CN104263729A

CN104263729A - 在网粘菌门微生物中产生蛋白质

Info

Publication number: CN104263729A
Application number: CN201410383618.0A
Authority: CN
Inventors: K·E·阿普特; J·C·利普迈耶; D·辛普森; J·王; J·P·怀恩; R·泽克尔
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV; Martek Biosciences Corp
Priority date: 2009-03-16
Filing date: 2010-03-15
Publication date: 2015-01-07
Anticipated expiration: 2030-03-15
Also published as: US20100233760A1; TWI504749B; AU2017202378A1; EP2408795A4; JP6369952B2; US10829794B2; WO2010107709A1; TWI548648B; CA3003188C; JP6012698B2; CA2755667A1; CA3003188A1; JP2016208993A; KR101786121B1; EP3202906A1; US20150132803A1; CA2755667C; EP2408795A1; TW201040276A; US20190211369A1

Abstract

本发明涉及在网粘菌门微生物中产生蛋白质。本发明具体涉及网粘菌门的重组细胞和微生物以及它们在异源蛋白质生产中的应用，与从重组宿主细胞和微生物有效产生和任选地分泌多肽有关的新颖启动子、终止子和信号序列也包含在本发明中。

Description

在网粘菌门微生物中产生蛋白质

本发明专利申请是国际申请号为PCT/US2010/027352，国际申请日为2010年3月15日，进入中国国家阶段的申请号为“201080022277.4”，发明名称为“在网粘菌门微生物中产生蛋白质”的发明专利申请的分案申请。

发明背景

发明领域

本发明涉及网粘菌门(Labyrinthulomycota)的重组细胞和微生物以及它们在异源蛋白质生产中的应用，与从重组宿主细胞和微生物有效产生和任选地分泌多肽有关的新颖启动子、终止子和信号序列也包含在本发明中。

技术背景

生物技术和分子生物学的发展使得原先只能从人或动物的组织、血液或尿液样本中提取的蛋白质，能够在微生物、植物和动物细胞中产生。目前商品化生物产品通常在哺乳动物细胞如CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)中，或在微生物细胞如酵母或大肠杆菌细胞系中产生。

与已有的动植物细胞培养体系相比，通过微生物发酵产生蛋白质有若干优势，例如，基于微生物发酵的过程有以下特性：(1)快速产生高浓度的蛋白质；(2)能够使用无菌的、严格控制的产生条件，(比如优良制造标准(GMP)生产条件)；(3)能够使用简单的、化学组分明确的生长培养基以便简化发酵和减少杂质；(4)没有人类或动物病原体污染；(5)容易回收蛋白质(如从发酵培养基中分离)。此外，与细胞培养设施相比，发酵设备的构建成本通常更低。

美国公开号2003/0166207(即现在的美国专利7,001,772)首次披露了适合转化破囊壶菌(包括裂殖壶菌属(Schizochytrium)在内)的重组构建体。此外，该公开文献还披露了裂殖壶菌的乙酰乳酸合酶的核酸及氨基酸序列、乙酰乳酸合酶的启动子和终止子区域、α-微管蛋白质的启动子、聚酮合酶(PKS)体系的启动子以及脂肪酸去饱和酶的启动子。随后出版的美国公开号2006/0275904及2006/0286650(通过引用全文纳入本文)进一步披露了裂殖壶菌的肌动蛋白、ef1α(延长因子1α)以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的启动子和终止子的序列。

持续需要鉴定用于在破囊壶菌微生物中表达蛋白质的其它调控元件，包括差异表达的调控元件，例如，在不同的时间点、或在一定的培养条件下、或在化学或环境因素的刺激下会应答的元件。还需要鉴定能够有效指导蛋白质从网粘菌门微生物和破囊壶菌目(Thraustochytriales)微生物(比如裂殖壶菌属和其它一些破囊壶菌)分泌出来的分泌信号系列。

发明概述

本发明涉及一种分离的核酸分子，其包含多核苷酸序列SEQ ID NO：3。

本发明也涉及一种分离的核酸分子，其包含多核苷酸序列SEQ ID NO：4。

本发明也涉及一种分离的核酸分子，其包含编码某多肽的多核苷酸序列，所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO：1。在一些实施方式中，所述的多核苷酸序列包含SEQ ID NO：2。

本发明也涉及一种分离的核酸分子，其包含编码某多肽的多核苷酸序列，所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO：37。在一些实施方式中，所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO：38。

本发明也涉及一种分离的核酸分子，其包含多核苷酸序列SEQ ID NO：42。在一些实施方式中，所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO：43。

本发明也涉及一种分离的核酸分子，其包含多核苷酸序列SEQ ID NO：44。在一些实施方式中，所述多核苷酸序列包含多核苷酸序列SEQ ID NO：45。

本发明也涉及一种分离的核酸分子，其包含多核苷酸序列SEQ ID NO：46。

本发明也涉及一种分离的核酸分子，其包含与上述的任何一个多核苷酸序列完全互补的多核苷酸序列。

本发明也涉及一种重组的核酸分子，其包含上述任何分离的核酸分子。在一些实施方式中，所述重组核酸分子是载体。

在一些实施方式中，所述分离的核酸分子操作性连接于编码蛋白质的多核苷酸序列。在一些实施方式中，所述蛋白质操作性连接于分泌信号。

本发明也涉及一种宿主细胞，其包含上述任何分离的或重组的核酸分子或其组合。在一些实施方式中，宿主细胞是破囊壶菌目成员。在一些实施方式中，宿主细胞是为裂殖壶菌属(Schizochytrium)或破囊壶菌属(Thraustochytrium)。

本发明也涉及一种产生蛋白质的方法，其包括在培养基中培养重组的破囊壶菌目微生物以产生所述蛋白质，其中所述重组微生物包含上述任何分离的核酸分子，所述核酸分子操作性连接于编码所述蛋白质的多核苷酸序列。在一些实施方式中，所述蛋白质从分离的破囊壶菌目生物质回收获得。在一些实施方式中，所述蛋白质在所述微生物内累积。在一些实施方式中，所述蛋白质在所述微生物的膜内累积。在一些实施方式中，所述蛋白质从培养基中回收获得。在一些实施方式中，所述蛋白质是分泌蛋白质。

本发明也涉及一种分离的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：1。

本发明也涉及一种分离的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：15。

本发明也涉及一种转化宿主细胞的方法，其包括：(a)用具有蛋白酶活性的酶预处理所述宿主细胞；和(b)通过电穿孔将核酸分子引入所述宿主细胞。

附图简要说明

图1为裂殖壶菌Na/Pi-IIIb2转运蛋白信号肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。

图2为编码信号肽SEQ ID NO：1的多核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。

图3为裂殖壶菌PUFA PKS OrfC启动子区域的多核苷酸序列(SEQ IDNO：3)。

图4为裂殖壶菌PUFA PKS OrfC终止子元件1的多核苷酸序列(SEQ IDNO：4)。

图5为pSchizE的质粒图谱。

图6为pSchiz-sG(又称pCO0001)的质粒图谱。

图7为pSchiz-sGr的质粒图谱。

图8为pSchiz-cG的质粒图谱。

图9为eGFP在裂殖壶菌属细胞的胞质和内质网中的表达情况。图9A、9C和9E是荧光显微照片；图9B、9D和9F是可见光显微照片；图9A和9B是转化pSchiz-sGr后同一个视野下的细胞图；图9C和9D是转化pSchiz-cG后同一个视野下的细胞图；图9E和9F是转化pSchiz-E后同一个视野下的细胞图。

图10A为pSchiz-sGr转化的裂殖壶菌细胞中，靶向内质网的eGFP和核酸染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的荧光定位的复合图；图10B和10C分别为用于制备该复合显微图的eGFP-ER染色和DAPI-核染色图；图10D为光镜下的同一视野；图10A表明：内质网膜包裹着各个细胞核，各细胞可包括多个细胞核。标示出一个细胞中只有一个核的相关特征。

图11为从裂殖壶菌的4个转化克隆得到的无细胞上清液和无细胞提取物样品的蛋白质印迹和相应的考马斯蓝染色染色的SDS-PAGE凝胶。“sup”和“cyto”分别代表无细胞上清液和无细胞提取物；“sG”代表转化了pSchiz-sGr质粒的细胞样品；“sGr”代表转化了pSchiz-sGr质粒的细胞样品；“cG”代表转化了pSchiz-cG质粒的细胞样品；“vec(-)”代表转化了pSchiz-E10质粒的细胞样品；“GFP(+)”代表纯化的重组GFP标准品(加利福尼亚州山景城的克隆泰克公司(Clontech,Mountain View,CA))；SDS-PAGE胶上样量无细胞上清液蛋白质为3μg，无细胞提取物蛋白质样品为1μg，在每对样品、重组GFP标准品和分子量标记物之间留有空白泳道。

图12为裂殖壶菌Sec1转运蛋白的前30个氨基酸，1-20位氨基酸为信号肽序列(SEQ ID NO：37)。

图13为编码SEQ ID NO：37的信号肽的多核苷酸序列(SEQ ID NO：38)。

图14为pSchiz-Cpt-s1eGFP(又称pCL0001)的质粒图。

图15A为不同发酵条件下(图15中定义为B26、B27或B28发酵条件)培养的三个裂殖壶菌培养中分泌的eGFP蛋白的蛋白质印迹图；图15B为对应的考马斯蓝染色SDS-PAGE凝胶。泳道1-19的上样量如图中所示。LH表示以小时计算的发酵时间；图15A中的泳道20和图15B中的泳道20分别加有10ng和0.5μg的纯化的重组GFP标准品；由于包含接头序列，裂殖壶菌产生的eGFP条带略大于对照条带。

图16为pSchiz-Cpt-s1κbh的质粒图。

图17为裂殖壶菌分泌的κ抗体亚单位的蛋白质印迹图，L为无细胞提取物，S为无细胞上清液。

图18A为κ抗体亚单位的表达的蛋白质印迹图。图18A顶部标示的孵育时间为收获培养物上清液样品的时间。“wt”代表"野生型"裂殖壶菌(即非转化菌)；"+cptS1κ"代表用包含编码人κ抗体片段的密码子优化基因、ORFC启动子和终止子以及Sec1信号肽的载体转化的裂殖壶菌。图18B为转化了cptS1κ质粒的裂殖壶菌的培养物上清液中的总蛋白质累积(蛋白质由Bradford法测定)和抗体κ链(通过ELISA测定)。

图19为裂殖壶菌EF1短启动子的多核苷酸系列(SEQ ID NO：42)。

图20为裂殖壶菌EF1长启动子的多核苷酸系列(SEQ ID NO：43)。

图21为裂殖壶菌60S短启动子的多核苷酸系列(SEQ ID NO：44)。

图22为裂殖壶菌60S长启动子的多核苷酸系列(SEQ ID NO：45)。

图23为裂殖壶菌Sec1启动子的多核苷酸系列(SEQ ID NO：46)。

图24为pAB0011的质粒图。

图25为pAB0018的质粒图。

图26为pAB0022的质粒图。

图27为无细胞上清液样品中eGFP的蛋白质印迹图，所述样品来自分别转化了含有EF1启动子(短形式)、EF1启动子(长形式)、60S启动子(短形式)、60S启动子(长形式)、SEC1启动子和OrfC启动子驱动的eGFP基因的表达载体的裂殖壶菌的培养物。

图28为与OrfC启动子(pCL0001-4)或EF1-L启动子(AB0018-9和-10)驱动eGFP表达有关的转化体细胞系的荧光显微图。

图29为裂殖壶菌天然分泌的蛋白质的N-聚糖结构图，N-聚糖结构由NSI-全面MS法分析全甲基化N-聚糖得到。

图30为裂殖壶菌天然分泌的蛋白质的N-聚糖结构图，N-聚糖结构由NSI-总离子图谱法分析全甲基化N-聚糖得到。

图31为pSchiz-EPCT(+)-s1Suc2_CL0076(又称pCL0076)的质粒图。

图32为细胞沉淀干重(g/L)结果，所述细胞沉淀来自在蔗糖-SSFM上培养的、转化了pCL0076质粒的ATCC编号为20888的裂殖壶菌培养物。转化子被标为1-1、1-3、1-24、3-1、3-2、3-5、3-21、4-1、4-24和4-31。“对照”为在蔗糖-SSFM中培养的的ATCC编号为20888的野生型裂殖壶菌细胞。

图33为细胞沉淀的脂肪含量(表示为生物质干重的％)，细胞沉淀来自在蔗糖-SSFM中培养的、转化了pCL0076质粒的ATCC编号为20888的裂殖壶菌培养物。转化子被标为1-1、1-3、1-24、3-1、3-2、3-5、3-21、4-1、4-24和4-31。“对照”为在蔗糖-SSFM中培养的ATCC编号为20888的野生型裂殖壶菌。

图34为随时间测量的细胞沉淀干重(g/L)，细胞沉淀来自在蔗糖-SSFM中培养的、转化了pCL0076质粒的ATCC编号为20888的裂殖壶菌培养物。转化子被标为1-3和3-5。“对照”为在蔗糖-SSFM中培养的ATCC编号为20888的野生型裂殖壶菌。

图35为细胞沉淀脂肪含量(表示为生物质干重的％)，细胞沉淀来自在蔗糖-SSFM中培养的两个转化体的培养物。所述转化体被标为1-3和3-5。“对照”为在蔗糖-SSFM中培养的ATCC编号为20888的野生型裂殖壶菌。

图36为细胞沉淀干重(g/L)，细胞沉淀来自在蔗糖-SSFM中培养2天或7天后收获的、转化了pCL0076质粒的裂殖壶菌菌株B76-32的培养物；"2118*"代表在蔗糖-SSFM上培养的ATCC编号为20888的野生型裂殖壶菌细胞的亚分离物；"B76-32**"代表在蔗糖-SSFM培养基中培养的亲代菌株B76-32。

图37为细胞沉淀脂肪含量，细胞沉淀来自在蔗糖-SSFM中培养2天或7天后收获的、转化了pCL0076质粒的裂殖壶菌菌株B76-32的培养物。每个样品最右边的柱形代表了脂肪含量占生物质干重的％，每个样品最左边的柱形代表由18个或更少碳原子(浅灰色)或者20个或更多碳原子(中等灰色)的酰基组成脂肪占总脂肪的％。"2118*"代表在蔗糖-SSFM上培养的ATCC编号为20888的野生型裂殖壶菌的亚分离物；"B76-32**"代表在蔗糖-SSFM培养基上培养的亲代菌株B76-32。

图38A和38B分别为转化酶的蛋白质印迹图和相应考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶。酿酒酵母(S.cerevisiae)转化酶对照和pCL0076转化体1-3的3天培养物的无细胞上清液上样量分别为5μg、2.5μg、1.25μg和0.625μg，如蛋白质印迹图顶部所示。

图39A为用反应速率与蔗糖浓度表示的转化酶的活性实验结果。图39B为用于计算Km和V_最大值的标准LB(Lineweaver-Burk)图。

图40A为裂殖壶菌分泌的蛋白质的N-聚糖结构图，N-聚糖结构由NSI-总离子图谱法分析全甲基化N-聚糖得到。

图40B为由NSI-总离子图谱法分析全甲基化N-聚糖得到的聚糖种类的表格。

图41A和41B为使用SignalP算法预测的裂殖壶菌的天然信号序列。参考，例如，Bendsten等，J.Mol.Biol.340:783-795(2004)；Nielsen和Krogh,Proc.Int.Conf.Intell.Syst.Mol.Biol.6:122-130(1998)；Nielsen等，Protein Engineering12:3-9(1999)；Emanuelsson等，Nature Protocols2:953-971(2007)。

图42为裂殖壶菌密码子使用表。

图43为pCL0120的质粒图。

图44为经过密码子优化的、编码融合于黑曲霉(Aspergillus nigar)的成熟Suc1转化酶(GenBank登录号为S33920)的裂殖壶菌Sec1信号肽的核酸序列(SEQ ID NO：75)。

图45为pCL0137_EPCT(+)-s1Suc1(又称pCL0137)的质粒图。

发明详述

网粘菌门(Labyrinthulomycota)成员，如裂殖壶菌属(Schizochytrium)、破囊壶菌属(Thraustochytrium)和其他破囊壶菌，都是能通过传统的分泌途径加工多肽的真核生物。与CHO细胞相比，这些微生物产生的大量分泌蛋白质的种类要少得多，导致采用裂殖壶菌比CHO细胞有很大优势。此外，与大肠杆菌(E.coli)不同，网粘菌门成员如裂殖壶菌，还有蛋白质糖基化功能，比如N连接的糖基化功能，这对某些蛋白质的活性来说是必需的。已确定，破囊壶菌如裂殖壶菌属的这种N连接的糖基化功能比酵母糖基化更接近哺乳动物的糖基化模式。

重组蛋白质的有效生产也包括：(1)转化所选宿主细胞的方法；(2)选择转化体的选择标记；(3)包含在特定的宿主细胞内起作用的调控元件的表达盒。这些调控元件包括对控制多核苷酸序列表达至关重要的启动子和终止子序列。本发明所述的调节元件、调控元件和调控序列等术语可以互换使用，包括但不限于启动子、增强子、转录终止子、信号序列、核糖体结合位点、阻抑物结合位点、茎环结构、内含子剪接位点的序列/或分子。如果需要蛋白质分泌到培养基中，也可利用指导蛋白质分泌的信号肽(也称为信号序列、分泌信号肽或前导序列)。

宿主细胞

本发明涉及用网粘菌门微生物的宿主细胞产生蛋白质。在一些实施方式中，网粘菌门的宿主细胞用作生产蛋白质的生物工厂。

在一些实施方式中，重组的网粘菌门宿主细胞是破囊壶菌，如裂殖壶菌属(Schizochytrium)或破囊壶菌属(Thraustochytrium)。根据本发明，术语“破囊壶菌”指所有的破囊壶菌目(Thraustochytriales)微生物，包括破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)微生物；术语“网粘菌”指所有的网粘菌目(Labyrinthulales)微生物，包括网粘菌科(Labyrinthulaceae)微生物。网粘菌科微生物原先被认为是破囊壶菌目微生物，但最近的分类学更正将网粘菌科认定为网粘菌目中的成员。不管是网粘菌目还是破囊壶菌目都是网粘菌门的成员，分类学家通常把这两类微生物与原生藻菌(Stramenopile)谱系中的藻类或藻样原生生物放在一起。目前分类学上关于破囊壶菌和网粘菌的分类可以概括如下：

