CN1398897A - 一组合成抗菌肽 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一组新的合成抗菌肽，这些合成抗菌肽具有比天然抗菌肽更强的杀菌活性。本发明合成抗菌肽的制备方法可以是固相化学法或是通过基因工程表达获得。本发明合成抗菌肽可以用于制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌感染引起的疾病的药物。

Description

一组合成抗菌肽
技术领域
本发明涉及一组合成抗菌肽、其制备方法及在制备治疗细菌、真菌感染的药物中的应用，该抗菌肽对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌有显著的杀菌活性。
背景技术
抗菌肽是生物体经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，一般由20-60个氨基酸组成，分子量在2000-7000D左右。随着医学免疫学和分子生物学的迅速发展，抗菌肽的研究越来越成为生物技术与生物医药领域中的热门课题。至今为止，在许多动物(尤其是昆虫)、植物、微生物和人体上已发现了超过200多种抗菌肽，这类短肽不仅对细菌、真菌有广谱的杀菌作用，而且对病毒、原虫及癌细胞也有攻击作用。临床试验也表明，在机体感染病菌或可能导致病菌感染的情况下，抗菌肽能快速杀灭已侵入的病菌，并且能阻止病菌的继续侵染。
随着对抗菌肽一级结构和高级结构研究的不断深入，已有许多研究者对这些抗菌肽的结构和功能进行研究，发现在模拟膜的疏水环境下，分子中的α-螺旋度与其杀菌活性密切相关。另外研究结果表明抗菌肽是通过破坏膜的完整性使得细菌细胞膜渗漏而杀死细菌(Nakajima Y.etal.，J.Biol.Chem，262：1665-1669；Zasloff M.Nature，2002，415：389-395)。因此有人试图通过增加分子中α-螺旋结构或提高多肽中含正电荷氨基酸的比例来寻找更强抗菌活性的多肽(Broth W.B.etal.，AntimicrobialAgentsChemotherapy，2001，45：1894-1895；HongS.Y.etal.，Peptides，2001，22：1669-1674)。
发明内容
本发明涉及一组合成抗菌肽，是在对天然抗菌肽的序列、结构分析的基础上设计合成的，它们的序列如下：
Arg Phe Arg Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Arg Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Lys Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Lys Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Lys Leu Val Lys Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Lys Leu Val Lys Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Lys Leu Val Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Lys Leu Val Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Lys Phe Lys Leu Val Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Lys Phe Lys Leu Val Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Arg Leu Phe Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Arg Leu Phe Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Lys Leu Phe Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Lys Leu Phe Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Lys Leu Phe Lys Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Lys Leu Phe Lys Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Lys Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Lys Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Arg Gly Val Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Arg Gly Val Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Arg Gly Val Lys Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Arg Gly Val Lys Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Lys Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Lys Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(Al′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Trp Arg Ilc Gly Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Trp Arg Ile Gly Arg Arg Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Lys Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Lys Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Lys Trp Lys Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Lys Trp Lys Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Trp Arg Leu Phe Arg Arg Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Trp Arg Leu Phe Arg Arg Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Trp Arg Leu Phe Lys Arg Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3 ′-A4′)
