CN104311672B

CN104311672B - 一种具有肿瘤细胞靶向性的抑制剂多肽

Info

Publication number: CN104311672B
Application number: CN201410564240.4A
Authority: CN
Inventors: 劳兴珍; 李斌; 于婷婷; 郑珩
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2014-10-21
Filing date: 2014-10-21
Publication date: 2017-07-11
Anticipated expiration: 2034-10-21
Also published as: CN104311672A

Abstract

本发明属于生物工程制药技术领域，具体涉及一种具有肿瘤细胞靶向性的抑制剂多肽。本发明设计了具有肿瘤细胞靶向的肿瘤抑制剂TA‑2.TA‑2含有胸腺肽a1的全部氨基酸序列，且在其羧基端含有肿瘤细胞靶向性多肽片段精氨酸‑甘氨酸‑天冬氨酸‑精氨酸序列。本发明的TA‑2是在大肠杆菌中表达的基因工程产品，其纯化过程包括蛋白的诱导表达，亲和层析，凝胶层析。该产物在体内外实验中体现显著提高原有胸腺肽a1的抗肿瘤细胞生长的效果，其有显著作用的肿瘤包括肺癌，黑色素瘤，乳腺癌在内的实体瘤。

Description

一种具有肿瘤细胞靶向性的抑制剂多肽

技术领域

本发明涉及生物工程制药技术领域，具体涉及一种具有肿瘤细胞靶向性的抑制剂多肽。

背景技术

研究表明，胸腺肽α1(以下简称Tα1)是一种免疫调节因子，已被证明具有提高免疫功能及抗病毒和抗癌作用。Tα1可以作为免疫增强剂，已应用于临床治疗与肝癌关系密切的乙肝，丙肝。此外，对其他癌症也有显著的治疗效果，如乳腺癌，胃癌，白血病等。对严重败血症等疾病，急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，胃肠道及全身感染性疾病，肝硬化自发性腹膜炎也有较好的治疗效果(Yumin L等.J Intensive Care Med,2009,24(1):47-53和Tuthill C等.Ann N Y Acad Sci.2010，1194:130-5)。

整合素是一类广泛存在于细胞表面的细胞外基质成分的受体家族，也是细胞表面受体的主要家族，属于一类细胞粘附分子，主要介导细胞之间、细胞与细胞外基质、细胞与病原体之间相互作用。

整合素在体内表达广泛，大多数细胞表面都可表达一种以上的整合素，在多种生命活动中发挥关键作用。整合素是由α(120～185kD)和β(90～110kD)两个亚单位形成的异二聚体。迄今已发现18种α亚单位和8种β亚单位。它们按不同的组合构成24种整合素。在肿瘤细胞中，整合素的组成与正常细胞不同，通常与细胞迁移有关的整合素的数量会增加，而其他的整合素数量下降。与细胞迁移有关的整合素通常都含有αν亚基。也就是说整合素含αν的整合素在肿瘤细胞表面高度表达，在正常组织不表达(Desgrosellier JS等.Nat RevCancer.2010，10(1):9-22.)。而一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的小分子多肽,与含有αν亚基的整合素有高度的选择性和亲和力(Pasqualini R等NatBiotechnol.1997，15(6):542-6.)。RGD肽与αν类整合素的特异性结合可介导多种病理生理过程的发生,尤其在肿瘤细胞的黏附、转移和肿瘤新生血管生成中起重要作用。因此，利用RGD肽与αν类整合素的特异结合,将具有肿瘤细胞靶向性效果,可以有效地减少肿瘤治疗中对正常组织或器官的损害，同时RGD肽能够直接诱导肿瘤细胞的凋亡，可以增强效应分子的抗肿瘤效果。本发明利用的Arg-Gly-Asp-Arg序列既兼具了与αν类整合素的特异结合的特性，也可以被神经菌毛素(Neuropilin-1,Nrp-1)所识别而介导药物进入肿瘤细胞内部(Teesalu T等，Proc Natl Acad Sci U S A.2009，106(38):16157-62.)，故兼具肿瘤靶向并介导进入肿瘤内部的优势。

