CN1765932A - 一种胸腺素α1和干扰素的融合蛋白 - Google Patents

一种胸腺素α1和干扰素的融合蛋白 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种胸腺肽与干扰素的融合蛋白，含有人胸腺肽α1的氨基酸序列以及人干扰素α2b的氨基酸序列，所述人胸腺肽α1的氨基酸序列位于人干扰素α2b的氨基酸序列的氨基端。所述的融合蛋白具有比干扰素α2b标准对照品更强的抗病毒活性；可增强T细胞的增殖；抑制肿瘤细胞的生长。实验表明，融合蛋白对免疫细胞功能、抗体水平的影响更优于单纯的干扰素α2b和胸腺素α1。

Description

一种胸腺素α1和干扰素的融合蛋白
技术领域
本发明涉及药物领域，具体地说涉及一种胸腺肽与干扰素的融合蛋白；
本发明还涉及含有上述融合蛋白的药物组合物。
背景技术
自1957年Isaacs和Lindermann发现干扰素以来，干扰素的研究和应用已取得了巨大成就。干扰素是一种细胞因子，它是机体感染病毒时，宿主细胞通过抗病毒应答反应而产生的一组结构类似、功能相近的低分子精蛋白，英文名称为Interferen，简称IFN。根据干扰素的抗原性和分子结构的不同，将其分为α、β、γ、δ、ε、ω等，在发现的某些类型的干扰素在其蛋白质多肽链上的氨基酸排列顺序有差别，则可再分亚型。干扰素最大的一类亚型是α-干扰素，其生物活性主要表现在三个方面：抑制病毒繁殖活性；抑制细胞分裂活性；免疫调节活性。干扰素的生物功能本质归纳为(1)抗细胞内侵害微生物的活性：抑制病毒繁殖；抑制胞内侵害的其他微生物繁殖，即保护细胞免疫被破坏，其功能得以自稳。(2)抗细胞分裂活性-相对地选择性抑制肿瘤细胞增殖，使细胞功能得以自稳。(3)调节免疫功能活性：调节免疫监视功能-增强抗肿瘤能力；调节免疫自稳功能-增强自身免疫能力；调节免疫防卫功能-增强抗感染能力，即使细胞功能得以自稳。其与细胞膜上受体结合后，诱生多种抗病毒蛋白，抑制病毒在细胞内的复制；对某些肿瘤细胞具有直接的抗增殖作用，其抗肿瘤效果会受免疫系统活动的影响；可改变正常细胞和转化细胞的膜特性，增强巨噬细胞和天然杀伤细胞的活性，增强淋巴细胞对靶细胞的细胞毒性。1986年FDA批准干扰素用于临床治疗，在近20年的临床应用过程中，在多种病毒性疾病及肿瘤方面均取得较好的疗效。
胸腺肽α1(也称胸腺素α1，α1-thymosin，Tα1)，是Goldstein等1977年首次在胸腺组织内发现。在体内它是由111个氨基酸组成的前体胸腺肽α1原(prothymosin)经酶解加工产生的。成熟的胸腺肽α1由28个氨基酸组成，NH2-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-
Thr-Ser-Ser-Glu-ILe-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-COOH，N端为乙酰化，分子量为3108道尔顿，等电点为4.2。胸腺肽α1除了存在于胸腺细胞，T-淋巴细胞以及胸腺组织外，在肝、肾、心、肺、脾等器官也有分布。胸腺肽α1作为一种广谱免疫调节剂，临床结果已显示其对乙型肝炎和丙型肝炎有显著疗效，对肿瘤和爱滋病也有一定疗效。此外，胸腺肽α1还可用作疫苗辅助药剂，以增强免疫机能衰弱的患者对疫苗(如流感疫苗及乙肝疫苗)的应答能力。
美国Sciclone(赛生)药品股份国际有限公司是胸腺肽α1的首家上市公司，于八十年代通过固相和液相法合成胸腺肽α1，制剂商品名为“日达仙ZADXIN”。自1980年以来已进行330余项临床研究，起初主要集中在观察恢复癌症病人的免疫功能，1986年首次观察对乙型肝炎病人的疗效。另外还研究了其他适应症，包括原发性和继发性免疫缺陷、HIV感染、丙型肝炎以及作为疫苗的佐剂给患有免疫抑制的病人使用。
国内在八十年代即有从小牛或猪的胸腺组织中提取胸腺肽制成制剂上市。临床上主要用于慢性乙肝、丙肝、癌症、自身免疫疾病、重度细菌感染、免疫系统缺陷引起的病症等。生物提取的胸腺肽制剂是多种多肽的复合物药品。虽然通过提取的生物制剂成本低廉，但其主要活性成分胸腺肽α1的含量不超过1％。剩余的99％成分是对机体无益的杂质，使其使用范围受到很大的限制。目前国内生产胸腺肽的厂家多达200多家。
通过液相或固相方法人工合成的胸腺肽与天然的胸腺肽相比有相近的生物学活性，经20年的临床实践，现已广泛应用。目前，单体胸腺素α1只有一种来源，即采用固相合成法全合成，至今国内临床所用均为进口的合成胸腺素α1制剂(日达仙)。通过化学合成的28氨基酸胸腺肽α1，其纯度可达99％，使用安全。在临床治疗中主要应用在慢性乙型肝炎、丙型肝炎、癌症患者、自体免疫疾病、重度细菌真菌感染、免疫系统缺陷引起的病症和老年性疾病等。其缺点是制备工艺成本高，制备过程中易造成环境的污染。而通过基因工程方法制备多肽产品的优点是纯度高，成本低。目前国内已有几家公司通过基因工程技术制备胸腺肽α1，并有进入临床阶段的如金赛药业。
近几年来，临床医生为取得更好的治疗肝炎的效果，多次联合应用干扰素和胸腺肽，虽然由于成本的原因使用的胸腺肽基本都是动物提取的，但从临床疗效看还是有明显进展。如孙兰英和于秀丽等的“干扰素结合胸腺肽治疗慢性乙型肝炎62例临床疗效观察”(中国临床医药研究杂志2004(113).-20-21)；刘红兵和周丽丽等的“干扰素α2b、联合胸腺肽治疗慢性乙型肝炎的临床疗效观察”(成宁学院学报，医学版.2003.17(6).-414-416)；秦守杰的“干扰素联合大剂量胸腺肽治疗慢性乙型肝炎42例临床观察”(临床医学2003.23(7)41-41；蒋行健等的“α-2b干扰素联合胸腺肽治疗慢性乙型肝炎临床观察”(中华实验和临床病毒学杂志，2001.15(2)171-172)；王萍，李卫国等的“干扰素联合胸腺肽治疗慢性乙型病毒性肝炎126例临床观察”(河北医学，2000.6(5).433-434)；陈国良等的“胸腺肽联合干扰素治疗慢性乙型肝炎临床疗效观察”(中华肝脏病杂志.2000.8(1)56-57)，但所有这些报道中的联合用药都有两点不足：一是两种药的联合只是一种物理混合用药；二是胸腺肽都是动物提取的。
中国专利01105705.X中，将胸腺肽连接在干扰素α2b的羧基端，构建了干扰素α2b-连接肽-Tα1的重组蛋白。但有关干扰素融合蛋白的文献(中国生化药物杂志，2005.26.2.95-98)证明，将一短肽连接在干扰素分子的氨基端更有利于其抗病毒活性的保留，同时融合蛋白的二硫键不再处于N端第一氨基酸位置，更有利于二硫键的形成和稳定。
中国专利申请03156231.0公开了一种人胸腺素α1与人复合干扰素的融合蛋白，其将胸腺素α1连接于复合干扰素的氨基端，构建了Tα1-连接肽-复合干扰素的融合蛋白，由于构建融合蛋白采用的干扰素序列为复合干扰素序列，是在几种天然干扰素序列的基础上组合而得到的序列，不是天然的序列，目前的研究表明，与天然干扰素相比，复合干扰素序列在重组载体中的表达率较低，表达产物的稳定性也较差，该专利申请也没有公开获得的活性蛋白的生物学活性和稳定性的相关资料。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种人干扰素α2b基因和胸腺素Tα1的基因形成融合蛋白，并且Tα1连接于干扰素α2b基因的氨基端，构建了具有高生物学活性的融合蛋白。
本发明的另一个目的是提供含有该融合蛋白的药物组合物，该组合物作为一种药物达到原来两种药物联合的功效，且互相补充，比单独用药抗体滴度高，也比物理的联合用药效果好。做到用药方便，药效好。
根据本发明的一方面，本发明的融合蛋白含有人胸腺肽α1的氨基酸序列以及人干扰素α2b的氨基酸序列，所述人胸腺肽α1的氨基酸序列位于人干扰素α2b的氨基酸序列的氨基端。
在上述构建的序列中，在人胸腺肽α1的氨基酸序列与人干扰素α2b的氨基酸序列之间可以进一步包含一段亲水又柔性连接肽序列，所述连接肽序列为(GGGGS)1-3，以提供重组蛋白更好的活性。
在本发明的一个优选实施例中，构建具有如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的重组蛋白。
根据本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸分子，其编码本发明的重组蛋白。在本发明的一个具体实施例中，其具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
根据本发明的再一方面，也提供含有本发明多核苷酸的重组表达载体和宿主细胞。采用基因工程技术，将本发明的多核苷酸序列与适当的载体连接，构建本发明的重组表达载体，可以根据需要转入的宿主细胞来选择适宜的载体。在本发明的一个具体实施例中，构建了如图1所示的毕赤酵母表达质粒。在本发明的另一个优选实施例中，构建了如图2所示的大肠杆菌表达质粒。
本发明也涉及到包括任何一种上述重组载体的宿主细胞。在已经构建载体之后，可以插入全部载体至适合的宿主细胞，以便扩增和/或多肽表达。宿主细胞可以是原核生物宿主细胞(例如E.coli)或者真核生物宿主细胞(例如酵母细胞，昆虫细胞，或脊椎动物细胞)。在本发明的一个优选实施例中，构建了含有本发明多核苷酸的、可以表达本发明重组蛋白的毕赤酵母宿主；在本发明的另一个优选实施例中，构建了含有本发明多核苷酸的、可以表达本发明重组蛋白的大肠杆菌宿主。
