CN1294258C - 一种分离抗菌肽的方法与分离的抗菌肽 - Google Patents

一种分离抗菌肽的方法与分离的抗菌肽 Download PDF

Info

Publication number
CN1294258C
CN1294258C CNB2004100051993A CN200410005199A CN1294258C CN 1294258 C CN1294258 C CN 1294258C CN B2004100051993 A CNB2004100051993 A CN B2004100051993A CN 200410005199 A CN200410005199 A CN 200410005199A CN 1294258 C CN1294258 C CN 1294258C
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
peptide
yeast
minutes
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB2004100051993A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1557960A (zh
Inventor
刘秋云
赫然
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CNB2004100051993A priority Critical patent/CN1294258C/zh
Publication of CN1557960A publication Critical patent/CN1557960A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1294258C publication Critical patent/CN1294258C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一个分离抗菌肽的方法与抗菌肽，构建酵母α交配因子前导肽与随机肽的融合DNA片段，插入含有诱导型启动子的酿酒酵母载体，用核酸外切酶III和绿豆芽核酸酶消化未连接的线状DNA，纯化后电激转化酿酒酵母，转化子过夜生长后用含大肠杆菌菌种K12D31的上层培养基覆盖，观测抑菌圈。用液体培养基诱导表达后测抑菌率。对阳性克隆进行PCR扩增，测序。本发明方法能简单、高效地发现抗菌寡肽和多肽；这将为抗生素的发现开辟新途径。

