CN1190673A - 丝状真菌中独立复制的表达载体及表达系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类可以在丝状真菌中独立自主复制的穿梭载体质粒及其在表达外源基因中的应用。本发明的载体质粒包括的主要功能片段有:a)牛的乳头瘤病毒(BPV)片段;b)丝状真菌的外源生物启动子;c)pBR322质粒的PvuII和BamHI片段。

Description

丝状真菌中独立复制的表达载体及表达系统

本发明涉及在丝状真菌中表达外源基因的表达载体系统。更确切地说，本发明涉及可在丝状真菌中穿梭并独立自主复制的载体质粒及其在表达外源基因中的应用。

丝状真菌是在分类地位上是高于细菌和酵母菌的一类微生物，它能够产生大量的胞外酶及其它代谢产物。因其具有生产诸多有机酸、醇类化合物、抗生素、氨基酸、核甘酸以及酶制剂等重要物质的能力，故而丝状真菌在目前的工业发酵生产中占有重要的地位。长期以来人们就一直用经典的遗传方法，各种理化诱变手段，炭氮源的利用和代谢调节等进行改善及提高丝状真菌各种生产能力的研究，并取得了很多成绩。

研究表明，丝状真菌本身不仅具有蛋白质外泌的功能，而且其表达的真核基因产物更接近于自然状态，再加上丝状真菌有长期丰富的工业生产背景，易于大规模发酵培养，因此，丝状真菌被认为是一个理想的高效表达外源基因并生产蛋白的系统和可能成为疫苗生产的理想系统。

八十年代后，人们除了对已建立的大肠杆菌和酵基因表达载体及表达系统进一步改进完善外，已经将注意力转向开发和利用丝状真菌，研究建立丝状真菌的基因表达和表达系统。

丝状真菌在遗传工程方面的研究之所以落后于大肠杆菌和酵母菌，是因其分子生物学的基础研究不够，了解的知识不够。而且另一主要原因是缺乏大肠杆菌与酵母菌那样的质粒和体内同源重组载体及人工构建的穿梭(Shuttle Vector)的载体质粒。而这正是对丝状真菌进行诸多研究所必须跨越的障碍。随着生物工程技术的发展，进年来经过人们不断地深入研究，继美国D.Cμllen等人首次报道外源真核牛的凝乳蛋白酶(Bovine Chymoin)在丝状真菌构巢曲霉(Aspergillus nidμlans)中表达成功后(Daniel Cμllen.et a1.：Bio/Technology.5：369-376，April，1987)，已有人的干扰素及细菌内葡聚糖酶在构巢曲霉中的表达，血纤维蛋白溶酶原、甘露己糖、鸡卵白溶菌酶、天门冬氨酸蛋白酶等在木霉(Trichoderma)，黑曲霉(Apergillus niger)，米曲霉(Apergillus oryzae)中的表达等文章陆续发表。我国也有乙肝表面抗原在臭曲霉(刘宏迪等，微生物学报30(2)：98-104，1990)和米曲霉中表达成功的报道。

从大量有关丝状真菌表达系统的研究报道中，我们发现在绝大多数情况下，转化的外源DNA整合到了宿主染色体上。研究发现，环状质粒整合到染色体上的方式，主要分为基因取代和质粒整合。质粒整合又分为同源整合和非同源整合两种。如果外源DNA片段两侧带有人工构建的旁侧系列(从宿主染色体分离到的特定基因)，则其整合为单拷贝同源整合。由于这种目的基因或质粒的单拷贝或多拷贝整合，可能造成：(1)由于外源DNA整合到染色体上而灭活宿主正常基因或激活有害基因，对宿主的正常生长及表达产物产生不利影响。(2)由于目的基因的整合，影响了其稳定性，从而该目的基因的表达受到了影响。(3)外源基因的随机整合不利于对其表达进行控制。由于同源重组型表达载体存在不能穿梭、不是独立自主复制、表达产量相对低等诸多特殊问题，因此，需要开放一种能克服上述问题的在丝状真菌中可以独立自主复制的穿梭质粒。

本发明的目的在于提供可以在丝状真菌中穿梭并独立自主复制的载体质粒，该载体质粒包括的主要功能片段有：a)牛的乳头瘤病毒(BPV)片段；b)丝状真菌的外源生物启动子；c)pBR322质粒的PvuII和BamHI片段(包括转录起始位点和氨苄抗性基因)。本发明的目的还在于提供利用本发明的独立自主复制载体质粒生产多肽的方法，包括：a)将外源基因与本发明的载体质粒有效地连接；b)用所述表达载体转化丝状真菌细胞；c)在合适的条件下培养所述转化细胞并回收目的产物。

本发明的质粒游离于宿主菌的染色体外，该载体携带的外源基因的表达不会由于整合而受到影响，始终以环状DNA形式存在，保持了基因稳定性。此外，外源基因在均一的核酸系列中有利于控制表达，并且质粒游离排除了由于外源DNA整合而灭活宿主正常基因或激活有害基因的可能性。

本发明的穿梭载体质粒中所用的启动子可以是与丝状真菌异源的任何外源生物启动子，其中优选的是MT、SV40、35S启动子，MT启动子能在重金属诱导下增加pBPV表达载体的表达调控能力。

本发明所选用的宿主细胞可以是大肠杆菌和丝状真菌，优选丝状真菌，更优选的是曲霉菌属。被转化的丝状真菌内具有相对多而恒定的质粒拷贝数，而且可以形成独立的细胞株，并以孢子传代的方式稳定地传代长期存活。本发明的载体不仅能表达原核生物的外源基因，而且能表达哺乳动物、人的病毒部分基因(HBsAg，并装配成22nm颗粒)；也能表达HAV的全部阅读框架基因，并在体内还可装配成完整的病毒颗粒(HAV，27～32nm)。从外，还能表达并外泌具生物活性的蛋白酶和人神经生长因子(hNGF)，其表达产物较原核表达系统更接近其自然状态。所以利用本发明的表达载体及表达系统能够高效稳定地表达高活性的外源蛋白。

建立了高效表达的丝状真菌系统，可以高效表达原核表达系统不能表达的外源真核基因。利用人们在发酵工业中积累的长期丰富的管理经验及丝状真菌发酵培养成本低廉的优点，本发明的表达系统具有其它任何系统不可比拟的优势。

