WO2022203395A1 - 신규한 화합물 및 이를 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

신규한 화합물 및 이를 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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박근완
이상준
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한국과학기술연구원
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Abstract

본 발명은 1-페닐-3-{6-[3-(트리플루오로메틸)페녹시]피리딘-3-닐}유레아 (1-phenyl-3-{6-[3-(trifluoromethyl)phenoxy]pyridin-3-yl}urea) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 식품 조성물, 의약외품 조성물, 사료 조성물, 상기 약학적 조성물을 이용한 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 화합물 및 이를 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 신규한 화합물 또는 이의 허용 가능한 염; 이를 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 식품 조성물, 의약외품 조성물, 사료 조성물, 및 상기 약학적 조성물을 이용한 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
최근 고령화 사회에 진입하면서, 고령화와 동반되는 대표적인 질환인 퇴행성 뇌질환에 대한 관심이 증가하고 있다. 퇴행성 뇌질환의 대표적인 예로 알츠하이머성 치매(Alzheimer's dementia) 예방 및 치료 시장도 성장하여 2018년 1조 달러에서 2030년에는 2조 달러의 시장에 달할 것으로 전망되고 있다.
그러나, 1900년도 초반에 최초로 알려진 이후로, 퇴행성 뇌질환의 일종인 치매의 가장 흔한 형태로서 연구되어온 알츠하이머 조차도, 아직까지도 현대 의학에서도 치료할 수 없는 질병으로 알려져 있으며, 발병 후 증상이 악화되고 결과적으로 죽음에 이르는 질병으로 인식되어 있다. 일 예로, 알츠하이머 치료를 위해 아세틸콜린분해효소 저해제 등의 약물이 사용되었으나(Francis, Paul T. (2005). The Interplay of Neurotransmitters in Alzheimer's Disease. CNS Spectrums, 10(S18), 6-9.), 이는 증상 완화일 뿐이며 현재까지도 치매의 근본적인 치료법은 알려지지 않은 실정이다.
본 발명자들은 기존에 연구된 퇴행성 뇌질환 치료제의 타겟에서 벗어나, 후성 유전학과 관련된 단백질을 타겟으로 하여, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료를 위한 신규한 화합물을 발굴함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 1-페닐-3-{6-[3-(트리플루오로메틸)페녹시]피리딘-3-닐}유레아 (1-phenyl-3-{6-[3-(trifluoromethyl)phenoxy]pyridin-3-yl}urea) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 화합물 또는 이의 의약외품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 화합물 또는 이의 사료학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 약학적 조성물을 이용한 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 식품, 의약외품, 또는 사료 조성물을 이용한 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; 또는 이를 포함하는 조성물의 퇴행성 뇌질환 예방, 개선, 또는 치료 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; 또는 이를 포함하는 조성물의 MeCP2 저해 용도를 제공하는 것이다.
본 발명에서 후성유전학과 관련된 MeCP2를 저해하는 신규한 화합물을 확인하였으며, 상기 화합물은 기존의 치료제보다 효과적인 퇴행성 뇌질환 치료제로 적용될 수 있다.
도 1은 ensECBS 방법의 모식도를 나타낸 도이다.
도 2는 stable cell line을 구축에 대한 모식도를 나타낸 도이다.
도 3은 stable cell line에서 MeCP2 mRNA 수준을 나타낸 도이다.
도 4는 stable cell line에서 MeCP2 단백질 수준을 나타낸 도이다.
도 5는 신규한 MeCP2 저해제 화합물이 MeCP2를 감소시킴을 나타낸 도이다.
도 6은 동물실험 모식도를 나타낸 도이다.
도 7은 Y-maze 테스트 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 새로운 사물 인지 실험(Novel object recognition test) 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 수동회피실험 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 열린 공간 실험 결과 중 거리 데이터를 나타낸 도이다.
도 11은 열린 공간 실험 결과 중 중간 체류시간 데이터를 나타낸 도이다.
도 12는 로타로드 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 13 및 도 14는 3 챔버 테스트 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 아밀로이드 B 플라그(amyloid B plaque) 발현 수준의 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 배측 해마 (dorsal hippocampus)에서 MeCP2, NeuN, DAPI에 대한 ICH 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 후각 피질(Entorhinal　cortex)에서 MeCP2, NeuN, DAPI에 대한 ICH 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 복측 선조체(Ventral striatum)에서 MeCP2, NeuN, DAPI에 대한 ICH 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 19는 복측 해마 (Ventral hippocampus)에서 MeCP2, NeuN, DAPI에 대한 ICH 분석 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명 내용에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시한 일 양태의 설명 및 실시형태는 공통된 사항에 대하여 다른 양태의 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 더불어, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 발명의 일 양태는 1-페닐-3-{6-[3-(트리플루오로메틸)페녹시]피리딘-3-닐}유레아 (1-phenyl-3-{6-[3-(trifluoromethyl)phenoxy]pyridin-3-yl}urea) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.
