KR102373603B1 - 섬유증 억제 활성을 가지는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 섬유증 억제용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 텔로머라제로부터 유래된 펩티드를 포함하여 조직 세포의 섬유증을 억제하는데 효과적인 섬유증 억제용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 펩티드는 암 발생으로 인한 섬유증, 화학요법 항암제의 투여로 인한 섬유증, 방사선 노출로 인한 섬유증 또는 TGF-β 신호전달 과정을 포함하여 진행되는 조직의 섬유증을 포함한 각종 섬유증의 진행을 억제하는 효과를 나타내어, 항-섬유증 또는 섬유증 억제용 조성물 및 섬유증으로 인한 질병의 치료방법을 제공할 수 있다.

Description

섬유증 억제 활성을 가지는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물{PEPTIDE HAVING FIBROSIS INHIBITORY ACTIVITY AND COMPOSITION CONTAINING SAME}

본 발명은 섬유증(fibrosis) 억제 효능 (anti-fibrosis)을 가지는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 텔로머라제로부터 유래된 펩티드를 포함하여 각종 조직 세포의 섬유증 발생을 억제하는데 효과적인 섬유증 억제용 조성물에 관한 것이다.

섬유증은 섬유아세포에 의한 세포외 기질의 비정상적 생성, 축적 및 침착이 일어나는 질환으로, 다양한 조직의 구조 및 기능을 변화시키는 손상(injury) 또는 염증에 따른 콜라겐 매트릭스의 비정상적인 축적을 말한다. 섬유증의 발병 위치에 무관하게, 섬유증의 대부분의 병인학은 정상 조직을 대체하는 콜라겐 매트릭스의 과도한 축적을 포함한다. 특히 신장, 간, 폐, 심장, 뼈 또는 골수, 그리고 피부에서 유발된 섬유증은 장기의 기능부전을 유도하고 최악의 경우 사망에 이르게도 한다. 상기 섬유아세포는 정상적 상태에서는 세포외 기질의 전구체를 생성하여 섬유 조직을 형성하는 기능을 한다. 결합 조직의 세포사이 물질인 세포외 기질은 피브로 넥틴, 라미닌, 콘드로넥틴, 콜라겐과 같은 단백질 형태로 존재한다.

한편, TGF-β는 섬유아세포에 의한 세포외 기질의 비정상적 생성, 축적 는 세포증식, 염증반응, 암세포 전이와 같이 매우 다양한 역할을 가지며, 많은 세포 신경전달 경로(Cellular Signaling Pathway)와 표적이 규명 되어 있다. 따라서, 많은 질병 모델에서 TGF-β에 관한 연구가 진행 되었으며 가장 활발한 연구 및 약물개발이 진행 되고 있는 분야는 섬유증 관련질환(Fibrotic diseases)과 암을 꼽을 수 있다.

TGF-β의 기전은 일반적으로 TGF-β수용체에 결합한 후, 세포질 내에서 Smad 단백질의 인산화를 유도하며 다양한 Smad 단백질과의 상호작용을 통해 신호를 전달한다. 여기에는 주로 Smad2, Smad3가 관여하며, Smad1 과 Smad5는 bone morphogenic protein (BMP) 신호전달에 관여한다. 그리고, Smad4는 TGF-β 뿐만 아니라, activin, BMP 등에 모두 관여하는 공통된 신호물질로 알려져 있다(Heldin, CH et al. Nature, 1997, 390, 465-471; Massague J. Annu. Rev. Biochem. 1998, 67, 753-791).

TGF-β신호전달기전의억제를 통해 종양 침투(tumor invasion) 억제와 상피 간엽 이행(epithelial-mesenchymal transition, EMT)를 조절함으로써 효과적인 항암치료효과를 기대할 수 있다. 더 나아가, TGF-β가 세포의 증식 및 분화 조절의 중요한 사이토카인임을 고려할 때, 항암치료의 주요한 부작용으로 거론되는 방사선에 의한 섬유화를 막을 수 있는 치료법으로도 각광받고 있다 (Zhang et al. J Radiat Res. 2013, 54, 630-636).

최근 특발성 폐섬유화증(Idiopathic Pulmonary Fibrosis) 치료제로서 FDA 승인(2014년 10월 15일)된 Esbriet® (Pirfenidone)의 경우 TGF-β 억제제로서 TGF-β의 생성 억제가 주된 작용기전으로 알려져 있다. 또한, TGF-β는 세포증식 조절인자로서 세포증식을 유도 또는 제한하여 암, 심장질환, 당뇨를 비롯한 다양한 질병의 발병과정에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 보고하고 있으며, 다양한 생리 활성 등이 보고되었다. 예를 들면, TGF-β 합성 억제 (세포증식 조절인자 생성 억제), TGF-β antagonist (TGF receptor를 교란, 신호전달방해), PDGF (Platelet-Derived Growth Factor) antagonist (혈관 생성 유도 인자 억제), p38 MAP kinase inhibitor (세포 증식 신호 전달 효소 억제), 항염 (TNF-alpha 및 MAPK의 생성억제) 등의 작용이 있다. 따라서, TGF-β를 보다 직접적으로 억제하거나 TGF-β가 관여하는 신호전달 과정을 차단할 수 있으며, 부작용도 없는 새로운 의약 조성물을 개발할 수 있다면, 섬유화로 유발되는 각종 질병 및 노화에 대한 예방 및 치료를 수행할 수 있을 것이다.

특히, 암 환경에 있어서, 암조직, 항암제, 방사선 치료 등 다양한 섬유증 유발 인자가 존재하므로, 암 환경에서 섬유증의 억제는 더욱 중요한 의미가 있다. 현재 대표적인 항암 치료법인 방사선 치료와 화학요법은 섬유화 등에 의한 부작용으로 환자 삶의 질을 현저히 떨어뜨리고 항암치료의 예후를 매우 악화시키는 것으로 알려져 있다.

따라서, 암 유발에 관여하는 TGF-β 신호기전을 억제하는 치료제는 항암백신의 개발뿐만 아니라, 기존 항암치료의 효과를 극대화할 수 있는 새로운 치료제 및 치료 방법으로서 매우 유용할 것이므로, 이의 개발이 요망된다. 예컨대, 항암 치료시, 암 조직, 항암제 및 방사선 조사 등에 의해 유발되는 섬유증은 항암제가 암 부위로 전달되어 항암 효과를 나타내도록 하는 약물 전달 및 약효 발현을 방해함과 동시에, 항암 면역세포가 암 부위로 이동하는 것을 막아 항암 치료가 효과적으로 이루어지지 못하게 한다. 따라서, 인체에 대한 부작용이 없고, 암 조직, 화학요법 항암제, 및 방사선 조사 등으로부터 유발되는 섬유화를 억제할 수 있는 의약 조성물이 개발된다면, 암에 대한 항암 치료를 보다 효과적으로 수행할 수 있을 것이다.

