ES2752196T3 - Producción de proteínas en microorganismos del filo Labyrinthulomycota - Google Patents

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Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende: (a) una secuencia polinucleotídica que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 43, y en donde el % de identidad de secuencia se puede encontrar sobre una secuencia de al menos 50 nucleótidos de la SEQ ID NO: 43; o (b) una secuencia polinucleotídica que es completamente complementaria a la secuencia polinucleotídica de (a), en donde la molécula de ácido nucleico aislada está unida operativamente a una secuencia polinucleotídica que codifica una proteína heteróloga y tiene actividad promotora.

Description

DESCRIPCIÓN
Producción de proteínas en microorganismos del filo Labyrinthulomycota
Antecedentes de la invención
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada como se reivindica y a células hospedadoras que comprenden la misma y su uso en la producción de proteínas heterólogas. La presente divulgación abarca un nuevo promotor, terminador y secuencias señal para una producción eficaz y, opcionalmente, la secreción de polipéptidos a partir de células hospedadoras y microorganismos recombinantes.
Antecedentes de la técnica
Los avances en biotecnología y biología molecular han permitido la producción de proteínas en células microbianas, vegetales y animales, muchas de las cuales anteriormente solo estaban disponibles mediante extracción de tejidos, sangre u orina de seres humanos y otros animales. Los productos biológicos que están disponibles comercialmente en la actualidad se fabrican normalmente en células de mamíferos, tales como células de ovario de hámster chino (CHO, de sus siglas en inglés), o en células microbianas, tales como líneas celulares de levadura o E. coli.
La producción de proteínas a través de la fermentación de microorganismos presenta varias ventajas sobre los sistemas existentes, tal como el cultivo de células vegetales y animales. Por ejemplo, los procesos basados en fermentación microbiana pueden ofrecer: (i) producción rápida de alta concentración de proteína; (ii) la capacidad de usar condiciones de producción estériles y bien controladas (tales como las condiciones de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP, de sus siglas en inglés)); (iii) la capacidad de usar medios de crecimiento simples, químicamente definidos que permiten fermentaciones más simples y menos impurezas; (iv) la ausencia de agentes patógenos humanos o animales contaminantes; y (v) la facilidad de recuperar la proteína (por ejemplo, a través del aislamiento de los medios de fermentación). Además, las instalaciones de fermentación suelen ser menos costosas de construir que las instalaciones de cultivo celular.
La publicación de Estados Unidos N.° 2003/0166207 (ahora Patente de Estados Unidos N.° 7.001.772) fue la primera divulgación de construcciones recombinantes adecuadas para transformar traustoquitridios, incluidos los miembros del género Schizochytrium. Esta publicación desveló, entre otras cosas, secuencias de aminoácidos y ácido nucleico de Schizochytrium para una acetolactato sintasa, una región promotora y de terminación de acetolactato sintasa, un promotor de a-tubulina, un promotor de un sistema de policétido sintasa (PKS, de sus siglas en inglés) y un promotor de ácido graso desaturasa. Las publicaciones de Estados Unidos N.° 2006/0275904 y 2006/0286650, ambas incorporadas en el presente documento como referencia en su totalidad, desvelaron posteriormente secuencias de Schizochytrium para actina, factor de elongación 1 alfa (efla, de sus siglas en inglés) y promotores y terminadores de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gadph, de sus siglas en inglés).
Existe una necesidad continua para la identificación de elementos de control reguladores adicionales para la expresión de proteínas en microorganismos traustoquitridios, incluidos los elementos de control reguladores que se expresan diferencialmente, por ejemplo, durante diferentes puntos temporales o bajo determinadas condiciones de crecimiento, o en respuesta a estímulos químicos o ambientales. También existe una necesidad de identificar secuencias señal de secreción que puedan dirigir eficazmente la secreción de una proteína de un microorganismo del filo Labyrinthulomycota y el orden Thraustochytriales, tal como Schizochytrium y otros traustoquitridios.
Breve sumario de la invención
La presente invención está dirigida a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende: (a) una secuencia polinucleotídica que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 43, y en donde el % de identidad de secuencia se puede encontrar sobre una secuencia de al menos 50 nucleótidos de la SEQ ID NO: 43; o (b) una secuencia polinucleotídica que es completamente complementaria a la secuencia polinucleotídica de (a), en donde la molécula de ácido nucleico aislada está unida operativamente a una secuencia polinucleotídica que codifica una proteína heteróloga y tiene actividad promotora.
La presente invención también se dirige a una célula hospedadora que comprende el ácido nucleico aislado. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es un miembro del orden Thraustochytriales. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es un Schizochytrium o un Thraustochytrium.
La presente invención también se dirige a un método para la producción de una proteína, que comprende el cultivo de un microorganismo recombinante del orden Thraustochytriales en un medio, en donde el microorganismo recombinante comprende cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aisladas descritas anteriormente unidas operativamente a una secuencia polinucleotídica que codifica la proteína, para producir la proteína. En algunas realizaciones, la proteína se recupera de una biomasa de Thraustochytriales aislada. En algunas realizaciones, la proteína se acumula dentro del microorganismo. En algunas realizaciones, la proteína se acumula dentro de una membrana del microorganismo. En algunas realizaciones, la proteína se recupera del medio de cultivo. En algunas realizaciones, la proteína se secreta.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra una secuencia de aminoácidos del péptido señal de la proteína transportadora Na/Pi-IIIb2 de Schizochytrium (SEQ ID NO: 1).
La Figura 2 muestra la secuencia polinucleotídica (SEQ ID NO: 2) que codifica el péptido señal de la SEQ ID NO: 1.
La Figura 3 muestra la secuencia polinucleotídica de la región promotora OrfC PUFA PKS de Schizochytrium (SEQ ID NO: 3).
La Figura 4 muestra la secuencia polinucleotídica del elemento 1 terminador OrfC PUFA PKS de Schizochytrium (SEQ ID NO: 4).
La Figura 5 muestra un mapa plasmídico de pSchizE.
La Figura 6 muestra un mapa plasmídico de pSchiz-sG, también denominado pCO0001.
La Figura 7 muestra un mapa plasmídico de pSchiz-sGr.
La Figura 8 muestra un mapa plasmídico de pSchiz-cG.
La Figura 9 muestra la expresión de eGFP en el citoplasma y el retículo endoplásmico (RE) de las células de Schizochytrium. Las Figuras 9A, 9C y 9E son micrografías fluorescentes. Las Figuras 9B, 9D y 9F son micrografías de luz. Las Figuras 9A y 9B muestran el mismo campo de células transformadas con pSchiz-sGr. Las Figuras 9C y 9D muestran el mismo campo de células transformadas con pSchiz-cG. Las Figuras 9E y 9F muestran el mismo campo de células transformadas con pSchiz-E.
La Figura 10A muestra la localización de fluorescencia compuesta de eGFP dirigida al RE y la tinción específica de ácido nucleico con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en células de Schizochytrium transformadas con pSchizsGr. Las Figuras 10B y 10C muestran la tinción del RE con eGFP y tinción nuclear con DAPI, respectivamente, utilizada para hacer la micrografía compuesta. La Figura 10D muestra la micrografía de luz del mismo campo. Como se indica en la Figura 10A, las membranas del RE envuelven cada núcleo de una célula, y cada célula puede contener múltiples núcleos. Se indican las características relevantes de un núcleo en una célula.
La Figura 11 muestra una transferencia Western y el correspondiente gel SDS-PAGE teñido con Coomassie de sobrenadante libre de células y muestras de extracto libres de células de cuatro clones transformantes de Schizochytrium. "sup" y "cyto" se refieren a sobrenadantes libres de células y extractos libres de células, respectivamente. "sG" se refiere a muestras de células transformadas con pSchiz-sG. "sGr" se refiere a muestras de células transformadas con pSchiz-sGr. "cG" se refiere a muestras de células transformadas con pSchiz-cG. "vec (-)" se refiere a muestras de células transformadas con pSchiz-E10. "GFP (+)" se refiere al estándar de GFP recombinante purificado (Clontech, Mountain View, CA). Los geles se cargaron con 3 |jg de proteína sobrenadante libre de células y 1 jg de muestras de proteína de extracto libre de células. Se encuentra un carril vacío entre cada par de muestras, el estándar de GFP recombinante y los marcadores de peso molecular.
La Figura 12 muestra los primeros 30 aminoácidos de la proteína transportadora proteína Sec1 de Schizochytrium. Los aminoácidos 1 a 20 constituyen la secuencia del péptido señal (SEQ ID NO: 37).
La Figura 13 muestra la secuencia polinucleotídica (SEQ ID NO: 38) que codifica el péptido señal de la SEQ ID NO: 37.
La Figura 14 muestra un mapa plasmídico de pSchiz-Cpt-s1eGFP, también denominado pCL0001.
La Figura 15A muestra una transferencia Western para la proteína eGFP secretada y la FIG. 15B muestra un gel SDS-PAGE teñido con Coomassie correspondiente de tres cultivos de Schizochytrium cultivados en diferentes condiciones de fermentación (condiciones de fermentación "B26", "B27", o "B28", como se define en la Figura 15). Los carriles 1-19 se cargaron con las cantidades indicadas de proteína. LH = tiempo de fermentación en horas. El carril 20 en la Figura 15A se cargó con 10 ng y el carril 20 en la Figura 15B se cargó con 0,5 jg de un estándar de GFP recombinante purificado; Las bandas de eGFP de Schizochytrium son ligeramente más grandes que la banda de control porque contienen una secuencia enlazadora.
La Figura 16 muestra un mapa plasmídico de pSchiz-Cpt-slkappabh.
La Figura 17 muestra una transferencia Western para la secreción de una subunidad de anticuerpo kappa por Schizochytrium. L = extracto libre de células; S = sobrenadante libre de células.
La Figura 18A muestra una transferencia Western para la expresión de la subunidad de anticuerpo kappa. El tiempo de incubación al que se obtuvo la muestra de sobrenadante de cultivo se indica en la parte superior de la Figura 18A. "ts" se refiere a Schizochytrium de "tipo silvestre" (es decir, no transformado). "+cptS1kappa" se refiere a Schizochytrium transformado con un vector que contiene un gen optimizado con codones que codifica un fragmento de anticuerpo kappa humano, un promotor y terminador ORFC, y una secuencia que codifica un péptido señal Sec1. La Figura 18B muestra la acumulación de proteína total (analizada de acuerdo con Bradford) y la cadena de anticuerpos kappa (analizada mediante ELISA) en el sobrenadante de cultivo de Schizochytrium transformado con cptS1kappa.
La Figura 19 muestra la secuencia polinucleotídica del promotor corto EF1 de Schizochytrium (SEQ ID NO: 42). La Figura 20 muestra la secuencia polinucleotídica del promotor largo EF1 de Schizochytrium (SEC ID La Figura 21 muestra la secuencia polinucleotídica del promotor corto 60S de Schizochytrium (SEQ ID NO: 44). La Figura 22 muestra la secuencia polinucleotídica del promotor largo 60S de Schizochytrium (SEC ID La Figura 23 muestra la secuencia polinucleotídica del promotor Sec1 de Schizochytrium (SEQ ID NO: 46).
La Figura 24 muestra un mapa plasmídico de pAB0011.
La Figura 25 muestra un mapa plasmídico de pAB0018.
La Figura 26 muestra un mapa plasmídico de pAB0022.
La Figura 27 muestra una transferencia Western para eGFP en muestras de sobrenadante libres de células tomadas de cultivos de Schizochytrium transformados con vectores de expresión que contienen el gen eGFP impulsado por el promotor EF1 (versión corta), el promotor EF1 (versión larga), el promotor 60S (versión corta), el promotor 60S (versión larga), promotor SEC1 y promotor OrfC, respectivamente.
La Figura 28 muestra microscopía de fluorescencia de líneas celulares transformantes asociadas con la expresión de eGFP dirigida por el promotor OrfC (pCL0001-4) o el promotor EF1-L (AB0018-9 y -10).
La Figura 29 muestra estructuras de N-glucano detectadas en proteínas secretadas por Schizochytrium naturales según lo determinado por el análisis NSI-full MS de N-glucanos permetilados.
La Figura 30 muestra estructuras de N-glucano detectadas en proteínas secretadas por Schizochytrium naturales según lo determinado por el mapeo de iones de NSI-Total de N-glucanos permetilados.
La Figura 31 muestra un mapa plasmídico de pSchiz-EPCT(+)-s1Suc2_CL0076, también denominado pCL0076. La Figura 32 muestra el peso seco (g/l) de sedimentos celulares de cultivos de Schizochytrium sp. ATCC 20888 transformados con pCL0076 cultivados en sacarosa-SSFM. Los transformantes se denominan 1-1, 1-3, 1-24, 3­ 1, 3-2, 3-5, 3-21, 4-1, 4-24 y 4-31. "Control" se refiere a células de Schizochytrium sp. ATCC 20888 cultivadas en glucosa-SSFM.
La Figura 33 muestra el contenido de grasa (expresado como % en peso de la biomasa seca) en sedimentos celulares de cultivos de Schizochytrium sp. ATCC 20888 transformados con pCL0076 cultivados en sacarosa-SSFM. Los transformantes se denominan 1-1, 1-3, 1-24, 3-1, 3-2, 3-5, 3-21, 4-1, 4-24 y 4-31. "Control" se refiere a células de Schizochytrium sp. ATCC 20888 cultivadas en glucosa-SSFM.
La Figura 34 muestra el peso seco (g/l) de sedimentos celulares medidos a lo largo del tiempo para cultivos de Schizochytrium sp. ATCC 20888 transformados con pCL0076 cultivados en sacarosa-SSFM. Los transformantes se denominan 1-3 y 3-5. "Control" se refiere a células de Schizochytrium sp. ATCC 20888 cultivadas en glucosa-SSFM.
La Figura 35 muestra el contenido de grasa (expresado como % en peso de la biomasa seca) en sedimentos celulares de cultivos de dos transformantes cultivados en sacarosa-SSFM. Los transformantes se denominan 1-3 y 3-5. "Control" se refiere a células de Schizochytrium sp. ATCC 20888 cultivadas en glucosa-SSFM.
La Figura 36 muestra el peso seco (g/l) de sedimentos celulares de cultivos de la cepa B76-32 de Schizochytrium transformados con pCL0076 y cosechados después de 2 días o 7 días de crecimiento en sacarosa-SSFM. "2118 *" se refiere a un subaislado de células de Schizochytrium sp. de tipo silvestre ATCC 20888 cultivadas en glucosa-SSFM. "B76-32 **" se refiere a la cepa parental B76-32 cultivada en glucosa-SSFM.
La Figura 37 muestra el contenido de grasa de sedimentos celulares de cultivos de la cepa B76-32 de Schizochytrium transformados con pCL0076 y cosechados después de 2 días o 7 días de crecimiento en sacarosa-SSFM. La columna más a la derecha para cada muestra muestra el contenido de grasa como % en peso de la biomasa seca. La columna más a la izquierda para cada muestra muestra el % de grasa total compuesta de grupos acilo con 18 o menos carbonos (gris claro) o 20 o más carbonos (gris medio). "2118 *" se refiere a un subaislado de células de Schizochytrium sp. de tipo silvestre ATCC 20888 cultivadas en glucosa-SSFM. "B76-32 **" se refiere a la cepa parental B76-32 cultivada en glucosa-SSFM.
La Figura 38A muestra una transferencia Western para la proteína invertasa y la Figura 38B muestra un gel SDS-PAGE teñido con Coomassie correspondiente. Un control de invertasa de S. cerevisiae y sobrenadantes libres de células de un cultivo de 3 días de transformante 1-3 pCL0076 se cargaron en cantidades de 5 |jg, 2,5 |jg, 1,25 |jg y 0,625 jg, respectivamente, como se indica en la parte superior de la transferencia Western.
La Figura 39A muestra un ensayo de actividad de invertasa ilustrado por la velocidad de reacción en función de la concentración de sacarosa. La Figura 39B muestra una transferencia de Lineweaver-Burk estándar utilizada para calcular el Km y Vmax.
La Figura 40A muestra estructuras de N-glucano detectadas en proteínas secretadas por Schizochytrium según lo determinado por el mapeo de iones NSI-Total de N-glucanos permetilados.
La Figura 40B muestra una tabla de especies de glucanos obtenidas mediante mapeo de iones NSI-Total de N-glucanos permetilados.
La Figura 41A y la Figura 41B muestran secuencias señal previsibles naturales de Schizochytrium basadas en el uso del algoritmo SignalP. Véase, por ejemplo, Bendsten et al., J., Mot Biol. 340: 783-795 (2004); Nielsen y Krogh, Proc. Int. Conf. Intell. Syst. Mol. Biol. 6:122-130 (1998); Nielsen et al., Protein Engineering 12:3-9 (1999); Emanuelsson et al., Nature Protocols 2:953-971 (2007).
La Figura 42 muestra una tabla de uso de codones para Schizochytrium.
La Figura 43 muestra un mapa plasmídico de pCL0120.
La Figura 44 muestra una secuencia de ácido nucleico optimizada con codón (SEQ ID NO: 75) que codifica el péptido señal Sec1 de Schizochytrium fusionado con la invertasa Suc1 madura de Aspergillus niger (N.° de acceso de GenBank S33920).
La Figura 45 muestra un mapa plasmídico de pCL0137_EPCT(+)-s1Suc1, también denominado pCL0137.
Descripción detallada de la invención
Los miembros del filo Labyrinthulomycota, tal como Schizochytrium, Thraustochytrium y otros traustoquitridios, son eucariotas que son capaces de procesar polipéptidos a través de una ruta secretora convencional. Se ha reconocido que estos microorganismos también producen menos proteínas secretadas de manera abundante que las células CHO, lo que da como resultado una ventaja usar Schizochytrium sobre las células CHO. Además, a diferencia de E. coli, los miembros del filo Labyrinthulomycota, tal como Schizochytrium, realizan la glucosilación de proteínas, como la glucosilación ligada a N, que se requiere para la actividad biológica de determinadas proteínas. Se ha determinado que la glucosilación ligada a N exhibida por los traustoquitridios como Schizochytrium se asemeja más a los patrones de glucosilación de mamíferos que la glucosilación de levaduras.
La producción eficaz de proteínas recombinantes también incluye: (i) métodos para transformar una célula hospedadora seleccionada, (ii) marcadores de selección para seleccionar transformantes y (iii) casetes de expresión que comprenden elementos reguladores que funcionan en la célula hospedadora particular. Dichos elementos reguladores incluyen secuencias promotoras y de terminación que son importantes para controlar la expresión de una secuencia polinucleotídica. De acuerdo con la presente invención, las expresiones elementos reguladores, elementos de control reguladores y secuencias reguladoras pueden usarse indistintamente e incluyen, pero no se limitan a, secuencias y/o moléculas que son promotores, potenciadores, terminadores de la transcripción, secuencias señal, sitios de unión a ribosomas, sitios de unión a represores, tallo-bucle y sitios de empalme de intrones. Los péptidos señal (también conocidos como secuencias señal, péptidos señal de secreción o secuencias líder) que dirigen la secreción de una proteína también se pueden utilizar si se desea la secreción de proteína en el medio de cultivo.
Células hospedadoras
La presente invención está dirigida a la producción de proteínas en una célula hospedadora que es un microorganismo del filo Labyrinthulomycota. En algunas realizaciones, la célula hospedadora del filo Labyrinthulomycota se usa como biofábrica para la producción de proteínas.
En algunas realizaciones, la célula hospedadora recombinante del filo Labyrinthulomycota es un traustoquitridio, tal como Schizochytrium o Thraustochytrium. De acuerdo con la presente invención, el término "traustoquitridio" se refiere a cualquier miembro del orden Thraustochytriales, que incluye a la familia Thraustochytriaceae, y el término "labyrinthulid" se refiere a cualquier miembro del orden Labyrinthulales, que incluye a la familia Labyrinthulaceae. Anteriormente se consideraba que los miembros de la familia Labyrinthulaceae eran miembros del orden Thraustochytriales, pero en revisiones más recientes de la clasificación taxonómica de dichos organismos, la familia Labyrinthulaceae ahora se considera miembro del orden Labyrinthulales. Tanto Labyrinthulales como Thraustochytriales se consideran miembros del filo Labyrinthulomycota. Los teóricos taxonómicos ahora generalmente colocan estos dos grupos de microorganismos con las algas o protistas similares a las algas del linaje Stramenopile. La ubicación taxonómica actual de los traustoquitridios y labyrinthulids se puede resumir de la siguiente manera:
Reino: Stramenopila (Chromista)
Filo: Labyrinthulomycota (Heterokonta)
Clase: Labyrinthulomycetes (Labyrinthulae)
Orden: Labyrinthulales
Familia: Labyrinthulaceae
Orden: Thraustochytriales
Familia: Thraustochytriaceae
Para los fines de la presente invención, las cepas descritas como traustoquitridios incluyen los siguientes organismos: Orden: Thraustochytriales; Familia: Thraustochytriaceae; Género: Thraustochytrium (Especies: sp., arudimentale, aureum, benthicola,globosum, kinnei, motivum,multirudimentale,pachydermum,proliferum, roseum, striatum), Ulkenia(Especies: sp., amoeboidea, kerguelensis, minuta, profunda, radiata, sailens, sarkariana, schizochytrops, visurgensis, yorkensis), Schizochytrium (Especies: sp., aggregatum, limnaceum, mangrovei, minutum, octosporum), Japonochytrium (Especies: sp., marinum), Aplanochytrium (Especies: sp., haliotidis, kerguelensis, profunda, stocchinoi), Althornia (Especies: sp., crouchii), o Elina (Especies: sp., marisalba, sinorifica). Para los fines de la presente invención, las especies descritas dentro de Ulkenia se considerarán miembros del género Thraustochytrium. Aurantiacochytrium y Oblogospora son dos géneros adicionales abarcados por el filo Labyrinthulomycota en la presente invención.
