法識別於頂端匹配的第二序列。此外，PSI-BLAST提供「側寫資料」搜尋之自動化容易使用版本，此乃尋找序列同系物的敏感方式。該程式首先進行有間隙之BLAST資料庫搜尋。PSI-BLAST程式使用得自任何顯著校準資訊返回構成一位置專一性分數矩陣，其替代查詢序列用於資料庫的下一回合搜尋。因此，須瞭解百分比相同度可使用此等程式中之任一者測定。
例如如於Tatusova及Madden，FEMS Microbiol. Lett.174：247-250(1999)，全文以引用方式併入此處，所述使用BLAST 2序列的兩個特定序列可彼此校準。BLAST 2序列校準係使用BLAST 2.0演繹法則於blastp或blastn進行，來進行兩個序列間之有間隙BLAST搜尋(BLAST 2.0)，允許於所得校準導入間隙(刪失及插入)。於若干實施例中，BLAST 2序列校準係使用標準內設值參數進行如下。
對blastn使用0 BLOSUM62矩陣：匹配加分=1
不匹配扣分=-2
開放間隙(5)及延伸間隙(2)扣分gap x_dropoff(50)預期(10)字大小(11)過濾(on)。
對blastp使用0 BLOSUM62矩陣：開放間隙(11)及延伸間隙(1)扣分gap x_dropoff(50)預期(10)字大小(3)過濾(on)。
如此處使用，雜交條件係指核酸分子用來識別相似的核酸分子之標準雜交條件。例如參考Sambrook J.及Russell D.(2001)分子選殖：實驗室手冊第3版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，全文以引用方式併入此處。此外，揭示計算達成雜交允許核苷酸之各種不匹配程度的適當雜交及洗滌條件之公式，例如參考Meinkoth等人，Anal.Biochem.138,267-284(1984)，全文以引用方式併入此處。
更特定言之，如此處所述中等苛刻雜交及洗滌條件係指允許與雜交反應中用來探測之核酸分子具有至少約70%核酸序列相同度之核酸分子單離的條件(亦即允許約30%或以下核苷酸不匹配之條件)。如此處所述高度苛刻雜交及洗滌條件係指允許與雜交反應中用來探測之核酸分子具有至少約80%核酸序列相同度之核酸分子單離的條件(亦即允許約20%或以下核苷酸不匹配之條件)。如此處所述極高度苛刻雜交及洗滌條件係指允許與雜交反應中用來探測之核酸分子具有至少約90%核酸序列相同度之核酸分子單離的條件(亦即允許約10%或以下核苷酸不匹配之條件)。如前文討論，熟諳技藝人士可使用於Meinkoth等人(舉例)之公 式來計算適當雜交及洗滌條件來達成此種特定程度的核苷酸不匹配。此等條件將依所形成者為DNA：RNA或DNA：DNA雜交體而改變。DNA：DNA雜交體計算所得熔點比DNA：RNA雜交體低10℃。於特定實施例中，DNA：DNA雜交體之苛刻雜交條件包括使用適當洗滌條件，於約20℃至約35℃(較低苛刻)、約28℃至約40℃(較高苛刻)、及約35℃至約45℃(又更高苛刻)間之溫度，於6X SSC(0.9M Na+)之離子強度雜交。於特定實施例中，DNA：RNA雜交體之苛刻雜交條件包括使用類似苛刻的洗滌條件，於約30℃至約45℃、約38℃至約50℃、及約45℃至約55℃間之溫度，於6X SSC(0.9M Na+)之離子強度雜交。此等數值係基於對大於約100核苷酸，0%甲醯胺，及約40%G+C含量之分子的熔點計算。另外，可如Sambrook等人所述憑經驗算出Tm。一般而言，洗滌條件應儘可能地苛刻，且應適合所選用之雜交條件。舉例言之，雜交條件可包括比特定雜交體計算所得Tm低約20-25℃之鹽與溫度條件的組合，及洗滌條件典型地包括比該特定雜交體計算所得之Tm低約12-20℃之鹽與溫度條件的組合。適合用於DNA：DNA雜交體之雜交條件之一個實例包括於6 SSC(50%甲醯胺)於約42℃雜交2至24小時，接著為洗滌步驟包括於約2X SSC於室溫一次或多次洗滌，接著為於較高溫及較低離子強度額外洗滌(例如於約0.1X-0.5X SSC於約37℃至少一次洗滌，接著於約0.1X-0.5X SSC於約68℃至少一次洗滌)。
已經大致上說明本發明，經由參考此處提供之實 例可對本發明獲得進一步瞭解。此等實例僅供舉例說明之目的而非意圖限制性。
實例1 裂殖壺菌屬蛋白質表現載體pSchizE之構成 a. p07074#6之構成：
pSP73載體(波米迦(Promega)，acc#X65333)以XbaI及綠豆核酸酶消化，及然後經純化及接合來形成載體p070604#3。然後p070604#3進一步以SphI、HpaI、及綠豆核酸酶消化，及然後經純化及再度接合而形成載體p070704#6。
b. pSchiz1之構成：
如WO02/083869之揭示，pTUBzeo11-2載體係以BamHI消化來釋放含裂殖壺菌屬α-微管素啟動子、ble基因、及SV40終結子區之1122鹼基對(bp)片段。此片段經凝膠純化及接合入載體pYES2/CT(英維仇貞(Invitrogen))，該載體事先已經使用BamHI消化。然後所得構成體以SmaI、SphI、及綠豆核酸酶消化來釋放含α-微管素啟動子之540bp片段。該片段接合入事先已經以BamHI、SmaI、及綠豆接合酶消化之pUC19(基因存庫存取號碼L09137)來形成pSchiz1。
c. pSchiz2之構成
於分開反應中，PCR係用來使用下列引子自pTUBzeo11-2產生編碼SV40終結子之擴增子，該等引子結合NcoI及PciI限剪位置(以斜體字顯示)用於接合： 引子S4termF：5'-GATCCCATGGCACGTGCTACG(SEQ ID NO：16)
引子S4termR：5'-GGCAACATGTATGATAAGATAC(SEQ ID NO：17)
所得擴增子以NcoI及PciI消化而暴露出黏端。然後此265bp片段接合入先前已經以NcoI消化之pSchiz1。所得質體定名為pSchiz2，含有該α-微管素啟動子接著為SV40終結子。
d. pSchiz3之構成：
於分開反應中，使用下列設計來將SmaI位置(以斜體字顯示)添加至任一端的下列引子，PCR用來自pYES2/CT擴增多個選殖位置(MCS)：引子C2mcsSmaF：5'-GATCCCCGGGTTAAGCTTGGT(SEQ ID NO：18)
引子C2mcsSmaR：5'-ACTGGGGCCCGTTTAAACTC(SEQ ID NO：19)
然後所得MCS擴增子以SmaI消化及接合入先前已經以NcoI及綠豆核酸酶消化之pSchiz2。所得載體定名為pSchiz3，含有α微管素啟動子、SV40終結子、及pYES2/CT MCS。
e. pSchiz0.5#4之構成
以下列引子及pSchiz3作為樣板，PCR用來產生編碼MCS卡匣之一擴增子，該MCS卡匣係由α-微管素啟動子pYES2/CT MCS，及SV40終結子區所組成。
引子5'tubMCS_BglII：5'-GACTAGATCTCAATTTTAGGCCCCCCACTGACCG(SEQ ID NO：20)
引子3'SV40MCS_Sal：5'-GACTGTCGACCATGTATGATAAGATACATTGATG(SEQ ID NO：21)
此等引子係設計來將BglII及SalI限剪位置(以斜體字顯示)添加至MCS卡匣擴增子末端。所得PCR片段以BglII及SalI消化及接合入先前也已經以BglII及SalI消化之p070704#6來產生pSchiz0.5#4。
f. pSchizE之構成
使用如美國專利案第7001,772號所述之載體pMON50203作為樣板，PCR用來產生編碼ALS基因(包括其啟動子區及終結子區)之4776bp擴增子。含有NdeI及BglII限剪位置(以斜體字顯示)之下列引子用於本PCR反應：引子5'ALSproNde3：5'-GACTCATATGGCCCAGGCCTACTTTCAC(SEQ ID NO：22)
引子3'ALStermBglII：5'GACTAGATCTGGGTCAAGGCAGAAGAATTCCGCC(SEQ ID NO：23)