KR 1019930001915 A KR 1020040107492 A

이러한 배경하에서 본 발명자들은 부작용이 없고, 효과가 우수한 섬유증 억제용 조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 목적은 효과적인 섬유증 억제용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 일측면에 따르면 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드(이하, "PEP1"), 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 섬유증 억제용 조성물이 제공된다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 펩티드의 단편은 3개 이상의 아미노산으로 구성된 단편일 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 섬유증은 상기 섬유증은 암, 항암제 투여, 및 방사선 노출로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것에 의해 유도되는 섬유증인 것일 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 섬유증은 췌장암, 대장암, 위암, 전립선암, 비소세포폐암, 유방암, 흑색종, 난소암으로 이루어진 군에서 선택되는 암세포조직의 섬유증을 억제하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 조성물은 암세포조직의 섬유증을 억제하기 위하여, 화학요법 항암제와 병용하거나, 방사선 치료와 병행하여 사용되는 조성물일 수 있다. 상기 화학요법 항암제는 데옥시뉴클레오시드 유사체 및 플루오로피리미딘 중 선택된 하나 이상일 수 있으며, 상기 데옥시뉴클레오시드 유사체는 젬시타빈이고, 상기 플루오로피리미딘은 5-플루오로우라실 또는 카페시타빈일 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 조성물은 제약학적으로 수용 가능한 부형제 및 첨가제 등을 더 포함하는 약학적 조성물일 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 조성물은 TGF-β신호전달 과정에 관여하여, 피부세포조직의 섬유증을 억제하는 섬유증 억제용 조성물일 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 조성물은 허용 가능한 부형제, 윤활제 및 첨가제 등을 더 포함하며, 화장품 조성물일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일측면에 따르면 상기 섬유증 억제용 조성물을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 특징으로 하는 섬유증 관련 질환을 치료 및 예방하는 방법이 제공된다.

본 발명에 따른 서열번호의 서열을 갖는 펩티드 또는 상기 서열과 80%의 상동성을 갖는 서열을 갖는 펩티드 또는 단편인 펩티드, 이를 포함하는 조성물, 및 이를 사용하는 방법은 우수한 섬유증 억제 효능을 나타내며, 이로 인한 부작용이 전혀 없어, TGF-β 신호전달 과정에 따른 조직적인 섬유화, 특히 암 조직에 의한 섬유화, 항암 치료 등에 수반되는 항암제 또는 방사선 노출 등에 의한 섬유증을 효과적으로 억제할 수 있으며, 섬유증 관련 질환의 예방 및/또는 치료에 매우 유용하다.

도 1은 이종이식 실험 모델로서, AsPCI 세포를 누드 마우스에 접종한 후 10일 후부터 PEP1 및 젬시타빈을 투약하는 전체적인 실험 과정을 나타낸 도식이다.
도 2는 생체 내에서의 PEP1과 젬시타빈의 항암 효과를 측정하기 위하여, AsPC1세포를 접종한 누드 마우스에 아무 것도 투약하지 않은 대조군, 10일 후부터 PEP1, 젬시타빈을 각 투약한 군 그리고 PEP1 및 젬시타빈을 함께 투약한 군의 투약 이후 24일 동안의 각 마우스 무게를 측정한 그래프이다.
도3은 AsPC1세포를 접종한 누드 마우스에 아무 것도 투약하지 않은 대조 군의 세포 사진이다.
도4는 AsPC1세포를 접종한 누드 마우스에 10일 후부터 1일 1회 피하로 PEP1을 투약한 군의 세포 사진이다.
도5는 AsPC1세포를 접종한 누드 마우스에 10일 후부터 3일마다 1회씩 복강으로 젬시타빈을 투약한 군의 세포 사진이다.
도6은 AsPC1세포를 접종한 누드 마우스에 10일 후부터 PEP1 (1일 1회 피하) 및 젬시타빈 (3일 1회 복강)을 함께 투약한 군의 세포 사진이다.
도7은 HepG2 세포주에 아무것도 처리하지 않은 대조군과 TGF-β1을 처리한 뒤 아무것도 처리하지 않은 실험군, SB431542을 처리한 양성 대조군 및 PEP1을 농도별(1, 5, 10 μM)로 처리한 실험군 각각에서 qRT-PCR법을 통하여 Smad2 유전자의 상대적인 발현량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도8은 HepG2 세포주에 TGF-β1을 처리한 뒤, PEP1을 농도별로(1, 5, 10 μM) 처리한 실험군 각각에서 Smad2유전자 억제 비율을 %로 나타낸 그래프이다.
도9는 HepG2 세포주에 아무것도 처리하지 않은 대조군과 TGF-β1을 처리한 뒤 아무것도 처리하지 않은 실험군, SB431542을 처리한 양성 대조군 및 PEP1을 농도별(1, 5, 10 μM)로 처리한 실험군 각각에서 qRT-PCR방법을 통하여 Smad4 유전자의 상대적인 발현량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도10은 HepG2 세포주에 TGF-β1을 처리한 뒤 PEP1을 농도별로(1, 5, 10 μM) 처리한 실험군 각각에서 Smad4유전자 억제 비율을 %로 나타낸 그래프이다.
도11은 HepG2 세포주에 아무것도 처리하지 않은 대조군과 TGF-β1을 처리한 뒤 아무것도 처리하지 않은 실험군, SB431542을 처리한 양성 대조군 및 PEP1을 농도별(1, 5, 10 μM)로 처리한 실험군 각각에서 qRT-PCR방법을 통하여 피브로넥틴(fibronectin)의 상대적인 발현량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도12는 HepG2 세포주에 TGF-β1을 처리한 뒤 SB431542을 처리한 양성 대조군 및 PEP1을 농도별로(1, 5, 10 μM) 처리한 실험군 각각에서 피브로넥틴 억제 비율을 %로 나타낸 그래프이다.
도13은 NHEK(Normal human epidermal keratiocytes)세포를 위약(sham)을 처리한 대조군 및 PEP1을 1mM 농도로 처리한 실험군으로 나누어 방사선(6Gy, IR(ionizing radation))에 노출시키지 않았을 때와 노출시켰을 때 각각 10일 뒤 세포의 배양 상태를 나타낸 사진이다.
도14는 NHEK 세포를 위약 처리한 대조군 및 PEP1을 1mM농도로 처리한 실험군으로 나누고 각각을 방사선(6Gy, IR)에 노출시키지 않았을 때와 노출시켰을 때 1일 후 및 10일 후에서 각 실험군의 세포내 GRHL2, p63, N-Cad 및 P-Akt의 발현 상태를 보여주는 전기영동 사진이다.
도15는 NHEK 세포를 위약 처리한 대조군 및 PEP1을 1mM농도로 처리한 실험군으로 나누어 방사선(6Gy, IR)에 노출시킨 후 각각의 세포에서 p-Smad2/3, Smad4, FN, Snail 및 N-Cad의 발현을 보여주는 웨스턴블로팅(Western Blotting) 사진이다.

발명의 실시를 위한 최선의 형태

이하에서 구체적인 실시예를 참고로 하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

텔로미어(telomere)는 염색체의 말단에 반복적으로 존재하는 유전 물질로서, 해당 염색체의 손상이나 다른 염색체와의 결합을 방지한다고 알려져 있다. 세포가 분열할 때마다 텔로미어의 길이는 조금씩 짧아지는데, 일정한 횟수 이상의 세포 분열이 있게 되면 텔로미어는 매우 짧아지고, 그 세포는 분열을 멈추고 죽게 된다. 반면 텔로미어를 길게 하면 세포의 수명이 연장된다고 알려져 있으며, 그 예로 암세포에서는 텔로머라제(telomerase)라는 효소가 분비되어 텔로미어가 짧아지는 것을 막기 때문에, 암세포가 죽지 않고 계속 증식할 수 있다고 알려져 있다. 본 발명자들은 텔로머라제로부터 유래되는 펩티드가 섬유증 억제에 효과적임을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 일 측면에서, 서열 번호 1의 펩티드, 서열번호 1의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드는 텔로머라제, 구체적으로 인간(Homo sapiens) 텔로머라제에서 유래한 펩티드를 포함한다.