Arg Trp Arg Leu Phe Lys Arg Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Trp Arg Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Trp Arg Leu Phe Lys Lus Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Arg Val Ile Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Arg Val Ile Arg Arg Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Arg Val Ile Arg Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Arg Val Ile Arg Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Arg Phe Arg Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Arg Phe Arg Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
Lys Phe Lys Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)
Lys Phe Lys Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)
(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)或(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)序列为抗菌肽序列的核心结构。其中A1、A1′、A1″为Lys或Arg中的一种，A2、A2′、A2″为Gly、Ala、Val、Leu、Ile或Phe中的一种，A3、A3′、A3″为Gly、Ala、Val、Leu、Ile或Phe中的一种，A4、A4′、A4″为Lys或Arg中的一种。(A1-A2-A3-A4)的氨基端连接有11个氨基酸，11个氨基酸中第1，3，6，7位氨基酸为赖氨酸或精氨酸中的一种，11个氨基酸中第2位氨基酸为色氨酸或苯丙氨酸中的一种，11个氨基酸中第4，5，8，9，10，11位氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸或甘氨酸中的一种。
本发明一组合成抗菌肽还包括以上所述多肽中个别氨基酸的取代、环化、L-型氨基酸变为D-型氨基酸、缺失或加入而得到的功能等同物的多肽。
本发明提供的一组合成抗菌肽，其制备方法可以是固相化学法，也可以将抗菌肽的编码基因克隆到载体上，然后在宿主细胞中表达后获得。其中表达载体可以是质粒或病毒中的一种，宿主细胞可以是原核细胞，包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等，宿主细胞也可以是真核细胞、包括酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。制备的抗菌肽可通过质谱鉴定。
为了深入研究本发明这类生物学活性抗菌肽的结构与功能关系，利用美国应用系统生物公司生产的Pioneer多肽合成仪制备一组多肽，以进行研究。下面以制备的具有下列氨基酸序列的GK-1，GK-2和GK-3抗菌肽作为举例来进行叙述：
GK-1：
Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Lys Arg Gly Leu Arg
Lys Leu Leu Lys
GK-2：
Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu Arg
Arg Leu Leu Arg
GK-3：
Arg Trp Arg Leu Phe Lys Arg Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Lys Arg Gly Leu Arg
利用96孔板法检测多肽的杀菌活性(In Yup Park etc；FEBS Letters；437(1998)258-262)以预先合成的天然抗菌肽buforin II，cecropin A1为对照，进行杀菌活性检测。结果表明本发明合成抗菌肽的杀菌活性强于所述两种天然抗菌肽的杀菌活性。
同样对多肽中氨基酸缺失、环化衍生物的抗菌肽功能等同物也进行了制备与生物活性测定，测定结果显示这些多肽的杀菌活性也基本上强于上述的天然抗菌肽的杀菌活性。
抗菌肽在高效杀菌的同时也有可能作用于高等有机体包括人体细胞，因为抗菌肽的作用方式都是在细胞膜上穿孔使得细胞发生渗漏死亡。所以把抗菌肽能否使红细胞发生渗漏作为其是否有毒性的一个标准，如果抗菌肽能使红细胞中的血红蛋白发生渗漏，就可以通过检测OD490值确定毒性的大小。因此本发明还检测了合成抗菌肽对人体红细胞的溶血活性，实验表明，抗菌肽溶血率值很低，证实本发明合成抗菌肽的溶血毒性极小。
此外，又对本发明合成抗菌肽进行动物体内急性毒性试验，证明合成抗菌肽无毒性作用。又进行合成抗菌肽对小白鼠急性感染金黄色葡萄球菌的抑制作用的试验，表明合成抗菌肽对金黄色葡萄球菌感染有显著的抑制作用。
本发明提供一组新的人工设计合成的抗菌肽。可方便地采用固相化学法制备或将编码抗菌肽的基因克隆到载体上，然后进入宿主细胞中表达后获得。该合成抗菌肽对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌具有广谱杀伤活性，并较天然抗菌肽有更强的杀菌活性，但对动、植物细胞无任何毒害作用。并通过抗菌肽对金黄色葡萄球菌急性感染杀菌活性的小鼠试验显示合成抗菌肽给予0.25mg/kg剂量，就能达到100％杀菌抑制率，而作为杀灭金黄色葡萄球菌特效药的万古霉素要给予4.0mg/kg剂量才能达到100％的杀菌抑制率，表明本发明合成抗菌肽对金黄色葡萄球菌急性感染有很显著的杀菌效果，因此本发明合成抗菌肽可应用于制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌感染引起的疾病的药物。
附图说明
图1是抗菌肽GK-2的质谱图。
具体实施方式
实施例1抗菌肽的制备及分离纯化
按上述序列制备GK-1，GK-2和GK-3，同时制备cecropin A1和buforin II作为对照。
cecropin A1的序列(参见Morishima，I.，etc，Comp.Biochem.Physiol.，1990，B 95(3)，551-554)：
Arg Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly Arg Asn Val Arg Asp Gly
Leu Ile Lys Ala Gly Pro Ala Ile Ala Val Ile Gly Gln Ala Lys Ser Leu
