WO2011155803A2

WO2011155803A2 - 청각보호 작용을 하는 신규 화합물

Info

Publication number: WO2011155803A2
Application number: PCT/KR2011/004297
Authority: WO
Inventors: 김철호; 정영식
Original assignee: 아주대학교산학협력단; 한국화학연구원
Priority date: 2010-06-11
Filing date: 2011-06-13
Publication date: 2011-12-15
Also published as: US20130217881A1; WO2011155803A3; US8772493B2; KR101388372B1; KR20130041896A

Abstract

본 발명은 난청을 유발하는 다양한 이독성에 대해 청각유모세포의 세포사멸기전을 억제하고, 청각기관과 청력을 보호하는 본 명세서의 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

Description

청각보호 작용을 하는 신규 화합물

본 발명은 난청을 유발하는 다양한 이독성에 대해 청각유모세포의 세포사멸기전을 억제하고, 청각기관과 청력을 보호하는 신규 화합물, 이를 제조하는 방법 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

인체 감각의 하나인 청각은 소실될 경우에 개인적으로는 일상생활에 장애를 초래하며 사회 경제적으로는 막대한 손실을 초래한다. 난청은 청각장애만을 유발하는 것이 아니라 언어습득 전에 심각한 난청이 발생할 경우 정상적인 언어발달에 지장을 받아 언어장애가 동반되어 문제가 된다.

국내에서 청각 장애자로 등록되어 있는 중등도 이상의 난청환자는 2008년 6월 기준으로 약 15만명으로 이르고 선천성으로 양측 중등도 난청으로 태어나는 비율을 0.1%라고 볼 때 후천성으로 난청이 발생하는 비율이 더욱 높다. 또한 청각 언어장애인은 전체 등록 장애인의 10%로(2002년 장애자 등록현황) 신체 장애의 주요 원인이며 양측 청각 소실시 맥브라이드식 장애평가상 노동력 상실률 100%에 해당되어 정상적인 경제활동이 불가능하게 되고 이로 인한 사회경제적 손실은 막대하다. 실례로 장애인의 보조를 위하여 정부가 지원하는 3000억(2005년도 보건복지부 장애인예산 - 2868억)가량의 예산과 장애인으로 인한 사회 간접 비용을 추정하면 실로 천문학적인 비용이 소요된다고 알려져 있다.

또한, 노인성 인구가 기하급수적으로 증가하면서 최근 부각되고 있는 노인성 난청은 고혈압과 퇴행성 관절염과 함께 3대 노인성 질환으로서 65세 이상 인구의 25~40%에서 발견되는 유병율이 높은 질환으로 알려져 있다. 2000년 통계청 자료에 따르면 60세 이상의 인구가 500만명을 넘어 potential support ratio가 약 11%에 달해 사회적 문제가 되며 증가된 노인층의 청각과 같은 감각기의 질환도 노인의 사회생활을 제한하는 중요한 요소로 퇴행성 감각기 질환에 대한 연구와 치료제 개발이 절실히 요구되고 있다.

최근 암환자를 비롯한 다양한 질환에 사용되는 약제 가운데 이독성을 보이는 약제가 많은데 대표적으로 aminoglycoside 계열의 항생제와 cisplatin 등의 항암제 등을 들 수 있다. 이들의 대표적인 부작용은 신독성과 이독성인데 신독성에 비하여 이독성은 비가역적으로 양측성의 영구적인 청력 및 전정기능의 손실을 초래하는 경우가 많고 이독성의 유병율은 보고자에 따라 와우 독성은 0.6 - 30%로, 전정 독성은 0-75%로 보고되고 있어 전반적으로 볼 때 7.5%에 이를 정도로 높다.

한편, 노인성 및 이독성 난청에 이어 후천성 난청의 원인의 흔한 원인으로 최근 증가하고 있는 소음성 난청을 들 수 있는데 1995년에 국내에 발표된 내용에 의하면, 유해환경 근로자의 특수 건강진단 782,274건 중 소음 특수 건강 진단 건수가 364,244건(44.3%)으로 가장 많았고, 1992년 발생된 전체 직업병자수 5,942명 중 소음성 난청자 수는 반이 넘는 3,345명이었다. 또한 1999년도에 실시한 건강진단의 결과 115,761개소의 2,713,240명 중 1,794명이 직업병으로 확진되었고, 이 중 58.9%인 1,056명이 소음성 난청으로 판명되어 직업병 중 소음성 난청의 비율이 매우 높으며, 소음은 우선적으로 관심을 두고 해결해야 하는 문제로 대두되고 있다.

다양한 원인(약물, 방사선, 소음, 환경공해-전자기파 등)에 의한 청각기관 세포고사 기전을 밝혀내고 이들의 세포고사를 조절할 수 있는 물질과 유전자를 찾아낸다면 다양한 원인 혹은 원인을 알 수 없는 난청을 예방 혹은 치료할 수 있을 것으로 판단되는데, 최근 들어 난청과 관련된 내이유모세포 손상에 대한 연구가 활발히 진행되면서 난청의 이유로 산소유리기 Reactive oxygen species, ROS)에 의한 청각유모세포사멸이 주된 원인으로 보고되고 있고, 이와 관련된 청각보호제에 대한 검색과 개발이 활성화되고 있다.

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 청각유모세포의 사멸을 억제하여 청력을 보호하는 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.