Description

一种分离抗菌肽的方法与分离的抗菌肽
技术领域
本发明涉及一种分离抗菌肽的方法与分离的抗菌肽。
背景技术
抗生素是在低浓度下，能选择性地抑制或杀伤他种微生物或肿瘤细胞的微生物次级代谢物和采用化学或生物学方法制得的同类化合物与结构修饰物。各种抗生素的抗菌效果，多数呈抑菌作用，少数具杀菌作用或溶菌作用。抗生素的抗菌作用主要是作用于菌类的生理方面，抑制微生物细胞代谢的某些环节或某些酶系统。抗生素的作用机理可归纳为下面几种类型：(1)抑制核酸的合成。(2)抑制蛋白质的合成。(3)改变细胞膜的通透性。(4)干扰细胞壁的形成。(5)作用于能量代谢系统或作为抗代谢物。
抗生素作为重要的临床应用药物，在保障人类健康方面起着极其重要的作用。然而，随着抗生素的广泛应用，在临床上引起两个问题：一是细菌耐药性逐年增加，致使一些抗生素疗效降低，甚至无效，多重耐药性不断恶化。二是一些不致病的细菌成为条件致病菌。越来越多的抗生素对许多病人失效，需要开发新的抗生素来加以防治。传统的抗生素发现途径所得到的新抗生素越来越少，需要建立一些新的方法与途径进行开发。现在新的开发途径包括抗生素与合成抗菌药的结构修饰、新作用机制与作用靶位的筛选、增强与保护抗菌药物性能的物质诸如抗菌增强剂、抗生素酶抑制剂、膜渗透性增强剂、外排泵抑制剂等。目前发现的新的作用靶位不过10余种。
多肽类抗生素是抗生素类医药发展的方向之一。传统的抗生素都是由霉菌产生的。新近的研究表明，动物、植物和人体的基因组中也有编码抗生素的基因。这些基因编码的多为一些短肽，称为抗菌肽。抗菌肽具有抗菌活性强，抗菌广谱性等特点。抗菌肽在自然界中广泛存在，代表宿主防御系统的古老机制。迄今从昆虫、两栖类、哺乳动物、植物等基因组中分离了数百种抗菌肽。抗菌肽可用于医药、饲料添加剂、食品防腐剂、植物基因工程等领域。由于抗菌肽对微生物特别是原核生物的毒性，一般的基因分离方法不适于分离抗菌肽基因。传统的分离抗菌肽的方法采用多次过柱从各种生物分离纯化然后氨基酸测序或质谱测序，十分繁琐。另外一个方法是根据已知抗菌肽设计同源性片段，然后进行活性检测，具有很大的局限性。还可以根据组合化学的方法寻找抗菌肽，费用昂贵，如果抗菌肽需要糖基化等修饰达到最大活性，该法无法满足实验要求。目前急需建立简单高效的抗菌肽分离方法。抗菌肽一般长为10到40个氨基酸，具有较强的免疫原性，对病人第一次使用有效，以后使用效果逐渐降低，须不断提高剂量。小分子抗菌肽不具这些缺点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效分离抗菌肽的方法，以便分离出具有强烈抗菌活性的寡肽和多肽。本发明还提供分离的抗菌三肽和多肽编码序列，以用于抗生素开发。
本发明的目的是通过以下技术措施实现的：构建酵母α交配因子前导肽与随机肽的融合DNA片段，用于随机肽的分泌表达；插入用EcoR I和Xba I双酶切的含有诱导型启动子的酿酒酵母载体；为避免未连接的线状DNA在转化后与酵母基因组DNA发生重组，用核酸外切酶III和绿豆芽核酸酶对其进行消化处理；纯化后电激转化酿酒酵母；转化子转接至棉子糖/半乳糖诱导表达平板，过夜生长后用含大肠杆菌菌种K12D31的上层培养基覆盖，观测抑菌圈；或用液体培养基诱导表达后测抑菌率；对阳性克隆进行PCR扩增，测序；化学合成部分抗菌肽，用琼脂糖扩散法检测活性。
本发明包括以下具体步骤：
(1)构建酵母α交配因子前导肽与随机肽的融合DNA片段，用于随机肽的分泌表达。用具有高保真活性的Pfu DNA聚合酶、PyrobestDNA聚合酶或其它具有高保真活性的热稳定的DNA聚合酶扩增，扩增模板为质粒pPICZαA(质粒pPICZαA含酵母α交配因子前导肽DNA序列，Invitrogen产品)，扩增产物用乙醇沉淀；电吹风吹干；悬浮在无菌蒸馏水里；用EcoR I和Xba I双酶切6小时至过夜；70℃热失活。
(2)pYES2/CT(Invitrogen产品)用EcoR I和Xba I双酶切6小时至过夜；70℃热失活；取双酶切的pYES2/CT，加入双酶切的PCR产物和T4DNA连接酶，6℃或16℃连接过夜。
(3)为避免数量占多数的未连接的线状DNA在转化后与酵母基因组DNA发生重组而导致无插入片段的转化子过多，需用核酸酶对其进行消化处理。连接产物用Qiagen公司的PCR纯化柱纯化(见产品说明书)；用H2O洗脱；加10-20单位核酸外切酶III于37℃处理1小时；70℃失活15分钟；再加入10-20单位绿豆芽核酸酶，37℃处理40分钟至1小时20分钟；用Qiagen公司的PCR纯化柱纯化，用H2O洗脱；取10μl做电激；
(4)首先制备酵母感受态细胞。将在30℃摇床培养到OD值1.3-1.5的酿酒酵母菌离心，去上清；重悬在醋酸锂/二硫苏糖醇预处理液中，20-30℃保温1小时；用冰预冷的无菌水洗涤两次；再用冰预冷的1mol/L山梨醇中洗涤一次；重悬于0.2-0.5ml冰预冷的1mol/L山梨醇中，冰浴；每个无菌管中加80μl酵母悬浮液和不超过100ng的DNA(总体积小于10μl)，轻轻混匀，冰浴5分钟；转移至冰预冷的0.2-cm无菌电激杯，加到底部；于1.5千伏、25微法和200欧姆做电激；立刻加入450μl至1ml 1mol/L山梨醇到电激杯中，轻轻混匀，转移到培养管；
(5)将电激混合物涂布葡萄糖/山梨醇选择平板，于30℃生长3天；转接至不含山梨醇的葡萄糖选择平板；
(6)转接至棉子糖/半乳糖诱导表达平板，于30℃生长1天；提前一天接种用于检测抗菌肽活性的大肠杆菌菌种K12D31，于37℃过夜生长；
(7)将5μl过夜生长的大肠杆菌菌种K12D31加至10ml 50℃左右高压灭菌过的0.7％琼脂糖/LB；轻轻倒在长有酵母转化子的棉子糖/半乳糖诱导表达平板上；静置10分钟凝固；打一个小孔，加入0.5μl 50mg/ml氨苄青霉素作为正对照，置超净台5分钟；在37℃培养箱倒置过夜生长；观察抑菌圈，记录，拍照；
(8)另将酵母转化子从不含山梨醇的葡萄糖选择平板接种至5-10ml棉子糖/半乳糖诱导表达液体培养基；诱导表达7天；取诱导了7天的培养物，13000rpm离心1分钟，取上清；与大肠杆菌K12D31和LB培养基混匀；放入37℃摇床，200rpm摇3小时，取出，冰浴；在分光光度计上600nm处测量样品和对照的OD.值，以等量的LB与酵母棉子糖/半乳糖诱导表达液体培养基为空白；根据公式(抑菌率＝1-样品OD.值/对照OD.值)计算抑菌率；