界:管毛生物界(Stramenopila)(假菌界(Chromista))

门:网粘菌门(Labyrinthulomycota)(不等毛门(Heterokonta))

纲:网粘菌纲(Labyrinthulomycetes)

目:网粘菌目(Labyrinthulales)

科:网粘菌科(Labyrinthulaceae)

目:破囊壶菌目(Thraustochytriales)

科:破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)

为了更好地说明本发明、描述为破囊壶菌的菌株包括下列生物：破囊壶菌目、破囊壶菌科、破囊壶菌属(种：阿迪门多(arudimentale)、奥雷姆(aureum)、碧席考拉(benthicola)、格罗波(globosum)、凯尼(kinnei)、摩迪(motivum)、茂迪待(multirudimentale)、派凯(pachydermum)、普罗弗(proliferum)、罗素(roseum)、斯托特(striatum))，吾肯氏壶菌属(Ulkenia)(种：埃摩拜迪(amoeboidea)、科格尼斯(kerguelensis)、米钮塔(minuta)、普罗弗达(profunda)、雷迪安(radiata)、塞仑(sailens)、赛卡瑞那(sarkariana)、斯佐凯(schizochytrops)、维格斯(visurgensis)、优克尼斯(yorkensis))，裂殖壶菌属(种：黃金石斛(aggregatum)、黎姆萘瑟(limnaceum)、芒格(mangrovei)、迷你藻(minutum)、欧托(octosporum))，日本壶菌属(Japonochytrium)(种：麦尼(marinum))，阿尔托尼氏壶菌属(Althornia)(种：克劳迪(crouchii))或埃氏壶菌属(Elina)(种：玛瑞萨(marisalba)和欣诺瑞弗卡(sinorifica))。出于本发明目的，吾肯氏壶菌属内的种将被认为是破囊壶菌属的成员。奥兰蒂克属(Aurantiacochytrium)和奥罗格属(Oblogospora)是本发明网粘菌门内包括的另外两个属。

本发明描述为网粘菌的菌株包括下列微生物：网粘菌目，网粘菌科，网粘菌属(Labyrinthula)(种：埃格瑞尼(algeriensis)、考诺赛斯(coenocystis)、查托尼(chattonii)、玛克赛斯(macrocystis)、大西洋玛克赛斯(macrocystis atlantica)、双重玛克赛斯(macrocystis macrocystis)、玛瑞那(marina)、迈纽塔(minuta)、罗斯科弗尼(roscoffensis)、凡卡诺维(valkanovii)、维丽那(vitellina)、太平洋维丽那(vitellina pacifica),双重维丽那(vitellina vitellina)、佐普菲(zopfi)，拉普利诺属(Labyrinthuloides)(种：海罗迪(haliotidis)、优克尼斯(yorkensis))，拉比粘菌属(Labyrinthomyxa)(种：玛丽娜(marina))，戴普罗弗属(Diplophrys)(种：阿凯瑞(archeri))，皮霍索属(Pyrrhosorus)(种包括玛瑞纽斯(marinus))，索罗迪普罗属(Sorodiplophrys)(种：斯特考瑞(stercorea))以及克莱米多属(Chlamydomyxa)(种：拉普利诺(labyrinthuloides)、蒙塔那(montana))(但目前学术界对索罗迪普罗属、皮霍索属和克莱米多属的准确分类学地位还没有达成一致)。

网粘菌门的宿主细胞包括但不限于以下保藏菌株：PTA-10212、PTA-10213、PTA-10214、PTA-10215、PTA-9695、PTA-9696、PTA-9697、PTA-9698、PTA-10208、PTA-10209、PTA-10210、PTA-10211，保藏为SAM2179的微生物(保藏者将其命名为吾肯氏壶菌SAM2179)、破囊壶菌属的任何种(包括曾划归于吾肯氏壶菌属的维格斯吾肯氏壶菌(U.visurgensis)、埃摩拜迪吾肯氏壶菌(U.amoeboida)、赛卡瑞那吾肯氏壶菌(U.sarkariana)、普罗弗达吾肯氏壶菌(U.profunda)、雷迪安吾肯氏壶菌(U radiata)、米钮塔吾肯氏壶菌(U.minuta)和吾肯氏壶菌BP-5601等微生物)以及斯托特破囊壶菌(Thraustochytrium striatum)、奥雷姆破囊壶菌(Thraustochytrium aureum)、罗素破囊壶菌(Thraustochytrium roseum)；以及日本壶菌属(Japonochytrium)任何种的微生物。破囊壶菌目包括但不限于以下：破囊壶菌(23B)(ATCC20891)；斯托特破囊壶菌(施奈德(Schneider))(ATCC24473)；奥雷姆破囊壶菌(戈尔茨坦(Goldstein))(ATCC34304)；罗素破囊壶菌(戈尔茨坦)(ATCC28210)；和日本壶菌(L1)(ATCC28207)。裂殖壶菌属包括但不限于黃金石斛裂殖壶菌、利马昔努裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)、裂殖壶菌(S31)(ATCC20888)、裂殖壶菌(S8)(ATCC20889)、裂殖壶菌(LC-RM)(ATCC18915)、裂殖壶菌(SR21)、保藏的ATCC28209菌株和保藏的利马昔努裂殖壶菌菌株IFO32693。在一些实施方式中，宿主细胞是裂殖壶菌属或破囊壶菌属。裂殖壶菌属既能以连续二分的方式繁殖，也能以形成孢子囊的形式繁殖，而破囊壶菌属只能以形成孢子囊的形式繁殖。在一些实施方式中，本发明宿主细胞是重组的宿主细胞。

本发明宿主细胞的有效培养条件包括但不限于：允许产生蛋白质和/或重组的有效培养基、生物反应器、温度、pH和氧气条件。有效培养基指通常培养破囊壶菌目细胞，如裂殖壶菌属宿主细胞的任何培养基。这种培养基通常包括具有可同化的碳、氮和磷酸盐来源，以及合适的盐、矿物质、金属和其它营养素如维生素的水性培养基。合适的培养基和培养条件的非限制性例子可参见实施例部分。适合破囊壶菌目微生物的非限制性培养条件也可参见美国专利号5,340,742，通过引用全文纳入本文。可以在常规的发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定皿和皮氏培养板中培养本发明细胞。可以在适合重组细胞的温度、pH和氧气含量下进行培养。在一些实施方式中，本发明的网粘菌门宿主细胞包含含有编码选择标记物的核酸序列的重组载体。在一些实施方式中，所述选择标记物可用于选择转化的微生物。显性选择标记物的例子包括降解具有抗生素或杀真菌活性的化合物的酶，例如，来自印度斯坦链异壁菌(Steptoalloteichushindustanus)的Sh ble基因，其编码“博来霉素结合蛋白”，由SEQ ID NO：5表示。在一些实施方式中，编码显性选择标记物的核酸序列包含破囊壶菌乙酰乳酸合酶序列，如多核苷酸序列SEQ ID NO：6的突变形式。在一些实施方式中，已经修饰、突变或选择了乙酰乳酸合酶，以使其对磺酰脲化合物、咪唑并啉酮类抑制剂和/或嘧啶基氧基苯甲酸酯的抑制作用产生抗性。在一些实施方式中，乙酰乳酸合酶是天然产生的乙酰乳酸合酶的同源物。在一些实施方式中，用包含乙酰乳酸合酶的重组载体转染的破囊壶菌微生物对硫脲化合物、咪唑啉酮类抑制剂和/或嘧啶基氧基苯甲酸酯的敏感性降低。在一些实施方式中，所述重组载体包含编码乙酰乳酸合酶蛋白的核酸序列，所述乙酰乳酸合酶蛋白包含在以下一个或多个位置上发生氨基酸缺失、插入或取代的不同于SEQ ID NO：7的氨基酸序列：116G、117A、192P、200A、251K、358M、383D、592V、595W或599F。在一些实施方式中，突变的乙酰乳酸合酶蛋白具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。在一些实施方式中，所述重组载体包含与SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列编码至少在破囊壶菌中用作显性选择标记物的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述重组载体包含编码SEQ ID NO：7的功能性片段的多核苷酸序列，所述功能性片段至少在破囊壶菌中用作显性选择标记物。在一些实施方式中，所述重组载体包含选自下组的多核苷酸序列：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13。

本发明用术语“转化”表示可将外源核酸分子(即重组核酸分子)插入微生物细胞的任何方法。在微生物系统中，用术语“转化”表示微生物获得外源核酸引起的遗传改变，其基本与术语“转染”同义。适合将外源核酸分子引入网粘菌门宿主细胞的转化技术包括但不限于：粒子轰击、电穿孔、显微注射、脂质转染、吸附、感染和原生质体融合。在一些实施方式中，将外源核酸分子，包括重组载体引入处于静止期的微生物细胞。在一些实施方式中，将外源核酸分子，包括重组载体引入处于指数生长期的微生物细胞。在一些实施方式中，当600nm光密度达到1.5至2时，将外源核酸分子，包括重组载体引入细胞。

本发明涉及一种转化宿主细胞的方法，包括：(a)用具有蛋白酶活性的酶预处理所述宿主细胞，和(b)通过电穿孔.将核酸分子引入所述宿主细胞。在一些实施方式中，与电穿孔之前不用酶预处理相比，用酶预处理能提高宿主细胞的转化效率。所述酶包括但不限于与蜗牛丙酮粉(snail acetone powder)有关的酶活性、蛋白酶IX、蛋白酶XIV、硫酸酯酶，β-葡糖醛酸糖苷酶和其组合。在一些实施方式中，用约0.05mg/ml、约0.1mg/ml、约0.15mg/ml、约0.2mg/ml、约0.25mg/ml、约0.3mg/ml、约0.4mg/ml、约0.5mg/ml、约0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml或约1mg/ml蜗牛丙酮粉、蛋白酶IX、蛋白酶XIV或其组合预处理宿主细胞。在一些实施方式中，用约0.05mg/ml至约1mg/ml、约0.1mg/ml至约1mg/ml、约0.1mg/ml至约0.5mg/ml、或约0.05mg/ml至约0.5mg/ml的蜗牛丙酮粉、蛋白酶IX、蛋白酶XIV或其组合处理宿主细胞。在一些实施方式中，用0.05X、0.1X、0.2X、0.3X、0.4X、0.5X、0.6X、0.7X、0.8X、0.9X或1X硫酸酯酶、β-葡糖醛酸糖苷酶或其组合处理宿主细胞。在一些实施方式中，用约0.05X至约1X、约0.1X至约1X、约0.1X至约0.5X或约0.05X至约0.5X硫酸酯酶、β-葡糖醛酸糖苷酶或其组合处理宿主细胞。在一些实施方式中，蛋白酶预处理包括用任何上述浓度的蛋白酶IX、蛋白酶XIV、蜗牛丙酮粉末、硫酸酯酶、β-葡糖醛酸糖苷酶或其组合预处理。在一些实施方式中，在0.1cm或0.2cm的小管间隙距离上使用约100V至约500V的电压进行电穿孔。在一些实施方式中，在0.1cm或0.2cm的小管间隙距离上使用约100V、150V、200V、250V、300V、350V、400V、450V或500V的电压进行电穿孔。

在本发明的一些实施方式中，遗传修饰宿主细胞，以引入或删除参与糖运输和/或糖合成相关性生物合成途径，包括糖基化的基因。例如，可通过删除内源性糖基化基因和/或插入人或动物的糖基化基因修饰宿主细胞，以实现更接近人的糖基化模式。酵母糖基化的修饰可参见，例如，美国专利号7,029,872和美国公开号2004/0171826、2004/0230042、2006/0257399、2006/0029604和2006/0040353。本发明宿主细胞也包括用RNA病毒元件提高或调节基因表达的细胞。

表达系统

在一些实施方式中，用于在宿主细胞中表达蛋白质的本发明表达系统包括在藻类细胞中有活性的调节控制元件。在一些实施方式中，本发明表达系统包括在网粘菌门细胞中有活性的调节控制元件。在一些实施方式中，本发明表达系统包括在破囊壶菌中有活性的调节控制元件。在一些实施方式中，本发明表达系统包括在裂殖壶菌属或破囊壶菌属中有活性的调节控制元件。许多藻类调节控制元件，包括各种启动子，在多种物种中有活性。因此，作为本发明某方面公开的新型调节序列可用于与分离它们的细胞相同的细胞类型，或者可用于与分离它们的细胞不同的细胞类型。这种表达盒的设计和构建采用本领域技术人员已知的标准分子生物学技术。参见例如，Sambrook等，2001，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第3版。

在一些实施方式中，用于在网粘菌门细胞中产生蛋白质的表达系统包括衍生自网粘菌门序列的调控元件。在一些实施方式中，用于在网粘菌门细胞中产生蛋白质的表达系统包括衍生自非网粘菌门序列的调控元件，包括衍生自非网粘菌门藻类序列的序列。在一些实施方式中，本发明表达系统包括编码蛋白质的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列与在网粘菌门宿主细胞中有功能的任何启动子序列、任何终止子序列和/或任何其它调节序列相关联。可采用诱导性或组成性活性序列。合适的调节控制元件也包括与本文所述核酸分子相关联的任何调节控制元件。

本发明也涉及一种用于在宿主细胞中表达蛋白质的表达盒。本发明也涉及包含用于在宿主细胞中表达蛋白质的表达盒的任何上述宿主细胞。在一些实施方式中，所述表达系统包括含有操作性连接以使其在宿主细胞中有功能的遗传元件，如至少含有启动子、编码序列和终止子区的表达盒。在一些实施方式中，表达盒包括本文所述的本发明分离核酸分子中的至少一种。在一些实施方式中，表达盒的所有遗传元件是与分离核酸分子相关联的序列。在一些实施方式中，所述控制序列是诱导性序列。在一些实施方式中，将编码蛋白质的核酸序列整合到宿主细胞基因组中。在一些实施方式中，将编码蛋白质的核酸序列稳定整合到宿主细胞基因组中。

在一些实施方式中，将编码待表达蛋白质的分离核酸序列操作性连接于启动子序列和/或终止子序列，二者均在所述宿主细胞中有活性。编码待表达蛋白质的分离核酸序列操作性连接的启动子和/或终止子序列可包括任何启动子和/或终止子序列，包括但不限于本发明的新型核酸序列、已授权美国专利7,001,772公开的调控序列、美国公开号2006/0275904和2006/0286650公开的调控序列或在转化的宿主细胞中有功能的其它调控序列，它们操作性连接于编码蛋白质的分离多核苷酸序列。在一些实施方式中，为了最大程度提高蛋白质翻译效率，针对网粘菌门宿主细胞对具体编码蛋白质的核酸序列进行密码子优化。

本发明也涉及包含本发明表达盒的重组载体。重组载体包括但不限于：质粒、噬菌体和病毒。在一些实施方式中，所述重组载体是线性化载体。在一些实施方式中，所述重组载体是表达载体。本文所用术语“表达载体”指适合产生编码产物(如感兴趣蛋白质)的载体。在一些实施方式中，将编码待产生的产物的核酸序列插入所述重组载体中产生重组核酸分子。将编码待产生的蛋白质的核酸序列插入载体中，以将该核酸序列操作性连接于载体中的调节序列(如破囊壶菌目的启动子)，使得能够在该重组微生物内转录和翻译该核酸序列。在一些实施方式中，选择标记物，包括本文所述的任何选择标记物使得能够选择成功引入本发明重组核酸分子的重组微生物。

在一些实施方式中，通过本发明重组宿主细胞产生的蛋白质包括但不限于：治疗性蛋白。本文所用术语“治疗性蛋白”包括可用于治疗或预防动物或人的疾病、病症或失调的蛋白质。术语“治疗”指治疗性处理和预防性或预防方法，其目的是防止或减缓(缓解)不良生理状况、疾病或失调，或获得有益或所需的临床结果。出于本发明目的，所述有益或所需的临床结果包括但不限于：与病症、疾病或失调有关的症状或体征的缓解；病症、疾病或失调的程度减轻；病症、疾病或失调的稳定(即病症、疾病或失调不恶化)；病症、疾病或失调的发病或进展延迟；病症、疾病或失调的好转；病症、疾病或失调的缓解(部分或完全，可检测或不可检测)；病症、疾病或失调的增强或改善。治疗包括引发临床显著反应而不引起过多的副作用。治疗也包括与不接受治疗的预计生存期相比延长生存期。

在某些实施方式中，治疗性蛋白包括但不限于：生物活性蛋白质，如酶、抗体或抗原性蛋白。在某些实施方式中，治疗性蛋白包括但不限于：蛋白A、人生长激素、干扰素、抑肽酶、人α抗胰蛋白酶、亲脂性蛋白、人血清白蛋白、谷氨酸脱羧酶、胃脂肪酶、乳铁蛋白/溶菌酶、转化酶、抗体(包括但不限于：VEGF单克隆抗体(艾瓦斯汀(AVASTIN))和HER2单克隆抗体(贺赛汀(HERCEPTIN)))、人疫苗、动物疫苗和动物治疗剂。

在一些实施方式中，通过本发明重组宿主细胞产生的蛋白质包括但不限于：工业酶。工业酶包括但不限于：用于生产、制备、保存、营养固定或加工某些产品，包括食品、医疗产品、化学品、机械产品和其它工业产品的酶。工业酶包括但不限于：α淀粉酶、α-半乳糖苷酶、β-淀粉酶、纤维素、β-葡聚糖酶、右旋糖苷酶、糊精酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶/戊聚糖酶、木聚糖酶、转化酶、乳糖酶、柚皮苷酶、果胶酶、支链淀粉酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、氨基肽酶、内肽酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶(chemotrypsin)、胃蛋白酶、弹性蛋白酶)、皱胃酶/高血压蛋白原酶/凝乳酶、枯草杆菌蛋白酶(subtilism)、嗜热菌蛋白酶、氨基酰化酶、谷氨酰胺酶、溶菌酶、青霉素酰化酶、脂酶(triglyceridases)、磷脂酶、前胃酯酶(pregastric esterases)、植酸酶、酰胺酶、异构酶、醇脱氢酶、氨基酸氧化酶、过氧化氢酶、氯过氧化物酶、过氧化物酶、乙酰乳酸脱羧酶、天冬氨酸β-脱羧酶、组氨酸酶、环式糊精糖基转移酶、弗洛酶(fromase)、肌醇六磷酸酶和凝乳酶。