根据本发明的再一方面，提供含有本发明重组蛋白的药物组合物，可以将本发明的重组蛋白添加药学上可接受的载体和/或赋形剂制备成药物组合物。
本发明成功地构建了胸腺素与干扰素的融合蛋白，经体外药效试验证明，本发明的重组蛋白对单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、乙肝病毒均有较强的抑制作用，且融合蛋白的稳定性十分好、毒性低。动物体内实验证明，本发明的融合蛋白对荷瘤小鼠的肝癌、骨肉瘤、胃癌均有明显的抑制作用，并且本发明的融合蛋白可增强小鼠NK细胞活性，提高机体免疫能力。对比试验结果表明，本发明的融合蛋白具有比干扰素α2b标准对照品更强的抗病毒活性；可增强T细胞的增殖；抑制肿瘤细胞的生长。实验表明，融合蛋白对免疫细胞功能、抗体水平的影响更优于单纯的干扰素α2b和胸腺素α1。
附图的简要说明
图1为本发明构建的毕赤酵母表达质粒结构图；
图2为本发明构建的大肠杆菌表达质粒结构图。
发明的具体实施方式
以下所使用的试剂材料如无特别说明，均为市售购买。
【实施例1】融合蛋白基因及其在毕赤酵母中的表达
一、材料
菌种：毕赤酵母表达质粒pPIC3.5K、毕赤酵母GS115均购自Invitrogen公司，质粒Bluescript SK(M13-)(简称质粒SK)、大肠杆菌XL-Iblue购自宝生物公司。
试剂：PCR试剂盒、限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA回收试剂盒购自宝生物工程公司。酵母培养基参照Invitrogen操作手册，引物自行设计，由宝生物工程公司合成
二、方法
1、胸腺肽α1+连接肽基因的获得
从简并密码子中选择毕赤酵母偏爱的密码子设计胸腺肽α1+连接肽的DNA序列，在5’端加入EcoRI酶切位点，在3’端加入BamHI酶切位点，连接入质粒SK中，获得含有胸腺肽α1+连接肽基因的质粒pSKTL由宝生物公司完成，序列如下：
gaattc atgtcagatg cagcagttga tacttcatca gagattacta ctaaagattt aaaagagaaa aaggaggttgttgaggaagc agagaatggt ggtggtggat cc
2、干扰素α2b基因的获得
PCR方法获得。上游引物为：5’-ggatcctgtgacctgccgca-3’，下游引物为：5’-gcggccgctttcattattcttcact-3’分别引入BamH I和NotI酶切位点。引物由宝生物工程公司合成。以质粒pBIFN(由pBI质粒<购买>和干扰素基因连接获得)为模板，加入上、下游引物、dNTP底物及TagDNA聚合酶后，进行如下步骤：先在94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，进行30个循环，取10ul反应液进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。
3、胸腺肽α1+连接肽+干扰素α2b基因的获得
质粒pSKTL经BamH I和Not I双酶切后收集大片段与PCR法获得的干扰素α2b基因1∶1混合，连接，转化，经过筛选获得含有胸腺肽α1+连接肽+干扰素α2b的基因的SK质粒，称为质粒pSKTII。
4、毕赤酵母表达质粒的构建
EcoRI和Not I双酶切pSKTII和表达载体pPIC3.5K，经琼脂糖凝胶电泳后回收胸腺肽α1+连接肽+干扰素α2b的基因片段和pPIC3.5K载体片段，用T4DNA连接酶连接组成质粒pTII。将重组质粒转化大肠杆菌XL-Iblue，筛选阳性克隆，质粒pTII用EcoRI和NotI双酶切鉴定，测定序列鉴定。
5、表达质粒转化酵母细胞
质粒pTII经SacI酶切后，电激转化到组氨酸缺陷型酵母GS115中。经MD和MM平板筛选Mut+转化子，用PCR筛选出阳性重组菌，再经甲醇诱导筛得高表达菌株PP06。
6、融合蛋白的诱导表达
从YDP斜面培养基挑选单克隆，接种于BMGY液体培养基中，30℃培养24小时，再转入BMMY液体培养基中，用0.5％甲醇诱导表达3d，收集菌体，超声破碎细胞，离心取上清，经金属獒合层析、离子交换层析及凝胶过滤层析纯化蛋白，经SDS-PAGE电泳和HPLC电泳测定蛋白的纯度。用Western免疫印迹证明表达和纯化出的蛋白是否正确。
三、结果
质粒pTII经双酶切，得到约594bp片段，与所设计的基因长度相符。测序结果表明，胸腺肽α1+连接肽+干扰素α2b的基因序列没有发生碱基突变，说明该重组基因正确的连接到质粒pTII中。
在80L生物反应器中接种和培养已经可以正确表达蛋白的酵母菌，经过24小时的培养，开始用甲醇诱导，甲醇浓度为0.5％再培养24小时，收获菌液。经离心分离保留菌体，并放置到-21℃冰箱冷冻保存。菌体后经溶解粗存，通过Ni金属螯合柱层析和阴离子DEAE柱层析的进一步纯化，得到目标蛋白纯品。经过SDS-PAGE电泳及银染的分析和HPLC正相和反相分析，结果说明蛋白纯度合格。经过Western免疫印迹证明得到的蛋白正确。经过质谱分析确定分子量和原设计相符。
【实施例2】大肠杆菌中的表达
一、材料
菌株和质粒：菌株E.coliDH5α和质粒pUC18购自鼎国生物试剂公司.BL21购自Novagen公司。
试剂：EcoRI、BamHI、HindIII、DNA连接酶、总RNA提取试剂盒、rt-pcr均由Promega公司提供，其它试剂由华美公司购买。
二、实验方法
1、胸腺肽α1+连接肽基因的获得
用大肠杆菌偏爱密码子编码设计胸腺肽α1+连接肽的DNA序列，在5’端加入EcoR I酶切位点，在3’端加入BamH I酶切位点，连接入质粒pUC18中，获得含有胸腺肽α1+连接肽基因的质粒pTL18由宝生物公司完成，序列如下：
gaattc atgtctgacg ctgctgttga cacctcttct gaaatcacca ccaaagacct gaaagaaaaa
aaagaagttg ttgaagaagc tgaaaacggt ggtggtggat cc
2、干扰素α2b基因的获得
PCR方法获得。上游引物为：5’-ggatcctgtgacctgccgca-3’，下游引物为：5’-gcaagctttcattattcttcact-3’分别引入BamHI和HindIII酶切位点。引物由宝生物工程公司合成。以干扰素α2b的cDNA(由人肝mRNA经过反转录获得)为模板，加入上、下游引物、dNTP底物及TagDNA聚合酶后，进行如下步骤：先在94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，进行30个循环，取10ul反应液进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。
3、胸腺肽α1+连接肽+干扰素α2b基因的获得
质粒pTL18经EcoRI和BamHI双酶切后收集大片段与PCR法获得的干扰素α2b基因1∶1混合，连接，转化，经过筛选获得含有胸腺肽α1+连接肽+干扰素α2b的基因的pUC18质粒，称为质粒pTLI18。
4、表达载体的构建
用EcoRI和HindIII双酶切质粒pTLI18获取594bp的融合基因片段，与用相同酶切处理的pET28a载体连接，转化BL21宿主菌，获得取阳性菌落经扩增，接种，在80L生物反应器中培养8小时，收获菌体。经SDS-PAGE电泳鉴定表达正确。粗纯后经过疏水、离子交换和分子筛柱层析精纯得到目标产物。
三、结果
从DNA电泳结果可见PCR扩增出一条特异带，与分子量标准比较，分子量基本与预期一致。用EcoRI和Hind III双酶切获得一条特异的DNA带。用Sanger法测序证明，阳性菌质粒DNA序列与预期序列一致。从SDS-PAGE电泳结果看出融合蛋白在大肠杆菌中表达成功。经过粗纯和精纯后的蛋白电泳显示蛋白纯度95％，HPLC结果97％；Western免疫印迹证明蛋白是目标蛋白。
胸腺肽α1和连接肽的同合成的序列，IFN的除引物外同已发表的或查到的专利的干扰素的序列。
融合蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列如下：
Met
ATG TCT GAC GCT GCT GTT GAC ACC TCT TCT GAA ATC ACC ACC AAA GAC
Figure A20051012752100102
CTG AAA GAA AAA AAA GAA GTT GTT GAA GAA GCT GAA AAC GGT GGT GGT
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg
GGA TCC TGT GAT CTG CCT CAA ACC CAC AGC CTG GGT AGC AGG AGG
Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys
ACC TTG ATG CTC CTG GCA CAG ATG AGG CGT ATC TCT CTT TTC TCC TGC
Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn
TTG AAG GAC AGA CAT GAC TTT GGA TTT CCC CAG GAG GAG TTT GGC AAC
Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln
CAG TTC CAA AAG GCT GAA ACC ATC CCT GTC CTC CAT GAG ATG ATC CAG
Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp
CAG ATC TTC AAT GTC TTC AGC ACA AAG GAC TCA TCT GCT GCT TGG GAT
Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn
GAG ACC CTC CTA GAC AAA TTC TAC ACT GAA CTC TAC CAG CAG CTG AAT
Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glh Thr Pro
GAC CTG GAA GCC TGT GTG ATA CAG GGG GTG GGG GTG ACA GAG ACT CCC
Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg
CTG ATG AAG GAG GAC TCC ATT CTG GCT GTG AGG AAA TAC TTC CAA AGA
Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu
ATC ACT CTC TAT CTG AAA GAG AAG AAA TAC AGC CCT TGT GCC TGG GAG
Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu
GTT GTC AGA GCA GAA ATC ATG AGA TCT TTT TCT TTG TCA ACA AAC TTG
Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu
CAA GAA AGT TTA AGA AGT AAG GAA
其中：Met为第一个氨基酸，所有重组蛋白都是，前面的28个氨基酸为胸腺肽序列，中间5个氨基酸为连接肽，其他为干扰素序列。
【实施例3】干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白抗单纯疱疹病毒体外药效试验
一、材料
病毒：单纯疱疹病毒HSV-1和HSV-2购自中国预防医学科学院病毒学研究所。-60℃冻存，取出溶化后稀释，TCID50均为4.0。
细胞：vero细胞，由美国ATCC提供(www.atcc.org)。
细胞培养板：96孔coster细胞培养板。
培养液：199培养液，按照相关的实验操作手册配制。
干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白，按照实施例1的方法制备，批号：20041005的原液加赋形剂制备。
二、方法
在96孔板中，将生长成单层的Vero细胞的培养液倾出后，第一行加入IFN(标准：参照中国药典2005年第3版)，第二行作为阴性对照加入Vero细胞生长液，第三行以后依次加入待测样品，每孔加入100μl，将干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白按照2倍连续稀释为6个浓度，即10000IU/ml，50000IU/ml，2500IU/ml，1000IU/ml，500IU/ml，250IU/ml每个浓度3复孔。于37℃，5％CO2培养24小时，将培养基上清吸出，用Vero细胞维持液稀释HSV，每孔加入100μl的病毒HSV液，37℃，5％CO2培养。培养后每天显微镜下观察，在第一行完整的单层活细胞应被观察到，在第二行应看到单层细胞被完全破坏；以第二行病毒对照行病毒病变为100％，分为：-(0)；+(病变≤25％)；++(25％＜病变≤50％)；+++(50％＜病变≤75％)；++++(病变＞75％)；观察5天，记录结果，试验重复3次。
三、结果
表1    干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白抗HSV-1和HSV-2病毒试验
  融合蛋白浓度(IU/ml)照组        HSV-1         HSV-2
试验组 病毒对照组 试验组 病毒对
  10000500025001000500250   -----+   ++++++++++++++++++++++++   -----+   ++++++++++++++++++++++++
四、结论
从上述试验结果可见，干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白对单纯疱疹病毒HSV-1和HSV-2均有较强的抑制作用。
【实施例4】干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白抗水痘---带状疱疹病毒体外药效试验
一、试验材料
1、病毒：水痘-疱疹病毒(VZV)，购自预防院病毒所，TCID50为3.0。
2、细胞：人二倍体细胞(2BS)，购自预防院病毒所。
3、细胞培养板：96孔coster细胞培养板。
4、干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白，批号：20041005的原液加赋形剂制备。
二、试验方法
在96孔板中，将生长成单层的2BS细胞的培养液倾出后，第一行加入IFN，第二行作为阴性对照加入2BS细胞生长液，第三行以后依次加入待测样品，每孔加入100μl，将干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白按照2倍连续稀释为6个浓度，即10000IU/ml，5000IU/ml，2500IU/ml，1000IU/ml，500IU/ml，250IU/ml每个浓度3复孔。于37℃，5％CO2培养48小时，将培养基上清吸出，用2BS细胞维持液稀释VZV，每孔加入100μl的病毒VZV液，37℃，5％CO2培养。培养后每天显微镜下观察，在第一行完整的单层活细胞应被观察到，在第二行应看到单层细胞被完全破坏；以第二行病毒对照行病毒病变为100％分为：-(0)；+(病变≤25％)；++(25％＜病变≤50％)；+++(50％＜病变≤75％)；++++(病变＞75％)；观察5天，记录结果，试验重复3次。
三、试验结果
将3次试验的平均结果列于表2
表2  干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白抗VZV病毒试验
  样品浓度(IU/ml)  试验组   病毒对照组
  10000500020001000500250  -----+   ++++++++++++++++++++++++
四、结论
从上述实验结果可看出，干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白对水痘-带状疱疹病毒有较强的抑制作用。
【实施例5】干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白体外抗乙型肝炎病毒试验
一、实验材料：
2.2.15细胞：乙型肝炎病毒(HBV)DNA转染的Hep-G2细胞，购自广州空军医院肝病研究所。
样品：干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白，按照实施例1制备，批号：20041005的原液加赋形剂制备。
阳性对照药阿糖腺苷Ara-A：购自广州空军医院肝病研究所。
乙肝抗原ELISA试剂盒：购自华美公司；
二、实验方法：
MEM细胞培养液配制：10％胎牛血清，380μg/ml G418，0.03％L-谷氨酰胺，100μg/ml链霉素，100IU/ml青霉素，5％NaHCO3调节pH至中性。
药物培养液配制：干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白用5ml细胞培养液溶解，1000IU/ml。
Ara-A细胞培养液配制：用细胞培养液配制320μg/ml。
铺板：将生长良好的2.2.15细胞接种于96孔板，细胞数为4×104/孔，每孔加入培养液100μl。
培养：5％二氧化碳孵箱37℃培养。
加样：48h后，弃去培养液，分别在试验孔加入药物培养液；阴性对照孔加入细胞培养液；阳性对照孔加入Ara-A细胞培养液；每孔加入100μl，依次倍比稀释6个浓度，每个浓度4复孔，5％二氧化碳孵箱37℃培养。
换液：每隔3天更换含药培养液1次，换液2次，第10天收集上清。
细胞毒性测定：在收取细胞上清液的同时，用MTT比色分析法检测存活细胞百分比，得CD50值。