[화학식 1]

상기 식에서,

R은 수소 또는 할로겐이다. 여기서 R은 퀴놀린-2,4(1H,3H)-디온의 벤젠 고리에 치환되는 치환기를 의미한다.

바람직하게는, 상기 R은 수소 또는 F이다.

또한, 바람직하게는, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은,

1) 3-아미노-3-(4-플루오로페닐)퀴놀린-2,4(1H,3H)-디온, 또는

2) 3-아미노-5-플루오로-3-(4-플루오로페닐)퀴놀린-2,4(1H,3H)-디온이다.

또한, 본 발명은 하기 반응식 1과 같이,

1) 화학식 2로 표시되는 화합물과 2-(4-플루오로페닐)아세틸 클로라이드를 반응시켜 화학식 3으로 표시되는 화합물을 제조하는 단계;

2) 화학식 3으로 표시되는 화합물과 NaH를 반응시켜 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계;

3) 화학식 4로 표시되는 화합물과 SO₂Cl₂를 반응시켜 화학식 5로 표시되는 화합물을 제조하는 단계;

4) 화학식 5로 표시되는 화합물과 NaH를 반응시켜 화학식 6으로 표시되는 화합물을 제조하는 단계; 및

5) 화학식 6으로 표시되는 화합물과 H₂를 반응시켜 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계를 포함하는, 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다.

[반응식 1]

상기 단계 1은, 2-(4-플루오로페닐)아세틸을 치환시키는 반응으로서, DMAP(4-dimethylaminopyridine)을 함께 반응시키는 것이 바람직하며, 용매는 CH₂Cl₂를 사용할 수 있다.

상기 단계 2는, 고리화 반응으로서, 용매는 DMF(dimethylformamide)를 사용할 수 있다.

상기 단계 3은, 케톤화 반응으로서, 용매는 1,4-디옥산(1,4-dioxane)을 사용할 수 있다.

상기 단계 4는, Cl을 N₃로 치환하는 반응으로서, 용매는 DMF를 사용할 수 있다.

상기 단계 5는, N₃를 NH₂로 치환하는 반응으로서, Pd/C 촉매하에 수행되는 것이 바람직하며, 용매는 MeOH을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 청각 보호용 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는청각 보호 용도로 사용하기 위한 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 청각 보호용 의약의 제조에 사용되는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 약학적 조성물의 용도를 제공한다.

상기 조성물은 청각세포사멸 억제 활성을 가지므로, 청각을 보호할 수 있다는 특징이 있다. 또한, 상기 조성물은 이독성 자극으로부터 청각을 보호하는 작용을 가진다는 특징이 있다. 상기 이독성 자극은 항암제, 항생제, 방사선, 전자파 또는 소음으로부터 유래한 것일 수 있다.

상기 항암제 또는 항생제는 시스프라틴(cisplatin), 카보프라틴(carboplatin), 질소 머스타드(nitrogen mustard), 빈크리스틴(vincristine), 아미카신(amikacin), 아지트로마이신(azithromycin), 카프레오마이신(capreomycin), 크로람페니콜(chloramphenicol), 디베카신(dibekacin), 디하이드로스트렙토마이신(dihydrostreptomycin), 에티오마이신(etiomycin), 에리트로마이신(erythromycin), 젠타마이신(gentamicin), 메트로니디졸(metronidizole), 네오마이신(neomycin), 네틸마이신(netilmicin), 폴리믹신(polymyxin) B, 스트렙토마이신(streptomycin), 토브라마이신(tobramycin), 반코마이신(vancomycin), 프록신(proxin), 마크로라이드(macrolide), 라식(lasix; furosemide), 부멕스(bumex; bumetanide), 에데크린(edecrin; ethacrynic acid), 피레타마이드(piretamide), 퀴니덱스(quinidex), 아타브린(atabrine), 프라퀘닐(plaquenil), 퀴닌 설페이트(quinine sulfate), 메프로퀸(mefloquine; lariam), 클로로퀸(chloroquine), 또는 아스피린(aspirin)일 수 있다.

상기 약학적 조성물에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량은 5 uM 내지 400 uM인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 화합물은 약학적으로 허용되는 염으로서 제공될 수 있다. 이들 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용되는 산 부가염을 형성할 수 있다. 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 구연산(citric acid), 초산, 젖산, 주석산(tartaric acid), 말레인산, 푸마르산(fumaric acid), 포름산, 프로피온산(propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산 등을 사용할 수 있다.

또 다른 면에서, 적합한 염은 알칼리 금속 염, 예를 들면 나트륨 또는 칼륨, 알칼리 토금속 염, 예를 들면 칼슘 또는 마그네슘, 또는 유기 아민 염, 예를 들면 트리에틸아민과 같은 염기 염이다.

본 발명의 약학적 조성물 및 투여 형태는 또한 하나 이상의 부가적 활성 성분을 더 포함할 수 있다. 결과적으로, 본 발명의 약학적 조성물 및 투여 형태는 본 명세서에서 개시된 활성 성분을 포함한다.

본 발명의 단일 유닛 투여 형태는 환자에게 경구, 점막(예를 들어, 비강, 설하, 질, 버칼, 또는 직장), 비경구적(예를 들어, 피하, 정맥, 볼루스 주입, 근육내 또는 동맥내), 국소(예를 들어, 눈), 경피(transdermal) 또는 피부통과(transcutaneous) 투여하기에 적절하다. 또한, 제형의 제조를 위하여, 부형제, 안정화제, 결합제, 충진제, 붕해제, 활택제 등이 포함될 수 있다.

