CN1766110A - 小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽及其应用与制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽，该多肽含有可形成离子通道大肠菌素的通道结构域，以及金黄色葡萄球菌信息素。本发明还公开了编码上述多肽的核苷酸序列以及含有所述核苷酸序列的重组质粒。本发明所述多肽不会诱导细菌产生传统的耐药性，其机理是通过直接在靶细菌的胞膜上形成离子通道而杀死细菌的，本发明所述多肽的抗菌谱更为专一，只杀灭金黄色葡萄球菌，而不杀灭大肠杆菌类革兰氏阴性菌，且杀菌效力很强，试验表明对抗耐药金黄色葡萄球菌感染的治疗效果至少是苯唑西林治疗效果的500倍。同时还可作为β－内酰胺类抗菌素的增效剂和细菌毒素抑制剂使用。

Description

小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽 及其应用与制备方法
                                技术领域
本发明涉及一种重组的小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽的基因、重组质粒、多肽及其应用与制备方法。
                                背景技术
细菌感染是人类生命和健康的主要威胁，自磺胺和青霉素问世以来，人类陆续发明的抗菌素主要以通过抑制细菌胞壁合成，抑制或干扰细菌的核酸和蛋白质的代谢与合成途径达到抗菌目的。然而这些抗菌途径容易诱使细菌发生突变而产生抗菌素耐药性。因此人们一直在致力于开发新型的抗菌素。
在细菌胞膜上直接形成离子通道而致细菌死亡是比较有前途的抗菌素开发方向之一。根据此设计理念发明人已构建出了人工组合的抗菌工程多肽，该发明已申请专利，并获国家知识产权局专利局授权(专利号为ZL01128836.1)。然而上述专利实施例中的抗金黄色葡萄球菌多肽在结构和功能上尚有一些不足之处：大肠菌素Ia氨基端的信号结构域仍被保留在该抗菌多肽中，这样造成(1)抗菌多肽具有广谱抗菌作用，既抗金黄色葡萄球菌，又抗大肠杆菌类革兰氏阴性菌；(2)多肽分子量大则免疫原性就有可能较大，对药物安全性不利。
                                发明内容
本发明的一个目的在于提供一种新型的重组小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽的基因、重组质粒、多肽；此种多肽能特异的杀灭耐药金黄色葡萄球菌而不会伤害人体正常细胞。与ZL01128836.1所公开的人工组合抗菌工程多肽相比，抗菌谱更为专一，它只杀灭金黄色葡萄球菌，而不杀灭大肠杆菌类革兰氏阴性菌，且杀菌效力更强。该多肽本身又是金黄色葡萄球菌密度生长调控系统(Quorum-sensing regulating system)的假性递质，可阻断金黄色葡萄球菌的信号调节-基因表达系统，从而可有效降低耐药金黄色葡萄球菌毒素和β-内酰胺酶的分泌。本发明的再一目的是提供上述重组小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽的制备方法。
本发明的技术方案如下：
将编码金黄色葡萄球菌信息素Agr D1的基因与大肠菌素通道结构域基因可操作地连接，从而获得表达重组小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽的核苷酸序列。编码金黄色葡萄球菌信息素Agr D1的基因为序列表中SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列。大肠菌素通道结构域可选自能形成离子通道的大肠菌素E1，Ia，Ib，A，B和N，在本发明的一个优选实施例中，将上述金黄色葡萄球菌信息素Agr D1的基因与大肠菌素Ia通道结构域(SEQ ID NO.1)的羧基端基因连接而形成如序列表中SEQ ID NO.4(大肠菌素Ia通道结构域-金黄色葡萄球菌信息素Agr D1)所述的核苷酸序列。在本发明的另一个优选实施例中，将上述金黄色葡萄球菌信息素Agr D1的基因与大肠菌素Ia通道结构域(SEQID NO.1)的氨基端基因连接而形成如序列表中SEQ ID NO.6(金黄色葡萄球菌信息素Agr D1-大肠菌素Ia通道结构域)所述的核苷酸序列。
本发明所述重组质粒，是将如上所述的编码金黄色葡萄球菌信息素Agr D1的核苷酸序列经双链寡聚核苷酸点突变技术插入大肠菌素通道结构域的羧基端或氨基端形成本发明的重组质粒。若选用大肠菌素Ia，则将编码金黄色葡萄球菌信息素Agr D1的核苷酸序列插入Ia通道结构域基因的第626位氨基酸后(羧基端)或第451位氨基酸前(氨基端)而形成本发明的诸重组质粒。构建重组质粒的原始商用质粒pET-15b来自于Novagen公司，由发明人在其中装载了大肠菌素Ia通道结构域和相应的Immunity蛋白基因，针对金黄色葡萄球菌信息素Agr D1基因设计了数对引物，其序列见实施例1和实施例2。利用双链寡聚核苷酸点突变技术，按照Strategene公司药箱操作获得本发明所述重组质粒。
本发明所述小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽的制备方法是将获得的上述重组质粒转染入大肠杆菌工程菌中而获得可产生重组抗菌多肽的工程菌细胞，用CM柱分离纯化即获得本发明所述的抗耐药金黄色葡萄球菌多肽。
本发明通过实验证明了所述抗耐药金黄色葡萄球菌多肽能对抗耐药金黄色葡萄球菌感染和抑制金黄色葡萄球菌β-内酰胺酶的分泌，既可以单独使用来杀灭已对现有抗菌素产生耐药性的耐药菌，又可以作为青霉素类和头孢菌素等β-内酰胺类抗菌素的增强剂联合用药。这样就可以为治疗或预防耐药金黄色葡萄球菌感染提供一种新药，为β-内酰胺类抗菌素对抗耐药菌产生的β-内酰胺酶提供一种全新的增效剂，为临床上降低细菌毒素的毒害作用提供一种全新的抑制剂。可以通过将本发明所述多肽添加药学上可接收的载体或赋形剂或可选的其它成分而制成适于临床使用的药物组合物。
本发明所述抗耐药金黄色葡萄球菌多肽相较于传统抗菌素的优点在于，其不会诱导细菌产生传统的耐药性，其机理在于本发明的重组多肽是通过直接在靶细菌的胞膜上形成离子通道而杀死细菌的，在本发明的重组多肽形成的离子通道造成泄漏而致细菌死亡的这一较短时限内，细菌较难以利用突变基因—蛋白表达方式来修复抗菌多肽离子通道在其细胞膜上造成的几何缺损。与ZL01128836.1所公开的人工组合抗菌工程多肽相比，本发明所述抗耐药金黄色葡萄球菌多肽的抗菌谱更为专一，只杀灭金黄色葡萄球菌，而不杀灭大肠杆菌类革兰氏阴性菌，且杀菌效力更强，在本发明的实施例中抗耐药金黄色葡萄球菌多肽对抗耐药金黄色葡萄球菌感染的治疗效果至少是苯唑西林治疗效果的500倍。本发明所述抗耐药金黄色葡萄球菌多肽具有双重功能：既杀菌又抑制细菌毒素分泌，在临床上的治疗价值将远远胜过现有抗菌素。同时由于分子量变小，其免疫原性与ZL01128836.1专利所公开的，具有类似活性的人工组合抗菌工程多肽(MW70,000)相比将大大减弱，从而增加了药物使用的安全性。
                                附图说明
图1是含有金黄色葡萄球菌信息素Agr D1基因和大肠菌素Ia通道结构域基因的重组质粒pCHCSACOM1的结构示意图，其中金黄色葡萄球菌信息素Agr D1连接在大肠菌素Ia的第626位氨基酸上。
图2是含有金黄色葡萄球菌信息素Agr D1基因和大肠菌素Ia通道结构域基因的重组质粒pCHCSACOM2的结构示意图，其中金黄色葡萄球菌信息素Agr D1连接在大肠菌素Ia的第451位氨基酸上。
