CN1634981A

CN1634981A - 一组新的抗菌肽及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN1634981A
Application number: CN 200410068195
Authority: CN
Inventors: 黄青山; 李国栋
Original assignee: SHANGHAI GAOKE UNION BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI GAOKE UNION BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd
Priority date: 2004-11-16
Filing date: 2004-11-16
Publication date: 2005-07-06
Anticipated expiration: 2024-11-16
Also published as: CN1634981B

Abstract

本发明提供一组新的抗菌肽，这些抗菌肽具有比天然抗菌肽更强的杀菌活性，对各种致病菌的杀灭效果都很好。本发明还公开了该组抗菌肽的制备方法，可以用固相化学法合成，也可以通过基因工程表达获得。本发明合成抗菌肽可以用于制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌或病毒感染引起的疾病的药物。

Description

一组新的抗菌肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一组抗菌肽、其制备方法及在制备治疗细菌、真菌、病毒感染的药物中的应用。

背景技术

抗菌肽是生物体经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，一般由20-60个氨基酸组成，分子量在2000-7000D左右。随着医学免疫学和分子生物学的迅速发展，抗菌肽的研究越来越成为生物技术与生物医药领域中的热门课题。至今为止，在许多动物(尤其是昆虫)、植物、微生物和人体上已发现了超过200多种抗菌肽，这类短肽不仅对细菌、真菌有广谱的杀菌作用，而且对病毒、原虫及癌细胞也有攻击作用。临床试验也表明，在机体感染病菌或可能导致病菌感染的情况下，抗菌肽能快速杀灭已侵入的病菌，并且能阻止病菌的继续侵染。

随着对抗菌肽一级结构和高级结构研究的不断深入，已有许多研究者对这些抗菌肽的结构和功能进行研究，发现在模拟膜的疏水环境下，分子中的α-螺旋度与其杀菌活性密切相关。另外研究结果表明抗菌肽是通过破坏膜的完整性使得细菌细胞膜渗漏而杀死细菌(Nakajima Y.etal.，J.Biol.Chem，262：1665-1669；Zasloff M.Nature，2002，415：389-395)。因此有人试图通过增加分子中α-螺旋结构或提高多肽中含正电荷氨基酸的比例来寻找更强抗菌活性的多肽(Broth W.B.etal.，Antimicrobial Agents Chemotherapy，2001，45：1894-1895；HongS.Y.etal.，Peptides，2001，22：1669-1674)。

美国专利6,316,594公开了天然抗菌肽parasinI，它是一种新的从鲶鱼中分离出来的，是由鲶鱼在表皮损伤时为防止微生物的入侵其上皮粘膜层产生出一种具有很强抗菌作用的多肽，属于α-螺旋抗菌肽，分子量为2000.4Da，由19个氨基酸残基组成，序列为：Lys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys Thr Arg Ser Ser。尽管专利文献中的Parasin I对微生物表现出非常有效的广谱抗菌活性，包括革兰阳性和革兰阴性细菌以及真菌，而且没有任何溶血性。它合成的衍生物也具有有效的活性。但是在我们实验中却发现其杀菌活性较低，天然序列很难应用于临床，但是Parasin I基本没有溶血性，它的一些相关的序列改造和功能应用方面的开发还进行的较少。

所以本发明想通过对Parasin I序列的改造，得到杀菌活性更强的有药用开发价值的抗菌肽，即可以形成新的专利技术。

发明内容

本发明需要解决的技术问题之一是提供一组抗菌肽。

本发明需要解决的技术问题之二是提供一组抗菌肽的制备方法。

本发明需要解决的技术问题之三是公开所述抗菌肽的应用。

本发明的发明构思是这样的：我们在经过多次试验后发现在Parasin I序列中间隔插入疏水性氨基酸和带正电荷的氨基酸后，形成两个疏水氨基酸和两个正电荷氨基酸交替排布的序列，这样的结构减低毒性并提高杀菌活性。经过改造后筛选到以下12条序列，抑杀菌试验证明其杀菌活性有较大的提高。而溶血毒性基本没有变化，非常有希望用于治疗细菌感染的新药的开发。