下面用实施例更详细地说明本发明。

图1、显示的载体质粒图谱是p50，该质粒是用于表达乙肝表面抗

 原基因和甲肝的全部阅读框架基因。图2、显示的载体质粒图谱是pBPV-hLY，该质粒是用于表达人

 溶菌酶基因。图3、显示的载体质粒图谱是pSNB7，该质粒是用于表达人神经

 生长因子基因。图4、显示的是MT启动子在重金属Cd²⁺诱导下人溶菌酶表达量

 的曲线图。图5、显示的是甲肝的免疫电镜图。图左侧是发酵菌丝提取物中

 甲肝颗粒，图右侧是阳性甲肝颗粒。图6、显示的是乙肝的免疫电镜图。图左侧是发酵上清中HBsAg

 颗粒，图右侧是阳性HBsAg颗粒。图7、显示的是鸡胚背根神经节加入NGF阳性转化株的培养上清

 液后神经节的生长图(图7-1，阳性对照图7-2)。

实施例1：自主复制型表达载体的构建A.50载体(p50)1.说明：大小：11Kb原核系统构件：

复制起始位点：来源于pBR322的复制起始位点

选择标记：抗氨苄青霉素基因氨苄青霉素抗性真核系统构件：

复制起始位点：来源于BPV的复制起始位点

启动子：猴肾病毒(SV40)早期启动子

        多克隆位点：BglII见说明书附图，图1。2.构建过程：(1).从pBPV上切下含BPV的BamHI-BamHI大小为7.9Kb的DNA片段。

以20μl pBPV质粒(购自Pharmacia公司，20μg)、10μl反应缓冲液(Promega公司的限制性内切酶缓冲液E)、5μl限制性内切酶BamHI(50unit)、65μl灭菌无离子水为反应体系，37℃酶切5小时，低熔点胶法回收(参照《分子克隆》，第二版，(美)J.萨姆布鲁克等著，科学出版社)获得一个包含BPV的BamHI-BamHI大小为8Kb的DNA片段。(2).从pBR322中切下一个包含氨苄青霉素抗性基因和复制起始位点(Ori)PvuII-BamHI大小为2.67Kb的DNA片段。

以10μl pBR322质粒(购自Pharmacia公司，20μg)、10μl反应缓冲液(Promega公司的限制性内切酶Core缓冲液)、5μl限制性内切酶BamHI(50unit)、65μl灭菌无离子水为反应体系，37℃酶切5小时，65℃，15min灭活BamHI，再补加5μl PvuII(50unit)，37℃酶切过夜，低熔点胶法回收(参照《分子克隆》，同上)获得一个包含氨苄青霉素抗性基因和复制起始位点(Ori)PvuII-BamHI大小为2.67 Kb的DNA片段。(3).从猴肾病毒(SV40)上切下包含SV40早期启动子的PvuII-Hind III大小为0.34Kb的DNA片段。

以10μl SV40(购自Biolabs公司，20μg)、10μl反应缓冲液(Promega公司的限制性内切酶Core缓冲液)、5μl限制性内切酶Hind III(50unit)、65μl灭菌无离子水为反应体系，37℃酶切5小时，65℃，15min灭活BamHI，再补加5μlPvuII(50unit)，37℃酶切过夜，低熔点胶法回收(参照《分子克隆》，同上)获得一个包含SV40早期启动子的PvuII-Hind III大小为0.34Kb的DNA片段。(4).将以上三个片段和序列为Hind III-BglII-BamHI的酶切位点连接、转化。

将这四个片段混合液7μl、1μl反应缓冲液(Promega公司Ligase缓冲液)、1μl连接酶(Promega公司Ligase)为反应体系，16℃连接过夜。将连接产物转化E.coli菌株JM109的感受态细胞(方法见《分子克隆》，同上)。将转化的感受态细胞涂于氨苄青霉素LB平板。(5).筛选。

挑取氨苄青霉素LB平板上长出的菌落，提取质粒(方法见《分子克隆》碱法提质粒)，进行琼脂糖电泳检验，筛选出大小约为11Kb的质粒。该质粒用BamHI酶切，进行琼脂糖电泳检验，切出一个大小为7.9Kb的片段，则证明该质粒带有从pBPV上切下含BPV的BamHI-BamHIDNA片段。低熔点胶法回收另外的大小约3.1Kb的DNA片段，再用PvuII酶切，进行琼脂糖电泳检验，切成二个DNA片段，大小分别约为2 67Kb和0 34Kb，则证明该质粒带有从pBR322中切下一个包含氨苄青霉素抗性基因和复制起始位点(Ori)PvuII-BamHIDNA片段和从猴肾病毒(SV40)上切下的包含SV40早期启动子的PvuII-Hind III的DNA片段。完整质粒用Hind III酶切，如切成二个DNA片段，大小分别为5.4Kb和5.6Kb，则证明该质粒带有的从pBPV上切下的含BPV的BamHI-BamHIDNA片段连接方向正确。完整质粒用BglII酶切，切成一个线性DNA片段，证明该质粒带有酶切位点上的BglII位点。B.人的神经生长因子表达载体(pSNB7)的构建1.说明：

大小：11.1Kb

原核系统构件：

复制起始位点：来源于pSP72的复制起始位点

选择标记：抗氨苄青霉素基因氨苄青霉素抗性

真核系统构件：

复制起始位点：来源于BPV的复制起始位点

启动子：猴肾病毒(SV40)早期启动子

插入外源片段：人的神经生长因子基因见说明书附图，图3。2.质粒构建：

a.pN9质粒的构建

(1).pSp72-SV40片段的制备

1.5ml离心管中加入8μg pSP72-SV40质粒、20单位限制性内切酶NcoI、20单位限制性内切酶KpnI、5μl10倍反应缓冲液A(Promega公司)、灭菌无离子水加至50μl，37℃温育2小时后，电泳检查已完全酶解，65℃ 15分钟灭活限制性内切酶。加入Klnow酶1μl，2.5mM 4xdNTP 1μl，37℃温育半个小时，补平粘末端，65℃ 15分钟灭活。加入碱性磷酸酶1单位，37℃ 1小时，对末端脱磷。加入1μl 0.5M EDTA终止反应。走1％琼脂糖凝胶，在354nm紫外灯下观测，以透析带电洗脱法进行回收纯化pSp72-SV40片段(见《分子克隆》第二版321页)。(2).hNGF片段的制备

250μl反应体积中加入质粒pNGFmp19(为β-hNGF的PCR片段重组入M13mp19构建而成，详见《科学通报》V.36 No.22 1745页)10μg，限制性内切酶Hind III和限制性内切酶BamHI各20units，10倍反应缓冲液5μl，补灭菌无离子水至50μl，37℃2小时。加入Klnow酶1μl，2.5mM 4xdNTP 1μl，37℃温育半个小时，补平粘末端，65℃ 15分钟灭活。走1％琼脂糖凝胶，以透析带电洗脱法进行回收纯化，得到hNGF片段。(3).将pSp72-SV40片段和hNGF片段连接、转化。

取pSP72-SV40片段0.2μg、hNGF片段0.3μg、2单位连接酶、1μl连接酶反应缓冲液、0.5μl 10mM ATP，灭菌无离子水加至10μl，在0.5ml离心管中，16℃过夜。连接反应结束后，加入200μlDH5α感受态细胞，混匀，在冰上放置30分钟，然后热冲击90秒，再加入1ml SOC培养基，37℃温育1小时，3000rpm离心2分钟，去上清，用200μl SOC培养基将细胞涂布于带有50μg/ml氨苄青霉素的LB平板上。37℃培养过夜。(4).筛选。