(9)从酵母转化子扩增插入片段，利用煮沸法制备PCR模板；根据载体pYES2/CT序列设计上下游引物，扩增、纯化并全自动测序。化学合成部分抗菌肽，用琼脂糖扩散法检测活性。
本发明方法适用于分离各种抗菌肽，酵母α交配因子前导肽与随机肽的融合DNA片段分泌表达后有一个Kex2蛋白酶酶切位点，将切下随机肽，分泌至胞外，从而可以抑制大肠杆菌的生长。测得的3个抗菌三肽序列为：第一个克隆为三肽，DNA序列为AAGACCCAC，氨基酸序列为Lys Thr His；第二个克隆为三肽，DNA序列为CCAACGCCT，氨基酸序列为Pro Thr Pro；第三个克隆为三肽，DNA序列为GCGTCTAAA，氨基酸序列为Ala Ser Lys；第四个克隆为68肽，DNA序列为ACCAACAATGATCTAGAGGGCCCTTCGAAGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACGCGTACCGGTCATCATCACCATCACCATTGAGTTTAAACCCGCTGATCCTAGAGGGCCGCATCATGTAATTAGTTATGTCACGCTTACATTCACGCCCTCCCCCCACATCCGCTCTAACCGAAAAGGAAGGAGT，氨基酸序列为Thr Asn Asn Asp Leu Glu Gly Pro Ser Lys Val Ser LeuSer Leu Thr Leu Ser Ser Val Ser Ile Leu Arg Val Pro Val Ile Ile Thr IleThr Ile Glu Phe Lys Pro Ala Asp Pro Arg Gly Pro His His Val Ile Ser TyrVal Thr Leu Thr Phe Thr Pro Ser Pro His Ile Arg Ser Asn Arg Lys Gly ArgSer。
本发明方法分离所得的三个抗菌3肽可作为抗生素开发的先导化合物。下表1是用抗菌肽克隆分泌液测得的抑菌率。
  第一个克隆   第二个克隆   第三个克隆  序列表1号和2号   空白：pYES2/CT转化子
 OD600nm   0.024   0.029   0.056   0.037   0.27
 抑菌率   91.1％   89.2％   79.2％   86.3％
从表1及各实验图示已充分说明本发明方法能有效地分离抗菌肽。
本发明方法所建立的方法能够高效分离抗菌寡肽和多肽。发现强烈抗菌克隆的频率约为20％，约10％测得序列。一般一人一年可分离40条以上抗菌寡肽和多肽，而传统的方法一般一人几年才能分离到一种抗菌肽。分离到的三肽不具免疫原性。由于分子量小，能够透过细菌细胞壁，生物可及性好。由于在酿酒酵母系统进行分泌表达，相当于利用真核系统进行了一个初步的生物安全性测试。而且，可以利用酵母基因工程进行生产。由于编码序列可以产生大量的组合，这些小肽可以针对细菌的几乎所有靶位。在酿酒酵母系统分泌表达的蛋白和多肽经常在丝氨酸、苏氨酸和天冬酰氨位点受到糖基化修饰。而本发明分离到的抗菌肽均存在糖基化位点，并表现出了强烈抗菌活性，抗菌3肽可作为抗生素开发的先导化合物加以化学修饰，开发出强效抗生素。
附图说明
图1a、图1b、图1c、图1d为分离所得4个抗菌肽克隆覆盖含大肠杆菌K12D31的上层培养基后所形成的抑菌圈；
图1e为空载体pYES2/CT酵母转化子覆盖含大肠杆菌K12D31的上层培养基后的负对照；
图1f为在含大肠杆菌K12D31的上层培养基打孔加入0.5μl 50mg/ml氨苄青霉素的正对照；
图2左上为全自动合成的、纯度为95.8％的抗菌3肽Lys Thr His点样10ng在含大肠杆菌K12D31的上层培养基所形成的抑菌圈；
图2右下为0.5μl 50mg/ml氨苄青霉素点样在含大肠杆菌K12D31的上层培养基的正对照。
具体实施方式
实施例1：
(1)构建酵母α交配因子前导肽与随机肽的融合DNA片段，用于随机肽的分泌表达。两个引物分别为<1>GCGAATTCAAAAATGAGATTTCCTTCAA。<2>CGTCTAGATCA(N)9TCTTTTCTCGAGAGAT。用具有高保真活性的PfuDNA聚合酶扩增。扩增模板使用量为每1ml PCR反应液50ng质粒pPICZαA(Invitrogen产品，含酵母α交配因子前导肽DNA序列)。扩增条件为：94℃5分钟预变性；94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 20秒，15个循环；72℃ 5分钟补平。扩增产物用1/102.5M NaAc，pH5.2和2.5倍绝对乙醇于13000rpm沉淀7分钟。用70％乙醇洗涤，13000rpm沉淀3分钟。电吹风吹干。悬浮在无菌蒸馏水里。用EcoR I和Xba I双酶切过夜，总体积为30μl。70℃热失活20分钟。
(2)5μg pYES2/CT(Invitrogen产品)用EcoR I和Xba I双酶切过夜，总体积为30μl。70℃热失活20分钟。取6.5μl双酶切的pYES2/CT，加入6μl双酶切的PCR产物，1.5μl 10X连接酶缓冲液，1μl T4DNA连接酶，16℃连接过夜。
(3)为避免未连接的线状DNA在转化后与酵母基因组DNA发生重组，需用核酸酶对其进行消化处理。连接产物用Qiagen公司的PCR纯化柱纯化(见产品说明书)。用30μl H2O洗脱。加3.5μl 10X核酸外切酶III缓冲液和1μl(20单位)核酸外切酶III，37℃处理1小时。70℃失活15分钟。加入3.5μl 10X绿豆芽核酸酶缓冲液和30μl H2O，再加入1μl(20单位)绿豆芽核酸酶，37℃处理1小时20分钟。用Qiagen公司的PCR纯化柱纯化，用13μl H2O洗脱。取10μl做电激。