图3示出包括184个氨基酸残基的抗菌多肽的结构以及制备的小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽15％SDS-PAGE电泳结果，A.含184个氨基酸残基的抗菌多肽结构示意图，a.含有175个氨基酸残基(D451-I626)的大肠菌素Ia通道结构域，b.含有8个氨基酸残基的金黄色葡萄球菌信息素Agr D1；B.15％SDS-PAGE电泳结果图，a分子量标记(标准蛋白)；b.野生型大肠菌素Ia，分子量70,000左右；c.制备的小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽COM1，分子量26,000左右；d.制备的小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽COM2，分子量26,000左右。
图4是对青霉素敏感的金黄色葡萄球菌的抑制实验结果图，该图表明青霉素敏感金黄色葡萄球菌的生长只能被苯唑西林、ZL01128836.1所述人工组合抗菌工程多肽(MW70,000)和本发明所述小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽抑制。图中Control，对照；Oxa，苯唑西林；Ia WT，野生型大肠菌素Ia；Ph-SA，ZL01128836.1所述人工组合抗菌工程多肽(MW70,000)；COM1，大肠菌素Ia通道结构域羧基端连接了金黄色葡萄球菌信息素Agr D1的抗金黄色葡萄球菌多肽；COM2，大肠菌素Ia通道结构域氨基端连接了金黄色葡萄球菌信息素Agr D1的抗金黄色葡萄球菌多肽。各实验组的药物用量：苯唑西林，9μg/ml，约合22nM/ml；野生型大肠菌素Ia，7μg/ml，约合0.1nM/ml；Ph-SA，7μg/ml，约合0.1nM/ml；COM1和COM2均为2μg/ml，约合0.1nM/ml。纵坐标为A595nm光密度值，横坐标为细菌生长小时。
图5是对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑制实验结果，该图表明耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生长只能被本发明所述小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽有效抑制。图中Control，对照；Oxa，苯唑西林；Ia WT，野生型大肠菌素Ia；Ph-SA，ZL01128836.1所述人工组合抗菌工程多肽(MW70,000)；COM1，大肠菌素Ia通道结构域羧基端连接了金黄色葡萄球菌信息素Agr D1的抗金黄色葡萄球菌多肽；COM2，大肠菌素Ia通道结构域氨基端连接了金黄色葡萄球菌信息素Agr D1的抗金黄色葡萄球菌多肽。各实验组的药物用量：苯唑西林，9μg/ml，约合22nM/ml；野生型大肠菌素Ia，7μg/ml，约合0.1nM/ml；Ph-SA，7μg/ml，约合0.1nM/ml；COM1和COM2均为2μg/ml，约合0.1nM/ml。纵坐标为A595nm光密度值，横坐标为细菌生长小时。
图6是对大肠杆菌的抑制实验结果，表明本发明所述小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽不能抑制大肠杆菌的生长。图中Control，对照；IaWT，野生型大肠菌素Ia；Ph-SA，ZL01128836.1所述人工组合抗菌工程多肽(MW70,000)；COM1，大肠菌素Ia通道结构域羧基端连接了金黄色葡萄球菌信息素Agr D1的抗金黄色葡萄球菌多肽。各实验组的药物用量：野生型大肠菌素Ia，7μg/ml，约合0.1nM/ml；Ph-SA，7μg/ml，约合0.1nM/ml；COM12μg/ml，约合0.1nM/ml。纵坐标为A595nm光密度值，横坐标为细菌生长小时。
图7是对耐药金黄色葡萄球菌β-内酰胺酶分泌的抑制实验结果图，图中Control，对照；PEN，青霉素；COM1，大肠菌素Ia通道结构域羧基端连接了金黄色葡萄球菌信息素Agr D1的抗金黄色葡萄球菌多肽；PEN+COM1，青霉素+小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽；各组所加剂量见实施例说明。结果表明本发明所述小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽可抑制耐药金黄色葡萄球菌β-内酰胺酶分泌。图7A纵坐标为A595nm光密度值，图7B纵坐标为头孢硝噻吩读数值，横坐标均为细菌生长小时。
图8是对耐药金黄色葡萄球菌δ-溶血素分泌的抑制实验结果图，图中Control，对照；PEN，青霉素G钠；COM1，大肠菌素Ia通道结构域羧基端连接了金黄色葡萄球菌信息素Agr D1的抗金黄色葡萄球菌多肽。各组所加剂量见实施例说明。结果表明本发明所述小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽可抑制耐药金黄色葡萄球菌δ-溶血素分泌。纵坐标为HPLC读数值，横坐标为细菌生长小时。
图9是对β-内酰胺抗菌素体内保护作用的增效实验结果图，图中a为对照组，b为青霉素G钠组，c为半量青霉素G钠和半量本发明所述抗金黄色葡萄球菌多肽组，d为本发明所述抗金黄色葡萄球菌多肽组。各组所加剂量请见实施例说明。结果表明半量小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽可有效的增强青霉素对抗耐药菌的体内保护作用。纵坐标为存活动物数值，横坐标为存活时间(天)。
图10是经本发明所述小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽30日处理后的鼠肝，肾，脾的组织切片；a肝组织切片，b肾组织切片，c脾组织切片，HE染色，100x。
                             具体实施方式
实施例1 表达小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽的质粒的构建和重组小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽的制备
原始质粒为装载了大肠菌素Ia通道结构域和Immunity蛋白基因的pET-15b商用质粒(质粒大小6.3kb，购自Novagen公司，上述基因由四川大学华西医院移植免疫实验室装载)，经双链寡聚核苷酸点突变技术(QuickChangeTM Kit，Strategene公司)将编码金黄色葡萄球菌信息素Agr D1的基因(序列表中SEQ ID NO.2)插入到大肠菌素Ia通道结构域基因的I626位点后，制备出了抗菌多肽的一种重组质粒pCHCSACOM1(如图1所示)。重组质粒转染入E.coli TG1工程菌里制备多肽，获得序列表中SEQ ID NO.5所述的小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽。在继后的实施例中称为“抗菌多肽1(COM1)”。
突变程序按Strategene QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit(catalog#200518)药箱手册进行：
1、准备点突变反应物
5ul 10 x buffer
2ul(10ng)野生型大肠菌素Ia质粒
1.25ul(125ng)设计的5’-3’寡聚核苷酸引物
1.25ul(125ng)设计的3’-5’寡聚核苷酸引物
1ul dNTP
双蒸水50ul
1ul pfu
(除质粒、引物和双蒸水外，均为药箱所备试剂)
2、进行PCR扩增，扩增条件：变性95℃，35秒，退火53℃，70秒，延伸68℃，17分共20个循环；
3、加入Dpn1内切酶1ul消化母体DNA链后(37℃，1小时)，取1ul反应物与XL1-Blue感受态细胞50ul冰孵30分钟，行热冲击42℃，45秒，再置入冰中2分钟；
4、加入NZY培基0.5ml后220rpm，37℃摇菌1小时后，取50-100ul反应物铺板(LB培基加1％琼脂加50ug/ml氨苄青霉素，37℃过夜)；
5、18小时后挑菌，循Qiagene，Gibco等公司的各种商用提取质粒药箱提取质粒均可，测序确定突变成功；