在LB平板上挑取单细胞至试管中，试管中装有含50μg/mlAp的3ml SOC培养基。37℃培养8-12小时，以碱法提取质粒(见《分子克隆》第二版26页)。用EcoRI酶切检测：加入质粒DNA 1μg，限制性内切酶EcoRI 2单位，高盐缓冲液2μl，灭菌无离子水加至20μl，37℃温育1小时，在1.5％的琼脂糖凝胶电泳半个小时后，紫外灯下观测有一条约360bp大小的带。说明此质粒为pN9质粒。b.pSN1质粒的构建(1)酶切pSP72-SV40载体。

加入20μg pSP72-SV40载体，20单位限制性内切酶PvuII，5μl1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，5μl中盐缓冲液，灭菌无离子水加至50μl，37℃温育3小时。加入碱性磷酸酶1单位，37℃1小时，对末端脱磷。加入1μl 0.5MEDTA终止反应。走1％琼脂糖凝胶，在354nm紫外灯下观测，以透析带电洗脱法进行回收纯化，得到载体片段。(2)带有ATG起始密码子的hNGF片段的获得。

加入20μg pN9质粒，20单位限制性内切酶SalI，20单位限制性内切酶ClaI，5μl 1mg/ml BSA，5μl高盐缓冲液，灭菌无离子水加至50μl，37℃温育3小时。65℃15分钟灭活限制性内切酶。加入Klnow酶1μl，2.5mM 4xdNTP 1μl，37℃温育半个小时，补平粘末端，65℃ 15分钟灭活。加入碱性磷酸酶1单位，37℃ 1小时，对末端脱磷。加入1μl 0.5M EDTA终止反应。走1％琼脂糖凝胶，在354nm紫外灯下观测，以透析带电洗脱法进行回收纯化，得到带有ATG起始密码子的hNGF片段。(3)连接、转化。

pSP72-SV40载体片段0.2μg、带有ATG起始密码子的hNGF片段0.3μg、2单位连接酶、1μl连接酶反应缓冲液、0.5μl 10mM ATP，灭菌无离子水加至10μl，在0.5ml离心管中，16℃过夜。

连接反应结束后，加入200μlDH5α感受态细胞，混匀，在冰上放置30分钟，然后热冲击90秒，再加入1ml SOC培养基，37℃温育1小时，3000rpm离心2分钟，去上清，用200μl SOC培养基将细胞涂布于带有50μg/ml氨苄青霉素的LB平板上。37℃培养过夜。(4)筛选。

在LB平板上挑取单细胞至试管中，试管中装有含50μg/mlAp的3ml SOC培养基。37℃培养8-12小时，以碱法提取质粒。酶切检查：20μl反应体系中加入质粒DNA 1μg，限制性内切酶SacI 2单位，缓冲液2μl，灭菌无离子水加至20μl，37℃酶切1小时，紫外灯下观测到一条约680bp的带。证明得到了pSN1质粒。

Southern印迹法证明该质粒上带有hNGF片段。取hNGFM13mp19 Hind III+BamIII双酶切片段。利用Promega公司的Nick Translation System制备hNGF探针(详见Promega公司data sheet DS002)。分取pN9，pSN1，pSP72-SV40，大肠杆菌DNA，hNGFM13mp19 0.5μg在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳1小时。按照《分子克隆》第二版475-490页的方法将DNA转移至硝酸纤维素膜上，固定，预杂交，杂交，放射自显影。结果发现pN9、pSN1，hNGFM13mp19为阳性，另两个为阴性。c.pSNB7质粒的构建(1)酶切pSN1质粒。

50μl反应体系中加入20μg pSN1质粒，20单位限制性内切酶BglII，5μl1mg/ml BSA，5μl中盐缓冲液，灭菌无离子水加至50μl，37℃温育3小时。65℃灭活限制性内切酶。(2)酶切pBPV质粒(Pharmacia公司)。

50μl反应体系中加入20μg pSN1质粒，20单位限制性内切酶BamHI，5μl1mg/ml BSA，5μl缓冲液，灭菌无离子水加至50μl，37℃温育3小时。(3)连接、转化：

pSN1载体片段0.20μg、BPV片段0.3μg、2单位连接酶、1μl连接酶反应缓冲液、0.5μl 10mM ATP，灭菌无离子水加至10μl，在0.5ml离心管中，16℃过夜。连接反应结束后，加入200μlDH5α感受态细胞，混匀，在冰上放置30分钟，然后热冲击90秒，再加入1ml SOC培养基，37℃温育1小时，3000rpm离心2分钟，去上清，用200μl SOC培养基将细胞涂布于带有50μg/ml氨苄青霉素的LB平板上。37℃培养过夜。(4)筛选。

在LB平板上挑取单细胞至试管中，试管中装有含50μg/mlAp的3ml SOC培养基。37℃培养8-12小时，以碱法提取质粒。由于BPV片段有8Kb，分子量远远大于pSN1载体，直接走电泳就看出区别。另外用EcoRI酶切可看到四条带，如无插入则只有三条带。C.人溶菌酶表达载体(pBPV-hLY)的构建1.说明：大小：13kb原核系统构件：

复制起始位点：来源于pBR322的复制起始位点

选择标记：抗氨苄青霉素基因氨苄青霉素抗性真核系统构件：

复制起始位点：来源于BPV的复制起始位点

启动子：小鼠摄金蛋白基因(MT)启动子插入的外源片段：人工合成的人溶菌酶基因见说明书附图，图2。2.质粒构建：

人溶菌酶基因采用DNA合成仪人工合成(钱世钧等，生物工程学报，1994，10(1)：34-38)，并克隆在质粒pBluescriptII KS⁺上(简称质粒KS⁺-hLY)。将克隆在质粒pBluescriptII KS⁺的人工人溶菌酶基因构建在哺乳动物表达载体pBPV上，从而获得人溶菌酶基因的丝状真菌表达重组质粒。

以10μl质粒KS⁺-hLY(20μg)、10μl反应缓冲液(Promega公司的限制性内切酶缓冲液C)、6μl限制性内切酶XhoI(60unit)、1.5μl限制性内切酶SacII(15unit)、72.5μl灭菌无离子水为反应体系，酶切并回收获得一个包含人溶菌酶全基因并且5′端比人溶菌酶DNA片段大30个碱基的DNA片段；以3μl质粒pBPV(5μg)、5μl反应缓冲液(Promega公司的限制性内切酶缓冲液C)、1μl限制性内切酶XhoI(10unit)、0.5μl限制性内切酶SacII(5unit)、40.5μl灭菌无离子水为反应体系，酶切并回收获得载体大片段。然后，以8μl回收的人溶菌酶基因片段(约0.1μg)和pBPV片段(约0.8μg)混合液、1μl反应缓冲液(Promega公司Ligase缓冲液)、1μl连接酶(Promega公司Ligase)为反应体系，连接过夜。将连接产物转化E.coli菌株JM109的感受态细胞(方法见《分子克隆》，同上)。将转化的感受态细胞涂于氨苄青霉素LB平板。