구체적으로, 상기 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다.
Figure PCTKR2022004080-appb-img-000001
일 구현 예로, 상기 화합물은 신규한 MeCP2(Methyl-CpG-binding protein 2) 저해제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명자들은 상기 신규한 MeCP2 저해제 화합물을 최초로 발굴하였으며, 상기 화합물이 퇴행성 뇌질환을 치료할 수 있음을 최초로 규명한 것에 기술적 의의가 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 1-페닐-3-{6-[3-(트리플루오로메틸)페녹시]피리딘-3-닐}유레아 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 MeCP2 저해용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 1-페닐-3-{6-[3-(트리플루오로메틸)페녹시]피리딘-3-닐}유레아 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 "퇴행성 뇌질환(degenerative brain disease)"은 노화에 따라 발생할 수 있는 뇌 질환을 의미하며, 파킨슨 병, 알츠하이머성 치매, 노인성 치매, 기억 장애, 및 기억상실로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 본 발명의 목적상, 상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머성 치매일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "알츠하이머성 치매(Alzheimer's dementia, Alzheimer's disease)"는 뇌세포의 점진적인 퇴행성 변화로 인하여 뇌기능을 저하시키는 퇴행성 뇌질환을 의미하며, 알츠하이머병 및 알츠하이머와 혼용될 수 있다. 알츠하이머병은 치매의 대표적인 원인질환으로서 전체 치매의 절반 이상을 차지하는 가장 흔한 퇴행성 뇌질환이며, 신경전달물질인 아세틸콜린(acetylcholine)이 감소하면서 발병할 수 있고, 뇌세포의 점진적인 퇴행성 변화 및 뇌조직 감소로 인하여 기억력, 언어능력, 판단력, 및/또는 방향감각 등이 저하시킬 수 있다. 상기 알츠하이머성 치매는 진행 정도, 지적 능력 손상, 기억력 감퇴, 언어능력 약화, 및 판단 장애 등의 정도에 따라 초기(early stage, mild stage) 및 중기(midstage, moderate stage) 또는 말기(late stage, severe stage)로 구분될 수 있다. 본 발명에서 알츠하이머성 치매는 초기 알츠하이머성 치매, 중기 알츠하이머성 치매, 및 말기 알츠하이머성 치매를 모두 포함할 수 있으며, 구체적으로, 중기 알츠하이머성 치매 또는 말기 알츠하이머성 치매일 수 있고, 보다 구체적으로, 말기 알츠하이머성 치매일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
알츠하이머성 치매 치료제의 타깃으로 아밀로이드 B(amyloid B) 및 타우(Tau) 단백질 등이 연구된 바 있으나, 본 발명에서는 후성유전학과 관련된 단백질인 MeCP2를 타겟으로 하여, 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료를 위한 신규한 화합물을 발굴하였다. 본 발명의 신규한 화합물인 1-페닐-3-{6-[3-(트리플루오로메틸)페녹시]피리딘-3-닐}유레아 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 공지된 알츠하이머성 치매 치료제보다도 더 우수한 알츠하이머성 치매 치료 효과를 나타낼 수 있음을 최초로 규명하였다는 데 의의가 있다.
또한, 본 발명의 1-페닐-3-{6-[3-(트리플루오로메틸)페녹시]피리딘-3-닐}유레아 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 초기, 중기, 및/또는 말기 알츠하이머성 치매를 치료하는 것일 수 있으며, 구체적으로, 중기 또는 말기 알츠하이머성 치매, 보다 구체적으로, 말기 알츠하이머성 치매를 예방 또는 치료하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "MeCP2(Methyl-CpG-binding protein 2)"는 메틸화 프로모터의 전사를 특이적으로 억제하는 단백질을 의미한다.
본 발명에서 "MeCP2 저해제"는 상기 MeCP2의 발현 또는 활성을 저해, 감소, 불활성화, 또는 억제하는 제제를 의미한다. 구체적으로, MeCP2 단백질 또는 MeCP2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이의 유래 전사체의 생산 및 발현을 감소시킬 수 있는 모든 물질을 포함한다. 상기 제제는 유전자에 결합하여 그 발현을 전사 수준에서 억제하는 전사인자; 전사되어 생성된 전사체에 결합하여 전사체를 분해하는 miRNA, siRNA, shRNA 등의 RNA; 발현된 단백질과 결합할 수 있는 항체, 압타머, 안타고니스트, 또는 화합물 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 신규한 MeCP2 저해제 화합물은 다른 MeCP2 저해제와 함께 사용될 수 있다.
본 발명에서 "siRNA(short interfering RNA)"는 전사 과정 이후에 특정 mRNA의 활성을 저하시켜 특정 유전자의 발현을 방해하는, 20 내지 25 염기쌍으로 이루어진 이중가닥 RNA를 의미한다.
