CN1766115A - 肿瘤血管导向肽与人干扰素α－2b的融合蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肿瘤新生血管特异性结合多肽NGR与人干扰素α－2b(IFNα－2b)融合蛋白的制备方法。本发明选用从噬菌体展示文库中筛选出的能与肿瘤新生血管内皮细胞表面高效表达的CD13结合的含13个氨基酸的环肽NGR，利用基因工程方法将其融合在IFNα－2b的羧基末端，制备的肿瘤新生血管特异性结合多肽NGR与IFNα－2b的融合蛋白，能在肿瘤新生血管处富集，从而提高干扰素α－2b的治疗特异性，减少全身用量，降低毒副反应，提高量效比。

Description

肿瘤血管导向肽与人干扰素α-2b的融合蛋白的制备方法

                           技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及基因克隆、基因突变、外源基因在原核细胞中的表达、目的蛋白质的纯化、肿瘤新生血管特异性结合多肽NGR与人干扰素α-2b(IFNα-2b)融合蛋白的体外活性测定及理化性质的鉴定等技术。进一步涉及一种肿瘤血管导向性结合多肽NGR与人干扰素α-2b(IFNα-2b)融合蛋白及制备，即一种肿瘤新生血管特异性结合多肽NGR与人干扰素α-2b(IFNα-2b)融合蛋白及其制备，肿瘤新生血管特异性结合多肽NGR与人干扰素α-2b(IFNα-2b)融合蛋白作为抗肿瘤药物，能够特异性作用于肿瘤组织新生血管内皮细胞及肿瘤细胞。

                           背景技术

肿瘤血管导向肽与细胞因子的融合蛋白的应用已有许多相关报导，申请人曾经就“肿瘤新生血管特异性结合多肽与人α干扰素融合蛋白及制备”和“肿瘤血管导向肽与新型重组人肿瘤坏死因子融合蛋白及制备”，申请了中国专利，申请号分别为02139537.3和02114663.2，在上述专利文献的背景技术中已经详尽的介绍了人IFNα的TNF的研究进展情况，限于篇幅这里就不再赘述。下面主要介绍多肽导向技术的发展。

1.多肽导向技术的概念和由来

目前绝大多数的临床药物都存在一个不容忽视的缺陷，即缺乏对病理部位的特异亲和力，大剂量给药不仅使得药物成本提高，还不可避免地产生非特异性毒性，对正常组织造成严重的损伤，引发毒副作用，这种毒副作用有时甚至是致死的。为了克服这一难题，人们提出了导向性的治疗策略，该策略的理论基础是相对于正常的组织，病灶部位(特别是肿瘤)具有自己独特的表面分子，这些分子不仅是相对特异的，而且常常是高表达的，所以若给药物连接上这些分子的配体或抗体，则借助于这些配体或抗体和它们相应的分子的结合，药物便可特异性的被带到病灶部位，选择性攻击病变细胞，对正常细胞几乎没有不良影响，从而使药物的疗效达到理想的程度。该策略被认为是提高药物特异性的有效方法，目前导向性药物的开发在药物开发领域发展处于邻先地位，仅以美国为例，其导向性药物的开发以13.2％的年增长率位居全美药物市场的首位。

导向性的分子有很多类，如抗体、靶分子的天然配体、肽等，其中以小分子肽作为导向分子的技术被称为多肽导向技术。可以作为导向性分子的肽包括两大类，一类是天然存在的肽，如生长激素释放抑制因子(somatostatin)、血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)等，它们分别在疾病的特异性诊断和治疗方面发挥了良好的导向性作用。另一类则是非天然存在的肽，与天然肽相比，该类肽的种类更多，鉴定更方便，而且有可能比天然肽与其相应受体的亲和力更高，故该类肽成为近年来人们关注的热点。噬菌体呈现技术则被认为是用于筛选该类肽的快速而有效的方法。