6、将质粒50ng与制备的TG1工程菌感受态细胞50ul冰孵30分，42℃，90秒热冲击，取50-100ul反应物加入LB培基0.5ml，220rpm，37℃摇菌1小时后铺板(LB培基加1％琼脂加50ug/ml氨苄青霉素)37℃孵育，18小时后挑取菌落；
7、大量增菌，8-16升FB培基，250rpm，37℃，6-8小时；离心沉淀菌体，4℃，6000g，20分钟，取50mM Borate，2mM EDTA，2mM DTT，pH9.0，4℃50-80ml悬浮菌体，加入0.2M PMSF 250ul后行超声破碎(4℃，400W，2分钟)，高速离心沉淀破碎菌体(4℃，75000g，1.5小时)，取上清加入硫酸链霉素500万单位沉淀DNA，高速离心后(4℃，30000g，10分钟)取上清装入分子量15,000的透析袋于50mM Borate，2mM EDTA，2mM DTT，pH9.0，4℃溶液透析过夜后，高速离心后(4℃，30000g，10分钟)将上清上样于CM柱(Amersham Biosciences)，经0.2M NaCl，50mM Borate，2mM EDTA，2mM DTT，pH9.0，4℃溶液线性梯度洗脱后即可得到重组抗菌多肽，经10mM sodium phosphate，0.2MNaCl，2mM EDTA，pH7.4，4℃透析后备用。
下面列出为制备pCHCSACOM1质粒的金黄色葡萄球菌信息素Agr D1基因所设计的具体双链寡聚核苷酸序列：
pCHCSACOM1
 1、5’-3’
gcg aat aag ttc tgg ggt att TAT TCC ACC TGT GAT TTT ATA ATG taa ata aaa tat aag aca ggc
3’-5’
gcc tgt ctt ata ttt tat tta CAT TAT AAAATC ACA GGT GGAATA aat acc cca gaa ctt att cgc
实施例2 表达小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽的质粒的构建和重组小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽的制备
原始质粒为装载了大肠菌素Ia通道结构域和Immunity蛋白基因的pET-15b商用质粒(质粒大小6.3kb，购自Novagen公司，上述基因由四川大学华西医院移植免疫实验室装载)，经双链寡聚核苷酸点突变技术(QuickChangeTM Kit，Strategene公司)将编码金黄色葡萄球菌信息素Agr D1的基因(序列表中SEQ ID NO.2所述核苷酸序列)插入到大肠菌素Ia通道结构域基因的D451位点前，制备出了抗菌多肽的一种重组质粒pCHCSACOM2(如图2所示)。重组质粒转染入E.coli TG1工程菌里制备多肽，获得序列表中SEQ ID NO 7所述的小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽，在继后的实施例中称为“抗菌多肽2(COM2)”。
突变程序按Strategene QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit(catalog#200518)药箱手册进行：
1、准备点突变反应物
5ul 10 x buffer
2ul(10ng)野生型大肠菌素Ia质粒
1.26ul(125ng)设计的5’-3’寡聚核苷酸引物
1.25ul(125ng)设计的3’-5’寡聚核苷酸引物
1ul dNTP
双蒸水50ul
1ul pfu
(除质粒、引物和双蒸水外，均为药箱所备试剂)
2、进行PCR扩增，扩增条件：变性95℃，35秒，退火53℃，70秒，延伸68℃，17分共20个循环；
3、加入Dpn1内切酶1ul消化母体DNA链后(37℃，1小时)，取1ul反应物与XL1-Blue感受态细胞50ul冰孵30分钟，行热冲击42℃，45秒，再置入冰中2分钟；
4、加入NZY培基0.5ml后220rpm，37℃摇菌1小时后，取50-100ul反应物铺板(LB培基加1％琼脂加50ug/ml氨苄青霉素，37℃过夜)；
5、18小时后挑菌，循Qiagene，Gibco等公司的各种商用提取质粒药箱提取质粒均可，测序确定突变成功；
6、将质粒50ng与制备的TG1工程菌感受态细胞50ul冰孵30分，42℃，90秒热冲击，取50-100ul反应物加入LB培基0.5ml，220rpm，37℃摇菌1小时后铺板(LB培基加1％琼脂加50ug/ml氨苄青霉素)37℃孵育，18小时后挑取菌落；
7、大量增菌，8-16升FB培基，250rpm，37℃，6-8小时；离心沉淀菌体，4℃，6000g，20分钟，取50mM Borate，2mM EDTA，2mM DTT，pH9.0，4℃50-80ml悬浮菌体，加入0.2M PMSF 250ul后行超声破碎(4℃，400W，2分钟)，高速离心沉淀破碎菌体(4℃，75000g，1.5小时)，取上清加入硫酸链霉素500万单位沉淀DNA，高速离心后(4℃，30000g，10分钟)取上清装入分子量15,000的透析袋于50mM Borate，2mM EDTA，2mM DTT，pH9.0，4℃溶液透析过夜后，高速离心后(4℃，30000g，10分钟)将上清上样于CM柱(Amersham Biosciences)，经0.2M NaCl，50mM Borate，2mM EDTA，2mM DTT，pH9.0，4℃溶液线性梯度洗脱后即可得到重组抗菌多肽，经10mM sodium phosphate，0.2MNaCl，2mM EDTA，pH7.4，4℃透析后备用。
制备pCHCSACOM2质粒的金黄色葡萄球菌信息素Agr D1基因的双链寡聚核苷酸序列按实施例1的方法设计。
实施例3 对青霉素敏感金黄色葡萄球菌的体外抑制试验
细菌为美国标准菌株，ATCC 25923青霉素敏感金黄色葡萄球菌，菌液5微升(108CFU/ml级菌量)加入1％胰蛋白胨，1％NaCl，0.5％酵母，0.5％葡萄糖，1％HK2PO4的培养液10ml中，共准备6组。第一组加入0.2M NaCl+10mM PBS缓冲液(量与实验组中加入的抗菌多肽及对照药物液体量相同)作为对照；第2组加入苯唑西林，9μg/ml，约合22nM/ml；第三组加入野生型大肠菌素Ia 7μg/ml，约合0.1nM/ml(大肠菌素保存液为0.2MNaCl+10mM PBS缓冲液)；第四组加入ZL 01128836.1所公开的抗菌工程多肽Ph-SA，7μg/ml，约合0.1nM/ml(保存液为0.2M NaCl+10mM PBS缓冲液)；第五组加入大肠菌素Ia通道结构域羧基端连接了金黄色葡萄球菌信息素Agr D1的小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽COM1(实施例1制备)，2μg/ml，约合0.1nM/ml(保存液为0.2M NaCl+10mM PBS缓冲液)，第六组加入大肠菌素通道结构域氨基端连接了金黄色葡萄球菌信息素Agr D1的小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽COM2(实施例2制备)，2μg/ml，约合0.1nM/ml(保存液为0.2MNaCl+10mM PBS缓冲液)。
上述各组液体置于100ml三角烧瓶中，200rpm，37℃生长，每小时采样100ul加入96孔酶标板中经分光光度计(A 595nm)比色测试细菌生长浊度，画出细菌生长曲线来比较抗菌多肽的抑菌效力，结果如图4所示，显示青霉素敏感金黄色葡萄球菌的生长只能被苯唑西林、ZL 01128836.1所公开的抗菌工程多肽和本发明所述小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽抑制。
实施例4 对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的体外抑制试验