本发明提供的抗菌肽是在对天然抗菌肽的序列、结构分析的基础上设计合成的，它们的这一系列序列被命名为GKV，序列如下：

GK V-1：Lys Gly Ala Arg Lys Gly Ala Lys Arg Gln Gly Gly Lys Lys Val Ala Arg Lys Ala Leu Lys ArgAla Gly Lys

GKV-2：Lys Gly Gly Arg Lys Gly Ala Lys Arg Gln Gly Gly Lys Lys Leu Ala Arg Lys Ala Leu LysArg Ala Gly Arg

GKV-3：Lys Gly Gly Arg Lys Gly Ala Lys Arg Gln Gly Gly Lys Lys Leu Ala Arg Lys Ala Leu Lys

GKV-4：Lys Gly Val Arg Lys Gly Ala Lys Arg Gln Gly Cys Lys Lys Leu Ala Arg Lys Ala Leu Lys

GKV-5：Lys Gly Ala Arg Arg Gly Ala Lys Arg Gly Gly Lys Lys Leu Ala Arg Lys Ala Leu Lys

GKV-6：Lys Gly Ala Arg Arg Leu Ala Lys Arg Ser Gly Lys Lys Val Ala Arg Lys Ala Gly Arg

GKV-7：Lys Phe Ala Arg Arg Leu Ala Lys Arg Leu Gly Lys Lys Val Ala Arg Lys Leu Gly Arg

GKV-8：Lys Phe Leu Arg Arg Leu Ile Lys Arg Leu Val Lys Lys Val Leu Arg Lys Leu Gly Arg

GKV-9：Lys Ala Ala Lys Lys Ala Ala Lys Arg Ala Ala Lys Lys Ala Thr Arg

GKV-10：Lys Ala Leu Lys Lys Ala Leu Lys Arg Ala Leu Lys Lys Ala Leu Arg

GKV-11：Lys Gly Leu Lys Lys Gly Leu Lys Arg Gly Leu Lys Lys Gly Leu Arg

GKV-12：Lys Ala Thr Lys Lys Ala Leu Lys Arg Ala Gly Lys Lys Ala Thr Arg

本发明提供的一组抗菌肽，其制备方法可以是固相化学法，也可以将抗菌肽的编码基因克隆到载体上，然后在宿主细胞中表达后获得。其中表达载体可以是质粒或病毒中的一种，宿主细胞可以是原核细胞，包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等，宿主细胞也可以是真核细胞、包括酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。制备的抗菌肽可通过质谱鉴定。

为了深入研究本发明这类生物学活性抗菌肽的结构与功能关系，利用美国应用系统生物公司生产的Pioneer多肽合成仪制备本发明公开的一组抗菌肽和作为对照的抗菌肽，以进行研究。

利用96孔板法检测多肽的杀菌活性(In Yup Park etc；FEBS Letters；437(1998)258-262)以预先合成的天然抗菌肽GramicidinS，parasinI，magaininII为对照，进行杀菌活性检测。结果表明本发明抗菌肽的杀菌活性强于所述三种天然抗菌肽的杀菌活性。

抗菌肽在高效杀菌的同时也有可能作用于高等有机体包括人体细胞，因为抗菌肽的作用方式都是在细胞膜上穿孔使得细胞发生渗漏死亡。所以把抗菌肽能否使红细胞发生渗漏作为其是否有毒性的一个标准，如果抗菌肽能使红细胞中的血红蛋白发生渗漏，就可以通过检测OD₄₉₀值确定毒性的大小。因此本发明还检测了抗菌肽对人体红细胞的溶血活性，实验表明，抗菌肽溶血率值很低，证实本发明抗菌肽的溶血毒性极小。

此外，又对本发明抗菌肽进行动物体内急性毒性试验，证明抗菌肽无毒性作用。又进行抗菌肽对小白鼠急性感染金黄色葡萄球菌的抑制作用的试验，表明抗菌肽对金黄色葡萄球菌感染有显著的抑制作用。