2  噬菌体随机肽库技术

1985年Smith率先将外源基因插入丝状噬菌体f1的外壳蛋白基因的III区，使目的基因编码的多肽呈现在噬菌体的表面，从而建立了噬菌体表面呈现技术。1990年Scott首次将随机序列肽与丝状噬菌体表面的蛋白gIII融合，并呈现在噬菌体表面，建立了噬菌体随机肽库。随机肽库的容量非常大，因为一个肽库就是一定长度随机肽段的混合物，理论上应该包含该长度所有可能的氨基酸排列信息，如果一个包含所有15个氨基酸长度的肽文库，理论上其分子多样性要达到20¹⁵。噬菌体肽库技术就是用特定的靶分子通过亲和淘洗的方法从随机肽库中筛选到特定靶分子结合的肽，然后通过测序，确定编码肽段的基因序列并推知其氨基酸序列。

目前常用的筛选方法可分为两大类，一类是体内筛选，一类是体内筛选。

2.1  体外筛选

体外筛选是目前最常用的方法，它最早是由Smith等人设计的。具体的操作是这样的：先将靶分子包被在固相介质上，加入噬菌体肽库与之吸附，其中呈现了与配基结合肽的噬菌体被捕获于固相载体上，而不与配基结合的噬菌体则被洗去，洗去未结合和结合力低的噬菌体，再用洗脱液洗脱结合的噬菌体并感染大肠杆菌得以扩增，扩增后的噬菌体进入下一轮循环。经过1-4轮淘洗可富集到特异性的噬菌体多肽。用于噬菌体肽库筛选的目的蛋白可以直接吸附于酶联板上，也可以固定在生物小磁珠上或者把经生物素化的靶分子固定到包被了链霉亲和素的ELISA小孔或生物磁珠上。对于一些难以分离的膜蛋白分子可以直接以表达此蛋白的细胞为靶去筛选肽库。

2.2  体内筛选

当某些抗原及标志物不易确定或难以获得纯化产物时，体内筛选是比较合适的选择。体内筛选的优点是其是在体内进行的，所以筛选出的肽是与完全保持了活性状态的靶分子结合的，但是筛选出的肽究竟是与何种分子结合还有待于进一步确定，它的主要操作是：将噬菌体肽库经尾静脉注射入小鼠，待噬菌体在体内循环适宜时间后，通过心脏对小鼠进行全身灌注以洗去非特异性结合的噬菌体，然后收集靶器官中的噬菌体，经感染大肠杆菌扩增、纯化后再注射小鼠，进行下一轮淘筛，一般为3-4轮，直到噬菌体得到富集，挑取单克隆，对噬菌体表面呈现片段进行测序，推导其序列的同源性。

1996年Ruoslahti、Pasqualini等人首次采用该技术，将噬菌体肽库直接注射到小鼠体内进行筛选，得到了与小鼠肾、脑血管结合的小肽，，他们的创新性实验设计和良好的实验结果，使他们的工作发表在当年的Nature杂志上。随后几年，他们在噬菌体展示技术的体内筛选方面做了一系列工作，并有许多应用到疾病的治疗和机理方面的研究。

3.导向肽在疾病治疗中的应用：

3.1  在传统治疗方面的应用

Ruoslahti等人用体内筛选的方法获得了能特异性和肿瘤血管结合的小肽CDCRGDCFC(简称RGD-4C)和CNGRCVSGCAGRC(简称NGR)，将它们分别与具有抗血管形成作用的常规化疗药物阿霉素交联，发现导向性的阿霉素可以使人乳腺癌移植瘤小鼠存活时间明显延长，且毒副反应降低。Arap和Pasqualini等人将这两条小肽与诱导细胞凋亡的小肽化学偶联，发现凋亡小肽在导向小肽的引导下直接进入肿瘤血管内皮细胞，破坏线粒体膜诱发内皮细胞凋亡，而对其他细胞没有影响。Angelo等人，用基因工程的方法构建了鼠NGR-TNF的融合蛋白，对荷瘤小鼠的抑瘤作用比天然鼠TNF高12-15倍，而毒性相似；同样方法构建的人NGR-TNF对人体肿瘤的抑制作用比天然人TNF强，且用药量降低30倍。