药效测定：将-20℃保存的样品用HBsAg和HBeAg固相放射免疫测定盒检测。获得ID50(半数抑制剂量)。
Figure A20051012752100141
药物抗HBV效果以治疗指数(TI)评价，TI＝CD50/ID50。TI＞2为有效，TI＝1为有毒有效，TI＜1为毒性作用。
三、实验结果：
表3  干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白体外对乙型肝炎病毒的抑制作用
  药物浓度(IU/ml)  HBsAg抑制率(％)   HBeAg抑制率(％)   存活细胞(％)
  100008000400020001000500  92884637218   86753928125   9292941029895
  ID50CD50TI  300＞1000＞2   350＞1000＞2
TI＞2，干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白为有效低毒性药物。
结论：干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白在体外对乙型肝炎病毒有明显的抑制作用。
【实施例6】干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白稳定性实验
表4  干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白8000U的稳定性试验结果
  干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白   规格：8000单位
  研究周期：4℃一年半；22℃九个月；37℃六个月.   研究项目：生物活性
  温度℃   批次No.   之前(IU/mL)   之后(IU/mL)
  2m   3m   4m   6m   8m   10m   12m   14m   16m   18m
  37   030801   8.1*103   8.1*103   5.0*102   2.7*102   2.2*102   1.2*102   5.0*10   -   -   -   -
  030802   8.0*103   8.0*103   4.8*102   2.2*102   2.5*102   1.3*102   5.9*10   -   -   -   -
  030803   8.1*103   8.1*103   5.1*102   2.6*102   2.7*102   1.1*102   5.8*10   -   -   -   -
  20-25   030801   8.1*103   -   8.1*103   8.0*103   8.1*103   8.9*102   6.0*102   2.5*102   9.0*10   -   -
  030802   8.0*103   -   8.0*103   8.0*103   8.0*103   6.8*102   5.0*102   2.4*102   7.0*10   -   -
  030803   8.1*103   -   8.1*103   8.3*103   8.0*103   8.8*102   6.0*102   2.5*102   7.0*10   -   -
  4-8   030801   8.1*103   -   8.1*103   8.1*103   -   8.0*103   8.0*103   8.0*103   8.1*103   8.2*103   8.1*103
  030802   8.0*103   -   8.0*103   8.2*103   -   8.1*103   8.1*103   8.0*103   8.1*103   8.1*103   8.0*103
  030803   8.1*103   -   8.1*103   8.0*103   -   8.2*103   8.1*103   8.1*103   8.1*103   8.1*103   8.0*103
  -20   030801   8.1*103   -   8.1*103   8.1*103   -   8.0*103   8.1*103   8.0*103   8.1*103   8.0*103   8.1*103
  030802   8.0*103   -   8.0*103   8.0*103   -   8.0*103   8.1*103   8.2*103   8.0*103   8.0*103   8.2*103
  030803   8.1*103   -   8.1*103   8.0*103   -   8.0*103   8.0*103   8.1*103   8.0*103   8.1*103   8.0*103
              表5  干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白4000U的稳定性试验结果
  干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白   规格：4000单位
  研究周期：4℃一年半；22℃九个月；37℃六个月.   研究项目：生物活性
  温度℃   批次No.   之前(IU/mL)   之后(IU/mL)
  2m   4m   6m   9m   12m   16m   18m
  37   030801   4.0*103   2.0*102   1.0*102   2.0*10   -   -   -   -
  030802   4.2*103   2.6*102   1.5*102   3.0*10   -   -   -   -
  030803   4.1*103   2.5*102   1.3*102   3.5*10   -   -   -   -
  20-25   030801   4.0*103   4.0*103   1.0*103   4.0*102   2.0*102   -   -   -
  030802   4.2*103   4.2*103   1.2*103   4.5*102   2.4*102   -   -   -
  030803   4.1*103   4.1*103   1.2*103   5.0*102   2.5*102   -   -   -
  4-8   030801   4.0*103   4.0*103   4.0*103   4.0*103   4.0*103   4.1*103   4.0*103   2.5*103
  030802   4.2*103   4.1*103   4.0*103   4.0*103   4.2*103   4.2*103   4.1*103   1.8*103
  030803   4.1*103   4.0*103   4.0*103   4.0*103   4.1*103   4.1*103   4.0*103   3.6*103
  -20   030801   4.0*103   4.1*103   4.1*103   4.1*103   4.0*103   4.1*103   4.0*103   4.0*103
  030802   4.2*103   4.1*103   4.1*103   4.2*103   4.2*103   4.1*103   4.1*103   4.1*103
  030803   4.1*103   4.1*103   4.1*103   4.1*103   4.0*103   4.1*103   4.1*103   4.1*103
【实施例7】干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白的毒理试验结果
一、材料
药物：干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白，按照实施例1制备，批号：20030801
动物：小鼠体重18g～21g，雌雄各半；猫的体重2～3kg，雌雄各半。(购自吉林大学医学部)
二、方法和结果
对CNS(中枢神经系统)的影响
小鼠的自我行为用GJ-1型光电子计数器.：36只鼠分为三个组.第二和第三组分别注射rHuIFN-α2b+Tα1 1×103u/kg，1×104u/kg.第一组注射同剂量的生理盐水。每一次将一只小鼠放进观察箱中。5分钟后，开始记录小鼠10分钟内的自主行为。结果见表6。
表6  干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白对小鼠自主行为的作用
  动物数  自主行为意识时间(X±SD)  均方差(P)
  对照组   20  82.9±10.3
  1×106IU/kg组   20  71.8±7.1  ＞0.05
  1×107IU/kg组   20  82.9±11.2  ＞0.05
从表6看出融合蛋白对CNS无明显作用。
对心率和呼吸系统的作用
