CN1301265C - 一种合成多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种合成多肽及其应用。其氨基酸序列如下所示：X1X2X3-Phe-Phe-X4X5-His-Val-Ala-X6-Ala-Asn-Val-X7X8-Leu-X9-Ile-Leu-X10其中，X1为Leu-Ser-Tyr-Arg-Cys-或Leu-Ser-Tyr-Arg-Cys-Pro-或Pro-；X2为-Ser-或-Cys-或-Thr-；X3为-Arg-或-Lys-或-His-；X4为-Glu-或-Asp-；X5为-Ser-或-Cys-或-Thr-；X6为-Arg-或-Lys-或-His-；X7为-Arg-或-Lys-或-His-；X8为-Arg-或-Lys-或-His-；X9为-Arg-或-Lys-或-His-；X10为-Asn或-Asn-Thr-Pro-Asn-Cys或-Asn-Thr-Pro-Asn-Cys-Ala。本发明的合成多肽在制备用于预防和治疗肿瘤转移药物中有着非常重要的应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药领域，具体地说涉及一种合成多肽。
背景技术
肿瘤的侵袭和转移是恶性和良性肿瘤的最本质区别，也是目前导致恶性肿瘤患者治疗失败的重要原因之一。肿瘤侵袭是指原发病灶的肿瘤细胞破坏细胞外基质和基底膜形成的天然屏障，侵进毗邻的正常组织，使之发生坏死和病变的过程；肿瘤转移是指肿瘤细胞通过血循环和淋巴循环，在远离原发部位的器官内形成转移灶的过程。临床上大约30％新诊断的实体瘤患者已有可见的转移灶，特别是一些高转移性的肿瘤如乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌及黑色素瘤等。虽然当前以手术为主的综合治疗对初期肿瘤能取得较好的疗效，但肿瘤的侵润和转移使原先的局部病变转化为全身弥散性、多灶性的疾病，最终导致化疗与手术治疗的失败，是引起肿瘤患者死亡的主要原因。因此有效的抑制肿瘤的侵袭和转移将是降低肿瘤死亡率的有效手段之一。
肿瘤的转移规律极其复杂，涉及诸多因素，如蛋白水解酶；血管生成因子；黏附因子，如整合素(integrin)，选择素(selectin)，钙黏合素(E-cadherin)等；运动因子；信号转导。影响肿瘤转移任何一个因素都会对其产生抑制作用，如抑制血管生长、抑制蛋白水解酶和黏附因子的活性。报道较多的是抑制基质金属蛋白酶(MMPs)活性以抑制肿瘤转移，如用天然酶抑制剂TIMPs。但TIMPs在组织中含量极微且难以提取；人工重组TIMPs是大分子蛋白质，存在生物利用度低等问题。还有研究含RGD(Arg-Gly-Asp)特异序列的肽类抗肿瘤转移抑制剂，其通过结合和饱和细胞表面的整合素、纤维粘连蛋白(FN)和层粘连蛋白(LN)结合位点来抑制肿瘤的黏附、浸润和转移[赛爱荣等，HAb18G/CD147拮抗肽抗肝癌转移作用的体外试验，World Chin JDigetol 2003，11(3)：255-259]，。总的来说治疗效果一直不尽人意，因此研制新型高效的抗肿瘤转移药物显得迫切需要。
近年来分子生物学的研究揭示肿瘤的转移有着高度的器官选择性。趋化因子及其受体介导的信号传导过程调节了肿瘤细胞的特异性器官迁移[anja Muller et al，involvement of chemokine receptors inbreast cancer metastasis，NATURE，2001，410：50-56；Chris J et al，Multiple actions of the chemokine CXCL12 on epithelial tumor cells inhuman ovarian cancer，CANCER RES.2O02，62：5930-5938；Russell S，Use of the stromal cell-derived factor-1/CXCR4 pathway in prostatecancer metastasis to bone，CANCER RES.2002，62：1832-1837]。研究表明，高转移的乳腺癌、前列腺癌等癌细胞表面均高表达有功能活性的趋化因子受体如CXCR4，而在淋巴结、骨髓、肝和肺等正常组织中，其基质细胞分泌高浓度的趋化因子如CXCL12。肿瘤细胞通过血液循环到达含高浓度CXCL12的器官时，CXCR4与CXC12发生特异的受体/配体相互作用，并引起下游的信号传导，使肿瘤细胞上调表达黏附分子受体，并引起癌细胞的效应细胞如癌周成纤维细胞分泌金属蛋白酶，以促进肿瘤细胞的迁移。因此以CXCR4/CXCL12的受体/配体相互作用为新的靶点，有效地抑制CXCR4/CXCL12的相互作用，可从高位阻断肿瘤细胞的迁移。
