CN1162546C - 基于体内同源重组的构建遗传工程生物体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种将所需要的、两端带有载体片段同源序列的线性化外源基因表达单元与线性化的特定表达载体共转化特定生物体，通过体内同源重组构建遗传工程生物体的方法，以及用该方法获得的遗传工程生物体及其用途。

Description

基于体内同源重组的构建遗传工程生物体的方法

技术领域

本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种构建遗传工程生物体的方法以及获得的遗传工程生物体的用途。

背景技术

酵母菌是一类单细胞真核生物。人类对酵母菌，尤其是酿酒酵母的应用，具有悠久的历史，积累了大量的经验。同时，由于人们对酵母生物学和分子生物学已积累了丰富的知识，所以，在国际上建成大肠杆菌基因工程表达系统后不久，酵母的基因工程表达系统也很快被建成，目前，它已是表达外源基因的最重要的表达系统之一。酿酒酵母作为单细胞生物，一方面在生产和操作上具有细菌表达系统易于大规模扩增的特点，另一方面又具有真核细胞对蛋白质的翻译后加工及修饰过程，如：二硫键的正确形成、前体蛋白的水解加工、糖基化作用等。目前已发展和建立了多种酿酒酵母表达系统的表达载体，其中以整合型(YIp)载体和附加体型(YEp)载体最为重要。整合型载体不含自主复制序列(ARS)，而是被整合到酵母宿主菌的染色体上，这类载体的优点是稳定性好，但它的缺点是拷贝数低。附加体型载体，由于含有来自酵母天然质粒2μ部分或全部序列，能够在酵母体内自主复制，它在细胞内的拷贝数通常可达30拷贝左右，但在非选择条件下多不稳定。目前广泛应用的表达载体大多为大肠杆菌—酵母菌穿梭质粒，具有大肠杆菌中复制扩增所需的序列，而这部分序列被证实对酵母菌有—定的毒性(Kaoru A，Akira N，Hiroyuki A and Yasuji O：Automaticelimination of unnecessary bacterial sequences from yeast vectors.Gene 121 1992 161-165)，影响质粒在宿主体内的稳定性及外源基因的表达(Dale L，Carlo V et al：The 2μm plasmid as anonselectable，stable，high copy number yeast vector.Plasmid 25 1991 81-95)。

酿酒酵母一直都被认为是研究同源重组的模式生物，研究表明，在酿酒酵母中，线性化的DNA片段可以有效的提高重组的发生频率(Martin K：Damage-induced recombination inthe yeast Saccharomyces cerevisiae.Mutation Research 451 2000 91-105)，这一特性使利用同源重组进行基因工程操作的技术在酿酒酵母中得到了广泛的应用。目前主要的应用包括：(1)将特定的DNA片段重组整合到染色体上(Kaiser，C.et al.： Methods in Yeast Genetics.ColdSpring Harbor Laboratory Press，1994 Cold Spring Harbor，NY.)；(2)基因中断、基因置换，即利用DNA重组将载体中的片段插入染色体中，造成基因功能缺失或由目的基因片段完全替代染色体上的基因；(3)构建表达载体。目的基因片段两端含有与质粒序列上同源的部分，就可以在酵母体内通过重组与线性化的质粒“连接”而获得所需的表达载体(Kevin R.Oldenburg，Kham T.Vo，Susan Michaelis and Chris Paddon：Recombination-mediatedPCR-directed plasmid construction in vivo in yeast.Nucl Acids Res 25(2)1997 451-452)。这种方法不依赖于是否存在合适的限制性内切酶位点。在一些酵母的基因中断实验中证实：30-50bp的同源区段就可以进行有效的体内重组(A，Lacroute F，Cullin C.：A simple andefficient method for direct gene deletion in Saccharomyces cerevisiae.Nucleic Acids Res21(14)1993 Jul 11 3329-30)，也就是说完全可以将同源区段作为PCR引物的一部分来合成。另有一些系统性的实验表明在同源整合实验中同源区段的大小只需15bp就可以得到重组克隆了(Manivasakam P，Weber SC，McElver J，Schiestl RH.：Micro-homology mediated PCRtargeting in Saccharomyces cerevisiae.Nucleic Acids Res 23(14)1995 Jul 25：2799-2800)。

但是，建成的表达载体都比较大，在细胞中的稳定性迄待提高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于体内同源重组的构建遗传工程生物体的方法，这种方法使外源基因表达单元能够在遗传工程生物体中稳定存在。