buforln II的序列(参见Park，C.B.，Biochem.Biophys.Res.Commun.1996，218(1)，408-413)
Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg Leu
Leu Arg Lys
本实施例采用固相化学法合成，所用仪器为美国应用生物系统公司生产的Pioneer多肽合成仪。合成的多肽经过高浓度的TFA剪切后，用反向柱纯化，纯化后的多肽通过质谱鉴定。具体试验步骤如下：
1、抗菌肽的制备(以制备0.1mmol量的GK-2为例)
以下所有制备抗菌肽的试剂均购于美国应用生物系统公司。
制备的GK-2多肽序列为
N-Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu
Arg Arg Leu Leu Arg-C
制备从C端到N端逐个进行，由合成仪自动控制。首先称量0.1mmol的结合了第一个氨基酸即Arg的树脂(购于美国应用生物系统公司)，装柱，再用20％哌啶二甲基甲酰胺溶液脱保护，二甲基甲酰胺清洗，9-笏甲氧羰基(Fmoc)保护的游离氨基酸溶解于碳二亚胺(DCC)，羟基苯并三唑(HOBt)/二异丙基乙基胺(DIPEA)，溶解后的溶液在柱上循环偶合反应30分钟，二甲基甲酰胺清洗重复以上脱保护到偶合反应步骤直到制备结束(具体操作步骤见pioneer多肽合成仪操作指南)。
制备后的多肽经如下步骤剪切：
取下反应后的树脂，加入B型剪切液(88％三氟乙酸，5％苯酚，5％水，2％三异丙基硅烷)，室温反应2小时，过滤，滤出液中加入10倍体积的预冷无水乙醚，4000转/分钟离心10分钟，收集沉淀并室温干燥。
2、抗菌肽纯化
称量一定量干燥后的多肽，溶于0.1％三氟乙酸，样品处理后经反向柱分离(洗脱液为含80％乙氰的0.1％三氟乙酸)，收集洗脱峰。
3、抗菌肽的鉴定
如图1所示，制备的抗菌肽GK-2经过质谱分析，GK-2在质谱图中显示的分子量计算如下：            (1)734.8×4＝2939.2，2939.2-4＝2935.2
                  (2)979.1×3＝2937.3，2937.3-3＝2934.3
                  (3)1468×2＝2936，2936-2＝2934计算出GK-2的分子量为2934。由多肽序列计算出的理论值为2932.74。证明制备的多肽即为设计的GK-2抗菌肽。鉴定合格的抗菌肽产物备用。
抗菌肽GK-1和GK-3，天然抗菌肽cecropin A1和buforin II可以采用类似于GK-2抗菌肽的制备方法制备。
实施例2  抗菌肽GK-1基因在大肠杆菌中的表达
首先设计合成编码抗菌肽的GK-1基因，将其克隆到pGEX-4T1载体上(购自AmershamPharmcia Biotech公司)，然后转化大肠杆菌JM109，经IPTG诱导表达GST-GK-1融合蛋白，再经凝血酶切割后，得抗菌肽GK-1。
实施例中使用的ATP，IPTG，T4多聚核苷酸激酶、T4DNA连接酶，Klenow酶、限制性内切酶除特别指明外均为BIOLAB公司产品，割胶回收试剂盒为上海生工公司产品，寡聚核苷酸为上海生工生物工程技术服务有限公司合成。凝血酶剪切试剂盒购于SIGMA公司。
有关DNA的分离、纯化、PCR扩增、酶解、质粒转化宿主菌、片段回收、连接等分子克隆操作均按照J.沙姆布鲁克等编著的《分子克隆实验指南》进行。大肠杆菌JM109培养在液体或固体的LB培养基中。
采用大肠杆菌偏爱的密码子设计编码优选抗菌肽GK-1基因的DNA序列，序列如下。在抗菌肽GK-1基因的5’端引入酶切位点BamHI(GGATCC)，在3’端加上终止密码子(TAG)，所得构建基因的长度为78bp。
通过DNA合成仪直接合成该核苷酸片断。首先用PCR方法对基因进行扩增。设计一对引物：5’-CCTAGGTTTACCT-3’和3’-CCGCCTGCTGAA-5’。PCR反应条件如下：94℃，30秒；45℃，45秒；72℃，30秒；反应30个循环。PCR反应后将该片断经过Klenow酶补平后用BamHI酶切，酶切片断经过割胶回收后(割胶回收操作参照试剂盒操作说明)与pGEX-4T1载体的BamHI和SmaI的双酶切片断连接后转化大肠杆菌JM109，转化子通过SmaI酶切鉴定、筛选。转化子经过IPTG诱导表达GST-GK-1融合蛋白。融合蛋白用GST亲合柱纯化后经凝血酶切割后得到抗菌肽GK-1，具体操作参照试剂盒操作说明。
GK-1蛋白序列：
Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Lys Arg Gly Leu Arg
Lys Leu Leu Lys
编码GK-1的核苷酸序列：
GGATCCAAATGGAAACTGTTTAAAAAAATTGGCATTGGCCGCCTGCTGAA
ACGCGGCCTGCGCAAGCTGCTGAAATAG
实施例3  抗菌肽GK-1基因在酵母细胞中的表达
本实施例中使用的ATP，IPTG，T4多聚核苷酸激酶、T4DNA连接酶，Klenow酶、限制性内切酶除特别指明外均为BIOLAB公司产品，割胶回收试剂盒为上海生工公司产品，寡聚核苷酸为上海生工生物工程技术服务有限公司合成。凝血酶剪切试剂盒购于SIGMA公司。
设计合成编码抗菌肽的GK-1基因，经过BamHI酶切与编码GST的DNA序列连接，后将其连接到质粒pBluescriptSKII(购自美国Stratagene公司)中，转化大肠杆菌DH5α(购自武汉大学菌种保藏中心)，提取质粒经过测序证明序列正确后，质粒经过EcoRI，XhoI酶切后连接到pPIC9载体(购自美国Invitrogen公司)中，后转化毕氏酵母菌株KM71(购自美国Invitrogen公司)，甲醇诱导表达融合蛋白GST-GK-1。
有关DNA的分离、纯化、PCR扩增、酶解、质粒转化宿主菌、片段回收、连接等分子克隆操作均按照J.沙姆布鲁克等编著的《分子克隆实验指南》进行。毕氏酵母菌株KM71培养在液体或固体的BMGY培养基中，甲醇诱导表达融合蛋白GST-GK-1时酵母菌株培养在BMMY培养基中，每隔24小时补加甲醇至终浓度为1％。
采用酵母菌偏爱的密码子设计编码优选抗菌肽GK-1及GST的DNA序列，序列如下。在抗菌肽GK-1基因的5’端引入酶切位点BamHI(GGATCC)，在3’端加上终止密码子(TAG)及EcoRI酶切位点(GAATCC)，所得构建基因的长度为84bp，同时在GK-1基因前段接编码GST的DNA序列，同时在GST的DNA序列的5’端加了一个XhoI酶切位点。
GK-1核苷酸片断的制备：通过DNA合成仪直接合成编码GK-1核苷酸片断。然后用PCR方法对基因进行扩增。设计一对引物5’CCTAGGTTTACCT3’和5’AAGTCGTCCGCC3’。PCR反应条件如下：94℃，30秒；45℃，45秒；72℃，30秒；反应35个循环。
编码GST的DNA序列的的制备：设计一对引物
5’-CTCGAGATGTCCCCTATACTAGGTT-3’
5’-CAGTGCTACGCCGGCGAG-3’
用以上引物扩增pGEX-4T1载体。PCR反应条件如下：94℃，30秒；45℃，45秒；72℃，60秒；反应30个循环。