注射氨基甲酸乙酯麻醉猫。采用插管测血压法，使用水银血压计测量其血压，使用圈式记录猫呼吸频率，使用心电图仪测定II导心电图，结果见表7、8、9。
表7  干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白注射剂对猫血压的影响(X±SD)
  分组   动物数   血压(Kpa，X±SD)
注射前   注射后
  10分钟   20分钟   30分钟   40分钟   50分钟   60分钟
  1×105IU/kg   5   16±2.1   16.5±2.1   16.5±2.3   16.8±2.4   17.8±3.2   17.4±2.1   17.3±2.0
  1×106IU/kg 5 15.6±1.2 15.7±2.3 16.1±1.7 16.7±1.8 16.5±1.8 14.8±1.8 14.0±1.2
  1×107IU/kg   5   16±1.3   16.6±1.4   17.3±1.3   17.6±1.0   16.0±2.0   16.1±2.1   15.7±2.0
表8  干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白注射剂对猫心率的影响(X±SD)
  分组   动物数   心率(次数/分钟，X±SD)
注射前   注射后
  10分钟   20分钟   30分钟   40分钟   50分钟   60分钟
  1×105IU/kg   5   168.8±18.6   160.8±11.8   166.2±15.5   166.2±15.5   164.8±13   166.8±11.3   166.0±11
  1×106IU/kg   5   178.7±9.1   186.5±10.4   190.8±22   184.4±22   187.5±20   177.5±14.8   174.3±17.9
  1×107IU/kg   5   158.7±17.2   172.8±11.9   166.2±15.5   168±14.1   150.3±16.8   147.3±10.5   150.0±12
表9  干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白注射剂对猫呼吸次数的影响(X±SD)
  分组   动物数   呼吸率(次数/分钟，X±SD)
注射前   注射后
  10分钟   20分钟   30分钟   40分钟   50分钟   60分钟
  1×105IU/kg 5 18.6±1.4   19.6±0.8   19.8±1.4   20.2±1.2   20.6±0.9   20.2±2.5   20.0±1.9
  1×106IU/kg   5   18.7±2.0   19.7±2.1   16.5±1.2   16.3±1.7   20.6±3.5   20.0±6.0   20.0±6.7
  1×107IU/kg   5   19.7±3.7   18.7±2.2   19.0±2.1   18.7±2.3   20.2±2.6   20.1±3.5   21.0±4.2
表7、8、9数据表明注射前后猫的血压、呼吸次数和心率都没有统计学意义(p＞0.05)。
对小鼠血压的影响
使用SY型血压测定仪测量健康大鼠鼠的血压。20只大鼠被平均分为两组。测量确定两组的血压正常后，第一组注射rHuIFN-α2b+Tα11×103u/kg；第二组注射rHuIFN-α2b+Tα1 1×104u/kg。测量注射后在15min，30min，60min，120min，180min后大鼠的血压值，结果见表10。
表10  干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白注射剂对大鼠呼吸次数的影响(X±SD)
  Group   AnimalNum.  Breathing Rate(Times/Min，X±SD)
Beforeinjection   AfterInjection
  10min   20min   30min   40min   50min   60min
  1×103IU/kg   10  18.6±1.4   19.6±0.8   19.8±1.4   20.2±1.2   20.6±0.9   20.2±2.5   20.0±1.9
  1×104IU/kg 10   18.7±2.0   19.7±2.1   16.5±1.2   16.3±1.7   20.6±3.5   20.0±6.0   20.0±6.7
  1×105IU/kg 5   19.7±3.7   18.7±2.2   19.0±2.1   18.7±2.3   20.2±26   20.1±3.5   21.0±4.2
从表10可见注射前和后的记录结果表明血压无显著性差异(p＞0.05)。
结论：结果表明按照临床使用剂量给动物注射结果表明对动物的CNS、心血管系统和呼吸系统无明显作用。
【实施例8】干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白的长期毒性实验结果材料
1、药物：干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白，按照实施例1的方法制备，批号：20030801；
2、动物：大鼠体重80g～100g，雌雄各半；狗体重6～10kg，雌雄均用。方法和结果
1、大鼠的长期毒性实验
大鼠160只，等分4组，第2、3、4组分别皮下注射干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白103U/Kg、104U/Kg、105U/Kg；第一组等体积皮下注射盐水，隔日注射1次；连续6个月，每周称体重2次，3或6个月于末次给药后24小时各组断头处死20只，测血象、尿常规、肝、肾功能。并切取心、肝、脾、肺、肾、肾上腺，以10％福尔马林溶液固定，石蜡包埋，染色后显微镜观查组织形态的变化，结果见表11和12。可见给药的小、中、大三个剂量组，与对照组比较，体重、血象、肝、肾功能组间无异常变化。
                        表11  基因工程干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白对大鼠血象的影响(X±SD)
时间 组别 血红蛋白(g％)   血小板(万/mm3)   红细胞(万/mm3)   白细胞(个/mm3)   白细胞分类(万/mm3)
  淋巴(％)   分叶(％)
3months   对照组   10.1±1.3   46.7±9.1   665.4±66.1   10780±3530   85.8±6.6   15.2±6.6
  1.0×103U/kg   11.5±0.9   46.6±9.2   659.1±86.8   11860±3872   82.2±9.0   17.8±9.0
  1.0×104U/kg   10.8±0.9   51.5±9.9   648.6±45.6   10970±26879   83.2±9.5   17.5±9.2
  1.0×105U/kg   11.8±0.6   48.9±9.2   75.40±48.3   10460±9.21   86.7±5.8   13.6±5.3
6months   ControlGroup   11.3±1.2   45.8±10.3   668.4±65.7   10780±3530   85.9±5.6   14.1±5.7
  1.0×103IU/kg   11.5±0.9   46.4±9.0   658.1±83.8   11830±3842   84.2±10.0   16.8±9.8
  1.0×104IU/kg   10.8±0.9   50.3±10.1   649.6±44.6   10960±26889   82.2±9.3   17.7±9.3
  1.0×105IU/kg   11.7±0.6   47.7±9.5   75.40±49.3   10460±9.15   87.9±5.6   14.1±5.3
表12  基因工程干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白对大鼠肝功能、肾功能的影响(X±SD)
时间 组别   转氨酶U/100ml   尿素氮mg％
3months   Control Group   43.8±10.8   13.9±1.6
  1.0×103U/kg   43.2±17.1   14.5±1.3
  1.0×104U/kg   46.1±32.6   16.1±3.9
  1.0×105U/kg   42.8±12.7   12.7±2.5
6months   Control Group   35.3±8.5   15.6±3.3
  1.0×103U/kg   32.6±9.8   13.4±2.3
  1.0×104U/kg   34.7±10.0   14.3±1.6