细菌为美国标准菌株，ATCC BAA-42耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，菌液5微升(108CFU/ml级菌量)加入1％胰蛋白胨，1％NaCl，0.5％酵母，0.5％葡萄糖，1％HK2PO4的培养液10ml中，共准备6组。第一组加入0.2M NaCl+10mM PBS缓冲液(量与实验组中加入的抗菌多肽及对照药物液体量相同)作为对照；第二组加入苯唑西林，9μg/ml，约合22nM/ml；第三组加入野生型大肠菌素Ia 7μg/ml，约合0.1nM/ml(大肠菌素保存液为0.2MNaCl+10mM PBS缓冲液)；第四组加入ZL 01128836.1所公开的抗菌工程多肽Ph-SA，7μg/ml，约合0.1nM/ml(保存液为0.2M NaCl+10mM PBS缓冲液)；第五组加入大肠菌素Ia通道结构域羧基端连接了金黄色葡萄球菌信息素Agr D1的小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽COM1(实施例1制备)，2μg/ml，约合0.1nM/ml(保存液为0.2M NaCl+10mM PBS缓冲液)；第六组加入大肠菌素Ia通道结构域氨基端连接了金黄色葡萄球菌信息素Agr D1的小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽COM2(实施例2制备)，2μg/ml，约合0.1nM/ml(保存液为0.2M NaCl+10mM PBS缓冲液)。
上述各组液体置于100ml三角烧瓶中，200rpm，37℃生长，每小时采样100ul加入96孔酶标板中经分光光度计(A 595nm)比色测试细菌生长浊度，画出细菌生长曲线来比较抗菌多肽的抑菌效力，结果如图5所示，在相同浓度下，野生型大肠菌素Ia和ZL01128836.1所公开的抗菌工程多肽均不能有效的抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生长；浓度大于小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽220倍的苯唑西林也不能有效的抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生长；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生长只能被COM1(实施例1制备)小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽抑制。
实施例5 对大肠杆菌的体外抗菌活性试验
细菌为R361大肠杆菌，菌液5微升(108CFU/ml级菌量)加入1％胰蛋白胨、1％NaCl、0.5％酵母的LB培养液10ml中，共准备6组。第一组加入0.2M NaCl+10mM PBS缓冲液(量与实验组中加入的药物液体量相同)作为对照；第二组加入野生型大肠菌素Ia7μg/ml，约合0.1nM/ml(大肠菌素保存液为0.2M NaCl+10mM PBS缓冲液)；第三组加入ZL 01128836.1所公开的抗菌工程多肽Ph-SA，7μg/ml，约合0.1nM/ml(保存液为0.2M NaCl+10mM PBS缓冲液)；第四组加入大肠菌素Ia通道结构域羧基端连接了金黄色葡萄球菌信息素Agr D1的小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽COM1(实施例1制备)，2μg/ml，约合0.1nM/ml(保存液为0.2M NaCl+10mM PBS缓冲液)。
上述各组液体置于100ml三角烧瓶中，200rpm，37℃生长，每小时采样100ul加入96孔酶标板中经分光光度计(A 595nm)比色测试细菌生长浊度，画出细菌生长曲线来比较各组的抑菌效力，结果如图6所示，显示大肠杆菌的生长只能被野生型大肠菌素Ia和ZL 01128836.1所公开的抗菌工程多肽所抑制。而本发明的小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽却不能抑制大肠杆菌的生长。
实施例6 对耐药金黄色葡萄球菌β-内酰胺酶分泌的的体外抑制活性试验
细菌为美国标准菌株，ATCC 29213产β-内酰胺酶金黄色葡萄球菌，菌液5微升(108CFU/ml级菌量)加入1％胰蛋白胨、1％NaCl、0.5％酵母、0.5％葡萄糖、1％HK2PO4的培养液10ml于100ml三角烧瓶中，200rpm，37℃生长至光密度值0.3(A595nm)，共准备4组。第一组加入0.2M NaCl+10mM PBS缓冲液(量与各实验组中加入的药物液体量相同)作为对照；第二组加入青霉素G钠10μg/ml；第三组加入大肠菌素Ia通道结构域羧基端连接了金黄色葡萄球菌信息素Agr D1的小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽COM1(实施例1制备)，5μg/ml(保存液为0.2M NaCl+10mM PBS缓冲液)；第四组加入大肠菌素Ia通道结构域羧基端连接了金黄色葡萄球菌信息素Agr D1的小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽COM1(实施例1制备)2.5μg/ml和青霉素G钠5μg/ml(保存液为0.2M NaCl+10mM PBS缓冲液)。每1小时测定各组细菌在595nm处的光密度值，同时定量检测其β-内酰胺酶活性并与对照相比较。酶活性检测为取菌液离心后用PBS(pH7.2，浓度0.05M)重悬菌体，然后与溶葡萄球菌酶(lysostaphin)于37℃孵育1小时获得酶粗提液，适当稀释后与0.01mol/ml头孢硝噻吩于37℃反应，386nm波长下读取OD值，并根据5分钟内OD的下降值计算出酶活性。结果如图7所示，显示本发明所述小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽有效地抑制了金黄色葡萄球菌β-内酰胺酶的分泌；而青霉素G钠却刺激金黄色葡萄球菌分泌β-内酰胺酶。
实施例7 对耐药金黄色葡萄球菌δ-溶血素分泌的的体外抑制活性试验
细菌为美国标准菌株，ATCC BAA-42耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，菌液5微升(108CFU/ml级菌量)加入1％胰蛋白胨、1％NaCl、0.5％酵母、0.5％葡萄糖、1％HK2PO4的培养液10ml于100ml三角烧瓶中，200rpm，37℃生长至光密度值0.2(A595nm)，共准备3组。第一组加入0.2M NaCl+10mM PBS缓冲液(量与实验组中加入的抗菌多肽及对照药物液体量相同)作为对照；第二组加入青霉素G钠5μg/ml，约合0.1nM/ml；第三组加入大肠菌素Ia通道结构域羧基端连接了金黄色葡萄球菌信息素Agr D1的小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽COM1(实施例1制备)，2μg/ml，约合0.1nM/ml(保存液为0.2M NaCl+10mM PBS缓冲液)。后继续培养，分别于加药后1，2，3，4，5，6，7小时各取1ml菌液，19,000g离心5分钟，上清经0.22μm滤膜过滤，取600μl滤进行HPLC分析，流动相A为0.1％三氟乙酸(TFA)/10％乙晴(acetonitrile)，流动相B为0.1％TFA/90％acetonitrile，体积流速1ml/min，上样后，先以11％B洗脱杂蛋白，然后用11％-100％的B进行线性梯度洗脱，数据采用重复测量的方差分析。结果如图8所示，显示本发明所述小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽有效地抑制了金黄色葡萄球菌δ-溶血素的分泌。
实施例8 小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽的体外抗菌活性试验
1、药物