扩增片段与质粒的连接：将GK-1的PCR扩增片断经过Klenow酶补平后用BamHI和EcoRI酶切，酶切片断经过割胶回收后(割胶回收操作参照试剂盒操作说明)与编码GST的DNA扩增序列的BamHI和XhoI酶切回收片段以及pBluescriptSKII的XhoI和EcoRI酶切回收片段连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α，转化子经过抗性、蓝白斑、酶切鉴定后，进一步经过测序确定表达序列正确。提取质粒经XhoI和EcoRI酶切回收小片段，与pPIC9的XhoI和EcoRI酶切连接构建成表达质粒pPIC9-gst-gk1，转化大肠杆菌DH5α后经氨苄青霉素抗性筛选转化子。按文献报道的方法(Clare JJ，etc.，Gene，1991，105：205-212)制备毕氏酵母KM71的感受态细胞，并将SacI单酶切的线性化重组质粒pPIC9-gst-gk1经电转化导入感受态细胞，电转化的条件为1.5KV，22.5uF。将电转化的酵母细胞涂板于YPD平板，30℃培养两天后，筛选表达融合蛋白的阳性克隆。
转化子经过甲醇诱导表达GST-GK-1融合蛋白。融合蛋白用GST亲合柱纯化后经凝血酶切割后得到抗菌肽GK-1，具体操作参照试剂盒操作说明。
GST-GK-1融合蛋白序列：
Leu Glu Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro Thr Arg Leu Leu Leu
Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys
Lys Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys Leu The Gln
Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala
Glu Ile Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser Lys
Asp Phe Glu The Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg
Leu Cys His Lys The Tyr Leu Asn Gly Asp His Val The His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu
Asp Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys Lys Arg
Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly
Trp Gln Ala The Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser Lys Trp
Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Arg Leu Leu Lys Arg Gly Leu Arg Lys Leu Leu Lys
GST-GK-1核苷酸序列：
TTAGAAATGTCTCCTATTTTAGGTTATTGGAAAATTAAAGGTTTAGTTCAACCTACTCGTTTATTATTAGAATATTTAGAAGAAAAA
TATGAAGAACATTTATATGAACGTGATGAAGGTGATAAATGGCGTAATAAAAAATTTGAATTAGGTTTAGAATTTCCTAATTTACCT
TATTATATTGATGGTGATGTTAAATTAACTCAATCTATGGCTATTATTCGTTATATTGCTGATAAACATAATATGTTAGGTGGTTGT
CCTAAAGAACGTGCTGAAATTTCTATGTTAGAAGGTGCTGTTTTAGATATTCGTTATGGTGTTTCTCGTATTGCTTATTCTAAAGAT
TTTGAAACTTTAAAAGTTGATTTTTTATCTAAATTACCTGAAATGTTAAAAATGTTTGAAGATCGTTTATGTCATAAAACTTATTTA
AATGGTGATCATGTTACTCATCCTGATTTTATGTTATATGATGCTTTAGATGTTGTTTTATATATGGATCCTATGTGTTTAGATGCT
TTTCCTAAATTAGTTTGTTTTAAAAAACGTATTGAAGCTATTCCTCAAATTGATAAATATTTAAAATCTTCTAAATATATTGCTTGG
CCTTTACAAGGTTGGCAAGCTACTTTTGGTGGTGGTGATCATCCTCCTAAATCTGATTTAGTTCCTCGTGGTTCTAAATGGAAATTA
TTTAAAAAAATTGGTATTGGTCGTTTATTAAAACGTGGTTTACGTAAATTATTAAAATGAGAATTT
实施例4  合成抗菌肽的杀菌活性检测
以下实施例中所使用的各种菌株购于中国生物制品检定所。
采用96孔板法对合成抗菌肽的杀菌活性进行检测，并用固相化学法合成的抗菌肽cecropin Al和buforin II作为对照，以评价本发明中作为举例的三条抗菌肽GK-1，GK-2和GK-3的杀菌活性。
按以下步骤进行测定抗菌肽的杀菌活性：
菌种复苏，接种斜面37℃培养过夜，挑菌于普通LB培养基中，37℃培养过夜，稀释菌液使菌浓度为104-105CFU/ml，按每孔100ul菌液接种于96孔板中，将多肽以一定比例稀释后，每孔中加入10ul，将96孔板置于37℃培养过夜，酶标仪检测0D620值(In Yup Park etc；FEBS Letters；437(1998)258-262)。检测结果见表1。
含有抗菌肽的细菌的生长浓度(OD620)与不加抗菌肽的细菌的生长浓度的比值大于90％时的抗菌肽浓度即为最小抑菌浓度(最小抑菌浓度(MIC)定义为显著抑制细菌生长的最低的浓度)。
表1  五种抗菌肽对不同细菌的抗菌活性最小抑菌浓度(MIC)的比较
菌株名称     几种抗菌肽的最小抑菌浓度(ug/ml)cecropin A1  buforin II  GK-1  GK-2  GK-3
  革兰氏阳性菌 金黄色葡萄球菌CMCC26003枯草杆菌DB430短小芽孢杆菌CMCC63202溶壁微球菌S1.634藤黄微球菌CMCC28001     16             4        0.4   0.2   0.512             6        4     4     550             6        0.5   1     0.850             8        1.0   0.8   1.230             8        2     4     3
  革兰氏阴性菌 大肠杆菌ATCC8099肺炎克雷伯氏菌CMCC46117乙型副伤寒沙门氏菌CMCC50094绿脓杆菌CMCC10104     20             16       1     0.5   1.616             20       2     0.8   212             14       4     1     618             20       10    12    1.8