本发明提供一组新的人工设计合成的抗菌肽。可方便地采用固相化学法制备或将编码抗菌肽的基因克隆到载体上，然后进入宿主细胞中表达后获得。该抗菌肽对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌、病毒具有广谱杀伤活性，并较天然抗菌肽有更强的杀菌活性，但对动、植物细胞无任何毒害作用。并通过抗菌肽对金黄色葡萄球菌急性感染杀菌活性的小鼠试验显示抗菌肽给予0.25mg/kg剂量，就能达到100％杀菌抑制率，而作为杀灭金黄色葡萄球菌特效药的万古霉素要给予4.0mg/kg剂量才能达到100％的杀菌抑制率，表明本发明抗菌肽对金黄色葡萄球菌急性感染有很显著的杀菌效果，因此本发明抗菌肽可应用于制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或真菌感染引起的疾病的药物。

附图说明

图1是抗菌肽GKV-4的质谱图。

具体实施方式

实施例1抗菌肽的固相化学合成制备及分离纯化

按上述序列制备GKV-1到GKV-12，同时制备GramicidinS，parasinI和magaininII作为对照。

GramicidinS的序列：

Val Orn Leu Phe Pro Val Orn Leu Phe Pro

ParasinI的序列

Lys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys Thr Arg Ser Ser

magaininII的序列：

Gly Ile Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe Val Gly Glu

Ile Met Asn Ser

本实施例采用固相化学法合成，所用仪器为美国应用生物系统公司生产的Pioneer多肽合成仪。合成的多肽经过高浓度的TFA剪切后，用反向柱纯化，纯化后的多肽通过质谱鉴定。具体试验步骤如下：

1、抗菌肽的制备(以制备0.1mmol量的GKV-1为例)

以下所有制备抗菌肽的试剂均购于美国应用生物系统公司。

制备的GKV-1多肽序列为

N-Lys Gly Val Arg Lys Gly Ala Lys Arg Gln Gly Cys Lys Lys Leu Ala Arg Lys Ala Leu Lys-C

制备从C端到N端逐个进行，由合成仪自动控制。首先称量0.1mmol的结合了第一个氨基酸即Arg的树脂(购于美国应用生物系统公司)，装柱，再用20％哌啶二甲基甲酰胺溶液脱保护，二甲基甲酰胺清洗，9-笏甲氧羰基(Fmoc)保护的游离氨基酸溶解于碳二亚胺(DCC)，羟基苯并三唑(HOBt)/二异丙基乙基胺(DIPEA)，溶解后的溶液在柱上循环偶合反应30分钟，二甲基甲酰胺清洗重复以上脱保护到偶合反应步骤直到制备结束(具体操作步骤见pioneer多肽合成仪操作指南)。

制备后的多肽经如下步骤剪切：

取下反应后的树脂，加入B型剪切液(88％三氟乙酸，5％苯酚，5％水，2％三异丙基硅烷)，室温反应2小时，过滤，滤出液中加入10倍体积的预冷无水乙醚，4000转/分钟离心10分钟，收集沉淀并室温干燥。

2、抗菌肽纯化

称量一定量干燥后的多肽，溶于0.1％三氟乙酸，样品处理后经反向柱分离(洗脱液为含80％乙氰的0.1％三氟乙酸)，收集洗脱峰。

实施例2抗菌肽GK V-4基因在大肠杆菌中的表达

首先设计合成编码抗菌肽的GK V-4基因，将其克隆到pGEX-4T1载体上(购自Amersham Pharmcia Biotech公司)，然后转化大肠杆菌JM109，经IPTG诱导表达GST-GKV-4融合蛋白，再经凝血酶切割后，得抗菌肽GK V-4。

实施例中使用的ATP，IPTG，T₄多聚核苷酸激酶、T₄DNA连接酶，Klenow酶、限制性内切酶除特别指明外均为BIOLAB公司产品，割胶回收试剂盒为上海生工公司产品，寡聚核苷酸为上海生工生物工程技术服务有限公司合成。凝血酶剪切试剂盒购于SIGMA公司。

有关DNA的分离、纯化、PCR扩增、酶解、质粒转化宿主菌、片段回收、连接等分子克隆操作均按照J.沙姆布鲁克等编著的《分子克隆实验指南》进行。大肠杆菌JM109培养在液体或固体的LB培养基中。