Las cepas descritas en la presente invención como Labyrinthulids incluyen los siguientes organismos: Orden: Labyrinthulales, Familia: Labyrinthulaceae, Género: Labyrinthula (Especies: sp., algeriensis, coenocystis, chattonii, macrocystis, macrocystis atlantica, macrocystis macrocystis, marina, minuta, roscoffensis, valkanovii, vitellina, vitellina pacifica, vitellina vitellina, zopfii), Labyrinthuloides (Especies: sp., haliotidis, yorkensis), Labyrinthomyxa (Especies: sp., marina), Diplophrys (Especies: sp., archeri), Pyrrhosorus (Especies: sp., marinus), Sorodiplophrys (Especies: sp., stercorea) o Chlamydomyxa (Especies: sp., labyrinthuloides, montana) (aunque actualmente no hay consenso sobre la ubicación taxonómica exacta de Pyrrhosorus, Sorodiplophrys o Chlamydomyxa).
Las células hospedadoras del filo Labyrinthulomycota incluyen, pero no se limitan a, las cepas depositadas PTA-10212, PTA-10213, PTA-10214, PTA-10215, PTA-9695, PTA-9696, PTA-9697, PTA-9698, PTA-10208, PTA-10209, PTA-10210, PTA-10211, el microorganismo depositado como SAM2179 (denominado "Ulkenia SAM2179" por el depositante), cualquier especie de Thraustochytrium (incluidas las especies de Ulkenia anteriores como U. visurgensis, U. amoeboida, U. sarkariana, U. profunda, U radiata, U. minuta y Ulkenia sp. BP-5601), e incluyendo Thraustochytrium striatum, Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium roseum; y cualquier Japonochytrium species. Las cepas de Thraustochytriales incluyen, pero no se limitan a Thraustochytrium sp. (23B) (ATCC 20891); Thraustochytrium striatum (Schneider)(ATCC 24473); Thraustochytrium aureum (Goldstein) (At CC 34304); Thraustochytrium roseum (Goldstein) (At CC 28210); y Japonochytrium sp. (L1) (a Tc C 28207). Schizochytrium incluye, pero no se limita a, Schizochytrium aggregatum, Schizochytrium limacinum, Schizochytrium sp. (S31) (ATCC 20888), Schizochytrium sp. (S8) (At Cc 20889), Schizochytrium sp. (LC-RM) (ATCC 18915), Schizochytrium sp. (SR 21), cepa depositada ATCC 28209 y cepa depositada de Schizochytrium limacinum IFO 32693. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es un Schizochytrium o un Thraustochytrium. El Schizochytrium puede replicarse tanto mediante bipartición sucesiva como mediante formación de esporangios, que finalmente liberan zoosporas. Thraustochytrium, sin embargo, se replica solo mediante la formación de esporangios, que luego liberan zoosporas. En algunas realizaciones, la célula hospedadora de la invención es una célula hospedadora recombinante.
Las condiciones de cultivo eficaces para una célula hospedadora de la invención incluyen, pero no se limitan a, medios eficaces, biorreactor, temperatura, pH y condiciones de oxígeno que permiten la producción y/o recombinación de proteínas. Un medio eficaz se refiere a cualquier medio en el que una célula de Thraustochytriales, por ejemplo, una célula hospedadora de Schizochytrium, se cultiva normalmente. Dicho medio comprende normalmente un medio acuoso que tiene fuentes asimilables de carbono, nitrógeno y fosfato, así como sales, minerales, metales y otros nutrientes apropiados, tales como vitaminas. En la sección de ejemplos se desvelan ejemplos no limitantes de medios y condiciones de cultivo adecuados. Las condiciones de cultivo no limitantes adecuadas para microorganismos Thraustochytriales también se describen en la Patente de Estados Unidos N.° 5.340.742, incorporada en el presente documento por referencia en su totalidad. Las células de la presente invención se pueden cultivar en biorreactores de fermentación convencionales, matraces de agitación, tubos de ensayo, placas de microtitulación y placas Petri. El cultivo se puede llevar a cabo a una temperatura, pH y contenido de oxígeno apropiados para una célula recombinante. En algunas realizaciones, una célula hospedadora de Labyrinthulomycota de la invención contiene un vector recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador de selección. En algunas realizaciones, el marcador de selección permite la selección de microorganismos transformados. Los ejemplos de marcadores de selección dominantes incluyen enzimas que degradan los compuestos con actividad antibiótica o fungicida, tales como, por ejemplo, el gen Sh ble de Steptoalloteichus hindustanus, que codifica una "proteína de unión a bleomicina" representada por la SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador de selección dominante comprende una secuencia de acetolactato sintasa de traustoquitridio tal como una versión mutada de la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 6. En algunas realizaciones, la acetolactato sintasa se ha modificado, mutado o seleccionado de otro modo para que sea resistente a la inhibición por compuestos de sulfonilurea, inhibidores de la clase de imidazolinona y/u oxibenzoatos de pirimidinilo. En algunas realizaciones, la acetolactato sintasa es un homólogo de una acetolactato sintasa de origen natural. En algunas realizaciones, un microorganismo traustoquitridio que se ha transfectado con un vector recombinante que comprende la acetolactato sintasa tiene una sensibilidad reducida a los compuestos de sulfonurea, inhibidores de la clase de imidazolinona y/u oxibenzoatos de pirimidinilo. En algunas realizaciones, el vector recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína acetolactato sintasa que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la SEQ ID NO: 7 por una eliminación, inserción o sustitución de aminoácidos en una o más de las siguientes posiciones: 116G, 117A, 192P, 200A, 251K, 358M, 383D, 592V, 595W, o 599F. En algunas realizaciones, una proteína acetolactato sintasa mutada tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: s Eq ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10. En algunas realizaciones, el vector recombinante comprende una secuencia polinucleotídica al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, en donde dicha secuencia polinucleotídica codifica una secuencia de aminoácidos que funciona como un marcador de selección dominante, al menos en un traustoquitridio. En algunas realizaciones, el vector recombinante comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un fragmento funcional de la SEQ ID NO: 7, que funciona como un marcador de selección dominante, al menos en un traustoquitridio. En algunas realizaciones, el vector recombinante comprende una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13.
El término "transformación" se usa para hacer referencia a cualquier método por el que pueda insertarse una molécula de ácido nucleico exógena (es decir, una molécula de ácido nucleico recombinante) en una célula microbiana. En sistemas microbianos, el término "transformación" se usa para describir un cambio hereditario debido a la adquisición de ácidos nucleicos exógenos por el microorganismo y es esencialmente sinónimo del término "transfección". Las técnicas de transformación adecuadas para introducir moléculas de ácido nucleico exógenas en las células hospedadoras de Labyrinthulomycota incluyen, pero no se limitan a, bombardeo de partículas, electroporación, microinyección, lipofección, adsorción, infección y fusión de protoplastos. En algunos ejemplos, las moléculas de ácido nucleico exógenas, incluidos los vectores recombinantes, se introducen en una célula microbiana que se encuentra en una fase estacionaria. En algunos ejemplos, las moléculas de ácido nucleico exógenas, incluidos los vectores recombinantes, se introducen en una célula microbiana durante la fase de crecimiento exponencial. En algunos ejemplos, las moléculas de ácido nucleico exógenas, incluidos los vectores recombinantes, se introducen en las células cuando alcanzan una densidad óptica de 1,5 a 2 a 600 nm.
Se describe un método para transformar una célula hospedadora, que comprende: (a) pretratar la célula hospedadora con una enzima que tiene actividad proteasa, y (b) introducir una molécula de ácido nucleico en la célula hospedadora mediante electroporación. En algunos ejemplos, la célula hospedadora se transforma con mayor eficacia después del pretratamiento enzimático antes de la electroporación que sin el pretratamiento enzimático. La enzima incluye, pero no se limita a, una actividad enzimática asociada con el polvo de acetona de caracol, proteasa IX, proteasa XIV, sulfatasa, p-glucuronidasa y combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, la célula hospedadora se trata previamente con aproximadamente 0,05 mg/ml, aproximadamente 0,1 mg/ml, aproximadamente 0,15 mg/ml, aproximadamente 0,2 mg/ml, aproximadamente 0,25 mg/ml, aproximadamente 0,3 mg/ml, aproximadamente 0,4 mg/ml, aproximadamente 0,5 mg/ml, aproximadamente 0,6 mg/ml, 0,7 mg/ml, 0,8 mg/ml, 0,9 mg/ml o aproximadamente 1 mg/ml de polvo de acetona de caracol, proteasa IX, proteasa XIV o combinaciones de las mismas. En algunos ejemplos, la célula hospedadora se trata con aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 1 mg/ml, aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1 mg/ml, aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 0,5 mg/ml o aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 0,5 mg/ml de polvo de acetona de caracol, proteasa IX, proteasa XIV o una combinación de las mismas. En algunos ejemplos, la célula hospedadora se trata con 0,05X, 0,1X, 0,2X, 0,3X, 0,4X, 0,5X, 0,6X, 0,7X, 0,8X, 0,9X o 1X de sulfatasa, p-Glucuronidasa o una combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la célula hospedadora se trata con aproximadamente 0,05X a aproximadamente IX, aproximadamente 0,1X a aproximadamente 1X, aproximadamente 0,1X a aproximadamente 0,5X, o aproximadamente 0,05X a aproximadamente 0,5X de sulfatasa, p-Glucuronidasa o una combinación de las mismas. En algunas realizaciones, el pretratamiento de proteasa comprende el pretratamiento con proteasa IX, proteasa XIV, polvo de acetona de caracol, sulfatasa, p-glucuronidasa, o una combinación de las mismas a cualquiera de las concentraciones descritas anteriormente. En algunos ejemplos, la electroporación ocurre a un voltaje de aproximadamente 100 V a aproximadamente 500 V para una distancia de separación de cubeta de 0,1 cm o 0,2 cm. En algunos ejemplos, la electroporación ocurre a un voltaje de aproximadamente 100 V, 150 V, 200 V, 250 V, 300 V, 350 V, 400 V, 450 V o 500 V para una distancia de separación de cubeta de 0,1 cm o 0,2 cm.
En algunos ejemplos, una célula hospedadora se modifica genéticamente para introducir o eliminar genes implicados en las rutas biosintéticas asociadas con el transporte y/o síntesis de carbohidratos, incluidos los implicados en la glucosilación.
Por ejemplo, la célula hospedadora se puede modificar mediante la eliminación de genes de glucosilación endógenos y/o la inserción de genes de glucosilación humanos o animales para permitir patrones de glucosilación que se parezcan más a los de los seres humanos. La modificación de la glucosilación en la levadura se puede encontrar, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N.° 7.029.872 y la Publicaciones de Estados Unidos N.° 2004/0171826, 2004/0230042, 2006/0257399, 2006/0029604, y 2006/0040353.
Sistemas de expresión
En algunos ejemplos, el sistema de expresión utilizado para la expresión de una proteína en una célula hospedadora comprende elementos de control reguladores que son activos en las células de algas. En algunos ejemplos, el sistema de expresión comprende elementos de control reguladores que son activos en las células de Labyrinthulomycota. En algunas realizaciones, la expresión comprende elementos de control reguladores que son activos en traustoquitridios. En algunos ejemplos, el sistema de expresión comprende elementos de control reguladores que están activos en Schizochytrium o Thraustochytrium. Muchos elementos de control reguladores de algas, incluidos varios promotores, están activos en varias especies diversas. Por lo tanto, las nuevas secuencias reguladoras desveladas se pueden utilizar en un tipo de célula que es idéntico a la célula de la que se aislaron o se pueden utilizar en un tipo de célula que es diferente de la célula de la que se aislaron. El diseño y la construcción de dichos casetes de expresión utilizan técnicas convencionales de biología molecular conocidas por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edición.
En algunos ejemplos, el sistema de expresión utilizado para la producción de proteínas en las células de Labyrinthulomycota comprende elementos reguladores que proceden de las secuencias de Labyrinthulomycota. En algunos ejemplos, el sistema de expresión utilizado para producir proteínas en células de Labyrinthulomycota comprende elementos reguladores que proceden de secuencias no Labyrinthulomycota, incluidas secuencias procedentes de secuencias de algas no Labyrinthulomycota. En algunos ejemplos, el sistema de expresión comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una proteína, en donde la secuencia polinucleotídica está asociada con cualquier secuencia promotora, cualquier secuencia de terminación y/o cualquier otra secuencia reguladora que sea funcional en una célula hospedadora de Labyrinthulomycota. Se pueden usar secuencias inducibles o constitutivamente activas. Los elementos de control reguladores adecuados también incluyen cualquiera de los elementos de control reguladores asociados con las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento.
Se describe un casete de expresión para la expresión de una proteína en una célula hospedadora. La presente invención también se dirige a cualquiera de las células hospedadoras descritas anteriormente que comprenden un casete de expresión para la expresión de una proteína en la célula hospedadora. En algunas realizaciones, el sistema de expresión comprende un casete de expresión que contiene elementos genéticos, tales como al menos un promotor, una secuencia de codificación y una región de terminación unidas operativamente de tal manera que sean funcionales en una célula hospedadora. En algunas realizaciones, el casete de expresión comprende al menos una de las moléculas de ácido nucleico aisladas de la invención como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, todos los elementos genéticos del casete de expresión son secuencias asociadas con moléculas de ácido nucleico aisladas. En algunas realizaciones, las secuencias de control son secuencias inducibles. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína está integrada en el genoma de la célula hospedadora. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína se integra de manera estable en el genoma de la célula hospedadora.
Los vectores recombinantes incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, fagos y virus. En algunas realizaciones, el vector recombinante es un vector linealizado. En algunas realizaciones, el vector recombinante es un vector de expresión. Como se usa en el presente documento, la expresión "vector de expresión" se refiere a un vector que es adecuado para la producción de un producto codificado (por ejemplo, una proteína de interés). En algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico que codifica el producto a producir se inserta en el vector recombinante para producir una molécula de ácido nucleico recombinante. La secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína que se va a producir se inserta en el vector de una manera que une operativamente la secuencia de ácido nucleico con secuencias reguladoras en el vector (por ejemplo, un promotor Thraustochytriales), lo que permite la transcripción y traducción de la secuencia de ácido nucleico dentro del microorganismo recombinante. En algunas realizaciones, un marcador seleccionable, que incluye cualquiera de los marcadores seleccionables descritos en el presente documento, permite la selección de un microorganismo recombinante en el que se ha introducido con éxito una molécula de ácido nucleico recombinante de la presente invención.
En algunas realizaciones, las proteínas producidas por una célula hospedadora recombinante de la invención incluyen, pero no se limitan a, proteínas terapéuticas. Una "proteína terapéutica", como se usa en el presente documento, incluye proteínas que son útiles para el tratamiento o prevención de enfermedades, afecciones o trastornos en animales y seres humanos. Los términos "tratar" y "tratamiento" se refieren tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas, en donde el objetivo es prevenir o ralentizar (disminuir) una afección, enfermedad o trastorno fisiológico no deseado, u obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para los fines de la presente invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de los síntomas o signos asociados con una afección, enfermedad o trastorno; disminución de la extensión de una afección, enfermedad o trastorno; estabilización de una afección, enfermedad o trastorno, (es decir, cuando la afección, enfermedad o trastorno no empeora); retraso en la aparición o progresión de la afección, enfermedad o trastorno; mejora de la afección, enfermedad o trastorno; remisión (ya sea parcial o total y si es detectable o indetectable) de la afección, enfermedad o trastorno; o mejora o alivio de una afección, enfermedad o trastorno. El tratamiento incluye obtener una respuesta clínicamente significativa sin efectos secundarios excesivos. El tratamiento también incluye prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no recibe tratamiento.
En determinadas realizaciones, las proteínas terapéuticas incluyen, pero no se limitan a, proteínas biológicamente activas, por ejemplo, enzimas, anticuerpos o proteínas antigénicas. En determinadas realizaciones, las proteínas terapéuticas incluyen, pero sin limitación: proteína A, hormona del crecimiento humana, un interferón, aprotinina, alfa antitripsina humana, proteínas lipofílicas, seroalbúmina humana, ácido glutámico descarboxilasa, lipasas gástricas, lactoferrina/lisozima, invertasa, anticuerpos (que incluyen, pero no se limitan a, anticuerpo monoclonal VEGF (AVASTIN®) y anticuerpo monoclonal HER2 (HERCEPTIN®)), una vacuna humana, una vacuna animal y un tratamiento terapéutico animal.
En algunas realizaciones, las proteínas producidas por una célula hospedadora recombinante de la invención incluyen, pero no se limitan a, enzimas industriales. Las enzimas industriales incluyen, pero no se limitan a, enzimas que se utilizan en la fabricación, preparación, conservación, movilización de nutrientes o procesamiento de productos, incluidos productos alimenticios, médicos, químicos, mecánicos y otros productos industriales. Las enzimas industriales incluyen, pero sin limitación: alfa amilasa, alfa-galactosidasa, beta-amilasa, celulosa, betaglucanasa, dextranasa, dextrinasa, glucoamilasa, hemicelulosa/pentosanasa, xilanasa, invertasa, lactasa, naringinasa, pectinasa, pululanasa, ácido proteinasa, alcalina proteasa, bromelina, papaína, pepsina, aminopeptidasa, endopeptidasas (tripsina, quimiotripsina, pepsina, elastasa), cuajo/renina/quimosina, subtilisina, termolisina, aminoacilasa, glutaminasa, lisozima, penicilina acilasa, trigliceridasas, fosfolipasas, esterasas pregástricas, fitasa, amidasas, isomerasas, alcohol deshidrogenasa, aminoácido oxidasa, catalasa, cloroperoxidasa, peroxidasa, acetolactato descarboxilasa, beta-descarboxilasa aspártica, histidasa, ciclodextrina glucosiltransferasa, fromasa, fitasa y quimosina.
En algunas realizaciones, las proteínas producidas mediante una célula hospedadora recombinante de la invención incluyen un marcador auxótrofo, un marcador de selección dominante (tal como, por ejemplo, una enzima que degrada la actividad antibiótica) u otra proteína implicada en la selección de transformación, una proteína que funciona como un informador, una enzima implicada en la glucosilación de proteínas y una enzima implicada en el metabolismo celular.
En cualquiera de las realizaciones de la invención, una proteína producida mediante una célula hospedadora de la invención puede ser una "proteína de salida" o una "proteína de salida heteróloga". Una "proteína de salida" o "proteína de salida heteróloga", como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína recombinante heteróloga que no está implicada en la modificación del metabolismo de la célula hospedadora que produce la proteína y que se produce mediante la célula hospedadora para su posterior aislamiento. La "proteína de salida", como se define en el presente documento, no incluye proteínas codificadas mediante genes informadores.
Las proteínas de salida heterólogas producidas por una célula hospedadora recombinante de la invención no incluyen marcadores seleccionables, tales como, un gen de resistencia a la zeocina (por ejemplo, el gen ble de Steptoalloteichus hindustanus) y Neomicina fosfotransferasa (npt, de sus siglas en inglés) de E. coli y el transposón Tn5, blasticidina desaminasa (bsdR) de Aspergillus terreus, PUFA sintasa ORFA de T23B de Thraustochytrium, PUFA sintasa ORFB de T23B de Thraustochytrium, PUFA sintasa ORFC de T23B de Thraustochytrium, eGFP sintética procedente de Aequorea victoria, genes naturales que codifican proteínas asociadas con la síntesis de un ácido graso seleccionado del grupo que consiste en ácido docosahexaenoico (DHA, de sus siglas en inglés), ácido docosapentaenoico (DPA, de sus siglas en inglés), ácido eicosapentaenoico (EPA, de sus siglas en inglés) y ácido araquidónico (ARA, de sus siglas en inglés), una ácido graso sintasa, una ácido graso desaturasa, una ácido graso elongasa, una proteína asociada con un complejo de policétido sintasa y una proteína asociada con la incorporación de ácidos grasos en fosfolípidos o en moléculas de triacilglicerol, una ácido graso omega-3 desaturasa, una ácido graso polienoico isomerasa, HMG-CoA sintasa, HMG-CoA reductasa, escualeno sintasa, fitoeno sintasa, fitoeno desaturasa, una carotenoide ciclasa, una carotenoide hidroxilasa, una carotenoide cetolasa, vitamina E y ácido lipoico, proteínas asociadas con la ruta biosintética isoprenoide, y enzimas implicadas en la producción de ácidos grasos poliinsaturados o carotenoides en la célula hospedadora.
En algunas realizaciones, una proteína producida mediante una célula hospedadora de la invención se produce a escala comercial. La escala comercial incluye la producción de proteínas a partir de un microorganismo cultivado en un fermentador aireado de un tamaño > l0o L, > 1.000 L, > 10.000 L o > 100.000 L. En algunas realizaciones, la producción a escala comercial se realiza en un fermentador aireado con agitación.
En algunas realizaciones, una proteína producida mediante una célula hospedadora de la invención puede acumularse dentro de la célula o puede secretarse de la célula, por ejemplo, en el medio de cultivo como una proteína soluble.
En algunas realizaciones, una proteína producida mediante la invención se recupera de la célula, del medio de cultivo o del medio de fermentación en el que se cultiva la célula. En algunas realizaciones, la proteína es una proteína secretada que se recupera de los medios de cultivo como una proteína soluble. En algunas realizaciones, la proteína es una proteína secretada que comprende un péptido señal.