然後所得ALS擴增子以BglII及NdeI消化。pSchiz0.5#4同樣以BglII及NdeI消化，較大的3171bp帶經凝膠純化及接合至已純化之ALS PCR擴增子。所得載體定名 為pSchizE係藉定序驗證為含有ALS基因(包括啟動子區及終結子區)接著為一表現卡匣其含有裂殖壺菌屬α-微管素啟動子、pYES2/CT MCS、及SV40終結子區(參考第5圖)。
實例2 裂殖壺菌屬蛋白質表現載體pSchiz-sG之構成
eGFP之表現及分泌係使用pSchiz-sG達成(參考第6圖)。本質體也定名為pCO0001，及2008年11月18日，寄存於美國種型培養物保藏所，專利寄存館，維吉尼亞州20110-2209曼納沙司，大學大道10801號，獲得ATCC存取號碼PTA-9617。本載體含有(i)裂殖壺菌α-微管素啟動子序列接著為(ii)附接有成熟轉運子蛋白質N-端部之一片段(SEQ ID NO：15)之裂殖壺菌屬Na/Pi轉運子信號序列之一序列融合至eGFP編碼序列接著為(iii)MCS其餘部分及(iv)SV40終結子區。本載體也含有裂殖壺菌屬ALS基因作為可選擇標記。該載體係如後文說明構成。
選用來編碼該信號肽之序列(SEQ ID NO：2)係得自由裂殖壺菌屬EST存庫中單離的Na/Pi轉運子。編碼信號肽及eGFP之核苷酸序列係藉PCR融合，使用含eGFP之質體pPha-T1-eGFP(Apt等人，細胞科學期刊115：4061-4069(2002))，及三個引子設計來加上信號序列。第一PCR反應採用含eGfp之質體作為樣板，於eGfp 3’端之小引子(引子sec.Gfp3’Spe，含有SpeI位置，以斜體字顯示如下)，及旁出於eGfp 5’端及信號序列3’端之100bp引子(引子sec.Gfp5’1b,sec)。該等引子序列如下： 引子sec.Gfp5'1b： (SEQ ID NO：24)
引子sec.Gfp3'Spe：5'-CGTCACTAGTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC(SEQ ID NO：25)
於第二PCR反應中，使用第一PCR之擴增子產物作為樣板使用相同3’引子連同結合信號序列其餘部分之第二100bp 5’引子(sec.Gfp5’Bam)。第二5’引子序列含有BamHI位置(以斜體字顯示如下)且為下列：引子sec.Gfp5'Bam： (SEQ ID NO：26)
由本第二PCR反應所得PCR產物含有用於選殖之BamHI位置及SpeI位置。
第二PCR反應之擴增子及pSchizE皆係以BamHI及SpeI消化及彼此接合來形成載體pSchiz-sG。
實例3 裂殖壺菌屬蛋白質表現載體pSchiz-sGr之構成
pSchiz-sGr載體含有α-微管素啟動子、帶有編碼 ER保留信號之一序列之eGFP核苷酸序列、SV40終結子區、及已突變之ALS可選擇標記。
常見ER保留信號胺基酸序列HDEL經反轉譯，編 碼本保留信號之序列(SEQ ID NO：14)使用得自實例2之pSchiz-sG作為樣板，藉PCR而融合至eGFP。寡核苷酸引子設計為包括與中止密碼子(顯示為框起)同框架之HDEL編碼序列(於如下ss.eGfpHELD3’RV引子序列中下方劃線的反訊息補體)加上於一框架之BamHI位置(以斜體字顯示)及於另一個框架的EcoRV位置(以斜體字顯示)。
引子ss.eGfpHELD3'RV： (SEQ ID NO：27)
引子sec.Gfp5'Bam2： (SEQ ID NO：28)
所得PCR產物以BamHI及EcoRV消化及接合至以BamHI及EcoRV消化pSchizE(如實例1所述)獲得之較大型片段。所得載體定名為pSchiz-sGr(參考第7圖)。
實例4 裂殖壺菌蛋白質表現載體pSchiz-cG之構成
作為比較性對照，pSchiz-cG載體構成為可表現eGFP使得螢光產物將蓄積於細胞的胞質。pSchiz-cG質體包 含裂殖壺菌OrfC啟動子、編碼eGFP之多核苷酸序列、SV40終結子區、及已突變之裂殖壺菌屬ALS可選擇標記。
首先，裂殖壺菌屬ORFC上游的2000bp以得自裂殖壺菌種屬ATCC 20888之基因體DNA的引子進行PCR擴增：引子prREZ15：5'-CGGTACCCGCGAATCAAGAAGGTAGGC(SEQ ID NO：29)
引子prREZ16：5'-CGGATCCCGTCTCTGCCGCTTTTTCTT(SEQ ID NO：30)
prREZ15及prREZ16引子分別係含於KpnI及BamHI序列(斜體化)。所得擴增子係以BamHI及KpnI消化及藉凝膠純化。
其次，裂殖壺菌屬ORFC上游的1985bp以得自裂殖壺菌種屬ATCC 20888之基因體DNA的引子進行PCR擴增：引子prREZ17：5'-CGGATCCGAAAGTGAACCTTGTCCTAACCC(SEQ ID NO：31)
引子prREZ18：5'-CTCTAGACAGATCCGCACCATCGGCCG(SEQ ID NO：32)
prREZ17及prREZ18引子分別含有BamHI序列及 XbaI序列(斜體化)。所得擴增子係以BamHI及XbaI消化及藉凝膠純化。
其次，載體pBluescript SK(+)(史徹特基因 (Stratagene)，acc# X52328)以KpnI及XbaI消化及藉凝膠純化。本載體及如上產生的兩個擴增子全部同時接合而製造載體pREZ22。
然後載體pSchizE(實例1)以BamHI消化及以綠豆核酸酶處理，經管柱純化，以XbaI消化及然後經凝膠純化。然後以下列引子進行PCR來產生含eGFP編碼區之擴增子(使用樣板pPha-T1-eGFP)：引子5'eGFP_kpn：5'-GACTGGTACCATGGTGAAGCAAGGGCGAGGAG(SEQ ID NO：33)
引子3'eGFP_xba：5'-GACTTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC(SEQ ID NO：34)
然後本擴增子以XbaI消化及接合至前述pSchizE片段來形成載體pSchizE-eGFP。
然後以pREZ22作為樣板使用PCR來產生編碼ORFC之啟動子之擴增子。各自含有KpnI限剪序列(以斜體字顯示)之下列引子用於本PCR：引子5'ORFCproKpn-2：5'-GATCGGTACCGGTGTTCTTTGTTTTGATTTCT(SEQ ID NO：35)
引子3'ORFCproKpn-2：5'-GATCGGTACCGTCTCTGCCGCTTTTTCTTTA(SEQ ID NO：36)
然後本擴增子以KpnI消化。pSchizE-eGFP載體也以KpnI消化而產生二片段。較大的片段(7554bp)經凝膠純化及接合至如上經KpnI消化之擴增子來產生pSchiz-cG載體，其含有該裂殖壺菌屬ORFC啟動子序列接著為eGFP序列及SV40終結子區(參考第8圖)。
實例5 裂殖壺菌屬之轉形及隨後之蛋白質表現
除非另行指示，否則全部載體及構成體皆係使用適合給定的培養規模之奎亞貞(Qiagen)套件組(加州汎倫西亞)，於用於質體純化之大腸桿菌UltraMax DH5-α FT化學勝任細胞(英維仇貞，加州卡爾司貝)增殖。