在一些实施方式中，本发明重组宿主细胞产生的蛋白质包括营养缺陷型标记物、显性选择标记物(如降解抗生素活性的酶)或参与转化选择的其它蛋白质、用作报道物的蛋白质、参与蛋白质糖基化的酶和参与细胞代谢的酶。

在本发明的任何实施方式中，本发明宿主细胞产生的蛋白质可以是“输出蛋白质”或“异源输出蛋白质”。本文所用的“输出蛋白质”或“异源输出蛋白质”指未参与修饰产生蛋白质的宿主细胞的代谢活动并由该宿主细胞产生以便进行后续分离的异源重组蛋白质。本文所用的“输出蛋白质”不包括报道基因编码的蛋白质。

本发明重组宿主细胞产生的异源输出蛋白质不包括选择标记物，如零霉素抗性基因(如印度斯坦链异壁菌(Steptoalloteichus hindustanus)的ble基因)和大肠杆菌(E.coli)新霉素磷酸转移酶(npt)和转座子Tn5，来自土曲霉(Aspergillusterreus)的杀稻瘟素脱氨酶(bsdR)，来自破囊壶菌T23B的PUFA合酶ORFA，来自破囊壶菌T23B的PUFA合酶ORFB，来自破囊壶菌属T23B的PUFA合酶ORFC，衍生自维多利亚水母(Aequorea victoria)的合成eGFP，编码与选自二十二碳六烯酸(DHA)、二十二碳五烯酸(DPA)、二十碳五烯酸(EPA)和花生四烯酸(ARA)的合成脂肪酸相关联的蛋白质的天然基因，脂肪酸合酶，脂肪酸去饱和酶，脂肪酸延长酶，与聚酮化合物合酶复合物相关联的蛋白质和与将脂肪酸掺入磷脂或三酰基甘油分子相关联的蛋白质，ω-3脂肪酸去饱和酶，多烯脂肪酸异构酶，HMG-CoA合酶，HMG-CoA还原酶，鲨烯合酶，八氢番茄红素合酶，八氢番茄红素去饱和酶，类胡萝卜素环化酶，类胡萝卜素羟化酶，类胡萝卜素酮酶，维生素E和硫辛酸，与类异戊烯生物合成途径相关联的蛋白质和参与宿主细胞产生多不饱和脂肪酸或类胡萝卜素的酶。

在一些实施方式中，本发明宿主细胞产生的蛋白质是商业规模的生产。商业规模包括由尺寸≥100L、≥1,000L、≥10,000L或≥100,000L的通气发酵罐培养的微生物产生蛋白质。在一些实施方式中，商业规模生产在能够搅拌的通气发酵罐中进行。

在一些实施方式中，本发明宿主细胞产生的蛋白质可以在细胞内累积，或者可以可溶性蛋白质的形式从细胞中分泌到(例如)培养基中。

在一些实施方式中，从所述细胞、所述培养基或培养细胞的发酵培养基中回收本发明产生的蛋白质。在一些实施方式中，所述蛋白质是以可溶蛋白质的形式从培养基中回收的分泌蛋白。在一些实施方式中，所述蛋白质是包含信号肽的分泌蛋白。

在一些实施方式中，本发明产生的蛋白质包含靶向信号，该靶向信号指导其保留在内质网内、指导其分泌到细胞外或将其导向其它细胞器或细胞隔室。在一些实施方式中，所述蛋白质包括信号肽。在一些实施方式中，所述蛋白质包括Na/Pi-IIb2转运蛋白信号肽或Sec1转运蛋白。在一些实施方式中，所述信号肽包括氨基酸序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：37。在一些实施方式中，包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：37的信号肽的蛋白质分泌到培养基中。在一些实施方式中，在分泌过程中从所述蛋白质上切下信号肽，产生所述蛋白质的成熟形式。

在一些实施方式中，本发明宿主细胞产生的蛋白质是糖基化的。在一些实施方式中，与酵母或大肠杆菌中产生的蛋白质相比，本发明产生的蛋白质的糖基化模式更接近哺乳动物糖基化模式。在一些实施方式中，本发明网粘菌门宿主细胞产生的蛋白质包含N-连接的糖基化模式。用于治疗目的的糖基化蛋白质的糖基化模式类似于对象生物体中发现的糖基化模式时，这种蛋白质不大可能刺激抗-糖形免疫应答。相反，具有不是对象生物体特征性的连接或糖的糖基化蛋白质更可能具有抗原性。可通过特定糖形调节效应物功能。例如，IgG可介导促炎或抗炎反应，这与Fc区糖形上不存在或存在末端唾液酸相关联(Kaneko等，Science313(5787):670-3(2006))。

本发明还涉及一种产生重组蛋白质的方法，所述方法包括在足以表达编码所述蛋白质的多核苷酸序列的条件下培养本发明重组网粘菌门宿主细胞。在一些实施方式中，所述重组蛋白由所述宿主细胞分泌，并从所述培养基中回收。在一些实施方式中，由所述细胞分泌的蛋白质包含分泌信号肽。根据用于生产的载体和宿主系统，本发明重组蛋白可保持在重组细胞内、分泌到发酵培养基中、分泌到两个细胞膜之间的空间内、或保留在细胞膜的外表面上。本文所用术语“回收蛋白质”指收集包含蛋白质的发酵培养基，不一定暗含分离和纯化等额外步骤。本发明方法产生的蛋白质可利用各种标准蛋白质纯化技术进行纯化，这些技术例如但不限于：亲和色谱、离子交换色谱、过滤、电泳、疏水相互作用色谱、凝胶过滤色谱、反相色谱、伴刀豆球蛋白A色谱、色谱聚焦和差异溶解。在一些实施方式中，以“基本纯”形式分离本发明方法产生的蛋白质。本文所用术语“基本纯”指允许以商业产品的形式有效利用所述蛋白质的纯度。在一些实施方式中，所述重组蛋白质在细胞内累积，并可从所述细胞回收。在一些实施方式中，所述方法的宿主细胞是破囊壶菌。在一些实施方式中，所述方法的宿主细胞是裂殖壶菌属或破囊壶菌属。在一些实施方式中，所述重组蛋白质是治疗性蛋白质、食品酶或工业酶。在一些实施方式中，重组网粘菌门宿主细胞是裂殖壶菌属且重组蛋白质是包含分泌信号序列的治疗性蛋白质。

在一些实施方式中，本发明重组载体是靶向载体。本文所用术语“靶向载体”指用于将特定核酸分子递送到重组细胞内的载体，其中利用所述核酸分子使宿主细胞的内源性基因缺失或失活(即用于靶向基因破坏或敲除技术)。这种载体也称为“敲除”载体。在一些实施方式中，靶向载体的一部分具有与宿主细胞内靶基因(即靶向缺失或失活的基因)的核酸序列同源的核酸序列。在一些实施方式中，插入载体的核酸分子(即插入物)与靶基因同源。在一些实施方式中，经设计，载体插入物的核酸序列能结合靶基因，以使靶基因和插入物发生同源重组，从而使内源性靶基因缺失、失活或减弱(即至少一部分内源性靶基因被突变或缺失)。

分离的核酸分子

本发明也涉及可用于在重组宿主细胞中调节基因表达和/或指导蛋白质分泌的分离的核酸分子或多核苷酸序列。本文所述核酸序列包括可用于调节同源或异源蛋白质的转录和/或分泌的启动子、终止序列和编码信号肽的核酸序列。

按照本发明，分离的核酸分子是从其天然环境取出(即经人工操作)的核酸分子，其天然环境是天然发现该核酸分子的基因组或染色体。因此，“分离”不一定反映核酸分子的纯化程度，但表明该分子不包含天然发现该核酸分子的完整基因组或完整染色体。分离的核酸分子可包括DNA、RNA(如mRNA)，或者DNA或RNA的衍生物(如cDNA)。虽然术语“核酸分子”主要指物理的核酸分子，术语“核酸序列”或“多核苷酸序列”主要指核酸分子的核苷酸序列，但该术语可互换使用，特别是提到能够编码蛋白质的核酸分子、多核苷酸序列或核酸序列时。在一些实施方式中，本发明的分离核酸分子是用重组DNA技术(如，聚合酶链反应(PCR)扩增，克隆)或化学合成产生。分离的核酸分子包括天然核酸分子和其同源物，包括但不限于：插入、缺失、取代和/或倒置核苷酸的天然等位基因变体和修饰的核酸分子，这种修饰能对所编码的肽或蛋白质的序列、功能和/或生物学活性产生所需作用。

启动子序列、终止子序列、信号肽序列或任何其它本发明序列的核酸序列互补物指与具有启动子序列、终止子序列、信号肽序列或任何其它本发明序列的链互补的核酸链的核酸序列。应理解，含有本发明序列的双链DNA包括单链DNA和具有该单链DNA的互补序列的互补链。同样，本发明核酸分子可以是双链或单链，包括在“严格”杂交条件下与本发明序列和/或与本发明序列的互补链形成稳定杂交体的核酸分子。推倒互补序列的方法是本领域技术人员已知的。

术语“蛋白质”包括单链多肽分子以及多-多肽复合物，其中单个组成多肽通过共价或非共价方式连接。术语“多肽”包括长度为两个或多个氨基酸，通常大于5、10或20个氨基酸的肽。

本发明的新型核酸分子可用于它们在其中有功能的任何微生物。在一些实施方式中，将核酸分子用于网粘菌门的重组微生物。在一些实施方式中，将重组核酸分子用于破囊壶菌目的重组微生物。在一些实施方式中，将重组核酸分子用于裂殖壶菌目或破囊壶菌目微生物。本文所用的重组微生物具有用重组技术从其普通(即野生型或天然产生的)形式进一步修饰(即突变或改变)的基因组。本发明重组微生物可包括插入、缺失或修饰了核酸分子(即通过，例如，插入、缺失、取代和/或倒置核苷酸突变的)微生物，这种遗传修饰方式能在所述微生物中提供所需效果。在本文中，导致基因表达、基因功能或基因产物(基因编码的蛋白质)功能降低的遗传修饰可称为基因的失活(完全或部分)、缺失、中断、阻断或下调。例如，基因中导致该基因编码的蛋白质功能降低的遗传修饰可能是该基因完全缺失(即该重组微生物中不存在该基因，因此该重组微生物中不存在该蛋白)，该基因发生突变导致不完全或不翻译蛋白质(如不表达蛋白质)，或该基因发生突变以降低或消除该蛋白质的天然功能(例如，表达活性(如酶的活性或作用)降低或无活性的蛋白质)的结果。导致基因表达或功能提高的遗传修饰可称为基因的扩增、过度产生、过度表达、活化、增强、增加或上调。

启动子

本发明也涉及新型调节控制元件启动子。本发明启动子是指导相关编码区转录的DNA区域。

在一些实施方式中，所述启动子来自网粘菌门微生物。在一些实施方式中，所述启动子来自破囊壶菌，包括但不限于：保藏为SAM2179的微生物(保藏者命名为“吾肯氏壶菌SAM2179”)，吾肯氏壶菌属或破囊壶菌属或裂殖壶菌属的微生物。裂殖壶菌属包括但不限于：黃金石斛裂殖壶菌属、利马昔努裂殖壶菌、裂殖壶菌(S31)(ATCC20888)、裂殖壶菌(S8)(ATCC20889)、裂殖壶菌(LC-RM)(ATCC18915)、裂殖壶菌(SR21)、保藏的裂殖壶菌菌株ATCC28209和保藏的裂殖壶菌菌株IFO32693。

本发明启动子至少在破囊壶菌中具有启动子活性，包括天然产生启动子的全长启动子序列和其功能性片段、融合序列和其同源物。可利用限制性酶消化本发明核酸分子，然后用合适的试验测定启动子活性必需的最小序列。这类片段本身单独代表本发明的实施方式。启动子的同源物不同于天然产生的启动子，因为至少一个、两个、三个或若干个核苷酸被删除、插入、倒置、取代和/或衍生化。启动子同源物可至少保留在破囊壶菌中作为启动子的活性，但可提高、降低或根据特定刺激改变该活性。本发明启动子可包含产生发育和组织特异性调控或表达的一个或多个序列元件。

在一些实施方式中，本发明的分离核酸分子包含PUFA PKS OrfC启动子(“PKS OrfC启动子”)。本发明PKS OrfC启动子是天然位于OrfC编码区上游(5'区方向)并指导OrfC转录的DNA区域。在一些实施方式中，PKS OrfC启动子具有多核苷酸序列SEQ ID NO：3。在一些实施方式中，本发明的分离核酸分子包含与SEQ ID NO：3至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列至少在破囊壶菌中具有启动子活性(即至少对PUFA PKS OrfC序列具有基本启动子转录活性)。可以在至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少1000、至少1500个核苷酸的序列，或整个序列上发现同源性(或相同性％)。

本发明也涉及包含与SEQ ID NO：3或与SEQ ID NO：3至少95％相同的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列的分离核酸分子。在一些实施方式中，所述分离的核酸分子包含与SEQ ID NO：3或与SEQ ID NO：3至少95％相同的多核苷酸序列完全互补的多核苷酸序列。在一些实施方式中，本发明PKS OrfC启动子包括与天然产生的PKS OrfC启动子序列足够相似的PKS OrfC启动子同源物，所述同源物的核酸序列在中等、高度或极高严格条件下(如下所述)能够与天然产生PKS OrfC启动子的核酸序列的互补物杂交。在一些实施方式中，本发明PUFA PKS OrfC启动子序列在中等、高度或极高严格条件下与SEQ IDNO：3的互补物杂交。

在一些实施方式中，本发明启动子包括以ATCC登录号PTA-9615保藏的pCL0001的OrfC启动子。

在一些实施方式中，本发明的分离核酸分子包含EF1短启动子(“EF1短”或“EF1-S”启动子)或EF1长启动子(“EF1长”或“EF1-L”启动子)。本发明的EF1短或长启动子是天然位于EF1编码区上游(5'区方向)并指导EF1转录的DNA区域。在一些实施方式中，EF1短启动子具有多核苷酸序列SEQ ID NO：42。在一些实施方式中，EF1长启动子具有多核苷酸序列SEQ ID NO：43。在一些实施方式中，本发明的分离核酸分子包含与SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：43至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列至少在破囊壶菌中具有启动子活性(即，至少对EF1短或长启动子序列具有基本启动子转录活性)。可以在至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少100、至少200、至少300、至少400或至少500个核苷酸的序列，或整个序列上发现同源性(或相同性％)。

本发明也涉及分离的核酸分子，其包含与SEQ ID NO：42和/或SEQ IDNO：43，或者与SEQ ID NO：42和/或SEQ ID NO：43至少95％相同的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列。在一些实施方式中，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO：42和/或SEQ ID NO：43，或者与SEQ ID NO：42和/或SEQ ID NO：43至少95％相同的多核苷酸序列完全互补的多核苷酸序列。在一些实施方式中，本发明的EF1短或EF1长启动子包括与天然产生的EF1短和/或长启动子序列足够相似的EF1短或长启动子同源物，所述同源物的核酸序列在中等、高度或极高严格条件下(如下所述)能够分别与天然产生的EF1短和/或长启动子的核酸序列的互补物杂交。在一些实施方式中，本发明的EF1短和/或长启动子序列在中等、高度或极高严格条件下分别与SEQ ID NO：42和/或SEQ IDNO：43的互补物杂交。

在一些实施方式中，本发明启动子包括以ATCC登录号PTA-9616保藏的pAB0018的EF1长启动子。

在一些实施方式中，本发明的分离核酸分子包含60S短启动子(“60S短”或“60S-S”启动子)或60S长启动子(“60S长”或“60S-L”启动子)。本发明的60S短或长启动子是天然位于60S编码区上游(5'区方向)并指导60S转录的DNA区域。在一些实施方式中，60S短启动子具有多核苷酸序列SEQ ID NO：44。在一些实施方式中，60S长启动子具有多核苷酸序列SEQ ID NO：45。在一些实施方式中，本发明的分离核酸分子包含与SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列至少在破囊壶菌中具有启动子活性(即，至少对60S短或长启动子序列具有基本启动子转录活性)。可以在至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少100、至少200、至少300、至少400或至少500个核苷酸的序列，或整个序列上发现同源性(或相同性％)。

本发明也涉及分离的核酸分子，其包含与SEQ ID NO：44和/或SEQ IDNO：45，或者与SEQ ID NO：44和/或SEQ ID NO：45至少95％相同的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列。在一些实施方式中，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO：44和/或SEQ ID NO：45，或者与SEQ ID NO：44和/或SEQ ID NO：45至少95％相同的多核苷酸序列完全互补的多核苷酸序列。在一些实施方式中，本发明的60S短或60S长启动子包括与天然产生的60S短或60S长启动子序列足够相似的60S短或60S长启动子同源物，所述同源物的核酸序列在中等、高度或极高严格条件下(如下所述)能够分别与天然产生的60S短和/或60S长启动子的核酸序列的互补物杂交。在一些实施方式中，本发明的60S短和/或60S长启动子序列在中等、高度或极高严格条件下分别与SEQ ID NO：44和/或SEQID NO：45的互补物杂交。

在一些实施方式中，本发明启动子包括以ATCC登录号PTA-9614保藏的pAB0011的60S长启动子。

在一些实施方式中，本发明的分离核酸分子包含Sec1启动子(“Sec1启动子”)。本发明Sec1启动子是天然位于Sec1编码区上游(5'区方向)并指导Sec1转录的DNA区域。在一些实施方式中，Sec1启动子具有多核苷酸序列SEQ IDNO：46。在一些实施方式中，本发明的分离核酸分子包含与SEQ ID NO：46至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列至少在破囊壶菌中具有启动子活性(即至少对Sec1序列具有基本启动子转录活性)。可以在至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少100、至少200、至少300、至少400或至少500个核苷酸的序列，或整个序列上发现同源性(或相同性％)。