3.2  在基因治疗上的应用

基因治疗载体也可以用噬菌体来源的肽作导向。纤维包被蛋白上掺入RGD-4C的腺病毒载体显著提高了对牛的内皮细胞的导向性，研究表明RGD-4C标记的腺病毒可高效导向原发的肿瘤细胞。在培养的平滑肌细胞中，各种不同的含RGD序列的肽标记的腺病毒都能导向整合素。另有研究表明，在体外筛选转铁蛋白受体得到的小肽展示在腺病毒的包膜蛋白时，腺病毒载体可以顺利地将基因转移到人脑的内皮细胞，因为内源转铁蛋白受体在其中高水平表达。另外，标记NGR的逆转录病毒MLV可以增强对培养的内皮细胞的转导效率。当将筛选噬菌体抗体库得来的与T细胞特异结合的单链抗体展示在MLV的外壳蛋白上时，此单链抗体可以介导MLV有选择地导入人的初级T细胞。

3.3  在临床疾病诊断上的应用

因为噬菌体展示肽库几乎可以筛到与任何靶标特异结合的多肽，通常情况下，这些小肽只需相应做一些改变就能符合造影剂的要求，即对某一靶标具有特异的导向性和亲和力，并且稳定性好。线状的多肽进入体内后，会被血清中的蛋白酶迅速降解，而大的蛋白半衰期太长，重复使用会引起免疫反应，因此不适合做造影剂。只有存在二硫键限制的6-30个左右的环状肽，既能人工合成，半衰期又合适，适合用作造影剂。有的多肽已获FDA批准进入市场，进行临床的局部造影诊断。如一个二聚肽P748和P357(来源于RGD motifs)标记后可以导向血栓形成部位，其商品名为Tect^。

4.NGR肽及其受体CD13/APN

4.1  NGR肽的发现及应用

1998年，Ruoslahti等人又通过噬菌体展示技术筛选出了可以和活化的肿瘤新生血管特异性结合的多肽序列CDCRGDCFC(简称RGD-4C)和CNGRCVSGCAGRC(简称NGR)。目前，RGD肽和NGR肽在体内作用机理也被阐明，即它们分别是与肿瘤血管表面高表达的α_vβ₃整合蛋白和氨肽酶N(CD13)分子特异性地结合，为这两条小肽作为靶向分子的应用提供了可行性和理论性依据。NGR小肽的应用在上述3.2中已有较多介绍，这里不再重复。

4.2  CD13/APN

4.1  CD13的一般特性

氨肽酶是一系列从蛋白质多肽链的氨基端催化降解氨基酸残基的水解蛋白酶，其中的氨肽酶N因其在肿瘤侵袭、转移、免疫调节和病毒感染等多方面的生理病理过程有关而倍受关注。氨肽酶N/CD13是一种相对分子量150kDa的金属蛋白酶，但由于糖基化程度的不同，在相对分子量上有所差异。它的催化活性中心有一个Zn²⁺，酶活性具有Zn²⁺依赖性，能够从肽、酰胺或芳酰胺上水解释放N端的中性氨基酸(Ala＞Phe＞Leu＞Gly)，作用的天然底物为血管作用肽(赖氨酸缓激肽、血管紧张素III)、神经肽激素(亮氨酸和蛋氨酸脑磷脂、神经激肽A、生长激素抑制因子)，细胞因子和免疫调节剂(IL-8、吞噬刺激素、胸腺喷丁)等等。

该酶曾有过多种命名，如微粒体氨肽酶、粒系氨肽酶、APM、p146、p161以及gp150等，1988年，国际生物化学和分子生物学联合会将其命名为膜型丙氨酰氨肽酶(membrane alanyl aminopeptidase)，1989年根据cDNA序列，将此酶与早期发现的CD13确定为同一种蛋白。