  真菌 白色念珠菌ATCC10231啤酒酵母ATCC9736     50             30       8     10    1150             20       14    12    12
上表中的的最小抑菌浓度值越小，则代表抗菌能力越强。
实施例5抗菌肽功能等同物——缺失、环化衍生物的杀菌活性检测
设计合成抗菌肽功能等同物：缺失GK-19及环化GK-20衍生物，合成方法见美国应用生物系统公司(Applied Biosystems)pioneer多肽合成仪操作指南。合成产物经过分离纯化(同实施例1)后，检测了衍生物的最小抑菌浓度，杀菌活性检测同实施例4，检测结果见表2。缺失GK-19、环化GK-20衍生物的序列如下：
GK-19：Arg Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Pro Arg Leu Leu Arg Arg Gly Leu Arg Lys Val Leu Lys
Figure A0213676600131
表2  抗菌肽功能等同物GK-19和GK-20对不同细菌的最小抑菌浓度(MIC)
菌株名称 抗菌肽的最小抑菌浓度(ug/ml)
  GK-19     GK-20
革兰氏阳性菌     金黄色葡萄球菌CMCC26003枯草杆菌DB430短小芽孢杆菌CMCC63202溶壁微球菌S1.634藤黄微球菌CMCC28001     1.0      0.82        210       64        210       4
革兰氏阴性菌     大肠杆菌ATCC8099肺炎克雷伯氏菌CMCC46117乙型副伤寒沙门氏菌CMCC50094绿脓杆菌CMCC1010 4     2        82        101        84        10
真菌     白色念珠菌ATCC10231啤酒酵母ATCC9736     16       1812       20
上表中的的最小抑菌浓度值越小，则代表抗菌能力越强。
实施例6体外溶血活性检测
本实施例用于检测合成抗菌肽对人体红细胞是否具有溶血活性，并用固相化学法合成的抗菌肽cecropin A1和buforinII作为对照。使用的的血样取于正常人血。
合成抗菌肽溶血活性的检测步骤是：
4％的新鲜红细胞悬液在414nm下血红蛋白的释放来检测的。人红细胞经PBS(PBS：35mM磷酸缓冲液/0.15MNaCl，PH7.0)洗涤，取100ul的8％人红细胞悬液于96孔板中，每孔中加入100ul抗菌肽溶液，37℃一小时后，1500rpm离心5分钟，转移100ul上清于新的96孔板中，通过酶标仪检测414nm下的吸收。阴性对照用PBS，阳性对照用0.1％TritonX-100。检测结果见表3
                  表3  五种抗菌肽溶血活性检测结果抗菌肽浓度                               溶血率(％)(ug/ml)       cecropinA1      buforinII        GK-1     GK-2     GK-312.5               0              0             0        0        025                 0              0             0        0        050                 0              0             0        0        0100                1.2            0             0.5      0.2      0.6200                3              0.5           0.8      1.0      1.1500                10             1.7           1.5      2        1.9
表3中抗菌肽的溶血率值越小，则代表抗菌肽的溶血毒性越小。
实施例7  动物体内急性毒性试验
本实施例用以检测合成抗菌肽对动物的毒性，并用固相化学法合成的抗菌肽cecropinA1和buforinII作为对照，测定本发明提供的抗菌肽GK-1、GK-2和GK-3的毒性。
采用昆明小白鼠60只，雌雄各半，体重33.5±0.25g，抗菌肽按1mg/kg剂量，每日一次连续7天经肌注小白鼠，观察动物在最大剂量下毒性反应。实验结果表明，动物经肌注抗菌肽7天后，无异常反应，活动正常。经7天观察，60只小白鼠全部存活。证明合成抗菌肽无毒性作用。
实施例8合成抗菌肽和万古霉素对小鼠金黄色葡萄球菌感染模型抑制效果的比较使用昆明小白鼠的急性感染模型，实验步骤如下：
将金黄色葡萄球菌CMCC26003置于含5％猪胃粘液素的小牛肉灌输肉汤里，振荡培养过夜。体重大约33.5±0.25g的小鼠腹腔内注射10u-107存活细胞，每个处理组里有3个小鼠。静脉注射抗菌肽GK-1(溶于0.1毫升5％右旋糖里供注射)，在10分钟里注射。皮下注射万古霉素(万古霉素对小鼠皮下给药是完全可生物利用的，不论皮下给予或静脉给予有相似的活性)。
表4  抗菌肽GK-1和万古霉素对金黄色葡萄球菌急性感染小白鼠模型的抑制作用
  剂量(mg/kg) 抑制率(％)
00.1250.250.51.02.04.08.0 抗菌肽GK-1静脉注射    万古霉素皮下注射020100100                      0100                      4080100100
如表4所示，静脉注射给予0.25mg/kg，合成抗菌肽能100％保护感染小鼠。万古霉素在4.0毫克/kg剂量下才100％有效。所有的未处理小鼠在不到24小时里都死亡。
该实验例显示，合成抗菌肽对用高致命的细菌剂量的小鼠急性感染模型杀灭金黄色葡萄球菌是十分有效的。
                          序列表<110>上海高科联合生物技术研发有限公司<120>一组合成抗菌肽<130>SPI028296<160>54<170>PatentIn Version2.1<210>1<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>1Arg Phe Arg Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
              5                  10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>2<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>2Arg Phe Arg Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
             20<210>3<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>3Arg Phe Lys Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