  1.0×105U/kg   36.8±12.1   13.0±1.4
1、狗长期毒性的实验和结果
狗15只，等分为3组，第2、3、4组分别皮下注射干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白103U/Kg、104U/Kg；第一组等体积皮下注射盐水，隔日注射1次；连续6个月，20日称体重1次，于3个月末次给药后24小时各组测血象、尿常规、肝、肾功能并做II导心电图后各组处死2只，切取心、肝、脾、肺、肾、肾上腺，以10％福尔马林溶液固定，石蜡包埋，染色后显微镜观查组织形态的变化，其余的狗继续给药至6个月后重复上述各项检查。结果见表13、14、15。可见给药的两个剂量组，与对照组比较，体重、血象、肝、肾功能、心电图组间均无显著差异。
上述长毒实验结果表明按公斤体重计算相当临床5、50、500倍的剂量大鼠均无毒性反应，按公斤体重计算临床剂量5、50倍对狗除大剂量组尿略有改变外，其它无明显毒性反应，说明临床用药安全。
        表13  基因工程干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白对狗体重的影响(kg，X±SD)
  组别   动物数.   注射前   20min   40min   60min   80min   100min   120min   140min   160min   180min
  对照   5   12.5±2.4   12.3±2.9   13.0±3.0   13.5±3.3   13.9±3.1   14.2±3.3   13.3±0.9   14.4±1.5   15.6±1.6   17.8±3.0
  1.0×103U/kg 5 13.6±1.9 13.4±1.6 15.3±1.6 15.3±2.3 15.4±2.0 15.7±1.7 14.8±3.3 16.3±2.5 18.4±1.8 19.0±1.6
  1.0×104U/kg   5   13.9±1.6   14.0±1.4   15.0±1.7   15.6±1.2   15.5±1.3   15.5±1.6   15.9±0.9   16.7±0.2   18.1±0.4   18.0±0.7
          表14  基因工程干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白对狗血象的影响：(X±SD)
时间 组别   血红蛋白(g/l)   血小板(×109/l)   红细胞(×1012/l)   白细胞(×109/l)   白细胞分类
  分叶(％)   淋巴(％)
  3months   对照   128±3.4   488±43   7.2±0.2   11.6±1.7   64.2±5.0   15.2±5.6
1.0×103U/kg 131±6.6 412±57 7.2±0.3 11.2±1.1 73.4±1.4 17.8±10.0
  1.0×104U/kg   134±2.8   435±30   72±0.3   11.8±0.8   66.8±6.8   18.8±9.3
  6months   对照   121.7±7.6   220±20   6.7±0.3   23.6±6.8   82.3±4.2   19.7±4.2
1.0×103U/kg 121±0.1 206±38 6.7±0.1 24.2±4.8 74.7±3.5 27.3±3.5
  1.0×104U/kg   125±7.0   20.7±35   6.7±0.5   17.1±5.0   71.7±6.1   30.3±6.1
表15  基因工程干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白对狗肝功能、肾功能的影响(X±SD)
时间 组别   转氨酶(U/100ml)   尿素氮(mg％)
  3months   对照   17.2±2.9   13.2±1.5
  1.0×103U/kg   25±5.2   14.8±1.9
  1.0×104U/kg   21±6.4   11.1±0.9
  6months   对照   25.3±7.4   11.3±2.1
  1.0×103U/kg   16.7±2.0   12.3±3.0
  1.0×104U/kg   24.3±6.0   11.0±3.0
【实施例9】干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白体内抗肝癌细胞试验
实验目的：干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白体内对肝癌细胞Hep-A-22的抑制作用，为临床用药有效性提供依据。
实验材料：
细胞：肝癌细胞Hep-A-22，购自吉林省肿瘤医院；
样品：干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白，按照实施例1的方法制备，批号：20041005的原液加赋形剂制备。
阳性对照药：化疗药物5-Fu尿嘧啶，购自吉林省肿瘤医院；
实验方法：
1、小鼠生存时间观察
取18-20g、6-8周龄NIH小鼠，每组20只，雌雄各半，阴性对照组注射癌细胞后，用等量的生理盐水代替药物。实验组接种癌细胞量1×105/只，注射途径为腹腔。实验组从注射癌细胞10天后，连续给药8天后改为每3天给药1次，每次1ml/只。第五天开始称重，记录各小鼠死亡时间。
2、抑瘤效果观察
注射癌细胞量、时间、途径同1。连续8天给药后第9天处死小鼠，摘除肿瘤称重，计算抑制率(TGI)。
            表16.干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白对Hep-A-22荷瘤小鼠生存期的比较
  组别   小鼠数量   体重(g)-治疗前   体重-15天治疗   生命周期(天)   t   p
  阴性样品500U/ml样品2000U/ml样品8000U/ml阳性5-Fu0.025g/kg   2020202020   20.2±1.222.6±0.922.2±1.322.5±1.122.1±1.4   25.2±1.125.8±1.825.3±2.326.7±1.321.5±1.1   7.8±1.4520.04±1.2123.22±1.4628.90±1.2420.28±1.20 20.8821.4635.6820.35 ＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01
从表16可见药物组高剂量8000U的效果最好，具有明显延长小鼠生存期的作用。
           表17  干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白对Hep-A-22细胞荷瘤小鼠抑瘤效果的比较
  组别   小鼠数量   瘤体重量(g)   t   p   TGI(％)
  阴性样品500U/ml样品2000U/ml样品8000U/ml阳性5-Fu0.25g/100g   2020202020   3.16±0.61.99±0.032.35±0.082.59±0.121.66±0.03 6.975.203.589.31 ＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01   -38.2126.7811.5648.53
【实施例10】干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白体内抗骨肉瘤S180细胞试验
实验目的：干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白体内对骨肉瘤S180细胞的抑制作用，为临床用药有效性提供依据。
实验材料：
细胞：骨肉瘤S180，购自吉林省肿瘤医院；
样品：干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白，按照实施例1的方法制备，批号：20041005的原液加赋形剂制备。
阳性对照药：化疗药物5-Fu尿嘧啶(来源同上)
实验方法：
1、小鼠生存时间观察取18-20g、6-8周龄NIH小鼠，每组20只，雌雄各半，阴性对照组注射癌细胞后，用等量的生理盐水代替药物。实验组接种癌细胞量1×105/只，注射途径为腹腔。实验组从注射癌细胞10天后，连续给药8天后改为每3天给药1次，每次1ml/只。第五天开始称重，记录各小鼠死亡时间。
2、抑瘤效果观察
注射癌细胞量、时间、途径同1。连续8天给药后第9天处死小鼠，摘除肿瘤称重，计算抑制率(TGI)。
表18.干扰素α2h+胸腺素α1融合蛋白对骨肉瘤S180小鼠生存期的比较
  组别   小鼠数量   体重(g)-治疗前   体重-15天治疗   生命周期(天)   t   p