采用大肠杆菌偏爱的密码子设计编码优选抗菌肽GK V-4基因的DNA序列，序列如下。在抗菌肽GK V-4基因的5’端引入酶切位点BamHI(GGATCC)，在3’端加上终止密码子(TAG)，所得构建基因的长度为72bp。

通过DNA合成仪直接合成该核苷酸片断。首先用PCR方法对基因进行扩增。设计一对引物：5’-CCTAGGTTTCCACA-3’和5’-GATGAAGTTTCG-3’。PCR反应条件如下：94℃，30秒；45℃，45秒；72℃，30秒；反应30个循环。PCR反应后将该片断经过Klenow酶补平后用BamHI酶切，酶切片断经过割胶回收后(割胶回收操作参照试剂盒操作说明)与pGEX-4T1载体的BamHI和SmaI的双酶切片断连接后转化大肠杆菌JM109，转化子通过SmaI酶切鉴定、筛选。转化子经过IPTG诱导表达GST-GKV-4融合蛋白。融合蛋白用GST亲合柱纯化后经凝血酶切割后得到抗菌肽GK V-4，具体操作参照试剂盒操作说明。

GK V-4蛋白序列：

Lys Gly Val Arg Lys Gly Ala Lys Arg Gln Gly Cys Lys Lys Leu Ala Arg Lys Ala Leu Lys

编码GK V-4的核苷酸序列：

AAAGGTGTTCGTAAAGGCGCCAAACGCCAGGGTTGCAAGAAACTTGCCCGTAAGGCTTTGAAG

实施例3抗菌肽GK V-4基因在酵母细胞中的表达

本实施例中使用的ATP，IPTG，T₄多聚核苷酸激酶、T₄DNA连接酶，Klenow酶、限制性内切酶除特别指明外均为BIOLAB公司产品，割胶回收试剂盒为上海生工公司产品，寡聚核苷酸为上海生工生物工程技术服务有限公司合成。凝血酶剪切试剂盒购于SIGMA公司。

设计合成编码抗菌肽的GK V-4基因，经过BamHI酶切与编码GST的DNA序列连接，后将其连接到质粒pBluescriptSKII(购自美国Stratagene公司)中，转化大肠杆菌DH5α(购自武汉大学菌种保藏中心)，提取质粒经过测序证明序列正确后，质粒经过EcoRI，XhoI酶切后连接到pPIC9载体(购自美国Invitrogen公司)中，后转化毕氏酵母菌株KM71(购自美国Invitrogen公司)，甲醇诱导表达融合蛋白GST-GK V-4。

有关DNA的分离、纯化、PCR扩增、酶解、质粒转化宿主菌、片段回收、连接等分子克隆操作均按照J.沙姆布鲁克等编著的《分子克隆实验指南》进行。毕氏酵母菌株KM71培养在液体或固体的BMGY培养基中，甲醇诱导表达融合蛋白GST-GK V-4时酵母菌株培养在BMMY培养基中，每隔24小时补加甲醇至终浓度为1％。

采用酵母菌偏爱的密码子设计编码优选抗菌肽GK V-4及GST的DNA序列。在抗菌肽GK V-4基因的5’端引入酶切位点BamHI(GGATCC)，在3’端加上终止密码子(TAG)及EcoRI酶切位点(GAATCC)，所得构建基因的长度为78bp，同时在GKV-4基因前段接编码GST的DNA序列，同时在GST的DNA序列的5’端加了一个XhoI酶切位点。

GK V-4核苷酸片断的制备：通过DNA合成仪直接合成编码GK V-4核苷酸片断。然后用PCR方法对基因进行扩增。设计一对引物5’-CCTAGGTTTCCACA-3’和5’-CTTAAGGATGAAGTTTCG-3’。PCR反应条件如下：94℃，30秒；45℃，45秒；72℃，30秒；反应35个循环。

编码GST的DNA序列的的制备：设计一对引物

5’-CTCGAGATGTCCCCTATACTAGGTT-3’

5’-CAGTGCTACGCCGGCGAG-3’