发明内容

本发明是将胸腺肽a1和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-精氨酸在C端进行连接，构建一个具有与αν类整合素的特异结合的特性的新型的抗肿瘤药物，具有肿瘤细胞靶向性。其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。它是一种肿瘤细胞靶向的高效的肿瘤抑制剂，其既可以在真核细胞也可以在原核细胞表达。本发明用重组DNA技术制备了含有目的基因的原核载体，并在大肠杆菌中表达和分离纯化，所获产物与原型胸腺肽a1相比，具有高效抗肿瘤效果。

本发明多肽的制备方法如下：

(1)基因的获取

利用基因合成的方法获得下列序列：

GGTACCGACGACGACGACAAAAGCGATGCGGCCGTGGATACCAGCAGCGAGATCACGACCAAAGACCTGAAGGAGAAAAAGGAAGTGGTGGAAGAAGCGGAAAACGGCGGTGGCGGCCGTGGCGATCGTTAAAAGCTT及其互补序列。

(2)将合成的基因与原核表达载体连接，转化大肠杆菌，以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。

(3)将表达产物进行分离，金属螯合亲和层析，凝胶层析分离纯化产物，收集并冻干，即得。

药效学试验证明本发明的多肽具有较强的抗肿瘤作用，下面是部分药效学试验和结果：

为了比较本发明多肽(以下简称TA-2)的实际效果，本发明同时克隆表达了胸腺肽a1及TA-3，TA-3含有胸腺肽a1的全部氨基酸序列，且在其羧基端含有肿瘤细胞靶向性多肽片段精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列。TA-3的序列如下：Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-lys-Asp-leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-GLu-Gln-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp。

小鼠体内抗肿瘤实验：

将培养的黑色素瘤B16F10细胞在C57BL/6(6-8周)小鼠体侧皮下接种,当肿瘤平均体积达到200-300mm³，随机将小鼠分组，包括阳性及阴性对照组外，一组给药本发明多肽TA-2，一组给药TA-3，一组给药胸腺肽a1。隔日用游标卡尺测量肿瘤长与宽，并计算肿瘤体积，肿瘤体积＝长×宽²×0.50。最终治疗效果经由肿瘤抑制率表示：(1-治疗组肿瘤体积/阴性对照组肿瘤体积)×100％。结果表明，本发明多肽TA-2与原型胸腺肽a1相比，具有高效抗肿瘤效果；本发明多肽TA-2与TA-3相比，也具有高效抗肿瘤效果。

附图说明

图1是SDS-PAGE分析纯化重组的TA-2(其中1：分子量标记，2：诱导表达的重组TA-2，3：被洗脱的杂蛋白，4：纯化的重组TA-2)

图2是TA-2体内抑制黑色素瘤效果

图3是多肽体内抑制黑色素瘤效果

具体实施方式

实施例1

1、TA-2基因的克隆及原核表达载体的构建

合成基因序列及其互补序列：GGTACCGACGACGACGACAAAAGCGATGCGGCCGTGGATACCAGCAGCGAGATCACGACCAAAGACCTGAAGGAGAAAAAGGAAGTGGTGGAAGAAGCGGAAAACGGCGGTGGCGGCCGTGGCGATCGTTAAAAGCTT。

进行KpnI和HindIII酶切，克隆到原核表达载体pET32a，转化至大肠杆菌，PCR法筛选阳性转化子，核苷酸序列测定分析。

2、重组菌的诱导表达

将重组菌接种，过夜摇育，以1％的接种量接种至信箱培养基，待OD600达到0.6时，加入1mMIPTG诱导4小时。收集细胞，加入1/20菌体体积的缓冲液(20mmol/L pH 7.4的磷酸钠，0.5mol/L NaCl)悬浮细胞，冰浴超声破碎菌体，4度13000转/分，离心10分钟，取上清，保存于-20度冰箱。