本发明也涉及包含与SEQ ID NO：46或与SEQ ID NO：46至少95％相同的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列的分离核酸分子。在一些实施方式中，所述分离的核酸分子包含与SEQ ID NO：46或与SEQ ID NO：46至少95％相同的多核苷酸序列完全互补的多核苷酸序列。在一些实施方式中，本发明Sec1启动子包括与天然产生的Sec1启动子序列足够相似的Sec1启动子同源物，所述同源物的核酸序列在中等、高度或极高严格条件下(如下所述)能够与天然产生Sec1启动子的核酸序列的互补物杂交。在一些实施方式中，本发明Sec1启动子序列在中等、高度或极高严格条件下与SEQ ID NO：46的互补物杂交。

在一些实施方式中，本发明启动子包括以ATCC登录号PTA-9613保藏的pAB0022的Sec1启动子。

终止子

本发明也涉及作为转录终止子的新型调控元件。本发明的终止子区是在基因组DNA中为转录标出基因序列末端的遗传序列区段。

在一些实施方式中，所述终止子区来自网粘菌门微生物。在一些实施方式中，所述终止子区来自破囊壶菌。在一些实施方式中，所述终止子区来自裂殖壶菌属或破囊壶菌属。裂殖壶菌属包括但不限于：黃金石斛裂殖壶菌属、利马昔努裂殖壶菌、裂殖壶菌(S31)(ATCC20888)、裂殖壶菌(S8)(ATCC20889)、裂殖壶菌(LC-RM)(ATCC18915)、裂殖壶菌(SR21)、保藏菌株ATCC28209和保藏菌株IFO32693。

本发明终止子区至少在破囊壶菌中可具有终止子活性，包括天然产生的终止子区的全长终止子序列和其功能性片段、融合序列和同源物。终止子的同源物不同于天然产生的终止子，因为至少一个或若干，但不限于一个或若干核苷酸被删除、插入、倒置、取代和/或衍生化。在一些实施方式中，本发明终止子的同源物至少在破囊壶菌中保持作为终止子区的活性，但可提高、降低活性或使活性因某些刺激而变。

在一些实施方式中，本发明包括分离的核酸分子，其包含PUFA PKS OrfC基因的终止子区(“PKS OrfC终止子区”)。本发明的PKS OrfC终止子区是在基因组DNA中为转录标出OrfC基因序列末端的遗传序列区段。在一些实施方式中，终止子区具有多核苷酸序列SEQ ID NO：4。SEQ ID NO：4所示的终止子区是来自破囊壶菌微生物的天然产生的(野生型)终止子序列，具体说，是裂殖壶菌属PKS OrfC终止子区，称为“OrfC终止子元件1”。在一些实施方式中，本发明的分离核酸分子包括与SEQ ID NO：4至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同且至少在破囊壶菌中用作PUFA PKS OrfC终止子区的多核苷酸序列。可以在至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少100、至少150或至少200个核苷酸的序列上，或者在整个序列上发现同源性(或相同性％)。

本发明也涉及包含与SEQ ID NO：4或与SEQ ID NO：4至少95％相同的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列的分离核酸分子。在一些实施方式中，所述分离的核酸分子包含分离的核酸分子，其包含与SEQ ID NO：4或与SEQ IDNO：4至少95％相同的多核苷酸序列完全互补的多核苷酸序列。在一些实施方式中，本发明的PKS OrfC终止子区包括与天然产生的PUFA PKS OrfC终止子区足够相似的PKS OrfC终止子区同源物，所述同源物的核酸序列在中等、高度或极高严格条件下(如下所述)能够与天然产生的PKS OrfC终止子区的核酸序列的互补物杂交。在一些实施方式中，PKS OrfC终止子区序列在中等、高度或极高严格条件下与SEQ ID NO：4的互补物杂交。

在一些实施方式中，本发明终止子包括以ATCC登录号PTA-9614保藏的pAB0011的OrfC终止子区。

信号肽

本发明也涉及编码信号肽的新型核酸分子。

在一些实施方式中，本发明涉及分离核酸分子，其包含编码来自网粘菌门微生物的分泌蛋白的信号肽的多核苷酸序列。在一些实施方式中，所述微生物是破囊壶菌。在一些实施方式中，所述微生物是裂殖壶菌属或破囊壶菌属。

本发明信号肽可在破囊壶菌中具有分泌信号活性，并包括天然产生的信号肽的全长肽和其功能片段、融合肽和同源物。信号肽的同源物不同于天然产生的信号肽，因为至少一个或若干，但不限于一个或若干氨基酸被删除(例如蛋白质的截短形式，如肽或片段)、插入、倒置、取代和/或衍生化(如糖基化、磷酸化、乙酰化、肉豆蔻酰化、异戊烯化、棕榈酰化、酰胺化和/或添加糖基磷脂酰肌醇)。在一些实施方式中，信号肽的同源物至少在破囊壶菌中保持信号活性，但可提高、降低活性或使活性因某些刺激而变。

在一些实施方式中，分离的核酸分子包含编码Na/Pi-IIb2转运蛋白信号肽的多核苷酸序列。Na/Pi-IIb2转运蛋白信号肽至少在破囊壶菌中至少对Na/Pi-IIb2转运蛋白可具有信号靶向活性，其包括天然产生的Na/Pi-IIb2转运蛋白信号肽的全长肽和其功能片段、融合肽和同源物。在一些实施方式中，所述Na/Pi-IIb2转运蛋白信号肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：1。在一些实施方式中，所述Na/Pi-IIb2转运蛋白信号肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：15。在一些实施方式中，本发明的分离核酸分子包括编码与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：15至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列编码至少在破囊壶菌中至少对Na/Pi-IIb2转运蛋白而言用作信号肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述分离核酸分子包含编码分离氨基酸序列的多核苷酸序列，所述氨基酸序列包含至少在破囊壶菌中至少对Na/Pi-IIb2转运蛋白而言用作信号肽的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：15的功能性片段。在一些实施方式中，分离的核酸分子包含SEQ ID NO：2。在一些实施方式中，分离的核酸分子包含与以下任何序列杂交的多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：2；(ii)与SEQ ID NO：2至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列；(iii)与编码SEQ ID NO：1的核酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列，和(vi)与编码SEQ ID NO：15的核酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列。在一些实施方式中，分离的核酸分子包含与以下任何序列完全互补的多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：2；(ii)与SEQ IDNO：2至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列；(iii)与编码SEQ ID NO：1的核酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列，和(vi)与编码SEQ ID NO：15的核酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列。

本发明也涉及一种分离多肽，其包含Na/Pi-IIb2转运蛋白信号肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述分离的多肽包含选自下组的氨基酸序列：(i)SEQID NO：1，(ii)SEQ ID NO：15，和(iii)至少在破囊壶菌中至少对Na/Pi-IIb2转运蛋白而言用作信号序列的与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：15至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述分离多肽包含SEQ ID NO：15的前20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸残基(即SEQ ID NO：15，该序列C末端的最后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个氨基酸被删除)。预计位于SEQ IDNO：15的C末端的18个氨基酸是成熟Na/Pi转运蛋白的一部分，预计所述信号序列的切割位点是在SEQ ID NO：15的氨基酸残基35和36之间。然而，本发明可采用和考虑到至多包含成熟Na/Pi转运蛋白的所有18个氨基酸(即SEQ ID NO：15的最后18个氨基酸残基)的信号肽。根据本发明，分离多肽是从其天然环境取出(即经人工操作)的多肽，可包括(例如)纯化的蛋白质、纯化的肽、部分纯化的蛋白质、部分纯化的肽、重组产生的蛋白质或肽以及合成产生的蛋白质。因此，“分离”不反映多肽的纯化程度。在一些实施方式中，本发明的分离的Na/Pi-IIb2转运蛋白信号肽是重组产生的。

在一些实施方式中，所述分离的核酸分子包含编码α-1,6-甘露糖基转移酶(ALG12)信号肽的多核苷酸序列。ALG12信号肽至少在破囊壶菌中至少对ALG12蛋白可具有信号靶向活性，其包括天然产生的ALG12信号肽的全长肽和其功能片段、融合肽和同源物。在一些实施方式中，所述ALG12信号肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：59。在一些实施方式中，本发明的分离核酸分子包括编码与SEQ ID NO：59至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列编码至少在破囊壶菌中至少对ALG12蛋白而言用作信号肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述分离核酸分子包含编码分离氨基酸序列的多核苷酸序列，所述氨基酸序列包含至少在破囊壶菌中至少对ALG12蛋白而言用作信号肽的SEQ ID NO：59的功能性片段。在一些实施方式中，分离的核酸分子包含SEQ ID NO：60。在一些实施方式中，分离的核酸分子包含与以下任何序列杂交的多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：60；(ii)与SEQ ID NO：60至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列；和(iii)与编码SEQ ID NO：59的核酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列。在一些实施方式中，分离的核酸分子包含与以下任何序列完全互补的多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：60；(ii)与SEQ ID NO：60至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列；和(iii)与编码SEQ ID NO：59的核酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列。

本发明也涉及一种分离多肽，其包含ALG12信号肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述分离的多肽包含选自下组的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO：59和(ii)至少在破囊壶菌中至少对ALG12蛋白而言用作信号序列的与SEQ IDNO：59至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，分离多肽包含SEQID NO：59的前24、25、26、27、28、29、30、31或32个氨基酸残基。在一些实施方式中，本发明的分离的ALG12信号肽是重组产生的。

在一些实施方式中，分离的核酸分子包含编码结合性免疫球蛋白(BiP)信号肽的多核苷酸序列。BiP信号肽至少在破囊壶菌中至少对BiP蛋白可具有信号靶向活性，其包括天然产生的BiP信号肽的全长肽和其功能片段、融合肽和同源物。在一些实施方式中，所述BiP信号肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：61。在一些实施方式中，本发明的分离核酸分子包括编码与SEQ ID NO：61至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列编码至少在破囊壶菌中至少对BiP蛋白而言用作信号肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述分离核酸分子包含编码分离氨基酸序列的多核苷酸序列，所述氨基酸序列包含至少在破囊壶菌中至少对BiP蛋白而言用作信号肽的SEQ ID NO：61的功能性片段。在一些实施方式中，分离的核酸分子包含SEQ ID NO：62。在一些实施方式中，分离的核酸分子包含与以下任何序列杂交的多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：62；(ii)与SEQ ID NO：62至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列；和(iii)与编码SEQ ID NO：61的核酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列。在一些实施方式中，分离的核酸分子包含与以下任何序列完全互补的多核苷酸序列：(i)SEQ IDNO：62；(ii)与SEQ ID NO：62至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列；和(iii)与编码SEQID NO：61的核酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列。

本发明也涉及一种分离多肽，其包含BiP信号肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述分离的多肽包含选自下组的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO：61和(ii)至少在破囊壶菌中至少对BiP蛋白而言用作信号序列的与SEQ ID NO：61至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，分离多肽包含SEQ IDNO：61的前23、24、25、26、27、28、29、30或31个氨基酸残基。在一些实施方式中，本发明的分离的BiP信号肽是重组产生的。

在一些实施方式中，所述分离的核酸分子包含编码α-1.3-葡糖苷酶(GLS2)信号肽的多核苷酸序列。GLS2信号肽至少在破囊壶菌中至少对GLS2蛋白可具有信号靶向活性，其包括天然产生的GLS2信号肽的全长肽和其功能片段、融合肽和同源物。在一些实施方式中，所述GLS2信号肽具有氨基酸序列SEQ IDNO：63。在一些实施方式中，本发明的分离核酸分子包括编码与SEQ ID NO：63至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列编码至少在破囊壶菌中至少对GLS2蛋白而言用作信号肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述分离核酸分子包含编码分离氨基酸序列的多核苷酸序列，所述氨基酸序列包含至少在破囊壶菌中至少对GLS2蛋白而言用作信号肽的SEQID NO：63的功能性片段。在一些实施方式中，分离的核酸分子包含SEQ IDNO：64。在一些实施方式中，分离的核酸分子包含与以下任何序列杂交的多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：64；(ii)与SEQ ID NO：64至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列；和(iii)与编码SEQ ID NO：63的核酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列。在一些实施方式中，分离的核酸分子包含与以下任何序列完全互补的多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：64；(ii)与SEQ ID NO：64至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列；和(iii)与编码SEQ ID NO：63的核酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列。

本发明也涉及一种分离多肽，其包含GLS2信号肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述分离的多肽包含选自下组的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO：63和(ii)至少在破囊壶菌中至少对GLS2蛋白而言用作信号序列的与SEQ ID NO：63至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，分离多肽包含SEQ IDNO：63的前30、31、32、33、34、35、36、37或38个氨基酸残基。在一些实施方式中，本发明的分离的GLS2信号肽是重组产生的。

在一些实施方式中，所述分离的核酸分子包含编码α-1,3-1,6-甘露糖苷酶样信号肽的多核苷酸序列。α-1,3-1,6-甘露糖苷酶样信号肽至少在破囊壶菌中至少对α-1,3-1,6-甘露糖苷酶样蛋白可具有信号靶向活性，其包括天然产生的α-1,3-1,6-甘露糖苷酶样信号肽的全长肽和其功能片段、融合肽和同源物。在一些实施方式中，所述α-1,3-1,6-甘露糖苷酶样信号肽具有氨基酸序列SEQ IDNO：65。在一些实施方式中，本发明的分离核酸分子包括编码与SEQ ID NO：65至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列编码至少在破囊壶菌中至少对α-1,3-1,6-甘露糖苷酶样蛋白而言用作信号肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述分离核酸分子包含编码分离氨基酸序列的多核苷酸序列，所述氨基酸序列包含至少在破囊壶菌中至少对α-1,3-1,6-甘露糖苷酶样蛋白而言用作信号肽的SEQ ID NO：65的功能性片段。在一些实施方式中，分离的核酸分子包含SEQ ID NO：66。在一些实施方式中，分离的核酸分子包含与以下任何序列杂交的多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：66；(ii)与SEQID NO：66至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列；和(iii)与编码SEQ ID NO：65的核酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列。在一些实施方式中，分离的核酸分子包含与以下任何序列完全互补的多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：66；(ii)与SEQ IDNO：66至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列；和(iii)与编码SEQ ID NO：65的核酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列。

本发明也涉及一种分离多肽，其包含α-1,3-1,6-甘露糖苷酶样信号肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述分离的多肽包含选自下组的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO：65和(ii)至少在破囊壶菌中至少对α-1,3-1,6-甘露糖苷酶样蛋白而言用作信号序列的与SEQ ID NO：65至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，分离多肽包含SEQ ID NO：65的前24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个氨基酸残基。在一些实施方式中，本发明的分离的α-1,3-1,6-甘露糖苷酶样信号肽是重组产生的。

在一些实施方式中，所述分离的核酸分子包含编码α-1,3-1,6-甘露糖苷酶样#1信号肽的多核苷酸序列。α-1,3-1,6-甘露糖苷酶样#1信号肽至少在破囊壶菌中至少对α-1,3-1,6-甘露糖苷酶样#1蛋白可具有信号靶向活性，其包括天然产生的α-1,3-1,6-甘露糖苷酶样#1信号肽的全长肽和其功能片段、融合肽和同源物。在一些实施方式中，所述α-1,3-1,6-甘露糖苷酶样#1信号肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：67。在一些实施方式中，本发明的分离核酸分子包括编码与SEQ ID NO：67至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列编码至少在破囊壶菌中至少对α-1,3-1,6-甘露糖苷酶样#1多肽而言用作信号肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述分离核酸分子包含编码分离氨基酸序列的多核苷酸序列，所述氨基酸序列包含至少在破囊壶菌中至少对α-1,3-1,6-甘露糖苷酶样#1蛋白而言用作信号肽的SEQ ID NO：67的功能性片段。在一些实施方式中，分离的核酸分子包含SEQ ID NO：68。在一些实施方式中，分离的核酸分子包含与以下任何序列杂交的多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：68；(ii)与SEQ ID NO：68至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列；和(iii)与编码SEQ ID NO：67的核酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列。在一些实施方式中，分离的核酸分子包含与以下任何序列完全互补的多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：68；(ii)与SEQ ID NO：68至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列；和(iii)与编码SEQ ID NO：67的核酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列。

本发明也涉及一种分离多肽，其包含α-1,3-1,6-甘露糖苷酶样#1信号肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述分离的多肽包含选自下组的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO：67和(ii)至少在破囊壶菌中至少对α-1,3-1,6-甘露糖苷酶样#1蛋白而言用作信号序列的与SEQ ID NO：67至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，分离多肽包含SEQ ID NO：67的前23、24、25、26、27、28或29个氨基酸残基。在一些实施方式中，本发明的分离的α-1,3-1,6-甘露糖苷酶样#1信号肽是重组产生的。

在一些实施方式中，所述分离的核酸分子包含编码α-1,2-甘露糖苷酶样信号肽的多核苷酸序列。α-1,2-甘露糖苷酶样信号肽至少在破囊壶菌中至少对α-1,2-甘露糖苷酶样蛋白可具有信号靶向活性，其包括天然产生的α-1,2-甘露糖苷酶样信号肽的全长肽和其功能片段、融合肽和同源物。在一些实施方式中，所述α-1,2-甘露糖苷酶样信号肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：69。在一些实施方式中，本发明的分离核酸分子包括编码与SEQ ID NO：69至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列编码至少在破囊壶菌中至少对α-1,2-甘露糖苷酶样蛋白而言用作信号肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述分离核酸分子包含编码分离氨基酸序列的多核苷酸序列，所述氨基酸序列包含至少在破囊壶菌中至少对α-1,2-甘露糖苷酶样蛋白而言用作信号肽的SEQ ID NO：69的功能性片段。在一些实施方式中，分离的核酸分子包含SEQ ID NO：70。在一些实施方式中，分离的核酸分子包含与以下任何序列杂交的多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：70；(ii)与SEQ ID NO：70至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列；和(iii)与编码SEQ ID NO：69的核酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列。在一些实施方式中，分离的核酸分子包含与以下任何序列完全互补的多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：70；(ii)与SEQ ID NO：70至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列；和(iii)与编码SEQ ID NO：69的核酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列。

本发明也涉及一种分离多肽，其包含α-1,2-甘露糖苷酶样信号肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述分离的多肽包含选自下组的氨基酸序列：(i)SEQID NO：69和(ii)至少在破囊壶菌中至少对α-1,2-甘露糖苷酶样蛋白而言用作信号序列的与SEQ ID NO：69至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，分离多肽包含SEQ ID NO：69的前26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个氨基酸残基。在一些实施方式中，本发明的分离的α-1,2-甘露糖苷酶样信号肽是重组产生的。