发明内容
本发明的目的在于克服目前肿瘤的治疗难题，提供一种合成多肽。
本发明的另一个目的在于提供上述合成多肽在制备用于预防和治疗肿瘤转移药物中的应用。
本发明的另一个目的在于提供一种多肽化合物。
本发明的另一个目的在于提供上述多肽化合物在制备用于预防和治疗肿瘤转移药物中的应用。
本发明的合成多肽，其氨基酸序列如(I)式所示：
X1X2X3-Phe-Phe-X4X5-His-Val-Ala-X6-Ala-Asn-Val-X7X8-Leu-X9-Ile-Leu-X10
(I)
在式(I)中：
X1选自Leu-Ser-Tyr-Arg-Cys-或Leu-Ser-Tyr-Arg-Cys-Pro-或Pro-
X2选自-Ser-或-Cys-或-Thr-，为结构类似的氨基酸；
X3选自-Arg-或-Lys-或-His-，为碱性氨基酸；
X4选自-Glu-或-Asp-，为结构类似的酸性氨基酸；
X5选自-Ser-或-Cys-或-Thr-，为结构类似的氨基酸；
X6选自-Arg-或-Lys-或-His-，为碱性氨基酸；
X7选自-Arg-或-Lys-或-His-，为碱性氨基酸；
X8选自-Arg-或-Lys-或-His-，为碱性氨基酸；
X9选自-Arg-或-Lys-或-His-，为碱性氨基酸；
X10选自-Asn或-Asn-Thr-Pro-Asn-Cys或
-Asn-Thr-Pro-Asn-Cys-Ala；
并且：
Ala表示英文名称为alanine，中文名称为丙氨酸的氨基酸的相应残基；
Arg表示英文名称为arginine，中文名称为精氨酸的氨基酸的相应残基；
Asn表示英文名称为asparagine，中文名称为天冬酰胺的氨基酸的相应残基；
Asp表示英文名称为aspartic acid，中文名称为天冬氨酸的氨基酸的相应残基；
Cys表示英文名称为cysteine，中文名称为半胱氨酸的氨基酸的相应残基；
Glu表示英文名称为glutamic acid，中文名称为谷氨酸的氨基酸的相应残基；
Gly表示英文名称为glycine，中文名称为甘氨酸的氨基酸的相应残基；
His表示英文名称为histidine，中文名称为组氨酸的氨基酸的相应残基；
Ile表示英文名称为isoleucine，中文名称为异亮氨酸的氨基酸的相应残基；
Leu表示英文名称为leucine，中文名称为亮氨酸的氨基酸的相应残基；
Lys表示英文名称为lysine，中文名称为赖氨酸的氨基酸的相应残基；
Phe表示英文名称为phenylalanine，中文名称为苯丙氨酸的氨基酸的相应残基；
Pro表示英文名称为proline，中文名称为脯氨酸的氨基酸的相应残基；
Ser表示英文名称为serine，中文名称为丝氨酸的氨基酸的相应残基；
Thr表示英文名称为threonine，中文名称为苏氨酸的氨基酸的相应残基；
Val表示英文名称为valine，中文名称为缬氨酸的氨基酸的相应残基；
上述合成多肽，其中X1选自Leu-Ser-Tyr-Arg-Cys-Pro-或Pro-；X2选自-Ser-或-Cys-；X3为-Arg-；X4为-Glu-；X5为-Ser-；X6为-Arg-；X7为-Lys-；X8为-His-；X9为-Lys-；
X10选自-Asn或-Asn-Thr-Pro-Asn-Cys或
-Asn-Thr-Pro-Asn-Cys-Ala。
上述合成多肽，其中X1为Leu-Ser-Tyr-Arg-Cys-Pro-，X2为-Ser-，X3-Arg-，X4为-Glu-，X5为-Ser-，X6为-Arg-，X7为-Lys-，X8-His-，X9为-Lys-，X10为-Asn-Thr-Pro-Asn-Cys-Ala。此序列命名为BSC-1。
上述合成多肽，其中X1为Leu-Ser-Tyr-Arg-Cys-Pro-，X2为-Ser-，X3为-Arg-，X4为-Glu-，X5为-Ser-，X6为-Arg-，X7为-Lys-，X8为-His-，X9为-Lys-，X10为-Asn。此序列命名为BSC-2。
上述合成多肽，其中X1为Pro-，X2为-Cys-，X3为-Arg-，X4为-Glu-，X5为-Ser-，X6为-Arg-，X7为-Lys-，X8为-His-，X9为-Lys-，X10为-Asn-Thr-Pro-Asn-Cys。此序列命名为BSC-3。
本发明所指多肽序列，包括式(I)所表示的片段、类似物和同族物以及它们的衍生序列，如反向序列，反手链，及Cys残基间在自然或实验室条件下形成二硫键所形成的新序列等。