小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽COM1(实施例1制备)，注射用头孢唑林钠，注射用青霉素钠，注射用苯唑西林钠，注射用万古霉素，Ph-SA(ZL 01128836.1所公开的抗菌工程多肽)。
以上样品用无菌水溶解稀释，药物终浓度为256mg/L，128mg/L，64mg/L，32mg/L，16mg/L，8mg/L，4mg/ml，2mg/L，1mg/ml，0.5mg/L，0.25mg/L，0.125mg/L，0.06mg/L，0.03mg/L，0.015mg/L。
2、细菌
临床分离菌株：试验所用菌株均为2002年从四川、北京地区收集的临床分离致病菌，所有菌种在收集分离的单位(华西医科大学检验科及重庆医科大学传染科细菌室)均经鉴定后，再经四川大学华西医院移植免疫实验室用API系统重新鉴定后使用。
金黄色葡萄菌128株(MRSA菌株74株，MSSA菌株54株)、表皮葡萄球菌39株(MRSE菌株14株，MSSE菌株25株)、肠球菌22株、大肠杆菌20株、铜绿假单孢菌15株，共224株。
3、结果
  菌株   药物      MIC50   MIC90    MIC范围
MRSA(74)   COM1      8       16       0.125-32头孢唑林  ＞128   256      2-＞256青霉素    ＞128   ＞128    4-256苯唑西林  ＞128   ＞128    4-256万古霉素  0.5     8        0.03-32Ph-SA    16       64       0.005-128
MSSA(54)   COM1     0.5      4        0.00125-32头孢唑林 0.25     0.5      0.025-＞128青霉素   16       ＞32     0.0015-128苯唑西林 0.125    0.5      0.0015-8万古霉素 0.5      1        0.03-4Ph-SA    0.5      8        0.05-32
MRSE(14)   COM1     16       32       0.0125-64头孢唑林 128      ＞256    0.25-＞256青霉素   ＞128    ＞128    8-256苯唑西林 128      ＞128    4-＞256万古霉素 0.5      1        0.03-16Ph-SA    ＞64     ＞64     0.25-128
MSSE(25)   COM1     4        8        0.00125-32头孢唑林 0.25     128      0.0125-＞128青霉素   16       128      4-256苯唑西林 0.125    1        0.004-2万古霉素 0.5      1        0.00125-8Ph-SA    ＞1      32       0.005-64
肠球菌(22)   COM1     32     64        0.25-64头孢唑林 32     128       2-＞256青霉素   64     ＞64      4-256苯唑西林 32     ＞128     4-256万古霉素 1      ＞4       0.5-64Ph-SA    ＞64   128       4-128
大肠杆菌(20)   COM1     64     128       16-128头孢唑林 ＞128  256       2-＞256青霉素   ＞128  ＞128     4-256苯唑西林 ＞128  ＞128     4-256万古霉素 128    ＞128     2-128Ph-SA    16     64        0.005-128
  铜绿假单孢菌(15)   COM1     128    ＞128     64-256头孢唑林 ＞128  256       128-＞256青霉素   ＞128  ＞128     ＞128苯唑西林 ＞128  ＞128     ＞128万古霉素 128    ＞128     64-＞128Ph-SA    8      ＞64      2-128
MRSA体外抗菌活性比较：苯唑西林MIC90测定值比本发明所述小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽测定值大8倍，比万古霉素测定值大16倍。本发明所述小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽分子量(26,000)是万古霉素分子量(1,400)的19倍，苯唑西林分子量(400)的65倍。按单位体积内相同药物分子数来标化，则本发明所述小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽对MRSA体外抗菌活性相当于万古霉素对MRSA体外抗菌活性的8倍，相当于苯唑西林对MRSA体外抗菌活性的520倍，数倍于ZL01128836.1所公开的抗菌工程多肽(分子量70,000)对MRSA体外抗菌活性。
实施例9 小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽的动物体内保护试验
1、实验材料
(1)药物
小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽COM1(实施例1制备)，注射用头孢唑林钠，注射用青霉素钠，注射用苯唑西林钠，注射用万古霉素，药物注射终浓度为10mg/kg、5mg/kg、2.5mg/kg。
(2)细菌
ATCC BAA-42耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，ATCC 29213耐青霉素金黄色葡萄球菌(产青霉素酶株)，ATCC 700802耐万古霉素肠球菌(VRE)。
2、实验方法
昆明小鼠120只，雌雄各半，体重18-22克，随机分组为腹腔分别注射ATCCBAA-42耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，ATCC 29213耐青霉素金黄色葡萄球菌和ATCC 700802耐万古霉素肠球菌(VRE)三个大组，其中青霉素，头孢唑林，苯唑西林，万古霉素和本发明所述小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽COM1试验组分别为每组小鼠10只，对照组10只。腹腔注射致死剂量的细菌后(0.5ml，5.2×106CFU/ml)，各药物试验组小鼠自静脉注射10mg/kg、5mg/kg、2.5mg/kg剂量的药物一次，每24小时观察结果，连续7-14天，以小鼠死亡为阳性结果。
3、结果
10mg/kg、5mg/kg、2.5mg/kg药物剂量组结果显示，小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽COM1组小鼠存活率在3个剂量组中与万古霉素组小鼠存活率始终保持了恒定的差距，因此在体内试验中小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽COM1对抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的治疗效果远优于万古霉素，这是由于小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽COM1具有杀菌和抑制细菌毒素分泌的双重功能。因此该药在临床应用时将具有现有抗菌素无法比拟的治疗效果。其它各抗菌素组小鼠死亡率≥80％，已不具备可比性；对照组于48小时内全部死亡。实验结果见下表。
  细菌(菌号)感染菌量(cfu/ml) 药物 MIC50(μg/ml) ED50mg/kg   95％可信限(mg/kg)
  肠球菌ATCC700802VRE(8.0×106)   COM1   ＞32   4.23(3.70)   2.09-7.62