在一些实施方式中，所述分离的核酸分子包含编码β-木糖苷酶样信号肽的多核苷酸序列。β-木糖苷酶样信号肽至少在破囊壶菌中至少对β-木糖苷酶样蛋白而言可具有信号靶向活性，其包括天然产生的β-木糖苷酶样信号肽的全长肽和其功能片段、融合肽和同源物。在一些实施方式中，所述β-木糖苷酶样信号肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：71。在一些实施方式中，本发明的分离核酸分子包括编码与SEQ ID NO：71至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列编码至少在破囊壶菌中至少对β-木糖苷酶样蛋白而言用作信号肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述分离核酸分子包含编码分离氨基酸序列的多核苷酸序列，所述氨基酸序列包含至少在破囊壶菌中至少对β-木糖苷酶样蛋白而言用作信号肽的SEQ ID NO：71的功能性片段。在一些实施方式中，分离的核酸分子包含SEQ ID NO：72。在一些实施方式中，分离的核酸分子包含与以下任何序列杂交的多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：72；(ii)与SEQ ID NO：72至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列；和(iii)与编码SEQ ID NO：71的核酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列。在一些实施方式中，分离的核酸分子包含与以下任何序列完全互补的多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：72；(ii)与SEQ ID NO：72至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列；和(iii)与编码SEQ ID NO：71的核酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列。

本发明也涉及一种分离多肽，其包含β-木糖苷酶样信号肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述分离的多肽包含选自下组的氨基酸序列：(i)SEQ IDNO：71和(ii)至少在破囊壶菌中至少对β-木糖苷酶样蛋白而言用作信号序列的与SEQ ID NO：71至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，分离多肽包含SEQ ID NO：71的前24、25、26、27、28、29或30个氨基酸残基。在一些实施方式中，本发明的分离的β-木糖苷酶样信号肽是重组产生的。

在一些实施方式中，所述分离的核酸分子包含编码胡萝卜素合酶信号肽的多核苷酸序列。胡萝卜素合酶信号肽至少在破囊壶菌中至少对胡萝卜素合酶蛋白可具有信号靶向活性，其包括天然产生的胡萝卜素合酶信号肽的全长肽和其功能片段、融合肽和同源物。在一些实施方式中，所述胡萝卜素合酶信号肽具有氨基酸序列SEQ ID NO：73。在一些实施方式中，本发明的分离核酸分子包括编码与SEQ ID NO：73至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列编码至少在破囊壶菌中至少对胡萝卜素合酶蛋白而言用作信号肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述分离核酸分子包含编码分离氨基酸序列的多核苷酸序列，所述氨基酸序列包含至少在破囊壶菌中至少对胡萝卜素合酶蛋白而言用作信号肽的SEQ ID NO：73的功能性片段。在一些实施方式中，分离的核酸分子包含SEQ ID NO：74。在一些实施方式中，分离的核酸分子包含与以下任何序列杂交的多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：74；(ii)与SEQ IDNO：74至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列；和(iii)与编码SEQ ID NO：73的核酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列。在一些实施方式中，分离的核酸分子包含与以下任何序列完全互补的多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：74；(ii)与SEQ IDNO：74至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列；和(iii)与编码SEQ ID NO：73的核酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列。

本发明也涉及一种分离多肽，其包含胡萝卜素合酶信号肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述分离的多肽包含选自下组的氨基酸序列：(i)SEQ IDNO：73和(ii)至少在破囊壶菌中至少对胡萝卜素合酶蛋白而言用作信号序列的与SEQ ID NO：73至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，分离多肽包含SEQ ID NO：73的前15、16、17、18、19、20、21、29、30、31、32、33或34个氨基酸残基。在一些实施方式中，本发明的分离的胡萝卜素合酶信号肽是重组产生的。

在一些实施方式中，分离的核酸分子包含编码Sec1蛋白(“Sec1”)信号肽的多核苷酸序列。Sec1信号肽至少在破囊壶菌中至少对Sec1蛋白可具有分泌信号活性，其包括天然产生的Sec1信号肽的全长肽和其功能片段、融合肽和同源物。在一些实施方式中，Sec1信号肽由SEQ ID NO：37代表。在一些实施方式中，本发明的分离核酸分子包括编码与SEQ ID NO：37至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列编码至少在破囊壶菌中至少对Sec1蛋白而言用作信号肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述分离核酸分子包含编码分离氨基酸序列的多核苷酸序列，所述氨基酸序列包含至少在破囊壶菌中至少对Sec1蛋白而言用作信号肽的SEQ ID NO：37的功能性片段。在一些实施方式中，分离的核酸分子包含SEQ ID NO：38。在一些实施方式中，分离的核酸分子包含与以下任何序列杂交的多核苷酸序列：(i)SEQ IDNO：38；(ii)与SEQ ID NO：38至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列；和(iii)与编码SEQID NO：37的核酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列。在一些实施方式中，分离的核酸分子包含与以下任何序列完全互补的多核苷酸序列：(i)SEQ ID NO：38；(ii)与SEQ ID NO：38至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列；和(iii)与编码SEQ ID NO：37的核酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的多核苷酸序列。

本发明也涉及一种分离多肽，其包含Sec1信号肽的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述分离的多肽包含选自下组的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO：37和(ii)至少在破囊壶菌中至少对Sec1转运蛋白而言用作信号序列的与SEQ IDNO：37至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述分离多肽包含某氨基酸序列，该氨基酸序列包含SEQ ID NO：37的前18或19个氨基酸残基(即SEQ ID NO：37，该序列的C末端的最后1或2个氨基酸被删除)。在一些实施方式中，本发明的分离的Sec1信号肽是重组产生的。

在一些实施方式中，本发明的分离核酸分子包含OrfC启动子、EF1短启动子、EF1长启动子、60S短启动子、60S长启动子、Sec1启动子、PKS OrfC终止子区、Na/Pi-IIb2转运蛋白信号肽的编码序列或本发明Sec1转运蛋白信号肽的编码序列，其操作性连接于编码某蛋白质的核酸序列的5'末端。本发明也包括重组载体(包括但不限于：表达载体)、表达盒和宿主细胞，其包含OrfC启动子、EF1短启动子、EF1长启动子、60S短启动子、60S长启动子、Sec1启动子、PKS OrfC终止子区、Na/Pi-IIb2转运蛋白信号肽的编码序列或本发明Sec1转运蛋白信号肽的编码序列，其操作性连接于编码某蛋白质的核酸序列的5'末端。

本发明也包括包含任何上述本发明的分离核酸分子(如包含OrfC启动子、EF1短启动子、EF1长启动子、60S短启动子、60S长启动子、Sec1启动子、PKS OrfC终止子区、Na/Pi-IIb2转运蛋白信号肽编码序列或Sec1转运蛋白信号肽编码序列)的重组载体(包括但不限于表达载体)、表达盒、宿主细胞和微生物，以及将所述载体和/或表达盒引入所述宿主细胞和重组微生物的方法。可选择或构建合适的载体和表达盒，使其包含合适的调节序列、终止子片段、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其它合适序列。本文列出了有关载体、表达盒和宿主细胞的其它细节。

除非另有说明，本文所用的相同性百分数(％)(和相同性％)指利用以下方法进行的同源性评估：(1)以标准默认参数进行BLAST2.0基本BLAST同源性检索，利用blastp进行氨基酸检索，利用blastn进行核酸检索，其中默认过滤查询序列的低复杂性区域(参见例如，Altschul，S.等，Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1997)，通过引用全文纳入本文)；(2)采用下述参数进行BLAST2比对；(3)和/或采用标准默认参数进行PSI-BLAST(位置特异性迭代BLAST)。应注意，由于BLAST2.0基本BLAST和BLAST2的标准参数有些差异，采用BLAST2程序可认定两个具体序列显著同源，而用BLAST2.0基本BLAST进行的检索可能不认定第二个序列是第一个查询序列的最高匹配序列之一。此外，PSI-BLAST提供自动化、容易使用的“概况”检索，这是一种寻找序列同源物的灵敏方式。该程序首先进行缺口BLAST数据库检索。PSI-BLAST程序利用返回的任何显著比对的信息构建位置特异性评分矩阵，其在下一轮数据库检索中代替查询序列。因此，应理解，可采用这些程序中任何一种确定相同性百分数。

可如Tatusova和Madden，FEMS Microbiol.Lett.174:247-250(1999)(通过引用全文纳入本文)所述，采用BLAST2序列比对两个具体序列。采用BLAST2.0算法中的blastp或blastn进行BLAST2序列比对，以便在允许在所得比对中引入缺口(缺失和插入)的情况下对两个序列进行进行缺口BLAST检索(BLAST2.0)。在一些实施方式中，采用如下所示的标准默认参数进行BLAST2序列比对。

在blastn中，采用0BLOSUM62矩阵：

匹配奖励＝1

错配罚分＝-2

开放缺口(5)和延伸缺口(2)罚分

缺口x_降低(x_dropoff)(50)预计值(10)字长(11)过滤器(开)。

在blastp中，采用0BLOSUM62矩阵：

开放缺口(11)和延伸缺口(1)罚分

缺口x_降低(50)预计值(10)字长(3)过滤器(开)。

本文所用的杂交条件指可利用某核酸分子鉴定相似核酸分子的标准杂交条件。参见例如，Sambrook J.和Russell D.(2001)《分子克隆：实验室手册》(Molecular cloning:A laboratory manual)，第3版，纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)，通过引用全文纳入本文。此外，计算允许以不同的核苷酸错配程度实现杂交的合适杂交和洗涤条件的公式参见例如，Meinkoth等，Anal.Biochem.138，267-284(1984)，通过引用全文纳入本文。

更具体说，本文所用的中等严格的杂交和洗涤条件指能够分离与在杂交反应中用于探测的核酸分子的核酸序列至少约70％相同的核酸分子的条件(即，允许约30％或更少的核苷酸错配的条件)。本文所用的高度严格的杂交和洗涤条件指能够分离与在杂交反应中用于探测的核酸分子的核酸序列至少约80％相同的核酸分子的条件(即，允许约20％或更少的核苷酸错配的条件)。极高严格的杂交和洗涤条件指能够分离与在杂交反应中用于探测的核酸分子的核酸序列至少约90％相同的核酸分子的条件(即，允许约10％或更少的核苷酸错配的条件)。如上所述，本领域技术人员可采用，例如，Meinkoth等所述的公式计算合适的杂交和洗涤条件，以实现这些具体核苷酸错配水平。这类条件将根据是否形成DNA:RNA或DNA:DNA杂交体而改变。DNA:DNA杂交体的解链温度计算值比DNA:RNA杂交体的计算值低10℃。在具体实施方式中，DNA:DNA杂交体的严格杂交条件包括在6X SSC(0.9M Na⁺)离子强度下，在约20℃至约35℃的温度下(低严格性)、约28℃和约40℃的温度下(提高严格性)和约35℃至约45℃的温度下(更高严格性)杂交，并采用合适的洗涤条件。在具体实施方式中，DNA:RNA杂交体的严格杂交条件包括在6X SSC(0.9M Na⁺)离子强度下，在约30℃至约45℃的温度下、约38℃和约50℃的温度下和约45℃至约55℃的温度下(更高严格性)杂交，并采用类似严格性的洗涤条件。这些数值基于大于约100个核苷酸的分子、0％甲酰胺和G+C含量约40％时的解链温度计算值。或者，可以如Sambrook等所述根据经验计算T_m。通常，洗涤条件应该尽可能严格，并且应适合所选的杂交条件。例如，杂交条件可包括比特定杂交体的T_m计算值低约20-25℃的盐和温度条件的组合，洗涤条件通常包括比特定杂交体的T_m计算值低约12-20℃的盐和温度条件的组合。适用于DNA:DNA杂交体的杂交条件的一个例子包括在6X SSC(50％甲酰胺)中约42℃下杂交2-24小时，随后是洗涤步骤，包括在室温下用约2X SSC洗涤一次或多次，随后在较高温度和较低的离子强度下进行额外洗涤(如用约0.1X-0.5XSSC在约37℃至少洗涤一次，然后用约0.1X-0.5X SSC在约68℃至少洗涤一次)。

尽管已经总的描述了本发明，但通过参考本文提供的实施例可进一步理解本发明。这些实施例仅用于说明目的，不构成限制。

实施例1

构建裂殖壶菌属蛋白质表达载体pSchizE

a.构建p07074#6：

用XbaI和绿豆核酸酶消化pSP73载体(普洛麦格公司(Promega)，登录号X65333)，然后纯化和连接产生载体p070604#3。接着，用SphI、HpaI和绿豆核酸酶进一步消化p070604#3，然后纯化并再连接产生载体p070704#6。

b.构建pSchiz1：

用BamHI消化pTUBzeo11-2载体(如WO02/083869所述)以释放含有裂殖壶菌属α-微管蛋白启动子、ble基因和SV40终止子区的1122碱基对(bp)片段。凝胶纯化该片段，并连接到已经用BamHI事先消化的载体pYES2/CT(英杰公司(Invitrogen))中。然后，用SmaI、SphI和绿豆核酸酶消化所得构建物，以释放含有α-微管蛋白启动子的540bp片段。将该片段连接到事先用BamHI、SmaI和绿豆连接酶消化的pUC19(Genbank登录号L09137)中，产生pSchiz1。

c.构建pSchiz2：

在单独反应中，利用掺入用于连接的NcoI和PciI限制性位点(以斜体显示)的下列引物，通过PCR产生扩增子，该扩增子编码来自pTUBzeo11-2的SV40终止子：

引物S4termF：5'-GATCCACGTGCTACG(SEQ ID NO：16)

引物S4termR：5'-GGCAATGATAAGATAC(SEQ ID NO：17)

用NcoI和PciI消化所得的扩增子，以暴露粘性末端。然后，将此265bp的片段连接到事先用NcoI消化的pSchiz1中。所得质粒(称为pSchiz2)含有α-微管蛋白启动子后接SV40终止子。

d.构建pSchiz3：

利用经设计在扩增子两端加入SmaI位点(斜体显示)的下列引物，通过PCR从pYES2/CT扩增多克隆位点(MCS)：

引物C2mcsSmaF：5'-GATCTTAAGCTTGGT(SEQ IDNO：18)

引物C2mcsSmaR：5'-ACTGGTTTAAACTC(SEQ IDNO：19)

然后，用SmaI消化所得MCS扩增子并连接到事先用NcoI和绿豆核酸酶消化的pSchiz2中。所得载体(称为pSchiz3)含有α微管蛋白启动子、SV40终止子和pYES2/CT MCS。

e.构建pSchiz0.5#4

采用以下引物和模板pSchiz3进行PCR，以产生编码MCS盒的扩增子，所述MCS盒由α-微管蛋白启动子、pYES2/CT MCS和SV40终止子区构成。

引物5'tubMCS_BglII：5'-GACTCAATTTTAGGCCCCCCACTGACCG

(SEQ ID NO：20)

引物3'SV40MCS_Sal：5'-GACTCATGTATGATAAGATACATTGATG

(SEQ ID NO：21)

设计这些引物，以便在MCS盒扩增子末端加入BglII和SalI限制性位点(以斜体显示)。用BglII和SalI消化所得PCR片段并连接到事先用BglII和SalI消化的p070704#6中，产生pSchiz0.5#4。

f.构建pSchizE

用美国专利7,001,772所述的载体pMON50203作模板，通过PCR产生编码ALS基因的4776bp的扩增子(包括其启动子和终止子区)。将包含NdeI和BglII限制性位点(以斜体显示)的下列引物用于此PCR反应：

引物5'ALSproNde3：5'-GACTGCCCAGGCCTACTTTCAC(SEQ ID NO：22)

引物3'ALStermBglII：5'GACTGGGTCAAGGCAGAAGAATTCCGCC(SEQ ID NO：23)

接着，用BglII和NdeI消化所得的ALS扩增子。同样，用BglII和NdeI消化pSchiz0.5#4，凝胶纯化较大的3171bp条带并连接到纯化的ALS PCR扩增子中。通过测序验证所得载体(称为pSchizE)，其包含ALS基因(包括启动子和终止子区)，后接含有裂殖壶菌属α-微管蛋白启动子、pYES2/CT MCS和SV40终止子区的表达盒(参见图5)。

实施例2

构建裂殖壶菌属蛋白质表达载体pSchiz-sG

利用pSchiz-sG表达和分泌eGFP(见图6)。此质粒也称为pCO0001，其于2008年11月18日保藏于美国典型培养物保藏中心(美国弗吉尼亚州玛纳萨斯大学大道10801号专利保藏中心(Patent Depository,10801University Boulevard,Manassas,VA20110-2209))，ATCC登录号为PTA-9617。此载体含有(i)裂殖壶菌属α-微管蛋白启动子序列，后接(ii)编码连接有成熟转运蛋白N-末端部分的片段的裂殖壶菌属Na/Pi转运蛋白信号序列的序列，(SEQ ID NO：15)，其与eGFP-编码序列融合，后接(iii)MCS的其余部分和(iv)SV40终止子区。此载体还含有裂殖壶菌属ALS基因作为选择标记物。如下所述构建该载体。

选择编码信号肽的序列(SEQ ID NO：2)来自由裂殖壶菌属EST文库分离的Na/Pi转运蛋白。通过PCR，利用含eGFP的质粒pPha-T1-eGFP(Apt等，J.Cell Sci.115:4061-4069(2002))和设计加入信号序列的3个引物融合编码信号肽和eGFP的核苷酸序列。第一个PCR反应采用含eGfp的质粒(作模板)、eGfp3'末端的小引物(引物sec.Gfp3'Spe，含有SpeI位点，下面以斜体显示)以及侧接eGfp5'末端和信号序列3'末端的100bp引物(引物sec.Gfp5'1b，sec)。引物序列如下：

引物sec.Gfp5'1b：5'-TACTGGTTCCTTGTCGGCCTCGCCCTTCTCGGCGAT

GGCTTCAAGGTCATCGCCGGTGACTCCGCCGGTACGCTCTTCATGGTGAGCAAGGGCGAGG(SEQ ID NO：24)

引物sec.Gfp3'Spe：5'-CGTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC(SEQ ID NO：25)