裂殖壺菌種屬ATCC第20888號之培養係於M2B培養基生長，該培養基之組成為10克/升葡萄糖、0.8克/升(NH4)2SO4、5克/升Na2SO4、2克/升MgSO4˙7H2O、0.5克/升KH2PO4、0.5克/升KCl、0.1克/升CaCl2˙2H2O、0.1M MES(pH 6.0)、0.1% PB26金屬、及0.1%PB26維生素(v/v)。PB26維生素之組成為50毫克/毫升維生素B12、100微克/毫升噻胺、及100微克/毫升泛酸鈣。PB26金屬經調整至pH 4.5及其組成為3克/升FeSO4˙7H2O、1克/升MnCl2˙4H2O、800毫克/毫升ZnSO4˙7H2O、20毫克/毫升CoCl2˙6H2O、10毫克/毫升Na2MoO4˙2H2O、600毫克/毫升CuSO4˙5H2O、及800毫克/ 毫升NiSO4˙6H2O。PB26儲備溶液經分開過濾滅菌及於高壓蒸氣滅菌後添加至培養醪。於混合前，葡萄糖、KH2PO4、及CaCl2˙2H2O各自與其餘培養醪成分分開高壓蒸氣滅菌以防止鹽沈澱及碳水化合物的焦糖化。全部培養基成分皆係購自希格瑪化學公司(Sigma Chemical)(密蘇里州聖路易)。 裂殖壺菌屬培養生長至對數期及使用載體pSchiz-E1(實例1)、pSchiz-sG(實例2)、pSchiz-sGr(實例3)、或pSchiz-cG(實例4)，使用拜歐利提(Biolistic)粒子撞擊器(拜雷公司(BioRad)，加州赫克利斯)轉形。拜歐利提轉形程序大致上與前文說明相同(參考Apt等人，J.Cell.Sci.115(Pt 21)：4061-9(1996)及美國專利案第7,001,772號)。於27℃培養2日至6日後，一次轉形株於含20克/升瓊脂(VWR，賓州西契斯特)、10微克/毫升蘇佛美突隆(Sulfometuron)甲基(SMM)(化學服務公司(Chem Service)，賓州西契斯特)之固體M2B培養基上選擇。全部一次轉形株皆以人工轉移至含SMM之新鮮M2B平板上。
藉螢光顯微術及光學顯微術分析一次轉形株群 落。一次轉形株群落也用來接種50微升M2B-SMM液體培養基。於27℃培養2日至5日後，經由於5500 x g離心15分鐘收穫培養物。不含細胞之上清液使用桑翠普(Centriprep)重力濃縮機(密里波(Millipore)，麻省比雷瑞卡)濃縮100倍，及細胞丸粒於水中洗滌及於液態氮中冷凍隨後再懸浮於丸粒重量兩倍之溶解緩衝液(組成為50mM磷酸鈉(pH 7.4)、1mM EDTA、5%甘油、及1mM新鮮苯基甲基磺醯氟)及丸粒重量 兩倍的0.5毫米玻璃珠(希格瑪，密蘇里州聖路易)。然後細胞丸粒混合物經由於多管渦旋器(VWR，賓州西契斯特)以最大速度於4℃渦旋3小時(h)而溶解。然後細胞溶解產物於於4℃於5500 x g離心10分鐘。保留上清液及於4℃於5500 x g再離心10分鐘。所得上清液於此處定義為「不含細胞之萃取物」。不含細胞之上清液及不含細胞之萃取物二者之蛋白質使用布萊佛檢定分析套件組(希格瑪，密蘇里州聖路易)定量，及於載荷至4-12%聚丙烯醯胺Bis-Tris凝膠(拜雷，加州赫克利斯)前，根據製造商之指示(拜雷，加州赫克利斯)與XT樣本緩衝液呈混合物沸騰。
SDS-PAGE凝膠係使用庫馬希染料染色或藉西 方墨點移轉至PVDF。於打點之後，PVDF膜以經Tris緩衝之食鹽水(TBS)(希格瑪，密蘇里州聖路易)清洗及於室溫以5%脫脂乾乳(NFDM)於TBS處理2小時。對感興趣之蛋白質具有專一性之一次抗體根據製造商指示於5% NFDM-TBS中稀釋。若有所需，此溶液經移出，以新鮮5% NFDM-TBS替代，該NFDM-TBS中添加綴合至鹼性磷酸酶且對第一抗體具有專一性之二次抗體。若未使用二次抗體，則一次抗體已經綴合至鹼性磷酸酶。然後經抗體處理之PVDF以TBS清洗及以5-溴-4-氯-3-吲哚醯基磷酸/硝基藍四唑鎓溶液(BCIP/NBT)(KPL，馬里蘭州蓋茲堡)處理。
如第9圖所示，以pSchizGr轉形之裂殖壺菌屬具 有eGFP位在ER(也參考第10圖)，而以pSchizcG轉形之裂殖壺菌屬顯示eGFP遍布於胞質。以pSchizE轉形之裂殖壺菌屬 (空白載體對照組)未顯示eGFP之表現。如第11圖所示，eGFP係於不含細胞之上清液樣本(亦即胞外)檢測，以及對以pSchiz-sG轉形之裂殖壺菌屬於不含細胞之萃取物中檢測。以pSchiz-sGr轉形之裂殖壺菌屬於不含細胞之萃取物中含有eGFP，及於不含細胞之上清液中含有eGFP至較少程度。最後，以pSchizcG轉形之裂殖壺菌屬排它地幾乎皆係含有eGFP於不含細胞之萃取物。
實例6 Sec1信號肽之識別
裂殖壺菌屬之基因體序列事先產生，組裝及格式化用於使用工業標準技術進行BLAST搜尋。得自於氮氣充滿條件下生長的裂殖壺菌屬培養上清液經濃縮及於SDS-PAGE上跑。由凝膠上切下主分泌蛋白質帶及用於胺基酸定序。經由所得胺基酸序列與裂殖壺菌屬基因體之BLAST比較(演繹法則-tBLASTn，低複雜度過濾-關，預期-1000，矩陣-PAM30，無間隙校準-開)，識別相對應之ORF。ORF之5’部分使用SignalP演繹法則分析。例如參考Bendsten等人，J,Mol.Biol.340：783-795(2004)；Nielsen及Krogh，Proc.Int.Conf.Intell.Syst.Mol.Biol.6：122-130(1998)；Nielsen等人，蛋白質基因改造12：3-9(1999)；Emanuelsson等人，自然方案2：953-971(2007)。Sec1蛋白質之5’區根據本分析識別為分泌信號。參考第12圖(包含SEQ ID NO：37)及第13圖(SEQ ID NO：38)。
實例7 裂殖壺菌屬載體pSchiz-Cpt之構成
pSchiz-Cpt載體含有OrfC啟動子及終結子及ALS可選擇標記。簡言之，經由首先以KpnI/XbaI消化pSchizE質體及凝膠純化所得6.89kb片段而構成本載體。此消化也獲得自pSchizE質體中移除微管素啟動子及大部分多聯結子；ALS編碼序列維持完好。所得6.8kb SchizE主鏈內部接合4kb KpnI/XbaI片段，其含有裂殖壺菌屬OrfC上游之2kb序列加裂殖壺菌屬OrfC下游之2kb序列且有BamHI位置分開上游節段與下游節段。自質體pREZ22切下4kb KpnI/XbaI片段(參考實例4)。6.8kb pSchizE主鏈與4kb KpnI/XbaI片段的接合獲得pSchiz-Cpt。
實例8 裂殖壺菌屬蛋白質表現載體pSchizCpt-s1eGFP之構成
pSchizCpt-s1eGFP質體包含裂殖壺菌屬OrfC啟動子、eGFP編碼序列前方之Sec1信號序列、及OrfC終結子及已突變之裂殖壺菌屬ALS可選擇標記序列。參考第14圖。本質體也定名為pCL0001，及2008年11月18日，寄存於美國種型培養物保藏所，專利寄存館，維吉尼亞州20110-2209曼納沙司，大學大道10801號，獲得ATCC存取號碼PTA-9615。
實例9 於發酵槽藉裂殖壺菌屬表現及分泌eGFP
如實例5所述，裂殖壺菌屬細胞以pSchizCpt-s1eGFP轉形(參考實例8)。SMM抗性細胞系於 M2B瓊脂平板上單離及轉移入振搖瓶的M2B液體培養(含10微克/毫升SMM)內及於27.5℃使用於150rpm之振搖培養。培養72小時至168小時後，藉離心(5000 x g 10分鐘)收穫培養物，不含細胞之上清液使用桑翠普及麥可康(Microcon)濃縮器(MWCO 10000)濃縮(約250倍)樣本(1微升至7微升)於SDS-PAGE上跑，分離的蛋白質移轉至PVDF膜上。經阻斷且經過洗滌之膜以兔抗-eGFP IgG(拜維森(Biovision))探測，經由使用鹼性磷酸酶綴合山羊抗兔IgG(fc)(波米迦)探測及使用BCIP/NBT試劑處理讓反應性蛋白質帶變成目測可見。選出表現最高量eGFP之細胞系。
高製造細胞系中之一者於2.0升(工作體積)發酵槽培養。有擋板的接種物瓶含有150毫升HD1培養基，於29.5℃培養24小時至48小時伴以於200rpm振搖。接種物培養用來接種發酵槽含有：50克/升葡萄糖、13.62克/升Na2SO4、0.72克/升K2SO4、0.56克/升KCl、2.27克/升MgSO4.7H2O、1.8克/升KH2PO4、17.5克/升(NH4)2SO4、0.19克/升CaCl2.2H2O、51.5毫克FeSO4.7H2O、3.1克/升MnCl2.4H2O、6.2克/升ZnSO4.7H2O、0.04毫克CoCl2.6H2O、0.04毫克Na2MoO4、2.07克/升CuSO4.5H2O、2.07克/升NiSO4.6H2O、9.75毫克噻胺、0.16毫克維生素B12、及3.33毫克泛酸鈣。培養期間之溫度為29.5℃，dO2%控制於20%，葡萄糖濃度維持於15-20克/升(一旦初濃度落入於此範圍及pH維持於6.5)。於一定間隔以無菌方式移出樣本進行分析。