또한 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 청각 보호용 건강 식품 조성물 또는 사료 조성물을 제공한다.

본 발명의 화합물을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 청각보호용 식품 또는 사료로서는 본 발명의 화합물을 식품 또는 사료에 첨가하여 제조하는 것이 일반적이다. 상기 식품 또는 사료는 건강 식품, 기능성 식품으로서 청각보호를 위해 사용된다.

본 발명의 식품 또는 사료는 본 발명의 화합물, 또는 필요에 따라서 다른 유효 성분을 첨가하는 것 이외에는 일반적인 식품 또는 사료의 제조 방법을 이용함으로써 제조할 수 있다.

또한, 상기 식품 또는 사료는 일반적인 식품 또는 사료를 예를 들면 성형조립 등의 가공 방법으로 가공할 수도 있다. 가공 방법으로서는 유동층 조립, 교반 조립, 압출 조립, 전동 조립, 기류 조립, 압축 성형 조립, 파쇄 조립, 분무조립, 분사 조립 등의 조립 방법, 팬 코팅, 유동층 코팅, 건식 코팅 등의 코팅 방법, 퍼프 드라이, 과잉 수증기법, 폼 매트 방법, 마이크로파 가열 방법 등의 팽화 방법 등을 들 수 있다.

본 발명의 식품 또는 사료에 첨가하는 본 발명의 화합물은 본 발명의 식품 또는 사료가 청각보호 작용을 갖는 것이라면, 첨가량에 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 0.01 내지 50 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 10 중량%를 함유하도록 첨가된다.

본 발명의 화합물을 첨가하여 얻어지는 식품의 예로는, 건강 식품, 건강 음료, 쥬스류, 청량 음료수, 스프, 차, 유산균 음료, 발효유, 빙과, 버터, 치즈, 요구르트, 가공유, 탈지 분유 등의 유제품, 햄, 소세지, 햄버거 등의 축육 제품, 어육 혼합 제품, 계란말이, 달걀 두부 등의 알제품, 쿠키, 젤리, 스낵 과자, 츄잉껌 등의 과자류, 빵, 국수, 김치, 훈제품, 건물, 해산물 조림, 조미료 등을 들 수 있다.

본 발명의 사료는 사료 원료에 본 발명의 화합물을 적절하게 배합하여 만들 수 있다. 사료 원료로서는 곡물류, 조강류, 식물성 유박류, 동물성 사료 원료, 기타 사료 원료, 정제품 등을 들 수 있다.

본 발명의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이를 포함하는 조성물은 청각보호제로서의 효과, 특히 다양한 이독성 자극(항암제 또는 방사선 또는 이들의 병용 치료)시 유발되는 청각세포 사멸을 억제하는데 있어서 우수한 효과를 나타낸다.

도 1 및 2는, 이독성 물질인 항암제 cisplatin에 의해 유도되는 청각세포사멸에 대해 본 발명의 화합물의 청각세포사멸 억제효과를 MTT assay로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 3은, 이독성 물질인 항암제 cisplatin에 의해 유도되는 청각세포사멸에 대해 본 발명의 화합물의 청각세포사멸 억제효과를 TUNEL assay로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 4 및 5는, 이독성 물질인 항암제 cisplatin에 의해 유도되는 청각세포사멸에 대해 본 발명의 화합물의 청각세포사멸 억제효과를 annexin와 PI double staining 한 후 FACS로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도6 및 7은, 이독성 물질인 항암제 cisplatin에 의해 유도되는 청각세포사멸에 대해 본 발명의 화합물의 청각세포사멸 억제효과분석을 위해 cell cycle analysis를 시행한 결과를 나타낸 것이다.

도8 및 9는, 이독성 물질인 항암제 cisplatin에 의해 유도되는 청각세포의 mitochondrial membrane potential의 변화에 대한 본 발명의 화합물의 효과에 대한 분석 결과를 나타낸 것이다.

도 10 및 11은, 이독성 물질인 항암제 cisplatin에 의해 유도되는 청각세포사멸관련 유전자(ERK, p38, JNK, p53, caspase 3, PARP)의 변화에 대한 본 발명의 화합물의 역할에 대한 Western blot 결과를 나타낸 것이다.

도 12는, 본 발명의 화합물에 대한 약물독성 검사로 zebrafish모델을 이용한 embryotoxicity 여부에 대한 결과를 나타낸 것이다.

도 13 및 14는, zebrafish모델을 이용한 청각보호현상을 형광현미경으로 분석한 사진을 나타낸 것이다.

도 15는, zebrafish모델을 이용한 청각보호현상을 주사전자현미경과 투사전자현미경으로 분석한 사진을 나타낸 것이다.

도 16은, 본 발명의 화합물의 청각보호 효과를 rat을 이용한 ABR (Auditory brainstem responses)측정으로 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1: 3-아미노-3-(4-플루오로페닐)퀴놀린-2,4(1H,3H)-디온의 제조

먼저, 2-Amino-benzoic acid methyl ester(1.00 g, 6.61 mmol)를 정제된 CH₂Cl₂에 용해시키고, 0℃에서 DMAP(0.04 g, 0.33 mmol)을 첨가한 다음, (4-Fluoro-phenyl)-acetic acid(1.53 g, 9.90 mmol)를 SOCl₂와 반응하여 생성된 (4-Fluoro-phenyl)-acetyl chloride가 들어있는 반응용기에 첨가한 후 상온에서 10시간 동안 반응시켰다. 반응 혼합물에 얼음이 함유된 차가운 Sodium bicarbonate solution를 넣은 후 CH₂Cl₂로 추출한 후 감압 농축하여 화합물 2-[2-(4-Fluoro-phenyl)-acetylamino]-benzoic acid methyl ester 1.50g(79%)을 고체로 수득하였다.