En algunas realizaciones, una proteína producida mediante la invención comprende una señal dirigida que dirige su retención en el retículo endoplásmico, dirige su secreción extracelular o se dirige a otros orgánulos o compartimentos celulares. En algunas realizaciones, la proteína comprende un péptido señal. En algunas realizaciones, la proteína comprende un péptido señal del transportador Na/Pi-IIb2 o una proteína transportadora Sec1. En algunas realizaciones, el péptido señal comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 37. En algunas realizaciones, la proteína que comprende un péptido señal que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 37 se secreta en el medio de cultivo. En algunas realizaciones, el péptido señal se escinde de la proteína durante el proceso de secreción, dando como resultado una forma madura de la proteína.
En algunas realizaciones, una proteína producida mediante una célula hospedadora de la invención está glucosilada. En algunas realizaciones, el patrón de glucosilación de la proteína producida mediante la invención se asemeja más a los patrones de glucosilación de mamíferos que las proteínas producidas en levaduras o E. coli. En algunas realizaciones, la proteína producida mediante una célula hospedadora de Labyrinthulomycota de la invención comprende un patrón de glucosilación ligado a N. Las proteínas glucosiladas utilizadas con fines terapéuticos tienen menos probabilidades de promover respuestas inmunitarias antiglucoforma cuando sus patrones de glucosilación son similares a los patrones de glucosilación encontrados en un organismo sujeto. Por el contrario, las proteínas glucosiladas que tienen enlaces o azúcares que no son característicos de un organismo sujeto tienen más probabilidades de ser antigénicas. Las funciones efectoras también se pueden modular mediante glucoformas específicas. Por ejemplo, la IgG puede mediar reacciones pro o antiinflamatorias en correlación con la ausencia o presencia, respectivamente, de ácidos siálicos terminales en glucoformas de la región Fc (Kaneko et al, Science 313(5787):670-3 (2006)).
La presente invención se dirige además a un método para la producción de una proteína codificada por un polinucleótido que está operativamente unido al polinucleótido de la reivindicación 1, que comprende: (a) cultivar un microorganismo recombinante del orden Thraustochytriales en un medio, en donde el microorganismo recombinante comprende la molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1; y (b) producir la proteína preparada en la etapa (a). En algunas realizaciones, la proteína recombinante se secreta de la célula hospedadora y se recupera del medio de cultivo. En algunas realizaciones, una proteína que se secreta mediante la célula comprende un péptido señal de secreción. Dependiendo del vector y del sistema hospedador usado para la producción, las proteínas recombinantes de la presente invención pueden permanecer dentro de la célula recombinante, pueden secretarse en el medio de fermentación, pueden secretarse en un espacio entre dos membranas celulares o pueden retenerse en la superficie exterior de una membrana celular. Como se usa en el presente documento, la expresión "recuperar la proteína" se refiere a recoger el medio de fermentación que contiene la proteína y no necesita implicar etapas adicionales de separación o purificación. Las proteínas producidas mediante el método de la presente invención pueden purificarse usando una variedad de técnicas estándar de purificación de proteínas, tales como, pero no se limitan a, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, filtración, electroforesis, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de fase inversa, cromatografía con concanavalina A, cromatoenfoque y solubilización diferencial. En algunas realizaciones, las proteínas producidas mediante el método de la presente invención se aíslan en forma "sustancialmente pura". Como se usa en el presente documento, "sustancialmente puro" se refiere a una pureza que permite el uso eficaz de la proteína como producto comercial. En algunas realizaciones, la proteína recombinante se acumula dentro de la célula y se recupera de la célula. En algunas realizaciones, la célula hospedadora del método es un traustoquitridio. En algunas realizaciones, la célula hospedadora del método es un Schizochytrium o un Thraustochytrium. En algunas realizaciones, la proteína recombinante es una proteína terapéutica, una enzima alimentaria o una enzima industrial. En algunas realizaciones, la célula hospedadora recombinante de Labyrinthulomycota es un Schizochytrium y la proteína recombinante es una proteína terapéutica que comprende una secuencia señal de secreción.
En algunas realizaciones, un vector recombinante de la invención es un vector de direccionamiento. Como se usa en el presente documento, la expresión "vector de direccionamiento" se refiere a un vector que se usa para administrar una molécula de ácido nucleico particular en una célula recombinante, en donde la molécula de ácido nucleico se usa para eliminar o inactivar un gen endógeno dentro de la célula hospedadora (es decir, utilizado para la inactivación génica dirigida o la tecnología de desactivación). Dicho vector también se conoce como un vector "de desactivación". En algunas realizaciones, una porción del vector de direccionamiento tiene una secuencia de ácido nucleico que es homóloga a una secuencia de ácido nucleico de un gen diana en la célula hospedadora (es decir, un gen cuyo objetivo es eliminar o inactivar). En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico insertada en el vector (es decir, el inserto) es homóloga al gen diana. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico del inserto del vector está diseñada para unirse al gen diana de manera que el gen diana y el inserto experimenten una recombinación homóloga, por lo que el gen diana endógeno se elimina, inactiva o atenúa (es decir, al menos una porción del gen diana endógeno está mutado o eliminado).
Moléculas de ácido nucleico aisladas
La presente invención está dirigida a moléculas de ácido nucleico aisladas o secuencias polinucleotídicas que pueden usarse para regular la expresión génica. Las secuencias de ácido nucleico descritas en el presente documento incluyen promotores y pueden utilizarse para regular la transcripción de proteínas heterólogas.
De acuerdo con la presente invención, una molécula de ácido nucleico aislada es una molécula de ácido nucleico que se ha eliminado de su medio natural (es decir, que ha sido sometida a manipulación humana), siendo su medio natural el genoma o cromosoma en que se encuentra la molécula de ácido nucleico en la naturaleza. Como tal, "aislada" no refleja necesariamente el grado en que se ha purificado la molécula de ácido nucleico, sino que indica que la molécula no incluye un genoma completo o un cromosoma completo en que se encuentra la molécula de ácido nucleico en la naturaleza. Una molécula de ácido nucleico aislada puede incluir ADN, ARN (por ejemplo, ARNm) o derivados de ADN o ARN (por ejemplo, ADNc). Aunque la expresión "molécula de ácido nucleico" se refiere principalmente a la molécula de ácido nucleico física y la expresión "secuencia de ácido nucleico" o "secuencia polinucleotídica" se refiere principalmente a la secuencia de nucleótidos en la molécula de ácido nucleico, las expresiones se utilizan indistintamente, especialmente con respecto a una molécula de ácido nucleico, secuencia polinucleotídica o una secuencia de ácido nucleico que es capaz de codificar un proteína. En algunas realizaciones, se produce una molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención usando tecnología de ADN recombinante (por ejemplo, amplificación de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, de sus siglas en inglés), clonación) o síntesis química. Las moléculas de ácido nucleico aisladas incluyen moléculas de ácido nucleico natural y sus homólogos, que incluyen, pero no se limitan a, variantes alélicas naturales y moléculas de ácido nucleico modificadas en las que se han insertado, eliminado, sustituido y/o invertido nucleótidos de tal manera que dichas modificaciones proporcionan el efecto deseado sobre la secuencia, función y/o actividad biológica del péptido o proteína codificados.
Un complemento de secuencia de ácido nucleico de una secuencia promotora, secuencia de terminación, secuencia de péptido señal o cualquier otra secuencia de la invención se refiere a la secuencia de ácido nucleico de la cadena de ácido nucleico que es complementaria a la cadena con la secuencia promotora, secuencia de terminación, secuencia de péptido señal, o cualquier otra secuencia de la invención. Se apreciará que un ADN bicatenario que contiene una secuencia de la invención comprende un ADN monocatenario y su cadena complementaria que tiene una secuencia que es un complemento del ADN monocatenario. Como tal, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden ser bicatenarias o monocatenarias, e incluyen aquellas moléculas de ácido nucleico que forman híbridos estables en condiciones de hibridación "estrictas" con una secuencia de la invención, y/o con un complemento de una secuencia de la invención. Los expertos en la materia conocen métodos para deducir una secuencia complementaria.
El término "proteína" incluye moléculas polipeptídicas de cadena sencilla, así como complejos polipeptídicos múltiples donde los polipéptidos constituyentes individuales están unidos mediante medios covalentes o no covalentes. El término "polipéptido" incluye péptidos de dos o más aminoácidos de longitud, que normalmente tienen más de 5, 10 o 20 aminoácidos.
Las nuevas moléculas de ácido nucleico de la presente invención se pueden utilizar en cualquier microorganismo en el que sean funcionales. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico se utilizan en microorganismos recombinantes del filo Labyrinthulomycota. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico recombinantes se utilizan en microorganismos recombinantes del orden Thraustochytriales. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico recombinantes se utilizan en microorganismos de Schizochytrium o Thraustochytrium. Como se usa en el presente documento, un microorganismo recombinante tiene un genoma que se modifica (es decir, muta o cambia) de su forma normal (es decir, de tipo silvestre o de origen natural) usando tecnología recombinante. Un microorganismo recombinante de acuerdo con la presente invención puede incluir un microorganismo en el que se han insertado, eliminado o modificado moléculas de ácido nucleico (es decir, mutado, por ejemplo, mediante inserción, deleción, sustitución y/o inversión de nucleótidos), de tal manera que dicha modificación o modificaciones proporcionan el efecto deseado dentro del microorganismo. Como se usa en el presente documento, las modificaciones genéticas que dan como resultado una disminución en la expresión génica, en la función del gen o en la función del producto génico (es decir, la proteína codificada por el gen) pueden denominarse inactivación (completa o parcial), deleción, interrupción, bloqueo o regulación a la baja de un gen. Por ejemplo, una modificación genética en un gen que da como resultado una disminución en la función de la proteína codificada por dicho gen, puede ser el resultado de una eliminación completa del gen (es decir, el gen no existe en el microorganismo recombinante y, por lo tanto, la proteína no existe en el microorganismo recombinante), una mutación en el gen que da como resultado una traducción incompleta o nula de la proteína (por ejemplo, la proteína no se expresa), o una mutación en el gen que disminuye o elimina la función natural de la proteína (por ejemplo, se expresa una proteína que tiene actividad disminuida o nula (por ejemplo, actividad o acción enzimática). Las modificaciones genéticas que dan como resultado un aumento en la expresión o función del gen pueden denominarse amplificación, sobreproducción, sobreexpresión, activación, mejora, adición o regulación al alza de un gen.
Promotores
La presente invención también se dirige a nuevos elementos de control reguladores que son promotores. Un promotor de la invención es una región de ADN que dirige la transcripción de una región codificante asociada.
En algunas realizaciones, el promotor es de un microorganismo del filo Labyrinthulomycota. En algunas realizaciones, el promotor es de un traustoquitridio que incluye, pero sin limitación: el microorganismo depositado como SAM2179 (denominado "Ulkenia SAM2179" por el depositante), un microorganismo del género Ulkenia o Thraustochytrium, o un Schizochytrium. Schizochytrium incluye, pero no se limitan a, Schizochytrium aggregatum, Schizochytrium limacinum, Schizochytrium sp. (S31) (ATCC 20888), Schizochytrium sp. (S8) (ATCC 20889), Schizochytrium sp. (LC-RM) (ATCC 18915), Schizochytrium sp. (SR 21), cepa depositada de Schizochytrium ATc C 28209, cepa depositada de Schizochytrium IFO 32693.
Un promotor de la invención puede tener actividad promotora al menos en un traustoquitridio, e incluye secuencias promotoras de longitud completa y fragmentos funcionales de las mismas, secuencias de fusión y homólogos de un promotor de origen natural. Las enzimas de restricción se pueden usar para digerir las moléculas de ácido nucleico de la invención, seguido del ensayo apropiado para determinar la secuencia mínima requerida para la actividad promotora. Dichos fragmentos en sí mismos representan individualmente realizaciones de la presente invención. Un homólogo de un promotor difiere de un promotor de origen natural en que al menos uno, dos, tres o varios, nucleótidos se han eliminado, insertado, invertido, sustituido y/o derivatizado. Un homólogo de un promotor puede retener la actividad como promotor, al menos en un traustoquitridio, aunque la actividad puede aumentarse, disminuirse o hacerse dependiente de ciertos estímulos. Los promotores de la invención pueden comprender uno o más elementos de secuencia que confieren control o expresión reguladora de desarrollo y específicos de tejido.
Una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende un promotor EF1 largo (promotor "EF1 largo" o "EF1-L"). Un promotor EF1 largo de la invención es una región de ADN que se encuentra de forma natural cadena arriba (hacia la región 5') de la región codificante EF1 y que dirige la transcripción EF1. En algunas realizaciones, el promotor EF1 largo tiene una secuencia polinucleotídica representada por la SEQ ID NO: 43. En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 43, en donde la secuencia polinucleotídica tiene actividad promotora (es decir, tiene actividad transcripcional del promotor basal, al menos para una secuencia promotora EF1 corta o larga, respectivamente), al menos en un traustoquitridio. La homología (o % de identidad) se puede encontrar en una secuencia de al menos 50, al menos 100, al menos 200, al menos 300, al menos 400 o al menos 500 nucleótidos, o en toda la secuencia.
En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que es completamente complementaria a la SEQ ID NO: 43 o a una secuencia polinucleotídica que es al menos un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 43. En algunas realizaciones, un promotor largo EF1 de la presente invención incluye un homólogo del promotor largo EF1 que es suficientemente similar a una secuencia promotora larga EF1 de origen natural, respectivamente, siendo la secuencia de ácido nucleico del homólogo capaz de hibridarse, bajo condiciones de moderada, alta o muy alta rigurosidad (descritas a continuación) con el complemento de la secuencia de ácido nucleico del promotor largo EF1 de origen natural, respectivamente. En algunas realizaciones, una secuencia promotora larga EF1 de la invención se hibrida en condiciones de moderada, alta o muy alta rigurosidad con el complemento de SEQ ID NO: 43.
En algunas realizaciones, el promotor de la invención comprende el promotor largo EF1 de pAB0018 como se deposita en el número de acceso ATCC PTA-9616. La molécula de la invención comprende una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 44 o SEQ ID NO: 45, en donde la secuencia polinucleotídica tiene actividad promotora (es decir, tiene actividad transcripcional del promotor basal, al menos para una secuencia promotora 60S corta o larga, respectivamente), al menos en un traustoquitridio. La homología (o % de identidad) se puede encontrar en una secuencia de al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 100, al menos 200, al menos 300, al menos 400 o al menos 500 nucleótidos, o en toda la secuencia.
La presente invención también se dirige a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia polinucleotídica que se hibrida con la SEC ID NO: 44 y/o la SEC ID NO: 45 o que se hibrida con una secuencia polinucleotídica que es al menos un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 44 y/o la SEQ ID NO: 45. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que es completamente complementaria a la SEQ ID NO: 44 y/o la SEQ ID NO: 45 o a una secuencia polinucleotídica que es al menos un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 44 y/o SEQ ID NO: 45. En algunas realizaciones, un promotor 60S corto o 60S largo de la presente invención incluye un homólogo del promotor 60S corto o 60S largo que es suficientemente similar a una secuencia promotora larga de origen natural 60S corta o 60S larga, respectivamente, siendo la secuencia de ácido nucleico del homólogo capaz de hibridarse, bajo condiciones de moderada, alta o muy alta rigurosidad (descritas a continuación) con el complemento de la secuencia de ácido nucleico del promotor largo de origen natural 60S corto y/o 60S largo, respectivamente. En algunas realizaciones, una secuencia promotora 60S corta y/o 60S larga de la invención se hibrida en condiciones de moderada, alta o muy alta rigurosidad con el complemento de SEQ ID NO: 44 y/o SEQ ID NO: 45, respectivamente.
En algunas realizaciones, el promotor de la invención comprende el promotor 60S largo de pAB0011 como se deposita en el número de acceso ATCC PTA-9614.
En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende un promotor Sec1 ("promotor Sec1"). Un promotor Sec1 de la invención es una región de ADN que se encuentra de manera natural cadena arriba (hacia la región 5') de la región codificante Sec1 y que dirige la transcripción Sec1. En algunas realizaciones, el promotor Sec1 tiene una secuencia polinucleotídica representada por la SEQ ID NO: 46. En algunas realizaciones, En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende un
Terminadores
Se describen elementos de control reguladores que son terminadores de la transcripción. Una región de terminación de la invención es una sección de secuencia genética que marca el final de una secuencia génica en el ADN genómico para la transcripción.
En algunos ejemplos, la región de terminación es de un microorganismo del filo Labyrinthulomycota. En algunos ejemplos, la región de terminación es de un traustoquitridio. En algunos ejemplos, la región de terminación es de un Schizochytrium o un Thraustochytrium. Schizochytrium incluye, pero no se limitan a, Schizochytrium aggregatum, Schizochytrium limacinum, Schizochytrium sp. (S31) (ATCC 20888), Schizochytrium sp. (S8) (ATCC 20889), Schizochytrium sp. (LC-RM) (ATCC 18915), Schizochytrium sp. (SR 21), cepa depositada At Cc 28209 y cepa depositada IFO 32693.
Una región de terminación de la invención puede tener actividad de terminación al menos en un traustoquitridio, e incluye secuencias de terminación de longitud completa y fragmentos funcionales de las mismas, secuencias de fusión y homólogos de una región de terminación de origen natural. Un homólogo de un terminador difiere de un terminador de origen natural en que al menos uno o unos pocos, pero sin limitarse a uno o unos pocos, nucleótidos se han eliminado, insertado, invertido, sustituido y/o derivatizado. En algunos ejemplos, los homólogos de un terminador retienen la actividad como una región del terminador al menos en un traustoquitridio, aunque la actividad puede aumentarse, disminuirse o hacerse dependiente de ciertos estímulos.
Se describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una región de terminación de un gen PUFA PKS OrfC ("región de terminación PKS OrfC"). Una región de terminación PKS OrfC de la invención es una sección de secuencia genética que marca el final de la secuencia génica OrfC en el ADN genómico para la transcripción. En algunos ejemplos, el terminador tiene una secuencia polinucleotídica representada por la SEQ ID NO: 4. La región de terminación desvelada en la SEQ ID NO: 4 es una secuencia de terminación de origen natural (de tipo silvestre) de un microorganismo traustoquitridio, y, específicamente, es una región de terminación PKS OrfC de Schizochytrium y se denomina "elemento terminador 1 de OrfC". En algunos ejemplos, una molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 4, y que funciona al menos como una región de terminación PUFA PKS OrfC al menos en un traustoquitridio. La homología (o % de identidad) se puede encontrar en una secuencia de al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 100, al menos 150 o al menos 200 nucleótidos, o en toda la secuencia.
Péptidos señal
También se describen moléculas de ácido nucleico que codifican péptidos señal.
En algunos ejemplos, se describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un péptido señal de una proteína secretada de un microorganismo del filo Labyrinthulomycota. En algunos ejemplos, el microorganismo es un traustoquitridio. En algunos ejemplos, el microorganismo es un Schizochytrium o un Thraustochytrium.
Un péptido señal descrito puede tener actividad de señal de secreción en un traustoquitridio e incluye péptidos de longitud completa y fragmentos funcionales de los mismos, péptidos de fusión y homólogos de un péptido señal de origen natural. Un homólogo de un péptido señal difiere de un péptido señal de origen natural en que al menos uno o unos pocos, pero sin limitarse a uno o unos pocos, aminoácidos se han eliminado (por ejemplo, una versión truncada de la proteína, tal como un péptido o fragmento), insertado, invertido, sustituido y/o derivatizado (por ejemplo, mediante glucosilación, fosforilación, acetilación, miristoilación, prenilación, palmitación, amidación y/o adición de glucosilfosfatidil inositol). En algunos ejemplos, los homólogos de un péptido señal retienen la actividad como señal al menos en un traustoquitridio, aunque la actividad puede aumentarse, disminuirse o hacerse dependiente de ciertos estímulos.
En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un péptido señal de proteína transportadora Na/Pi-IIb2. Un péptido señal de la proteína transportadora Na/Pi-IIb2 puede tener actividad de direccionamiento de señal al menos para una proteína transportadora Na/Pi-IIb2 al menos en un traustoquitridio, e incluye péptidos de longitud completa y fragmentos funcionales de los mismos, péptidos de fusión y homólogos de un péptido señal de la proteína transportadora Na/Pi-IIb2 de origen natural. En algunos ejemplos, el péptido señal de la proteína transportadora Na/Pi-IIb2 tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1. En algunos ejemplos, el péptido señal de la proteína transportadora Na/Pi-IIb2 tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 15. En algunos ejemplos, una molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 15, en donde la secuencia polinucleotídica codifica una secuencia de aminoácidos que funciona como un péptido señal, al menos para una proteína transportadora Na/Pi-IIb2, al menos en un traustoquitridio. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos aislada que comprende un fragmento funcional de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 15 que funciona como un péptido señal, al menos para una proteína transportadora Na/Pi-IIb2, al menos en un traustoquitridio. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende la SEQ ID NO: 2. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que se hibrida con cualquiera de: (i) SEQ ID NO: 2; (ii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 2; (iii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la secuencia de ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 1, y (vi) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la secuencia de ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 15. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que es completamente complementaria a cualquiera de: (i) SEQ ID NO: 2, (ii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 2, (iii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la secuencia de ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 1, y (vi) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la secuencia de ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 15.