本发明的目的还在于提供利用这种方法获得的遗传工程生物体，尤其是表达具有商业价值的基因工程产品的酵母基因工程菌株。

本发明提出的基于体内同源重组的构建遗传工程生体的方法，是将所需要的、两端带有载体片段同源序列的线性化外源基因表达单元与线性化的特定表达载体共转化特定生物体，外源基因表达单元与特定表达载体进行遗传重组，载体的非必要序列被外源基因表达单元替换，所得到的带有外源基因表达单元的遗传工程生物体中，外源基因表达单元能够稳定存在和高效率表达外源基因产物。

本发明的具体步骤如下：

1、载体的线形化：载体利用适当的限制性内切酶进行酶切，然后收集适当大小的片段，此即为线形化的载体；

2、获得两端带有和线性化的载体片段同源的序列的表达单元；

3、将线形化的载体与步骤2所述的表达单元分别共转化适当的生物体；

4、鉴定转化子。取少量转化子对它们进行表达单元存在情况、表达水平的测定和转化子中质粒稳定性的分析。

本发明中，所述的遗传工程生物体包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、细菌和真菌。

本发明中，所述的外源基因包括编码干扰素、乙型肝炎病毒表面抗原、促红细胞生成素、人血清白蛋白、人超氧化物歧化酶、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子受体I和II、白细胞介素-1，白细胞介素-2及其受体等的基因。

本发明中，所述的载体是含有以完整2μ质粒为基础。

本发明中，所述的载体同源序列，其同源区段碱基数目15-60bp。

本发明中，所述的真菌为酵母，包括酿酒酵母、克鲁维酵母、假丝酵母、红酵母、粟酒裂殖酵母等。

本发明中，所述的细菌是枯草杆菌或大肠杆菌。

上述酵母中，特别是含有表达乙型肝炎病毒SA-28融合抗原的酵母基因工程菌DCO4/pHC11R-SA-28或表达乙型肝炎病毒表面抗原和其他融合抗原的酵母基因工程菌。

上述酵母中，特别是含有表达人α2a或α2b干扰素的酵母基因工程菌DCO4/pHC11R-IFNα2a，或DCO4/pHC11R-IFNα2b，或表达其他人干扰素的酵母基因工程菌。

上述酵母中，特别是用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或巴氏毕氏酵母(Pichiapastoris)。

采用上述方法获得了外源基因表达单元稳定性明显提高的遗传工程生物体的，外源基因的表达水平也较其他方法显著提高。

附图说明

图1：采用该方法构建酵母基因工程菌的路线。其中，(A)：pHC11R-SA-28的构建；(B)：pHC11R-IFNα2a的构建。

图2：pHC11R-SA-28转化子的PCR鉴定。其中，1-10：PCR模板为转化子DCO4/pHC11R-SA-28总DNA，pHC11SA-28：PCR模板为转化子DCO4/pHC11SA-28总DNA，pHC11R：PCR模板为载体片段pHC11R自连DNA，pHC11SA-28质粒对照：PCR模板为pHC11SA-28质粒DNA，marker：λ-HindIII marker。

图3：pHC11R-IFNα2a转化子的PCR鉴定。其中，1-6：PCR模板为转化子DCO4/pHC11R-IFNα2a转化子，pHC11-IFNα2a：PCR模板为转化子DCO4/pHC11-IFNα2a的总DNA，pHC11-IFNα2a质粒对照：PCR模板为pHC11-IFNα2a质粒DNA，marker：λ-HindIII marker。

图4：pHC11R-SA-28转化子表达水平的ELISA测定结果。其中，Y轴为ELISA测定中的吸光度值，与乙肝表面抗原活性成正比。阴性为空白样品测定，对照为pHC11 SA-28转化的高表达工程菌的表达产物活性测定，1～10为pHC11R-SA-28的10个不同转化子的表达产物活性测定。

图5：重组转化子表达干扰素α2a蛋白电泳结果。其中，1～6：6个不同的pHC11R-IFNα2a转化子表达产物，对照：pHC11-IFNα2a转化子表达产物对照，M：分子量Marker。

图6：转化子中质粒稳定性。

具体实施方式

下面通过构建酵母基因工程菌的例子具体描述本发明方法。

构建的步骤如图1(A)及图1(B)所示：

1.载体pHC11R的线形化：载体pHC11R经SalI和BglI同时酶切，然后收集8.7Kbp的大片段，此即为线形化的载体pHC11R。

2.PCR扩增乙型肝炎病毒融合抗原SA-28或人α2a干扰素的表达单元DNA，获得的产物两端带有和线性化的载体片段同源的50bp序列。

3.将线形化的载体pHC11R和PCR扩增的乙型肝炎病毒融合抗原SA-28表达单元或人αA干扰素表达单元分别共转化酿酒酵母DCO4 cir⁰ leu2 ade1。