  阴性样品500U/ml样品2000U/ml样品8000U/ml阳性5-Fu0.025g/kg   2020202020   20.5±0.821.6±1.322.2±1.323.5±1.120.3±1.2   24.2±1.024.0±0.824.3±2.327.7±1.319.8±0.9   7.02±1.0512.7±1.7113.2±1.4615.9±1.2410.0±0.98 16.8817.3612.8617.55 ＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01
阴性对照组小鼠接种S180细胞荷瘤小鼠接种S180细胞后，很快萎糜，三便不正常，厌食，体重减轻，肛门处局部出现溃烂，实验组小鼠也持续出现以上现象，但小鼠生存时间延长，见表18。
【实施例11】干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白体内抗胃癌细胞MFC试验
实验目的：干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白体内对骨肉瘤S180细胞的抑制作用，为临床用药有效性提供依据。
实验材料：
1细胞：胃癌细胞MFC，购自吉林省肿瘤医院；
2样品：干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白，按照实施例1的方法制备，批号：20041005的原液加赋形剂制备。
3阳性对照药：化疗药物5-Fu尿嘧啶
实验方法：
1、小鼠生存时间观察
取18-20g、6-8周龄NIH小鼠，每组20只，雌雄各半，阴性对照组注射癌细胞后，用等量的生理盐水代替药物。实验组接种癌细胞量1×105/只，注射途径为腹腔。实验组从注射癌细胞10天后，连续给药8天后改为每3天给药1次，每次1ml/只。第五天开始称重，记录各小鼠死亡时间。
2、抑瘤效果观察
注射癌细胞量、时间、途径同1。连续8天给药后第9天处死小鼠，摘除肿瘤称重，计算抑制率(TGI)。
  组别   小鼠数量   体重(g)-治疗前   体重-15天治疗   生命周期(天)   t   p
  阴性样品500U/ml样品2000U/ml样品8000U/ml阳性5-Fu0.025g/kg   2020202020   20.5±0.821.6±1.322.2±1.323.5±1.120.3±1.2   24.2±1.024.0±0.824.3±2.327.7±1.319.8±0.9   7.02±1.0512.7±1.7113.2±1.4615.9±1.2410.0±0.98 16.8817.3612.8617.55 ＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01
表19.干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白对胃癌MFC小鼠生存期的比较
阴性对照组小鼠接种MFC细胞荷瘤小鼠接种S180细胞后，很快萎糜，三便不正常，厌食，体重减轻，肛门处局部出现溃烂，实验组小鼠也持续出现以上现象，但小鼠生存时间延长，见表19。
【实施例12】干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白对小鼠免疫细胞功能、抗体水平的影响
1试验材料
1.1受试药品：干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白按照实施例1的方法制备，500IU/ml、5000IU/ml、50000IU/ml，用批号20040803的原液配制。阳性对照药：短小棒状菌购自长春生物制品研究所。
1.2动物：Balb/c小鼠，体重18～22g，雌雄各半。K562细胞株购自武汉大学菌种保藏中心。
1.3仪器和试剂：
PRMI-1640培养基(Gibco，USA)；胎牛血清(FCS，中国医学科学院血液研究所购进，批号：200308)；曲拉通(Triton X100，Sigma)；还原型辅酶I(CoI，NADH，Sigma)；CO2培养箱(SANYO，MCO-175M，Japan)。
EPICS  ELITE流式细胞仪，COULTER公司生产；CD3e、CD4、CD8a、CD16/32鼠抗体，购自深圳达科为生物技术有限公司。
大鼠抗小鼠抗体、酶标羊抗小鼠抗体、TMB显色液、封闭液5％BSA、小鼠IgA均为美国SBA公司出品。
2方法与结果
2.1NK细胞功能测定：对小鼠脾脏NK细胞活性测定(比色法)
将小鼠180只均分成6大组，正常对照组、阳性对照短小棒状菌0.2ml/只组、干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白500IU/只组、5000IU/只组、50000IU/只组、空白基质组，各大组又分为给药10d、20d、30d 3个小组，每小组10只。干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白组小鼠肌肉注射给药，空白基质片组注射基质液，每日分2次给药；短小棒状菌组小鼠ip短小棒状菌0.2ml/只组，隔天一次。分别于给药后10d、20d、30d次日清晨断头处死小鼠，无菌取脾制备脾细胞悬液。
采用NK细胞毒活性-胞浆乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定NK细胞活力。
结果见表20。
表20  干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白对小鼠NK细胞活性的影响( x±s，n＝10)
组别 剂量(IU/只)   NK细胞活性(％)
  10d   20d   30d
  正常对照组空白基质组短小棒状菌   --0.2ml/只   44.6±9.1646.47±10.3566.32±12.49*   43.19±9.8446.95±10.4276.09±12.38*   48.25±12.4451.12±13.5373.91±12.11*
  融合蛋白融合蛋白融合蛋白   500500050000   62.41±9.00*65.85±11.34*58.93±13.05*   77.23±13.10***80.75±9.86***75.38±11.25***   72.99±14.15*75.47±11.62*69.20±15.69*
空白基质组比较***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05。
表20结果表明：干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白各剂量组药物作用不同时间与对照组和空白对照组比较NK细胞活性有明显差异，其中给药20d高、中、低剂量组有非常显蓍差异(P＜0.001)。表明干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白能够增强小鼠NK细胞活性，从而提高机体免疫力。
2.2小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能
分组及给药方法同上。分别于给药后10d、20d、30d次日腹腔注射20％鸡红细胞悬液化1ml/只，轻柔腹部，30min后，颈椎脱臼处死动物，立即开腹吸取腹腔液滴在玻片上约0.2ml，玻片置入37℃，孵育30min后，再用生理盐水中漂洗，除去未贴片细胞，晾干，以1∶1丙酮甲醇溶液固定，4％(V/V)Giemsa磷酸缓冲液染色3min，蒸馏水漂洗晾干。
显微镜下结果判定：油镜下计数巨噬细胞，每张计数100个，按下列公式计算吞噬百分率，结果见表21。
Figure A20051012752100301
表21干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
                          ( x±s，n＝10)
组别   剂量(IU/只)   吞噬百分率(％)
  10d   20d   30d
  正常对照组空白基质片短小棒状菌融合蛋白融合蛋白融合蛋白   --0.2ml/只500500050000   28.8±3.8533.3±3.3439.2±2.90*34.0±44.535.5±3.3633.8±2.62   32.9±3.4531.75±2.7544.0±3.86*39.9±3.41*43.2±4.61*40.8±2.74*   31.6±3.1732.9±3.6741.8±3.05*39.4±3.20*42.0±3.32*35.6±4.00
与空白基质组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
结果药后20d，干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白各剂量组吞噬百分率与空白组比较差异显著。药后30d，融合蛋白5000、50000U/只组吞噬百分率与空白基质比较差异显著。
2.3T细胞亚群测定
分组及给药方法同上。分别于给药后5d、11d、16d次日，眼眶采血，加抗凝剂，分别加入CD4、CD8、CD16抗体，离心，取沉淀物，然后用流式细胞仪测定血液CD3、CD4、CD8、CD16/32含量，结果见表22.