También se describe un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos del péptido señal del transportador Na/Pi-IIb2. En algunos ejemplos, el polipéptido aislado comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (i) SEQ ID NO: 1, (ii) SEQ ID NO: 15, y (iii) una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 15, que funciona como una secuencia señal, al menos para un transportador Na/Pi-IIb2, al menos en un traustoquitridio. En algunos ejemplos, el polipéptido aislado comprende los primeros 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 o 35 restos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15 (es decir, SEQ ID NO: 15 en donde los últimos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 aminoácidos en el extremo C-terminal de esta secuencia se eliminan). Se predice que los 18 aminoácidos ubicados en el extremo C-terminal de la SEQ ID NO: 15 son parte de la proteína transportadora Na/Pi madura y se predice que el sitio de escisión de la secuencia señal se produce entre los restos de aminoácidos 35 y 36 de la SEQ ID NO: 15. Sin embargo, se puede emplear un péptido señal que incluye hasta los 18 aminoácidos de la proteína transportadora Na/Pi madura (es decir, los últimos 18 restos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15). Un polipéptido aislado es un polipéptido que se ha eliminado de su medio natural (es decir, que ha sido sometido a manipulación humana) y puede incluir proteínas purificadas, péptidos purificados, proteínas parcialmente purificadas, péptidos parcialmente purificados, proteínas o péptidos producidos de forma recombinante y proteínas o péptidos producidos de forma sintética, por ejemplo. Como tal, "aislado" no refleja el grado en que se ha purificado el polipéptido. En algunos ejemplos, se produce un péptido señal de transportador Na/Pi-IIb2 aislado de forma recombinante.
En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un péptido señal de alfa-1,6-manosiltransferasa (ALG12). Un péptido señal de ALG12 puede tener una actividad de direccionamiento de señal al menos para una proteína ALG12, al menos en un traustoquitridio, e incluye péptidos de longitud completa y fragmentos funcionales de los mismos, péptidos de fusión y homólogos de un péptido señal de ALG12 de origen natural. En algunos ejemplos, el péptido señal de ALG12 tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 59. En algunos ejemplos, una molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 59, en donde la secuencia polinucleotídica codifica una secuencia de aminoácidos que funciona como un péptido señal, al menos para una proteína ALG12, al menos en un traustoquitridio. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos aislada que comprende un fragmento funcional de SEQ ID NO: 59 que funciona como un péptido señal al menos para una proteína ALG12, al menos en un traustoquitridio. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende la SEQ ID NO: 60. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que se híbrida con cualquiera de: (i) SEQ ID NO: 60; (ii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 60; y (iii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la secuencia de ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 59. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que es completamente complementaria a cualquiera de: (i) SEQ ID NO: 60, (ii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 60, y (iii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la secuencia de ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 59.
También se describe un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos del péptido señal de ALG12. En algunos ejemplos, el polipéptido aislado comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (i) SEQ ID NO: 59, y (ii) una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 59 que funciona como una secuencia señal, al menos para una proteína ALG12, al menos en un traustoquitridio. En algunos ejemplos, el polipéptido aislado comprende los primeros 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32 restos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 59. En algunos ejemplos, se produce un péptido señal de ALG12 aislado de forma recombinante.
En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un péptido señal de la proteína de inmunoglobulina de unión (BiP, de sus siglas en inglés). Un péptido señal de BiP puede tener actividad de direccionamiento de señal al menos para una proteína BiP, al menos en un traustoquitridio, e incluye péptidos de longitud completa y fragmentos funcionales de los mismos, péptidos de fusión y homólogos de un péptido señal de BiP de origen natural. En algunos ejemplos, el péptido señal de BiP tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 61. En algunos ejemplos, una molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 61, en donde la secuencia polinucleotídica codifica una secuencia de aminoácidos que funciona como un péptido señal, al menos para una proteína BiP, al menos en un traustoquitridio. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos aislada que comprende un fragmento funcional de SEQ ID NO: 61 que funciona como un péptido señal al menos para una proteína BiP, al menos en un traustoquitridio. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende la SEQ ID NO: 62. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que se hibrida con cualquiera de: (i) SEQ ID NO: 62; (ii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 62; y (iii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la secuencia de ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 61. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que es completamente complementaria a cualquiera de: (i) SEQ ID NO: 62, (ii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 62, y (iii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la secuencia de ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 61.
También se describe un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos del péptido señal de BiP. En algunos ejemplos, el polipéptido aislado comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (i) SEQ ID NO: 61, y (ii) una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 61 que funciona como una secuencia señal, al menos para una proteína BiP, al menos en un traustoquitridio. En algunos ejemplos, el polipéptido aislado comprende los primeros 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o 31 restos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 61. En algunos ejemplos, se produce un péptido señal de BiP aislado de forma recombinante.
En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un péptido señal de alfa-1,3-glucosidasa (GLS2). Un péptido señal de GLS2 puede tener actividad de direccionamiento de señal al menos para una proteína GLS2, al menos en un traustoquitridio, e incluye péptidos de longitud completa y fragmentos funcionales de los mismos, péptidos de fusión y homólogos de un péptido señal de GLS2 de origen natural. En algunos ejemplos, el péptido señal de GLS2 tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 63. En algunos ejemplos, una molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 63, en donde la secuencia polinucleotídica codifica una secuencia de aminoácidos que funciona como un péptido señal, al menos para una proteína GLS2, al menos en un traustoquitridio. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos aislada que comprende un fragmento funcional de SEQ ID NO: 63 que funciona como un péptido señal al menos para una proteína GLS2, al menos en un traustoquitridio. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende la SEQ ID NO: 64. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que se hibrida con cualquiera de: (i) SEQ ID NO: 64; (ii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 64; y (iii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la secuencia de ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 63. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que es completamente complementaria a cualquiera de: (i) SEQ ID NO: 64, (ii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 64, y (iii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la secuencia de ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 63.
También se describe un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos del péptido señal de GLS2. En algunos ejemplos, el polipéptido aislado comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (i) SEQ ID NO: 63, y (ii) una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 63 que funciona como una secuencia señal, al menos para una proteína GLS2, al menos en un traustoquitridio. En algunos ejemplos, el polipéptido aislado comprende los primeros 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 o 38 restos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 63. En algunos ejemplos, se produce un péptido señal de GLS2 aislado de forma recombinante.
En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un péptido señal tipo alfa-1,3-1,6-manosidasa. Un péptido señal de tipo alfa-1,3-1,6-manosidasa puede tener actividad de direccionamiento de señal al menos para una proteína de tipo alfa-1,3-1,6-manosidasa, al menos en un traustoquitridio, e incluye péptidos de longitud completa y fragmentos funcionales de los mismos; péptidos de fusión y homólogos de un péptido señal de tipo alfa-1,3-1,6-manosidasa de origen natural. En algunos ejemplos, el péptido señal de tipo alfa-1,3-1,6-manosidasa tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 65. En algunos ejemplos, una molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 65, en donde la secuencia polinucleotídica codifica una secuencia de aminoácidos que funciona como un péptido señal, al menos para una proteína tipo alfa-1,3-1,6-manosidasa, al menos en un traustoquitridio. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos aislada que comprende un fragmento funcional de s Eq ID NO: 65 que funciona como un péptido señal al menos para una proteína tipo alfa-1,3-1,6-manosidasa, al menos en un traustoquitridio. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende la SEQ ID NO: 66. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que se hibrida con cualquiera de: (i) SEQ ID NO: 66; (ii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 66; y (iii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la secuencia de ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 65. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que es completamente complementaria a cualquiera de: (i) SEQ ID NO: 66, (ii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 66, y (iii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la secuencia de ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 65.
Se describe un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos del péptido señal tipo alfa-1,3-1,6-manosidasa. En algunos ejemplos, el polipéptido aislado comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (i) SEQ ID NO: 65, y (ii) una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 65 que funciona como una secuencia señal, al menos para una de tipo alfa-1,3-1,6-manosidasa; al menos en un traustoquitridio. En algunos ejemplos, el polipéptido aislado comprende los primeros 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 o 34 restos de aminoácidos de la s Eq ID NO: 65. En algunos ejemplos, un péptido señal aislado de tipo alfa-1,3-1,6-manosidasa de la presente invención se produce de forma recombinante.
En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un péptido señal n.° 1 de tipo alfa-1,3-1,6-manosidasa. Un péptido señal n.° 1 de tipo alfa-1,3-1,6-manosidasa puede tener actividad de direccionamiento de señal al menos para una proteína n.° 1 de tipo alfa-1,3-1,6-manosidasa, al menos en un traustoquitridio, e incluye péptidos de longitud completa y fragmentos funcionales de los mismos, péptidos de fusión y homólogos de un péptido señal n.° 1 de tipo alfa-1,3-1,6-manosidasa de origen natural. En algunos ejemplos, el péptido señal n.° 1 de tipo alfa-1,3-1,6-manosidasa tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 67. En algunos ejemplos, una molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 67, en donde la secuencia polinucleotídica codifica una secuencia de aminoácidos que funciona como un péptido señal, al menos para un polipéptido n.° 1 de tipo alfa-1,3-1,6-manosidasa; al menos en un traustoquitridio. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos aislada que comprende un fragmento funcional de SEQ ID NO: 67 que funciona como un péptido señal al menos para una proteína n.° 1 de tipo alfa-1,3-1,6-manosidasa, al menos en un traustoquitridio. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende la SEQ ID NO: 68. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que se hibrida con cualquiera de: (i) SEQ ID NO: 68; (ii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 68; y (iii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la secuencia de ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 67. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que es completamente complementaria a cualquiera de: (i) SEQ ID NO: 68, (ii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 68, y (iii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la secuencia de ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 67.
También se describe un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos del péptido señal n.° 1 de tipo alfa-1,3-1,6-manosidasa. En algunos ejemplos, el polipéptido aislado comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (i) SEQ ID NO: 67, y (ii) una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 67 que funciona como una secuencia señal, al menos para una proteína n. ° 1 de tipo alfa-1,3-1,6-manosidasa, al menos en un traustoquitridio. En algunos ejemplos, el polipéptido aislado comprende los primeros 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29 restos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 67. En algunos ejemplos, se produce un péptido señal n. ° 1 de tipo alfa-1,3-1,6 manosidasa aislado de forma recombinante.
En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un péptido señal tipo alfa-1,2-manosidasa. Un péptido señal de tipo alfa-1,2-manosidasa puede tener actividad de direccionamiento de señal al menos para una proteína de tipo alfa-1,2-manosidasa, al menos en un traustoquitridio, e incluye péptidos de longitud completa y fragmentos funcionales de los mismos, péptidos de fusión y homólogos de un péptido señal de tipo alfa-1,2-manosidasa de origen natural. En algunos ejemplos, el péptido señal de tipo alfa-1,2-manosidasa tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 69. En algunos ejemplos, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 69, en donde la secuencia polinucleotídica codifica una secuencia de aminoácidos que funciona como un péptido señal, al menos para una proteína tipo alfa-1,2-manosidasa; al menos en un traustoquitridio. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos aislada que comprende un fragmento funcional de s Eq ID NO: 69 que funciona como un péptido señal al menos para una proteína tipo alfa-1,2-manosidasa, al menos en un traustoquitridio. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende la SEQ ID NO: 70. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que se hibrida con cualquiera de: (i) SEQ ID NO: 70; (ii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 70; y (iii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la secuencia de ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 69. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que es completamente complementaria a cualquiera de: (i) SEQ ID NO: 70, (ii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 70, y (iii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la secuencia de ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 69.
Se describe un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos del péptido señal tipo alfa-1,2-manosidasa. En algunos ejemplos, el polipéptido aislado comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (i) SEQ ID NO: 69, y (ii) una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 69 que funciona como una secuencia señal, al menos para una proteína tipo alfa-1,2-manosidasa, al menos en un traustoquitridio. En algunos ejemplos, el polipéptido aislado comprende los primeros 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 o 36 restos de aminoácidos de la s Eq ID NO: 69. En algunos ejemplos, se produce un péptido señal de tipo alfa-1,2-manosidasa aislado de forma recombinante.
En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un péptido señal tipo beta-xilosidiasa. Un péptido señal de tipo beta-xilosidasa puede tener actividad de direccionamiento de señal al menos para una proteína de tipo beta-xilosidasa, al menos en un traustoquitridio, e incluye péptidos de longitud completa y fragmentos funcionales de los mismos, péptidos de fusión y homólogos de un péptido señal de tipo beta-xilosidasa de origen natural. En algunos ejemplos, el péptido señal de tipo betaxilosidasa tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 71. En algunos ejemplos, una molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 71, en donde la secuencia polinucleotídica codifica una secuencia de aminoácidos que funciona como un péptido señal, al menos para una proteína de tipo beta-xilosidasa, al menos en un traustoquitridio. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos aislada que comprende un fragmento funcional de SEQ ID NO: 71 que funciona como un péptido señal al menos para una proteína de tipo beta-xilosidasa, al menos en un traustoquitridio. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende la SEQ ID NO: 72. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que se hibrida con cualquiera de: (i) SEQ ID NO: 72; (ii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 72; y (iii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la secuencia de ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 71. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que es completamente complementaria a cualquiera de: (i) SEQ ID NO: 72, (¡i) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 72, y (iii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la secuencia de ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 71.
Se describe un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos del péptido señal de tipo betaxilosidasa. En algunos ejemplos, el polipéptido aislado comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (i) s Eq ID NO: 71, y (ii) una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 71 que funciona como una secuencia señal, al menos para una proteína de tipo beta-xilosidasa, al menos en un traustoquitridio. En algunos ejemplos, el polipéptido aislado comprende los primeros 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 restos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 71. En algunos ejemplos, se produce un péptido señal de tipo beta-xilosidasa aislado de forma recombinante.
En algunos ejemplos descritos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un péptido señal de caroteno sintasa. Un péptido señal de caroteno sintasa puede tener actividad de direccionamiento de señal al menos para una proteína caroteno sintasa, al menos en un traustoquitridio, e incluye péptidos de longitud completa y fragmentos funcionales de los mismos, péptidos de fusión y homólogos de un péptido señal de caroteno sintasa de origen natural. En algunos ejemplos, el péptido señal de caroteno sintasa tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 73. En algunos ejemplos, una molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 73, en donde la secuencia polinucleotídica codifica una secuencia de aminoácidos que funciona como un péptido señal, al menos para una proteína caroteno sintasa, al menos en un traustoquitridio. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos aislada que comprende un fragmento funcional de SEQ ID NO: 73 que funciona como un péptido señal al menos para una proteína caroteno sintasa; al menos en un traustoquitridio. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende la SEQ ID NO: 74. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que se hibrida con cualquiera de: (i) SEQ ID NO: 74; (ii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 74; y (iii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la secuencia de ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 73. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que es completamente complementaria a cualquiera de: (i) SEQ ID NO: 74, (ii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 74, y (iii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la secuencia de ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 73.
Se describe un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos del péptido señal de caroteno sintasa. En algunos ejemplos, el polipéptido aislado comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (i) SEQ ID NO: 73, y (ii) una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 73 que funciona como una secuencia señal, al menos para una proteína caroteno sintasa, al menos en un traustoquitridio. En algunos ejemplos, el polipéptido aislado comprende los 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 29, 30, 31, 32, 33 o 34 restos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 73. En algunos ejemplos, se produce una señal de caroteno sintasa aislada de forma recombinante.
En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un péptido señal de la proteína Sec1 ("Sec1"). Un péptido señal de Sec1 puede tener actividad de direccionamiento de señal al menos para una proteína Sec1 al menos en un traustoquitridio, e incluye péptidos de longitud completa y fragmentos funcionales de los mismos, péptidos de fusión y homólogos de un péptido señal de Sec1 de origen natural. En algunas realizaciones, el péptido señal de Sec1 se representa por la SEQ ID NO: 37. En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un
65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un
80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un
95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98
%, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 37, en donde la secuencia polinucleotídica codifica una secuencia de aminoácidos que funciona como un péptido señal al menos para una proteína Sec1, al menos en un traustoquitridio. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos aislada que comprende un fragmento funcional de SEQ ID NO: 37 que funciona como un péptido señal, al menos para una proteína Sec1, al menos en un traustoquitridio. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende la SEQ ID NO: 38. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que se hibrida con cualquiera de: (i) SEQ ID NO: 38, (ii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60
%, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 38, y (iii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la secuencia de ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 37. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia polinucleotídica que es completamente complementaria a cualquiera de: (i) SEQ ID NO: 38, (ii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 38, y (iii) una secuencia polinucleotídica que es al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 %, al menos aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la secuencia de ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 37.
Se describe un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos del péptido señal de Sec1. En algunos ejemplos, el polipéptido aislado comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (i) SEQ ID nO: 37, y (ii) una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 65 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 aproximadamente un 80 %, al
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menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 96 %, al menos aproximadamente un 97 aproximadamente un 98 %, o al menos aproximadamente un 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 37 que funciona una secuencia señal, al menos para un transportador Sec1, al menos en un traustoquitridio. En algunos ejemplos, el polipéptido aislado comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los primeros 18 o 19 restos de aminoácidos de la SEQ Id NO: 37 (es decir, SEQ ID NO: 37, en donde los últimos 1 o 2 aminoácidos en el extremo
C-terminal de esta secuencia se eliminan). En algunos ejemplos, se produce un péptido señal de Sec1 aislado de forma recombinante.
En algunos ejemplos, una molécula de ácido nucleico aislada comprende un promotor OrfC, un promotor corto EF1, un promotor largo EF1, un promotor corto 60S, un promotor largo 60S, un promotor Sec1, una región de terminación
PKS OrfC, una secuencia que codifica un péptido señal de proteína transportadora Na/Pi-IIb2, o una secuencia que codifica un péptido señal de proteína transportadora Sec1 que está unida operativamente al extremo 5' de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína. La presente invención también abarca vectores recombinantes (que incluyen, pero no se limitan a, vectores de expresión), casetes de expresión y células hospedadoras que comprenden un promotor OrfC, un promotor corto EF1, un promotor largo EF1, un promotor corto
60S, un promotor largo 60S, un promotor Sec1, una región de terminación PKS OrfC, una secuencia que codifica un péptido señal de proteína transportadora Na/Pi-IIb2, o una secuencia que codifica un péptido señal de proteína transportadora Sec1 que está unida operativamente al extremo 5' de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína.
Los vectores recombinantes (incluyen, pero no se limitan a, vectores de expresión), casetes de expresión, células hospedadoras y microorganismos que comprenden cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aisladas descritas anteriormente de la presente invención también están abarcados por la presente invención, al igual que los métodos para introducir los vectores y/o casetes de expresión en las células hospedadoras y los microorganismos recombinantes. Se pueden seleccionar o construir vectores y casetes de expresión adecuados para que contengan secuencias reguladoras apropiadas, fragmentos terminadores, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias según sea apropiado. En el presente documento se exponen detalles adicionales con respecto a los vectores, los casetes de expresión y las células hospedadoras.
Como se usa en el presente documento, a menos que se especifique lo contrario, la referencia a un porcentaje (%) de identidad (y % idéntico) se refiere a una evaluación de homología que se realiza usando: (1) una búsqueda de homología BLAST 2.0 Basic BLAST usando blastp para búsquedas de aminoácidos y blastn para búsquedas de ácido nucleico con parámetros por defecto convencionales, en donde la secuencia de consulta se filtra para regiones de baja complejidad por defecto (véase, por ejemplo, Altschul, S., et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997), incorporada en el presente documento como referencia en su totalidad); (2) una alineación BLAST 2 usando los parámetros descritos posteriormente; (3) y/o PSI-BLAST (BLAST iterado específico de posición) con los parámetros por defecto convencionales. Se aprecia que debido a algunas diferencias en los parámetros convencionales entre BLAST 2.0 Basic BLAST y BLAST 2, podría reconocerse que dos secuencias específicas tienen homología significativa usando el programa BLAST 2, mientras que una búsqueda realizada en BLAST 2.0 Basic BLAST usando una de las secuencias como secuencia de consulta puede no identificar la segunda secuencia en las mejores coincidencias. Además, PSI-BLAST proporciona una versión automatizada, fácil de usar de una búsqueda "de perfil", que es una manera sensible de buscar homólogos de secuencia. El programa en primer lugar realiza una búsqueda en base de datos de BLAST con huecos. El programa PSI-BLAST usa la información de cualquier alineación significativa devuelta para construir una matriz de valores específica de posición, que remplaza la secuencia de consulta para la siguiente ronda de búsqueda en base de datos. Por lo tanto, debe entenderse que el porcentaje de identidad puede determinarse usando uno cualquiera de estos programas.
Las dos secuencias específicas pueden alinearse entre sí usando la secuencia BLAST 2 como se describe, por ejemplo, en Tatusova y Madden, FEMS Microbial. Lett. 174:247-250 (1999), incorporada en el presente documento como referencia en su totalidad. La alineación de secuencias BLAST 2 se realiza en blastp o blastn usando el algoritmo BLAST 2.0 para realizar una búsqueda de BLAST con huecos (BLAST 2.0) entre las dos secuencias permitiendo la introducción de huecos (supresiones e inserciones) en la alineación resultante. En algunas realizaciones, se realiza una alineación de secuencia BLAST 2 usando los siguientes parámetros por defecto convencionales.
Para blastn, usando la matriz 0 BLOSUM62:
Recompensa por coincidencia = 1
Penalización por falta de coincidencia = -2
Penalizaciones por abertura de hueco (5) y extensión de hueco (2) disminución por hueco x (50) expectativa (10) tamaño de palabra (11) filtro (activo).
Para blastp, usando la matriz 0 BLOSUM62:
Penalizaciones por abertura de hueco (11) y extensión de hueco (1)
disminución por hueco x (50) expectativa(10) tamaño de palabra (3) filtro (activo).