挑取氨苄青霉素LB平板上长出的菌落，提取质粒(方法见《分子克隆》碱法提质粒)，然后酶切(同上)并进行琼脂糖电泳检验筛出阳性转化子，从而获得人溶菌酶基因的重组质粒，即简称pBPV-hLY。实施例2：用p50载体表达甲肝病毒(HAV)全部开放阅读框架基因

并在米曲霉(A.oryzae)内装配成病毒颗粒一、构建甲肝病毒(HAV)全部开放阅读框架基因的重组表达质粒

为了在丝状真菌中表达甲肝病毒(HAV)全部开放阅读框架基因，必须构建能在丝状真菌中表达的重组表达质粒。甲肝病毒(HAV)全部开放阅读框架基因来源于甲肝原始质粒(高峰等，病毒学报，1989，5：301)。甲肝病毒(HAV)全部开放阅读框架基因构建在本课题组构建的丝状真菌表达载体p50上，从而获得甲肝病毒(HAV)全部开放阅读框架基因的丝状真菌表达重组质粒。

以10μl甲肝原始质粒(20μg)、10μl反应缓冲液(Promega公司的限制性内切酶Core缓冲液)、5μl限制性内切酶Smal I(60unit)、75μl灭菌无离子水为反应体系，25℃酶切5小时，65℃，15min灭活Smal I，再补加5μl Stu I，37℃酶切过夜，低熔点胶法回收(参照《分子克隆》，同上)获得一个包含甲肝病毒(HAV)全部开放阅读框架基因的大小约为6.8Kb的DNA片段；以3μl质粒p50(5μg)、5μl反应缓冲液(Promega公司的限制性内切酶缓冲液C)、1μl限制性内切酶BglII(10unit)、41μl灭菌无离子水为反应体系，37℃酶切并回收获得载体片段。然后，将回收的载体片段3’端和5’端补平：50μl反应终体系中，9μlDNA片段(含5mMol/lMgCl₂)，1μlklenow酶(500u/ml)，5μl缓冲液D，1μl dNTP(2.5mM)，34μl灭菌无离子水，37℃反应15min，75℃灭活10min。加入等体积50μl TE(pH7.6)，用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提2次，上清待用。连接反应：回收的甲肝病毒(HAV)全部开放阅读框架基因片段2μl和上步制备的平头的p50载体DNA片段5μl混合液7μl、1μl反应缓冲液(Promega公司Ligase缓冲液)、1μl连接酶(Promega公司Ligase)为反应体系，16℃连接过夜。将连接产物转化E.coli菌株JMl09的感受态细胞(方法见《分子克隆》，同上)。将转化的感受态细胞涂于氨苄青霉素LB平板。

挑取氨苄青霉素LB平板上长出的菌落，提取质粒(方法见《分子克隆》碱法提质粒)，然后EcoRI酶切，进行琼脂糖电泳检验，如切出一个大小约7Kb的片段，则初步认为是阳性转化子，从而获得甲肝病毒(HAV)全部开放阅读框架基因的重组质粒，即简称p50-HAV。二、丝状真菌原生质体制备

用无菌水或真菌液体培养基(葡萄糖100g、酵母提取物10g、玉米浆0.5g、加水至1000ml)少许从真菌土豆斜面(PDA斜面，200g马铃薯浸出液、20g葡萄糖、15g琼脂、加水至1000ml)上洗下真菌孢子(米曲霉Apergillus oryzae)，获得孢子悬液。将孢子悬液点种在覆盖真菌固体培养基(真菌液体培养基+1.5％琼脂)上的玻璃纸上，30℃培养过夜。制备新鲜的纤维素酶和蜗牛酶混合酶液(含0.5％纤维素酶+0.5％蜗牛酶的0.6M NaCl溶液)，过滤除菌。将长出真菌斑的玻璃纸从培养基平板上揭下并放入混合酶液中涮洗，洗下真菌斑。将含有真菌斑的混合酶液在37℃保温2小时。显微镜检查是否菌丝已酶解成球形细胞。将酶解好的原生质体液1500rpm低速离心，沉淀用0.6M NaCl液悬浮。然后，再次1500rpm低速离心，将沉淀用少量0.6M NaCl溶液(通常200μl)悬浮，从而得到原生质体悬液。三、原生质体电击转化

将200μl原生质体悬液和20μg重组质粒p50-HAV DNA放入电击小杯，以电压10⁴V，脉冲数2¹⁰，脉冲时间62.5μs、持续时间3.2s为一个循环，进行40个循环电击转化(电穿孔仪Electric Gene Transfer System Baekon 2000，购自Baekon公司)。将电击后混合液置于冰上10分钟，稀释后涂于真菌平板，30℃培养过夜。将长出的小菌落单个挑取，接到土豆斜面上，30℃培养3天。四、丝状真菌阳性转化株的鉴定

提取米曲霉(A。oryzae)转化株全DNA进行转化株的鉴定。提取真菌转化株全DNA。将土豆斜面上转化株转接种到真菌固体平板上，培养3～4天。然后，从平板上取0.2g转化株菌丝体与200μl TE(pH8.0)(含少量巯基乙醇)、200μl饱和酚、少许金钢沙混合，-70℃冻一小时。然后磨碎，12000rpm高速离心，取上清，用饱和酚：氯仿、氯仿各抽提二遍，-20℃乙醇沉淀。

采用DIG酶联免疫Dot Blotting检出阳性转化子。1)探针制备。按DIGLabeling and Detection kit(购自Boehringer公司)方法，将1μg酶切回收的HAV基因片段与dNTP、带DIG标记的dUTP、Klenow混合，37℃保温过夜。然后，沉淀DNA于-20℃保存。2)点样。将提取的米曲霉(A。oryzae)转化株全DNA、阳性对照重组质粒p50-HAV、阴性对照米曲霉(A。oryzae)原始株点于硝酸纤维素膜上，风干。3)DNA变性。将风干的膜用10％SDS液处理3分钟，然后置于变性液(0.5N NaOH、1.5M NaCl)作用5分钟，重复一遍，最后放于中和液(pH7.4，1M Tris-HCl、1.5M NaCl)作用5分钟，重复两遍。风干后，80℃烤干1小时。4)预杂交。将已烘干的膜放入杂交袋，放入适量的预杂交液(5×SSC、1％封闭试剂、0.1％N-月桂酰肌氨酸、0.02％SDS)，68℃水浴过夜。5)探针变性。将适量探针加入100μl预杂交液中，100℃水浴5分钟，然后立即插入冰中。6)杂交。倒出预杂交液，加入含适量变性探针的预杂交液，即杂交液。68℃杂交过夜。7)洗膜。用含2×SSC、0.1％SDS的溶液68℃作用15分钟，重复两遍；然后，用含0.1×SSC，0.1％SDS的溶液68℃作用15分钟，重复两遍。7)显色。用洗液(pH7.5，含0.1M马来酸、0.15M NaCl、0.3％Tween20)洗1～5分钟。然后，加入1％封闭液(pH7.5，含1％封闭试剂、0.1M马来酸、0.15MNaCl)封闭，室温作用30分钟。倒出1％封闭液，加入用1％封闭液稀释的Anti-DIG-AP偶联剂—即抗体溶液，室温作用30分钟。再用洗液洗15分钟，重复两次。最后用检测溶液(pH9.5，含0.1M Tris-HCl，0.1M NaCl，50mMMgCl₂，)平衡后，加入10ml发色低物溶液(含33μl NBT，66μl X-phosphate的检测溶液)。显色后，用TE缓冲液(pH8.0)终止反应。