본 명세서에 개시된 펩티드는 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에 개시된 펩티드는, 서열번호 1을 포함하는 펩티드 또는 그 단편들과 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미노산, 3개 이상의 아미노산, 4개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 6개 이상의 아미노산 또는 7개 이상의 아미노산이 변화된 펩티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 일측면에서, 본 발명의 범주 내에서 서열 번호 1의 펩티드의 물리화학적 특성이 변경되도록 하는 펩티드에 대한 일부 아미노산 변화가 행해질 수 있다. 예를 들어, 펩티드의 열안정성을 향상시키고, 기질 특이성을 변경시키고, 최적의 pH를 변화시키는 등의 아미노산 변화가 수행될 수 있다.

본 명세서에서 "아미노산"이라 함은 자연적으로 펩티드로 통합되는 22개의 표준 아미노산들 뿐만 아니라 D-아이소머 및 변형된 아미노산들을 포함한다. 이에 따라, 본 발명의 일측면에서 펩티드는 D-아미노산을 포함하는 펩티드일 수 있다. 한편, 본 발명의 다른 측면에서 펩티드는 번역 후 변형(post-translational modification)된 비표준 아미노산 등을 포함할 수 있다. 번역 후 변형의 예는 인산화(phosphorylation), 당화(glycosylation), 아실화(acylation) (예컨대, 아세틸화(acetylation), 미리스토일화(myristoylation) 및 팔미토일화(palmitoylation)를 포함), 알킬화(alkylation), 카르복실화(carboxylation), 히드록실화(hydroxylation), 당화반응(glycation), 비오티닐화(biotinylation), 유비퀴티닐화(ubiquitinylation), 화학적 성질의 변화(예컨대, 베타-제거 탈이미드화, 탈아미드화) 및 구조적 변화(예컨대, 이황화물 브릿지의 형성) 를 포함한다. 또한, 펩티드 컨쥬게이트를 형성하기 위한 가교제(crosslinker)들과의 결합과정에서 일어나는 화학 반응들에 의해 생기는 아미노산의 변화, 예컨대 아미노기, 카르복시기 또는 사이드 체인에서의 변화와 같은 아미노산의 변화를 포함한다.

본 명세서에 개시된 펩티드는 자연 그대로의 공급원으로부터 동정 및 분리된 야생형 펩티드일 수 있다. 한편, 본 명세서에 개시된 펩티드는 서열번호 1의 단편들인 펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하는, 인공 변이체일 수 있다. 인공 변이체에서 뿐만 아니라 야생형 폴리펩티드에서의 아미노산 변화는 단백질의 폴딩(folding) 및/또는 활성에 유의한 영향을 미치지 않는 보존성 아미노산 치환을 포함한다. 보존성 치환의 예들은 염기성 아미노산(아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산(글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산(루신, 이소로이신, 발린 및 메티오닌), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판 및 티로신), 및 작은 아미노산(글리신, 알라닌, 세린 및 트레오닌)의 군의 범위 내에 있다. 일반적으로 특이적 활성을 변경시키지 않는 아미노산 치환이 본 분야에 공지되어 있다. 가장 흔하게 발생하는 교환은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, 및 Asp/Gly, 그리고 이들과 반대인 것들이다. 보존적 치환의 다른 예는 다음 표와 같다.

원래 아미노산	예시적인 잔기 치환	바람직한 잔기 치환
Ala (A)	val; leu; ile	Val
Arg (R)	lys; gln; asn	Lys
Asn (N)	gln; his; asp, lys; arg	Gln
Asp (D)	glu; asn	Glu
Cys (C)	ser; ala	Ser
Gln (Q)	asn; glu	Asn
Glu (E)	asp; gln	Asp
Gly (G)	Ala	Ala
His (H)	asn; gln; lys; arg	Arg
Ile (I)	leu; val; met; ala; phe; norleucine	Leu
Leu (L)	norleucine; ile ; val; met; ala; phe	Ile
Lys (K)	arg; gln; asn	Arg
Met (M)	leu; phe; ile	Leu
Phe (F)	leu; val; ile; ala; tyr	Tyr
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	thr	Thr
Thr (T)	Ser	Ser
Trp (W)	tyr; phe	Tyr
Tyr (Y)	trp; phe ; thr; ser	Phe
Val (V)	ile; leu; met; phe; ala; norleucine	Leu

펩티드의 생물학적 특성에 있어서의 실재적인 변형은 (a) 치환 영역 내의 폴리펩티드 골격의 구조, 예를 들면 시트 또는 나선 입체 구조를 유지하는데 있어서의 이들의 효과, (b) 표적 부위에서의 상기 분자의 전하 또는 소수성을 유지하는데 있어서의 이들의 효과, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는데 있어서의 이들의 효과가 상당히 상이한 치환부를 선택함으로써 수행된다. 천연 잔기는 통상의 측쇄 특성에 기준하여 다음 그룹으로 구분된다:

(1) 소수성: 노르루이신, met, ala, val, leu, ile;

(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;

(3) 산성: asp, glu;

(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및

(6) 방향족: trp, tyr, phe.

비-보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환함으로써 이루어질 것이다. 펩티드의 적당한 입체 구조를 유지하는 것과 관련이 없는 어떠한 시스테인 잔기도 일반적으로 세린으로 치환되어 상기 분자의 산화적 안정성을 향상시키고 이상한 가교결합을 방지할 수 있다. 역으로 말하면, 시스테인 결합(들)을 상기 펩티드에 가하여 그의 안정성을 향상시킬 수 있다

펩티드의 다른 유형의 아미노산 변이체는 항체의 글리코실화 패턴이 변화된 것이다. 변화란 의미는 펩티드에서 발견된 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실 및(또는) 펩티드 내에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 나타낸다.

펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된 것이다. N-연결된이란 탄수화물 잔기가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 말한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 탄수화물 잔기를 아스파라긴 측쇄에 효소적 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이들 트리펩티드 서열 중의 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써, 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중의 하나를 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 의미하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신을 사용할 수도 있다.

펩티드로의 글리코실화 부위의 부가는 하나 이상의 상기 언급된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변화시킴으로써 편리하게 수행된다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 이러한 변화는 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 최초 항체의 서열에 부가하거나 이들 잔기로 치환함으로써 이루어질 수도 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).

또한 본 발명의 일측면에 따른 서열 번호 1의 서열을 갖는 펩티드, 서열 번호 1의 서열의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드는 세포 내 독성이 낮고, 생체 내 안정성이 높다는 장점을 가진다. 본 발명에서의 서열번호 1은 텔로머라제 유래 펩티드로서 하기와 같이 16개의 아미노산으로 이루어진 펩티드이다.

서열 번호 1에 기재된 펩티드는 아래 표 2과 같다. 아래 표 2의 "이름"은 펩티드를 구별하기 위해 명명한 것이다. 본 발명의 일측면에서, 서열 번호 1에 기재된 펩티드는 인간 텔로머라제의 전체 펩티드를 나타낸다. 본 발명의 다른 일측면에서, 서열 번호 1의 서열을 갖는 펩티드, 서열 번호 1의 서열의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드는 텔로머라제에 포함된 펩티드 중 해당 위치의 펩티드를 선별해 합성한 "합성 펩티드"를 포함한다. 서열번호 2는 전체 텔로머레이즈의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

서열번호	이름	텔로머라제 상 위치	서열	길이
1	pep1	[611-626]	EARPALLTSRLRFIPK	16 aa
2		[1-1132]	MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRR GAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRDCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGT TLTALEAAANPALPSDFKTILD	1132 aa

본 발명의 일측면에서는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는(comprising) 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 섬유증 억제 효능을 가지는 펩티드를 유효 성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일측면에 따른 섬유증 억제용 약학 조성물은 일측면에서는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는(comprising) 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 0.01mg/kg 내지 0.1mg/kg, 1mg/kg, 및 10mg/kg 의 함량으로 포함할 수 있으나 용량에 따른 효과의 차이를 보이는 경우 이를 적절히 조절할 수 있다. 상기 범위 또는 그 이하의 범위로 포함하는 경우 본 발명의 의도한 효과를 나타내기에 적절할 뿐만 아니라, 조성물의 안정성 및 안전성을 모두 만족할 수 있으며, 비용 대비 효과의 측면에서도 상기 범위로 포함하는 것이 적절할 수 있다.