Como se usa en el presente documento, las condiciones de hibridación se refieren a condiciones de hibridación convencionales en las que se usan moléculas de ácido nucleico para identificar moléculas de ácido nucleico similares. Véase, por ejemplo, Sambrook J. y Russell D. (2001) Molecular cloning: A laboratory manual, 3a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, incorporada por referencia en su totalidad en el presente documento. Además, se desvelan fórmulas para calcular las condiciones de hibridación y lavado apropiadas para lograr la hibridación que permite diversos grados de falta de coincidencia de nucleótidos, por ejemplo, en Meinkoth et al., Anal. Biochem. 138, 267-284 (1984), incorporada por referencia en su totalidad en el presente documento.
Más particularmente, las condiciones de hibridación y lavado de moderada rigurosidad, como se menciona en el presente documento, se refieren a condiciones que permiten el aislamiento de moléculas de ácido nucleico que tienen al menos aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia de ácido nucleico con la molécula de ácido nucleico que se usa para sondear en la reacción de hibridación (es decir, condiciones que permiten aproximadamente un 30 % o menos de falta de coincidencia de nucleótidos). Las condiciones de hibridación y lavado de alta rigurosidad, como se menciona en el presente documento, se refieren a condiciones que permiten el aislamiento de moléculas de ácido nucleico que tienen al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia de ácido nucleico con la molécula de ácido nucleico que se usa para sondear en la reacción de hibridación (es decir, condiciones que permiten aproximadamente un 20 % o menos de falta de coincidencia de nucleótidos). Las condiciones de hibridación y lavado de muy alta rigurosidad, como se menciona en el presente documento, se refieren a condiciones que permiten el aislamiento de moléculas de ácido nucleico que tienen al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia de ácido nucleico con la molécula de ácido nucleico que se usa para sondear en la reacción de hibridación (es decir, condiciones que permiten aproximadamente un 10 % o menos de falta de coincidencia de nucleótidos). Como se ha analizado anteriormente, un experto en la materia puede usar las fórmulas en Meinkoth et al., por ejemplo, para calcular las condiciones de hibridación y lavado apropiadas para lograr estos niveles particulares de falta de coincidencia de nucleótidos. Dichas condiciones variarán, dependiendo de si se están formando híbridos de ADN:ARN o ADN:ADN. Las temperaturas de fusión calculadas para los híbridos de ADN:ADN son 10 °C menos que para los híbridos de ADN:ARN. En realizaciones particulares, las condiciones de hibridación rigurosas para híbridos de ADN:ADN incluyen hibridación a una fuerza iónica de 6X SSC (Na+ 0,9 M) a una temperatura de entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 35 °C (rigurosidad inferior), entre aproximadamente 28 °C y aproximadamente 40 °C (más rigurosidad), y entre aproximadamente 35 °C y aproximadamente 45 °C (incluso más rigurosidad), con condiciones de lavado apropiadas. En realizaciones particulares, las condiciones de hibridación rigurosas para híbridos de ADN:ARN incluyen hibridación a una fuerza iónica de 6X SSC (Na+ 0,9 M) a una temperatura de entre aproximadamente 30 °C y aproximadamente 45 °C, entre aproximadamente el 38 °C y aproximadamente el 50 °C, y entre aproximadamente el 45 °C y aproximadamente 55 °C, con condiciones de lavado igualmente rigurosas. Estos valores se basan en cálculos de una temperatura de fusión para moléculas mayores de aproximadamente 100 nucleótidos, 0 % de formamida y un contenido de G C de aproximadamente un 40 %. Alternativamente, la Tf puede calcularse empíricamente como se establece en Sambrook et al. En general, las condiciones de lavado deben ser lo más estrictas posible y deben ser apropiadas para las condiciones de hibridación elegidas. Por ejemplo, las condiciones de hibridación pueden incluir una combinación de condiciones de sal y temperatura que son aproximadamente 20-25 °C por debajo de la Tf calculada de un híbrido particular, y las condiciones de lavado normalmente incluyen una combinación de condiciones de sal y temperatura que son aproximadamente 12-20 °C por debajo de la Tf calculada del híbrido particular. Un ejemplo de condiciones de hibridación adecuadas para su uso con híbridos de ADN:ADN incluyen una hibridación de 2-24 horas en 6X SSC (formamida al 50 %) a aproximadamente 42 °C, seguido de etapas de lavado que incluyen uno o más lavados a temperatura ambiente en aproximadamente 2X SSC, seguido de lavados adicionales a temperaturas más altas y menor fuerza iónica (por ejemplo, al menos un lavado a aproximadamente 37 °C en aproximadamente 0,1X - 0,5X SSC, seguido de al menos un lavado a aproximadamente 68 °C en aproximadamente 0,1X - 0,5X SSC).
Habiendo descrito generalmente esta invención, se puede obtener una comprensión adicional por referencia a los ejemplos proporcionados en el presente documento. Estos ejemplos son solo para fines ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
Ejemplo 1
Construcción del vector de expresión pSchizE de proteína de Schizochytrium
a. Construcción de p07074 n.° 6:
El vector pSP73 (Promega, acc n.° X65333) se digirió con Xbal y nucleasa de frijol mungo, y luego se purificó y ligó para crear el vector p070604 n.° 3. p070604 n.° 3 se digirió luego más con Sphl, Hpal y nucleasa de frijol mungo y luego se purificó y volvió a ligar para crear el vector p070704 n.° 6.
b. Construcción de pSchizI:
El vector pTUBzeo11-2, como se desvela en el documento WO02/083869, se digirió con BamHI para liberar un fragmento de 1122 pares de bases (pb) que contiene el promotor de a-tubulina de Schizochytrium, el gen ble y una región de terminación SV40. Este fragmento se purificó en gel y se ligó en el vector pYES2/CT (Invitrogen), que se había digerido previamente con BamHI. La construcción resultante se digirió luego con Smal, Sphl y nucleasa de frijol mungo para liberar un fragmento de 540 pb que contiene el promotor de a-tubulina. El fragmento se ligó en pUC19 (número de acceso de Genbank L09137) que se había digerido previamente con BamHI, Smal y ligasa de frijol mungo, creando pSchiz1.
c. Construcción de pSchiz2:
En una reacción distinta, se usó PCR para generar un amplicón que codifica el terminador SV40 de pTUBzeoll-2 usando los siguientes cebadores, que incorporan sitios de restricción Ncol y Pci I (mostrados en cursiva) para la unión:
Cebador S4termF: 5'-GATCCC^TGGCACGTGCTACG (SEQ ID NO: 16)
Cebador S4termR: 5'-GGCAACATGTATGATAAGATAC (SEQ ID NO: 17)
El amplicón resultante se digirió con NcoI y Pci I para exponer los extremos adhesivos. Este fragmento de 265 pb se ligó luego a pSchiz1, que se había digerido previamente con NcoI. El plásmido resultante, denominado pSchiz2, contenía el promotor de a-tubulina seguido por el terminador SV40.
d. Construcción de pSchiz3:
En una reacción distinta, se usó PCR para amplificar el sitio de clonación múltiple (MCS, de sus siglas en inglés) de pYES2/CT usando los siguientes cebadores diseñados para añadir un sitio Smal (mostrado en cursiva) a cada extremo:
Cebador C2mcsSmaF: 5'-GATCCCCGGGTTAAGCTTGGT (SEQ ID NO: 18)
Cebador C2mcsSmaR: 5'-ACTGGGGCCCGTTTAAACTC (SEQ ID NO: 19)
El amplicón MCS resultante se digirió luego con SmaI y se ligó en pSchiz2, que se había digerido previamente con Ncol y nucleasa de frijol mungo. El vector resultante, denominado pSchiz3, contenía el promotor de alfa tubulina, el terminador SV40 y el MCS pYES2/CT.
e. Construcción de pSchiz0,5 n.° 4
Se usó PCR con los siguientes cebadores y pSchiz3 como plantilla para generar un amplicón que codifica el casete MCS que consiste en el promotor a-tubulina, el MCS pYES2/CT y la región de terminación SV40.
Cebador 5'tubMCS_BglII: 5-GACTAGATCTCAATTTTAGGCCCCCCACTGACCG (SEQ ID NO: 20) Cebador 3'SV40MCS_Sal: 5'-GACTGTCGACCATGTATGATAAGATACATTGATG (SEQ ID NO: 21)
Estos cebadores fueron diseñados para añadir sitios de restricción BglII y SalI (mostrados en cursiva) a los extremos del amplicón de casete MCS. El fragmento de PCR resultante se digirió con BglII y SalI y se ligó en p070704 n.° 6, que también se había digerido previamente con BglII y SalI, para generar pSchiz0,5 n.° 4.
f. Construcción de pSchizE
Se usó PCR para generar un amplicón de 4776 pb que codifica el gen ALS (incluyendo sus regiones promotoras y de terminación) usando el vector pMON50203, como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 7.001.772, como plantilla. Los siguientes cebadores, que contienen sitios de restricción NdeI y BglII (mostrados en cursiva), se usaron para esta reacción de PCR:
Cebador 5'ALSproNde3: 5'-GACTCATATGGCCCAGGCCTACTTTCAC (SEQ ID NO: 22)
Cebador 3'ALStermBglII: 5'GACTAGATCTGGGTCAAGGCAGAAGAATTCCGCC (SEQ ID NO: 23)
El amplicón de ALS resultante se digirió luego con BglII y NdeI. pSchiz0,5 n.° 4 también se digirió con BglII y NdeI, y la banda más grande de 3171 pb se purificó en gel y se ligó al amplicón de PCR ALS purificado. El vector resultante, denominado pSchizE, se verificó mediante secuenciación y contenía el gen ALS (incluido la región promotora y de terminación) seguido de un casete de expresión que contenía el promotor de la a-tubulina de Schizochytrium, el MCS pYES2/CT y la región de terminación SV40 (véase la Figura 5).
Ejemplo 2
Construcción del vector de expresión pSchiz-sG de proteína de Schizochytrium
La expresión y secreción de eGFP se logró usando pSchiz-sG (véase la Figura 6). Este plásmido también se denomina pCO0001 y se depositó en la American Type Culture Collection, Patent Depository, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, el 18 de noviembre de 2008, y se le otorgó el número de acceso de ATCC PTA-9617. Este vector contiene (i) la secuencia promotora de a-tubulina de Schizochytrium seguida de (ii) una secuencia que codifica la secuencia señal del transportador Na/Pi de Schizochytrium con un fragmento de la porción N-terminal de la proteína transportadora madura unida (SEQ ID NO: 15), fusionados con la secuencia que codifica eGFP seguida de (iii) el resto del MCS y (iv) la región de terminación SV40. Este vector también contiene el gen ALS de Schizochytrium como marcador seleccionable. El vector se construyó como se describe a continuación.
La secuencia elegida para codificar el péptido señal (SEQ ID NO: 2) era de un transportador Na/Pi aislado de una biblioteca EST de Schizochytrium. Las secuencias de nucleótidos que codifican el péptido señal y la eGFP se fusionaron mediante PCR usando el plásmido pPha-T1-eGFP que contiene eGFP (Apt et al., J. Cell Sci. 115:4061-4069 (2002)), y 3 cebadores diseñados para añadir la secuencia señal. La primera reacción de PCR empleó el plásmido que contiene eGfp como plantilla, un pequeño cebador en el extremo 3' de eGfp (cebador sec.Gfp3'Spe, que contenía un sitio SpeI, que se muestra en cursiva a continuación), y un cebador de 100 pb que flanqueaba el extremo 5' de eGfp y el extremo 3' de la secuencia de señal (cebador sec.Gfp5'1b, sec). Las secuencias de los cebadores fueron las siguientes:
Cebador sec.Gfp5'1b: 5-TACTGGTTCCTTGTCGGCCTCGCCCTTCTCGGCGAT GGCTTCAAGGTCATCGCCGGTGACTCCGCCGGTACGCTCTTCATGGTGAGC AAGGGCGAGG (SEQ ID NO: 24)
Cebador sec.Gfp3'Spe: 5’-CGTCACTAGTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC (SEQ ID NO: 25)
En la segunda reacción de PCR, el producto amplicón de la primera PCR se utilizó como plantilla. Se utilizó el mismo cebador en 3' junto con un segundo cebador en 5' de 100 pb (sec.Gfp5'Bam) que incorporaba el resto de la secuencia señal. La segunda secuencia de cebador en 5' contenía un sitio BamHI (que se muestra en cursiva a continuación) y fue la siguiente:
Cebador sec.Gfp5'Bam: 5'-TAATGGATCCATGGCCAACATCATGGCC AACGTCACGCCCCAGGGCGTCGCCAAGGGCTTTGGCCTCTTTGTCGGCGT GCTCTTCTTTCTCTACTGGTTCCTTGT (SEQ ID NO: 26)
El producto de PCR resultante de esta segunda reacción de PCR contenía los sitios BamHI y SpeI para la clonación. El amplicón de la segunda reacción de PCR y pSchizE se digirieron con BamHI y SpeI y se ligaron entre sí para crear el vector pSchiz-sG.
Ejemplo 3
Construcción del vector de expresión pSchiz-sGr de proteína de Schizochytrium
El vector pSchiz-sGr comprende un promotor de a-tubulina, una secuencia de nucleótidos eGFP con una secuencia que codifica una señal de retención de RE, una región de terminación SV40 y un marcador seleccionable de ALS mutado.
La secuencia de aminoácidos de la señal de retención de RE común HDEL se tradujo de nuevo y la secuencia que codifica esta señal de retención (SEQ ID NO: 14) se fusionó a eGFP mediante PCR usando pSchiz-sG del Ejemplo 2 como plantilla. Los cebadores oligonucleotídicos se diseñaron para incluir la secuencia que codifica HDEL (complemento inverso subrayado en la secuencia del cebador ss.eGfpHELD3'RV a continuación) en marco con un codón de parada (se muestra en el recuadro), más un sitio BamHI (mostrado en cursiva) en un cebador y un sitio EcoRV (en cursiva) en el otro cebador.
Cebador ss.eGfpHELD3'RV:
Cebador sec.Gfp5'Bam2: 5'-TAATGGATCCATGGCCAACATCATGGCCAACGTCACGCCCCAGGGCGTCGCCAAGGGCTTTGGCCTCTTTG TCGGC GTGCTCTTCTTTCTCTACTGGTTCCTTGT (SEQ ID NO: 28)
El producto de PCR resultante se digirió con BamHI y EcoRV y se ligó al fragmento más grande que resultó de digerir pSchizE (descrito en el Ejemplo 1) con BamHI y EcoRV. El vector resultante se denominó pSchiz-sGr (véase la Figura 7).
Ejemplo 4
Construcción del vector de expresión pSchiz-cG de proteína de Schizochytrium
Como control comparativo, el vector pSchiz-cG se construyó para expresar eGFP de tal manera que la proteína fluorescente se acumularía en el citoplasma celular. El plásmido pSchiz-cG comprende un promotor OrfC de Schizochytrium, una secuencia polinucleotídica que codifica eGFP, una región de terminación de SV40 y un marcador seleccionable de ALS de Schizochytrium mutado.
Primero, una secuencia de 2000 pb cadena arriba de ORFC de Schizochytrium se amplificó mediante PCR con los siguientes cebadores del ADN genómico de Schizochytrium sp. ATCC 20888:
Cebador prREZ15: 5'-CGGTACCCGCGAATCAAGAAGGTAGGC (SEQ ID NO: 29)
Cebador prREZ16: 5'-CGGATCCCGTCTCTGCCGCTTTTTCTT (SEQ ID NO: 30)
Los cebadores prREZ15 y prREZ16 contenían la secuencia KpnI y BamHI, respectivamente (en cursiva). El amplicón resultante se digirió con BamHI y KpnI y se purificó en gel.
A continuación, una secuencia de 1985 pb cadena abajo de ORFC de Schizochytrium se amplificó mediante PCR con los siguientes cebadores del ADN genómico de Schizochytrium sp. ATCC 20888:
Cebador prREZ17: 5'-CGGATCCGAAAGTGAACCTTGTCCTAACCC (SEQ ID NO: 31)
Cebador prREZ18: 5-CTCTAGACAGATCCGCACCATCGGCCG (SEQ ID NO: 32)
Los cebadores prREZ17 y prREZ18 contenían la secuencia BamHI y la secuencia Xbal, respectivamente (en cursiva). El amplicón resultante se digirió con BamHI y XbaI y se purificó en gel.
El vector pBluescript SK(+) (Stratagene, acc n.° X52328) se digirió a continuación con Kpnl y XbaI y se purificó en gel. Este vector y los dos amplicones generados anteriormente se ligaron todos simultáneamente para producir el vector pREZ22.
El vector pSchizE (Ejemplo 1) se digirió luego con BamHI y se trató con nucleasa de frijol mungo, se purificó en columna, se digirió con XbaI y luego se purificó en gel. Luego se realizó la PCR con los siguientes cebadores para generar un amplicón que contiene la región que codifica eGFP (usando la plantilla pPha-T1-eGFP):
Cebador 5'eGFP_kpn: 5-GACTGGTACCATGGTGAAGCAAGGGCGA (SEQ ID NO: 33)
Cebador 3'eGFP_xba; 5'-GACTTCTAGATTACTTGTACAGCTCGT (SEQ ID NO: 34)
Este amplicón se digirió luego con XbaI y se ligó al fragmento de pSchizE descrito anteriormente para crear el vector pSchizE-eGFP.
Luego se usó PCR con pREZ22 como plantilla para generar un amplicón que codifica el promotor de ORFC. Los siguientes cebadores, cada uno con una secuencia de restricción KpnI (mostrada en cursiva), se usaron para esta PCR:
Cebador 5'ORFCproKpn-2: 5'-GATCGGTACCGGTGTTCTTTGTTTTGAT (SEQ ID NO: 35)
Cebador 3'ORFCproKpn-2: 5'-GATCGGTACCGTCTCTGCCGCTTTTTCTTTA (SEQ ID NO: 36)
Este amplicón se digirió luego con KpnI. El vector pSchizE-eGFP también fue digerido con KpnI, generando dos fragmentos. El fragmento más grande (7554 pb) se purificó en gel y se ligó al amplicón digerido con KpnI anterior para producir el vector pSchiz-cG, que contenía la secuencia promotora ORFC de Schizochytrium seguida de la secuencia eGFP y una región de terminación SV40 (véase la Figura 8).
Ejemplo 5
Transformación de Schizochytrium y posterior expresión de proteínas
A menos que se indique otra cosa, todos los vectores y construcciones se propagaron en células UltraMax DH5-a FT de E. coli químicamente competentes (Invitrogen, Carlsbad, CA) para la purificación de plásmidos usando kits Qiagen apropiados para una escala de cultivo dada (Valencia, CA).
Se cultivaron cultivos de Schizochytrium sp. número ATCC 20888 en medio M2B que consta de glucosa 10 g/l, (NH4)2SO40,8 g/l, Na2SO45 g/l, MgSO4 -7H2O 2 g/l, KH2PO40,5 g/l, KCl 0,5 g/l, CaCh2H2O 0,1 g/l, MES 0,1 M (pH 6,0), metales PB26 al 0,1 % y vitaminas PB26 al 0,1 % (v/v). Las vitaminas PB26 consistieron en vitamina B12 50 mg/ml, tiamina 100 pg/ml y pantotenato de calcio 100 pg/ml. Los metales PB26 se ajustaron a pH 4,5 y consistieron en FeSO4 -7H2O 3 g/l, MnCh4H2O 1 g/l, ZnSO47H2O 800 mg/ml, CoCh6H2O 20 mg/ml, Na2MoO42H2O 10 mg/ml, CuSO4 -5H2O 600 mg/ml, y MSO4 6H2O 800 mg/ml. Las soluciones madre de PB26 se esterilizaron por filtración por separado y se añadieron al caldo después de la esterilización en autoclave. La glucosa, KH2PO4 y CaCh-2H2O se esterilizaron en autoclave por separado del resto de los ingredientes del caldo antes de mezclar para evitar la precipitación de sal y la caramelización de carbohidratos. Todos los ingredientes del medios se compraron de Sigma Chemical (St. Louis, MO). Se cultivaron cultivos de Schizochytrium hasta la fase logarítmica y se transformaron con un bombardero de partículas Biolistic™ (BioRad, Hercules, CA) usando los vectores pSchiz-E1 (Ejemplo 1), pSchizsG (Ejemplo 2), pSchiz-sGr (Ejemplo 3), o pSchiz-cG (Ejemplo 4). El procedimiento de transformación Biolistic™ fue esencialmente el mismo que se describió anteriormente (véase Apt et al., J. Cell. Sci. 115 (Pt 21):4061-9 (1996) y la Patente de Estados Unidos N.° 7.001.772). Los transformantes primarios se seleccionaron en medios sólidos M2B que contenían agar 20 g/l (VWR, West Chester, PA), sulfometuron metil 10 pg/ml (SMM) (Chem Service, Westchester, PA) después de 2-6 días de incubación a 27 °C. Todos los transformantes primarios se transfirieron manualmente a placas de M2B nuevas con SMM.