              5                  10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>4<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>4Arg Phe Lys Leu Val Arg Arg Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
             20<210>5<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>5Arg Phe Lys Leu Val Lys Arg Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
              5                  10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>6<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>6Arg Phe Lys Leu Val Lys Arg Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
             20<210>7<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Va l或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>7Arg Phe Lys Leu Val Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>8<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<22 3>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>8Arg Phe Lys Leu Val Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
             20<210>9<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>9Lys Phe Lys Leu Val Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>10<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>10Lys Phe Lys Leu Val Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
             20<210>11<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>11Arg Phe Arg Leu Phe Arg Arg Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>12<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>12Arg Phe Arg Leu Phe Arg Arg Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
             20<210>13<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>13Arg Phe Lys Leu Phe Arg Arg Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>14<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>14Arg Phe Lys Leu Phe Arg Arg Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
             20<210>15<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>15Arg Phe Lys Leu Phe Lys Arg Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>16<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>16Arg Phe Lys Leu Phe Lys Arg Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
              5                  10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
             20<210>17<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>17Arg Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>18<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>18Arg Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
             20<210>19<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>19Lys Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>20<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>20Lys Phe Lys Leu Phe Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
             20<210>21<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>21Arg Phe Arg Gly Val Arg Arg Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>22<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>22Arg Phe Arg Gly Val Arg Arg Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