用以上引物扩增pGEX-4T1载体。PCR反应条件如下：94℃，30秒；45℃，45秒；72℃，60秒；反应30个循环。

扩增片段与质粒的连接：将GK V-4的PCR扩增片断经过Klenow酶补平后用BamHI和EcoRI酶切，酶切片断经过割胶回收后(割胶回收操作参照试剂盒操作说明)与编码GST的DNA扩增序列的BamHI和XhoI酶切回收片段连接后与pBluescriptSKII的XhoI和EcoRI酶切回收片段连接。连接产物转化大肠杆菌DH_5α，转化子经过抗性、蓝白斑、酶切鉴定后，进一步经过测序确定表达序列正确。提取质粒经XhoI和EcoRI酶切回收小片段，与pPIC9的XhoI和EcoRI酶切连接构建成表达质粒pPIC9-gst-GK V-4，转化大肠杆菌DH_5α后经氨苄青霉素抗性筛选转化子。按文献报道的方法(Clare JJ，etc.，Gene，1991，105：205-212)制备毕氏酵母KM71的感受态细胞，并将SacI单酶切的线性化重组质粒pPIC9-gst-GKV-4经电转化导入感受态细胞，电转化的条件为1.5KV，22.5uF。将电转化的酵母细胞涂板于YPD平板，30℃培养两天后，筛选表达融合蛋白的阳性克隆。

转化子经过甲醇诱导表达GST-GKV-4融合蛋白。融合蛋白用GST亲合柱纯化后经凝血酶切割后得到抗菌肽GK V-4，具体操作参照试剂盒操作说明。

GST-GKV-4融合蛋白序列：

Leu Glu Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro Thr Arg Leu Leu Leu

Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys

Lys Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys Leu The Gln

Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala

Glu Ile Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser Lys

Asp Phe Glu The Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg

Leu Cys His Lys The Tyr Leu Asn Gly Asp His Val The His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu

Asp Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys Lys Arg

Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly

Trp Gln Ala The Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser

GST-GK V-4核苷酸序列：

CTCGAGATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGC

AACCCACTCGACTTCTTTTGGAATATCTTGAAGAAAAATATGAAGAGC

ATTTGTATGAGCGCGATGAAGGTGATAAATGGCGAAACAAAAAGTTTG

AATTGGGTTTGGAGTTTCCCAATCTTCCTTATTATATTGATGGTGATGTT

AAATTAACACAGTCTATGGCCATCATACGTTATATAGCTGACAAGCACA

ACATGTTGGGTGGTTGTCCAAAAGAGCGTGCAGAGATTTCAATGCTTG

AAGGAGCGGTTTTGGATATTAGATACGGTGTTTCGAGAATTGCATATAG

TAAAGACTTTGAAACTCTCAAAGTTGATTTTCTTAGCAAGCTACCTGAA

ATGCTGAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGTCATAAAACATATTTAAATGG

TGATCATGTAACCCATCCTGACTTCATGTTGTATGACGCTCTTGATGTTG

TTTTATACATGGACCCAATGTGCCTGGATGCGTTCCCAAAATTAGTTTGT

TTTAAAAAACGTATTGAAGCTATCCCACAAATTGATAAGTACTTGAAATC

CAGCAAGTATATAGCATGGCCTTTGCAGGGCTGGCAAGCCACGTTTGGT

GGTGGCGACCATCCTCCAAAATCGGATCTGGTTCCGCGTAAAGGTGTTC

GTAAAGGCGCCAAACGCCAGGGTTGCAAGAAACTTGCCCGTAAGGCTT

TGAAGTAGGAATTC

实施例4抗菌肽的鉴定

如图1所示，制备的抗菌肽GK V-4经过质谱分析，GK V-4在质谱图中显示的分子量为2324.0。由多肽序列计算出的理论值为2324.0。证明制备的多肽即为设计的GK V-4抗菌肽。鉴定合格的抗菌肽产物备用。

抗菌肽GK V-1，GK V-2及本发明公开的其它抗菌肽，天然抗菌肽GramicidinS，parasinI和magaininII可以采用GK V-4抗菌肽的制备方法制备。