다음으로, NaH를 사용하여 고리화 반응을 통해 3-(4-Fluoro-phenyl)-4-hydroxy-1H-quinolin-2-one와 3-Chloro-3-(4-fluoro-phenyl)-1H-quinoline-2,4-dione을 90% 수율로 수득하고, 염소화 반응(수율 88%)과 azidation 반응으로 3-Azido-3-(4-fluoro-phenyl)-1H-quinoline-2,4-dione(수율 88%)을 수득하였다.

상기 얻어진 azido 화합물(0.10g)을 정제된 MeOH에 녹인 후 10% Pd/C(0.01 g 10w%)를 첨가하고 풍선으로 수소를 주입하면서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 용액을 celite로 filter한 후 여액을 감압 농축시키고 잔여물을 silica gel column chromatography로 정제하여 표제 화합물(0.08g, 87%)을 고체로 얻었다.

¹H NMR (300MHz, CDCl₃) d 2.67 (br s, 2H, NH2), 6.91-7.01 (m, 3H, ArH), 7.09 (t, J=7.5Hz, 1H, ArH), 7.38~7.49 (m, 3H, ArH), 7.84 (dd, J=7.8, 1.4Hz, 1H, ArH), 10.27 (br s, 1H, NH)

¹³C NMR (75MHz, CDCl₃) d 70.8, 115.9, 116.2, 116.6, 119.4, 124.0, 127.7, 127.8, 128.1, 136.2, 139.9, 161.0, 164.3, 173.3, 193.7. mp 187-188. Mass(EI) C₁₅H₁₁FN₂O₂[M⁺]270)

실시예 2: 3-아미노-5-플루오로-3-(4-플루오로페닐)퀴놀린-2,4(1H,3H)-디온의 제조

먼저, 2-Amino-6-fluoro-benzoic acid methyl ester(1.00 g, 5.91 mmol)를 정제된 CH₂Cl₂에 녹인 후, 0℃에서 DMAP(0.04 g, 0.30 mmol)와 (4-Fluoro-phenyl)-acetyl chloride(1.22 g, 6.50 mmol)을 첨가한 후 상온에서 10시간 동안 반응시켰다. 반응 혼합물에 얼음이 함유된 차가운 Sodium bicarbonate solution를 넣은 후 CH₂Cl₂로 추출한 후 증류수로 씻어주고 MgSO₄로 건조하여 감압 농축하여 crude한 2-Fluoro-6-[2-(4-fluoro-phenyl)-acetylamino]-benzoic acid methyl ester(1.20 g, 61 %)을 고체로 얻었다.

¹H NMR (300MHz, CDCl₃) d 3.71 (s, 2H, COCH₂Ph), 3.88 (s, 3H, OCH₃), 6.79~6.85 (m, 1H, ArH), 7.07 (t, J=8.7Hz, ArH), 7.30~7.44 (m, 5H, ArH), 8.37 (d, J=8.40, 1H, ArH), 10.46 (br s, 1H, NH).

다음으로, 2-Fluoro-6-phenylacetylamino-benzoic acid methyl ester(1.00 g, 3.27 mmol)을 정제된 DMF에 녹인후 0℃에서 60% NaH(0.20 g, 4.91 mmol)를 첨가한 후 서서히 상온으로 올려 1시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 얼음이 함유된 차가운 2N HCl로 산성화 한 후 생성된 고체를 filter하여 crude한 5-Fluoro-3-(4-fluoro-phenyl)-4-hydroxy-1H-quinolin-2-one(0.70 g, 78 %)을 고체로 얻었다.

¹H NMR (200MHz, DMSO-d ₆) d 6.88~6.98(m, 1H, ArH), 7.10~7.38 (m, 3H, ArH), 7.40~7.53 (m, 3H, ArH), 9.76 (br s, 1H, OH), 11.69 (br s, 1H, NH).

다음으로, 5-Fluoro-4-hydroxy-3-phenyl-1H-quinolin-2-one(1.00 g, 3.66 mmol)을 1,4-dioxane에 녹인후 0℃에서 SO₂Cl₂(0.40 ml, 4.00 mmol)를 천천히 첨가 하고, 서서히 상온으로 올려 1시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 얼음이 함유된 차가운 물에 붓고 EtOAc로 추출하고 유기층은 물로 2회 씻어 준 후 MgSO₄로 건조하여 감압 농축하여 3-Chloro-5-fluoro-3-(4-fluoro-phenyl)-1H-quinoline-2,4-dione(1.03 g, 91 %)을 고체로 얻었다.

¹H NMR (200MHz, DMSO-d ₆) d 6.89~6.98(m, 2H, ArH), 7.20~7.29 (m, 2H, ArH), 7.39~7.47 (m, 2H, ArH), 7.55~7.66 (m, 1H, ArH), 11.61 (br s, 1H, NH).