不含細胞上清液(含有0.5微克至5.0微克總蛋白 質)之未經濃縮樣本藉SDS-PAGE分離，蛋白質移轉至PVDF膜。經阻斷且經洗滌之膜如前文說明探測分泌的eGFP。參考第15圖。
實例10 裂殖壺菌屬蛋白質表現載體pSchizCpt-s1kappabh之構成
pSchizCpt-s1kappabh質體包含裂殖壺菌屬OrfC啟動子、編碼IgG κ亞單位之多核苷酸序列前方之Sec1信號序列，及OrfC終結子區及已突變之裂殖壺菌屬ALS可選擇標記序列(參考第16圖)。表現載體係如下製造：編碼IgG κ鏈之再合成的(密碼子-經最佳化的)基因係使用第42圖之密碼子使用表而自藍喜隆生技公司(Blue Heron Biotechnologies)出品的相對應胺基酸序列製造，5’Sec1分泌信號序列係選殖入orfC啟動子與orfC終結子間之質體pSchiz-Cpt。簡言之，載體pSchiz-Cpt係根據酶製造商指示(新英格蘭生物實驗室(New England Biolabs))以BamHI及鹼性磷酸酶消化。此載體接合至以BglII(NEB)消化之擴增子，及該擴增子係使用下列引子：引子5'ss-X Bgl long：GACTagatctATGAAGTTCGCGACCTCG(SEQ ID NO：39)
引子3'ritx_kap_bh_Bgl：gactagatctTCAGCACTCACCGCGGTTAAAGG(SEQ ID NO：40)
及藍喜隆生技公司提供的樣板形成，該樣板載有合成最佳 化之DNA分子其含有Sec1信號肽之多核苷酸序列接著為κ多核苷酸序列(SEQ ID NO：41)。所得細菌性轉形株群落篩檢載體插子，適當校準用於表現。撿拾一個純株(定名為pSchizCPT-s1kappabh)用於進一步分析，驗證序列及用於裂殖壺菌屬之轉形。
實例11 藉裂殖壺菌屬表現及分泌抗體亞單位κ 轉形株細胞系之生成
裂殖壺菌種屬ATCC 20888於含50毫升M2B培養基之250毫升振搖瓶內於27℃培養24小時。於600奈米測量吸光率，具有吸光率值為1體積相當於1毫升之培養於8,000 x g離心5分鐘。細胞丸粒懸浮於100微升M2B，以2厘米直徑圓展開於M2B瓊脂平板上。
平板含有展開的裂殖壺菌屬細胞之區以1100Psi壓力使用經pSchizCptS 1kappa(以XbaI線性化)的M10珠粒撞擊。
撞擊後，M2B平板於27℃培養16小時，拾取長在裂殖壺菌屬展布平板中心的群落及展開於含10微克/毫升SMM之M2B平板。經24小時至72小時後，拾取20個群落及接種於25毫升培養管內含10毫克/毫升SMM之5毫升M2B。培養管係於27℃於135rpm培養72小時。
κ表現之檢測
選出如上所得十個最混濁的振搖瓶培養物接受表現分析。250毫升燒瓶內含10微克/毫升SMM之M2B 50毫 升接種0.5毫升得自培養管之培養。培養物於27℃以於135rpm之振搖培養24小時，隨後經由於5500 x g離心10分鐘分離細胞丸粒及不含細胞之上清液。
細胞丸粒懸浮於40毫升dH2O，於5500 x g離心10 分鐘然後懸浮於其濕重兩倍的萃取緩衝液。添加丸粒濕重兩倍的玻璃珠及培養管於4℃振搖3小時。所得細胞均化物於5000 x g離心10分鐘及保留上清液作為不含細胞之萃取物。
不含細胞之上清液使用桑翠普及麥可康濃縮機 (亞米康(Amicon))具有10000分子量截留自約50毫升濃縮至大於200微升。
所選定之各轉形株之蛋白質(不含細胞之萃取物 及已濃縮之不含細胞之上清液)3微克於4-12% Bis Tris SDS PAGE(艾克里提昂(xt criterion)，拜雷公司)使用MOPS流動緩衝液於200伏特跑約45分鐘(直到染料鋒剛剛跑出凝膠底部之外)。使用紐沛吉(Nupage)轉移緩衝液於70伏特將蛋白質帶移轉至PVDF膜歷90分鐘。膜以5%(w/v)乳粉於含0.1%吐溫(Tween)20之TBS中封阻，使用鹼性磷酸酶綴合抗人κ IgG(希格瑪公司)透過西方墨點法定位抗體亞單位κ。以BCIP/NBT磷酸鹽酶基質(KPL)讓陽性帶變成目測可見。
抗體亞單位κ可清晰檢測主要係得自如前述培養 的振搖瓶培養物之不含細胞的上清液(參考第17圖)。κ蛋白質出現於不含細胞之上清液且具有與真正κ標準品無法區別之分子量係符合分泌κ亞單位及進行適當後轉譯改性 (Sec1分泌信號的裂解)。
實例12 藉裂殖壺菌屬於發酵槽表現抗體亞單位κ 培養
顯然可表現最高量胞外κ亞單位之兩株純株(1及3)於2.0升(工作體積)發酵槽內培養。有擋板之接種瓶含有150微升HD1培養基及於29.5℃培養24小時至48小時伴以於200rpm之振搖。用於接種發酵槽之接種培養物含有：50克/升葡萄糖、13.62克/升Na2SO4、0.72克/升K2SO4、0.56克/升KCl、2.27克/升MgSO4.7H2O、1.8克/升KH2PO4、17.5克/升(NH4)2SO4、0.19克/升CaCl2.2H2O、51.5毫克FeSO4.7H2O、3.1克/升MnCl2.4H2O、6.2克/升ZnSO4.7H2O、0.04毫克CoCl2.6H2O、0.04毫克Na2MoO4、2.07克/升CuSO4.5H2O、2.07克/升NiSO4.6H2O、9.75毫克噻胺、0.16毫克維生素B12、及3.33毫克泛酸鈣。培養期間之溫度為29.5℃，dO2%控制於20%，葡萄糖濃度維持於15-20克/升，一旦初濃度落入於此範圍，及pH維持於6.5。樣本係以間隔時間以無菌方式移出接受分析。
κ表現之檢測
不含細胞之上清液未經濃縮進行分析，使用布萊佛方法(希格瑪布萊佛試劑)以BSA作為標準品測定總蛋白質。驗證κ亞單位表現之西方分析係如前文對振搖瓶培養所述進行。
κ表現之定量係使用人κ-B+F Elisa定量套件組 (比席爾實驗室公司(Bethyl Laboratories Inc.))及福洛歐美加(Fluoro Omega)平板讀取器(BMG萊柏泰克公司(BMG Labtech))進行，皆係根據製造商的指示進行。參考第18圖。
實例13 pAB0011表現載體之構成
使用萃取自裂殖壺菌種屬ATCC 20888之gDNA作為樣板，使用下列引子進行PCR來形成長2015bp之擴增子：5' 60S-807：TCGATTTGCGGATACTTGCTCACA(SEQ ID NO：47)
3' 60S-2821：GACGACCTCGCCCTTGGACAC(SEQ ID NO：48)
此擴增子經凝膠純化及用作為樣板用於隨後使用下列引子之PCR：5' 60Sp-1302-Kpn：GACTggtaccTTTTTCCGCTCTGCATAATCCTAA(SEQ ID NO：49)
3' 60Sp-Bam：GACTggatccTTGGCTTTTTCTTTCTTGTTGC(SEQ ID NO：50)
所得1017bp擴增子經純化，以KpnI及BamHI消化及接合至pSchiz-CPT(+)-s1GFP(6h)，該載體先前經純化且以KpnI及BamHI消化。接合產物用於轉形大腸桿菌，質體經純化及藉得自所得群落之限剪消化物產物篩檢。具有 預期之限剪消化物樣式及包括60S長啟動子之一個質體純株(#4.1)係藉珊哲(Sanger)定序驗證及命名為pAB0011用於裂殖壺菌屬之轉形。參考第24圖。該載體pAB0011係於2008年11月18日，寄存於美國種型培養物保藏所，專利寄存館，維吉尼亞州20110-2209曼納沙司，大學大道10801號，獲得ATCC存取號碼PTA-9614。
實例14 pAB0018表現載體之構成
使用萃取自裂殖壺菌種屬ATCC 20888之gDNA作為樣板，使用下列引子進行PCR來形成長2268bp之擴增子：5' EF1-68：CGCCGTTGACCGCCGCTTGACTCT(SEQ ID NO：51)
3' EF1-2312：CGGGGGTAGCCTCGGGGATGGACT(SEQ ID NO：52)
此擴增子經凝膠純化及用作為樣板用於隨後使用下列引子之PCR：5' EF1-54-Kpn：GACTggtaccTCTTATCTGCCTCGCGCCGTTGAC(SEQ ID NO：53)