(4)首先制备酵母感受态细胞。用过夜培养的酿酒酵母菌种INVScl接种200ml YPD。30℃摇瓶培养到OD值1.3，将培养物分装在50ml离心管，5000rpm，4℃离心5分钟。去上清。重悬在总体积100ml醋酸锂/二硫苏糖醇预处理液中，25℃保温1小时。重悬在总体积200ml冰预冷的无菌水中。5000rpm，4℃离心5分钟。去上清。重悬在总体积100ml冰预冷的无菌水中。5000rpm，4℃离心5分钟。去上清。重悬在20ml冰预冷的1mol/L山梨醇中。5000rpm，4℃离心5分钟。去上清。重悬于0.2ml冰预冷的1mol/L山梨醇中。冰浴。每个无菌管中加80μl酵母悬浮液和100ng的DNA(总体积为10μl)，轻轻混匀，冰浴5分钟。转移至冰预冷的0.2-cm无菌电激杯，加到底部。1.5千伏、25微法、200欧姆做电激。立刻加入450μl 1mol/L山梨醇到电激杯中。轻轻混匀，转移到培养管。
(5)将电激混合物涂布葡萄糖/山梨醇选择平板，于30℃生长3天。转接至不含山梨醇的葡萄糖选择平板。
(6)转接至棉子糖/半乳糖诱导表达平板，于30℃生长1天。提前一天接种用于检测抗菌肽活性的大肠杆菌菌种K12D31，于37℃过夜生长。
(7)将5μl过夜生长的大肠杆菌菌种K12D31加至10ml 50℃左右高压灭菌过的0.7％琼脂糖/LB。轻轻倒在长有酵母转化子的棉子糖/半乳糖诱导表达平板上。静置10分钟凝固。在没有转化子的地方用枪头尖打一个小孔，加入0.5μl50mg/ml氨苄青霉素作为正对照，置超净台5分钟。在37℃培养箱倒置过夜生长。观察抑菌圈，记录，拍照。
(8)从酵母转化子扩增插入片段。取对数生长晚期的酵母菌1.5ml，13000rpm离心15秒，去上清。用双蒸水洗涤一次，13000rpm离心15秒。沉淀悬浮于30μl TE缓冲液。在沸水上煮3min。13000rpm离心1min。将上清储存在-20℃。取3μl用来做PCR。根据载体pYES2/CT序列设计上下游引物。<3>CCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACCCCGGATCG。<4>GGCGTGAATGTAAGCGTGACATAACTAATTACATGATGCG。扩增条件为：95℃5分钟预变性；94℃30秒，68℃2分钟，72℃30秒，4个循环；94℃30秒，68℃40秒，72℃30秒，41个循环；72℃5分钟补平。选用上海博亚公司的Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶。100μl反应加5单位Taq DNA聚合酶和2单位Pfu DNA聚合酶。扩增片段长为570bp，由上海申有技术有限公司纯化并全自动测序。测序引物为<5>TAATACGACTCACTATAGGG；<6>TAGGATCAGCGGGTTTAAACTC。测得的2个抗菌三肽序列为：第一个克隆为三肽，DNA序列为AAGACCCAC，氨基酸序列为Lys ThrHis。第二个克隆为三肽，DNA序列为CCAACGCCT，氨基酸序列为Pro Thr Pro。
(9)在上海博亚公司用多肽合成仪合成三肽Lys Thr His。将5μl过夜生长的大肠杆菌菌种K12D31加至10ml 50℃左右高压灭菌过的0.7％琼脂糖/LB，倒平板，静置10分钟凝固。用枪头尖打两个小孔，一个小孔加入10ng三肽LysThr His，另一个小孔加入0.5μl 50mg/ml氨苄青霉素作为正对照，置超净台5分钟。在37℃培养箱倒置过夜生长。观察抑菌圈，记录，拍照。
实施例2：
(1)构建酵母α交配因子前导肽与随机肽的融合DNA片段，用于随机肽的分泌表达。两个引物分别为<1>GCGAATTCAAAAATGAGATTTCCTTCAA。<2>CGTCTAGATCA(N)9TCTTTTCTCGAGAGAT。用具有高保真活性的PyrobestDNA聚合酶扩增。扩增模板使用量为每1ml PCR反应液100ng质粒pPICZαA(Invitrogen产品，含酵母α交配因子前导肽DNA序列)，。扩增条件为：94℃5分钟预变性；94℃30秒，49℃30秒，72℃30秒，18个循环；72℃5分钟补平。扩增产物用1/102.5M NaAc，pH5.2和2.5倍绝对乙醇于13000rpm沉淀7分钟。用70％乙醇洗涤，13000rpm沉淀3分钟。电吹风吹干。悬浮在无菌蒸馏水里。用EcoRI和XbaI双酶切过夜，总体积为40μl。70℃热失活20分钟。
(2)5μg pYES2/CT(Invitrogen产品)用EcoR I和Xba I双酶切过夜，总体积为40μl。70℃热失活20分钟。取6.5μl双酶切的pYES2/CT，加入6μl双酶切的PCR产物，1.5μl 10X连接酶缓冲液，1μl T4DNA连接酶，16℃连接过夜。
(3)为避免未连接的线状DNA在转化后与酵母基因组DNA发生重组，需用核酸酶对其进行消化处理。连接产物用Qiagen公司的PCR纯化柱纯化(见产品说明书)。用30μl H2O洗脱。加3.5μl 10X核酸外切酶III缓冲液和10单位核酸外切酶III，37℃处理1小时。70℃失活15分钟。加入3.5μl 10X绿豆芽核酸酶缓冲液和30μl H2O，再加入20单位绿豆芽核酸酶，37℃处理1小时20分钟。用Qiagen公司的PCR纯化柱纯化，用20μl H2O洗脱。取10μl做电激。
(4)首先制备酵母感受态细胞。用过夜培养的酿酒酵母菌种INVScl接种50mlYPD。30℃摇瓶培养到OD值1.3，将培养物分装在50ml离心管，5000rpm，4℃离心5分钟。去上清。重悬在总体积50ml醋酸锂/二硫苏糖醇预处理液中，25℃保温1小时。重悬在总体积50ml冰预冷的无菌水中。5000rpm，4℃离心5分钟。去上清。重悬在总体积30ml冰预冷的无菌水中。5000rpm，4℃离心5分钟。去上清。重悬在20ml冰预冷的1mol/L山梨醇中。5000rpm，4℃离心5分钟。去上清。重悬于0.2ml冰预冷的1mol/L山梨醇中。冰浴。每个无菌管中加80μl酵母悬浮液和100ng的DNA(总体积为10μl)，轻轻混匀，冰浴5分钟。转移至冰预冷的0.2-cm无菌电激杯，加到底部。1.5千伏、25微法和200欧姆做电激。立刻加入1ml 1mol/L山梨醇到电激杯中。轻轻混匀，转移到培养管。
(5)将电激混合物涂布葡萄糖/山梨醇选择平板，于30℃生长3天。转接至不含山梨醇的葡萄糖选择平板。