如果转化株全DNA显出蓝色，与阳性对照相同，那么可以确定此转化株为阳性转化株。也就是说，此阳性转化株中已转入了甲肝病毒(HAV)全部开放阅读框架基因。五、转入丝状真菌中的穿梭质粒回穿梭到E.coli

按上述方法提取HAV阳性丝状真菌转化株的全DNA，然后采用电穿孔法转化E.coli DH5α细胞。将200μl原生质体悬液和20μgDNA放入电击小杯，以电压10⁴V，脉冲数2¹⁰，脉冲时间62.5μs、持续时间3.2s为一个循环，进行40个循环。将电击后混合液置于冰上10分钟，稀释后涂于真菌平板，30℃培养过夜。将长出的小菌落单个挑取，接到土豆斜面上，30℃培养3天。涂青霉素抗性选择平板培养。挑转化子，提取质粒用酶切法(EcoRI)检测阳性。六、甲肝病毒(HAV)全部开放阅读框架基因在米曲霉A.oryzae中表达的鉴定

HAV的提取。将阳性转化株接种于真菌液体培养基，进行28℃液体摇床发酵。培养三天后，纱布过滤菌丝体。液氮冷冻菌丝体，在搅拌机中搅碎，加入0.05M Tris-HCl(pH7.4)缓冲液继续搅碎。纱布过滤搅碎液，向菌丝体中再加入缓冲液再搅碎一次。将两次的过滤液3000rpm，15min离心，取上清。上清液中加入PEG(10g/100ml)、NaCl(2.3g/100ml)，充分搅拌3-4小时，4℃冰箱过夜。8000rpm/min，离心20min，取沉淀。将沉淀重新悬浮于缓冲液中，搅拌悬浮液15min。加入体积比为2∶1的氯仿，充分振荡混匀。10000rpm/min，离心10min，将上清33,000rpm/min，超离心1.5hr，弃上清，将沉淀溶于适量缓冲液，4℃保存。

点杂交检验。分别取5-10μl阳性转化株中提取的HAV样品、阳性HAV、阴性对照米曲霉(A。oryzae)原始株的发酵液的病毒提取液点于硝酸纤维素膜上，风干，用封闭液(1％小牛血清溶于包被液)43℃封闭1hr。弃去封闭液，加入适量的酶标抗体，43℃反应1hr。将膜浸在洗液(0.85％生理盐水，0.05％Tween-20)中1-2min。将膜浸在发色液(12.5ml 0.2M Na₂HPO₄，12.1ml0.1M柠檬酸，0.07ml 3％H₂O₂，40mg邻苯二胺，25ml蒸馏水)中，避光发色0-15min。阳性对照产生黄褐色，阴性对照无色，阳性转化株中提取的HAV样品亦产生黄褐色，证明阳性转化株中有甲肝病毒(HAV)全部开放阅读框架基因的表达。

ELISA检验(北京生物制品研究所提供试剂盒)。在微量反应板上每孔加入100μl包被液(2.39g NaHCO₃，1.59g Na₂CO₃，加蒸馏水至1000ml)，再分别在每孔中加入100μl倍比稀释的阳性转化株中提取的HAV样品、阳性HAV、阴性对照米曲霉(A。oryzae)原始株的发酵液的病毒提取液。放入4℃冰箱过夜。取出板，倒出包被液，用洗液(0.85％生理盐水，0.05％Tween-20)洗涤三次。每孔加入100μl酶标抗体，43℃水浴1hr。回收每孔的酶标抗体，用洗液(0.85％生理盐水，0.05％Tween-20)洗涤孔二次。每孔加入100μl发色液(12.5ml 0.2MNa₂HPO₄，12.1ml 0.1M柠檬酸，0.07ml 3％H₂O₂，40mg联苯二胺，25ml蒸馏水)，避光发色0-40min，每孔加入50μl硫酸终止反应。阳性转化株中提取的HAV样品的P/N值约10。

免疫电镜观察并照相。将阳性转化株中提取的HAV样品于15,000rpm/min，4℃离心30min，取上清稀释成不同稀释度，分别加入相同浓度的抗体，混合后4℃冰箱过夜。15,000rpm，4℃离心30min，将沉淀溶解至5-10μl，点铜网，电镜(日立H600型)放大40,000倍观察，并获得了与HAV颗粒大小相同的直径为27-32nm的病毒颗粒照片。见附图说明书，图5。

免疫双向琼脂扩散检验。将阳性转化株中提取的HAV样品作为抗原制备抗血清。参照《医用实验病毒学》第153页“双向琼脂扩散检验”方法，进行免疫双向琼脂扩散实验。在阳性转化株中提取的HAV样品与抗血清之间产生沉淀线，在阴性对照米曲霉(A。oryzae)原始株的发酵液的病毒提取液与抗血清之间没有沉淀线产生。实施例3：用p50载体表达乙肝病毒表面抗原(HBsAg)并在米曲霉(A.oryzae)内装配成病毒颗粒一、构建乙肝病毒表面抗原(HBsAg)基因的重组表达质粒

乙肝病毒表面抗原(HBsAg)基因来源于质粒pAFH8HB(刘宏迪等，微生物学报30(2)：98-104，1990)。该基因两端为BglII粘性末端，同实施例2(一)的方法，将此基因与p50连接，构建并筛选出了乙肝病毒表面抗原(HBsAg)基因的重组表达质粒，即简称p50-HBsAg。二、丝状真菌原生质体制备

同实施例2的方法。三、原生质体电击转化

同实施例2的方法。四、丝状真菌阳性转化株的鉴定

同实施例2的方法。五、转入丝状真菌中的穿梭质粒回穿梭到E.coli

同实施例2的方法，采用DIG酶联免疫Dot Blotting检出阳性转化子。六、乙肝病毒表面抗原(HBsAg)基因在米曲霉A.oryzae中表达的鉴定

同实施例2的方法，点杂交检验，阳性转化株中提取的HBV样品产生黄褐色，证明阳性转化株中有乙肝病毒表面抗原(HBsAg)基因的表达。同实施例2的方法，ELISA检验出阳性转化株中提取的HAV样品的P/N值约20。同实施例2的方法，免疫电镜观察并照相，获得了与HBV颗粒大小相同的直径为22nm的病毒颗粒照片。实施例4：用p50载体表达乙肝病毒表面抗原(HBsAg)并在黑曲霉