结果表明，给药11d和16d各剂量组CD3、CD4/CD8、CD16/32，均明显升高(P＜0.05)，提示融合蛋白通过注射，可以激活某些T细胞亚群的生成。
本实验证明，融合蛋白明显增加NK细胞和巨噬细胞活力，同时明显激活T细胞亚群，即CD3、CD4的生成，并能提高CD4/CD8、CD16/32的比值。表明，融合蛋白也可以调节细胞免疫和体液免疫，为融合蛋白临床使用提供依据。
干扰素是一种由感染病毒的细胞所产生的淋巴细胞因子，也是可激活NK细胞或巨噬细胞活力，是病毒被清除的免疫介质。目前，干扰素制剂已被广泛应用于病毒性疾病的治疗，最常用的剂型为注射剂。而胸腺素是胸腺肽组分5的主要成分，多年来的临床应用表明具有明显的非特异性和特异性免疫作用，干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白对免疫细胞功能、抗体水平的影响实验表明更优于单纯的干扰素α2b和胸腺素α1。
                     表22  干扰素α2b+胸腺素α1融合蛋白对小鼠血样T细胞亚群的影响( x±s，n＝10)
组别   剂量(IU/只)   给药11天   给药16天
  CD3   CD4/CD8   CD16/32   CD3   CD4/CD8   CD16/32
  正常对照组空白基质短小棒状菌融合蛋白融合蛋白融合蛋白   --0.2ml/只500500050000   40.03±6.7944.25±7.9054.96±10.17*52.75±5.75*57.67±13.41*57.37±8.77**   2.31±0.822.39±0.673.55±1.08**3.35±0.95*3.45±1.30*3.31±0.78*   8.49±2.819.51±3.7313.19±3.88*13.67±4.30*13.45±4.18*13.30±3.94*   41.67±5.2345.32±4.7757.35±14.56*53.76±10.81*53.39±9.09*56.13±11.10*   2.35±0.652.61±0.603.82±1.16**3.62±1.04*3.62±1.27*4.36±1.76**   8.44±1.539.39±3.8813.91±4.55*13.29±4.06*14.18±5.03*13.41±3.47*
与空白基质组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0
                                SEQUENCE LISTING
<110>吉林大学
<120>SEQ ID NO.1
<130>05P 101376
<160>2
<170>Patent In version 3.1
<210>1
<211>597
<212>DNA
<213>人工序列(artificial)
<220>
<221>CDS
<222>(4)..(597)
<223>编码胸腺肽干扰素融合蛋白
<400>1
atg tct gac gct gct gtt gac acc tct tct gaa atc acc acc aaa gac        48
    Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys Asp
    1               5                   10                  15
ctg aaa gaa aaa aaa gaa gtt gtt gaa gaa gct gaa aac ggt ggt ggt        96
Leu Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn Gly Gly Gly
                20                  25                  30
gga tcc tgt gat ctg cct caa acc cac agc ctg ggt agc agg agg acc        144
Gly Ser Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr
            35                  40                  45
ttg atg ctc ctg gca cag atg agg cgt atc tct ctt ttc tcc tgc ttg        192
Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu
        50                  55                  60
aag gac aga cat gac ttt gga ttt ccc cag gag gag ttt ggc aac cag        240
Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln
    65                  70                  75
ttc caa aag gct gaa acc atc cct gtc ctc cat gag atg atc cag cag        288
Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln
80                  85                  90                  95
atc ttc aat ctc ttc agc aca aag gac tca tct gct gct tgg gat gag        336
Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu
                100                 105                 110
acc ctc cta gac aaa ttc tac act gaa ctc tac cag cag ctg aat gac        384
Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp
            115                 120                 125
ctg gaa gcc tgt gtg ata cag ggg gtg ggg gtg aca gag act ccc ctg        432
Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu
        130                 135                 140
atg aag gag gac tcc att ctg gct gtg agg aaa tac ttc caa aga atc        480
Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile
    145                 150                 155
act ctc tat ctg aaa gag aag aaa tac agc cct tgt gcc tgg gag gtt        528
Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val
160                 165                 170                 175
gtc aga gca gaa atc atg aga tct ttt tct ttg tca aca aac ttg caa        576
Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln
                180                 185                 190
gaa agt tta aga agt aag gaa                                                 597
Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu
            195
<210>2
<211>198
<212>PRT
<213>人工序列(artificial)
<400>2
Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys Asp Leu
  1             5                   10                  15
Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn Gly Gly Gly Gly
            20                      25                  30
Ser Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu
    35                  40                  45
Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys
    50                  55                  60
Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile
                85                  90                  95
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
            100                 105                 110
Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
        115                 120                 125
Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met
    130                 135                  140
Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
145                 150                 155                 160
                                             05P101376.ST25.txt
Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
                165                 170                 175
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu
            180                 185                  190
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
        195

Claims (10)

1、一种融合蛋白，含有人胸腺肽α1的氨基酸序列以及人干扰素α2b的氨基酸序列，所述人胸腺肽α1的氨基酸序列位于人干扰素α2b的氨基酸序列的氨基端。
2、权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，在人胸腺肽α1的氨基酸序列与人干扰素α2b的氨基酸序列之间可以进一步包含一段连接肽序列，所述连接肽序列为(GGGGS)1-3。
3、权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，其具有如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列。
4、一种分离的多核苷酸分子，其编码权利要求1所述的融合蛋白。
5、权利要求4所述的多核苷酸分子，其特征在于，其具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
6、一种重组载体，其含有权利要求4所述的多核苷酸分子。
7、权利要求6所述的重组载体，其特征在于所述载体为酵母表达载体。
8、权利要求6所述的重组载体，其特征在于所述载体为大肠杆菌表达载体。
9、一种宿主细胞，含有权利要求6所述的重组载体。
10、一种药物组合物，含有有效量的权利要求1所述的融合蛋白以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
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