实施例5抗菌肽的杀菌活性检测

以下实施例中所使用的各种菌株购于中国生物制品检定所。

采用96孔板法对抗菌肽的杀菌活性进行检测，并用固相化学法合成的抗菌肽GramicidinS(S)，parasinI(I)和magaininII(II)作为对照，并用固相化学合成法合成本发明中的12条抗菌肽GK V-1到GK V-12，检测它们的杀菌活性。

按以下步骤进行测定抗菌肽的杀菌活性：

菌种复苏，接种斜面37℃培养过夜，挑菌于普通LB培养基中，37℃培养过夜，稀释菌液使菌浓度为10⁴-10⁵CFU/ml，按每孔100ul菌液接种于96孔板中，将多肽以一定比例稀释后，每孔中加入10ul，将96孔板置于37℃培养过夜，酶标仪检测OD₆₂₀值(In Yup Park etc；FEBS Letters；437(1998)258-262)。检测结果见表1。

含有抗菌肽的细菌的生长浓度(OD₆₂₀)与不加抗菌肽的细菌的生长浓度的比值大于90％时的抗菌肽浓度即为最小抑菌浓度(最小抑菌浓度(MIC)定义为显著抑制细菌生长的最低的浓度)。

表1几种抗菌肽对不同细菌的抗菌活性最小抑菌浓度(ug/ml)的比较

革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌真菌

乙

金肺型

短

黄藤炎副白

小溶大绿

色黄克伤色啤

枯芽壁微肠脓

葡草孢蕾寒念酒

微球杆杆

萄伯沙珠酵

杆杆菌

球球菌菌氏门菌母

菌菌 C

菌菌 C A 菌氏 M A A

M T

D C S C C C T T

C B M 1 C C

M 4 C . C C M 菌 C C C

C 3 C 6 2 8 1 C

C C 0 1 9

C 0 6 3 8 0 C M 1 0 7

2 3 4 0 9 4 C 0 2 3

6 2 0 9 6 C 4 3 6

0 0 1 1 5 1

0 2 1 0

3 7 0

9

4

S 6 24 24 12 24 ＞100 ＞100 48 ＞100 ＞100 ＞100

I 12 12 24 12 24 24 24 24 48 48 48

II 12 ＞100 48 24 48 48 24 48 ＞100 ＞100 ＞100

V1 3 3 6 3 3 1.5 0.75 1.5 6 12 12

V2 6 3 3 3 3 12 12 6 24 24 24

V3 3 1.5 6 12 6 1.5 3 12 24 48 48

V4 1.5 0.75 1.5 0.75 0.4 3 3 1.5 6 12 12

V5 3 3 1.5 6 6 6 12 12 24 ＞100 ＞100

V6 6 6 12 6 3 12 12 1.5 12 48 48

V7 12 3 6 6 48 12 12 1.5 48 48 48

V8 1.5 3 12 0.4 3 6 12 12 24 ＞100 ＞100

V9 0.75 6 24 1.5 3 12 6 12 48 48 48

V10 12 24 12 6 6 12 12 6 48 6 6

V11 3 6 0.75 6 3 12 12 1.5 12 24 48

V12 6 12 12 6 3 0.75 12 1.5 6 3 3

上表中的的最小抑菌浓度值越小，则代表抗菌能力越强，从上表可以看出，本发明的抗菌肽的MIC比GramicidinS，parasinI和magaininII均要小，特别是对革兰氏阴性菌的效果，本发明的抗菌肽的抗菌能力大大强于对比的三条抗菌肽。

实施例6抗菌肽功能等同物——环化衍生物的杀菌活性检测

设计合成抗菌肽功能等同物：环化GK-20衍生物，合成方法见美国应用生物系统公司(Applied Biosystems)pioneer多肽合成仪操作指南。合成产物经过分离纯化(同实施例1)后，检测了衍生物的最小抑菌浓度，杀菌活性检测同实施例4，检测结果见表2。环化GK V-2衍生物的序列如下：

GK V-2：

表2抗菌肽GK V-2功能等同物对不同细菌的最小抑菌浓度(MIC)

抗菌肽的最小抑菌浓度

(ug/ml)