(6)将酵母转化子从不含山梨醇的葡萄糖选择平板接种至10ml棉子糖/半乳糖诱导表达液体培养基。诱导表达7天。取诱导了7天的培养物各1.5ml，13000rpm离心1分钟，取上清，每支无菌eppendorf管中加0.75ml。取大肠杆菌K12D31过夜培养物与LB培养基混匀，终浓度为50μl大肠杆菌K12D31过夜培养物/5mlLB培养基，其中取0.75ml加到装有样品的eppendorf管，使总体积为1.5ml。放入37℃摇床，200rpm摇3小时，取出，冰浴。在752分光光度计上600nm处测量样品和对照的OD.值，以等量的LB与酵母棉子糖/半乳糖诱导表达液体培养基为空白。根据公式(抑菌率＝1-样品OD.值/对照OD.值)计算抑菌率。
(7)从酵母转化子扩增插入片段。取对数生长晚期的酵母菌1.5ml，13000rpm离心15秒，去上清。用双蒸水洗涤一次，13000rpm离心15秒。沉淀悬浮于30μl TE缓冲液。在沸水上煮3min。13000rpm离心1min。将上清储存在-20℃。取3μl用来做PCR。根据载体pYES2/CT序列设计上下游引物。<3>CCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACCCCGGATCG。<4>GGCGTGAATGTAAGCGTGACATAACTAATTACATGATGCG。扩增条件为：95℃5分钟预变性；94℃30秒，68℃2分钟，72℃30秒，4个循环；94℃30秒，68℃40秒，72℃30秒，41个循环；72℃5分钟补平。选用上海博亚公司的Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶。100μl反应加5单位Taq DNA聚合酶和2单位Pfu DNA聚合酶。扩增片段长为570bp，由上海申有技术有限公司纯化并全自动测序。测序引物为<5>TAGGATCAGCGGGTTTAAACTC；<6>TAGGATCAGCGGGTTTAAACTC。测得的1个抗菌三肽DNA序列为GCGTCTAAA，氨基酸序列为Ala Ser Lys。
实施例3
(1)构建酵母α交配因子前导肽与随机肽的融合DNA片段，用于随机肽的分泌表达。两个引物分别为<1>GCGAATTCAAAAATGAGATTTCCTTCAA。<2>CGTCTAGATCA(N)9TCTTTTCTCGAGAGAT。用具有高保真活性的PfuDNA聚合酶扩增。扩增模板使用量为每1ml PCR反应液50ng质粒pPICZαA(Invitrogen产品，含酵母α交配因子前导肽DNA序列)，。扩增条件为：94℃5分钟预变性；94℃30秒，51℃30秒，72℃20秒，20个循环；72℃5分钟补平。扩增产物用1/102.5M NaAc，pH5.2和2.5倍绝对乙醇于13000rpm沉淀7分钟。用70％乙醇洗涤，13000rpm沉淀3分钟。电吹风吹干。悬浮在无菌蒸馏水里。用EcoRI和XbaI双酶切过夜，总体积为30μl。70℃热失活20分钟。
(2)5μg pYES2/CT(Invitrogen产品)用EcoR I和Xba I双酶切过夜，总体积为30μl。70℃热失活20分钟。取6.5μl双酶切的pYES2/CT，加入6μl双酶切的PCR产物，1.5μl 10X连接酶缓冲液，1μl T4DNA连接酶，16℃连接过夜。
(3)为避免未连接的线状DNA在转化后与酵母基因组DNA发生重组，需用核酸酶对其进行消化处理。连接产物用Qiagen公司的PCR纯化柱纯化(见产品说明书)。用30μl H2O洗脱。加3.5μl 10X核酸外切酶III缓冲液和20单位核酸外切酶III，37℃处理1小时。70℃失活15分钟。加入3.5μl 10X绿豆芽核酸酶缓冲液和30μl H2O，再加入10单位绿豆芽核酸酶，37℃处理1小时。用Qiagen公司的PCR纯化柱纯化，用11μl H2O洗脱。取10μl做电激。
(4)首先制备酵母感受态细胞。用过夜培养的酿酒酵母菌种INVScl接种100ml YPD。30℃摇瓶培养到OD值1.3，将培养物分装在50ml离心管，5000rpm，4℃离心5分钟。去上清。重悬在总体积100ml醋酸锂/二硫苏糖醇预处理液中，30℃保温1小时。重悬在总体积100ml冰预冷的无菌水中。5000rpm，4℃离心5分钟。去上清。重悬在总体积50ml冰预冷的无菌水中。5000rpm，4℃离心5分钟。去上清。重悬在20ml冰预冷的1mol/L山梨醇中。5000rpm，4℃离心5分钟。去上清。重悬于0.3ml冰预冷的1mol/L山梨醇中。冰浴。每个无菌管中加80μl酵母悬浮液和100ng的DNA(总体积为10μl)，轻轻混匀，冰浴5分钟。转移至冰预冷的0.2-cm无菌电激杯，加到底部。1.5千伏、25微法和200欧姆做电激。立刻加入650μl 1mol/L山梨醇到电激杯中。轻轻混匀，转移到培养管。
(5)将电激混合物涂布葡萄糖/山梨醇选择平板，于30℃生长3天。转接至不含山梨醇的葡萄糖选择平板。
(6)转接至棉子糖/半乳糖诱导表达平板，于30℃生长1天。提前一天接种用于检测抗菌肽活性的大肠杆菌菌种K12D31，于37℃过夜生长。
(7)将5μl过夜生长的大肠杆菌菌种K12D31加至10ml 50℃左右高压灭菌过的0.7％琼脂糖/LB。轻轻倒在长有酵母转化子的棉子糖/半乳糖诱导表达平板上。静置10分钟凝固。在没有转化子的地方用枪头尖打一个小孔，加入0.5μl50mg/ml氨苄青霉素作为正对照，置超净台7分钟。在37℃培养箱倒置过夜生长。观察抑菌圈，记录，拍照。
(8)从酵母转化子扩增插入片段。取对数生长晚期的酵母菌1.5ml，13000rpm离心15秒，去上清。用双蒸水洗涤一次，13000rpm离心15秒。沉淀悬浮于30μl TE缓冲液。在沸水上煮3min。13000rpm离心1min。将上清储存在-20℃。取3μl用来做PCR。根据载体pYES2/CT序列设计上下游引物。<3>CCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACCCCGGATCG。<4>GGCGTGAATGTAAGCGTGACATAACTAATTACATGATGCG。扩增条件为：95℃5分钟预变性；94℃30秒，68℃2分钟，72℃30秒，4个循环；94℃30秒，68℃40秒，72℃30秒，41个循环；72℃5分钟补平。选用上海博亚公司的Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶。100μl反应加5单位Taq DNA聚合酶和2单位Pfu DNA聚合酶。扩增片段长为570bp，由上海申有技术有限公司纯化并全自动测序。测序引物为<5>TAATACGACTCACTATAGGG；<6>TAGGATCAGCGGGTTTAAACTC。测得的1个抗菌68肽，其DNA序列和氨基酸序列见序列表。该克隆的随机序列在引物合成时丢失一个碱基而导致读码框改变。