3、重组蛋白的分离纯化

将蛋白粗品上样于金属螯合层析柱，用10倍柱体积的缓冲液(20mmol/L pH 7.4的磷酸钠，0.5mol/L NaCl)洗涤层析柱，用5倍柱体积的洗脱缓冲液(20mmol/L pH 7.4的磷酸钠，0.5mol/L NaCl，0.1mol/L Imidazole)进行洗脱。收集洗脱液，用Sephadex G-25脱盐，流动相为0.01mmol/LNH₄HCO₃(pH8.6)溶液，紫外280nm检测，收集第一个峰，所得蛋白溶液冻干。SDS-PAGE电泳结果如图1所示。取冻干样品，在23度下，用肠激酶进行切割16小时，酶切混合液经过金属螯合层析柱，收集前流份，用用Sephadex G-25脱盐，流动相为0.01mmol/LNH₄HCO₃(pH8.6)溶液，紫外检测280nm检测，冻干后保存于4度冰箱。

4.动物体内抗黑色素瘤实验

将培养的鼠黑色素瘤B16F10细胞用0.05％的胰蛋白酶消化，1000rpm离心5分钟，重悬于PBS，在C57BL/6(6-8周)小鼠体侧皮下接种50000个细胞(0.1ml)。当肿瘤平均体积达到200-300mm3，随机将小鼠分4组，每组8只，一组给药TA-2，一组给药胸腺肽a1(Ta1)，一组以PBS做阴性对照，一组以紫杉醇做阳性对照。除了阴性对照，剂量都是0.25mg/kg/d，每天在接种肿瘤对侧皮下注射。隔日用游标卡尺测量肿瘤长与宽，并计算肿瘤体积，肿瘤体积＝长×宽2×0.50。最终治疗效果经由肿瘤抑制率表示：(1-治疗组肿瘤体积/阴性对照组肿瘤体积)×100％。

结果如图2所示，当治疗至第15天时，TA-2的肿瘤抑制率为41％，而胸腺肽a1的肿瘤抑制率为24％(p<0.05)。实验结果说明本发明设计的TA-2确实能够显著抑制小鼠体内的肿瘤生长，而且比原型胸腺肽a1具有更好的抗肿瘤生长的效果。

将培养的鼠黑色素瘤B16F10细胞用0.05％的胰蛋白酶消化，1000rpm离心5分钟，重悬于PBS，在C57BL/6(6-8周)小鼠体侧皮下接种50000个细胞(0.1ml)。当肿瘤平均体积达到200-300mm3，随机将小鼠分4组，每组8只，一组给药TA-2，一组给药TA-3，一组给药胸腺肽a1(Ta1)，一组以PBS做阴性对照，一组以紫杉醇做阳性对照。除了阴性对照，剂量都是0.25mg/kg/d，每天在接种肿瘤对侧皮下注射。隔日用游标卡尺测量肿瘤长与宽，并计算肿瘤体积，肿瘤体积＝长×宽2×0.50。最终治疗效果经由肿瘤抑制率表示：(1-治疗组肿瘤体积/阴性对照组肿瘤体积)×100％。

结果如图3所示，当治疗至第13天时，TA-2的肿瘤抑制率为55％，TA-3的肿瘤抑制率为49％，而胸腺肽a1的肿瘤抑制率为36％。实验结果说明本发明设计的TA-2确实能够显著抑制小鼠体内的肿瘤生长，并具有比TA-3和原型胸腺肽a1具有更好的抗肿瘤生长的效果。

Claims

1.一种抗肿瘤的多肽，其特征是：氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1的多肽的制备方法，包括：设计得到权利要求1多肽的对应核苷酸序列，构建羧基端含有如权利要求1的氨基酸序列所对应基因的载体，进行基因工程表达和分离纯化。

3.一种药物组合物，其中含有权利要求1的多肽及药学上可接受的载体。

4.权利要求1的多肽用于制备治疗肿瘤的药物的用途。