다음으로, 3-Chloro-5-fluoro-3-phenyl-1H-quinoline-2,4-dione(1.00 g, 3.25 mmol)를 정제된 DMF에 녹인 후 0℃에서 sodium azide(0.42 g, 6.50 mmol)을 첨가한 후 상온에서 2시간 동안 교반 시켰다. 반응 혼합물을 얼음물과 Et₂O로 추출하였다. 추출한 유기층을 MgSO₄로 건조한 후 감압 농축하였다. 잔여물을 silica gel column chromatography하여 3-Azido-5-fluoro-3-(4-fluoro-phenyl)-1H-quinoline-2,4-dione(0.98 g, 96 %)를 고체로 얻었다.

¹H NMR (200MHz, CD₃OD) d 6.81~6.90(m, 2H, ArH), 7.18~7.29(m, 2H, ArH), 7.46~7.60 (m, 3H, ArH).

다음으로, 3-Azido-5-fluoro-3-phenyl-1H-quinoline-2,4-dione(1.00 g, 3.18 mmol)를 정제된 MeOH에 녹인 후 10% Pd/C(0.1 g 10w%)를 첨가한 후 풍선으로 수소를 주입하면서 1시간 동안 반응시켰다. 반응용액을 celite로 filter한 후 감압 농축시키고 재결정(EtOAc)하여 표제 화합물(0.41 g, 45%)을 고체로 얻었다.

¹H NMR (300MHz, CDCl₃) d 2.50(br s, 2H, NH₂), 6.76-6.80(m, 2H, ArH), 6.95-7.01(m, 2H, ArH), 7.36-7.44(m, 3H, ArH), 9.87(s, 1H, NH).

실험예 1: MTT assay

청각세포인 HEI-OC1, UB-OC1를 대상으로 MTT assay를 시행하였다. 96 well plate에 청각세포주를 well당 2×10³ cells로 seeding을 한 뒤 37℃, 5% CO₂ incubator에서 2일간 배양하였다. 실시예 1 및 2의 화합물을 다양한 농도로 각 sample당 5번의 실험이 되도록 한 뒤 incubator에서 16시간 배양하였다. Well당 1mg/ml의 MTT solution으로 처리한 뒤 4시간 incubator에서 배양한 뒤 well당 100㎕ DMSO로 formazan을 용해시킨뒤, 540 nm에서 용해된 formazan의 optical density를 측정하였다.

실험예 2: TUNEL Assay

TUNEL 방법을 사용한 in situ cell death detection kit, POD(Roche, Germany)를 이용하여 실시예 1의 화합물을 처리한 HEI-OC1의 apoptosis를 확인하였다. 6-well에 3×10⁵ cell을 seeding하여 배양한 뒤 24시간동안 starvation 시킨 후 조건별로 본 발명의 약물을 처리하여 24시간 배양하였다. 4% paraformaldehyde를 첨가하여 상온에서 30분간 고정한 후, PBS로 2회 세척하고, 0.1% Triton X-100이 포함된 permeablilization 용액을 상온에서 10분간 처리하였다. PBS로 다시 2회 세척한 후 terminal deoxynucleotidyl transferase(TDT)와 nucleotide mixture를 첨가하고 37℃에서 빛을 차단한 후 1시간 동안 배양하였다. PBS로 2회 세척하고 난 후, 형광 현미경하에서 세포의 apotosis를 조사하였다. apotosis가 일어나지 않은 세포의 대조 염색을 위하여 4,6-diamino-2-phenylindole(DAPI, sigma) 용액을 이용하였다.

실험예 3: FACScan with annexin-V and PI double staining

Annexin V-FITC Apoptosis Detection kit I(BD Biosciences, San Diego, CA)를 이용하여 apoptosis 정도를 분석하였다. 60 mm dish에 3×10⁵ cell을 seeding하여 배양한 뒤 24시간 동안 starvation 시킨 후 조건별로 실시예 1 및 2의 화합물을 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양액을 제거하고 PBS로 2회 세척 후 binding buffer에 세포수가 1×10⁶ cells/ml이 되도록 부유시킨 후 이 용액 100 ㎕를 5 ml tube로 옮기고 5㎕의 Annexin V-FITC를 tube에 첨가한 후 잘 혼합하여 약 15분간 암처에서 반응시켰다. 이후 400㎕의 binding buffer를 첨가한 후 Becton Dicki nson FACSscan(Lysis II Ver. 1.0)에서 10,000개 이상이 될 때까지 세포를 측정하였으며 FACScan 유세포계측기(flowcytometry)의 판독결과를 Annexin V-FITC의 발현유무에 따라 apoptosis 정도를 측정하였다. 또한 형광현미경하에서 세포의 apoptosis 정도를 측정하였다.

실험예 4: FACScan을 이용한 세포주기분석

세포를 six-well plates에 10⁶ cells/ml로 하룻밤 배양한 후에 HEI-OC1에서 cisplatin과 실시예 1 및 2의 화합물을 처리하였다. 세포에 트립신처리를 한 다음 PBS로 세척한 후 상온에 염색시료(5 mg/ml propidium iodide, 20 mg/ml RNase A)로 암실에서 15분간 염색하였다. 염색된 세포는 flow cytometry cell sorter (Becton Dickinson)로 분석하였다.

실험예 5 : Mitochondrial membrane potential (MMP) 측정

mitochondrial membrane potential(MMP)은 lipophilic cationic probe인 5,5V,6,6V-tetrachloro-1,1V,3,3V-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide (JC-1; Molecular Probes)을 이용하여 측정하였다.