上述实施例中所用的醋酸锂/二硫苏糖醇预处理液配方为(每100ml)：0.1M醋酸锂(终浓度)，10mM Tris(终浓度)，pH7.5，1mM EDTA(终浓度)，高压灭菌后加入过滤灭菌的10ml 0.1M二硫苏糖醇至90ml上述溶液(终浓度为10mM)。
上述实施例中所用的葡萄糖/山梨醇选择平板培养基配方为(每升)：100ml10X酵母盐(含微量元素)，1M山梨醇，10g葡萄糖，30mg亮氨酸，20mg组氨酸，30mg色氨酸，20g琼脂。高压灭菌。加入维生素并在50-60℃时加入青霉素以抑制细菌生长，倒平板。10X酵母盐(含微量元素)、维生素配方见“酵母遗传学和分子生物学指南”，酶学方法，1991，194卷。
上述实施例中所用的不含山梨醇的葡萄糖选择平板配方为(每升)：100ml10X酵母盐(含微量元素)，10g葡萄糖，30mg亮氨酸，20mg组氨酸，30mg色氨酸，20g琼脂。高压灭菌。加入维生素并在50-60℃时加入青霉素以抑制细菌生长，倒平板。10X酵母盐(含微量元素)、维生素配方见“酵母遗传学和分子生物学指南”，酶学方法，1991，194卷。
上述实施例中所用的棉子糖/半乳糖诱导表达平板配方为(每升)：100ml10X酵母盐(含微量元素)，30mg亮氨酸，20mg组氨酸，30mg色氨酸，20g琼脂。高压灭菌。加入过滤除菌的终浓度为1％的棉子糖和1％的半乳糖。加入维生素，倒平板。10X酵母盐(含微量元素)、维生素配方见“酵母遗传学和分子生物学指南”，酶学方法，1991，194卷。
上述实施例中所用的棉子糖/半乳糖诱导表达液体培养基配方为(每升)：：100ml 10X酵母盐(含微量元素)，30mg亮氨酸，20mg组氨酸，30mg色氨酸。高压灭菌。加入过滤除菌的1％的棉子糖和1％的半乳糖。加入维生素。10X酵母盐(含微量元素)、维生素配方见“酵母遗传学和分子生物学指南”，酶学方法，1991，194卷。
上述实施例中所用的LB配方为(500ml)：5g蛋白胨，2.5g酵母抽提物，5g氯化钠，蒸馏水，pH7.0。
                                                  抗菌肽序列表.seq
<110>刘秋云，赫然
<120>一种分离抗菌肽的方法与分离的抗菌肽
<160>2
<210>1
<211>207
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)…(204)
<400>1
ACC AAC AAT GAT CTA GAG GGC CCT TCG AAG GTA AGC CTA TCC CTA ACC 48
Thr Asn Asn Asp Leu Glu Gly Pro Ser Lys Val Ser Leu Ser Leu Thr
1                5                  10                  15
CTC TCC TCG GTC TCG ATT CTA CGC GTA CCG GTC ATC ATC ACC ATC ACC 96
Leu Ser Ser Val Ser Ile Leu Arg Val Pro Val Ile Ile Thr Ile Thr
            20                  25                  30
ATT GAG TTT AAA CCC GCT GAT CCT AGA GGG CCG CAT CAT GTA ATT AGT 144
Ile Glu Phe Lys Pro Ala Asp Pro Arg Gly Pro His His Val Ile Ser
        35                  40                  45
TAT GTC ACG CTT ACA TTC ACG CCC TCC CCC CAC ATC CGC TCT AAC CGA 192
Tyr Val Thr Leu Thr Phe Thr Pro Ser Pro His Ile Arg Ser Asn Arg
    50                  55                  60
AAA GGA AGG AGT TAG 207
Lys Gly Arg Ser ***
65
<210>2
<211>68
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
Thr Asn Asn Asp Leu Glu Gly Pro Ser Lys Val Ser Leu Ser Leu Thr
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Val Ser Ile Leu Arg Val Pro Val Ile Ile Thr Ile Thr
            20                  25                  30
Ile Glu Phe Lys Pro Ala Asp Pro Arg Gly Pro His His Val Ile Ser
        35                  40                  45
Tyr Val Thr Leu Thr Phe Thr Pro Ser Pro His Ile Arg Ser Asn Arg
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Ser
65