일 측면에서 본 발명은, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드의 용도로서, 상기 언급된 섬유증 억제용 조성물들 중 어느 한 조성물을 제조하기 위한 용도이다.

본 발명의 일측면에 따른 조성물은 인간, 개, 닭, 돼지, 소, 양, 기니아피그 또는 원숭이를 포함하는 모든 동물에 적용될 수 있다.

본 발명의 일측면에서 조성물은 서열번호 1 의 아미노산 서열을 포함하는(comprising) 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 섬유증 억제효능을 가지는 펩티드를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 경구, 직장, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 골수 내, 경막 내 또는 피하 등으로 투여될 수 있다.

경구 투여를 위한 제형은 정제, 환제, 연질 또는 경질 캅셀제, 과립제, 산제, 액제 또는 유탁제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비경구 투여를 위한 제형은 주사제, 점적제, 로션, 연고, 겔, 크림, 현탁제, 유제, 좌제, 패취 또는 분무제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 필요에 따라 희석제, 부형제, 활택제, 결합제, 붕해제, 완충제, 분산제, 계면 활성제, 착색제, 향료 또는 감미제 등의 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 당업계의 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물의 유효 성분은 투여 받을 대상의 연령, 성별, 체중, 병리 상태 및 그 심각도, 투여 경로 또는 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 적용량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 0.1 ㎍/kg/일 내지 1 g/kg/일, 구체적으로는 1 ㎍/kg/일 내지 100 mg/kg/일, 더 구체적으로는 10 ㎍/kg/일 내지 10 mg/kg/일, 보다 더 구체적으로는 50 ㎍/kg/일 내지 1 mg/kg/일이 될 수 있으나, 용량에 따른 효과의 차이를 보이는 경우 이를 적절히 조절할 수 있다. 본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 1일 1회 내지 3회 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일측면에서 조성물은 서열번호 1 의 아미노산 서열을 포함하는(comprising) 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 유효 성분으로 포함하는 섬유증 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일측면에서 조성물은 암 조직,특히 췌장암, 위암, 신장암, 전립선암, 후두암, 식도암, 갑상선암, 폐암, 유방암 (breast cancer), 장암, 자궁암, 자궁경부암 (cervical cancer), 자궁체암, 방광암 (urinary bladder cancer), 비뇨생식로암, 방광암 (bladder cancer), 피부암 조직이 유발하는 섬유증의 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일측면에 따른 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어, 정제, 과립제, 분말제, 액제, 고형 제제 등으로 제형화될 수 있다. 각 제형은 유효 성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.

상기 유효 성분의 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 구체적으로는 1 ㎍/kg/일 내지 100 mg/kg/일, 더 구체적으로는 10 ㎍/kg/일 내지 10 mg/kg/일, 보다 더 구체적으로는 50 ㎍/kg/일 내지 1 mg/kg/일이 될 수 있으나, 용량에 따른 효과의 차이를 보이는 경우 이를 적절히 조절할 수 있고, 투여하고자 하는 대상의 연령, 건강 상태, 합병증 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어들은 특정 구체예들을 설명하기 위한 목적으로만 의도된 것이지 본 발명을 한정하고자 하는 의도가 아니다. 명사 앞에 개수가 생략된 용어는 수량을 제한하고자 하는 것이 아니라 언급된 명사 물품이 하나 이상 존재하는 것을 나타내는 것이다. 용어 "포함하는", "갖는", 및 "함유하는"은 열린 용어로 해석된다(즉, "포함하지만 이에 한정되지는 않는"의 의미).

수치의 범위를 언급하는 것은 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 별개의 수치들을 개별적으로 언급하는 것을 대신하는 쉬운 방법이기 때문이며, 그것이 아님이 명시되어 있지 않는, 각 별개의 수치는 마치 개별적으로 명세서에 언급되어 있는 것처럼 본 명세서에 통합된다. 모든 범위의 끝 값들은 그 범위 내에 포함되며 독립적으로 조합 가능하다.

본 명세서에 언급된 모든 방법들은 달리 명시되어 있거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한 적절한 순서로 수행될 수 있다. 어느 한 실시예 및 모든 실시예 또는 예시적 언어 (예컨대, "~과 같은")를 사용하는 것은, 청구범위에 포함되어 있지 않는 한, 단지 본 발명을 더 잘 기술하기 위함이지 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 명세서의 어떤 언어도 어떤 비청구된 구성요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 해석되어서는 아니된다. 다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용되는 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 갖는 사람에 의해 통상 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.

본 발명의 바람직한 구체예들은 본 발명을 수행하기 위해 발명자에게 알려진 가장 최적의 모드를 포함한다. 바람직한 구체예들의 변이들이 앞선 기재를 읽으면 당업자에게 명백하게 될 수 있다. 본 발명자들은 당업자들이 그러한 변이를 적절히 이용하길 기대하고, 발명자들은 본 명세서에 기재된 것과 다른 방식으로 본 발명이 실시되기를 기대한다. 따라서, 본 발명은, 특허법에 의해 허용되는 것과 같이, 첨부된 특허청구범위에서 언급된 발명의 요지의 균등물 및 모든 변형들을 포함한다. 더욱이, 모든 가능한 변이들 내에서 상기 언급된 구성요소들의 어떤 조합이라도 여기서 반대로 명시하거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 본 발명에 포함된다. 본 발명은 예시적인 구체예들을 참조하여 구체적으로 나타내어지고 기술되었지만, 당업자들은 하기 청구범위에 의해 정의되는 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고서도 형태 및 디테일에서 다양한 변화가 행해질 수 있음을 잘 이해할 것이다 .

이하, 실시예 및 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.

발명의 실시를 위한 형태

실시예 1: 펩티드의 합성

1. 펩티드의 합성

서열번호 1의 펩티드(이하 "PEP1"이라 함)를 종래에 알려진 고상 펩티드 합성법에 따라 제조하였다. 구체적으로, 펩티드들은 ASP48S(Peptron, Inc., 대한민국 대전)를 이용하여 Fmoc 고상 합성법(solid phase peptide synthesis, SPPS)을 통해 C-말단부터 아미노산 하나씩 커플링함으로써 합성하였다. 다음과 같이, 펩티드들의 C-말단의 첫번째 아미노산이 수지에 부착된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다:

NH₂-Lys(Boc)-2-chloro-Trityl Resin

NH₂-Ala-2-chloro-Trityl Resin

NH₂-Arg(Pbf)-2-chloro-Trityl Resin

펩티드 합성에 사용한 모든 아미노산 원료는 N-term이 Fmoc으로 보호(protection)되고, 잔기는 모두 산에서 제거되는 Trt, Boc, t-Bu (t-butylester), Pbf (2,2,4,6,7-pentamethyl dihydro-benzofuran-5-sulfonyl) 등으로 보호된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다:

Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ahx-OH, Trt-Mercaptoacetic acid.

커플링 시약(Coupling reagent)으로는 HBTU[2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetamethylaminium hexafluorophosphate] / HOBt [N-Hydroxxybenzotriazole] /NMM [4-Methylmorpholine] 를 사용하였다. Fmoc 제거는 20%의 DMF 중 피페리딘(piperidine in DMF)을 이용하였다. 합성된 펩티드를 Resin에서 분리 및 잔기의 보호기 제거에는 절단 칵테일(Cleavage Cocktail) [TFA (trifluoroacetic acid) /TIS (triisopropylsilane) / EDT (ethanedithiol) / H₂O=92.5/2.5/2.5/2.5] 를 사용하였다.