在第二个PCR反应中，将第一个PCR的扩增子产物用作模板。采用相同的3'引物，以及掺入信号序列其余部分的第二个100bp5'引物(sec.Gfp5'Bam)。第二个5'引物序列含有BamHI位点(下面以斜体显示)，如下所示：

引物sec.Gfp5'Bam：5'-TAATATGGCCAACATCATGGCC

AACGTCACGCCCCAGGGCGTCGCCAAGGGCTTTGGCCTCTTTGTCGGCGTGCTCTTCTTTCTCTACTGGTTCCTTGT(SEQ ID NO：26)

第二个PCR反应得到的PCR产物含有用于克隆的BamHI和SpeI位点。

用BamHI和SpeI消化第二个PCR反应的扩增子和pSchizE，互相连接产生载体pSchiz-sG。

实施例3

构建裂殖壶菌属蛋白质表达载体pSchiz-sGr

pSchiz-sGr载体包含α-微管蛋白启动子、具有编码ER保留信号的序列的eGFP核苷酸序列、SV40终止子区和突变的ALS选择标记物。

反相翻译共有的ER保留信号氨基酸序列HDEL，并利用实施例2的pSchiz-sG作模板，通过PCR将此保留信号的编码序列(SEQ ID NO：14)融合于eGFP。设计寡核苷酸引物，以包含HDEL编码序列(下述ss.eGfpHELD3'RV引物序列中下划线表示的反向互补物)，在同一读框内还有终止密码子(方框表示)，其中BamHI位点(以斜体显示)在一个引物中，EcoRV位点(以斜体显示)在另一个引物中。

引物ss.eGfpHELD3'RV：5'-CCTTTACAACTCGTCGTGGTTGTACA

GCTCGTCC(SEQ ID NO：27)

引物sec.Gfp5'Bam2：5'-TAATATGGCCAACATCATGG

CCAACGTCACGCCCCAGGGCGTCGCCAAGGGCTTTGGCCTCTTTGTCGGC GTGCTCTTCTTTCT CTACTGGTTCCTTGT(SEQ ID NO：28)

用BamHI和EcoRV消化所得PCR产物，与BamHI和EcoRV消化pSchizE获得的较大片段(如实施例1所述)连接。所得载体称为pSchiz-sGr(见图7)。

实施例4

构建裂殖壶菌属蛋白质表达载体pSchiz-cG

作为比较对照，构建pSchiz-cG载体以表达eGFP，使得该荧光蛋白在细胞质中累积。pSchiz-cG质粒包含裂殖壶菌属OrfC启动子、编码eGFP的多核苷酸序列、SV40终止子区和突变的裂殖壶菌属ALS选择标记物。

首先，用以下引物从裂殖壶菌ATCC20888的基因组DNA中PCR扩增裂殖壶菌属ORFC上游的2000bp序列：

引物prREZ15：5'-CCGCGAATCAAGAAGGTAGGC(SEQID NO：29)

引物prREZ16：5'-CCGTCTCTGCCGCTTTTTCTT(SEQID NO：30)

所述prREZ15和prREZ16引物分别包含KpnI和BamHI序列(斜体)。用BamHI和KpnI消化所得扩增子，并进行凝胶纯化。

接下来，用以下引物从裂殖壶菌ATCC20888的基因组DNA中PCR扩增裂殖壶菌属ORFC下游的1985bp序列：

引物prREZ17：5'-CGAAAGTGAACCTTGTCCTAACCC(SEQ ID NO：31)

引物prREZ18：5'-CCAGATCCGCACCATCGGCCG(SEQ IDNO：32)

所述prREZ17和prREZ18引物分别包含BamHI序列和XbaI序列(斜体)。用BamHI和XbaI消化所得扩增子，并进行凝胶纯化。

接着，用KpnI和XbaI消化载体pBluescript SK(+)(司查塔基公司(Stratagene)，登录号X52328)，并进行凝胶纯化。同时连接此载体和上述产生的两个扩增子，以产生载体pREZ22。

然后，载体pSchizE(实施例1)用BamHI消化，用绿豆核酸酶处理，节行柱纯化，用XbaI消化，然后进行凝胶纯化。接着，用以下引物进行PCR，以产生含有eGFP编码区的扩增子(采用pPha-T1-eGFP作模板)：

引物5'eGFP_kpn：5'-GACTATGGTGAAGCAAGGGCGAGGAG(SEQ ID NO：33)

引物3'eGFP_xba：5'-GACTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC(SEQ ID NO：34)

接着用XbaI消化此扩增子，与上述pSchizE的片段连接产生载体pSchizE-eGFP。

利用pREZ22作模板，通过PCR产生编码ORFC的启动子的扩增子。该PCR中使用以下引物，各自含有KpnI限制性序列(以斜体显示)：

引物5'ORFCproKpn-2：5'-GATCGGTGTTCTTTGTTTTGATTTCT(SEQ ID NO：35)

引物3'ORFCproKpn-2：5'-GATCGTCTCTGCCGCTTTTTCTTTA(SEQ ID NO：36)

然后用KpnI消化此扩增子。接着用KpnI消化pSchizE-eGFP载体，产生两个片段。对较大片段(7554bp)进行凝胶纯化，并与上述KpnI消化的扩增子连接产生pSchiz-cG载体，其包含裂殖壶菌属ORFC启动子序列，后接eGFP序列和SV40终止子区(见图8)。

实施例5

转化裂殖壶菌属和后续蛋白质表达

除非另有说明，利用适合给定培养规模的恰根(Qiagen)试剂盒(加州瓦伦西亚(Valencia，CA))，在用于质粒纯化的大肠杆菌(E.coli)UltraMax DH5-αFT化学感受态细胞(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA))中扩增所有载体和构建物。

裂殖壶菌ATCC20888在M2B培养基中培养，该培养基由10g/L葡萄糖、0.8g/L(NH₄)₂SO₄、5g/L Na₂SO₄、2g/L MgSO₄·7H₂O、0.5g/L KH₂PO₄、0.5g/LKCl、0.1g/L CaCl₂·2H₂O、0.1M MES(pH6.0)、0.1％PB26金属和0.1％PB26维生素(v/v)构成。PB26维生素由50mg/mL维生素B12、100μg/mL硫胺和100μg/mL泛酸钙构成。将PB26金属调节至pH4.5，其由3g/L FeSO₄·7H₂O、1g/LMnCl₂·4H₂O、800mg/mL ZnSO₄·7H₂O、20mg/mL CoCl₂·6H₂O、10mg/mLNa₂MoO₄·2H₂O、600mg/mL CuSO₄·5H₂O和800mg/mL NiSO₄·6H₂O构成。对PB26母液进行单独过滤除菌，高压灭菌后加入肉汤中。将葡萄糖、KH₂PO₄和CaCl₂·2H₂O与其余肉汤成分分开单独灭菌，然后混合，以防止盐沉淀和糖焦化。所有培养基成分均购自密苏里州圣路易斯的西格玛化学品公司(SigmaChemical,St.Louis,MO)。将裂殖壶菌培养物培养至指数期，通过生物射弹(Biolistic)^TM颗粒轰击器(加州赫克里斯的伯乐公司(BioRad，Hercules，CA))，利用载体pSchiz-E1(实施例1)、pSchiz-sG(实施例2)、pSchiz-sGr(实施例3)或pSchiz-cG(实施例4)转化。生物射弹^TM转化方法与先前所述基本相同(参见Apt等，J.Cell.Sci.115(Pt21):4061-9(1996)和美国专利7,001,772)。在固体M2B培养基上27℃培育2-6天后选择原代转化体，该培养基含有20g/L琼脂(宾夕法尼亚州西切斯特的VWR公司(VWR，West Chester，PA))、10μg/mL甲嘧磺隆(SMM)(宾夕法尼亚州西切斯特的化学服务公司(Chem Service，Westchester，PA))。将所有原代转化体手工转移到含有SMM的新鲜M2B平板上。

通过荧光和普通光显微镜分析原代转化体集落。还利用原代转化体集落接种50mL M2B-SMM液体培养基。27℃培育2-5天后，5500xg离心15分钟收获培养物。用CP(Centriprep)^TM重力浓缩器(马萨诸塞州比尔里卡的密理博公司(Millipore，Billerica，MA))将无细胞上清液浓缩100倍，用水洗涤细胞沉淀，用液氮冻存，然后用两倍于细胞沉淀重量的裂解缓冲液(由50mM磷酸钠(pH7.4)、1mM EDTA、5％甘油和1mM新鲜的苯基甲基磺酰氟构成)和两倍于细胞沉淀重量的0.5mm玻璃珠(密苏里州圣路易斯的西格玛公司)重悬。接着在多管涡旋器(宾夕凡尼亚州西切斯特的VWR公司)中以最大速度4℃涡旋3小时(h)，以裂解细胞沉淀混合物。然后将细胞裂解物以5500xg4℃离心10分钟。保留上清液，并以5500xg4℃再离心10分钟。在本文中，将所得上清液定义为“无细胞提取物”。用布拉德福德(Bradford)试剂盒(密苏里州圣路易斯的西格玛公司)定量测定无细胞上清液和无细胞提取物的蛋白质，在上样于4-12％聚丙烯酰胺双Tris凝胶(加州赫克里斯的伯乐公司)之前，按照生产商说明书(加州赫克里斯的伯乐公司)将其与XT样品缓冲液的混合物煮沸。

SDS-PAGE凝胶用考马斯燃料染色，或通过蛋白质印迹转移到PVDF上。印迹后，用Tris-缓冲盐水(TBS)(密苏里州圣路易斯的西格玛公司)冲洗PVDF膜，并用5％脱脂牛奶(NFDM)的TBS溶液室温处理2小时。根据生产商说明书用5％NFDM-TBS稀释对感兴趣蛋白质特异的第一抗体。如果需要，除去该溶液并更换新鲜的加入第二抗体的5％NFDM-TBS，所述第二抗体偶联于碱性磷酸酶并对第一抗体有特异性。如果不用第二抗体，第一抗体将偶联于碱性磷酸酶。然后，用TBS冲洗抗体处理的PVDF，并用5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸/硝基氮蓝四唑溶液(BCIP/NBT)(马里兰州盖瑟斯堡的KPL公司(KPL，Gaithersburg，MD))处理。

如图9所示，用pSchizGr转化的裂殖壶菌中eGFP定位于ER(也参见图10)，而用pSchizcG转化的裂殖壶菌的整个胞质中都显示有eGFP。用pSchizE(空载体对照)转化的裂殖壶菌不表达eGFP。如图11所示，在pSchiz-sG转化的裂殖壶菌的无细胞上清液样品(即细胞外)和无细胞提取物中检测到eGFP。pSchiz-sGr转化的裂殖壶菌的无细胞提取物中含有eGFP，但无细胞上清液中含量较少。最后，在pSchizcG转化的裂殖壶菌中，几乎只有无细胞提取物中含有eGFP。

实施例6

鉴定Sec1信号肽

以前用工业标准技术为BLAST检索产生、组装和格式化了裂殖壶菌属的基因组序列。浓缩在N-充满条件下培养的裂殖壶菌培养物上清液，并用SDS-PAGE跑胶。从凝胶上剪下主要的分泌蛋白条带，用于氨基酸测序。通过BLAST比较所得氨基酸序列与裂殖壶菌属基因组(算法–tBLASTn，低复杂性过滤–关闭，预计值–1000，矩阵–PAM30，无缺口比对–开放)，鉴定相应的ORF。利用信号P算法(SignalP algorithm)分析该ORF的5'部分。参见例如，Bendsten等，J.Mol.Biol.340:783-795(2004)；Nielsen和Krogh，Proc.Int.Conf.Intell.Syst.Mol.Biol.6:122-130(1998)；Nielsen等，Protein Engineering12:3-9(1999)；Emanuelsson等，Nature Protocols2:953-971(2007)。根据该项分析，将Sec1蛋白的5'区鉴定为分泌信号。参见图12(包含SEQ ID NO：37)和图13(SEQ IDNO：38)。

实施例7

构建裂殖壶菌载体pSchiz-Cpt

pSchiz-Cpt载体含有OrfC启动子和终止子，以及ALS选择标记物。简要说，首先用KpnI/XbaI消化pSchizE质粒，然后对所得的6.89kb片段进行凝胶纯化，以构建此载体。该消化也导致除去pSchizE质粒上的微管蛋白启动子和大部分多聚接头；而ALS编码序列保持不变。向所得的6.8kb SchizE主链中连接4kb KpnI/XbaI片段，该片段含有裂殖壶菌属OrfC上游的2kb序列和裂殖壶菌属OrfC下游的2kb序列，用BamHI位点分割所述上游和下游区段。从质粒pREZ22中切下该4kb KpnI/XbaI片段(参见实施例4)。所述6.8kb pSchizE主链和4kb KpnI/XbaI片段连接产生pSchiz-Cpt。

实施例8

构建裂殖壶菌属蛋白质表达载体pSchizCpt-s1eGFP

所述pSchizCpt-s1eGFP质粒包含裂殖壶菌属OrfC启动子、eGFP编码序列之前的Sec1信号序列和OrfC终止子，以及突变的裂殖壶菌属ALS选择标记物序列。参见图14。此质粒也称为pCL0001，其于2008年11月18日保藏于美国典型培养物保藏中心(美国弗吉尼亚州玛纳萨斯大学大道10801号专利保藏中心(Patent Depository,10801University Boulevard,Manassas,VA20110-2209))，ATCC登录号为PTA-9615。

实施例9

在发酵罐中裂殖壶菌表达和分泌eGFP

如实施例5所述，用pSchizCpt-s1eGFP(见实施例8)转化裂殖壶菌属细胞。在M2B琼脂平板上分离SMM抗性细胞系，将其转移到摇瓶中的M2B液体培养物(含有10μg/ml SMM)中，27.5℃振荡孵育(150rpm)。培育72-168小时后，离心收获培养物(5000xg，10分钟)，用C&M(Centriprep and Microcon)浓缩器(MWCO10000)浓缩无细胞上清液(约250倍)。样品(1-7μl)在SDS-PAGE上跑胶，将分离的蛋白质转移到PVDF膜上。用兔抗-eGFP IgG(百信公司(Biovision))探测封闭和洗涤的膜，并且使用碱性磷酸酶偶联的山羊抗-兔IgG(fc)(普洛麦格公司(Promega))和BCIP/NBT试剂处理观察发生反应的蛋白质条带。选择eGFP表达量最高的细胞系。

在2.0L(工作容积)发酵罐中培育一种高产细胞系。有挡板的接种瓶中含有150ml HD1培养基，在29.5℃下200rpm振荡培育24-48h。用接种体培养物接种含有以下物质的发酵罐：50g/L葡萄糖、13.62g/L Na₂SO₄、0.72g/LK₂SO₄、0.56g/L KCl、2.27g/L MgSO₄.7H₂O、1.8g/L KH₂PO₄、17.5g/L(NH₄)₂SO₄、0.19g/L CaCl₂.2H₂O、51.5mg FeSO₄.7H₂O、3.1g/L MnCl₂.4H₂O、6.2g/L ZnSO₄.7H₂O、0.04mg CoCl₂.6H₂O、0.04mg Na₂MoO₄、2.07g/LCuSO₄.5H₂O、2.07g/L NiSO₄.6H₂O、9.75mg硫胺、0.16mg维生素B12和3.33mg泛酸钙。在培养过程中，温度是29.5℃，dO₂％控制在20％，葡萄糖浓度保持在15-20g/L(初始水平落入该范围后)，pH位置在6.5。在无菌条件下以一定间隔取出样品进行分析。

通过SDS-PAGE分离未浓缩的无细胞上清液样品(含有0.5-5.0μg总蛋白)，将蛋白质转移到PVDF膜上。如上所述，检测经封闭和洗涤的膜上分泌的eGFP。参见图15。

实施例10

构建裂殖壶菌属蛋白质表达载体pSchizCpt-s1κbh

所述pSchizCpt-s1κbh质粒包含裂殖壶菌属OrfC启动子、编码IgGκ亚基的多核苷酸序列之前的Sec1信号序列和OrfC终止子区，以及突变的裂殖壶菌属ALS选择标记物序列(见图16)。表达载体的制备如下：

将蓝色合龙生物技术公司(Blue Heron Biotechnologies)利用图42的密码子使用表由相应氨基酸序列产生的、再合成的(密码子优化的)IgG κ链编码基因(具有5'Sec1分泌信号序列)克隆到质粒pSchiz-Cpt中orfC启动子和orfC终止子之间的位置。简要说，根据酶生产商说明(新英格兰生物实验室公司(NewEngland Biolabs))用BamHI和碱性磷酸酶消化载体pSchiz-Cpt。将其连接到用以下引物和模板产生的BglII(NEB)消化的扩增子中：

引物5'ss-X Bgl长：GACTagatctATGAAGTTCGCGACCTCG(SEQ IDNO：39)

引物3'ritx_kap_bh_Bgl：gactagatctTCAGCACTCACCGCGGTTAAAGG(SEQ ID NO：40)

所述模板由蓝色合龙生物技术公司提供，携带合成的优化的DNA分子，其含有Sec1信号肽的多核苷酸序列，后接κ多核苷酸序列(SEQ ID NO：41)。筛选所得细菌转化体集落的载体插入物，适当比对以表达。选择一个克隆(称为pSchizCPT-s1κbh)进行进一步分析，验证序列，并用于转化裂殖壶菌。

实施例11

由裂殖壶菌属表达和筛选抗体亚基κ

产生转化细胞系

在含50ml M2B培养基的250ml摇瓶中，27℃培养裂殖壶菌ATCC2088824小时。在600nm测定吸光度，将相当于吸光度为1的1ml培养物的体积在8,000xg离心5分钟。将细胞沉淀重悬于100μl M2B，并散布在M2B琼脂平板上2cm直径的圆圈内。

用pSchizCptS1κ(用XbaI线性化)包被的M10珠，在1100Psi压力下轰击含有散布的裂殖壶菌属细胞的平板面积。

轰击后，在27℃培育该M2B平板16小时，挑取在裂殖壶菌散布平板中心生长的集落，并散布到含有10μg/ml SMM的平板上。24至72小时后，挑取20个集落，接种到25ml培养管中的含10mg/ml SMM的5ml M2B中。27℃、135rpm培育该培养管72小时。