4.取少量转化子对它们进行表达单元存在情况、乙型肝炎病毒融合抗原SA-28或人α2a干扰素表达水平的测定和转化子中质粒稳定性的分析。对转化子的鉴定结果如下：

10个SA-28转化子中只有4号未扩增出表达单元片段(图2)，也不能表达SA-28(图4)，可能是线形化pHC11的自连；其余九个转化子都能扩增出表达单元片段(图3)，SA-28的表达水平有差别，其中1号和7号表达水平最高，想当于原工程菌的3倍多(图4)，质粒在酵母细胞中的稳定性也明显高于原工程菌(图6)。

6个人α2a干扰素转化子全部都能扩增出表达单元片段(图3)，从电泳胶上可以看出6个转化子都有人α2a干扰素的表达，表达量都明显高于原工程菌(图5)。5号转化子中质粒稳定性也略高于原工程菌(图6)。

进一步的操作过程如下：

1、质粒DNA的提取用试剂盒快速制备少量质粒DNA：(博彩公司试剂盒)。

将过夜培养的3ml细菌，高速离心1min，彻底去除上清。

加入100μl Solution I，用振荡器充分悬浮细胞。加入200μl Solution II，立即上下颠倒或用手指弹管底，使细菌裂解，室温放置2mins，使溶液变成澄清。加入400μl SolutionIII，立即上下颠倒5-10次，使之充分中和，室温放置2mins。

取出2ml样品收集管和3S柱，在管壁上标上样品号，将前一步的上清全部转移到3S柱里。室温放置2mins，室温离心12,000rpm，1min。

取下3S柱，弃去收集管中的废液，将3S柱放入同一收集管中，吸取700μl Wash Solution到3S柱，高速离心1min，并重复该步骤一次。取下3S柱，弃去收集管中的废液，将3S柱放入同一收集管中，高速离心5mins。

将3S柱放入干净的1.5ml离心管中，在3S柱膜中央加50μl TE，室温离心5mins。

2、DNA的酶切和载体片段的回收

将制备好的pHC11R质粒DNA，用BglI和SalI酶切。

在琼脂糖凝胶电泳分离片段，割下含有8.7Kbp的大片段DNA的琼脂糖块，放入1.5ml离心管，按每100mg琼脂糖加入300～600μl S1液，置55℃水浴10mins，待琼脂糖块完全融化后，加入1/10 S1体积的异丙醇，混匀，55℃温浴1min。

将融化后的Agarose液移入吸附柱，高速离心1min，倒掉收集管中液体，再将吸附柱放入同一收集管中，在吸附柱中加入450μl W1液，静置1min后，离心15secs，倒掉收集管中液体，再将吸附柱放入同一收集管中，在吸附柱中加入450μl W1液，离心15secs，倒掉收集管中液体，再将吸附柱放入同一收集管中。

离心3mins，将吸附柱放入一个干净的1.5ml Eppendorf管，在吸附膜中央加入30μlT1液，静置1min，高速离心1min，-20℃贮存。

(本实验步骤由上海华舜生物工程有限公司提供)

3、PCR反应

PCR引物的设计：

每条引物包括2个部分：大约50bp左右的同源区段，分别和线性化载体片段的5’段和3’段同源；另一部分是PCR反应所需与模板配对部分，大约25bp左右，在5’引物序列中为酿酒酵母的ADH2-GAPDH融合启动子(诱导型启动子)或PGK1启动子(组成型启动子)的5’端序列、在3’引物中为ADH1终止子的3’序列。合成的PCR引物的序列如下：

5’PCR引物：

①76nts：下划线部分为载体片段BglI端同源的部分(50nts)，

         斜体部分为PADH2-GAPDH 5’端序列(26nts)

TAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCGGATCCTTCAATATGCGCACATACGC

②68nts：下划线部分为载体片段BglI端同源的部分(44nts)，

         斜体部分为或PPGK1 5’端序列(24nts)

CGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCGGATCCACAGGACGGGTGTGGTCG

3’PCR引物：

76nts：下划线部分为载体片段SalI端同源的部分(50nts)，

         斜体部分为TADH1 3’端序列(26nts)