菌株名称

GK V-2

革金黄色葡萄球菌CMCC26003 0.75

兰枯草杆菌DB430 1.5

氏

短小芽孢杆菌CMCC63202 6

阳

溶壁微球菌S1.634 3

性

藤黄微球菌CMCC28001 6

菌

革大肠杆菌ATCC8099 6

兰肺炎克雷伯氏菌CMCC46117 6

氏乙型副伤寒沙门氏菌CMCC50094 12

阴

性绿脓杆菌CMCC10104 6

菌

真白色念珠菌ATCC10231 24

菌啤酒酵母ATCC9736 24

实施例7体外溶血活性检测

本实施例用于检测抗菌肽对人体红细胞是否具有溶血活性，并用固相化学法合成的抗菌肽GramicidinS，parasinI和magaininII作为对照。使用的的血样取于正常人血。

抗菌肽溶血活性的检测步骤是：

4％的新鲜红细胞悬液在414nm下血红蛋白的释放来检测的。人红细胞经PBS(PBS：35mM磷酸缓冲液/0.15MNaCl，PH7.0)洗涤，取100ul的8％人红细胞悬液于96孔板中，每孔中加入100ul抗菌肽溶液，37℃一小时后，1500rpm离心5分钟，转移100ul上清于新的96孔板中，通过酶标仪检测414nm下的吸收。阴性对照用PBS，阳性对照用0.1％TritonX-100。检测结果见表2

表3五种抗菌肽溶血活性检测结果

抗菌肽浓度溶血率(％)

(ug/ml) GramicidinS parasinI magaininII GK V-1 GK V-3

12.5 0.6 0 0 0 0

25 3.1 0 0 0 0

50 24.6 0 0.9 0 0

100 100 0.03 3.3 0.03 0.05

200 100 0.3 11.5 0.5 0.4

500 100 6.0 40.0 8.0 6.0

表2中抗菌肽的溶血率值越小，则代表抗菌肽的溶血毒性越小。

实施例8动物体内急性毒性试验

本实施例用以检测抗菌肽对动物的毒性，并用固相化学法合成的抗菌肽GramicidinS，parasinI和magaininII作为对照，测定本发明提供的抗菌肽GK V-1，GK V-2和GK V-4的毒性。

采用昆明小白鼠60只，雌雄各半，体重33.5±0.25g，抗菌肽按1mg/kg剂量，每日一次连续7天经肌注小白鼠，观察动物在最大剂量下毒性反应。实验结果表明，动物经肌注抗菌肽7天后，无异常反应，活动正常。经7天观察，60只小白鼠全部存活。证明抗菌肽无毒性作用。

实施例9抗菌肽和万古霉素对小鼠金黄色葡萄球菌感染模型抑制效果的比较

使用昆明小白鼠的金黄色葡萄球菌急性感染模型，实验步骤如下：

将金黄色葡萄球菌CMCC26003置于含5％猪胃粘液素的小牛肉灌输肉汤里，振荡培养过夜。体重大约32.6±0.25g的小鼠腹腔内注射10⁶-10⁷存活细胞，每个处理组里有3个小鼠。静脉注射抗菌肽GK V-1和GK V-3(分别溶于0.1毫升5％右旋糖里供注射)，在10分钟里注射。皮下注射万古霉素(万古霉素对小鼠皮下给药是完全可生物利用的，不论皮下给予或静脉给予有相似的活性)。

表4抗菌肽GK V-1、GK V-3和万古霉素对金黄色葡萄球菌急性感染小白鼠模型

的抑制作用

剂量(mg/kg)	抑制率(％)
剂量(mg/kg)	抑制率(％)	00.1250.250.51.02.04.08.0	抗菌肽GK V-1 抗菌肽GK V-3 万古霉素静脉注射静脉注射皮下注射038 42100 100100 100 0100 100 4080100100

如表3所示，静脉注射给予0.25mg/kg，抗菌肽能100％保护感染小鼠。万古霉素在4.0毫克/kg剂量下才100％有效。所有的未处理小鼠在不到24小时里都死亡。