本发明涉及的多肽序列，源于以CXCR4为靶标的系统研究，实验显示它们可有效抑制CXCR4/CXCL12的相互作用，阻断癌细胞的信号传导通路，抑制相关蛋白的高表达，从高位阻断肿瘤细胞的迁移。但这些多肽的抗肿瘤转移活性并不限于抑制CXCR4/CXCL12的相互作用。
本发明的有益效果：本发明的合成多肽可用于预防和治疗肿瘤转移，在制备用于预防和治疗肿瘤转移药物中有着重要的应用。其治疗效果好，应用前景广阔。
具体实施方式
实施例1 BSC-1、BSC-2及BSC-3的合成，分离纯化及二硫键构建：
由Fmoc/tBu固相多肽合成方法合成(SPPS)。合成的固相支持物为2-chlorotrityl resin，每步耦合反应均为一次，Kaiser test检测反应过程。合成所需肽链后用Reagent B(TFA 88％，phenol 5％，H2O 5％，TIS2％)从2-chlorotrityl resin切除多肽，冷乙醚沉淀得多肽粗品。粗品用巯基乙醇还原二硫键，再溶于DMSO中配成稀溶液，空气鼓动过夜形成分子内二硫键。
RT-HPLC纯化多肽，C18柱(10mm×200mm，300 particle size)，线性梯度洗脱H2O/acetonitrile 0.1％TFA.冷冻干燥，得SN-1 12mg，SN-2 13mg，SN-3 10mg.每个样品均配置浓度为5mg/300ul DMSO.MALDI-TOF MS分析分子量为：BSC-1：3571.7(calculated 3571.1)；BSC-2：3086.9(calculated 3086.5)；BSC-3：2893.1(calculated 2893.4)。
实施例2底物与受体CXCR4亲和性实验
将待测底物SN-1，2，3与CXCR4+的U373-MAGI-CXCR4 CEM细胞培养，加入荧光素标记的CXCR4单抗12G5，保温一定时间，测细胞之荧光强度。显示多肽底物与受体CXCR4有很强的亲和性。其中序列BSC-1、BSC-2及BSC-3的IC50见表(1)：
表(1)
| No.of Substrate | IC50(μg/ml)(Mean±SD)for inhibition of | |
| 12G5 binding to CXCR4 | SDF-1αbinding to CXCR4 | |
| BSC-1BSC-2 | 0.865±0.0051.041±0.466 | 0.0914±0.00070.1710±0.0460 |
| BSC-3SDF-1α | 0.983±0.1480.811±0.008 | 0.1033±0.0102 |
实施例3底物抑制SDF-1α与CXCR4的相互作用实验
将荧光标记的SDF-1α与CXCR4+的U373-MAGI-CXCR4 CEM细胞培养，加入待测底物，保温一定时间，测细胞之荧光强度。显示多肽底物与受体CXCR4的强亲和性抑制了天然配体SDF-1α与CXCR4的相互作用，其中序列BSC-1、BSC-2及BSC-3的IC50见表(1)。
结果说明多肽底物可能以SDF-1α/CXCR4的相互作用为靶点。
实施例4重组基底膜侵袭抑制试验
将底部铺有8μm孔径PVP-聚碳酸膜的transwell小室放入24孔灭菌培养板中，小室内膜上加入Maruigel胶(40ul/膜)，37℃，1h，超净工作台吹干。在小室外24孔板中加入含有SDF-1a的趋化剂200ul，小室内加入预先与SN-1，2，3(1mg/ml)共孵育2h的U373-MAGI-CXCR4 CEM细胞，于37℃含5％CO2孵箱中孵育20h。弃去培养液，用棉签擦去上室中的细胞，95％酒精固定15min后，取下滤膜，HE染色，中性树胶封片，在40X光镜下计数膜背面侵袭的细胞数，记数至少5个视野。同时，以无多肽底物作对照，计算趋化指数。结果含有多肽底物的实验组穿膜细胞数明显少于对照组(P＜0.05)，显示多肽底物对肿瘤细胞的侵袭和转移有显著的抑制作用。其中序列BSC-1、BSC-2及BSC-3的IC50见表(2)：
表(2)
| 多肽 | BSC-1 | BSC-2 | BSC-3 |
| 抑制率％ | 73.2 | 64.2 | 70.5 |
实施例6序列BSC-1、BSC-2及BSC-3的急性毒理试验：
小鼠急性毒理试验：实验用动物为健康雄性小鼠。采用灌胃方法试验。给药量至1.2g/kg时仍未发现供试小鼠有中毒症状和死亡。试验表明，BSC-1、BSC-2及BSC-3的LD50远大于1.2g/kg。
小鼠30天毒性试验：实验用动物为健康雄性小鼠。采用灌胃方法试验。给药量为150mg/kg day，连续30天。试验表明，受试小鼠无死亡，生长发育、造血功能等系列生化指标均无明显异常变化。