AAAGTTCCCTCAAGAATTTTACTCTGTCAGAAACGGCCTTAACGACGTAGCCCGTGTGGAAGAACGATTACAACAGG

反应体系：

        模板DNA：50～100ng

          15pM 5’引物：1.0μl

          15pM 3’引物：1.0μl

          10mM dNTP：0.5μl

          10×ExTaq buffer：5μl

          5U/μl ExTaq：1.0μl

          补水至总体积为：50μl

反应程序：

          95℃  5mins     1cycle

          94℃  30secs

          58℃  30secs    30cycles

          72℃  2mins

          72℃  10mins    1cycle

4、酿酒酵母转化  醋酸锂LiAc化学转化法

从平板上挑取1个单菌落的受体菌(DCO4 cir⁰ leu2 ade1)，接种于3ml YEPD，30℃摇床培养16～24hr。

转接过夜菌于50ml YEPD中，使得起始浓度为OD600＝0.1，30℃培养4～5hr至OD600＝0.4。离心，5,000rpm，5mins，收集菌体，并用无菌水洗涤两次。

用10ml无菌水重悬，每1ml分装，30secs离心，收集菌体。每管加入900μl无菌水、100μl 1M LiAc重悬，30℃，10mins。

将菌体快速离心30secs，收集菌体，小心移去LiAc。

每管加入50％PEG 240μl、1M LiAc 36μl、5 mg/ml ssDNA 10μl、载体片段DNA和PCR片段(载体片段与PCR片段摩尔比为1∶6、载体片段用量为1μg)，补水至总体积为360μl。彻底混匀。

30℃静置30mins。42℃水浴20mins。8,000rpm，离心1min，弃上清。

加200μl无菌水打匀。往每块选择性培养基SDA平板上加100μl菌液，用无菌涂布棒涂布均匀。30℃培养3天。

(转化效率可达0.5-1×10³/ug载体片段。)

5、工程菌发酵方法

将工程菌接种到新制备的SDA平板，培养24-36hrs，等量接种到3mlSDA，30℃振荡培养18hrs。

将1ml种子液转入到25mlYEPE/250ml(诱导型启动子，pHC11R-SA-28)三角瓶中，或25mlYEPD/250ml(组成型启动子，pHC11R-IFNαA)三角瓶中，30℃振荡培养48hrs。

*(SDA：0.67％YNB 2％Glucose 40ug/ml Adene)

6、简易酵母细胞抽提液制备

取20 OD发酵菌体于Eppendorf管，5,000rpm离心5mins，弃上清。

菌体加入500ul玻璃珠、500ul破碎缓冲液*。

置于冰浴中，vortex振荡1min，冰浴1min，10次。

12,000rpm离心15mins，吸取上清，置于-20℃保存。

*(破碎缓冲液(PBS)pH＝7.8：NaH₂PO₄ 0.09g Na₂HPO₄ 0.95g定容至150ml)

7、SA-28的ELISA测定

准备：将微孔顺序编号。并将各样品按比例稀释：稀释10倍、100倍、1000倍。

加样及酶标：加待测样品或阴、阳对照50μl于相应孔。每孔加酶标结合物50μl，混匀。设空白对照孔(不加酶标结合物)。

孵育：置37℃恒温反应60mins。

洗板：甩去板中样品，拍干并加满清洗液(将试剂盒内T-PBS干粉溶于双蒸水并订容500ml)。15～20secs后甩去清洗液，重复5次。

显色：每孔加入显色剂A和显色剂B各50μl，37℃避光显色15mins。

终止：每孔加终止液50μl，混匀。

比色：选波长450nm或双波长450/630nm，空白孔校零。用酶标仪对每孔进行比色，并记录其OD值。阴性对照OD值低于0.05时按0.05计算，高于0.05时按实际OD计算。样品孔OD值≥阴性对照平均OD值×2.1时，该孔样品HbsAg为阳性；反之，为阴性。

8、人α2a干扰素的凝胶电泳分析

将玻璃板洗涤干净，擦干净，固定于电泳槽上；配制浓度为15％的分离胶，将分离胶注入玻璃夹层中，上部用70％乙醇封面，保持胶面平整；待分离胶聚合后，配制15％浓缩胶，倒去分离胶表面的乙醇，灌入浓缩胶，插入点样梳。

取50μl蛋白上清样品，加入10μl 6×SDS-PAGE样品处理液，100℃水浴3-5mins。

在电泳槽加入电泳缓冲液后，小心拔取上样梳，用微量加样器分别吸取待分析样品，注入加样孔。

加样完毕后，接通电源，起始用低电压(30-50V)或低电流，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，再加大电压或电流(60-90V)，待溴酚蓝指示剂到达底部边缘时即可停止电泳。