        (A.niger)内装配成病毒颗粒一、构建乙肝病毒表面抗原(HBsAg)基因的重组表达质粒

同实施例3方法，构建并筛选出了乙肝病毒表面抗原(HBsAg)基因的重组表达质粒，即简称p50-HBsAg。二、丝状真菌原生质体制备

同实施例2的方法。三、原生质体电击转化

同实施例2的方法。四、丝状真菌阳性转化株的鉴定

同实施例2的方法。五、转入丝状真菌中的穿梭质粒回穿梭到E.coli

同实施例2的方法，采用DIG酶联免疫Dot Blotting检出阳性转化子。六、乙肝病毒表面抗原(HBsAg)基因在黑曲霉A.niger中表达的鉴定

同实施例2的方法，点杂交检验，阳性转化株中提取的HBV样品产生黄褐色，证明阳性转化株中有乙肝病毒表面抗原(HBsAg)基因的表达。同实施例2的方法，ELISA检验出阳性转化株中提取的HAV样品的P/N值约20。同实施例2的方法，免疫电镜观察并照相，获得了与HBV颗粒大小相同的直径为22nm的病毒颗粒照片。见附图说明书，图6。实施例5：用人的神经生长因子表达载体(pSNB7)在米曲霉中表达有活性的人的神经生长因子(hNGF)一、构建人的神经生长因子的重组表达质粒(pSNB7)

见实施例1B。二、丝状真菌原生质体制备

见实施例2。三、原生质体电击转化

见实施例2。四、丝状真菌阳性转化株的鉴定提取米曲霉(A。oryzae)转化株全DNA进行转化株的鉴定。将土豆斜面上转化株转接种到真菌固体平板上，培养3～4天。然后，从平板上取0.2g转化株菌丝体与200μl TE(pH8.0)(含少量巯基乙醇)、200μl饱和酚、少许金钢沙混合，-70℃冻一小时。然后磨碎，12000rpm高速离心，取上清，用饱和酚：氯仿、氯仿各抽提二遍，-20℃乙醇沉淀。

采用PCR的方法检出阳性转化子。取下列引物(由微生物所中心实验室合成)：引物1：5’-CCAAGCTTGTCATCATCCCATCCCATCT-3’引物2：5’-CGGATCCTATCTCACAGCCTTCCTGCTG-3’

50μl反应体积：引物1，2各加50pmol，质粒DNA 0.1μg，2.5mM 4×dNTP4μl，Taq酶1unit，Taq酶10×缓冲液5μl，灭菌无离子水加至50μl。PCR反应条件：95℃ 1min、56℃ 1min、72℃ 2min，25个循环。1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测有一条约360bp大小的带。证明此为阳性转化株。电就是说，此阳性转化株中已转入了人的神经生长因子基因。五、转入丝状真菌中的穿梭质粒回穿梭到E.coli

称取10g干重菌丝，提取真菌的全DNA。采用CsCl-EB连续梯度平衡离心分离质粒，方法详见《分子克隆》第二版28-30页。CsCl浓度为1g/ml，溶液终密度为1.55g/ml，EB(溴化乙锭)终浓度为740μg/ml。转头采用Beckman Ti35，4℃45000转离心24小时。紫外灯下观测除底部的RNA外有两条DNA带，穿刺取下面的带。然后转化E.coli DH5α感受态细胞。在青霉素抗性选择平板培养。挑转化子，提取质粒用酶切、PCR法检测阳性。六、hNGF外泌表达的检测

ELISA检测。将菌株BEN1.1(pSNB7质粒转入米曲霉的菌株)接入真菌液体培养基，30℃下在摇床上培养3天，纱布过滤，取上清。采用直接法进行检测(详见杜平编著的《医用实验病毒学》221页)，以上清+包被缓冲液(见实施例2)进行包被，以PBS(PH7.0 0.05M)缓冲液作为稀释液，以PBS+0.5％Tween20作为洗涤液，Anti-hNGF(sigma公司)稀释40倍作为工作浓度。最后检测P/N值高达20。

Western印迹法检测。1)SDS-PAGE电泳：发酵上清液用丙酮沉淀得到总蛋白。取BEN1.1、米曲霉(空白)各10-20μg蛋白，按《分子克隆》第二版上的方法电泳。2)转膜：石墨底槽放2张用阳极缓冲液I(0.3M Tris、20％甲醇)浸湿的滤纸，再在其上放2张用阳极缓冲液II(0.025M Tris、20％甲醇)湿透的滤纸；然后放上硝酸纤维素膜，在膜上放上电泳后的聚丙烯酰胺胶，最后在胶上放2张用阴极缓冲液(40mM甘氨酸、50mM Tris、20％甲醇)浸湿的滤纸。除气泡，盖紧石墨盖，通电(0.65mA/cm² gel)1小时。3)抗体结合：将放入杂交袋的硝酸纤维素膜用封闭液(pH8.0，0.01M Tris-HCl、0.15M NaCl、0.05％Tween20、1％BSA)进行预杂交(0.1ml/cm²NC)，室温振荡1小时。倒出预杂交液后，加入用封闭液稀释的I抗血清(Anti-hNGF)，室温振荡1小时。然后，用TBST(pH8.0，0.01M Tris-HCl、0.15M NaCl、0.05％Tween20)洗10分钟，再用TBS洗10分钟，重复两次。洗膜后，加入用封闭液稀释的Anti-rabbit IgG(F_c)ApConjμgate，室温振荡1小时。如上述方式洗膜。4)显色：加入显色液(pH9.5，100mM Tris-HCl、5mM MgCl₂、以及适量NBT和BCIP)，37℃避光保温3-6分钟，显色后用TE缓冲液(pH8.0)终止反应。

生物活性检测。样品送至军事医学科学院，将表达产物人的NGF加入培养7天的鸡胚背根神经节和新生小鼠背根神经节的原代培养细胞中，以从生物组织中提取的NGF为阳性对照，通过感觉神经元突起的生长进行了确认。见说明书附图，图7。实施例6：用人溶菌酶表达载体在丝状真菌中表达人溶菌酶基因一、构建人溶菌酶基因的重组表达质粒

见实施例1C。二、丝状真菌原生质体制备

用无菌水或真菌液体培养基(葡萄糖100g、酵母提取物10g、玉米浆0.5g、加水至1000ml)少许从真菌土豆斜面(PDA斜面，200g马铃薯浸出液、20g葡萄糖、15g琼脂、加水至1000ml)上洗下真菌孢子(米曲霉Apergillus oryzae)，获得孢子悬液。将孢子悬液点种在覆盖真菌固体培养基(真菌液体培养基+1.5％琼脂)上的玻璃纸上，30℃培养过夜。制备新鲜的纤维素酶和蜗牛酶混合酶液(含0.5％纤维素酶+0.5％蜗牛酶的0.6M NaCl溶液)，过滤除菌。将长出真菌斑的玻璃纸从培养基平板上揭下并放入混合酶液中涮洗，洗下真菌斑。将含有真菌斑的混合酶液在37℃保温2小时。显微镜检查是否菌丝已酶解成球形细胞。将酶解好的原生质体液1500rpm低速离心，沉淀用0.6M NaCl液悬浮。然后，再次1500rpm低速离心，将沉淀用少量0.6M NaCl溶液(通常200μl)悬浮，从而得到原生质体悬液。三、原生质体电击转化