JC-1은 미토콘드리아에 의해 내부에 축적되는 형광염색약으로 정상 미토콘드라아의 기능을 할 때는 MMP가 높아 적색이 주가 되다가 미토콘드리아가 손상을 받게 되면 MMP가 감소하면서 녹색으로 바뀌게 된다. 이러한 특성을 이용하여 HEI-OC1에서 cisplatin과 실시예 1 및 2의 화합물을 처리한 다음 flow cytometry and fluorescence microscopy을 이용하여 MMP의 변화를 측정하였다.

실험예 6: Western Blotting

청각 세포주 HEI-OC1를 phosphate buffered saline (PBS)으로 세척한 다음 단백질 분해 억제제(100㎍/㎖ phenylmethylsulfonyl fluoride, 1㎍/㎖ leupeptin)가 첨가된 RIPA(RadioImmunoPrecipitation) buffer 1㎖ 150mM NaCl, 1% NP-40, 50 mM Tris(pH 8.0), 1 mM EDTA, 0.5% Deoxycholate에 넣고 균질화하였다. 이 균질액을 15,000 rpm에서 10분간 원심분리 후 상층액을 Western blot analysis에 이용하였는데 단백질의 양은 Bio-Rad protein assay(Bio-Rad, Hercules, CA USA)를 이용하여 측정하였다. Well 당 20㎍의 단백질을 분리하기 위해 sodium dodesyl sulfate(SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE)를 사용하여 분리한 후 nitrocellulose filter(Amersham, Arlington Heights, IL. USA)에 옮긴 다음 4℃에서 하루 밤 동안 항 c-Met항체를 반응시켰다. 다음날 filter를 0.1% Tween-20이 함유된 Tris buffered saline(TBS) 용액으로 세척한 후 peroxidase-conjugated donkey anti-rabbit antibody(Amersham)와 donkey anti-mouse antibody(Amersham)로 각각 반응시킨 후 enhanced chemiluminescence detection system(ECL, Amersham)을 이용하여 X-ray film으로 확인하였다.

실험예 7: Zebrafish에서의 약물독성분석

Zebrafish(Danio rerio)의 embryo에 실시예 1 및 2의 화합물의 약물 독성여부를 확인하기 위해 농도별(0, 50, 100, 150, 200, 400 uM)로 처리한 후 1시간 동안 28.5℃ incubator에서 배양한 다음, 신선한 0.3 X Danieu's Soltion으로 3번 씻어 주고, 3시간동안 28.5℃에서 배양하고, embryo의 hatching rate, organogenesis, development 등을 현미경(AXIO vert 200, Carl zeiss, Gottingen, Germany)으로 확인하여 embryotoxicity를 확인하고, embryo에 대한 생존율은 embryo의 심박수축(cardiac contractility) 여부에 따라 결정하였다.

실험예 8 : 형광 현미경을 이용한 지브라피쉬의 신경소구 관찰

zebrafish(Danio rerio) wild type의 수정란이 4일째 될 때, 6 well에 Embryo media 2㎖에 처리할 약물(실시예 1 및 2의 화합물)을 넣고, 각 그룹 당 5마리 씩 넣고 1시간 동안 28.5℃를 유지하고 있는 배양기에서 약물을 반응시켰다. 반응 후, embryo media로 3번 세척한 후, 깨끗한 embryo media에서 3시간 동안 두었다. 3시간 후, 2의 Yo-Pro-1(molecular probes, Oregon U.S.A)을 embryo media에 넣고 빛이 차단된 곳에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 시킨 후, 다시 깨끗한 embryo media로 3번 씻어준 후, 8㎍/㎖의 MS222(3-aminobenzoic aid ethyl ester, methanesulfonate salt, Sigma Chemical CO, St Louis, U.S.A) 마취약으로 마취한 후 형광현미경을 사용하여 zebrafish에서 청각기능을 하는 신경소구의 형광발현을 관찰하였다.

실험예 9 : Zebrafish neuromast에 대한 주사 전자현미경 분석

cisplatin과 실시예 1로 다양한 조건에서 처리된 zebrafish의 embryo(dfp 4)에 에탄올 용액(25, 50, 70, 80, 95 %)을 이용하여 탈수화한 뒤 시료를 25%, 50%, 75%, 및 100% isoamyl acetate로 처리하였다. 드라이어를 이용하여 건조시킨 후 evaporator(MED010; Baltec, Hudson, NH)로 처리후 주사현미경(JSM-6700F JEOL, Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰하였다.

실험예 10 : Zebrafish neuromast에 대한 투사 전자현미경 분석

cisplatin과 실시예 1의 화합물로 다양한 조건에서 처리된 zebra fish( Danio rerio)의 embryo(dfp 4)를 4% glutaraldehyde in 0.1 M sodium cacodylate (pH 7.4)와 0.001 % CaCl₂에 1시간 처리한 뒤 zebrafish를 단계별 에탄올을 이용하여 탈수화를 시킨 뒤 propylene oxide 통해 Spurr's epoxy resin에 처리하였다. Larvae는 머리에서 꼬리방향으로 절단한 후 두께가 2 로 얇게 절단한 후 1% toluidine blue로 염색하였다. Ultracut S microtome(Leica, Wetzlar, Germany)을 이용하여 Ultrathin sections(90 nm)한 후 200-mesh Athene thin bar-grids 위에 마운트를 시행하고 contrastedwith uranyl acetate과 lead citrate로 처리하고 transmission electron microscope(EM 902A Carl Zeiss)을 이용하여 관찰하였다.