             20<210>23<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>23Arg Phe Arg Gly Val Lys Arg Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
              5                  10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>24<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>24Arg Phe Arg Gly Val Lys Arg Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
             20<210>25<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>25Arg Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>26<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>26Arg Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
             20<210>27<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>27Lys Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>28<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>28Lys Phe Arg Gly Val Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
             20<210>29<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>29Arg Trp Arg Ile Gly Arg Arg Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>30<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>30Arg Trp Arg Ile Gly Arg Arg Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
             20<210>31<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>31Arg Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>32<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>32Arg Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
             20<210>33<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>33Lys Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>34<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>34Lys Trp Arg Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
             20<210>35<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>35Lys Trp Lys Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>36<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>36Lys Trp Lys Ile Gly Lys Lys Ile Val Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa  Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
              20<210>37<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>37Arg Trp Arg Leu Phe Arg Arg Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>38<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>38Arg Trp Arg Leu Phe Arg Arg Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
             20<210>39<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>39Arg Trp Arg Leu Phe Lys Arg Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>40<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>40Arg Trp Arg Leu Phe Lys Arg Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
             20<210>41<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>41Arg Trp Arg Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>42<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Va l或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>42Arg Trp Arg Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
             20<210>43<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>43Arg Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>44<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>44Arg Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
             20<210>45<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>45Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>46<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>46Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
                      Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
             20<210>47<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>47Arg Phe Arg Val Ile Arg Arg Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>48<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>48Arg Phe Arg Val Ile Arg Arg Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
             20<210>49<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>49Arg Phe Arg Val Ile Arg Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>50<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>50Arg Phe Arg Val  Ile Arg Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
              5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
             20<210>51<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>51Arg Phe Arg Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>52<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>52Arg Phe Arg Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
             20<210>53<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>53Lys Phe Lys Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa<210>54<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><221>CHAIN<222>(12，16，20)<223>Xaa＝Lys或Arg<222>(13，17，21)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(14，18，22)<223>Xaa＝Gly或Ala或Val或Leu或Ile或Phe<222>(15，19，23)<223>Xaa＝Lys或Arg<400>54Lys Phe Lys Val Ile Lys Lys Ile Leu Val Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
             5                   10                  15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
             20

Claims (17)

1.一组合成抗菌肽，其特征在于所述抗菌肽具有序列表中所列的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的合成抗菌肽，其特征在于所述抗菌肽还包括所述多肽中个别氨基酸的取代、环化、L-型氨基酸变为D-型氨基酸、缺失或加入而得到的功能等同物多肽。
3.根据权利要求1或2所述的合成抗菌肽，其特征在于所述抗菌肽含有(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)或(A1-A2-A3-A4)(A1′-A2′-A3′-A4′)(A1″-A2″-A3″-A4″)的核心结构。
4.根据权利要求3所述的合成抗菌肽，其特征在于所述的A1、A1′、A1″为Lys或Arg中的一种。
5.根据权利要求3所述的合成抗菌肽，其特征在于所述的A2、A2′、A2″为Gly、Ala、Val、Leu、Ile或Phe中的一种。
6.根据权利要求3所述的合成抗菌肽，其特征在于所述的A3、A3′、A3″为Gly、Ala、Val、Leu、Ile或Phe中的一种。
7.根据权利要求3所述的合成抗菌肽，其特征在于所述的A4、A4′、A4″为Lys或Arg中的一种。
8.根据权利要求3所述的合成抗菌肽，其特征在于所述的核心结构中(A1-A2-A3-A4)的氨基端连接有11个氨基酸。
9.根据权利要求8所述的合成抗菌肽，其特征在于所述的11个氨基酸中第1，3，6，7位氨基酸为Lys或Arg中的一种。
10.根据权利要求8所述的合成抗菌肽，其特征在于所述的11个氨基酸中第2位氨基酸为Trp或Phe中的一种。
11.根据权利要求8所述的合成抗菌肽，其特征在于所述的11个氨基酸中第4，5，8，9，10，11位氨基酸为Leu、Ile、Ala、Val或Gly中的一种。
12.权利要求1所述合成抗菌肽的制备方法，其特征在于采用固相化学法合成。
13.权利要求1所述合成抗菌肽的制备方法，其特征在于将编码所述抗菌肽的基因克隆到载体上，然后进入宿主细胞中表达后获得所述抗菌肽。
14.根据权利要求13所述合成抗菌肽的制备方法，其特征在于所述的载体是质粒或病毒中的一种。
15.根据权利要求13所述合成抗菌肽的制备方法，其特征在于所述的宿主细胞是原核细胞，包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。
16.根据权利要求13所述合成抗菌肽的制备方法，其特征在于所述的宿主细胞是真核细胞，包括酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。
17.权利要求1或2所述合成抗菌肽的应用，其特征在于所述抗菌肽在制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌感染的药物中的应用。
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