检测κ表达

从上述培养物中选择10个最混浊的摇瓶培养物进行表达分析。将0.5ml试管培养物接种到250mL烧瓶中50ml含10μg/ml SMM的M2B中。该培养物在27℃以135rpm振荡培养24小时，然后通过5500xg离心10分钟分离细胞沉淀和无细胞上清液。

将细胞沉淀重悬于40ml dH₂O，5500xg离心10分钟，接着重悬于两倍于其湿重量的提取缓冲液中。加入两倍于沉淀湿重量的玻璃珠，4℃振荡试管3小时。将所得的细胞匀浆物以5000xg离心处理10分钟，上清液保留成无细胞提取物。

利用截止值为10000MW的C&M浓缩器(阿米康公司(Amicon))将无细胞上清液由大约50ml浓缩至>200μl。

3μg来自各所选转化体的蛋白质(无细胞提取物和浓缩的无细胞上清液)在4-12％Bis Tris SDS PAGE(xt标准，伯乐公司(BioRad))上以MOPS运行缓冲液200V运行大约45分钟(直到染料前端刚好跑出凝胶底部)。用牛裴(Nupage)转移缓冲液在70V运行90分钟，以便将蛋白质条带转移到PVDF膜上。用5％(w/v)奶粉的TBS溶液封闭膜，所述TBS溶液中还含有0.1％吐温20，通过蛋白质印迹用碱性磷酸酶偶联的抗-人κ IgG(西格玛公司)定位抗体亚基κ。用BCIP/NBT磷酸酶底物(KPL)观察阳性条带。

在如上所述培养的摇瓶培养物的无细胞上清液中，抗体亚基κ清晰可见(见图17)。无细胞上清液中出现κ蛋白和MW与真实κ标准品不可区分的现象与κ亚基是分泌的并且经历了适当的翻译后修饰(切割Sec1分泌信号)相一致。

实施例12

在发酵罐中裂殖壶菌表达抗体亚基κ

培养

在2.0L(工作容积)发酵罐中培养看上去细胞外κ亚基表达量最高的两个克隆(1和3)。有挡板的接种瓶中含有150ml HD1培养基，在29.5℃下200rpm振荡培育24-48小时。用接种体培养物接种含有以下物质的发酵罐：50g/L葡萄糖、13.62g/L Na₂SO₄、0.72g/L K₂SO₄、0.56g/L KCl、2.27g/L MgSO₄.7H₂O、1.8g/L KH₂PO₄、17.5g/L(NH₄)₂SO₄、0.19g/L CaCl₂.2H₂O、51.5mg FeSO₄.7H₂O、3.1g/L MnCl₂.4H₂O、6.2g/L ZnSO₄.7H₂O、0.04mg CoCl₂.6H₂O、0.04mgNa₂MoO₄、2.07g/L CuSO₄.5H₂O、2.07g/L NiSO₄.6H₂O、9.75mg硫胺、0.16mg维生素B12和3.33mg泛酸钙。在培养过程中，温度是29.5℃，dO₂％控制在20％，葡萄糖浓度保持在15-20g/L(初始水平落入该范围后)，pH位置在6.5。在无菌条件下以一定间隔取出样品进行分析。

检测κ表达

在不浓缩的情况下分析无细胞上清液，用布拉德福德(Bradford)法(西格玛公司的布拉德福德试剂)测定总蛋白，用BSA作为蛋白质标准品。如上述摇瓶培养物中所述，进行蛋白质印迹分析以验证κ亚基表达。

按照生产商说明书，用人Κ-B+F Elisa定量试剂盒(贝司实验室公司(BethylLaboratories Inc.))和FO(Fluoro Omega)读板机(BMG实验室技术公司(BMGLabtech))对κ表达进行定量测定。参见图18。

实施例13

构建pAB0011表达载体

采用提取自裂殖壶菌ATCC20888的gDNA作模板，用以下引物进行PCR以产生长度为2015bp的扩增子：

5'60S-807：TCGATTTGCGGATACTTGCTCACA(SEQ ID NO：47)

3'60S-2821：GACGACCTCGCCCTTGGACAC(SEQ ID NO：48)

对扩增子进行凝胶纯化，并用作采用以下引物进行的后续PCR的模板：

5'60Sp-1302-Kpn：GACTggtaccTTTTTCCGCTCTGCATAATCCTAA(SEQ ID NO：49)

3'60Sp-Bam：GACTggatccTTGGCTTTTTCTTTCTTGTTGC(SEQ IDNO：50)

纯化所得的1017bp扩增子，用KpnI和BamHI消化，并连接到事先纯化并用KpnI和BamHI消化的pSchiz-CPT(+)-s1GFP(6h)中。利用连接产物转化大肠杆菌，通过所得集落的限制性消化物纯化和筛选质粒。用桑格法测序验证具有预期限制性消化物图样并包含60S长启动子的一个质粒克隆(#4.1)，将其称为pAB0011，用于转化裂殖壶菌。参见图24。载体pAB0011于2008年11月18日保藏于美国典型培养物保藏中心(美国弗吉尼亚州玛纳萨斯大学大道10801号专利保藏中心(Patent Depository,10801University Boulevard,Manassas,VA20110-2209))，ATCC登录号为PTA-9614。

实施例14

构建pAB0018表达载体

采用提取自裂殖壶菌ATCC20888的gDNA作模板，用以下引物进行PCR以产生长度为2268bp的扩增子：

5'EF1-68：CGCCGTTGACCGCCGCTTGACTCT(SEQ ID NO：51)

3'EF1-2312：CGGGGGTAGCCTCGGGGATGGACT(SEQ ID NO：52)

对该扩增子进行凝胶纯化，并用作采用以下引物进行的后续PCR的模板：

5'EF1-54-Kpn：GACTggtaccTCTTATCTGCCTCGCGCCGTTGAC(SEQ ID NO:53)

3'EF1-1114-Bam：GACTggatccCTTGCTTGCTAGTAGTCGCTTTCGAAC(SEQ ID NO：54)

纯化所得的1060bp扩增子，用KpnI和BamHI消化，并连接到事先纯化并用KpnI和BamHI消化的pSchiz-CPT(+)-s1GFP(6h)中。利用连接产物转化大肠杆菌，通过所得集落的限制性消化物纯化和筛选质粒。用桑格法测序验证具有预期限制性消化物图样并包含EF-1长启动子的一个质粒克隆(#6.1)，将其称为pAB0018，用于转化裂殖壶菌。参见图25。载体pAB0018于2008年11月18日保藏于美国典型培养物保藏中心(美国弗吉尼亚州玛纳萨斯大学大道10801号专利保藏中心(Patent Depository,10801University Boulevard,Manassas,VA20110-2209))，ATCC登录号为PTA-9616。

实施例15

构建pAB0022表达载体

通过SDS-PAGE分析裂殖壶菌培养物的无细胞上清液，由此选择称为Sec1p(指Sec1蛋白)的一条蛋白质条带，纯化至均质。用质谱技术鉴定此蛋白的肽片段序列，并利用BLAST算法(tBLASTn，无缺口比对，低复杂性过滤-关闭，预计值＝10000，矩阵＝PAM30)(ftp://ncbi.nlm.nih.gov/blast)关联于裂殖壶菌全基因组序列的概念翻译。鉴定编码所有肽序列的一个开放阅读框，称为Sec1g(表示Sec1基因)。也鉴定和合成位于起始ATG上游的推定启动子序列(蓝色合龙生物技术公司)。将含有合成Sec1g启动子的载体用作模板，利用以下引物进行PCR：

5'Sec1P-kpn：GACTggtaccCCGTCCTTGACGCCTTCGC(SEQ IDNO：55)

3'Sec1P-bam：GACTggatccGATGAGTAATGGACGATCTTC(SEQ IDNO：56)

纯化所得的1438bp扩增子，用KpnI和BamHI消化，并连接到事先纯化并用KpnI和BamHI消化的pSchiz-CPT(+)-s1GFP(6h)中。利用连接产物转化大肠杆菌，通过所得集落的限制性消化物纯化和筛选质粒。用桑格法测序验证具有预期限制性消化物图样并包含Sec1启动子的一个质粒克隆(#8.1)，将其称为pAB0022，用于转化裂殖壶菌。参见图26。载体pAB0022于2008年11月18日54于美国典型培养物保藏中心(美国弗吉尼亚州玛纳萨斯大学大道10801号专利保藏中心(Patent Depository,10801University Boulevard,Manassas,VA20110-2209))，ATCC登录号为PTA-9613。

实施例16

异源基因的转录

将延伸因子1(EF1)和60S核糖体单位的编码基因的启动子选作在裂殖壶菌中转录异源基因的启动子。检索裂殖壶菌的基因组序列，鉴定显示与这两个基因的公开序列同源的基因。通过PCR克隆各启动子的两种形式(一个短形式和一个长形式)。

也将驱动SEC1基因表达的启动子选作用于在裂殖壶菌中转录异源基因的启动子。因为SEC1基因编码迄今为止在裂殖壶菌属培养物中鉴定到的唯一一种天然分泌和糖基化的蛋白质，所以该启动子可将异源蛋白的表达安排在最适合产生分泌型糖基化蛋白质的生长期。

修饰含有S1eGFP构建体(即N末端具有SEC1分泌信号的eGFP基因，表达由OrfC启动子驱动–载体CL0001)的载体cpt(+)，以切下OrfC启动子并用以下序列代替该元件：

EF1启动子(短形式)＝来自载体AB0015的EF1-S

EF1启动子(长形式)＝来自载体AB0018的EF1-L

60S启动子(短形式)＝来自载体AB0010的60S-S

60S启动子(长形式)＝来自载体AB0011的60S-L

SEC1启动子＝来自载体AB0022的Sec1

如前所述，通过粒子轰击用5种载体分别转化裂殖壶菌20888。在每个转化中随机选择10个活细胞系进行分析。转化CL0001分别用作这5种载体的对照。在转化CL0001时随机选择6个活细胞系进行分析。

在包含50ml M2B的250mL摇瓶中以29.5℃培养转化体细胞系72小时，其间以200rpm连续振荡。5000xg离心10分钟去除生物质，用Centriprep浓缩器(MWCO10000)将无细胞上清液浓缩至≈1ml。用布拉德福德法测定无细胞上清液样品的蛋白质浓度。

在SDS丙烯酰胺凝胶(XT标准)上、还原条件下分离无细胞上清液等份，将分离的蛋白质条带转移到PVDF膜上。利用AP-偶联的抗-eGFP抗体检测eGFP，并用NCIP/NBT试剂观察。

在各个泳道中分离最大量(7μl)的浓缩上清液，以确定哪种细胞系表达和分泌eGFP(表1)。虽然对单个启动子而言，eGFP表达水平随不同启动子和细胞系而变，但有33种细胞系(来自分析所比较的6个启动子的55种细胞系)表达eGFP(数据未显示)。

表1.表达可检测量的分泌型eGFP的来自每个转化的细胞系的数量

虽然不是所有的细胞系都表达分泌型eGFP，但至少大约一半细胞系产生可检测水平的eGFP且各个启动子能够指导eGFP表达。

进一步分析发现表达和分泌eGFP的细胞系，以比较相对启动子强度。将经测定表达eGFP的每种培养物的无细胞上清液的蛋白质上样于SDS丙烯酰胺凝胶，每条泳道归一化到1μg。通过电泳分离蛋白质，将分离的蛋白质转移到PVDF膜上，如上所述用AP偶联的抗-eGFP抗体探测eGFP。参见图27。eGFP初始筛选中上清液蛋白质的加载量大约是产生图27的实验中用量的10倍。同样，在图27的所有泳道中异源eGFP蛋白不明显，因为该实验中的蛋白质上样水平下一些样品中的eGFP蛋白低于检测水平。在上样量为1μg蛋白质/泳道时，由OrfC启动子表达的分泌型eGFP低于检测限。然而，在至少一些产生的细胞系中，可检测到所有其它启动子驱动的eGFP的表达/分泌。这证明，与OrfC启动子相比，所有所选启动子(EF1、60S和SEC1)均未“强”启动子。具体说，可观察到在来自EF1-L转化体的某些细胞系中分泌型eGFP的表达水平高于任何其它启动子构建物，表明此种启动子是所检测的最强的启动子。

在荧光显微镜下，与普通OrfC转化体CL0001-4相比，观察EF1-L转化体细胞系AB0018-9和AB0018-10中的表达以验证EF1-L启动子强度。参见图28。虽然CL0001-4细胞系产生的荧光不多(Fluo:ISO2001.1秒方格)，但AB0018-9和AB0018-10细胞系产生明显荧光，表明胞内eGFP大量累积。

实施例17

裂殖壶菌中的糖基化概况

测定天然裂殖壶菌属蛋白质的N-糖基化。发现裂殖壶菌与哺乳动物和昆虫的糖基化途径有相同步骤，并且没有观察到它利用酵母的特征性高甘露糖基化途径。图29和图30显示用质谱分析裂殖壶菌的分泌蛋白检测到的聚糖结构。具体说，GlcNAc₂Man₅的特征峰出现在m/z1580，GlcNAc₂Man₆的特征峰出现在m/z1785，GlcNAc₂Man₇的特征峰出现在m/z1991。

实施例18

通过电穿孔转化裂殖壶菌

在M50-20培养基中，在29℃以200rpm振荡培养裂殖壶菌ATCC20888细胞48小时(参见美国公开号2008/0022422)。用新鲜培养基1:100稀释细胞，并培养过夜。离心细胞，重悬于1M甘露醇和10mM CaCl₂(pH5.5)，至终浓度为2OD₆₀₀单位。将5mL细胞与0.25mg/mL蛋白酶XIV(西格玛化学品公司)混合，振荡培育4小时。用10％冰冷的甘油洗涤细胞两次，重悬于500μL10％冷甘油。将90μL等份加到预冷的0.2cm缺口电转化小管(伯乐(Biorad)165-2086)中。将10μl DNA(1-5μg)加入该小管，温和混合，放在冰上。在200欧姆(电阻)、25μF和0V至500V的电压范围(用于0.1cm小管间隙距离)或500V(用于0.2cm小管间隙距离)的条件下，用重组载体电穿孔细胞。立即将0.5mL培养基加入该小管中。然后，将细胞转移到4.5mL M50-20培养基中，100rpm振荡培育2-3小时。离心细胞，并重悬于0.5mL培养基中，接种到含有合适选择压力(如果需要)的2-5个M2B平板上，29℃培育。

表2显示用不同酶组合预处理(参数是300V和0.1cm小管间隙距离)后产生的裂殖壶菌ATCC20888转化体数量。

表3显示用不同酶组合和电压预处理(0.1cm小管间隙距离)后产生的裂殖壶菌ATCC20888转化体数量。

表4显示用不同电穿孔小管间隙距离产生的裂殖壶菌ATCC20888转化体数量。细胞用0.25mg/mL蛋白酶XIV预处理。

表5显示用不同电穿孔电压产生的裂殖壶菌ATCC20888转化体数量。细胞用0.1mg/mL蜗牛丙酮粉末+0.25mg/mL蛋白酶XIV预处理(0.1cm小管间隙距离)。

表2.用不同酶组合预处理后产生的裂殖壶菌转化体

表3.用不同酶组合和电压预处理后产生的裂殖壶菌转化体

表4.用不同电穿孔小管间隙距离(用0.25mg/mL蛋白酶XIV预处理)产生的裂殖壶菌转化体

小管间隙

转化体数量

0.1cm(250V)	345
		0.2cm(500V)	530

表5.用不同电穿孔电压(用0.1mg/mL蜗牛丙酮粉末+0.25mg/mL蛋白酶XIV预处理)产生的裂殖壶菌转化体

电压(V)	0	100	150	200	300	400	500
								转化体数量	0	4	490	1320	794	156	100

实施例19

在裂殖壶菌中表达转化酶

用BamHI和NdeI消化载体pAB0018，产生两个长度为838bp和9879bp的片段。通过标准电泳技术在琼脂凝胶中分离9879bp片段，用市售的DNA纯化试剂盒纯化，连接至经密码子优化适合在裂殖壶菌中表达(见图42)的包含编码裂殖壶菌属Sec1蛋白的天然分泌信号的多核苷酸序列、后接编码酿酒酵母的成熟转化酶蛋白(SUC2)的合成序列的序列(SEQ ID NO：57)。将包含Sec1信号肽和酿酒酵母转化酶蛋白的编码序列的融合序列插入裂殖壶菌载体pSchiz中，然后用BamHI和NdeI消化产生SEQ ID NO：57。

根据生产商说明书，利用该连接产物转化市售的感受态DH5α大肠杆菌菌株的细胞(英杰公司)。增殖所得的若干克隆，提取和纯化其质粒。然后，通过限制性消化或PCR筛选这些质粒，以确认连接产生所需的质粒载体。通过桑格法测序验证与SEQ ID NO：57连接产生的一种这类质粒载体，称为pCL0076(SEQ ID NO：58)。参见图31。

裂殖壶菌ATCC 20888和遗传修饰的裂殖壶菌衍生物B76-32在M2B培养基中培养，该培养基由10g/L葡萄糖、0.8g/L(NH₄)₂SO₄、5g/L Na₂SO₄、2g/LMgSO₄·7H₂O、0.5g/L KH₂PO₄、0.5g/L KCl、0.1g/L CaCl₂·2H₂O、0.1M MES(pH6.0)、0.1％PB26金属和0.1％PB26维生素(v/v)构成。PB26维生素由50mg/mL维生素B12、100μg/mL硫胺和100μg/mL泛酸钙构成。将PB26金属调节至pH4.5，其由3g/L FeSO₄·7H₂O、1g/L MnCl₂·4H₂O、800mg/mL ZnSO₄·7H₂O、20mg/mL CoCl₂·6H₂O、10mg/mL Na₂MoO₄·2H₂O、600mg/mL CuSO₄·5H₂O和800mg/mL NiSO₄·6H₂O构成。对PB26母液进行单独过滤除菌，高压灭菌后加入肉汤中。将葡萄糖、KH₂PO₄和CaCl₂·2H₂O与其余肉汤成分分开单独灭菌，然后混合，以防止盐沉淀和糖焦化。所有培养基成分均购自密苏里州圣路易斯的西格玛化学品公司(Sigma Chemical,St.Louis,MO)。菌株B76-32是按照美国专利7,211,418以及美国专利公开2008/0022422和2008/0026434工程改造的裂殖壶菌ATCC20888的衍生物。