由以上实例可知，BSC-1，BSC-2，BSC-3表现出很好的抗肿瘤转移细胞活性，且无明显毒性。由于序列中的X3X5X6X7X8X9均为碱性胺基酸，本领域的技术人员很容易就能推出这些位置的胺基酸残基用-Arg-或-Lys-或-His-相互替代不会显著改变序列的性质，因而推测其相互替换产生的新序列同样具有原序列类似的生物活性。
X2位置的-Ser-或-Cys-和-Thr-，为结构类似的氨基酸；本领域的技术人员很容易就能推出这些位置的胺基酸残基相互替代不会显著改变序列的性质，因而推测其相互替换产生的新序列同样具有原序列类似的生物活性。
X4位置的-Glu-与-Asp-，为结构类似的酸性氨基酸；本领域的技术人员很容易就能推出这些位置的胺基酸残基相互替代不会显著改变序列的性质，因而推测其相互替换产生的新序列同样具有原序列类似的生物活性。
一种合成多肽及其应用序列表
SEQUENCE LISTING
<110>中山大学
<120>一种合成多肽及其应用
<130>
<160>3
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Ser Arg Glu Ser Arg Lys His Lys Asn Thr Pro Asn Cys Ala
5 10 15 20
<210>2
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Ser Arg Glu Ser Arg Lys His Lys Asn
5 10 15
<210>3
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<400>3
Pro Cys Arg Glu Ser Arg Lys His Lys Asn Thr Pro Asn Cys
5 10 14
Claims (2)
1、一种合成多肽，其氨基酸序列如(I)式所示：
X1X2X3-Phe-Phe-X4X5-His-Val-Ala-X6-Ala-Asn-Val-X7X8-Leu-X9-Ile-Leu-X10
(I)
X1为Leu-Ser-Tyr-Arg-Cys-Pro-，X2为-Ser-，X3为-Arg-，X4为-Glu-，X5为-Ser-，X6为-Arg-，X7为-Lys-，X8为-His-，X9为-Lys-，X10为-Asn-Thr-Pro-Asn-Cys-Ala；
或X1为Leu-Ser-Tyr-Arg-Cys-Pro-，X2为-Ser-，X3为-Arg-，X4为-Glu-，X5为-Ser-，X6为-Arg-，X7为-Lys-，X8为-His-，X9为-Lys-，X10为-Asn；
或X1为Pro-，X2为-Cys-，X3为-Arg-，X4为-Glu-，X5为-Ser-，X6为-Arg-，X7为-Lys-，X8为-His-，X9为-Lys-，X10为-Asn-Thr-Pro-Asn-Cys。
2、权利要求1所述的合成多肽在制备用于预防和治疗肿瘤转移药物中的应用。
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| CN 200410077777 CN1301265C (zh) | 2004-12-30 | 2004-12-30 | 一种合成多肽及其应用 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN 200410077777 CN1301265C (zh) | 2004-12-30 | 2004-12-30 | 一种合成多肽及其应用 |
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| Publication Number | Publication Date |
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| CN1660895A CN1660895A (zh) | 2005-08-31 |
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-
2004
- 2004-12-30 CN CN 200410077777 patent/CN1301265C/zh not_active Expired - Fee Related
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