将200μl原生质体悬液和20μg重组质粒pBPV-hLY DNA放入电击小杯，以电压10⁴V，脉冲数2¹⁰，脉冲时间62.5μs、持续时间3.2s为一个循环，进行40个循环电击转化(电穿孔仪Electric Gene Transfer System Baekon 2000，购自Baekon公司)。将电击后混合液置于冰上10分钟，稀释后涂于真菌平板，30℃培养过夜。将长出的小菌落单个挑取，接到土豆斜面上，30℃培养3天。四、丝状真菌阳性转化株的鉴定

提取米曲霉(A。oryzae)转化株全DNA进行转化株的鉴定。将土豆斜面上转化株转接种到真菌固体平板上，培养3～4天。然后，从平板上取0.2g转化株菌丝体与200μl TE(pH8.0)(含少量巯基乙醇)、200μl饱和酚、少许金钢沙混合，-70℃冻一小时。然后磨碎，12000rpm高速离心，取上清，用饱和酚：氯仿、氯仿各抽提二遍，-20℃乙醇沉淀。

采用DIG酶联免疫Dot Blotting检出阳性转化子。1)探针制备。按DIGLabeling and Detection kit(购自Boehringer公司)方法，将1μg酶切回收的溶菌酶基因片段与dNTP、带DIG的dUTP、Klenow混合，37℃保温过夜。然后，-20℃保存。2)点样。将提取的米曲霉(A.oryzae)转化株全DNA、阳性对照重组质粒pBPV-hLY、阴性对照米曲霉(A.oryzae)原始株点于硝酸纤维素膜上，风干。3)DNA变性。将风干的膜用10％SDS液处理3分钟，然后置于变性液(0.5N NaOH、1.5M NaCl)作用5分钟，重复一遍，最后放于中和液(pH7.4，1M Tris-HCl、1.5M NaCl)作用5分钟，重复两遍。风干后，80℃烤干1小时。4)预杂交。将已烘干的膜放入杂交袋，放入适量的预杂交液(5×SSC、1％封闭试剂、0.1％N-月桂酰肌氨酸、0.02％SDS)，68℃水浴过夜。5)探针变性。将适量探针加入100μl预杂交液中，100℃水浴5分钟，然后立即插入冰中。6)杂交。倒出预杂交液，加入含适量变性探针的预杂交液，即杂交液。68℃杂交过夜。7)洗膜。用含2×SSC、0.1％SDS的溶液68℃作用15分钟，重复两遍；然后，用含0.1×SSC，0.1％SDS的溶液68℃作用15分钟，重复两遍。7)显色。用洗液(pH7.5，含0.1M马来酸、0.15M NaCl、0.3％Tween20)洗1～5分钟。然后，加入1％封闭液(pH7.5，含1％封闭试剂、0.1M马来酸、0.15M NaCl)封闭，室温作用30分钟。倒出1％封闭液，加入用1％封闭液稀释的Anti-DIG-AP偶联剂—即抗体溶液，室温作用30分钟。再用洗液洗15分钟，重复两次。最后用检测溶液(pH9.5，含0.1M Tris-HCl，0.1M NaCl，50mM MgCl₂，)平衡后，加入10ml发色低物溶液(含33μl NBT，66μl X-phosphate的检测溶液)。显色后，用TE缓冲液(pH8.0)终止反应。

如果转化株全DNA显出蓝紫色，与阳性对照相同，那么可以确定此转化株为阳性转化株。也就是说，此阳性转化株中已转入了人溶菌酶基因。五、抗血清制备用于Western印迹法

配制天然人溶菌酶抗原溶液：11mg人溶菌酶溶于5.5ml无离子水，-20℃配制完全佐剂：9份液体石蜡、1份羊毛脂、1mg卡介苗混合后，研钵磨成乳浊液，4℃保存。挑选实验用家兔2只，体重各约3公斤。常规免疫注射，耳静脉采抗血清。首先，用蘸二甲苯的脱脂棉球摩擦耳部，使血管充分扩张；然后，用酒精棉涂去二甲苯，将针头刺入血管，血即淌出。采血可达20ml。采血结束后，用脱脂棉压迫采血点2～3分钟，即可止血。将采集到的血液4000g离心，分离得血清。然后过滤除菌，制成冷冻干粉。六、人溶菌酶基因在米曲霉A.oryzae中诱导表达及外泌的鉴定

重组质粒pBPV-hLY含鼠摄金蛋白启动子，以Cd²⁺等重金属离子为诱导物能激活它，使它大量表达插入的外源基因产物。因此，培养液中加入一定浓度氯化镉可以诱导插入pBPV的人溶菌酶基因表达。

将发酵上清浓缩并用透析袋透析，同时将磨碎菌丝体、12000rpm离心后的上清液透析浓缩，然后进行15％SDS-PAGE电泳(参考《分子克隆》方法)。

Western印迹法鉴定人溶菌酶蛋白存在。1)转膜。放三张滤纸于正极侧的多孔垫片上，用转移缓冲液(39mM甘氨酸、48mM Tris、0.037％SDS、20％甲醇)浸湿；然后放上已浸湿的硝酸纤维素滤膜，再放上SDS-PAGE胶；最后，放三张已浸湿的滤纸在胶上，并将两侧多孔垫片夹好插入转移槽中。加入3升转移缓冲液，进行电转移(电流1.5A)。2)抗体结合。将放入杂交袋的硝酸纤维素膜用封闭液(pH8.0，0.01M Tris-HCl、0.15M NaCl、0.05％Tween20、1％BSA)进行预杂交(0.1ml/cm²膜)，室温振荡1小时。倒出预杂交液后，加入用封闭液稀释的I抗血清(人溶菌酶兔抗血清)，室温振荡1小时。然后，用TBST(pH8.0，0.01M Tris-HCl、0.15M NaCl、0.05％Tween20)洗10分钟，再用TBS洗10分钟，重复两次。洗膜后，加入用封闭液稀释的Anti-rabbit IgG(F_c)Ap偶联剂，室温振荡1小时。如上述方式洗膜。3)显色。加入10ml显色液(pH9.5，100mMTris-HCl、5mM MgCl₂、以及33μl NBT和66μl BCIP)，37℃避光保温3-6分钟，显色后用TE缓冲液(pH8.0)终止反应。

实验结果表明，与阳性对照天然人溶菌酶(Sigma公司产品)对应的位置上，加100μg氯化镉的发酵上清和菌丝体提取液也显相同的蓝紫色，说明发酵产物与Sigma公司的天然人溶菌酶有相同的特异性抗原抗体反应，一定浓度的Cd2+能成功诱导表达并外泌人溶菌酶蛋白。七、米曲霉(A.oryzae)诱导表达并外泌的人溶菌酶生物活性测定