아미노산 보호기가 결합된 출발 아미노산이 고상 지지체에 결합되어 있는 상태를 이용하여 여기에 해당 아미노산들을 각각 반응시키고 용매로 세척한 후 탈보호하는 과정을 반복함으로써 각 펩티드를 합성하였다. 합성된 펩티드를 수지로부터 끊어낸 후 HPLC로 정제하고, 합성 여부를 MS로 확인하고 동결 건조하였다.

본 실시예에 사용된 펩티드에 대해 고성능 액체 크로마토그래피 결과, 모든 펩티드의 순도는 95% 이상이었다.

펩티드 PEP1 제조에 관한 구체적인 과정을 설명하면 다음과 같다.

1) 커플링

NH₂-Lys(Boc)-2-chloro-Trityl Resin 에 보호된 아미노산(8당량)와 커플링 시약 HBTU(8당량)/HOBt(8당량)/NMM(16당량) 을 DMF에 녹여서 첨가한 후, 상온에서 2시간 동안 반응하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.

2) Fmoc 탈보호

20%의 DMF 중의 피페리딘(piperidine in DMF) 을 가하고 상온에서 5분 간 2회 반응하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.

3) 1과 2의 반응을 반복적으로 하여 펩티드 기본 골격 NH₂-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Boc)-2-chloro-Trityl Resin)을 만들었다.

4) 절단(Cleavage): 합성이 완료된 펩티드 Resin에 절단 칵테일(Cleavage Cocktail) 을 가하여 펩티드를 Resin에서 분리하였다.

5) 얻어진 mixture에 Cooling diethyl ether를 가한 후, 원심 분리하여 얻어진 펩티드를 침전시킨다.

6) Prep-HPLC로 정제 후, LC/MS로 분자량을 확인하고 동결하여 powder로 제조하였다.

실시예 2: AsPC1 세포 이종이식(xenograft) 모델에서 PEP1의 섬유증 억제

생체 내 (In vivo) 췌장암에 대한 PEP1 과 젬시타빈의 항암 효과를 확인하기 위하여 AsPC1 세포주를 사용하여 이종이식 실험을 실시하였다. 사용된 이종이식 방법은 다음과 같다.

시약 및 재료의 준비

실험을 위하여 사용한 시약 및 재료는 다음과 같다. 파우더 상태의 PEP1 은 0.2μm 필터에 여과된 증류수(0.2μm filtered steriled water)에 녹인 후 -70℃에 분주(aliquot)하여 보관하고, 사용시 이를 녹여 사용하였고, 젬시타빈은 100% 살린(Saline)에 녹여 사용하였다. 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil)은 DMSO에 녹여 사용하였다.

세포주 준비

실험에 사용된 세포주인 AsPC1 세포주 (Cell # 6 x 10⁵ cells/ 100 ml)는 휴먼 췌장암 전이성 세포로 American Type Cell Culture (ATCC, Rockville, MD)에서 구입하고 10% FBS(fetal bovine serum)와 50 U/ml 페니실린, 50μg/ml 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 1640(Roswell Park Memorial Institute medium)를 배지로 하여 1 내지 2 x 10⁶/ml가 되도록 37℃에서 배양하였다.

실험 방법

하기의 ① 내지 ④의 각 누드 마우스 실험군에 AsPC1 세포를 이식하였다. 실험을 위해 사용한 시약 및 재료, 세포주 배양 방법은 상기 "시약 및 재료의 준비"에 기재되어 있는 바와 같다.

배양한 5 x 10⁶ AsPC1 세포를 누드 마우스(BALB/c-nu/nu nude mice, 중앙실험동물, 서울, 한국에서 구입)에 피하로 주사한다. 암이 100 mm³ (about 10 days) 크기로 성장할 때까지의 조건으로 시행하였으며, 암 생착 이후 각 군당 평균 무게를 비슷하게 그룹핑하여, 젬시타빈과 Pep 1을 각각 하기의 4가지 실험군 조건에 따라 피하와 복강 내로 주사하였다(도1 참조). 암 부피는 칼리퍼스(calipers)로 측정하였으며 부피 계산은 다음을 따랐다. [width² x length x 0.52]

이식 이후 Pep1과 젬시타빈을 아래의 4개의 각 실험군에 나누어 투여하였다.

① AsPC1 이식 대조군

② AsPC1 이식 + Pep1 2 mg/kg (일 1회, s.c) 투약군

③ AsPC1 이식 + 젬시타빈 125 mg/kg (3일 1회, i.p) 투약군

④ AsPC1 이식 + Pep1 2 mg/kg (일 1회, s.c) + 젬시타빈 125 mg/kg 투약군 (3일 1회, i.p)

이후 매회 쥐의 무게(mouse weight)를 정량 하였다. 또한 암조직 표본 제작 및 PCNA(세포 증식 마커)/TUNEL(자가사멸 마커) 염색을 수행하였다.

실험 결과 분석을 위해 여러 처치군 간의 평균들을 student's t-test로 검정하였다. 통계적 유의성의 기준은 p=0.0002로 설정하였다.

실험 결과

상기 실험군별 분석 결과, 젬시타빈과 PEP1을 병용 투여한 경우 그리고 젬시타빈을 투여한 경우에 20일이 지난 시점에서 쥐의 무게가 가장 감소하였음을 확인할 수 있었다(도 2 참조).

도3 내지 도6은 위 각 실험군에 대한 세포 사진이다.

AsPC1 세포를 접종한 대조군 ①군(도3 참조)에서는 붉은 색으로 염색된(도3 에서 밝은 회색 부분에 해당) 암세포와 암세포 사이사이에 파란색으로 염색된 콜라겐(도3 에서 어두운 회색 부분에 해당) 부분이 증가된 것으로 나타났다. 즉, 암에 의해 섬유증이 상당부분 진행된 것을 볼 수 있다.

AsPC1 세포에 PEP1을 처리한 ②군(도4 참조)에서는 도3과 비교할 때 파란색으로 염색된 부분(도4 에서 어두운 회색 부분에 해당)이 안 보이는 것을 볼 수 있다. 이는 콜라겐이 줄어들었음을 의미하는데, 이를 통해 PEP1이 섬유증을 상당부분 억제하였음을 볼 수 있다.

한편, AsPC1 세포와 젬시타빈을 처리한 ③군(도5 참조)에서는 붉은 색으로 염색된 부분(도5 에서 검은색 부분에 해당)이 많이 줄어든 것을 볼 수 있는데, 파란색으로 염색된 부분(도5 에서 밝은 회색 부분에 해당)은 많은 것을 발견할 수 있다. 이는 젬시타빈에 의해서 암세포가 죽지만, 섬유증은 많이 진행되었음을 의미한다.

여기서 남아있는 붉은 색 세포들은 CD133+인 암줄기세포(cancer stem cell) 항암제일 가능성이 있다. 췌장암에서의 CD133+인 암줄기세포는 항암제인 젬시타빈에 저항성이 있는 것으로 알려져 있는데, 이들 세포의 주변에 섬유증이 진행된다는 것은 약물의 전달도 잘 이루어지지 않는 것을 의미한다.