电泳结束后，轻轻橇开两层玻璃，取出凝胶(戴手套，防止污染胶面)，将凝胶放于染色液中，振荡染色0.5-2hrs，用脱色液洗至背景干净，条带清晰。

照相保存或凝胶干燥。

30％(W/V)acr-bis母液、3mol/L Tris-HCl pH＝8.8、0.5mol/L Tris-HCl pH＝6.7、10％SDS、TEMED、10％过硫酸铵、Tris-Gly电泳缓冲液(Gly 1.44％ Tris 0.6％ SDS 0.1％)pH＝8.3、0.05％(W/V)考马斯蓝染色液、脱色液

9、转化子中表达单元片段的PCR扩增

接种各转化子菌株于3ml SDA培养液中30℃振荡培养16hrs，收集过夜菌。

用200μl酵母裂解液悬浮菌体，加入200μl玻璃珠，vortex剧烈振荡2mins，加入100μl饱和酚、100μl氯仿/异戊醇，vortex剧烈振荡2mins，共3次。

10,000rpm离心10mins，收集上清。加入等体积的氯仿/异戊醇抽提。

上清中加入1/10体积的3M NaAc、2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀2～3hrs。

70％乙醇洗一次，烘干后加入20μl无菌水溶解。-20℃保存。

取上述酵母DNA抽提物10μl为PCR模板，进行PCR鉴定。方法同前所述。

10、转化子中质粒稳定性的测定

接种转化子菌株DCO4/pHC11R-SA-28和对照菌株DCO4/pHC11-SA-28，或DCO4/pHC11R-IFNα2a和对照菌株DCO4/pHC11R-IFNα2a到3mlSDA培养液中，30℃振荡培养16hrs。

等量各接种100ul到25mlYEPD培养液，30℃振荡培养24hrs*。

分别测定两组菌液的OD600值，将两组菌液稀释8,000倍，单倍体菌取100ul涂布YEPD平板。

将两组平板30℃静置2天，可见YEPD平板上明显菌落形成，每皿约300个左右。

两组菌分别用已灭菌牙签作单菌落点种SDA平板，计数100个，30℃静置培养36hrs，观察平板上两组菌生长情况，记录菌落百分比。

将*步骤的菌液各取100ul接种于另两瓶YEPD液中，重复上述。

Claims (10)

1.一种通过体内同源重组构建遗传工程生物体的方法，其特征是将所需要的、两端带有载体片段同源序列的线性化外源基因表达单元与线性化的特定表达载体共转化特定生物体，外源基因表达单元与特定表达载体进行遗传重组，载体的非必要序列被外源基因表达单元替换，所得到的带有外源基因表达单元的遗传工程生物体中，外源基因表达单元能够稳定存在和高效率表达外源基因产物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所说的生物体包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、细菌和真菌。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是所说的外源基因包括编码干扰素、乙型肝炎病毒表面抗原、促红细胞生成素、人血清白蛋白、人超氧化物歧化酶、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子受体I和II、白细胞介素-1，白细胞介素-2及其受体基因。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征是所说的载体，是含有以完整2μ质粒为基础。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征是所说的载体同源序列，其同源区段碱基数目为15-60bp。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征是所说的真菌是酵母，包括酿酒酵母、克鲁维酵母、假丝酵母、红酵母、粟酒裂殖酵母。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征是所说的遗传工程生物体是酵母，其含有表达乙型肝炎病毒SA-28融合抗原的酵母基因工程菌DCO4/pHCl1R-SA-28或表达乙型肝炎病毒表面抗原和其他融合抗原的酵母基因工程菌。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征是所说的遗传工程生物体是酵母，其含有表达人α2a或α2b干扰素的酵母基因工程菌DCO4/pHC11R-IFNα2a，或DCO4/pHC11R-IFNα2b，或表达其他人干扰素的酵母基因工程菌。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征是所说的酵母是酿酒酵母或巴氏毕氏酵母。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征是具体步骤如下：

(1)载体的线形化：载体利用适当的限制性内切酶进行酶切，然后收集适当大小的片段，此即为线形化的载体：

(2)获得两端带有和线性化的载体片段同源的序列的表达单元；

(3)将线形化的载体与步骤2所述的表达单元分别共转化适当的生物体；

(4)鉴定转化子：取少量转化子对它们进行表达单元存在情况、表达水平的测定和转化子中质粒稳定性的分析。

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