3' EF1-1114-Bam：GACTggatccCTTGCTTGCTAGTAGTCGCTTTCGAAC(SEQ ID NO：54)
所得1060bp擴增子經純化，以KpnI及BamHI消 化及接合至pSchiz-CPT(+)-s1GFP(6h)，該載體先前經純化且以KpnI及BamHI消化。接合產物用於轉形大腸桿菌，質體經純化及藉得自所得群落之限剪消化物產物篩檢。具有預期之限剪消化物樣式及包括EF-1長啟動子之一個質體純株(#6.1)係藉珊哲定序驗證及命名為pAB0018用於裂殖壺菌屬之轉形。參考第25圖。該載體pAB0018係於2008年11月18日，寄存於美國種型培養物保藏所，專利寄存館，維吉尼亞州20110-2209曼納沙司，大學大道10801號，獲得ATCC存取號碼PTA-9616。
實例15 pAB0022表現載體之構成
裂殖壺菌屬培養物之不含細胞的上清液藉SDS-PAGE分析，及由此選出單一蛋白帶標示為Sec1p(表示Sec1蛋白質)選用來純化至均質。此蛋白質之胜肽片段序列使用質譜技術識別，及使用BLAST演繹法則(tBLASTn，無間隙校準，低複雜度過濾OFF，預期=10000，矩陣=PAM30)(ftp：//ncbi.nlm.nih.gov/blast)與裂殖壺菌屬全基因體序列之構想轉譯交互關聯。識別編碼全部胜肽序列之一個開放讀碼框及標示為Sec1g(表示Sec1基因)。於起始ATG上游的推定之啟動子序列也經識別與合成(藍喜隆生技公司)。含有合成Sec1g啟動子之載體使用下列引子用作為PCR之樣板：5' Sec1P-kpn：GACTggtaccCCGTCCTTGACGCCTTCGC(SEQ ID NO：55)
3' Sec1P-bam：GACTggatccGATGAGTAATGGACGATCTTC(SEQ ID NO：56)
所得1438bp擴增子經純化，以KpnI及BamHI消化及接合至pSchiz-CPT(+)-s1GFP(6h)，該載體先前經純化且以KpnI及BamHI消化。接合產物用於轉形大腸桿菌，質體經純化及藉得自所得群落之限剪消化物產物篩檢。具有預期之限剪消化物樣式及包括Sec1啟動子之一個質體純株(#8.1)係藉珊哲定序驗證及命名為pAB0022用於裂殖壺菌屬之轉形。參考第26圖。該載體pAB0022係於2008年11月18日，寄存於美國種型培養物保藏所，專利寄存館，維吉尼亞州20110-2209曼納沙司，大學大道10801號，獲得ATCC存取號碼PTA-9613。
實例16 異源基因之轉錄
編碼延長因子1(EF1)及60S核糖體單元之基因之啟動子選用作為於裂殖壺菌屬異源基因轉錄的啟動子。搜尋裂殖壺菌屬之基因體序列，識別對二基因已公告之序列顯示同源性之基因。各啟動子之二版本(一短一長)透過PCR選殖。
SEC1基因之啟動子驅動表現也選用作為於裂殖壺菌屬中異源基因轉錄之啟動子。由於SEC1基因編碼至目前為止唯一識別於裂殖壺菌屬培養中之天然分泌的經糖化蛋白質，故此種啟動子可時間表現異源蛋白質至最適合用 於製造分泌的已糖化蛋白質之生長期。
含有S1eGFP構成體(亦即於N端有SEC1分泌信號之eGFP基因，藉OrfC啟動子-載體CL0001驅動表現)之載體cpt(+)係經修改來切除OrfC啟動子，且以下列序列中之一者置換此元體：EF1啟動子(短版本)=EF1-S得自載體AB0015
EF1啟動子(長版本)=EF1-L得自載體AB0018
60S啟動子(短版本)=60S-S得自載體AB0010
60S啟動子(長版本)=60S-L得自載體AB0011
SEC1啟動子=Sec1得自載體AB0022
裂殖壺菌種屬20888透過如前文說明之粒子撞擊各以5個載體轉形。隨機選定各個轉形之十個可存活細胞系用於分析。對5個載體各自進行以CL0001轉形來作為對照。隨機選出以CL0001轉形之5個可存活細胞系用於分析。
轉形株細胞系於含50毫升M2B之250毫升振搖瓶內於29.5℃培養72小時，伴以於200rpm連續振搖。經由於5000 x g離心10分鐘移出生質，不含細胞之上清液使用桑翠普離心機(MWCO 10000)濃縮至約1毫升。使用布萊佛方法測量不含細胞之上清液樣本之蛋白質濃度。
整份不含細胞之上清液於還原條件下於SDS丙烯醯胺凝膠(艾克里提昂)上分離，分離所得蛋白質帶移轉至PVDF膜上。eGFP使用與AP綴合之抗eGFP抗體檢測及使用NCIP/NBT試劑變成目測可見。
於各線道分離最大量已濃縮之上清液(7微升)來 測定哪一個細胞系表現及分泌eGFP(表1)。雖然eGFP之表現程度於多個啟動子間各異，及對個別啟動子於多個細胞系間各異，但33細胞系(得自對所比較之6個啟動子分析55細胞系)顯示可表現eGFP(資料未顯示)。
雖然並非全部細胞系皆表現分泌的eGFP，但至 少約半量細胞系確實產生可檢測濃度之eGFP，各個啟動子可指導eGFP的表現。
發現可表現與分泌eGFP之細胞系經進一步分析 來比較相對啟動子長度。得自各培養物之不含細胞的上清液且測定可表現eGFP之蛋白質載荷至SDS丙烯醯胺凝膠上，且經規度化成為每個線道1微克。蛋白質藉電穿孔分離，已分離之蛋白質移轉至PVDF膜及使用如前文說明之經AP綴合之抗eGFP抗體探測eGFP。參考第27圖。載荷於初步篩檢eGFP之上清液蛋白質數量比較用於產生第27圖之實驗中之用量約大十倍。如此，異源性eGFP蛋白質於第27圖之全部線道皆不顯著，原因在於於載荷進行實驗的蛋白質濃度，其對若干樣本係低於檢測濃度。於1微克蛋白質/線道之負載量，得自OrfC啟動子之分泌的eGFP之表現係低於可檢測極限。但於至少若干所產生之細胞系中由全部其它啟動子驅動的eGFP之表現為可檢測。如此驗證比較OrfC啟動子，所選出之啟動子亦即EF1、60S及SEC1皆為「強」啟動 子。特定言之，於得自EF1-L轉形株之某些細胞系中，可見分泌的eGFP之表現係大於任何其它啟動子構成體之表現，指示此種啟動子為所測試的啟動子中最強而有力者。
經由於螢光顯微鏡檢下觀察於EF1-L轉形株細胞 系AB0018-9及AB0018-10中之表現且與典型OrfC轉形株之表現做比較，獲得EF1-L啟動子強度之證實。參考第28圖。 而CL0001-4細胞系具有溫和螢光(Fluo：ISO 200 1.1秒平板)，AB0018-9及AB0018-10細胞系具有顯著螢光，指示胞內eGFP之實質上蓄積。
實例17 於裂殖壺菌屬之糖化側寫資料
測定天然裂殖壺菌屬蛋白質之N-糖化。發現裂殖壺菌屬與哺乳動物及昆蟲之糖化徑路有共用的步驟，且未觀察得利用酵母之高甘露糖化徑路特性。第29圖及第30圖顯示藉裂殖壺菌屬分泌蛋白質之質譜術分析檢測得之聚糖結構。特定言之，觀察得特性峰，GlcNAc2Man5於m/z 1580、GlcNAc2Man6於m/z 1785、及GlcNAc2Man7於m/z 1991。
實例18 藉電穿孔轉形裂殖壺菌屬
裂殖壺菌種屬ATCC 20888細胞於振搖器上於M50-20培養基(參考美國公告案第2008/0022422號)於200rpm於29℃生長48小時。細胞於新鮮培養基稀釋1：100及生長隔夜。細胞經離心及再懸浮於1M甘露糖醇及10mM CaCl2(pH 5.5)至2 OD600單位之終濃度。5毫升細胞混合0.25 毫克/毫升蛋白酶XIV(希格瑪化學公司)及於振搖器上培養4小時。細胞以10%冰冷甘油洗兩次及再懸浮於500微升冷10%甘油。90微升整份置於預先經過冷激之0.2厘米間隙電透光管(拜雷165-2086)。添加10微升DNA(1-5微克)至透光管，溫和混合及維持於冰上。細胞於200歐姆(電阻)、25微法拉第(μF)、及自0伏特至500伏特(用於0.1厘米透光管間隙距離)或500伏特(用於0.2厘米透光管間隙距離)範圍之電壓，細胞於重組載體電穿孔。即刻添加0.5毫升培養基至透光管。然後細胞移至4.5毫升M50-20培養基及於振搖器上於100rpm培養2至3小時。細胞經離心及再懸浮於0.5毫升培養基，及以適當選擇(若有所需)接種至2片至5片M2B平板上及於29℃培養。
表2顯示於以不同酶組合物前處理(300伏特及 0.1厘米透光管間隙距離參數)後所產生之裂殖壺菌種屬ATCC 20888轉形株之數目。