하지만, AsPC1 세포에 PEP1과 젬시타빈을 처리한 ④군(도6 참조)에서는 도5와 비교해 보았을 때, 파란색으로 염색된 부분(도6에서 밝은 회색 부분에 해당)이 줄어들어 있음을 관찰할 수 있다. 이는 PEP1에 의해 섬유증이 상당부분 억제되어 섬유증에 의한 약물전달의 저해가 상당히 감소하였음을 알 수 있으며, 이는 항암제인 젬시타빈의 세포 내 전달이 더 잘 일어날 수 있다는 것을 의미한다.

실시예 3: HepG2 세포주에서 PEP1의 TGF-β억제 효능

섬유화증의 주요원인으로 여겨지는 TGF-β에 대한 PEP1의 억제 효능을 확인하기 위하여 HepG2 세포주에서 TGF-β신호전달(signaling) 억제작용을 확인하는 실험을 아래와 같이 실시하였다.

시약 및 재료의 준비

본 실험을 위하여 사용한 시약 및 재료는 다음과 같다. 파우더 상태의 PEP1은 0.2μm 필터에 여과된 증류수(0.2μm filtered sterile water)에 녹인 후 -70℃에 분주(aliquot)하여 보관하고, 사용시 이를 녹여 사용하였다. 세포주는 HepG2 (ATCC HB-8065; American Type Culture Collection)를 사용하였고, 재조합 human TGF-β1을 4mM HCl에 녹여 10μg/mL stock으로 제조하여 사용하였다. 양성 대조군으로 사용하는 SB431542 (Sigma)는 10 mM stock으로 제조하여 사용하였다.

세포주 준비

60mm 페트리디쉬(petri-dish)에 2x10⁶ 개의 HepG2 세포들 (ATCC HB-8065;)을 파종(seeding)한 후, 16시간 CO₂ 배양기에서 배양한다. 그 후, 무혈청 배지(serum-free media, SFM)로 배지를 교환하고 추가로 24 시간을 배양한다. 그 후, 10 ng/ml 농도의 TGF-β1으로 배지를 교환하고 추가로 다양한 농도의 PEP1(0.1, 1, 5, 10 μM)를 동시 처리(co-treatment)하여 72시간 동안 배양한다. 각 처리군들은 추가로 37℃에서 1시간 CO₂배양기에 배양한다.

TGF-β억제 효과 관련 유전자들의 발현 분석 실험

펩티드 처리된 세포들을 RNeasy® Plus Mini Kit(Qiagen)를 사용하여 제조사의 프로토콜을 이용하여 RNA를 추출한다. 추출한 RNA를 정량한 후, total RNA 1ug을 Reverse Transcription system (Promega)을 사용하여 cDNA 를 합성한다. 그 후, CFX96-Real-Time System (Bio-rad)를 이용하여 qRT-PCR를 실시한다. TGF-β에 관련된 바이오마커(biomarker)로서 피브로넥틴(FN), Smad2, Smad4 의 mRNA 발현을 분석하였으며, 참조 유전자(reference gene)으로 GAPDH를 사용하였다. PCR 조건은 아래 각 유전자의 프라이머(primer)를 제작하였다. PCR 조건은 아래 표 3의 프라이머를 이용하여 40 사이클 (95℃, 15 sec, 57℃, 30 sec, 72℃, 30 sec) 조건에서 Real-Time으로 증폭하였다. 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.

Gene	Forward sequence (5′-3′)	Reverse sequence (5′-3′)
FN	CAGGATCACTTACGGAGAAACAG(서열번호 3)	GCCAGTGACAGCATACACAGTG(서열번호 4)
Smad2	ATCCTAACAGAACTTCCGCC(서열번호 5)	CTCAGCAAAAACTTCCCCAC(서열번호 6)
Smad4	GCATCGACAGAGACATACAG(서열번호 7)	CAACAGTAACAATAGGGCAG(서열번호 8)
GAPDH	AGGGCTGCTTTTAACTCTGGT(서열번호 9)	CCCCACTTGATTTTGGAGGGA(서열번호 10)

실험 결과

PEP1의 TGF-β 억제에 대한 효과를 qRT-PCR을 통해 평가하였다. TGF-β 존재 하에서 PEP1을 48시간 배양 후 나타나는 TGF-β 관련 유전자인 Smad2, Smad4의 mRNA 발현 레벨을 참조 유전자인 GAPDH와 비교하여 측정하였다 (도 7, 8, 9 및 10 참조). 아무것도 처리하지 않은 대조군 대비 TGF-β 처리군에서 Smad2, Smad4의 발현이 증가하였으며, 양성대조군인 SB431542의 경우 TGF-β 처리군 대비 PEP1의 경우 농도가 증가할수록 TGF-β의 바이오마커로서 Smad2 및 Smad4의 저해가 농도 의존적으로 나타남을 확인하였다.

또한, TGF-β 존재 하에서 PEP1를 48시간 배양 후 나타나는 TGF-β 관련 섬유화 유전자인 피브로넥틴의 발현감소 여부를 피브로넥틴 mRNA 발현레벨을 GAPDH와 비교하여 측정하였다 (도 11 참조). 아무것도 처리하지 않은 음성 대조군과 대비하여, TGF-β 처리군에서 피브로넥틴의 발현이 증가하였다. 한편, 양성대조군인 SB431542의 경우 TGF-β 처리군의 경우와 비교하였을때, PEP1 처리군의 경우 농도가 증가할수록 피브로넥틴의 저해가 나타남을 확인하였다. 양성대조군(SB431542)의 경우 60.7% 저해율을 나타내었으며, PEP1은 22.8%~47.5%의 저해율을 나타내었다(도12 참조).

이와 같은 결과들은 PEP1이 TGF-β 신호전달 기전에 관여하는 하향조절(downstream) 유전자인 Smad2, Smad4 발현을 억제하는 직접적인 효과를 나타냄과 동시에 TGF-β 에 의해 유도된 피브로넥틴의 발현을 저해함으로써 섬유화 예방 및 치료제로서의 가능성을 시사한다고 할 수 있다.

실시예 4: 방사능 노출된 NHEK 세포주에서 PEP1의 TGF-4 억제 효능

항암 치료 및 기타 종양 치료 등의 이유로 방사능에 노출되어 유발되는 섬유증에 대한 PEP1의 효능을 확인하기 위하여, 방사능 노출된 NHEK세포에서 PEP1의 TGF- β 억제 효능 확인 실험을 실시하였다.

시약 및 세포주의 준비

실시예 1에 따라 합성된 PEP1 및 대조군으로 사용될 위약(Sham)을 준비하였다. NHEK (Normal Human Epidermal Keratinocytes) 세포를 단일층 (monolayer)으로 배양하여 방사능 노출 실험을 위해 준비하였다. 방사능 노출 실험을 위한 방사선은 이온화된 방사선을 6Gy 세기로 준비하여 실험하였다.

실험 방법

방사능 노출에 따른 NHEK 세포주의 세포 분화 진행을 보기 위하여, NHEK 세포에 각각 위약 및 PEP1을 1mM로 처리한 뒤 방사선을 처리하지 않은 것과 처리한 것으로 나누어 각각 10일 동안 배양하는 실험을 하였다(도13 참조).

또한, 방사능 노출에 따른 NHEK 세포주의 바이오마커들의 발현 레벨 변화를 알아보기 위하여, NHEK 세포에 각각 위약 및 PEP1을 1mM로 처리한 뒤 방사선을 처리하지 않은 것(-)과 방사선을 처리한 것(+)으로 나눈 다음, 방사선 처리 후 1일과 처리 후 10일 각각에서 바이오마커들의 발현 레벨을 살펴보았다(도14 참조). 바이오마커들의 발현 레벨 측정시 참조 대조군으로 GAPDH를 사용하였다.