Las colonias transformantes primarias se analizaron mediante fluorescencia y microscopía óptica. Las colonias transformantes primarias también se usaron para inocular 50 ml de medio líquido M2B-SMM. Después de la incubación a 27 °C durante 2-5 días, los cultivos se cosecharon mediante centrifugación a 5500 x g durante 15 minutos. Los sobrenadantes libres de células se concentraron 100 veces usando concentradores de gravedad Centriprep™ (Millipore, Billerica, MA) y los sedimentos celulares se lavaron en agua y se congelaron en nitrógeno líquido antes de resuspender en dos veces el peso del sedimento de tampón de lisis (que consiste en fosfato sodio 50 mM (pH 7,4), EDTA 1 mM, glicerol al 5 % y fluoruro de fenilmetilsulfonil fresco 1 mM) y dos veces el peso del sedimento de perlas de vidrio de 0,5 mm (Sigma, St. Louis, MO). Las mezclas de sedimentos celulares se lisaron luego mediante vórtice a 4 °C en un vórtice multitubo (VWR, Westchester, PA) a velocidad máxima durante 3 horas (h). Los lisados celulares se centrifugaron luego a 5500 x g durante 10 minutos a 4 °C. Los sobrenadantes se retuvieron y se volvieron a centrifugar a 5500 x g durante 10 minutos a 4 °C. El sobrenadante resultante se define en el presente documento como "extracto libre de células". Las proteínas de los sobrenadantes libres de células y los extractos libres de células se cuantificaron con un kit de ensayo Bradford (Sigma, St. Louis, MO) y, antes de cargarlas en geles de poliacrilamida Bis-Tris al 4-12 % (Bio-Rad, Hercules, CA), se hirvieron como una mezcla con tampón de muestra XT de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Bio-Rad, Hercules, CA).
Los geles SDS-PAGE se tiñeron con colorante Coomassie o se transfirieron a PVDF mediante transferencia Western. Después de la transferencia, las membranas de PVDF se enjuagaron con solución salina tamponada con Tris (TBS) (Sigma, St. Louis, MO) y se trataron con leche en polvo sin grasa (NFDM, de sus siglas en inglés) al 5 % en TBS a temperatura ambiente durante 2 horas. Los anticuerpos primarios específicos para la proteína de interés se diluyeron en NFDM-TBS al 5 % de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En caso necesario, esta solución se eliminó y se reemplazó con NFDM-TBS nuevo al 5 % a la que se añadió un anticuerpo secundario, conjugado con fosfatasa alcalina y específico del primero. Si no se usa un anticuerpo secundario, el primario se habría conjugado con fosfatasa alcalina. El PVDF tratado con anticuerpo se enjuagó luego con TBS y se trató con solución de 5-bromo-4-cloro-3-indoil-fosfato/nitroblue tetrazolio (BCIP/NBT) (KPL, Gaithersburg, MD).
Tal como se muestra en la Figura 9, El Schizochytrium transformado con pSchizGr exhibió localización de eGFP en el RE (véase también la Figura 10), mientras que el Schizochytrium transformado con pSchizcG mostró eGFP en todo el citoplasma. El Schizochytrium transformado con pSchizE (control de vector vacío) no mostró expresión de eGFP. Tal como se muestra en la Figura 11, se detectó eGFP en las muestras de sobrenadante libres de células (es decir, extracelularmente) así como en el extracto libre de células para Schizochytrium transformado con pSchiz-sG. El Schizochytrium transformado con pSchiz-sGr contenía eGFP en el extracto libre de células y, en un menor grado, en el sobrenadante libre de células. Finalmente, el Schizochytrium transformado con pSchizcG contenía eGFP casi exclusivamente en el extracto libre de células.
Ejemplo 6
Identificación del péptido señal Sec1
La secuencia del genoma de Schizochytrium se generó, ensambló y formateó previamente para la búsqueda BLAST utilizando técnicas convencionales de la industria. El sobrenadante de un cultivo de Schizochytrium, cultivado en condiciones repletas de N, se concentró y se ejecutó en SDS-PAGE. Las principales bandas de proteínas secretadas se extirparon del gel y se usaron para la secuenciación de aminoácidos. Mediante la comparación BLAST de las secuencias de aminoácidos obtenidas con el genoma de Schizochytrium (algoritmo - tBLASTn, filtrado de baja complejidad - desactivado, Expectativa - 1000, matriz - PAM30, alineación sin huecos - activada), se identificó el ORF correspondiente. La parte 5' del ORF se analizó utilizando el algoritmo SignalP. Véase, por ejemplo, Bendsten et al., J., Mol. Biol. 340: 783-795 (2004); Nielsen y Krogh, Proc. Int. Conf. Intell. Syst. Mol. Biol.
6:122-130 (1998); Nielsen et al., Protein Engineering 12:3-9 (1999); Emanuelsson et al., Nature Protocols 2:953-971 (2007). La región 5' de la proteína Sec1 se identificó como una señal de secreción de acuerdo con este análisis. Véase la Figura 12 (que comprende la SEQ ID NO; 37) y la Figura 13 (SEQ ID NO: 38).
Ejemplo 7
Construcción del vector pSchiz-Cpt de Schizochytrium
El vector pSchiz-Cpt contiene el promotor y terminador OrfC y el marcador seleccionable ALS. En resumen, este vector se construyó mediante la digestión primero del plásmido pSchizE con KpnI/XbaI y la purificación en gel del fragmento de 6,89 kb resultante. Esta digestión también dio como resultado la eliminación del promotor de tubulina y la mayoría del polienlazador del plásmido pSchizE; la secuencia de codificación de ALS permaneció intacta. En la cadena principal de SchizE de 6,8 kb resultante se ligó un fragmento KpnI/XbaI de 4 kb que contenía una secuencia de 2 kb cadena arriba de OrfC de Schizochytrium de más 2 kb de secuencia cadena abajo de OrfC de Schizochytrium con un sitio BamH I que separaba los segmentos cadena arriba y cadena abajo. El fragmento KpnI/XbaI de 4 kb se cortó del plásmido pREZ22 (véase el Ejemplo 4). La ligadura de la cadena principal de pSchizE de 6,8 kb y el fragmento KpnI/XbaI de 4 kb dio como resultado pSchiz-Cpt.
Ejemplo 8
Construcción del vector de expresión pSchizCpt-s1eGFP de proteína de Schizochytrium
El plásmido pSchizCpt-sleGFP comprende un promotor OrfC de Schizochytrium, una secuencia señal Sec1 que precede a una secuencia que codifica eGFP, y un terminador OrfC y una secuencia marcadora seleccionable ALS de Schizochytrium mutada. Véase la Figura 14. Este plásmido también se denomina pCL0001 y se depositó en la American Type Culture Collection, Patent Depository, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, el 18 de noviembre de 2008 y se le otorgó el número de acceso de ATCC PTA-9615.
Ejemplo 9
Expresión y secreción de eGFP por Schizochytrium en fermentadores
Las células de Schizochytrium se transformaron con pSchizCpt-sleGFP (véase el Ejemplo 8) como se describe en el Ejemplo 5. Las líneas celulares resistentes a SMM se aislaron en placas de agar de M2B y se transfirieron a cultivo líquido M2B (que contiene SMM 10 pg/ml) en matraces de agitación y se incubaron a 27,5 °C con agitación a 150 rpm. Después del cultivo durante 72-168 h, los cultivos se cosecharon mediante centrifugación (5000 x g durante 10 min) y el sobrenadante libre de células se concentró (aproximadamente 250 veces) usando concentradores Centriprep y Microcon (MWCO 10000). Las muestras (1-7 pl) se procesaron en SDS-PAGE y las proteínas separadas se transfirieron a la membrana PVDF. Las membranas bloqueadas y lavadas se sondaron con anticuerpo de conejo anti-IgG de eGFP (Biovision) y se visualizaron las bandas de proteínas de reacción mediante la sonda con un anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo conjugado con fosfatasa alcalina (fc) (Promega) y el tratamiento con reactivo BCIP/NBT. Se seleccionaron las líneas celulares que expresan la mayor cantidad de eGFP.
Una de las líneas celulares de alta producción se cultivó en fermentadores de 2,0 l (volumen de trabajo). Los matraces de inóculo desconcertados contenían 150 ml de medio HD1 y se incubaron a 29,5 °C durante 24-48 h con agitación a 200 rpm. El cultivo de inóculo se usó para inocular el fermentador que contiene: glucosa 50 g/l, Na2SO4 13,62 g/l, K2SO4 0,72 g/l, KCI 0,56 g/l, MgSO4.7H2O 2,27 g/l, KH2PO4 1,8 g/l, (NH4)2SO4 17,5 g/l, CaCb.2H2O 0,19 g/l, 51,5 mg FeSO4.7 H2O, MnCb.4 H2O 3,1 g/l, ZnSO4.7 H2O 6,2 g/l, 0,04 mg COCb.6 H2O, 0,04 mg Na2MoO4, CuSO4.5H2O 2,07 g/l, NiSO4.6H2O 2,07 g/l, 9,75 mg de tiamina, 0,16 mg de vitamina B12 y 3,33 mg de pantotenato de calcio. Durante el cultivo, la temperatura fue de 29,5 °C, el % dO2 se controló al 20 %, la concentración de glucosa se mantuvo entre 15-20 g/l una vez que el nivel inicial cayó dentro de este intervalo y el pH se mantuvo a 6,5. Las muestras se eliminaron de manera aséptica a intervalos para su análisis.
Las muestras no concentradas de sobrenadantes libres de células (que contienen 0,5-5,0 pg de proteína total) se separaron mediante SDS-PAGE y las proteínas se transfirieron a la membrana PVDF. Las membranas bloqueadas y lavadas se sondaron para eGFP secretada como se describió anteriormente. Véase la Figura 15.
Ejemplo 10
Construcción del vector de expresión pSchizCpt-s1kappabh de proteína de Schizochytrium
El plásmido pSchizCpt-s1kappabh comprende un promotor OrfC de Schizochytrium, una secuencia señal Sec1 que precede a una secuencia polinucleotídica que codifica una subunidad kappa de IgG, y una región de terminación OrfC y una secuencia marcadora seleccionable ALS de Schizochytrium mutada (Véase la Figura 16). El vector de expresión se realizó de la siguiente manera:
El gen resintetizado (optimizado por codones) que codifica la cadena kappa de una IgG, producido a partir de la secuencia de aminoácidos correspondiente mediante Blue Heron Biotechnologies usando la tabla de uso de codones de la Figura 42, con una secuencia señal de secreción Sec1 en 5' se clonó en el plásmido pSchiz-Cpt entre el promotor orfC y el terminador orfC. En resumen, el vector pSchiz-Cpt se digirió con BamHI y fosfatasa alcalina de acuerdo con las instrucciones del fabricante de la enzima (New England Biolabs). Esto fue ligado a un amplicón digerido con BgllI (NEB) y que fue creado usando los siguientes cebadores:
Cebador 5'ss-X Bgl largo: GACTagatctATGAAGTTCGCGACCTCG (SEQ ID NO: 39)
Cebador 3'ritx_kap_bh_Bgl: gactagatctTCAGCACTCACCGCGGTTAAAGG (SEQ ID NO: 40)
y una plantilla proporcionada por Blue Heron Biotechnologies que albergaba una molécula de ADN sintética optimizada que contenía la secuencia polinucleotídica para el péptido señal Sec1 seguido de la secuencia polinucleotídica kappa (SEQ ID NO: 41). Las colonias transformantes bacterianas resultantes se seleccionaron para insertos de vectores, alineados apropiadamente para la expresión. Se recogió un clon (denominado pSchizCPT-s1kappabh) para su posterior análisis, confirmación de secuencia y para la transformación de Schizochytrium.
Ejemplo 11
Expresión y secreción de la subunidad kappa de anticuerpos por Schizochytrium
Generación de líneas celulares transformantes
Schizochytrium sp. ATCC 20888 se cultivó en matraces de agitación de 250 ml que contenían 50 ml de medio M2B a 27 °C durante 24 h. La absorbancia se midió a 600 nm y un volumen equivalente a 1 ml de un cultivo con un valor de absorbancia de 1 se centrifugó a 8.000 x g durante 5 min. El sedimento celular se suspendió en 100 pl de M2B y se extendió sobre una placa de agar M2B en un círculo de 2 cm de diámetro.
El área de la placa que contiene las células de Schizochytrium diseminadas se bombardeó con perlas M10 recubiertas con pSchizCptSIkappa (linealizadas con XbaI) a una presión de 1100 Psi.
Después del bombardeo, la placa M2B se incubó durante 16 h a 27 °C y las colonias que crecían en el centro de la placa de propagación de Schizochytrium se recogieron y extendieron en placas M2B que contenían SMM 10 pg/ml. Después de 24 a 72 h, se recogieron veinte colonias y se inocularon en 5 ml de M2B que contenía SMM 10 mg/ml en un tubo de cultivo de 25 ml. Los tubos de cultivo se incubaron a 27 °C a 135 rpm durante 72 h.
Detección de expresión de kappa
Se seleccionaron diez de los cultivos de matraces de agitación más turbios de arriba para análisis de expresión. Se inocularon 50 ml de M2B que contenía SMM 10 pg/ml en matraces de 250 ml con 0,5 ml de un cultivo en tubo. Los de cultivo se incubaron a 27 °C con agitación a 135 rpm durante 24 h, después de lo cual el sedimento celular y el sobrenadante libre de células se separaron mediante centrifugación a 5500 x g durante 10 min.
El sedimento celular se suspendió en 40 ml de dH2O, se centrifugó a 5500 x g durante 10 minutos y luego se suspendió en dos veces su peso húmedo de tampón de extracción. Se añadió dos veces el peso húmedo de las perlas de vidrio y los tubos se agitaron durante 3 horas a 4 °C. El homogeneizado celular resultante se centrifugó a 5000 x g durante 10 minutos y el sobrenadante se retuvo como el extracto libre de células.
El sobrenadante libre de células se concentró de aproximadamente 50 ml a > 200 pl usando concentradores Centriprep y Microcon (Amicon) con un valor de corte de 10000 MW.
Se ejecutaron 3 pg de proteína (extracto libre de células y sobrenadante concentrado libre de células) para cada transformante seleccionado en Bis Tris SDS PAGE al 4-12 % (criterio xt, BioRad) con MOPS ejecutando tampón a 200 V durante aproximadamente 45 minutos (hasta que el frente del tinte acababa de salir del fondo del gel). Las bandas de proteínas se transfirieron a la membrana de PVDF usando tampón de transferencia Nupage a 70 V durante 90 min. Las membranas se bloquearon con leche en polvo al 5 % (p/v), en TBS que contenía Tween 20 al 0,1 % y la subunidad kappa de anticuerpo se localizó a través de una transferencia Western usando anticuerpo antikappa de IgG humana conjugada con fosfatasa alcalina (Sigma). Las bandas positivas se visualizaron con BCIP/NBT Phosphatase Substrate (KPL).
La subunidad kappa de anticuerpo fue claramente detectable predominantemente en los sobrenadantes libres de células de cultivos en matraces de agitación cultivados como se describe anteriormente (véase la Figura 17). La aparición de la proteína kappa en el sobrenadante libre de células y con un MW indistinguible del estándar kappa auténtico fue consistente con la secreción de la subunidad kappa y la modificación postraduccional apropiada (escisión de la señal de secreción Sec1).
Ejemplo 12
Expresión de la subunidad kappa de anticuerpos por Schizochytrium en fermentadores
Cultivo
Los dos clones (1 y 3) que parecían expresar la mayor cantidad de subunidad kappa extracelular se cultivaron en fermentadores de 2,0 l (volumen de trabajo). Los matraces de inóculo desconcertados contenían 150 ml de medio HD1 y se incubaron a 29,5 °C durante 24-48 horas con agitación a 200 rpm. El cultivo de inóculo se usó para inocular el fermentador que contiene: glucosa 50 g/l, Na2SO4 13,62 g/l, K2SO4 0,72 g/l, KCI 0,56 g/l, MgSO4.7H2O 2,27 g/l, KH2PO4 1,8 g/l, (NH4)2SO4 17,5 g/l, CaCl2.2H2O 0,19 g/l, 51,5 mg FeSO4.7H2O, MnCl2.4H2O 3,1 g/l, ZnSO4.7H2O 6,2 g/l, 0,04 mg COCl2.6 H2O, 0,04 mg Na2MoO4 , CuSO4.5H2O 2,07 g/l, NiSO4.6H2O 2,07 g/l, 9,75 mg de tiamina, 0,16 mg de vitamina B12 y 3,33 mg de pantotenato de calcio. Durante el cultivo, la temperatura fue de 29,5 °C, el % dO2 se controló al 20 %, la concentración de glucosa se mantuvo entre 15-20 g/l una vez que el nivel inicial cayó dentro de este intervalo y el pH se mantuvo a 6,5. Las muestras se eliminaron de manera aséptica a intervalos para su análisis.
Detección de expresión de kappa
Los sobrenadantes libres de células se analizaron sin concentración, la proteína total se determinó usando el método de Bradford (Sigma Bradford Reagent) con BSA como estándar de proteína. El análisis Western para confirmar la expresión de la subunidad kappa se realizó como se describe para los cultivos de matraces con agitación anteriores. La cuantificación de la expresión de kappa se llevó a cabo utilizando un kit de cuantificación Elisa Kappa-B+F humano (Bethyl Laboratories Inc.) y un lector de placas Fluoro Omega (BMG Labtech), ambos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Véase la Figura 18.
Ejemplo 13
Construcción del vector de expresión pAB0011
Usando ADNg extraído de Schizochytrium sp. ATCC 20888 como plantilla, se realizaron PCR con los siguientes cebadores para crear un amplicón de 2015 pb de longitud:
5' 60S-807: TCGATTTGCGGATACTTGCTCACA (SEQ ID NO: 47)
3' 60S-2821: GACGACCTCGCCCTTGGACAC (SEQ ID NO: 48)
El amplicón se purificó en gel y se usó como plantilla para la posterior PCR con los siguientes cebadores:
5' 60Sp-1302-Kpn: GACTggtaccTTTTTCCGCTCTGCATAATCCTAA (SEQ ID NO: 49)
3' 60Sp-Bam: GACTggatccTTGGCTTTTTCTTTCTTGTTGC (SEQ ID NO: 50)
El amplicón resultante de 1017 pb se purificó, se digirió con KpnI y BamHI, y se ligó a pSchiz-CPT(+)-s1GFP(6h), que había sido previamente purificado y digerido con KpnI y BamHI. Los productos de ligadura se usaron para transformar E. coli, y los plásmidos se purificaron y se seleccionaron mediante digestión de restricción de las colonias resultantes. Un clon de plásmido (n.° 4,1), con el patrón de digestión de restricción esperado e incluyendo el promotor largo 60S, se verificó mediante secuenciación de Sanger y se denominó pAB0011 para las transformaciones de Schizochytrium. Véase la Figura 24. El vector pAB0011 se depositó en la American Type Culture Collection, Patent Depository, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, el 18 de noviembre de 2008, y se le otorgó el número de acceso de ATCC PTA-9614.
Ejemplo 14
Construcción del vector de expresión pAB0018
Usando ADNg extraído de Schizochytrium sp. ATCC 20888 como plantilla, se realizaron PCR con los siguientes cebadores para crear un amplicón de 2268 pb de longitud:
5' EF1-68: CGCCGTTGACCGCCGCTTGACTCT (SEQ ID NO: 51)
3' EF1-2312: CGGGGGTAGCCTCGGGGATGGACT (SEQ ID NO: 52)
Este amplicón se purificó en gel y se usó como plantilla para la posterior PCR con los siguientes cebadores:
5' EF1-54-Kpn: GACTggtaccTCTTATCTGCCTCGCGCCGTTGAC (SEQ ID NO: 53)
3' EF1-1114-Bam:GACTggatccCTTGCTTGCTAGTAGTCGCTTTCGAAC (SEQ ID NO: 54)
El amplicón resultante de 1060 pb se purificó, se digirió con KpnI y BamHI, y se ligó a pSchiz-CPT(+)-s1GFP(6h), que había sido previamente purificado y digerido con KpnI y BamHI. Los productos de ligadura se usaron para transformar E. coli, y los plásmidos se purificaron y se seleccionaron mediante digestión de restricción de las colonias resultantes. Un clon de plásmido (n.° 6,1), con el patrón de digestión de restricción esperado y que contiene el promotor largo EF-1, se verificó mediante secuenciación de Sanger y se denominó pAB0018 para las transformaciones de Schizochytrium. Véase la Figura 25. El vector pAB0018 se depositó en la American Type Culture Collection, Patent Depository, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, el 18 de noviembre de 2008, y se le otorgó el número de acceso de ATCC PTA-9616.
Ejemplo 15
Construcción del vector de expresión pAB0022
Los sobrenadantes libres de células de cultivos de Schizochytrium se analizaron mediante SDS-PAGE y de esta se seleccionó una única banda de proteína, denominada Sec1p (para la proteína Sec1), para la purificación hasta la homogeneidad. Las secuencias de fragmentos de péptidos de esta proteína se identificaron utilizando técnicas de espectrometría de masas y se correlacionaron con las traducciones conceptuales de una secuencia del genoma completo de Schizochytrium utilizando algoritmos BLAST (tBLASTn, alineación sin huecos, filtrado de baja complejidad DESACTIVADO, Expectativa = 10000, Matriz = PAM30) (ftp://ncbi.nlm.nih.gov/blast). Se identificó un marco de lectura abierto que codifica todas las secuencias peptídicas y se denominó Sec1g (para el gen Sec1). Las posibles secuencias promotoras, cadena arriba del ATG de inicio también se identificaron y sintetizaron (Blue Heron Biotechnologies). Se usó un vector que contenía el promotor sintético Sec1g como plantilla para PCR con los siguientes cebadores:
5' Sec1P-kpn: GACTggtaccCCGTCCTTGACGCCTTCGC (SEQ ID NO: 55)
3' Sec1P-bam: GACTggatccGATGAGTAATGGACGATCTTC (SEQ ID NO: 56)
El amplicón resultante de 1438 pb se purificó, se digirió con Kpnl y BamHI, y se ligó a pSchiz-CPT(+)-s1GFP(6h), que había sido previamente purificado y digerido con KpnI y BamHI. Los productos de ligadura se usaron para transformar E. coli, y los plásmidos se purificaron y se seleccionaron mediante digestión de restricción de las colonias resultantes. Un clon de plásmido (n.° 8,1), con el patrón de digestión de restricción esperado y que contiene el promotor Sec1, se verificó mediante secuenciación de Sanger y se denominó pAB0022 para las transformaciones de Schizochytrium. Véase la Figura 26. El vector pAB0022 se depositó en la American Type Culture Collection, Patent Depository, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, el 18 de noviembre de 2008, y se le otorgó el número de acceso de ATCC PTA-9613.