실험예 11 : 백서의 뇌간유발전이 청력측정

백서를 zoletil과 rompun을 1:1비율로 혼합한 마취약으로 마취한 후, 뇌간유발전이 청력검사를 실시하였다. 뇌간유발전이 청력검사는 흰 쥐를 어둡고 전기적으로 차단된 특수 제작된 방음 실에 똑바로 누운 자세로 눕혀서 실험하였다. 자극음은 초당 13회의 교대상 클릭음을 75dB HL의 강도부터 단계별로 5dB씩 낮추며 측정하였다. 청력역치는 파형 Ⅰ을 기준으로 정상적인 파형 Ⅰ이 추정되는 강도를 청력 역치로 정하였고, 클릭음의 주파수 필터는 100 - 3000 Hz로 조절하였고, 총 자극음의 횟수는 1,024회로 하였다.

cisplatin을 투여한 뒤, 실시예 1의 화합물을 병용투여한 군과 실시예 1의 화합물을 투여하지 않은 대조군으로 나누었으며, 아무것도 처리하지 않은 군에서 뇌간유발전이 청력검사를 시행한 후 실시예 1의 화합물 2mM과 대조군에는 DMSO를 투여하였으며, 이 때 약물은 26gage의 바늘로 흰 쥐의 고막 안쪽에 투여하였다. 약물투여후 1일, 3일, 7일 총 3번 뇌간유발전이 청력측정을 하였다.

상기 실시예 및 실험예의 결과는 다음과 같다.

(1) 이독성 항암제인 cisplatin에 의해 유도되는 청각세포사멸을 억제하는 효능을 MTT assay로 분석

청각유모세포(HEI-OC1(도 1의 A 및 B), UB-OC1(도 1의 C 및 D))에 대해 실시예 1의 화합물 처리시의 cytotoxicity를 MTT로 확인한 결과 실시예 1의 화합물의 용량을 200까지 증량을 하여도 세포독성이 거의 없는 것으로 확인되었고, 세포사멸을 유도하는 대표적인 항암제인 cisplatin에 의해 유도되는 청각세포사멸을 MTT assay를 통해 분석한 결과로 cisplatin 50에서 청각유모세포 HEI-OC1과 UB-OC1이 50% 정도 사멸하는 것으로 나타났고, 여기에 실시예 1의 화합물을 용량별로 처리한 결과 용량이 증가함에 따라 청각유모세포의 사멸이 통계적으로 유의하게 억제되는 것을 확인하였다. 또한, 실시예 2의 화합물에 대해서도 거의 동일한 결과를 확인하였다(도 2).

(2) cisplatin에 의한 청각세포사멸을 억제하는 효능을 TUNEL assay로 분석

cisplatin 50 uM을 청각세포에 처리한 결과 세포사멸을 나타내는 TUNEL positive cell이 증가하는 것을 확인할 수 있었고, 실시예 1의 화합물의 단독 투여시에는 세포사멸현상은 나타나지 않았다. cisplatin에 대한 실시예 1의 화합물의 청각보호효과를 관찰하기 위해 cisplatin과 실시예 1의 화합물을 동시에 투여하였을 때 청각세포사멸이 억제가 되는 것을 확인할 수 있었다. 실시예 1의 화합물의 효과는 50 uM 보다는 100 uM를 처리하였을 때 용량에 의존적으로 더 효과가 좋은 것으로 확인되었다(도 3).

(3) cisplatin에 의한 청각세포사멸을 억제하는 효능을 FACS로 분석

cisplatin에 의해 유도되는 청각세포사멸에 대해 실시예 1 및 2의 화합물의 보호효과를 알아보기 위해 annexin과 PI로 double staining한 뒤 FACS로 분석한 결과 cisplatin 50 uM에 의해 증가된 세포사멸이 실시예 1 및 2의 화합물을 동시에 투여하였을 때 통계적으로 유의하게 청각세포사멸이 억제가 되는 것을 확인할 수 있었다(도 4 및 5). 실시예 1의 화합물의 효과는 50 uM 보다는 100 uM를 처리하였을 때 용량에 의존적으로 더 효과가 좋은 것으로 확인되었다.

(4) 세포주기에 미치는 영향에 대한 FACS 분석

실시예 1의 화합물이 세포주기에 미치는 영향을 확인하기 위해, 세포사멸과 관련된 sub G1의 변화를 확인하였다. cisplatin에 의해 유도되는 sub G1의 증가가 실시예 1의 화합물의 처리시 효과적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 6).

(5) Mitochondrial membrane potential에 미치는 영향분석

세포사멸에 중요한 기전중에 하나인 미토콘드리아의 손상에 관한 측정 중 mitochondrial membrane potential(MMP)의 측정을 통해 cisplatin에 의한 미토콘드리아의 손상으로부터 실시예 1 및 2의 화합물의 보호효과를 확인하고자 측정한 결과, 정상대조군의 HEI-OC1세포는 MMP가 높게 유지되어 세포가 적색을 유지하다가 cisplatin를 처리하면 녹색형광으로 변화하면서 미토콘드리아에 손상이 있는 것을 확인할 수 있었고 이러한 현상은 실시예 1 및 2의 화합물에 의해 억제되는 것을 확인할 수 있었다(도 7 및 8).