  头孢唑啉   ＞128   ＞10(14.01)   ＞10
  青霉素   16   ＞16(17.50)   14.37-19.6
  苯唑西林   0.5   6.77(6.50)   6.51-8.34
  万古霉素   14   5.17(4.64)   3.74-6.34
  金葡球菌MRSABAA-42(4.5×106)   COM1   8   2.24(2.61)   2.08-4.04
  头孢唑啉   128   9.77(8.56)   8.04-18.44
  青霉素   64   ＞12(15.09)   ＞12
  苯唑西林   128   12.36(11.55)   10.21-18.64
  万古霉素   0.5   3.78(3.66)   2.44-7.42
  金葡球菌ATCC 29213(4.6×106)   COM1   0.5   4.13(3.36)   3.24-8.76
  头孢唑啉   ＞64   27.11(21.06)   20.51-59.25
  青霉素   32   12.16(11.76)   6.32-15.11
  苯唑西林   4   6.43(5.87)   5.2-14.31
  万古霉素   0.5   3.25(3.16)   1.89-4.47
由表中结果可以看出：SA小鼠体内保护试验中，最小剂量(2.5mg/kg)条件下小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽COM1的死亡率最低(30％)，其它各组死亡率分别为，青霉素组80％，头孢唑林组100％，苯唑西林组100％，万古霉素组60％，对照组100％。该结果显示，本发明所述小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽的保护率最高(70％)；万古霉素的保护率次之(40％)。
实施例10 对β-内酰胺抗菌素体内保护作用的增效试验
1、实验材料
(1)药物
本发明所述小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽COM1(实施例1制备)，青霉素G钠。
(2)细菌
ATCC 29213耐青霉素金黄色葡萄球菌(产青霉素酶株)。
2、实验方法
昆明小鼠20只，雌雄各半，体重18-22克，随机分组腹腔分别注射ATCC 29213耐青霉素金黄色葡萄球菌(0.5ml，4.8×105CFU/ml)。腹腔注射致死剂量的细菌1小时后，各药物试验组小鼠自静脉注射相应剂量的药物一次，每24小时观察结果，连续7-14天，以小鼠死亡为阳性结果。图9中a为对照组(0.9％NaCl，n＝5)，b为青霉素G钠组(10.75mg/kg，n＝5)，c为半量青霉素G钠和半量本发明所述小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽组(5.17mg/kg小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽+5.37mg/kg青霉素G钠，n＝5)，d为本发明所述小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽组(10.35mg/kg，n＝5)。
小鼠体内保护试验中，本发明所述小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽的死亡率最低(0％)，其它各组死亡率分别为，青霉素组60％，半量青霉素G钠和半量本发明所述小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽组20％。该结果显示半量小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽使半量青霉素G钠的保护率比全量青霉素G钠的保护率提高了2倍。
实施例11 小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽体内毒性试验
昆明小鼠10只，雌雄各半，体重18-22克，腹腔每日注射10mg/kg本发明所述小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽COM1共20日，所有小鼠均存活，体重增加，处死后取肝，肾，和脾等切片观察，未见形态学异常，详情请见附图10。该结果说明本发明所述小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽在本实施例试验中未出现现有抗菌药物的毒副作用。
                        SEQUENCE LISTING
<110>四川大学华西医院
<120>小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽及其应用与制备方法
<160>7
<170>PatentIn Version 3.2
<210>1
<211>528
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<220>
<221>misc_feature
<222>(1).....(528)
<223>菌素Ia通道结构域基因
<400>1
gacgcaatta atttcacaac agagttcctg aaatcagttt cagaaaaata tggtgcaaaa   60
gctgagcagt tagccagaga gatggccggg caggctaaag ggaagaaaat acgtaatgtt   120
gaagaggcat taaaaacgta tgaaaagtac cgggctgaca ttaacaaaaa aattaatgca   180
aaagatcgtg cagcgattgc cgcagccctt gagtctgtga agctgtctga tatatcgtct   240
aatctgaaca gattcagtcg gggactggga tatgcaggaa aatttacaag tcttgctgac   300
tggatcactg agtttggtaa ggctgtccgg acagagaact ggcgtcctct ttttgttaaa   360
acagaaacca tcatagcagg caatgccgca acggctcttg tggcactggt cttcagtatt   420
cttaccggaa gcgctttagg cattatcggg tatggtttac tgatggctgt caccggtgcg   480
ctgattgatg aatcgcttgt ggaaaaagcg aataagttct ggggtatt                528
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>
<220>
<222>(1).....(24)
<223>金黄色葡萄球菌信息素D1基因
<400>2
tattccacct gtgattttat aatg
<210>3
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<223>金黄色葡萄球菌信息素D1多肽氨基酸序列
<400>3
 Tyr Ser Thr Cys Asp Phe Ile Met
  1               5
<210>4
<211>552
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1).....(552)
<223>编码抗耐药金黄色葡萄球菌多肽的基因1
<400>4
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tggatcactg agtttggtaa ggctgtccgg acagagaact ggcgtcctct ttttgttaaa   360