Ejemplo 16
Transcripción de genes heterólogos
Los promotores de genes que codifican el Factor de alargamiento 1 (EF1, de sus siglas en inglés) y la unidad ribosómica 60S se seleccionaron como promotores para la transcripción de genes heterólogos en Schizochytrium. Se buscó la secuencia del genoma de Schizochytrium y se identificaron genes que mostraban homología con secuencias publicadas para ambos genes. Se clonaron dos versiones (una corta y otra larga) para cada promotor mediante pCr .
El promotor que impulsa la expresión del gen SEC1 también se seleccionó como promotor para la transcripción de genes heterólogos en Schizochytrium. Debido a que el gen SEC1 codifica la única proteína secretada y glucosilada natural identificada hasta ahora en cultivos de Schizochytrium, este promotor podría programar la expresión de proteínas heterólogas en la fase de crecimiento más adecuada para la producción de proteínas glucosiladas secretadas.
El vector cpt(+), que contiene la construcción SleGFP (es decir, el gen eGFP con la señal de secreción SEC1 en el extremo N, expresión dirigida por el promotor OrfC - vector CL0001) se modificó para eliminar el promotor OrfC y reemplazar este elemento con una de las siguientes secuencias:
Promotor EF1 (versión corta) = EF1-S del vector AB0015
Promotor EF1 (versión larga) = EF1-L del vector AB0018
Promotor 60S (versión corta) = 60S-S del vector AB0010
Promotor 60S (versión larga) = 60S-L del vector AB0011
Promotor SEC1 = Sec1 del vector AB0022
Schizochytrium sp. 20888 se transformó con cada uno de los 5 vectores mediante bombardeo de partículas como se describió previamente. Se seleccionaron al azar diez líneas celulares viables para cada transformación para el análisis. La transformación con CL0001 se realizó como control para cada uno de los 5 vectores. Se seleccionaron al azar cinco líneas celulares viables para la transformación con CL0001 para el análisis.
Las líneas celulares transformantes se cultivaron en matraces de agitación de 250 ml que contenían 50 ml de M2B durante 72 h a 29,5 °C con agitación continua a 200 rpm. La biomasa se eliminó mediante centrifugación a 5000 x g durante 10 minutos, y el sobrenadante libre de células se concentró a = 1 ml usando concentradores Centriprep (MWCO 10000). La concentración de proteína de las muestras de sobrenadante libre de células se midió utilizando el método de Bradford.
Alícuotas de sobrenadantes libres de células se separaron en geles de acrilamida SDS (Criterio XT) en condiciones reductoras y las bandas proteicas separadas se transfirieron a la membrana PVDF. Se detectó eGFP usando un anticuerpo anti-eGFP conjugado con AP y se visualizó usando reactivo NCIP/NBT.
La cantidad máxima de sobrenadante concentrado (7 j l) se separó en cada carril para determinar cuál de las líneas celulares expresaba y secretaba eGFP (Tabla 1). Aunque el nivel de expresión de eGFP varió entre promotores y entre líneas celulares para promotores individuales, se demostró que 33 líneas celulares (de las 55 líneas celulares analizadas para los 6 promotores comparados) expresaban eGFP (datos no mostrados).
Tabla 1. Número de líneas celulares de cada transformación que expresa cantidades detectables de eGFP secretada
Figure imgf000031_0001
Si bien no todas las líneas celulares expresaron eGFP secretada, al menos aproximadamente la mitad de las líneas celulares produjeron niveles detectables de eGFP y cada promotor fue capaz de dirigir la expresión de eGFP.
Las líneas celulares que se encontró que expresaban y secretaban eGFP se analizaron adicionalmente para comparar las fuerzas relativas del promotor. Las proteínas del sobrenadante libre de células de cada cultivo determinado para expresar eGFP se cargaron en geles de acrilamida SDS y se normalizaron a 1 |jg por carril. Las proteínas se separaron mediante electroforesis, y las proteínas separadas se transfirieron a la membrana de PVDF y se sondaron para eGFP usando el anticuerpo anti-eGFP conjugado con AP como se describió anteriormente. Véase la Figura 27. Las cantidades de proteína sobrenadante cargadas en la selección inicial para eGFP fueron aproximadamente diez veces mayores que las utilizadas en el experimento que generó la Figura 27. Como tal, la proteína eGFP heteróloga no es evidente en todos los carriles de la Figura 27 ya que estaba por debajo del nivel de detección para algunas muestras en los niveles de proteína cargados para el experimento. Con una carga de 1 jg de proteína/carril, la expresión de eGFP secretada del promotor OrfC estaba por debajo de los límites detectables. Sin embargo, la expresión/secreción de eGFP dirigida por todos los otros promotores se detectó en al menos algunas de las líneas celulares generadas. Esto demostró que todos los promotores seleccionados, EF1, 60S y SEC1, eran promotores "fuertes" en comparación con el promotor OrfC. En particular, la expresión de eGFP secretada en determinadas líneas celulares de los transformantes EF1-L fue visiblemente mayor que para cualquiera de las otras construcciones de promotores, lo que indica que este promotor fue el más fuerte de los promotores probados.
La confirmación de la fuerza del promotor EF1-L se obtuvo mediante la observación de la expresión en las líneas celulares transformantes EF1-L AB0018-9 y AB0018-10 en comparación con un transformante OrfC normal, CL0001-4, bajo microscopía de fluorescencia. Véase la Figura 28. Mientras que la línea celular CL0001-4 exhibió una fluorescencia modesta (paneles Fluo:ISO 200 de 1,1 sec), las líneas celulares AB0018-9 y AB0018-10 exhibieron una fluorescencia pronunciada, lo que indica una acumulación sustancial de eGFP intracelular.
Ejemplo 17
Perfiles de glucosilación en Schizochytrium
Se determinó la N-glucosilación de proteínas de Schizochytrium naturales. Se descubrió que Schizochytrium comparte etapas en común con la ruta de glucosilación de mamíferos e insectos y no se observó que utilizara la ruta de hipermanosilación característica de la levadura. La Figura 29 y la Figura 30 muestran estructuras de glucano detectadas mediante análisis de espectrometría de masas de proteínas secretadas por Schizochytrium. En particular, se observaron máximos característicos para GlcNAc2Man5 a 1580 m/z, GlcNAc2Man6 a 1785 m/z y GlcNAc2Man7 a 1991 m/z.
Ejemplo 18
Transformación de Schizochytrium mediante electroporación
Las células de Schizochytrium sp. ATCC 20888 se cultivaron en medios M50-20 (véase la patente de Estados Unidos N.° 2008/0022422) en un agitador a 200 rpm durante 48 horas a 29 °C. Las células se diluyeron a 1:100 en medios frescos y se cultivaron durante la noche. Las células se centrifugaron y se resuspendieron en manitol 1 M y CaCl210 mM (pH 5,5) hasta una concentración final de 2 unidades de DO600. Se mezclaron 5 ml de células con 0,25 mg/ml de Proteasa XIV (Sigma Chemical) y se incubaron en un agitador durante 4 h. Las células se lavaron dos veces con glicerol helado al 10 % y se resuspendieron en 500 j l de glicerol al 10 % frío. Se dividieron en partes alícuotas de 90 pl en unas electrocubetas preenfriadas de 0,2 cm de hueco (Biorad 165-2086). Se añadieron 10 j l de ADN (1-5 jg ) a la cubeta, se mezclaron suavemente y se mantuvieron en hielo. Las células se electroporaron con un vector recombinante a 200 ohmios (resistencia), 25 jF y un voltaje que varía de 0 V a 500 V (para una distancia de hueco de cubeta de 0,1 cm) o 500 V (para una distancia de hueco de cubeta de 0,2 cm). Se añadieron 0,5 ml de medio inmediatamente a la cubeta. Las células se transfirieron luego a 4,5 ml de medio M50-20 y se incubaron durante 2-3 h a 100 rpm en un agitador. Las células se centrifugaron y se resuspendieron en 0,5 ml de medio y se colocaron en placas sobre 2-5 placas M2B con la selección apropiada (si fuera necesario) y se incubaron a 29 °C. La Tabla 2 muestra el número de transformantes de Schizochytrium sp. ATCC 20888 generados después del tratamiento previo con diferentes combinaciones de enzimas (parámetros de 300 V y distancia de hueco de cubeta de 0,1 cm).
La Tabla 3 muestra el número de transformantes de Schizochytrium sp. ATCC 20888 generados después del tratamiento previo con diferentes combinaciones de enzimas y voltajes (distancia de hueco de cubeta de 0,1 cm). La Tabla 4 muestra el número transformantes de Schizochytrium sp. ATCC 20888 generados utilizando diferentes distancias de hueco de cubetas de electroporación. Las células se trataron previamente con 0,25 mg/ml de proteasa XIV.
La Tabla 5 muestra el número transformantes de Schizochytrium sp. ATCC 20888 generados utilizando diferentes voltajes de electroporación. Las células se trataron previamente con polvo de acetona de caracol 0,1 mg/ml proteasa XIV 0,25 mg/ml (distancia de hueco de cubetas de 0,1 cm).
Tabla 2. Transformantes de Schizochytrium generados después del tratamiento previo con diferentes combinaciones de enzimas
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Tabla 3. Transformantes de Schizochytrium generados después del tratamiento previo con diferentes combinaciones nzim v l
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Tabla 4. Transformantes de Schizochytrium generados usando diferentes distancias de hueco de cubetas de l r r i n r r vi m n n 2 m ml Pr XIV
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Tabla 5. Transformantes de Schizochytrium generados usando diferentes voltajes de electroporación (tratados
Figure imgf000033_0004
Ejemplo 19
Expresión de invertasa en Schizochytrium
El vector pAB0018 se digirió con HIHI y Ndel dando como resultado dos fragmentos de 838 pb y 9879 pb de longitud. El fragmento de 9879 pb se fraccionó mediante técnicas electroforéticas convencionales en un gel de agar, se purificó usando kits comerciales de purificación de ADN y se ligó a una secuencia (SEQ ID NO: 57) que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica la señal de secreción natural de la proteína Sec1 de Schizochytrium seguido de una secuencia sintética que codifica la proteína invertasa madura (SUC2) de Saccharomyces cerevisiae, que se optimizó con codones para la expresión en Schizochytrium (véase la Figura 42). Se insertó una secuencia de fusión que contenía las secuencias que codifican el péptido señal Sec1 y la proteína invertasa de Saccharomyces cerevisiae en el vector pSchiz de Schizochytrium, seguido de digestión con SamHI y NdeI para producir la SEC ID NO: 57.
El producto de ligadura se utilizó para transformar una cepa suministrada comercialmente de células DH5a de E. coli competentes (Invitrogen) utilizando el protocolo del fabricante. Varios de los clones resultantes se propagaron y sus plásmidos se extrajeron y purificaron. Estos plásmidos se seleccionaron luego mediante digestión de restricción o PCR para confirmar que la ligadura generó los vectores plasmídicos esperados. Uno de dichos vectores plasmídicos que resulta de una unión con la SEQ ID NO: 57 se verificó mediante secuenciación de Sanger y se denominó pCL0076 (SEQ ID NO: 58). Véase la Figura 31.
Cultivos de Schizochytrium sp. ATCC 20888 y un derivado de Schizochytrium genéticamente modificado, denominado B76-32, se cultivaron en medio M2B que consiste en glucosa 10 g/l, (NH4)2SO4 0,8 g/l, Na2SO4 5 g/l, MgSO4 -7H2O 2 g/l, KH2PO4 0,5 g/l, KCl 0,5 g/l, CaCb 2H2O 0,1 g/l, MES 0,1 M (pH 6,0) metales PB26 al 0,1 % y vitaminas PB26 al 0,1 % (v/v). Las vitaminas PB26 consistieron en vitamina B12 50 mg/ml, tiamina 100 pg/ml y pantotenato de calcio 100 pg/ml. Los metales PB26 se ajustaron a pH 4,5 y consistieron en FeSO4 -7H2O 3 g/l, MnCl2 4 H2O 1 g/l, ZnSO4 -7H2O 800 mg/ml, CoCb ^ ^ O 20 mg/ml, Na2MoO4 -2H2O 10 mg/ml, CuSO4 -5H2O 600 mg/ml, y MSO4 6 H2O 800 mg/ml. Las soluciones madre de PB26 se esterilizaron por filtración por separado y se añadieron al caldo después de la esterilización en autoclave. La glucosa, KH2PO4 y CaCb 2H2O se esterilizaron en autoclave por separado del resto de los ingredientes del caldo antes de mezclar para evitar la precipitación de sal y la caramelización de carbohidratos. Todos los ingredientes del medios se compraron de Sigma Chemical (St. Louis, MO). La cepa B76-32 es un derivado de Schizochytrium sp. ATCC 20888 genomanipulado de acuerdo con la Patente de Estados Unidos N.° 7.211.418 y las Publicaciones de Patente de Estados Unidos N° 2008/0022422 y 2008/0026434.
Cultivos de Schizochytrium sp. ATCC 20888 y B76-32 se hicieron crecer hasta la fase logarítmica y se transformaron con el vector pCL0076 usando electroporación con tratamiento previo enzimático como se describe a continuación.
Electroporación con tratamiento previo enzimático - Las células se cultivaron en 50 ml de medio M50-20 (véase la publicación de Estados Unidos N.° 2008/0022422) en un agitador a 200 rpm durante 2 días a 30 °C. Las células se diluyeron a 1:100 en medio M2B (véase el siguiente párrafo) y se cultivaron durante la noche (16-24 h), intentando alcanzar el crecimiento de fase logarítmica medio (DO600 de 1,5-2,5). Las células se centrifugaron en un tubo cónico de 50 ml durante 5 minutos a aproximadamente 3000 x g. El sobrenadante se eliminó y las células se resuspendieron en manitol 1 M, pH 5,5, en un volumen adecuado para alcanzar una concentración final de 2 unidades DO600. Se dividieron en alícuotas de 5 ml de células en un matraz agitador de 25 ml y se modificaron con CaCl2 10 mM (reserva 1,0 M, esterilizado por filtro) y Proteasa XIV 0,25 mg/ml (reserva 10 mg/ml, esterilizado por filtro; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Los matraces se incubaron en un agitador a 30 °C y aproximadamente 100 rpm durante 4 h. Las células se monitorizaron bajo el microscopio para determinar el grado de protoplastización, con células individuales deseadas. Las células se centrifugaron durante 5 minutos a aproximadamente 2500 x g en tubos de fondo redondo (es decir, tubos Falcon™ de 14 ml, BD Biosciences, San Jose, CA). El sobrenadante se eliminó y las células se resuspendieron suavemente con 5 ml de glicerol al 10 % enfriado con hielo. Las células se volvieron a centrífugar durante 5 minutos a aproximadamente 2500 x g en tubos de fondo redondo. El sobrenadante se eliminó y las células se resuspendieron suavemente con 500 pl de glicerol al 10 % enfriado con hielo, usando puntas de pipeta de gran diámetro. Se dividieron en alícuotas de 90 pl de células en una electrocubeta preenfriada (cubeta Gene Pulser® - hueco de 0,1 cm o hueco de 0,2 cm, Bio-Rad, Hercules, CA). Se añadieron 1 pg a 5 pg de ADN (en un volumen menor o igual a 10 pl) a la cubeta, se mezclaron suavemente con una punta de pipeta y se colocaron en hielo durante 5 minutos. Las células se electroporaron a 200 ohms (resistencia), 25 pF (capacidad) y 250 V (para un hueco de 0,1 cm) o 500 V (hueco de 0,2 cm). Se añadieron 0,5 ml de medio M50-20 inmediatamente a la cubeta. Las células se transfirieron luego a 4,5 ml de medio M50-20 en un matraz agitador de 25 ml y se incubaron durante 2-3 h a 30 °C y a aproximadamente 100 rpm en un agitador. Las células se centrifugaron durante 5 minutos a aproximadamente 2500 x g en tubos de fondo redondo. Se retiró el sobrenadante y se resuspendió el sedimento celular en 0,5 ml de medio M50-20. Las células se colocaron en placas en un número apropiado (2 a 5) de placas M2B con la selección apropiada (si es necesario) y se incubaron a 30 °C.
Los transformantes se seleccionaron para crecimiento en medios M2B SMM o se seleccionaron directamente para crecimiento en sacarosa mediante la colocación en placas sobre MSFM sacarosa. Para la selección de MSFM sacarosa, después de 1-2 semanas, las colonias se volvieron a colocar con varios pases en medios frescos que contenían sacarosa. Se determinó que la expresión de la invertasa se puede usar como un marcador seleccionable para colonias de traustoquitridio cultivadas en sacarosa como única fuente de carbono.
Para los siguientes experimentos, se seleccionaron transformantes primarios para el crecimiento en medios M2B sólidos que contenían agar 20 g/l (VWR, West Chester, PA) y Sm M 10 pg/ml (Chem Service, Westchester, PA) después de 2-6 días de incubación a 27 °C. Todos los transformantes primarios se transfirieron manualmente a placas de M2B nuevas con SMM. Después de 1 semana, las colonias se transfirieron a MSFM y sacarosa 5 g/l sin SMM. Después de 1 semana, las colonias más grandes se transfirieron a placas de medio MSFM/sacarosa frescas. Diez de los transformantes de Schizochytrium sp. ATCC 20888 que crecen en sacarosa se seleccionaron para caracterización adicional y se denominaron como 1-1, 1-3, 1-24, 3-1, 3-2, 3-5, 3-21, 4-1, 4-24 y 4-31, respectivamente. Nueve de los transformantes B76-32 que crecen en sacarosa se seleccionaron para caracterización adicional y se denominaron como B76-32 n.° 2, n.° 12, n.° 19, 326, n.° 30, n.° 39, n.° 42, n.° 56, y n.° 61.
Las colonias que crecen en sacarosa (1-1, 1-3, 1-24, 3-1, 3-2, 3-5, 3-21, 4-1, 4-24, 4-31) se eliminaron de las placas usando un bucle de inoculación y se transfiere a tubos de cultivo que contienen 5 ml de medio de sacarosa y se cultivaron durante 4 días a 29 °C en un agitador. Se usaron 2 ml de este cultivo para inocular 50 ml de medio (MSFM o SSFM) en matraces de 250 ml y se cultivaron a 29 °C en un agitador a 200 rpm.
Los matraces de control de la cepa parental Schizochytrium sp. ATCC 20888 se cultivaron de la misma manera pero usando medios que contienen glucosa. Las células se cosecharon después de 7 días. Las células se centrifugaron y se lavaron con una mezcla de isopropanol al 50 %:agua destilada. Las células sedimentadas se secaron por congelación, se pesaron y se realizó un análisis de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME, de sus siglas en inglés). El crecimiento y contenido de grasa de los transformantes CL0076 de Schizochytrium sp. ATCC 20888 o B76-32 se analizaron gravimétricamente y mediante cromatografía de gases de aceites derivados como se describió previamente en la publicación de Estados Unidos N.° 2008/0022422, incorporada en el presente documento por referencia en su totalidad. Los resultados se muestran en las Tablas 6 - 9. Los pesos secos y el contenido de grasa de los sedimentos de los cultivos de transformantes en matraces de agitación, así como las cepas parentales, se muestran en las Figuras 32-37.
Medio SSFM: glucosa o sacarosa 50 g/l, Na2SO4 13,6 g/l, K2SO40,7 g/l, KCI 0,36 g/l, MgSO4 -7H2O 2,3 g/l, MES 0,1 M (pH 6,0), (NH4)2SO4 1,2 g/l, glutamato monosódico 0,13 g/l, KH2PO40,056 g/l, y CaCb 2H2O 0,2 g/l. Se añadieron vitaminas a 1 ml/l de una reserva que consistía en vitamina B120,16 g/l, tiamina 9,7 g/l y pantotenato de calcio 3,3 g/l. Se añadieron trazas de metales a 2 ml/l de una reserva compuesta por ácido cítrico 1 g/l, FeSO4 -7H2O 5,2 g/l, MnCb ^ O 1,5 g/l, ZnSO47H2O 1,5 g/l, CoCb 6 H2O 0,02 g/l, Na2MoO42H2O 0,02 g/l, CuSO45H2O 1,0 g/l, y MSO46 H2O 1,0 g/l, ajustado a pH 2,5.
Medios SFM modificados (MSFM): glucosa o sacarosa 10 g/l, NaCl 25,0 g/l, KCl 1,0 g/l, (NH4)2SO4 0,2 g/l, 5 g/l, MgSO4 -7H2O 5,0 g/l, KH2PO40,1 g/l, CaCb 2H2O 0,3 g/l, HEPES 0,1 M (pH 7,0), metales PB26 al 0,1 % y vitaminas PB26 al 0,1 % (v/v). Se añadieron vitaminas a 2 ml/l de una reserva que consistía en vitamina B120,16 g/l, tiamina 9,7 g/l y pantotenato de calcio 3,3 g/l. Se añadieron trazas de metales a 2 ml/l de una reserva compuesta por ácido cítrico 1 g/l, FeSO4 -7H2O 5,2 g/l, MnCb -4H2O 1,5 g/l, ZnSO4 -7H2O 1,5 g/l, CoCb 6H2O 0,02 g/l, Na2MoO4 -2H2O 0,02 g/l, CuSO4 -5H2O 1,0 g/l, y MSO46 H2O 1,0 g/l, ajustado a pH 2,5.