CD13/氨基肽酶N(APN)最早被认为是正常或恶性髓细胞亚群的标志物。后来发现它在多中细胞表明均有表达，尤其在小肠的肠上皮细胞和肾近曲小管的上皮中最为丰富。

人的APN基因编码序列含有20个外显子，定位于染色体15(q25-26)。它的胞内区仅有7个氨基酸残基；8-39位为跨膜区，为α螺旋结构，蛋白分子通过跨膜区固定在细胞膜上；其他的残基则都在胞外，胞外区与氨肽酶活性有关。氨肽酶家族的分子(如氨肽酶N和A、白三烯A₄水解酶、大肠杆菌氨肽酶N等)在锌离子螯合残基附近的氨基酸序列有相似性，它们的共有一段短的模序VBXHEBXHXWFG称为锌离子螯合模序。

4.2  CD13/APN的主要生理功能

4.2.1  蛋白水解酶的作用

CD13/APN通过降解不同的生物活性肽发挥不同的作用，其功能依据它的不同位置而定。另外，其他膜型肽酶如CD10或CD26常与CD13/APN共存，它们在肽降解过程中发挥协同作用。在肠刷状缘，CD13/APN和CD26与小分子肽的降解和氨基酸的切除有关；在突触膜上，CD13/APN和CD10能使脑啡肽和脑磷脂失活；当黑素瘤细胞形成群落时，CD13/APN定位于细胞间连接处，与细胞外复合物紧密相关，调节肿瘤细胞迁移通过基底膜。

4.2.2  在肿瘤发生和转移中的作用

通过研究关节炎和增生性视网膜病变中的病理学炎症反应发现，CD13/APN是新生血管形成的重要调节因子，它在血管上的表达受到血管生成信号的诱导。内皮细胞上CD13对细胞因子的诱导受到了不同肾素/血管紧张素系统(RAS)效应器的调节，包括RAS/分裂素激活的蛋白激酶(MAPK)或磷酸肌醇(PI-3K)等。CD13还是新生血管生成中Ras信号过程的重要靶点，并且是血管生成过程中的限制性因子。在血管生成中，内皮细胞CD13/APN水平会受到组织缺氧、血管生成因子和调节毛细血管形成的信号的调节。CD13的功能性抗体能干扰毛细血管的形成。研究表明，CD13的单克隆抗体(WM15)能抑制肿瘤细胞对IV型胶原的降解，降低多种肿瘤细胞氨肽酶对底物的水解活性。因此推测，CD13可能与IV型胶原酶和其他基质蛋白酶，如溶酶的活化和转化有关，机理可能是切除N端氨基酸残基来引发完成激活过程。

                           发明内容

本发明的目的在于，提供一种肿瘤新生血管特异性结合多肽NGR与人干扰素α-2b(IFNα-2b)融合蛋白的制备方法。本发明是在申请号02139537.3，“肿瘤新生血管特异性结合多肽与人α干扰素融合蛋白及制备”的专利基础上进行了后续研究。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：应用基因克隆技术，构建肿瘤新生血管特异性结合多肽NGR与人干扰素α-2b(IFNα-2b)的融合基因，并在大肠杆菌中获得高效表达。其制备方法是选用能特异性与肿瘤新生血管内皮细胞表达的CD13结合的13个氨基酸的环肽NGR，应用基因重组的方法，将其与IFNα-2b羧基端融合，并在大肠杆菌中获得高效表达。

本发明在成功构建和表达融合基因的基础上，参照IFNα-2b的纯化方法，建立了成本低廉的纯化工艺。在体外活性试验中，该融合蛋白IFNα-2b-NGR能够明显抑制病毒的增殖，比活性达到5.8×10⁸IU/mg。

                           附图说明

图1是本发明的中IFNα-2b-NGR融合基因的全序列测定图；

图2是本发明中IFNα-2b-NGR融合蛋白的纯化过程的电泳图。其中M：低分量蛋白标准；1：未诱导的菌体；2：诱导的菌体；3：包含体经洗涤后的上清；4：包含体经洗涤后的沉淀；5：纯化的蛋白(还原性SDS-PAGE)；6：纯化的蛋白(非还原性SDS-PAGE)。