Claims (2)

1、一种分离抗菌肽的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)高保真PCR构建酵母α交配因子前导肽与随机肽的融合DNA片段，用于随机肽的分泌表达；
(2)插入用EcoR I和Xba I双酶切的含有诱导型启动子的酿酒酵母载体；
(3)为避免未连接的线状DNA在转化后与酵母基因组DNA发生重组，用核酸外切酶III和绿豆芽核酸酶对其进行消化处理，纯化后电激转化酿酒酵母；
(4)转化子转接至棉子糖/半乳糖诱导表达平板，过夜生长后用含大肠杆菌菌种K12D31的上层培养基覆盖，观测抑菌圈；或用液体培养基诱导表达后测抑菌率；
(5)对阳性克隆进行PCR扩增，测序；
(6)利用多肽自动合成仪合成抗菌肽，利用琼脂糖扩散法验证抗菌活性。
2、一种权利要求1所述方法分离的的抗菌肽，其特征是可融合表达为三肽，其DNA序列为AAGACCCAC，氨基酸序列为Lys Thr His。
CNB2004100051993A 2004-01-16 2004-02-10 一种分离抗菌肽的方法与分离的抗菌肽 Expired - Fee Related CN1294258C (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNB2004100051993A CN1294258C (zh) 2004-01-16 2004-02-10 一种分离抗菌肽的方法与分离的抗菌肽