추가로, NHEK 세포에서 방사능 노출 이후 계속 배양시 PEP1이 TGF-β 신호전달을 억제하는 것을 명확하게 관찰하기 위하여, 방사선(6Gy, IR)에 노출된 NHEK 세포에 위약을 처리한 군과 PEP1을 1μM 처리한 군을 나누어 10일간 배양 한 뒤, TGF-β 및 섬유증 관련 바이오마커들의 웨스턴블로팅(Western Blotting)을 실시하여 각 마커들의 발현 레벨을 관찰하였다(도15 참조).

웨스턴블로팅 과정은 다음과 같이 수행되었다. 펩티드 처리한 세포들을 PBS로 2번 세척한 후, 세포 수거기(cell scraper)로 1.5 mL 원심분리 튜브에 모아, 원심분리한다 (1,000rpm, 4℃, 2분). 얻어진 상층액을 제거 후 NHEK 세포에 RIPA 완충액을 100 μL씩 가한다. 40분간 얼음에서 배양한 후 10분마다 흔들어 섞고 (vortex, micro-centrifuge는 미리 4℃로 냉각) 1ml 주사기를 사용해서 시료를 40-50번 섞는다. 마지막으로 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 사용한다.

30g의 단백질을 8% SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 수행하여 PVDF 막 (membranes, Millipore)으로 전이시킨다 (transfer). PVDF막을 5% 탈지우유(skim milk)로 블로킹(blocking)하고 특정한 일차 항체(primary antibodies)와 배양한다. 이 실험에 사용된 항체는 다음과 같다. 피브로넥틴 (285 kDa, 5% BSA 1:3000, ab2413, Abcam), N-Cadherin (140 kDa, 5% BSA 1:1000, #4061, Cell Signaling), Smad4 (70 kDa, 5% BSA 1:1000, #9515, Cell Signaling), Smad 2/3 (60, 52 kDa, 5% BSA 1:1000, #3102, Cell Signaling), P-Akt (60 kDa, 5% BSA 1:1000, #9271, Cell Signaling), pSmad2/3 (Cell Signaling #3102), GRHL2 (Abcam #ab15532), GAPDH (37 kDa, 5% BSA 1:1000, #2118, Cell Signaling). 이어서 PVDF막을 TBST (Tris-buffered saline containing 0.1% Tween-20)로 세척 후, HRP-접합 항-토끼 항체(HRP-conjugated anti-rabbit antibody, Jackson Immuno Research Laboratories, INC.)와 반응시킨다. 그 후, ECL 검출(Amersham Pharmacia Biotech)을 수행하고, 얻어진 이미지는 이미지 분석기(GE Healthcare, ImageQuant LAS 4000)로 분석한다.

실험 결과

방사능 노출에 따른 NHEK 세포주의 세포 분화 진행 실험에서, 방사능 노출 처리시 대조군은 분화 진행(섬유화 진행)이 나타났으나 PEP1을 처리한 군은 방사능 노출 후에도 분화 진행이 거의 나타나지 않았다. 이 결과는 방사능 노출에 따른 섬유화 진행을 PEP1 투여시 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.

방사능 노출에 따른 NHEK 세포주의 바이오마커들의 발현 레벨 변화 관찰 실험에서, 방사능 노출 10일 후 바이오마커인 GRHL2, p63 및 N-Cad의 발현증가 정도를 각각의 실험군에서 관찰한 결과, TGF-β신호전달 억제효과를 나타내는 바이오마커인 GRHL2 및 p63의 발현 레벨이 위약을 처리한 군에서 감소하였으며, PEP1을 처리한 군에서는 증가하였다. 이 결과는 방사능 노출에 따른 섬유화 진행과정에 관여하는 TGF-β 신호전달 억제효과를 나타내는 GRHL2 및 p63이 PEP1에 의해 발현 증가된다는 것을 나타낸다.

한편, 섬유화된 조직에서 발현하는 바이오마커인 N-Cad의 발현 레벨은 위약을 처리한 군에서 증가하였으며, PEP1을 처리한 군에서는 감소하였다. 세포의 생존정도를 나타내는 바이오마커인 P-Akt(Phosphorylation of Akt(protein kinase B))의 발현 레벨은 PEP1을 처리한 군에서 증가하였다. 이 결과들은 PEP1이 방사능 노출에 따른 섬유화 진행을 억제할 뿐만 아니라, 세포의 생존기전에도 관여할 수 있다는 것을 나타낸다.

상기 실험의 결과들에서 PEP1은 GRHL2 및 p63의 발현을 증가시켜 TGF- β 의 신호전달과정을 억제시키는 효과가 있으므로 방사능 노출에 따른 TGF- β 신호전달로 인한 섬유증을 억제할 수 있는 효과를 가져, 방사능 노출에 따른 섬유화 및 조직 세포의 섬유화를 예방 또는 치료할 수 있는 약물로서의 가능성을 가진다고 볼 수 있다.

실시예 5: 생체외(in vitro) 및 생체내(in vivo)에서 PEP1의 방사선 방어 효능과 조직적인 섬유화 억제 효능 확인

시약, 세포주 및 실험동물의 준비

실시예 1에 따라 합성된 PEP1 및 대조군으로 사용될 위약(Sham)을 준비하였다. NHEK 세포를 단일층으로 배양하여 생체외 방사능 노출 실험을 위해 준비하였다. 생체외, 실시간(in-situ) 및 생체내 방사능 노출 실험을 위한 방사선은 이온화된 방사선을 0-10Gy (0, 2, 4, 6, 8 및 10 Gy)의 단계별 세기로 준비하여 실험하였다.

한편 실험동물은 2개의 동물모델을 나누어 준비하였다. 첫 번째 모델은 구강 점막염(oral mucositis) 모델로 C3H 쥐(mice)를 5일 연속 방사선(6Gy, IR)을 사용하여 머리와 목 부위에 쪼여 혀에 궤양(ulcer)을 발생시키는 방법을 적용하였다. 두 번째 모델은 피부 섬유화(dermal fibrosis) 모델로 폐섬유화증의 발생 원인으로 알려진 블레오마이신(bleomycin)을 1일 1회 투여량 0.1cc, 농도 0.5mg/ml 로 0.9% NaCl수용액에 희석된 것을 피하주사(sub-q)로 24 내지 28일간 주사하여 국소 경피증(local scleroderma)을 발생시키는 방법을 적용하였다.

실험 방법 및 결과

생체외 및 실시간 실험은 NHEK세포주 에서, 방사능 노출 손상에 대한 PEP1의 방어 효과를 알아보기 위하여, NHEK 세포에 위약 및 PEP1을 처리한 군으로 각각 나눈 다음 방사선을 0내지 10Gy (0, 2, 4, 6, 8 및 10 Gy)의 단계별 세기로 쪼였을 때, 방사선-유도 조기 노화(RIPS, radiation-induced premature senescence)로 대표되는 방사능 노출 손상 증상을 나타내는 마커, DNA 손상 반응(DDR, DNA Damage Response) 단백질 및 노화-연관 헤테로크로마틴 병소들(SAHF, senescence-associated heterochromatin foci)의 마커의 발현 레벨을 확인하였다. 각각의 마커들의 발현 레벨은 qRT-PCR, 웨스턴블로팅 및 면역형광 염색법을 사용하여 측정하였다. SA β-Gal(senescence-associated β-galactosidase), p16INK4A, p-p53Ser15, p-ATM, γ-H2AX, 53BP1,H3K9me3, HP1γ및 HMGA2 가 마커로서 레벨이 측정되었다.