表3顯示於以不同酶組合物及電壓前處理(0.1厘 米透光管間隙距離)後所產生之裂殖壺菌種屬ATCC 20888轉形株之數目。
表4顯示使用不同電穿孔透光管間隙距離所產生 之裂殖壺菌種屬ATCC 20888轉形株之數目。細胞係以0.25毫克/毫升蛋白酶XIV前處理。
表5顯示使用不同電穿孔電壓所產生之裂殖壺菌 種屬ATCC 20888轉形株之數目。細胞係使用0.1毫克/毫升，蝸牛丙酮粉末(Snail Acetone Powder)+0.25毫克/毫升蛋 白酶XIV(0.1厘米透光管間隙距離)前處理。
實例19 反錄酶於裂殖壺菌屬之表現
載體pAB0018以BamHI及NdeI消化，獲得長838bp及9879bp之片段。9879bp片段於瓊脂凝膠藉標準電穿孔技術分選，使用商用DNA純化套件組純化，及接合至一序列(SEQ ID NO：57)，該序列包含編碼裂殖壺菌屬Sec1蛋白質之天然分泌信號之多核苷酸序列，接著為編碼釀酒酵母之成熟反錄酶蛋白質(SUC2)之合成序列，該SUC2係經密碼子最佳化用於裂殖壺菌屬表現(參考第42圖)。含有Sec1信號肽編碼序列及釀酒酵母反錄酶蛋白質編碼序列之一融合序列插入裂殖壺菌屬載體pSchiz，接著以BamHI及NdeI消化來獲得SEQ ID NO：57。
接合產物用來使用製造商之方案轉形市面上供應的勝任DH5α大腸桿菌細胞株系(英維仇貞公司)。若干所得純株經過增殖，其質體經萃取及純化。然後此等質體藉限剪消化或PCR篩檢來驗證接合產生預期的質體載體。由與SEQ ID NO：57接合所得之一個此種質體載體係藉珊哲定序證實及命名為pCL0076(SEQ ID NO：58)。參考第31圖。
裂殖壺菌種屬ATCC 20888及遺傳改性裂殖壺菌屬衍生物標示為B76-32之培養物於M2B培養基生長，該培養基之組成為10克/升葡萄糖、0.8克/升(NH4)2SO4、5克/升Na2SO4、2克/升MgSO4˙7H2O、0.5克/升KH2PO4、0.5克/升KCl、0.1克/升CaCl2˙2H2O、0.1M MES(pH 6.0)、0.1% PB26金屬、及0.1%PB26維生素(v/v)。PB26維生素之組成為50毫 克/毫升維生素B12、100微克/毫升噻胺、及100微克/毫升泛酸鈣。PB26金屬調整至pH 4.5及其組成為3克/升FeSO4˙7H2O、1克/升MnCl2˙4H2O、800毫克/毫升ZnSO4˙7H2O、20毫克/毫升CoCl2˙6H2O、10毫克/毫升Na2MoO4˙2H2O、600毫克/毫升CuSO4˙5H2O、及800毫克/毫升NiSO4˙6H2O。PB26儲備溶液經分開過濾滅菌及於高壓蒸氣滅菌後添加至培養醪。葡萄糖、KH2PO4、及CaCl2˙2H2O各自係與培養醪之其餘成分分開高壓蒸氣滅菌，隨後混合以防鹽沈澱及碳水化合物焦糖化。全部培養基成分皆係購自希格瑪化學公司(密蘇里州聖路易)。株系B76-32為根據美國專利案第7,211,418號及美國專利公告案第2008/0022422及2008/0026434號基因改造之裂殖壺菌種屬ATCC 20888之衍生物。
裂殖壺菌種屬ATCC 20888及B76-32之培養物生 長至對數期，及使用電穿孔以後文說明之帶有酶前處理以載體pCL0076轉形。
帶有酶前處理之電穿孔-細胞於振搖器上於50毫 升M50-20培養基(參考美國公告案第2008/0022422號)於200rpm於30℃生長2日。細胞以1：100稀釋入M2B培養基(參考下段)及生長隔夜(16小時至24小時)，意圖達到對數生長中期(OD600為1.5-2.5)。細胞於約3000 x g於50毫升錐形管離心5分鐘。移出上清液及細胞再懸浮於適當體積之1M甘露糖醇、pH 5.5來達2 OD600單位之終濃度。5毫升細胞整份添加至25毫升振搖瓶內，使用10mM CaCl2(1.0M儲備溶液，過 濾滅菌)及0.25毫克/毫升蛋白酶XIV(10毫克/毫升儲備溶液，過濾滅菌；希格瑪-亞利須公司(Sigma-Aldrich)，密蘇里州聖路易)改性。振搖瓶於振搖器上於30℃及約100rpm培養4小時。細胞於顯微鏡下監視測定原生質體化程度，期望為單細胞。細胞於圓底試管(亦即14毫升法爾康(Falcon)試管，BD生科公司，加州聖荷西市)於2500 x g離心5分鐘。 移出上清液，細胞以5毫升冰冷10%甘油溫和再懸浮。細胞於圓底試管於約2500 x g再離心5分鐘。移出上清液及細胞使用廣口徑滴量管梢端以500微升冰冷10%甘油溫和再懸浮。90微升細胞計量入經過預冷激之電透光管(基因帕塞(Gene Pulser)透光管-0.1厘米間隙或0.2厘米間隙，拜雷公司，加州赫克利斯)。1微克至5微克DNA(小於或等於10微升體積)添加至透光管，以滴量管梢端溫和混合及置於冰上5分鐘。細胞於200歐姆(電阻)、25微法拉第(電容)、及250伏特(用於0.1厘米間隙)或500伏特(用於0.2厘米間隙)電穿孔。0.5毫升M50-20培養基即刻添加至透光管。然後細胞移轉入25毫升振搖瓶之4.5毫升M50-20培養基內，及於振搖器上於30℃及約100rpm培養2小時至3小時。細胞於圓底試管內於2500 x g離心5分鐘。移出上清液及細胞丸粒再懸浮於0.5毫升M50-20培養基。細胞以適當選擇(若有所需)接種於適當數目的(2至5個)M2B平板上及於30℃培養。
選出轉形株用於M2B+SMM培養基生長，或經由 接種於MSFM+蔗糖上直接選擇於蔗糖上生長。用於MSFM+蔗糖選擇，經1週至2週後，群落再度接種，伴以數次於含 新鮮蔗糖的培養基上繼代培養。測定反錄酶之表現可用作為破囊壺菌群落於蔗糖作為唯一碳源上生長的可選擇標記。
用於下列實驗，於27℃培養2日至6日後，選出一 次轉形株用來於含20克/升瓊脂(VWR，賓州西契斯特)、10微克/毫升SMM(化學服務公司，賓州西契斯特)之固體M2B培養基上生長。全部一次轉形株以手動移轉至含SMM之新鮮M2B平板。一週後，群落移至不含SMM之MSFM及5克/升蔗糖。1週後，最大的群落移轉至新鮮MSFM/蔗糖培養基平板。選出10個於蔗糖上生長之裂殖壺菌種屬ATCC 20888轉形株用於進一步決定特徵且分別標示為1-1、1-3、1-24、3-1、3-2、3-5、3-21、4-1、4-24、及4-31。選出於蔗糖上生長之B76-32轉形株中之九株接受進一步特徵化及標示為B76-32#2、#12、#19、326、#30、#39、#42、#56、及#61。
於蔗糖上生長之群落(1-1、1-3、1-24、3-1、3-2、 3-5、3-21、4-1、4-24、4-31)使用接種環自平板上移出，移轉入含5毫升蔗糖培養基之培養試管內，及於振搖器上於29℃生長4日。2毫升此培養物用於接種250毫升燒瓶內之50毫升培養基(MSFM或SSFM)及於29℃於振搖器上於200rpm生長。
親代株系裂殖壺菌種屬ATCC 20888之對照瓶係以相同方式但使用含蔗糖之培養基生長。7日後收穫細胞。細胞經離心及以50%異丙醇：蒸餾水混合物洗滌。已丸粒化之細胞經凍乾，稱重，及進行脂肪酸甲酯(FAME)分析。 裂殖壺菌種屬ATCC 20888或B76-32之CL0076轉形株之生長及脂肪含量係如先前於美國公告案第2008/0022422號(全文以引用方式併入此處)所述藉重量分析及已衍生油類之氣相層析術檢定分析。結果示於表6至表9。得自轉形株及親代株系之振搖瓶培養物之丸粒的乾重及脂肪含量顯示於第32圖至第37圖。
SSFM培養基：50克/升蔗糖或葡萄糖，13.6克/ 升Na2SO4、0.7克/升K2SO4、0.36克/升KCl、2.3克/升MgSO4˙7H2O、0.1M MES(pH 6.0)、1.2克/升(NH4)2SO4、0.13克/升麩胺酸一鈉、0.056克/升KH2PO4、及0.2克/升CaCl2˙2H2O。維生素係以1毫升/升自儲備溶液添加，儲備溶液之組成為0.16克/升維生素B12、9.7克/升噻胺、及3.3克/升泛酸鈣。微量金屬係以2毫升/升自儲備溶液添加，儲備溶液之組成為1克/升檸檬酸、5.2克/升FeSO4˙7H2O、1.5克/升MnCl2˙4H2O、1.5克/毫升ZnSO4˙7H2O、0.02克/毫升CoCl2˙6H2O、0.02克/毫升Na2MoO4˙2H2O、1.0克/毫升CuSO4˙5H2O、及1.0克/毫升NiSO4˙6H2O調整至pH 2.5。