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN200410015163 2004-01-16
CN200410015163.3 2004-01-16
CNB2004100051993A CN1294258C (zh) 2004-01-16 2004-02-10 一种分离抗菌肽的方法与分离的抗菌肽

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1557960A CN1557960A (zh) 2004-12-29
CN1294258C true CN1294258C (zh) 2007-01-10

Family

ID=34378870

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB2004100051993A Expired - Fee Related CN1294258C (zh) 2004-01-16 2004-02-10 一种分离抗菌肽的方法与分离的抗菌肽

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN1294258C (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102093998A (zh) * 2010-12-09 2011-06-15 山东大学 一种抗菌肽天蚕素饲料添加剂的制备方法

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100345865C (zh) * 2005-09-16 2007-10-31 中山大学 一种抗菌二肽及其化学修饰物、制备方法与应用
CN102382173A (zh) * 2011-11-12 2012-03-21 山东大学 一种寡肽c及其抗菌应用
CN102618551A (zh) * 2012-03-15 2012-08-01 安徽希普生物科技有限公司 一种利用酿酒酵母表达抗菌肽g13的方法
CN103382219B (zh) * 2013-07-16 2017-12-29 青岛科技大学 一种抗肿瘤多肽的制备方法
CN103360467B (zh) * 2013-07-16 2015-06-03 青岛科技大学 一种广谱抗菌多肽的制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07203975A (ja) * 1994-01-23 1995-08-08 Showa Denko Kk 抗菌活性ペプチドをコードする遺伝子及び抗菌活性ペプチドの製造方法
US5646014A (en) * 1994-08-31 1997-07-08 Agriculture, Forestry And Fisheries Technical Information Society Peptide, antibacterial agent, peptide gene, recombinant DNA and method for preparing the peptide
CN1398897A (zh) * 2002-09-02 2003-02-26 上海高科联合生物技术研发有限公司 一组合成抗菌肽

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07203975A (ja) * 1994-01-23 1995-08-08 Showa Denko Kk 抗菌活性ペプチドをコードする遺伝子及び抗菌活性ペプチドの製造方法
US5646014A (en) * 1994-08-31 1997-07-08 Agriculture, Forestry And Fisheries Technical Information Society Peptide, antibacterial agent, peptide gene, recombinant DNA and method for preparing the peptide
CN1398897A (zh) * 2002-09-02 2003-02-26 上海高科联合生物技术研发有限公司 一组合成抗菌肽

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102093998A (zh) * 2010-12-09 2011-06-15 山东大学 一种抗菌肽天蚕素饲料添加剂的制备方法
CN102093998B (zh) * 2010-12-09 2012-11-07 山东大学 一种抗菌肽天蚕素饲料添加剂的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN1557960A (zh) 2004-12-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104497119A (zh) 一种天然抗菌肽及其应用
CN111004317B (zh) 一种犬重组干扰素α7及其制备方法与应用
CN100351270C (zh) 棕点湍蛙抗菌肽及其基因和在制药中的应用
CN1294258C (zh) 一种分离抗菌肽的方法与分离的抗菌肽
CN1763175A (zh) 甘油通道蛋白基因缺失降低甘油生成提高乙醇产量的酿酒酵母菌株及构建方法
CN100393742C (zh) 一种抗菌三肽及其化学修饰物与应用
CN1314804C (zh) 内源基因超量表达技术提高黄芪甲苷含量
CN102061303B (zh) 两种海洋动物抗菌肽基因的融合表达产物及其制备方法
CN100345865C (zh) 一种抗菌二肽及其化学修饰物、制备方法与应用
CN1177055C (zh) 家蝇抗菌肽基因及其克隆方法
CN105753958B (zh) 一种新型鱼源抗菌肽突变体及其制备方法和应用
CN1262559C (zh) 家蝇防御素基因及其克隆方法与重组应用
CN100351271C (zh) 棕点湍蛙活性多肽及其基因和在制药中的应用
CN1381587A (zh) 中国对虾抗菌肽基因与克隆技术
CN1238377C (zh) 酸性抗菌肽及其基因和在制药中的应用
CN1170845C (zh) 大蹼铃蟾抗肿瘤蛋白及其制备方法和其基因
CN1157477C (zh) 含有大鳞大马哈鱼生长因子的大肠杆菌
CN110003318B (zh) 褐鲳鲉抗菌肽moronecidin及其应用
CN106754995A (zh) 中华蜜蜂AccCDK5基因及AccCDK5r1基因及其应用
TW200825100A (en) Protein and nucleic acid for glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase (GFD), alcohol dehydrogenase and S-nitrosoglutathione reductase from Antrodia camphorata, manufacturing method and uses therefor
CN1724674A (zh) 昆虫防御素在毕赤酵母中的表达方法
CN1170847C (zh) 大蹼铃蟾抗微生物肽及其制备方法和其基因
CN101012275A (zh) 无指盘臭蛙蛙皮肽及其基因和在制药中的应用
CN1262657C (zh) 利用转基因植物生产人白血病抑制因子的方法
CN1288240C (zh) 含有大鳞大马哈鱼生长因子的酵母菌

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20070110

Termination date: 20120210