acagaaacca tcatagcagg caatgccgca acggctcttg tggcactggt cttcagtatt   420
cttaccggaa gcgctttagg cattatcggg tatggtttac tgatggctgt caccggtgcg   480
ctgattgatg aatcgcttgt ggaaaaagcg aataagttct ggggtattta ttccacctgt   540
gattttataa tg                                                       552
<210>5
<211>184
<212>PRT
<213>人工序列
<223>小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽氨基酸序列1
<400>5
Asp Ala Ile Asn Phe Thr Thr Glu Phe Leu Lys Ser Val Ser Glu
1               5                   10                  15
Lys Tyr Gly Ala Lys Ala Glu Gln Leu Ala Arg Glu Met Ala Gly
                20                  25                  30
Gln Ala Lys Gly Lys Lys Ile Arg Asn Val Glu Glu Ala Leu Lys
                35                  40                  45
Thr Tyr Glu Lys Tyr Arg Ala Asp Ile Asn Lys Lys Ile Asn Ala
                50                  55                  60
Lys Asp Arg Ala Ala Ile Ala Ala Ala Leu Glu Ser Val Lys Leu
                65                  70                  75
Ser Asp Ile Ser Ser Asn Leu Asn Arg Phe Ser Arg Gly Leu Gly
                80                  85                  90
Tyr Ala Gly Lys Phe Thr Ser Leu Ala Asp Trp Ile Thr Glu Phe
                95                  100                 105
Gly Lys Ala Val Arg Thr Glu Asn Trp Arg Pro Leu Phe Val Lys
                110                 115                 120
Thr Glu Thr Ile Ile Ala Gly Asn Ala Ala Thr Ala Lue Val Ala
                125                 130                 135
Leu Val Phe Ser Ile Leu Thr Gly Ser Ala Leu Gly Ile Ile Gly
                140                 145                 150
Tyr Gly Leu Leu Met Ala Val Thr Gly Ala Leu Ile Asp Glu Ser
                155                 160                 165
Leu Val Glu Lys Ala Asn Lys Phe Trp Gly Ile Tyr Ser Thr Cys
                170                 175                 180
Asp Phe Ile Met
            184
<210>6
<211>552
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1).....(552)
<223>编码抗耐药金黄色葡萄球菌多肽的基因2
<400>6
tattccacct gtgattttat aatggacgca attaatttca caacagagtt cctgaaatca   60
gtttcagaaa aatatggtgc aaaagctgag cagttagcca gagagatggc cgggcaggct   120
aaagggaaga aaatacgtaa tgttgaagag gcattaaaaa cgtatgaaaa gtaccgggct   180
gacattaaca aaaaaattaa tgcaaaagat cgtgcagcga ttgccgcagc ccttgagtct   240
gtgaagctgt ctgatatatc gtctaatctg aacagattca gtcggggact gggatatgca   300
ggaaaattta caagtcttgc tgactggatc actgagtttg gtaaggctgt ccggacagag   360
aactggcgtc ctctttttgt taaaacagaa accatcatag caggcaatgc cgcaacggct   420
cttgtggcac tggtcttcag tattcttacc ggaagcgctt taggcattat cgggtatggt   480
ttactgatgg ctgtcaccgg tgcgctgatt gatgaatcgc ttgtggaaaa agcgaataag   540
ttctggggta tt                                                       552
<210>7
<211>184
<212>PRT
<213>人工序列
<223>小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽氨基酸序列2
<400>7
Tyr Ser Thr Cys Asp Phe Ile Met Asp Ala Ile Asn Phe Thr Thr
1               5                   10                  15
Glu Phe Leu Lys Ser Val Ser Glu Lys Tyr Gly Ala Lys Ala Glu
                20                  25                  30
Gln Leu Ala Arg Glu Met Ala Gly Gln Ala Lys Gly Lys Lys Ile
                35                  40                  45
Arg Asn Val Glu Glu Ala Leu Lys Thr Tyr Glu Lys Tyr Arg Ala
                50                  55                  60
Asp Ile Asn Lys Lys Ile Asn Ala Lys Asp Arg Ala Ala Ile Ala
                65                  70                  75
Ala Ala Leu Glu Ser Val Lys Leu Ser Asp Ile Ser Ser Asn Leu
                80                  85                  90