La Tabla 6 muestra el crecimiento y los niveles de grasa de Schizochytrium sp. ATCC 20888 cultivado en MSFM con glucosa, fructosa, sacarosa o sin fuente de carbono añadida.
La Tabla 7 muestra el peso seco y el % de ácidos grasos para Schizochytrium sp. ATCC 20888 cultivado en medios MSFM con glucosa (control) y líneas celulares transformadas de Schizochytrium sp. ATCC 20888 cultivadas en medios MSFM con sacarosa.
La Tabla 8 muestra el peso seco y el % de ácidos grasos para Schizochytrium sp. ATCC 20888 cultivado en medios SSFM con glucosa (control) y líneas celulares transformadas de Schizochytrium sp. ATCC 20888 cultivadas en medios SSFM con sacarosa.
La Tabla 9 muestra el peso seco y el % de ácidos grasos para B76-32 de Schizochytrium cultivado en medios SSFM con glucosa (control) y líneas celulares transformadas B76-32 de Schizochytrium cultivadas en medios SSFM con sacarosa.
Tabla 6. Crecimiento y niveles de grasa de Schizochytrium sp. ATCC 20888 cultivado en MSFM con glucosa, fructosa sacarosa o sin fuente de carbono añadida.
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Tabla 7. Líneas celulares transformadas de Schizochytrium sp. ATCC 20888 cultivadas en medios MSFM con sacarosa.
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Tabla 8. Líneas celulares transformadas de Schizochytrium sp. ATCC 20888 cultivadas en medios SSFM con sacarosa.
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Tabla 9. Líneas celulares transformadas B76-32 cultivadas en medios SSFM con sacarosa.
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Inmunotransferencia - Se recogieron sobrenadantes libres de células de cultivos en matraces de agitación de 50 ml cultivados en SSFM durante 3 días (véase la publicación de Estados Unidos N.° 2008/0022422) después de centrifugar los cultivos a 5000 x g. Los sobrenadantes de cultivo se usaron directamente para SDS-PAGe o se concentraron de 50 a 100 veces usando concentradores disponibles comercialmente equipados con membranas permeables que permiten la concentración de todos los componentes más pesados que 10 kDa. La concentración de proteína total se midió mediante el ensayo de Bradford (Biorad). La expresión de la invertasa se verificó luego mediante análisis de inmunotransferencia siguiendo el procedimiento convencional de inmunotransferencia (Sambrook et al.). En resumen, las proteínas (0,625 |jg a 5 |jg) se separaron por SDS-PAGE en un gel bis-tris (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Luego, las proteínas se tiñeron con azul de Coomassie (SimplyBlue Safe Stain, Invitrogen) o se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno y se probó la presencia de proteína invertasa con un antisuero invertasa (Open Biosystems) procedente de conejos que habían sido inyectados con una preparación pura de invertasa de Saccharomyces cerevisiae (Sigma). La membrana se incubó posteriormente con un anticuerpo secundario de ratón anti-conejo acoplado a fosfatasa alcalina (Promega). La membrana se trató luego con solución de 5-bromo-4-cloro-3-indoil-fosfato/nitroblue tetrazolio (BCIP/NBT) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (KPL, Gaithersburg, MD). Un ejemplo se presenta en la Figura 38. La inmunotransferencia anti-invertasa y el gel teñido de azul Coomassie correspondiente se presentan en los paneles A y B, respectivamente. De las cuatro bandas principales vistas en los sobrenadantes de cultivo del clon 1-3, solo se demostró que una reaccionaba con antisueros anti-invertasa. La identidad de la proteína se confirmó mediante análisis de secuencia peptídica.
Ensayo funcional - La enzima EC 3.2.1.26 es un tipo de sacarasa invertasa que cataliza la hidrólisis de sacarosa a fructosa y glucosa. La actividad sacarasa se midió por la velocidad de liberación de fructosa y glucosa a partir de la sacarosa. El ensayo se realizó de forma bruta mediante la adición de sacarosa al sobrenadante de caldo de fermentación y el contenido de glucosa/fructosa se midió mediante HPLC.
La cepa de Schizochytrium B76-32 n.° 3 se cultivó en MSFM (con sacarosa) hasta que la DO alcanzó aproximadamente 4 en matraces de agitación de 50 ml a 29 °C. Las células se centrifugaron durante 15 minutos a 4500 x g y se midió la actividad de la invertasa en el sobrenadante. La invertasa se ensayó mediante la adición de sacarosa 0,1 M a volúmenes variables de caldo de fermentación y ajustando el volumen final a 1 ml. La reacción se incubó a 55 °C durante 3 min. La terminación de la reacción se realizó a 100 °C durante 10 minutos, luego se congeló hasta el análisis que consiste en la determinación de glucosa, fructosa y sacarosa mediante HPLC. HPLC se realizó utilizando una versión modificada del proceso descrito en Liu et al.; Food Sci. 28:293-296 (2007). En resumen, los mono y disacáridos se separaron usando una HPLC con una columna de NH2 Luna y se detectaron usando un RID (detector de índice de refracción). La identificación se realizó mediante la comparación de los tiempos de retención con los de los estándares. La cuantificación se realizó mediante una calibración externa convencional. La velocidad de reacción en función de la concentración de sacarosa se muestra en la Figura 39A. Las Km (33,4 mM) y Vmax (6,8 mM glucosa/min) se calcularon a partir de una transferencia convencional de Lineweaver-Burk. Véase la Figura 39B.
Análisis de glucosilación - Las proteínas sobrenadantes se separaron mediante SDS-PAGE en un gel bis-tris al 4-12 % (Invitrogen). Las proteínas se tiñeron luego con azul de Coomassie (SimplyBlue Safe Stain, Invitrogen). Las proteínas teñidas de interés se cortaron del gel y los cortes se cortaron en trozos más pequeños (~ 1 mm3) y se tiñeron alternativamente con bicarbonato de amonio 40 mM (AmBic) y acetonitrilo al 100 % hasta que el color se volvió claro. El gel desteñido se volvió a llenar en DTT 10 mM en AmBic 40 mM a 55 °C durante 1 h. La solución de DTT se intercambió con yodoacetamida (IAM) 55 mM y se incubó en oscuridad durante 45 minutos. Después de la incubación se lavó alternativamente con AmBic 40 mM y acetonitrilo al 100 % dos veces. El gel deshidratado se volvió a llenar con solución de tripsina (tripsina en AmBic 40 mM) en hielo durante 45 minutos inicialmente, y la digestión de proteínas se llevó a cabo a 37 °C durante la noche. El sobrenadante se transfirió a otro tubo. Los péptidos y glucopéptidos se extrajeron del gel en serie con acetonitrilo al 20 % en ácido fórmico al 5 %, acetonitrilo al 50 % en ácido fórmico al 5 % y luego acetonitrilo al 80 % en ácido fórmico al 5 %. Las soluciones de muestra se secaron y se combinaron en un tubo. El extracto tríptico extraído se pasó a través de un cartucho sep-pak C18 y se lavó con ácido acético al 5 % para eliminar contaminantes (tales como sales y SDS). Los péptidos y glucopéptidos se eluyeron en serie con isopropanol al 20 % en ácido acético al 5 %, isopropanol al 40 % en ácido acético al 5 % e isopropanol al 100 % y se secaron en un concentrador de vacío de velocidad. Las muestras secas se combinaron y luego se reconstituyeron con tampón de fosfato de sodio 50 mM (pH 7,5) y se calentaron a 100 °C durante 5 minutos para inactivar la tripsina. La digestión tríptica se incubó con PNGasa F a 37 °C durante la noche para liberar N-glucanos. Después de la digestión, la muestra se pasó a través de un cartucho sep-pak C18 y la fracción de carbohidratos se eluyó con ácido acético al 5 % y se secó mediante liofilización. Los oligosacáridos ligados a N liberados se permetilaron según el método de Anumula y Taylor, Anal Biochem. 203:101-108 (1992) y perfilaron mediante espectrometría de masas. El análisis espectrométrico de masas se realizó siguiendo el método desarrollado en el Complex Carbohydrates Research Center (Aoki K et al., J. Biol. Chem. 282:9127-42 (2007). El análisis de masas se determinó usando NSI-LTQ/MSn. En resumen, los glucanos permetilados se disolvieron en NaOH 1 mM en metanol al 50 % y se infundieron directamente en el instrumento (LTQ, Thermo Finnigan) a una velocidad de flujo constante de 0,4 jl/min. El análisis de MS se realizó en el modo de iones positivos. Para el mapeo total de iones, el análisis MS/MS automatizado (a una energía de colisión de 35), el intervalo m/z de 500 a 2000 se escaneó en sucesivas ventanas de 2,8 unidades de masa que se superponían a la ventana anterior en 2 unidades de masa.
El mapeo total de iones se realizó para examinar la presencia de fragmentos de iones indicativos de glucanos. Se tomaron todos los datos de MS/MS desde m/z 500 hasta m/z 2000 y los datos en bruto se analizaron manualmente. El cromatograma y la tabla de especies obtenidas mediante mapeo de iones totales NSI se muestran en la Figura

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende:
(a) una secuencia polinucleotídica que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 43, y en donde el % de identidad de secuencia se puede encontrar sobre una secuencia de al menos 50 nucleótidos de la SEQ ID NO: 43; o
(b) una secuencia polinucleotídica que es completamente complementaria a la secuencia polinucleotídica de (a), en donde la molécula de ácido nucleico aislada está unida operativamente a una secuencia polinucleotídica que codifica una proteína heteróloga y tiene actividad promotora.
2. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, en donde la secuencia polinucleotídica tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 43.
3. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, en donde la secuencia polinucleotídica es la SEQ ID NO: 43.
4. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, en donde el % de identidad de secuencia se puede encontrar en una secuencia de al menos 100 nucleótidos de la SEQ ID NO: 43.
5. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, en donde la molécula de ácido nucleico recombinante es un vector.
6. Una célula hospedadora que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1.
7. La célula hospedadora de la reivindicación 6, en donde la célula hospedadora es un miembro del orden Thraustochytriales.
8. La célula hospedadora de la reivindicación 7, en donde la célula hospedadora es un Schizochytrium o un Thraustochytrium.
9. Un método para la producción de una proteína heteróloga que comprende:
(a) cultivar un microorganismo recombinante del orden Thraustochytriales en un medio, en donde el microorganismo recombinante comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1; y
(b) producir la proteína preparada en la etapa (a).
10. El método de la reivindicación 9, en donde la proteína heteróloga se recupera de una biomasa de Thraustochytriales aislada.
11. El método de la reivindicación 9, en donde la proteína heteróloga se acumula en el microorganismo.
12. El método de la reivindicación 9, en donde la proteína heteróloga se recupera del medio de cultivo.
13. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 5, en donde dicho vector se deposita bajo el número de acceso ATCC PTA-9616.
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Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107858297A (zh) 2009-12-28 2018-03-30 Dsm Ip资产公司 在蔗糖上生长的重组破囊壶菌和其组合物、制备方法及用途
CA2785867C (en) * 2009-12-28 2018-03-27 Dsm Ip Assets B.V. Production of hemagglutinin-neuraminidase protein in microalgae
CA3028175C (en) 2009-12-28 2022-05-24 Sanofi Vaccine Technologies, S.A.S. Methods of producing heterologous viral neuraminidase proteins in microalgae
CN102906270B (zh) * 2009-12-28 2016-06-22 Dsmip资产公司 在木糖上生长的重组破囊壶菌和其组合物、制备方法及用途
RU2575599C2 (ru) 2010-03-12 2016-02-20 Мериал Лимитед Рекомбинантные вакцины против вируса "синего языка", их применение
CN105764916B (zh) 2013-06-05 2021-05-18 博士医疗爱尔兰有限公司 鸟苷酸环化酶c的超纯激动剂、制备和使用所述激动剂的方法
US20220000141A1 (en) * 2014-07-25 2022-01-06 Smallfood Inc. Protein rich food ingredient from biomass and methods of production
US11213048B2 (en) 2014-07-25 2022-01-04 Smallfood, Inc. Protein rich food ingredient from biomass and methods of preparation
US11122817B2 (en) * 2014-07-25 2021-09-21 Smallfood Inc. Protein rich food ingredient from biomass and methods of production
WO2016140925A1 (en) 2015-03-02 2016-09-09 Synthetic Genomics, Inc. Regulatory elements from labyrinthulomycetes microorganisms
US10584347B2 (en) * 2016-03-16 2020-03-10 Conagen Inc. Production of proteins in labyrinthulomycetes
BR112018073164A2 (pt) 2016-05-12 2019-04-30 Dsm Ip Assets Bv método de aumento de produção de ácidos graxos poli-insaturados ômega-3 em microalgas
CN109689856A (zh) * 2016-07-13 2019-04-26 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于海藻宿主细胞的CRISPR-Cas系统
US10633454B2 (en) 2016-11-01 2020-04-28 Conagen Inc. Expression of modified glycoproteins and glycopeptides
WO2018085273A1 (en) * 2016-11-01 2018-05-11 Synthetic Genomics, Inc. Expression of modified glycoproteins and glycopeptides
WO2019173226A1 (en) * 2018-03-05 2019-09-12 Synthetic Genomics, Inc. Organisms and methods for producing glycomolecules with low sulfation
WO2019213095A1 (en) * 2018-05-01 2019-11-07 Conagen Inc. Recombinant organisms and methods for producing glycomolecules with high glycan occupancy
CN109777815B (zh) * 2019-03-28 2021-10-29 昆明理工大学 HMG-CoA合成酶基因RKHMGCS及其应用
WO2022232213A1 (en) * 2021-04-28 2022-11-03 Conagen Inc. Methods of producing sars-cov-2 spike protein
WO2023144707A1 (en) 2022-01-25 2023-08-03 Dsm Ip Assets B.V. Media refinement and nutrient feeding approaches to increase polyunsaturated fatty acid production

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
LU35839A1 (es)
BE545283A (es)
US3223456A (en) * 1963-11-14 1965-12-14 Siemens Ag Conveying apparatus for fine-granular material
US4381897A (en) * 1980-10-06 1983-05-03 Krupp Polysius Ag Installation for transporting fine-grained material
US4626505A (en) * 1984-02-24 1986-12-02 E. I. Du Pont De Nemours And Company Selectable markers for yeast transformation
US5605011A (en) * 1986-08-26 1997-02-25 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
IL83348A (en) 1986-08-26 1995-12-08 Du Pont Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
GB8716899D0 (en) * 1987-07-17 1987-08-26 Unilever Plc Detergent compositions
US5130242A (en) * 1988-09-07 1992-07-14 Phycotech, Inc. Process for the heterotrophic production of microbial products with high concentrations of omega-3 highly unsaturated fatty acids
US5340742A (en) 1988-09-07 1994-08-23 Omegatech Inc. Process for growing thraustochytrium and schizochytrium using non-chloride salts to produce a microfloral biomass having omega-3-highly unsaturated fatty acids
US5426040A (en) * 1989-08-17 1995-06-20 Northeastern University Methods for producing improved strains of seaweed by fusion of spore-protoplasts, and resultant seaweeds and phycocolloids
IL100908A0 (en) * 1991-02-22 1992-11-15 Salk Inst Biotech Ind Invertase genes and their use
US5804408A (en) * 1991-03-13 1998-09-08 Yoshihide Hagiwara Expression of human SOD in blue green algae
US5661017A (en) * 1993-09-14 1997-08-26 Dunahay; Terri Goodman Method to transform algae, materials therefor, and products produced thereby
US5853973A (en) * 1995-04-20 1998-12-29 American Cyanamid Company Structure based designed herbicide resistant products
DE19529475A1 (de) 1995-08-11 1997-02-13 Marcus Weis Siebkonstruktion zum Abtrennen des Faseranteils aus der Shredderleichtfraktion
US5824309A (en) * 1995-12-05 1998-10-20 University Of Massachusetts Recombinant gas vesicles and uses thereof
US6027900A (en) * 1996-04-12 2000-02-22 Carnegie Institution Of Washington Methods and tools for transformation of eukaryotic algae
CN1190673A (zh) 1996-04-29 1998-08-19 中国科学院微生物研究所 丝状真菌中独立复制的表达载体及表达系统
AU727570B2 (en) 1997-02-20 2000-12-14 Bayer Cropscience Nv Improved transformation method for plants
ES2125195B1 (es) 1997-04-18 1999-10-01 Antibioticos Sa Procedimiento de inactivacion de genes que codifican para enzimas del catabolismo del fenilacetato, plasmidos que intervienen y cepas transformadas con los mismos.
US7247461B2 (en) * 1999-01-14 2007-07-24 Martek Biosciences Corporation Nucleic acid molecule encoding ORFA of a PUFA polyketide synthase system and uses thereof
US8003772B2 (en) * 1999-01-14 2011-08-23 Martek Biosciences Corporation Chimeric PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
US7217856B2 (en) 1999-01-14 2007-05-15 Martek Biosciences Corporation PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
US7211418B2 (en) 1999-01-14 2007-05-01 Martek Biosciences Corporation PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
FR2791699B1 (fr) 1999-03-29 2004-10-29 Meristem Therapeutics Promoteurs chimeriques d'expression, cassettes d'expression, vecteurs, plantes et semences transgeniques les contenant, et methodes de leur obtention
KR20000075076A (ko) 1999-05-28 2000-12-15 최태진 형질전환된 미세조류를 이용하여 외래 단백질을 생산하는 방법
MXPA03000105A (es) * 2000-06-28 2004-09-13 Glycofi Inc Metodo para producir glicoproteinas modificadas.
US7795002B2 (en) * 2000-06-28 2010-09-14 Glycofi, Inc. Production of galactosylated glycoproteins in lower eukaryotes
US7625756B2 (en) 2000-06-28 2009-12-01 GycoFi, Inc. Expression of class 2 mannosidase and class III mannosidase in lower eukaryotic cells
US20060257399A1 (en) 2000-06-28 2006-11-16 Glycofi, Inc. Immunoglobulins comprising predominantly a Man5GIcNAc2 glycoform
US20060029604A1 (en) 2000-06-28 2006-02-09 Gerngross Tillman U Immunoglobulins comprising predominantly a GlcNAc2Man3GlcNAc2 glycoform
ES2343106T3 (es) * 2000-09-28 2010-07-23 BIORIGINAL FOOD & SCIENCE CORP. Fad4, fad5, fad5-2 y fad6, miembros de la familia de desaturasas de acidos grasos y usos de los mismos.
US6419425B1 (en) * 2001-02-28 2002-07-16 Neu Transf'air Granular material distributing apparatus comprising at least two transfer vessels that operate in alternation
TWI324181B (en) * 2001-04-16 2010-05-01 Martek Biosciences Corp Product and process for transformation of thraustochytriales microorganisms
US7332299B2 (en) 2003-02-20 2008-02-19 Glycofi, Inc. Endomannosidases in the modification of glycoproteins in eukaryotes
AU2004225485B2 (en) * 2003-03-26 2008-08-21 Dsm Ip Assets B.V. PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
BRPI0411099A (pt) * 2003-06-05 2006-07-18 Wyeth Corp composições imunogênicas que compreendem os vetores de replicon do vìrus da encefalite eqüina venezuelana e antìgenos de proteìnas de paramixovìrus
JP4796786B2 (ja) * 2005-04-28 2011-10-19 富士フイルム株式会社 ラビリンチュラ類を形質転換可能なベクター
JP4796787B2 (ja) 2005-04-28 2011-10-19 富士フイルム株式会社 ラビリンチュラ類への遺伝子導入法
PT103331A (pt) * 2005-08-05 2007-02-28 Fundacao Da Faculdade De Cienc Expressão dum transportador activo de xilose em saccharomyces cerevisiae modificada geneticamente
EP2653557A1 (en) * 2006-03-15 2013-10-23 DSM IP Assets B.V. Plant seed oils containing polyunsaturated fatty acids
US8477593B2 (en) 2006-07-28 2013-07-02 Qualcomm Incorporated Method and apparatus for sending signaling for data transmission in a wireless communication system
CA2659603C (en) 2006-08-01 2017-03-07 Ocean Nutrition Canada Limited Oil producing microbes and methods of modification thereof
CA2615372A1 (en) 2007-07-13 2009-01-13 Marc-Andre D'aoust Influenza virus-like particles (vlps) comprising hemagglutinin
NZ598199A (en) * 2007-09-12 2013-12-20 Martek Biosciences Corp Biological oils and production and uses thereof
EP2090648A1 (en) 2008-02-12 2009-08-19 Institut Francais de Recherche pour l'Exploitation de la Mere(Ifremer) Production of glycosylated polypeptides in microalgae
BRPI0910914A2 (pt) 2008-04-09 2015-10-13 Solazyme Inc método para modificar quimicamente biomassa microbiana contendo lipídeo, composição, e, método para fabricar um sabão.
CN102906270B (zh) * 2009-12-28 2016-06-22 Dsmip资产公司 在木糖上生长的重组破囊壶菌和其组合物、制备方法及用途
CA3028175C (en) * 2009-12-28 2022-05-24 Sanofi Vaccine Technologies, S.A.S. Methods of producing heterologous viral neuraminidase proteins in microalgae
CN107858297A (zh) * 2009-12-28 2018-03-30 Dsm Ip资产公司 在蔗糖上生长的重组破囊壶菌和其组合物、制备方法及用途
CA2785867C (en) * 2009-12-28 2018-03-27 Dsm Ip Assets B.V. Production of hemagglutinin-neuraminidase protein in microalgae

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Publication number Publication date
JP6369952B2 (ja) 2018-08-08
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