将裂殖壶菌ATCC20888和B76-32的培养物培养至对数期，通过电穿孔方法用载体pCL0076转化，如下所述用酶进行预处理。

具有酶预处理步骤的电穿孔-在50mL M50-20培养基中，在30℃以200rpm振荡培养细胞2天(参见美国公开号2008/0022422)。用M2B培养基以1:100稀释细胞(参见下段)并培养过夜(16-24小时)，尝试达到对数中期(OD₆₀₀为1.5-2.5)。细胞在50mL锥形管中以约3000xg离心5分钟。取出上清液，将细胞重悬于合适体积的1M甘露醇，pH5.5，以使终浓度达到2个OD₆₀₀单位。将5mL细胞分装到25mL摇瓶中，其中装有10mM CaCl2(1.0M母液，过滤除菌)和0.25mg/mL蛋白酶XIV(10mg/mL母液，过滤除菌；密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO))。该摇瓶以30℃和约100rpm振荡培育4小时。在显微镜下监测细胞以确定单个细胞的原生质化(protoplasting)程度。在圆底管(即14mL菲克(Falcon)^TM管，加州圣何塞的BD生物科学公司(BD Biosciences，San Jose，CA))中，以约2500xg离心细胞5分钟。取出上清液，将细胞温和重悬于5mL冰冷的10％甘油中。再次在圆底管中以约2500xg离心细胞5分钟。取出上清液，采用大口径移液器尖头将细胞温和重悬于500μL冰冷的10％甘油中。将90μL细胞分装到预冷的电转化小管(基因脉冲器(Gene Pulser)小管-0.1cm缺口或0.2cm缺口，加州赫克里斯的伯乐公司)中。将1μg至5μg DNA(体积小于等于10μL)加入该小管中，用移液器尖头温和混合，置于冰上5分钟。以200欧姆(电阻)、25μF(电容)和250V(用于0.1cm缺口)或500V(用于0.2cm缺口)电穿孔细胞。立即将0.5mLM50-20培养基加入该小管中。然后，将细胞转移到25mL摇瓶内的4.5mLM50-20培养基中，以约100rpm、30℃振荡培育2-3小时。在圆底管中以约2500xg离心细胞5分钟。取出上清液，将细胞沉淀重悬于0.5mL M50-20培养基。将细胞接种到具有合适选择压力(如果需要)的适当数量(2-5个)M2B平板上，30℃培育。

选择在M2B+SMM培养基中生长的转化体，或通过接种于MSFM+蔗糖直接选择在蔗糖上生长的转化体。在MSFM+蔗糖选择中，1-2周后，将集落接种到新鲜的含蔗糖培养基以便传代数次。已确定，转化酶的表达可用作在蔗糖作为唯一碳源的培养基上生长的破囊壶菌集落的选择标记物。

在以下实验中，在固体M2B培养基上27℃培育2-6天后选择初步转化体，该培养基含有20g/L琼脂(宾夕法尼亚州西切斯特的VWR公司)、10μg/mLSMM(宾夕法尼亚州西切斯特的化学服务公司)。将所有初步转化体手工转移到含有SMM的新鲜M2B平板上。1周后，将集落转移到含有MSFM和5g/L蔗糖但不含SMM的培养基中。1周后，将最大的集落转移到新鲜的MSFM/蔗糖培养基平板中。选择在蔗糖上生长的10个裂殖壶菌ATCC20888转化体进行进一步表征，它们分别称为1-1、1-3、1-24、3-1、3-2、3-5、3-21、4-1、4-24和4-31。选择在蔗糖上生长的9个B76-32转化体进行进一步表征，它们称为B76-32#2、#12、#19、326、#30、#39、#42、#56和#61。

用接种环从平板上取出在蔗糖上生长的集落(1-1、1-3、1-24、3-1、3-2、3-5、3-21、4-1、4-24、4-31)，并转移到含有5mL蔗糖培养基的培养管中29℃振荡培养4天。利用2mL此种培养物接种250ml摇瓶中的50mL培养基(MSFM或SSFM)，29℃、200rpm振荡培养。

以相同方式培养裂殖壶菌ATCC20888亲代菌株的对照瓶，但采用含葡萄糖的培养基。7天后收获细胞。离心细胞，并用50％异丙醇:蒸馏水混合物洗涤。将沉淀细胞冻干、称重并进行脂肪酸甲酯(FAME)分析。通过重力法和衍生油的气相色谱测定裂殖壶菌ATCC20888或B76-32的CL0076转化体的生长和脂肪含量，如美国公开号2008/0022422(通过引用全文纳入本文)所述。结果见表6-9。来自转化体以及亲本菌株摇瓶培养物的沉淀的干重和脂肪含量见图32-37。

SSFM培养基：50g/L葡萄糖或蔗糖、13.6g/L Na₂SO₄、0.7g/L K₂SO₄、0.36g/L KCl、2.3g/L MgSO₄·7H₂O、0.1M MES(pH6.0)、1.2g/L(NH₄)₂SO₄、0.13g/L谷氨酸单钠、0.056g/L KH₂PO₄和0.2g/L CaCl₂·2H₂O。加入1mL/L维生素母液，该母液由0.16g/L维生素B12、9.7g/L硫胺和3.3g/L泛酸钙构成。通过加入2mL/L的母液加入痕量金属，该母液由1g/L柠檬酸、5.2g/LFeSO₄·7H₂O、1.5g/L MnCl₂·₄H₂O、1.5g/L ZnSO₄·7H₂O、0.02g/L CoCl₂·6H₂O、0.02g/L Na₂MoO₄·2H₂O、1.0g/L CuSO₄·5H₂O和1.0g/L NiSO₄·6H₂O，调节至pH2.5构成。

改良的SFM(MSFM)培养基：10g/L葡萄糖或蔗糖、25.0g/L NaCl、1.0g/LKCl、0.2g/L(NH₄)₂SO₄、5g/L、5.0g/L MgSO₄·7H₂O、0.1g/L KH₂PO₄、0.3g/LCaCl₂·2H₂O、0.1M HEPES(pH7.0)、0.1％PB26金属和0.1％PB26维生素s(v/v)。加入2mL/L维生素母液，该母液由0.16g/L维生素B12、9.7g/L硫胺和3.3g/L泛酸钙构成。通过加入2mL/L的母液加入痕量金属，该母液由1g/L柠檬酸、5.2g/L FeSO₄·7H₂O、1.5g/L MnCl₂·₄H₂O、1.5g/L ZnSO₄·7H₂O、0.02g/L CoCl₂·6H₂O、0.02g/L Na₂MoO₄·2H₂O、1.0g/L CuSO₄·5H₂O和1.0g/LNiSO₄·6H₂O，调节至pH2.5构成。

表6显示含有葡萄糖、果糖、蔗糖或不加碳源的MSFM中生长的裂殖壶菌ATCC20888的生长和脂肪水平。

表7显示在含葡萄糖的MSFM培养基中培养的裂殖壶菌ATCC20888(对照)和在含蔗糖的MSFM培养基中培养的裂殖壶菌ATCC20888转化细胞系的干重和％脂肪酸。

表8显示在含葡萄糖的SSFM培养基中培养的裂殖壶菌ATCC20888(对照)和在含蔗糖的SSFM培养基中培养的裂殖壶菌ATCC20888转化细胞系的干重和％脂肪酸。

表9显示在含葡萄糖的SSFM培养基中培养的裂殖壶菌B76-32(对照)和在含蔗糖的SSFM培养基中培养的裂殖壶菌B76-32转化细胞系的干重和％脂肪酸。

表6.含有葡萄糖、果糖、蔗糖或不加碳源的MSFM中培养的裂殖壶菌ATCC20888的生长和脂肪水平。

	葡萄糖	果糖	蔗糖	不加碳源
					DW(g/L)	2.84	2.65	0.16	0.11
％FA	66.5	65.3	ND	ND

DW＝干重

FA＝脂肪酸

表7.在含有蔗糖的MSFM培养基中培养的裂殖壶菌ATCC20888转化细胞系.

DW＝干重

FA＝脂肪酸

表8.在含有蔗糖的SSFM培养基中培养的裂殖壶菌ATCC20888转化细胞系.

DW＝干重

FA＝脂肪酸

表9.在含有蔗糖的SSFM培养基中培养的B76-32转化细胞系.

DW＝干重

FA＝脂肪酸

免疫印迹–5000xg离心培养物后，收集SSFM中培养3天的50mL摇瓶培养物的无细胞上清液(参见美国公开号2008/0022422)。培养物上清液直接用于SDS-PAGE或用装有可渗透膜的市售浓缩器浓缩50至100倍，所述可渗透膜能够浓缩分子量大于10kDa的所有组分。通过布拉德福德测定(伯乐公司)测定总蛋白浓度。然后，按照标准免疫印迹步骤(Sambrook等)，通过免疫印迹分析验证转化酶的表达。简要说，通过SDS-PAGE在双tris凝胶(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA))上分离蛋白质(0.625μg至5μg)。接着，用考马斯蓝(简单蓝色安全染料(SimplyBlue SafeStain)，英杰公司)染蛋白质，或将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上并用转化酶抗血清(开放生物系统公司(Open Biosystems))检测转化酶的存在，所述转化酶抗血清来自注射了酿酒酵母转化酶纯制剂(西格玛公司)的兔。接着，用偶联于碱性磷酸酶的小鼠抗-兔第二抗体(普洛麦格公司)培育膜。然后，按照生产商(马里兰州盖瑟斯堡的KPL公司)说明书用5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸/硝基氮蓝四唑溶液(BCIP/NBT)处理该膜。图38中显示了一个例子。图A和B分别提供抗-转化酶免疫印迹和相应的考马斯蓝染色凝胶。在克隆1-3培养物上清液中观察到的四条主要条带中，只有一条条带与抗-转化酶抗血清发生反应。通过肽序列分析确认该蛋白的身份。

功能性试验-酶EC3.2.1.26是催化蔗糖水解成果糖和葡萄糖的蔗糖酶的转化酶类型。通过由蔗糖释放果糖和葡萄糖的速率确定蔗糖酶活性。粗略来说，通过将蔗糖加入发酵肉汤上清液进行该试验，通过HPLC测定葡萄糖/果糖含量。

在MSFM(含蔗糖)中29℃培养裂殖壶菌菌株B76-32#3，直到50mL摇瓶中OD达到约4。4500xg离心15分钟收集细胞，测定上清液中的转化酶活性。将0.1M蔗糖加入不同体积的发酵肉汤中，并将终体积调整至1mL，以测定转化酶。反应在55℃孵育3分钟。在100℃处理10分钟终止该反应，然后冷冻，直到通过HPLC测定葡萄糖、果糖和蔗糖进行分析。根据Liu等，Food Sci.28:293-296(2007)所述方法的修饰形式进行HPLC。简要说，使用Luna NH₂柱进行HPLC分离单糖和二糖，并采用(折射率检测器)进行检测。将其保留时间与标准品作比较以进行鉴定。通过外部标准品校准进行定量。反应速率与蔗糖浓度的关系见图39A。由标准LB(Lineweaver-Burk)曲线计算Km(33.4mM)和V_最大(6.8mM葡萄糖/分钟)。见图39B。

糖基化分析-通过SDS-PAGE在4-12％双tris凝胶(英杰公司)上分离上清液蛋白质。然后，蛋白质用考马斯蓝(简单蓝色安全染料，英杰公司)染色。从凝胶上切下感兴趣的染色的蛋白质，将该条带切成小块(～1mm³)，用40mM碳酸氢氨(AmBic)和100％乙腈交替脱色直到颜色变透明。在10mM DTT和40mM AmBic溶液中，55℃再次溶胀脱色的凝胶1小时。用55mM碘乙酰胺(IAM)交换DTT溶液，避光培育45分钟。培育后，用40mM AmBic和100％乙腈交替洗涤两次。先用胰蛋白酶溶液(40mM AmBic配制的胰蛋白酶)在冰上处理脱水凝胶45分钟以便再次溶胀该凝胶，接着于37℃消化蛋白质过夜。将上清液转移到另一试管中。用5％甲酸配制的20％乙腈、5％甲酸配制的50％乙腈和5％甲酸配制的80％乙腈连续提取凝胶中的肽和糖肽。干燥样品溶液并并入一个试管。使提取的胰蛋白酶消化物通过C18sep-pak柱，用5％乙酸洗涤去除污染物(如盐和SDS)。用5％乙酸配制的20％异丙醇、5％乙酸配制的40％异丙醇和100％异丙醇连续洗脱肽和糖肽，然后在快速干燥浓缩器中干燥。合并干燥样品，用50mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)重建，加热到100℃保持5分钟使胰蛋白酶失活。用PNG酶F在37℃培育胰蛋白酶消化物过夜以释放N-聚糖。消化后，使样品通过C18sep-pak柱，用5％乙酸洗脱糖组分并且进行冻干。根据Anumula和Taylor，Anal Biochem.203:101-108(1992)所述方法使释放的N-连接的寡糖全甲基化，通过质谱进行概况分析。按照复杂糖类研究中心(ComplexCarbohydrates Research Center)开发的方法(Aoki K等，J.Biol.Chem.282:9127-42(2007))进行质谱分析采用NSI-LTQ/MS_n进行质量分析。简要说，将全甲基化的聚糖溶解于50％甲醇配制的1mM NaOH中，以0.4μL/min的恒定流速直接输入设备(LTQ，TF公司(Thermo Finnigan))。以正离子模式进行MS分析。在全离子作图中，自动MS/MS分析(35碰撞能)在与前一窗口重叠2个质量单位的连续2.8个质量单位的窗口中扫描m/z范围500-2000。

进行全离子作图以检测片段离子的存在(表明存在聚糖)。获得m/z500至m/z2000的所有MS/MS数据，手工分析原始数据。由NSI-总离子作图获得的物质的图谱和表格参见图40A和图40B。通过扫猫过滤器加工此图谱；m/z139的中性损失是高甘露糖型聚糖的特征。总离子作图揭示出此样品含有一系列具有长甘露糖链的高甘露糖类型的聚糖。这些结果类似于天然裂殖壶菌分泌蛋白质上检测到的N-聚糖结构，正如利用与实施例17相同方法所检测的那样(见图30)。

实施例20

在裂殖壶菌中表达黑曲霉(Aspergillus niger)转化酶

用HindIII消化载体pAB0018(ATCC登录号PTA-9616)，用绿豆核酸酶处理，进行纯化，接着用KpnI消化产生四个不同大小的片段。利用标准电泳技术在琼脂凝胶中分离2552bp的片段，采用市售DNA纯化试剂盒纯化。然后，用PmeI和Kpn第二次消化pAB0018。从该消化物分离和纯化6732bp片段，并连接于2552bp片段。接着，根据生产商说明书，利用该连接产物转化市售的感受态DH5α大肠杆菌菌株的细胞(英杰公司)。增殖氨苄青霉素抗性克隆的质粒，进行纯化，接着通过限制性消化或PCR进行筛选，以确认该连接产生预计的质粒结构。一种验证的质粒称为pCL0120。参见图43。

采用图42的裂殖壶菌密码子使用表，为在裂殖壶菌中表达对来自黑曲霉的Suc1转化酶蛋白的成熟形式(GenBank登录号S33920)进行密码子优化(由华盛顿州玻塞尔的蓝色合龙生物技术公司(Blue Heron Biotechnology，Bothell，WA)进行密码子优化)。合成密码子优化序列，将所得多核苷酸序列融合于编码裂殖壶菌属Sec1信号肽(“Sec1ss”)的多核苷酸序列，作为N末端前导物，代替内源性信号肽。所得的“s1Suc1”核酸序列的编码区(SEQ ID NO：75)如图44所示。利用5'和3'限制性位点BamHI和NdeI，按照标准技术插入和连接，将此种密码子优化的s1Suc1多核苷酸克隆到载体pCL0120中。所得载体pCL0137的质粒图见图45。用此种载体转化野生型菌株裂殖壶菌ATCC20888，在含有SSM的固体SSFM培养基上选择所得克隆。接着，将SMM抗性克隆再接种到含有蔗糖作为唯一碳源的SSFM固体培养基上，以检测生长情况。根据转化试验，50％至90％的SMM抗性原代转化体能够在蔗糖培养基上生长。

本文所述的所有不同方面、实施方式和选择可以任意和全部的变化形式组合。

将本说明书中提到的所有发表物、专利和专利申请以其全文形式纳入本文作为参考，就好像将各篇单独的发表物、专利或专利申请具体地和单独地通过引用纳入本文一样。

Claims

1.一种分离的核酸分子，其包含：

(a)与SEQ ID NO:38具有至少85％相同性的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列编码作为信号肽发挥功能的多肽；

(b)编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽包含与SEQ ID NO:37的氨基酸序列具有至少85％相同性的氨基酸序列或其片段，其中所述氨基酸序列或其片段作为信号肽发挥功能；

(c)与(a)或(b)所述的多核苷酸序列完全互补的多核苷酸序列。

2.一种重组核酸分子，其包含权利要求1中所述的分离的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的重组核酸分子，其特征在于，所述重组核酸分子为载体。

4.根据权利要求2或3所述的重组核酸分子，其特征在于，所述分离的核酸分子操作性连接于编码蛋白质的多核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的重组核酸分子，其特征在于，所述蛋白质操作性连接于分泌信号。

6.一种宿主细胞，其包含权利要求1所述的分离的核酸分子、权利要求2-5中任一项所述的重组核酸分子或其组合。

7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是破囊壶菌目(Thraustochytriales)的成员。

8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是裂殖壶菌属(Schizochytrium)或破囊壶菌属(Thraustochytrium)。

9.一种产生蛋白质的方法，其包括：

在培养基中培养破囊壶菌目重组微生物来表达蛋白质，其中所述重组微生物包含操作性连接于编码所述蛋白质的多核苷酸序列的权利要求1所述的分离的核酸分子。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，从分离的破囊壶菌生物质回收所述蛋白质。

11.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于，所述蛋白质在所述微生物中积累。

12.根据权利要求9-11中任一项所述的方法，其特征在于，所述蛋白质在所述微生物的膜中积累。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，从培养基中回收所述蛋白质。

14.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述蛋白质是分泌的蛋白质。