한편, 생체외 실험으로 NHEK세포주에서 TGF-β 또는 블레오마이신으로 처리하여 유도되는 조직적인 섬유화에 대한 PEP1의 억제 효과를 알아보기 위하여 NHEK세포에 위약과 PEP1을 각각 10 μg/ml로 최종농도를 맞추어 투여하여 배양하고, 매 48시간마다 TGF-β및 블레오마이신을 처리하여 피브로넥틴(FN)과 콜라겐 1형(Col 1α1, collagen type 1)의 발현 레벨을 qRT-PCR 및 웨스턴블로팅을 사용하여 측정하였다.

생체내 실험은 먼저 첫 번째 구강 점막염 모델의 경우 C3H 쥐에 위약 및 PEP1을 각각 최종 투여량 1 mg/kg으로 맞추어 복강내로 투여한 군으로 나눈 다음 연속 5일간 방사선(6Gy, IR)에 노출시켜 구강 점막염에 해당하는 혀 궤양을 유도한 뒤 10일 후 희생하여 혀 조직을 수거한 뒤 톨루이딘 블루 (toluidine blue) 및 H&E 염색을 통하여 조직 검사를 수행하였다. 추가로 1일 1회 투여량 5 mg/kg로 5일간 라파마이신(rapamycin)을 투여한 비교 대조군을 이용하여 PEP1의 효능을 상대적으로 확인하는 실험을 수행하였다.

한편, 두 번째 피부 섬유화 모델의 경우 C3H 쥐에 위약 및 PEP1을 각각 총 투여량 50 mg/kg으로 맞추어 복강내로 투여한 군으로 나눈 다음 상기 실험동물의 준비단계에서 언급한 농도의 블레오마이신을 24 내지 28일간 피하주사한 다음 28일째에 희생시켜 경피증(scleroderma) 여부를 측정하고 Masson's trichrome 염색법을 사용하여 섬유증의 확산여부를 알아보는 실험을 수행하였다.

상기 생체외 및 생체내의 동물 모델 실험을 통하여 PEP1의 투여가 방사능 노출 손상에 대한 방어 효과가 있음을 알 수 있으며, 구체적으로 생체외 실험을 통하여 방사선-유도 조기 노화 증상의 억제 효과가 있음을 마커의 발현 억제 정도를 알 수 있고, 생체내 실험을 통하여 방사선 노출 및 조직적인 섬유화 유도에 대한 방어 효과를 조직검사 결과로 알 수 있다.

상기 실험 예들을 통하여 본 발명에 따른 PEP1 및 PEP1을 포함하는 조성물은 TGF-β 신호전달 등을 포함하는 다양한 원인들에 의하여 발생되는 다양한 부위의 세포성 섬유증, 암, 항암제 투여, 방사선 조사 등의 조직적 섬유화와 관련된 노화 및 질병 등을 예방 또는 치료할 수 있는 효능이 있음을 알 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 PEP1 및 PEP1을 포함하는 조성물을 사용하여 섬유증 관련 노화 및 질병의 예방 또는 치료를 수행하는 치료제의 개발 또는 치료법의 개발하는 것이 가능할 것으로 판단된다.

<110> GEMVAX & KAEL CO., LTD. KIM, Sangjae <120> A Peptide Possessing Fibrosis Inhibition Activity and the Composition Comprising the Same <130> OF15P068PCT <150> KR 10-2014-0043586 <151> 2014-04-11 <160> 10 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys 1 5 10 15 <210> 2 <211> 1132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg Ser 1 5 10 15 His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly 20 25 30 Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg 35 40 45 Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro 50 55 60 Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu 65 70 75 80 Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val 85 90 95 Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro 100 105 110 Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr 115 120 125 Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val 130 135 140 Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val 145 150 155 160 Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr 165 170 175 Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly 180 185 190 Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg 195 200 205 Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg 210 215 220 Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg 225 230 235 240 Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp 245 250 255 Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val 260 265 270 Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala 275 280 285 Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His 290 295 300 Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro 305 310 315 320 Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly 325 330 335 Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro 340 345 350 Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser 355 360 365 Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln 370 375 380 Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His 385 390 395 400 Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg 405 410 415 Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln 420 425 430 Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu 435 440 445 Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe 450 455 460 Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser 465 470 475 480 Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser 485 490 495 Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met 500 505 510 Ser Val Arg Asp Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys 515 520 525 Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe 530 535 540 Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe 545 550 555 560 Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr 565 570 575 Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His 580 585 590 Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln 595 600 605 His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile 610 615 620 Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val 625 630 635 640 Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser 645 650 655 Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg 660 665 670 Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg 675 680 685 Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro 690 695 700 Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile 705 710 715 720 Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln 725 730 735 Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His 740 745 750 Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp 755 760 765 Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser 770 775 780 Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu 785 790 795 800 Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His 805 810 815 Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro 820 825 830 Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp 835 840 845 Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu 850 855 860 Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala 865 870 875 880 Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys 885 890 895 Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu 900 905 910 Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe 915 920 925 Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser 930 935 940 Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe 945 950 955 960 Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly 965 970 975 Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn 980 985 990 Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln 995 1000 1005 Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln Gln 1010 1015 1020 Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp Thr Ala 1025 1030 1035 1040 Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly Met Ser Leu 1045 1050 1055 Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu Ala Val Gln Trp 1060 1065 1070 Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr Arg His Arg Val Thr 1075 1080 1085 Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr Ala Gln Thr Gln Leu Ser 1090 1095 1100 Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn 1105 1110 1115 1120 Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys Thr Ile Leu Asp 1125 1130 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FN forward primer <400> 3 caggatcact tacggagaaa cag 23 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FN reverse primer <400> 4 gccagtgaca gcatacacag tg 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Smad2 forward primer <400> 5 atcctaacag aacttccgcc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Smad2 reverse primer <400> 6 ctcagcaaaa acttccccac 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Smad4 forward primer <400> 7 gcatcgacag agacatacag 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Smad4 reverse primer <400> 8 caacagtaac aatagggcag 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 9 agggctgctt ttaactctgg t 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 10 ccccacttga ttttggaggg a 21

Claims (12)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 포함하는 섬유증 억제용 조성물로서,
   상기 섬유증은 암세포조직의 섬유증 또는 피부세포조직의 섬유증인 것인 섬유증 억제용 조성물.
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서, 상기 섬유증은 암, 항암제 투여, 및 방사선 노출로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것에 의해 유도되는 것인 섬유증 억제용 조성물.
4. 제 3항에 있어서, 상기 조성물은 췌장암, 대장암, 위암, 전립선암, 비소세포폐암, 유방암, 흑색종 및 난소암으로 이루어진 군에서 선택되는 암세포조직의 섬유증을 억제하는 섬유증 억제용 조성물.
5. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 암세포조직의 섬유증을 억제하기 위하여, 화학요법 항암제와 병용하거나, 방사선 치료와 병행하여 사용되는 섬유증 억제용 조성물.
6. 제5항에 있어서, 상기 화학요법 항암제는 데옥시뉴클레오시드 유사체 및 플루오로피리미딘 중 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 섬유증 억제용 조성물.
7. 제6항에 있어서, 상기 데옥시뉴클레오시드 유사체는 젬시타빈이고, 상기 플루오로피리미딘은 5-플루오로우라실 또는 카페시타빈인 조성물.
8. 제 1항에 있어서, 상기 조성물이 제약학적으로 수용 가능한 부형제 및 첨가제 등을 더 포함하는 약학적 조성물인 섬유증 억제용 조성물.
9. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 TGF-β 신호전달 과정을 억제하는 것인 섬유증 억제용 조성물.
10. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드, 허용 가능한 부형제, 윤활제 및 첨가제를 포함하는 섬유증 억제용 화장품 조성물로서,
    상기 섬유증은 피부세포조직의 섬유증인 것인 섬유증 억제용 화장품 조성물.
    
    
    
    
    
    
    
11. 삭제
12. 삭제

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