Asn Arg Phe Ser Arg Gly Leu Gly Tyr Ala Gly Lys Phe Thr Ser
                95                  100                 105
Leu Ala Asp Trp Ile Thr Glu Phe Gly Lys Ala Val Arg Thr Glu
                110                 115                 120
Asn Trp Arg Pro Leu Phe Val Lys Thr Glu Thr Ile Ile Ala Gly
                125                 130                 135
Asn Ala Ala Thr Ala Lue Val Ala Leu Val Phe Ser Ile Leu Thr
                140                 145                 150
Gly Ser Ala Leu Gly Ile Ile Gly Tyr Gly Leu Leu Met Ala Val
                155                 160                 165
Thr Gly Ala Leu Ile Asp Glu Ser Leu Val Glu Lys Ala Asn Lys
                170                 175                 180
Phe Trp Gly Ile
            184

Claims (10)

1、一种编码小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽的基因，其特征在于该基因由编码大肠菌素通道结构域的基因与编码金黄色葡萄球菌信息素的基因组成。
2、根据权利要求1所述的抗耐药金黄色葡萄球菌多肽的基因，其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO 4所述的核苷酸序列。
3、根据权利要求1所述的抗耐药金黄色葡萄球菌多肽的基因，其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO 6所述的核苷酸序列。
4、一种小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽的重组质粒，其特征在于它含有权利要求1或2或3所述的基因。
5、一种小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽，其特征在于它由权利要求4所述的重组质粒表达而成。
6、根据权利要求5所述的小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽，其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO.5所述的氨基酸序列。
7、根据权利要求5所述的小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽，其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO.7所述的氨基酸序列。
8、权利要求5至7之一所述多肽在制备治疗或预防耐药金黄色葡萄球菌感染的药中的应用。
9、权利要求5至7之一所述多肽在制备β-内酰胺类抗菌素增效剂和细菌毒素抑制剂中的应用。
10、一种权利要求5至7之一所述多肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
将编码金黄色葡萄球菌信息素的基因可操作地与大肠菌素通道结构域基因连接获得编码重组小型化抗耐药金黄色葡萄球菌多肽基因的重组质粒，将获得的重组质粒转染入大肠杆菌工程菌中而获得可产生重组抗菌多肽的工程菌细胞，用CM柱分离纯化即获得本发明所述的抗耐药金黄色葡萄球菌多肽。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007083175A1 (en) * 2006-01-17 2007-07-26 West China Hospital, Sichuan University Antiviral bifunctional molecules, methods of construction and methods of treating virus-induced cancer therewith
WO2011026447A1 (zh) * 2009-09-02 2011-03-10 畿晋庆三联（北京）生物技术有限公司 一种含抗体模拟物的新型抗生素及其制备方法与应用
CN101643501B (zh) * 2008-11-07 2012-06-20 畿晋庆三联（北京）生物技术有限公司 一种新型抗生素及其核苷酸序列、制备方法与应用
CN106729610A (zh) * 2016-12-16 2017-05-31 湖北工业大学 N15多肽在抑制金黄色葡萄球菌抑制剂中的用途
CN107286224A (zh) * 2010-05-05 2017-10-24 纽约大学 金黄色葡萄球菌杀白细胞素及其治疗组合物和用途

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1164612C (zh) * 2001-09-11 2004-09-01 四川新泰克控股有限责任公司 人工组合的抗菌工程多肽及其制备方法
CN1403484A (zh) * 2002-10-11 2003-03-19 浙江大学 跨膜型金黄色葡萄球菌肠毒素a融合蛋白的制备及应用

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007083175A1 (en) * 2006-01-17 2007-07-26 West China Hospital, Sichuan University Antiviral bifunctional molecules, methods of construction and methods of treating virus-induced cancer therewith
CN101643501B (zh) * 2008-11-07 2012-06-20 畿晋庆三联（北京）生物技术有限公司 一种新型抗生素及其核苷酸序列、制备方法与应用
WO2011026447A1 (zh) * 2009-09-02 2011-03-10 畿晋庆三联（北京）生物技术有限公司 一种含抗体模拟物的新型抗生素及其制备方法与应用
AP3302A (en) * 2009-09-02 2015-06-30 Protein Design Lab Ltd New antibiotic containing simulacrum antibody, preparation method and application thereof
EA028912B1 (ru) * 2009-09-02 2018-01-31 Протеин Дизайн Лаб., Лтд. Новый антибиотик, содержащий миметическое антитело, способы его приготовления и применения
CN107286224A (zh) * 2010-05-05 2017-10-24 纽约大学 金黄色葡萄球菌杀白细胞素及其治疗组合物和用途
CN106729610A (zh) * 2016-12-16 2017-05-31 湖北工业大学 N15多肽在抑制金黄色葡萄球菌抑制剂中的用途

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