图3是插入片段大小正确的IFN α-2b-NGR融合基因原核表达载体；

图4是重组蛋白的活性测定和SDS-PAGE检测。

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。

                           具体实施方式

制备如上所述的肿瘤新生血管特异性结合多肽NGR与人干扰素α-2b(IFNα-2b)的融合蛋白的方法，按以下步骤制备：

1)IFNα-2b-NGR融合基因的克隆

人白细胞cDNA文库，购自Clontech公司；首先设计一对引物将5’端和3’端的酶切位点分别突变为NdeI和BamHI；

引物1(26nt)：5’-CGC ATA TGT GTG ATC TGC CTC AAA CC-3’

引物2(58nt)：5’-CGG GAT CCT TCC TTA CTT CTT AAA CTT TCT TGCAAG TTT GTT GAC AAA GAA AAA GAT C-3′

对白细胞cDNA文库进行PCR扩增；

PCR扩增反应管的组成为：

200ng/ml cDNA           0.5μl

2.5mM dNTPs             1μl

25mM MgCl₂             4μl

20μM P1                0.5μl

20μM P2                0.5μl

5.0U/ul Taq酶           0.5μl

10×PCR Buffer          5μl

H₂O                    38μl

总计                    50μl。

PCR扩增反应管的配制均在冰浴中进行，配制过程中，先加水、模板cDNA及其他反应组分，95℃反应5min，再加入Taq酶，然后进行PCR反应，PCR扩增的循环参数为：94℃，60s变性反应；55℃，60s退火反应；72℃，60s扩增反应，进行30次循环，于72℃延伸10min；

PCR产物用NdeI和BamHI双酶切后，经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离(图2)，回收目的片段，命名为mutant IFNα-2b；

按照大肠杆菌惯用密码子设计并合成了编码NGR导向肽的核酸片断，这两个片段退火后可形成含13个氨基酸的导向肽片段以及5’端和3’端的粘性末端(BamHI和SalI的酶切位点)；

片段1(46nt)：5’-GAT CCT GCA ACG GTC GTT GCG TGA GCG GTT GCGCGG GTC GTT GCT G-3’

片段2(46nt)：5’-TCG ACC TAG CAA CGA CCC GCG CAA CCG CTC ACGCAA CGA CCG TTG CAG-3’

将合成的两个片段于煮沸变性5min，然后退火，再与mutant IFNα-2b及用NdeI和SalI处理过的pET-22b(+)质粒连接，连接产物转化感受态细胞DH5α，挑取阳性克隆，于LB培养液中培养过夜，提取质粒DNA，经酶切鉴定，获得插入片段大小正确的IFNα-2b-NGR融合基因原核表达载体(图3)，进行DNA序列分析(图1)。测序正确者命名为pET-22b(+)-IFNα-2b-NGR。其中含有编码肿瘤新生血管特异性结合多肽NGR与IFNα-2b融合蛋白的基因；

3)重组蛋白的诱导表达

将测序正确的质粒pET-22b(+)-IFNα-2b-NGR转化感受态细胞BL21(DE3)，随机挑选单克隆菌，于LB培养液中30℃活化振摇培养过夜，次日晨以1∶100比例接种LB(含Amp 100μg/ml)培养基，37℃继续培养至OD_600nm＝0.6时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养4小时，3000rpm离心15min收集菌体，行SDS-PAGE及Western Blot，对SDS-PAGE结果进行用薄层扫描以测定目的蛋白的表达量。

上述工程菌大肠杆菌BL21(DE3)细胞，基因型为F^- ompT hsdSB(r_B ^- m_B ^-)galdcm(DE3)，其中含有编码肿瘤新生血管特异性结合多肽NGR与人干扰素α2b融合蛋白的基因的原核表达载体pET-22b(+)-IFNα-2b-NGR。

4)重组蛋白的纯化

按1克菌体加入5ml的STE缓冲液(100mM NaCl，50mM Tris，pH8.0，1mMEDTA)的比例将菌体重悬，然后加入溶菌酶0.5mg/g及DOC 5ug/g，室温搅拌30min；再加入DNase 20ug/g，静置20min后，4℃离心15min，12,000rpm，弃上清液，收集沉淀；用洗涤液(3M Urea，2％TritonX-100，STE)洗涤沉淀(按1克菌体加入20ml洗涤液)后，4℃离心15min，12,000rpm，弃上清液，再收集沉淀；将沉淀在缓冲液(6.5M盐酸胍，1％ β巯基乙醇，25mM Tris)中彻底溶解；对PBS(pH7.2)透析24h，4℃离心10min，12,000rpm，收集到的上清用PBS(pH7.2)充分平衡的亲和色谱层析柱层析纯化，洗脱液为0.1M甘氨酸(pH2.5)，连续梯度洗脱5个柱床体积，收集洗脱液，进行活性测定和SDS-PAGE检测(图4)。