(6) 본 발명의 화합물에 의해 억제되는 세포사멸기전

실시예 1 및 2의 화합물의 기전을 연구하기 위해 시행한 Western blot에서 JNK, p38, cleaved caspase 3, PARP가 cisplatin에 의해 증가되었다가 실시예 1 및 2의 화합물에 의해 효과적으로 억제가 되는 것으로 확인되어, 세포사멸기전에 관여하여 세포사멸을 억제하는 것으로 확인되었다(도 9 및 10).

(7) 본 발명의 화합물에 대한 약물독성연구

약물독성 검사로 zebrafish모델을 이용한 embryotoxicity 여부에 대한 결과로서 실시예 1의 화합물을 400 uM까지 처리했을 때 약물독성이 나타나지 않았고, 사용했던 50, 100, 150, 200, 400 uM에 대해 zebrafish 부화후 7일간 약물독성을 확인한 결과 약물독성이 나타나지 않았다(도 11).

(8) Zebrafish에서 본 발명의 화합물의 청력기관보호 분석

zebrafish을 이용한 in vivo실험을 시행하여, 부화된지 4일째 zebrafish에 청각유모세포를 포함한 감각신경계인 neuromast을 YO - PRO 1으로 염색한 사진으로 cisplatin 처리시 초기용량에서부터 neuromast 감소가 나타나 cisplatin 50 uM에서는 neuromast의 70%이상이 감소하고, 100 uM에서는 neuromast가 거의 모두 소실되는 소견을 보였다. cisplatin에 의해 소실되었던 청각유모세포를 포함한 neuromast가 실시예 1 및 2의 화합물에 의해 효과적으로 보호되는 현상을 확인할 수 있었고 이는 용량에 의존적으로 나타났다(도 12 및 13).

(9) Zebrafish neuromast에 대한 주사 및 투사 전자현미경(SEM, TEM) 분석

형광현미경의 관찰한 실시예 1의 화합물의 zebrafish neuromast보호효과에 대한 미세구조의 변화를 형태학적으로 확인하고자 시행한 주사 및 투사 전자현미경 소견상 정상에서 잘 확인되는 neuromast의 청각세포의 kinocilium이 50 uM cisplatin처리시 현격한 kinocilium의 손상이 있어나 대부분이 소실되거나 융합되는 등의 현상이 확인되었으나, 실시예 1의 화합물을 함께 처리한 경우 cisplatin에 의한 kinocilium과 stereocilia의 손상이 억제되어 청각기관을 보호하는 것으로 확인되었다(도 14).

(11) 청각보호 평가를 위해 시행한 백서에서의 뇌간유발전이 측정

앞의 세포실험과 지브라피쉬를 이용한 실험에서 cisplatin에 의해 손상되는 청각기관을 본 발명의 화합물이 보호한다는 것을 확인하였다. 기능적으로도 보호가 되는 가를 확인하기 위해 백서에 cisplatin에 의해 감소되는 청력을 본 발명의 화합물이 보호하는지를 확인하였다.

백서에 아무것도 처리하지 않은 상태에서 뇌간유발전이 청력측정을 시행한 결과 75dB부터 15~20dB까지 반응하였으며, cisplatin만 처리한 군에서는 50~65dB로 청력 역치가 증가하였으나, cisplatin과 실시예 1의 화합물을 함께 처리한 군에서는 25~35dB로 청력역치가 감소하여 15~25dB의 청력역치를 보인 대조군과 큰 차이를 보이지 않았다(도 15).

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:

[화학식 1]

상기 식에서,

R은 수소 또는 할로겐이다.
제1항에 있어서, 상기 R은 수소 또는 F인 것을 특징으로 하는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
제1항에 있어서, 상기 화합물은,

1) 3-아미노-3-(4-플루오로페닐)퀴놀린-2,4(1H,3H)-디온, 또는

2) 3-아미노-5-플루오로-3-(4-플루오로페닐)퀴놀린-2,4(1H,3H)-디온

인 것을 특징으로 하는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
하기 단계를 포함하는 제1항의 화합물의 제조방법:

1) 하기 화학식 2로 표시되는 화합물과 2-(4-플루오로페닐)아세틸 클로라이드를 반응시켜 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 제조하는 단계;

2) 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물과 NaH를 반응시켜 하기 화학식 4로 표시되는 화합물을 제조하는 단계;

3) 하기 화학식 4로 표시되는 화합물과 SO₂Cl₂를 반응시켜 하기 화학식 5로 표시되는 화합물을 제조하는 단계;

4) 하기 화학식 5로 표시되는 화합물과 NaH를 반응시켜 하기 화학식 6으로 표시되는 화합물을 제조하는 단계; 및

5) 하기 화학식 6으로 표시되는 화합물과 H₂를 반응시켜 제1항의 화합물을 제조하는 단계.

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]
제4항에 있어서, 상기 단계 5)는 Pd/C 촉매 하에 반응시키는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 청각 보호용 약학적 조성물.
제6항에 있어서, 상기 조성물은 청각세포사멸 억제 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제6항에 있어서, 상기 조성물은 이독성 자극으로부터 청각 보호 작용을 하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제6항에 있어서, 상기 이독성 자극은 항암제, 항생제, 방사선, 전자파 또는 소음으로부터 유래한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 청각 보호용 건강 식품 조성물.