该实验例显示，抗菌肽对用高致命的细菌剂量的小鼠急性感染模型杀灭金黄色葡萄球菌是十分有效的。

序列表

<110>上海高科联合生物技术研发有限公司

<120>一组新的抗菌肽及其制备方法和应用

<130>SPI048554

<160>12

<170>Patent In Version2.1

<210>1

<211>25

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>CHAIN

<400>1

Lys Gly Ala Arg Lys Gly Ala Lys Arg Gln Gly Gly Lys Lys Val

5 10 15

Ala Arg Lys Ala Leu Lys Arg Ala Gly Lys

20 25

<210>2

<211>25

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>CHAIN

<400>2

Lys Gly Gly Arg Lys Gly Ala Lys Arg Gln Gly Gly Lys Lys Leu

5 10 15

Ala Arg Lys Ala Leu Lys Arg Ala Gly Arg

20 25

<210>3

<211>21

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>CHAIN

<400>3

Lys Gly Gly Arg Lys Gly Ala Lys Arg Gln Gly Gly Lys Lys Leu

5 10 15

Ala Arg Lys Ala Leu Lys

20

<210>4

<211>21

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>CHAIN

<400>4

Lys Gly Val Arg Lys Gly Ala Lys Arg Gln Gly Cys Lys Lys Leu

5 10 15

Ala Arg Lys Ala Leu Lys

20

<210>5

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>CHAIN

<400>5

Lys Gly Ala Arg Arg Gly Ala Lys Arg Gly Gly Lys Lys Leu Ala

5 10 15

Arg Lys Ala Leu Lys

20

<210>6

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>CHAIN

<400>6

Lys Gly Ala Arg Arg Leu Ala Lys Arg Ser Gly Lys Lys Val Ala

5 10 15

Arg Lys Ala Gly Arg

20

<210>7

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>CHAIN

<400>7

Lys Phe Ala Arg Arg Leu Ala Lys Arg Leu Gly Lys Lys Val Ala

5 10 15

Arg Lys Leu Gly Arg

20

<210>8

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>CHAIN

<400>8

Lys Phe Leu Arg Arg Leu Ile Lys Arg Leu Val Lys Lys Val Leu

5 10 15

Arg Lys Leu Gly Arg

20

<210>9

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>CHAIN

<400>9

Lys Ala Ala Lys Lys Ala Ala Lys Arg Ala Ala Lys Lys Ala Thr

5 10 15

Arg

<210>10

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>CHAIN

<400>10

Lys Ala Leu Lys Lys Ala Leu Lys Arg Ala Leu Lys Lys Ala Leu

5 10 15

Arg

<210>11

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>CHAIN

<400>11

Lys Gly Leu Lys Lys Gly Leu Lys Arg Gly Leu Lys Lys Gly Leu

5 10 15

Arg

<210>12

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>CHAIN

<400>12

Lys Ala Thr Lys Lys Ala Leu Lys Arg Ala Gly Lys Lys Ala Thr

5 10 15

Arg

Claims

1.一组抗菌肽，其特征在于所述抗菌肽具有序列表中所列的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的抗菌肽，其特征在于所述抗菌肽还包括所述抗菌肽中个别氨基酸的取代、环化、L-型氨基酸变为D-型氨基酸、缺失或加入而得到的功能等同物多肽。

3.一种如权利要求1或2所述抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述的制备方法为固相化学法合成。

4.一种如权利要求1或2所述抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述的制备方法为将编码所述抗菌肽的基因克隆到载体上，然后进入宿主细胞中表达后获得所述抗菌肽。

5.根据权利要求4所述抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述及的载体是质粒或病毒中的一种。

6.根据权利要求4所述抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述及的宿主细胞是原核细胞。

7.根据权利要求6所述抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述及的原核细胞包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。

8.根据权利要求4所述抗菌肽的制备方法，其特征在于所述及的宿主细胞是真核细胞。

9.根据权利要求8所述抗菌肽的制备方法，其特征在于所述及的真核细胞是酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

10.一种如权利要求1或2所述抗菌肽的应用，其特征在于所述的抗菌肽在制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌或病毒感染的药物中的应用。

11.抗菌肽在药物中的应用，其特征在于所述的药物包括权利要求1或2任一项的抗菌肽中的一种或一种以上，并混合有一种或一种以上医药上可接受的载体和添加剂。