5)重组蛋白的体外生物学活性检测

WISH细胞在含抗生素和谷氨酰胺的10％FSC，pH7.4的Eagle’s培养液中37℃培养。待细胞呈单层生长后，消化传代继续培养。将消化的WISH细胞，按1,000个细胞/孔接种于96孔板。37℃孵箱培养过夜。换入用含5％FCS的Eagle’s液稀释的不同浓度的蛋白样品，继续培养，次日用含2％FCS的Eagle’s培养液按1∶10-30稀释的VSV病毒培养液，换入细胞培养板，37℃培养24h，观察结果，以50％细胞保护的IFNα-2b-NGR稀释度为IFNα-2b-NGR效价。

本发明经实验证明，其有益效果如下：

1)利用PCR的方法成功的改造了IFNα-2b的5’端和3’端酶切位点，并将人工合成的编码NGR的寡核苷酸片段与IFNα-2b的3’端连接，构建了IFNα-2b融合基因的原核表达载体pET-22b(+)-IFNα-2b-NGR，DNA序列测定证实完全正确。

2)经IPTG诱导后，IFNα-2b-NGR蛋白在大肠杆菌中获得高效表达。经免疫印迹证实该融合蛋白与抗IFNα单克隆抗体和抗NGR单克隆抗体均能特异性结合。

3)纯化了IFNα-2b-NGR融合蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳检测纯度大于95％。

4)体外活性实验显示IFNα-2b-NGR融合蛋白具有明显的抗病毒增殖能力，比活性达到5.8×10⁸IU/mg。

        IFNα-2b-NGR融合基因的全序列

ATGTGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGAT

GCTCCTGGCACAGATGCGCAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACA

GACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGGCAACCAGTTCCAAAAG

GCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCT

CTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACA

AATTCTACACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGTGTG

ATACAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCA

TTCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCAAAGAATCACTCTCTATCTGAAAGAG

AAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGA

GATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGGAA

GGATCCTGCAACGGTCGTTGCGTGAGCGGTTGCGCGGGTCGTTGCTAGTC

TAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTA

AATAAGCTTGGCGTAATCATGGGCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAAATGGT

AT

Claims (4)

1.一种肿瘤新生血管特异性结合多肽NGR与人干扰素α-2b融合蛋白的制备方法，其特征在于，按以下步骤制备：

1)IFNα-2b-NGR融合基因的克隆

选择人白细胞cDNA文库，首先设计一对引物将5’端和3’端的酶切位点分别突变为NdeI和BamHI；

引物1(26nt)：5’-CGC ATATGT GTG ATC TGC CTC AAA CC-3’

引物2(58nt)：5’-CGG GAT CCT TCC TTA CTT CTT AAA CTT TCT TGCAAG TTT GTT GAC AAA GAA AAA GAT C-3′

对人白细胞cDNA文库进行PCR扩增；

PCR扩增反应管的配制均在冰浴中进行，配制过程中，先加水、模板cDNA及其他反应组分，95℃反应5min，再加入Taq酶，然后进行PCR反应，PCR扩增的循环参数为：94℃，60s变性反应；55℃，60s退火反应；72℃，60s扩增反应，进行30次循环，于72℃延伸10min；

PCR产物用NdeI和BamHI双酶切后，经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的片段，命名为mutant IFNα-2b；

按照大肠杆菌惯用密码子设计并合成了编码NGR导向肽的核酸片断，这两个片段退火后可形成含13个氨基酸的导向肽片段以及5’端和3’端的粘性末端即BamHI和SalI的切点；