根据文献，我们采用测定天然溶菌酶的通用方法测定表达的人溶菌酶生物活性。同上，将阳性转化株接种于真菌液体培养基，进行30℃液体发酵。发酵24小时后，以每100毫升培养液加终浓度为100μg氯化镉，平行加入阳性转化株培养液进行诱导发酵两天。最后，用纱布过滤分离菌丝体，并分别保存发酵上清和菌丝体。

分别测定发酵上清和菌丝体提取液。配制OD₄₅₀≈0.3的Micrococcuslysodeikticus悬液(pH6.4，含50mM磷酸盐和50mM NaCl)。将300μl发酵上清液与1.2mlM.lysodeikticus悬液混合，测OD₄₅₀。37℃保温10分钟后，再测OD₄₅₀。从而，我们测出了发酵上清液的酶活：酶活力＝OD₄₅₀差值/(0.3×10)×10⁶(单位/升发酵上清液)

酶活单位的定义：在上述条件下，于450nm光波长处，每分钟使吸光度降低0.001所需的酶量。

实验证明，发酵上清和菌丝体提取液中都有溶菌酶酶活，也就是说，在米曲霉(A.oryzae)阳性转化株发酵上清和菌丝体中都存在具有生物活性的人溶菌酶。八、氯化镉最适诱导条件的研究

培养液中氯化镉浓度的不同对阳性转化株的诱导效应是不同的。如果氯化镉浓度太低，那么将无法激活摄金蛋白启动子，当然无法诱导人溶菌酶基因表达；如果氯化镉浓度太高，反而将使A.oryzae代谢和分裂生长受抑制，从而也无法高效表达人溶菌酶。因此，摸索出最佳的诱导物浓度是完全必要的。

以不同浓度氯化镉诱导人溶菌酶表达并且测定酶活。两次实验结果(见图3a中曲线A、曲线B)表明，1.25μg/ml发酵液的氯化镉诱导浓度可能是最佳的。根据以上实验摸索出的条件，在其它条件如氯化镉加入时间等固定的前提下，以每100ml517号转化株培养液加入0、50、75、100、125、150、175、200μg的氯化镉，测定发酵上清液及菌体粗提液的酶活。以此数据作氯化镉最适诱导浓度曲线，如图3b为氯化镉最适诱导浓度曲线，图3c为氯化镉诱导的菌体内酶活。

由氯化镉最适诱导浓度曲线可知，在其他条件一定时，培养液中1.25μg/ml的氯化镉诱导终浓度为最适诱导浓度；在此氯化镉诱导浓度下，发酵液中最大的人溶菌酶外泌量为50000单位/升，即发酵液中人溶菌酶量为0.5mg/l(按文献报道方法换算，Kozo Tsuchiya et al.Appl.Microbiol.Biotechnol.38：109-114)。九、重组质粒pBPV-hLY为独立自主复制的穿梭质粒的研究

我们利用Western印迹法和重组质粒pBPV-hLY的回穿梭来验证该重组质粒为独立自主复制的穿梭质粒。

利用Western印迹法，我们能证明重组质粒pBPV-hLY在丝状真菌中是否以游离状态存在。Westem印迹法过程为：1)样品电泳。提取米曲霉阳性转化子全DNA(见标题四内容)，然后将全DNA样品、阳性对照重组质粒pBPV-hLY、阴性对照原始米曲霉全DNA点样走琼脂糖电泳，25V。2)胶变性。电泳完毕后，将凝胶置于1.5M NaCl、0.5M NaOH中浸泡45分钟并且不断振荡，使DNA变性。3)胶中和。将凝胶置于无离子水中漂洗后，浸泡于1M Tris-HCl(pH7.4)、1.5MNaCl溶液中，不断振荡15分钟，重复两次。4)转膜。将两张长条滤纸放在转移槽平台上，滤纸两端伸入两侧装有10×SSC的槽中。待滤纸湿透后，赶出气泡而后将凝胶背面朝上放于湿滤纸上，除气泡。用保鲜膜围绕凝胶四周，然后把已浸湿的尼龙膜置于其上，除气泡。在尼龙膜上再放两张湿滤纸，除气泡。最后，将一打纸巾放在滤纸上，并用一个约500克的重物压在最上面。持续24小时。5)膜烘干。取下尼龙膜，放入6×SSC中室温泡10分钟。然后，取出晾干。将晾干的尼龙膜放于80℃烘干2小时。6)杂交。取出后，采用上述方法(见标题四内容)进行DIG酶联杂交。

实验证实，与阳性对照重组质粒pBPV-hLY相对应的位置上，米曲霉(A.oryzae)阳性转化株的全DNA提取物有相同的蓝紫色，即米曲霉(A.oryzae)阳性转化株中，重组质粒pBPV-hLY以独立自主复制的方式游离存在。

进行转入丝状真菌中的穿梭质粒回穿梭到E.coli的实验方法，我们可以证实重为穿梭质粒。提取真菌的全DNA，然后以电压5kv，脉冲数2⁸，脉冲时间62.5us，持续时间3.2s为一个循环，进行两个循环完成电击转化新鲜培养的E.coliDH5α。涂氨苄青霉素抗性选择平板培养。挑转化子，提取质粒(见《分子克隆》，同上)按上述方法酶切、PCR法、Southern印迹法检测阳性。

上述穿梭质粒回穿梭到E.coli的实验表明，在米曲霉(A.oryzae)中的重组质粒pBPV-hLY能穿梭回E.coli，也即穿梭质粒。

Claims (12)

1.一类可以在丝状真菌中独立复制、在丝状真菌和大肠杆菌中独立穿梭的载

体质粒，其特征在于所述质粒含有下述主要功能片段：

a)牛的乳头瘤病毒(BPV)片段；

b)丝状真菌的外源生物启动子；

c)pBR322质粒的PvuII和BamHI片段，包括转录起始位点和氨苄抗性

基因。

2.根据权利要求1的载体质粒，其中用于转化的宿主菌是丝状真菌。

3.根据权利要求1或2的载体质粒，其中的外源生物启动子是MT、SV40

或35S启动子。

4.一种用丝状真菌表达系统生产多肽的方法，包括用权利要求1所述的独立

自主复制的穿梭载体质粒在丝状真菌中表达所述的多肽基因。

5.根据权利要求4的方法，其中的宿主菌是丝状真菌。

6.根据权利要求4或6的方法，其中的启动子为MT、SV40或35S启动子。

7.根据权利要求4的方法，其中被表达的基因是与丝状真菌异源的任何外源

基因。

8.根据权利要求7的方法，其中的外源基因是人β-NGF基因。

9.根据权利要求7的方法，其中的外源基因是HBsAg基因。

10.根据权利要求7的方法，其中的外源基因是HAV基因。

11.根据权利要求10的方法，其中的外源基因是HAV全部阅读框架基因。

12.根据权利要求7的方法，其中的外源基因是人溶菌酶基因。

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