改性SFM(MSFM)培養基：10克/升葡萄糖或蔗 糖，25.0克/升NaCl、1.0克/升KCl、0.2克/升(NH4)2SO4、5克/升、5.0克/升MgSO4˙7H2O、0.1克/升KH2PO4、0.3克/升CaCl2˙2H2O、0.1M HEPES(pH 7.0)、0.1% PB26金屬、及0.1% PB26維生素(v/v)。維生素係以2毫升/升自儲備溶液添加，儲備溶液之組成為0.16克/升維生素B12、9.7克/升噻胺、及3.3克/升泛酸鈣。微量金屬係以2毫升/升自儲備溶液添加， 儲備溶液之組成為1克/升檸檬酸、5.2克/升FeSO4˙7H2O、1.5克/升MnCl2˙4H2O、1.5克/毫升ZnSO4.7H2O、0.02克/毫升CoCl2˙6H2O、0.02克/毫升Na2MoO4˙2H2O、1.0克/毫升CuSO4˙5H2O、及1.0克/毫升NiSO4˙6H2O調整至pH 2.5。
表6顯示於含葡萄糖、果糖、蔗糖或未添加碳源 之MSFM中生長之裂殖壺菌種屬ATCC 20888之生長及脂肪含量。
表7顯示於含葡萄糖之MSFM培養基(對照)生長 之裂殖壺菌種屬ATCC 20888及於含蔗糖之MSFM培養基生長之裂殖壺菌種屬ATCC 20888轉形細胞系之乾重及%脂肪酸。
表8顯示於含葡萄糖之SSFM培養基(對照)生長 之裂殖壺菌種屬ATCC 20888及於含蔗糖之SSFM培養基生長之裂殖壺菌種屬ATCC 20888轉形細胞系之乾重及%脂肪酸。
表9顯示於含葡萄糖之SSFM培養基(對照)生長 之裂殖壺菌屬B76-32及於含蔗糖之SSFM培養基生長之裂殖壺菌屬B76-32轉形細胞系之乾重及%脂肪酸。
DW=乾重
FA=脂肪酸
DW=乾重
FA=脂肪酸
DW=乾重
FA=脂肪酸
DW=乾重
FA=脂肪酸
免疫墨點-於SSFM生長3日之50毫升振搖瓶培養物之不含細胞之上清液(參考美國公告案第2008/0022422號)係於培養物於5000 x g離心後收集。培養上清液直接用於 SDS-PAGE，或使用裝配有可滲透膜允許比10kDa更重的全部組分濃縮之市售濃縮機濃縮50倍至100倍。總蛋白質濃度藉布萊佛檢定分析(拜雷公司)測量。然後遵照標準免疫墨點法程序(Sambrook等人)藉免疫墨點分析證實反錄酶之表現。簡言之，於bis-tris凝膠(英維仇貞，美國加州卡爾司貝)上藉SDS-PAGE分離蛋白質(0.625微克至5微克)。然後以庫馬西藍(單純藍安全染色，英維仇貞公司)染色蛋白質，或蛋白質移轉至聚亞乙烯氟膜上，及使用衍生自已經注射釀酒酵母反錄酶之純質製劑(希格瑪公司)之兔衍生所得之反錄酶抗血清(開放生物系統公司(Open Biosystems))來探測是否存在有反錄酶蛋白質。隨後膜與偶合至鹼性磷酸酶之小鼠抗兔二次抗體(波米迦公司)培養。然後根據製造商之指示(KPL，馬里蘭州蓋塞堡)，膜以5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸酯/硝基藍四唑鎓溶液(BCIP/NBT)處理。一個實例示於第38圖。抗反錄酶免疫墨點法及相對應之經庫馬西藍染色之凝膠分別示於A圖及B圖。於純株1-3之培養上清液中所見四個主帶中，只有一者顯示與抗反錄酶抗血清反應。藉胜肽序列分析證實蛋白質身分。
功能檢定分析-酶EC 3.2.1.26為可催化蔗糖水解 成為果糖及葡萄糖之蔗糖酶之反錄酶類型。蔗糖酶活性係藉果糖及葡萄糖自蔗糖釋放之速率測量。經由添加蔗糖至發酵醪上清液粗略進行檢定分析，葡萄糖/果糖濃度係藉HPLC測量。
裂殖壺菌株系B76-32 #3係於MSFM(含蔗糖)於 50毫升振搖瓶內於29℃生長至OD達到約4。細胞於4500 x g離心15分鐘，及測量於上清液之反錄酶活性。經由添加0.1M蔗糖至不等體積之發酵醪及將終體積調整至1毫升，進行反錄酶之檢定分析。反應係於55℃培養3分鐘。於100℃反應10分鐘結束反應，然後冷凍至分析為止，分析包含藉HPLC測定葡萄糖、果糖及蔗糖。使用已修改之方法版本如Liu等人食品科學28：293-296(2007)進行HPLC。簡言之，使用有魯納(Luna)NH2管柱之HPLC分離單醣及雙醣及使用RID(折射率檢測器)檢測。經由比較其滯留時間與標準品之滯留時間進行識別。藉外部標準校準進行定量。反應速率呈蔗糖濃度之函數顯示於第39A圖。Km(33.4mM)及Vmax(6.8mM葡萄糖/分鐘)係自標準Lineweaver-Burk作圖求出。參考第39B圖。
糖化分析-上清液蛋白質係於4%至12% bis-tris凝 膠(英維仇貞)藉SDS-PAGE分離。然後蛋白質以庫馬西藍(單純藍安全染色，英維仇貞)染色。自凝膠切下感興趣之已染色的蛋白質及將切片切成小塊(約1立方毫米)及以40mM碳酸氫銨(AmBic)及100%乙腈交錯脫染色直到顏色轉透明無色。已脫染色之凝膠於55℃於10mM DTT於40mM碳酸氫銨再度溶脹1小時。DTT溶液交換55mM碘乙醯胺(IAM)及於暗處培養45分鐘。培養接著以40mM碳酸氫銨及100%乙腈交錯洗滌兩次。已脫水之凝膠最初於冰上使用胰蛋白酶溶液(胰蛋白酶於40mM碳酸氫銨)再度溶脹45分鐘，及於37℃進行蛋白質消化隔夜。上清液移至另一根試管。自凝膠 一系列使用下列萃取劑來萃取胜肽及糖肽：20%乙腈於5%甲酸，50%乙腈於5%甲酸及然後80%乙腈於5%甲酸。樣本溶液經乾燥及組合入一根試管。已萃取之胰蛋白酶消化產物通過C18賽普-派克(sep-pak)卡匣且以5%乙酸洗滌去除污染物(諸如鹽類及SDS)。胜肽及糖肽以20%異丙醇於5%乙酸、40%異丙醇於5%乙酸、及100%異丙醇一系列洗提及於加速真空濃縮機內乾燥。已乾燥之樣本經組合然後以50mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.5)重新調製及於100℃加熱5分鐘來鈍化胰蛋白酶。胰蛋白酶消化產物與PNGase F於37℃培養隔夜來釋放出N-聚糖。消化後，樣本通過C18賽普-派克卡匣，碳水化合物選分以5%乙酸洗提及藉凍乾乾燥。釋放出之與N鏈接的寡醣基於Anumula及Taylor，Anal Biochem.203：101-108(1992)之方法經全甲基化及藉質譜術決定側寫資料。遵照複雜碳水化合物研究中心(Aoki K等人，J.Biol.Chem.282：9127-42(2007))發展之方法進行質譜分析。質量分析係使用NSI-LTQ/MSn測定。簡言之，全甲基化聚糖溶解於1mM氫氧化鈉於50%甲醇，以0.4微升/分鐘恆定流速直接擴散入儀器(LTQ，瑟摩費尼根(Thermo Finnigan))。MS分析係以陽離子模式進行。用於總離子映射，自500至2000之m/z範圍之自動化MS/MS分析(於35碰撞能)以連續2.8個質量單位窗其係重疊前一窗達2質量單位掃描。
進行總離子映射來檢查是否存在有指示聚糖之 斷片離子。自m/z 500至m/z 2000之全部MS/MS資料取得及以人工分析原始資料。藉NSI-總離子映射所得之各種層析 圖及表係顯示於第40A圖及第40B圖。此層析圖藉掃描濾波器處理；m/z 139之中性損耗乃高甘露糖型聚糖之特徵。總離子映射顯示本樣本含有具有長甘露糖鏈之一串列高甘露糖型聚糖。此等結果係類似於天然裂殖壺菌屬分泌蛋白質上檢測得之N-聚糖結構，如藉實例17之相同方法測定(參考第30圖)。
實例20 黑麴菌反錄酶於裂殖壺菌屬之表現
載體pAB0018(ATCC存取號碼PTA-9616)以HindIII消化，以綠豆核酸酶處理、純化及以可產生四個不等大小片段之KpnI進一步消化。2552bp片段係於瓊脂凝膠藉標準電穿孔技術分離及使用商用DNA純化套件組純化。然後進行以PmeI及Kpn進行pAB0018之第二次消化。由此消化產物單離及純化6732bp片段及接合至2552bp片段。然後遵照製造商之方案，接合產物用來轉形商業供應的勝任DH5-α大腸桿菌細胞株系(英維仇貞公司)。增殖得自安比西林(ampicillin)抗藥性純株之質體、純化及然後藉限剪消化或PCR篩檢來證實接合產生期望的質體結構。一個經證實的質體定名為pCL0120。參考第43圖。