片段1(46nt)：5’-GAT CCT GCA ACG GTC GTT GCG TGA GCG GTT GCGCGG GTC GTT GCT G-3’

片段2(46nt)：5’-TCG ACC TAG CAA CGA CCC GCG CAA CCG CTC ACGCAA CGA CCG TTG CAG-3’

将合成的两个片段于煮沸变性5min，然后退火，再与mutant IFNα-2b及用NdeI和SalI处理过的pET-22b(+)质粒连接，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α细胞，挑取阳性克隆，于LB培养液中培养过夜，提取质粒DNA，经酶切鉴定，获得插入片段大小正确的IFNα-2b-NGR融合基因原核表达载体，进行DNA序列分析，测序正确者命名为pET-22b(+)-IFNα-2b-NGR，其中含有编码肿瘤新生血管特异性结合多肽NGR与IFNα-2b融合蛋白的基因；

3)重组蛋白的诱导表达

将测序正确的质粒pET-22b(+)-IFNα-2b-NGR转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞，随机挑选单克隆菌，于LB中30℃活化振摇培养过夜，次日晨以1∶100比例接种LB培养基，其中含Amp 100μg/ml，37℃继续培养至OD_650nm＝0.6时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养4小时，3000rpm离心15min收集菌体，行SDS-PAGE及Western Blot，对SDS-PAGE结果进行用薄层扫描以测定目的蛋白的表达量。

4)重组蛋白的纯化

按1克菌体加入5ml的STE缓冲液，其配方为100mM NaCl，50mM Tris，pH8.0，1mM EDTA，将菌体重悬，然后加入融菌酶0.5mg/g及DOC 5ug/g，室温搅拌30min；再加入DNase 20ug/g，静置20min后，4℃离心15min，12,000rpm，弃上清液，收集沉淀；用洗涤液3M Urea，2％TritonX-100，STE洗涤沉淀后，按1克菌体加入20ml洗涤液，4℃离心15min，12,000rpm，弃上清液，再收集沉淀；将沉淀在缓冲液中彻底溶解，缓冲液的配方为6.5M盐酸胍，1％β巯基乙醇，25mM Tris；对PBS透析24h，其PBS的pH为7.2，4℃离心10min，12,000rpm，收集到的上清用PBS充分平衡的亲和色谱层析柱层析纯化，洗脱液为0.1M甘氨酸，其pH为2.5，连续梯度洗脱5个柱床体积，收集洗脱液，进行活性测定和SDS-PAGE检测；

5)重组蛋白的体外生物学活性检测

WISH细胞在含抗生素和谷氨酰胺的10％FSC，pH7.4的Eagle’s培养液中37℃培养，待细胞呈单层生长后，消化传代继续培养；将消化的WISH细胞，按1,000个细胞/孔接种于96孔板，37℃孵箱培养过夜，换入用含5％FCS的Eagle’s液稀释的不同浓度的IFN裂菌上清，继续培养，次日用含2％FCS的Eagle’s培养液按1∶10-30稀释的VSV病毒培养液，换入细胞培养板，37℃培养24h，观察结果，以50％细胞保护的IFN稀释度为IFN效价。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述原核表达载体pET-22b(+)-IFNα-2b-NGR中含有编码肿瘤新生血管特异性结合多肽NGR与人干扰素α2b融合蛋白的基因，该载体经37℃振荡培养过夜、活化后，经0.1mMIPTG诱导，高效表达肿瘤新生血管特异性结合多肽NGR与人干扰素α2b融合蛋白。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述工程菌大肠杆菌BL21(DE3)细胞，基因型为F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm(DE3)，其中含有编码肿瘤新生血管特异性结合多肽NGR与人干扰素α2b融合蛋白的基因的原核表达载体pET-22b(+)-IFNα-2b-NGR。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应管的组成为：

200ng/ml cDNA                            0.5μl

2.5mM dNTPs                              1μl

25mM MgCl₂                              4μl

20μM P1                                 0.5μl

20μM P2                                 0.5μl

5.0U/ul Taq酶                            0.5μl

10×PCR Buffer                           5μl

H₂O                                     38μl

总计                                     50μl。

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