得自真菌黑麴菌(基因存庫存取號碼S33920)之Suc1反錄酶蛋白質之成熟形式使用第42圖之裂殖壺菌屬密碼子使用表經密碼子最佳化供於裂殖壺菌表現(密碼子最佳化係藉藍喜隆生技公司，華盛頓州波特海爾進行)。已經密碼子最佳化之序列經合成，所得多核苷酸序列融合至編 碼裂殖壺菌屬Sec1信號肽(「Sec1 ss」)之多核苷酸序列作為N端先導子來替代內生性信號肽。所得「s1Suc1」核酸序列(SEQ ID NO：75)之編碼區顯示於第44圖。此已經密碼子最佳化之s1Suc1多核苷酸根據標準技術使用5’及3’限剪位置BamHI及NdeI用於插入及接合而選殖入載體pCL0120。所得載體pCL0137之質體拼圖顯示於第45圖。野生型株系裂殖壺菌種屬ATCC 20888係以此載體轉形，所得純株係於含SMM之固體SSFM培養基上選擇。然後SMM抗性純株再接種至含蔗糖作為唯一碳源之SSFM固體培養基來檢定分析生長情況。依據轉形實驗而定，50%至90%之SMM-抗性一次轉形株係可於蔗糖培養基上生長。
此處所述全部各個面相、實施例及選項皆可以任一種變化及全部變化組合。
本說明書所述全部公告案、專利案、及專利申請案皆係以引用方式併入此處，彷彿個別公告案、專利案、或專利申請案係特別地個別指示以引用方式併入此處。
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1. 財團法人食品工業法展研究所、2010/5/27、BCRC 940588
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3. 財團法人食品工業法展研究所、2010/5/27、BCRC 940589
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9. 財團法人食品工業法展研究所、2010/5/6、BCRC 930131
10.財團法人食品工業法展研究所、2010/6/10、BCRC 930133
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1. 美國、ATCC、2008/11/18、PTA-9613
2. 美國、ATCC、2008/11/18、PTA-9614
3. 美國、ATCC、2008/11/18、PTA-9615
4. 美國、ATCC、2008/11/18、PTA-9616
5. 美國、ATCC、2008/11/18、PTA-9617
6. 美國、ATCC、2009/1/7、PTA-9695
7. 美國、ATCC、2009/1/7、PTA-9696
8. 美國、ATCC、2009/1/7、PTA-9697
9. 美國、ATCC、2009/1/7、PTA-9698
10.美國、ATCC、2009/7/14、PTA-10212
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<213> 裂殖壼菌屬
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<213> 裂殖壼菌屬
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<213> 裂殖壼菌屬
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<220>
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<213> 人造序列
<220>
<223> 合成引子5’EF1-1114-Bam
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<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成引子5’Sec1P-kpn
<400> 55
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> 分泌信號
<400> 57
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<212> DNA
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<220>
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<213> 裂殖壼菌屬
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<400> 60
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<213> 裂殖壼菌屬
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 裂殖壼菌屬
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<213> 裂殖壼菌屬
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<212> PRT
<213> 裂殖壼菌屬
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<212> DNA
<213> 裂殖壼菌屬
<400> 68
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<211> 36
<212> PRT
<213> 裂殖壼菌屬
<400> 69
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<211> 108
<212> DNA
<213> 裂殖壼菌屬
<400> 70
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<211> 30
<212> PRT
<213> 裂殖壼菌屬
<400> 71
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<211> 90
<212> DNA
<213> 裂殖壼菌屬
<400> 72
<210> 73
<211> 35
<212> PRT
<213> 裂殖壼菌屬
<400> 73
<210> 74
<211> 105
<212> DNA
<213> 裂殖壼菌屬
<400> 74
<210> 75
<211> 1785
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 密碼子已最佳化之核酸序列
<400> 75

Claims (5)

  1. 一種重組核酸分子，包含：(a)一多核苷酸序列，其與SEQ ID NO：43之多核苷酸序列具有至少90%序列相同度；或(b)一多核苷酸序列，其與(a)之多核苷酸序列完全互補。
  2. 如請求項1之重組核酸分子，其中該多核苷酸序列與SEQ ID NO：43之多核苷酸序列具有至少90%序列相同度。
  3. 如請求項1之重組核酸分子，其中該多核苷酸序列是SEQ ID NO：43。
  4. 如請求項1或2之重組核酸分子，其中該%相同度可在SEQ ID NO：43之至少10個核苷酸之一序列上被發現。
  5. 如請求項1或2之重組核酸分子，其中該%相同度可在SEQ ID NO：43之至少20個核苷酸之一序列上被發現。
TW104129961A 2009-03-16 2010-03-15 於網黏菌門微生物中生產蛋白質之技術 TWI548648B (zh)

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