본 발명에서 "항체"는 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하는 것으로, 이는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않는바, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 및 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고, 모든 면역글로불린 항체뿐만 아니라 인간화 항체 등의 특수한 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 "압타머(aptamer)"는 표적 물질에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 의미하는 것으로, RNA, DNA 및 변형된(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "안타고니스트(antagonist)"는 수용체의 생물학적 활성을 직접 또는 간접적으로 감소시킬 수 있는 물질을 의미하며, 수용체의 리간드와 함께 사용하는 경우에 상기 리간드의 작용을 감소시킬 수 있는 분자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상 상기 RNA, 항체, 압타머, 안타고니스트 등은 안타고니스트는 MeCP2 저해할 수 있는 것인 한, 제한 없이 포함될 수 있다.
일 구현예로, 본 발명자들은 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료를 위하여, 신규한 화합물을 발굴하였다.
하나의 구체 예로, 상기 MeCP2 저해제는 1-페닐-3-{6-[3-(트리플루오로메틸)페녹시]피리딘-3-닐}유레아 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 화합물은 상기 화학식 1로 표시되는 것일 수 있다.
일 구현예로, 본 발명자들은 상기 화합물을 인공지능(Artificial Intelligence: AI) 딥러닝 기술(ensECBS)을 이용한 스크리닝 방법을 통해 발굴하였으며, 상기 ensECBS을 통해 상기 화합물을 발굴하였고, 그러나, 본 발명의 목적상 상기 화합물은 이의 명칭 및/또는 구조가 동일하다면 이의 발굴 방법 등에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 화합물이 MeCP2를 효과적으로 억제함을 확인하였으며, 퇴행성 뇌질환 치료 효과가 우수함을 확인하였다.
본 발명의 용어, "약학적으로 허용 가능한 염"은 양이온과 음이온이 정전기적 인력에 의해 결합하고 있는 물질인 염 중에서도 약제학적으로 사용될 수 있는 형태의 염을 의미하며, 통상적으로 금속염, 유기염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산과의 염 등이 될 수 있다. 예를 들어, 금속염으로는 알칼리 금속염(나트륨염, 칼륨염 등), 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염, 바륨염 등), 알루미늄염 등이 될 수 있고; 유기염기와의 염으로는 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 시클로헥실아민, 디시클로헥실아민, N,N-디벤질에틸렌디아민 등과의 염이 될 수 있으며; 무기산과의 염으로는 염산, 브롬화수소산, 질산, 황산, 인산 등과의 염이 될 수 있고; 유기산과의 염으로는 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프탈산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레인산, 시트르산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 등과의 염이 될 수 있으며; 염기성 아미노산과의 염으로는 아르기닌, 라이신, 오르니틴 등과의 염이 될 수 있고; 산성 아미노산과의 염으로는 아스파르트산, 글루탐산 등과의 염이 될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 0.01 내지 80%, 구체적으로 0.01 내지 70%, 더욱 구체적으로 0.01 내지 60 중량%로 포함할 수 있으나, 퇴행성 뇌질환, 이의 관련 질환, 및 관련 증상의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 한, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 "담체"는 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체를 의미할 수 있으며, 구체적으로, 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
상세하게는, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
구체적으로, 상기 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 주사제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 또한, 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함된 상기 담체, 부형제 또는 희석제의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총중량을 기준으로 0.0001 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 10 중량%의 함량으로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양을 포함할 수 있다. 상기 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 구체적 조성물, 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 식이, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 조성물의 분비율, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 정도, 진행경과, 환자의 연령, 체중, 성별, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 구체적으로는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 매일 투여 또는 간헐적으로 투여할 수 있고, 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 당업계에 공지된 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 물질 및 이들의 유도체와 각종 식물 추출물로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 추가 성분은 전체 조성물 중량에 대하여 0.0001 중량% 내지 10 중량%로 포함될 수 있을 것이며, 상기 함량 범위는 안전성, 본 발명 조성물의 제형화 시의 용이성 등의 요건에 따라 조절될 수 있을 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 본 발명의 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 약학적 조성물 및 퇴행성 뇌질환 등은 다른 양태에서 기재된 바와 같다.
본 발명에서 "개체"는 상기 퇴행성 뇌질환이 발병될 가능성이 있거나 발병된 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축(예를 들어, 소, 말 등), 및 반려동물(예를 들어, 개, 고양이 등) 등을 의미한다. 구체적으로, 상기 개체는 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.
본 발명의 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 조성물의 투여 경로는 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 구체적으로, 비경구 투여 시 비강 투여, 피부 외용 또는 복강 내 주사, 직장 내 주사, 피하주사, 정맥 내 주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 등의 주입방식을 선택할 수 있다. 상기 비강 투여는 비강 내 흡입 및 비강 내 주사 등의 방식을 선택할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.
본 발명에서 용어, "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 퇴행성 뇌질환의 발병 또는 진행을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어, "치료"는 치료하고자 하는 대상체 또는 세포의 천연 과정을 변경시키기 위해 임상적으로 개입하는 것을 지칭하고, 이는 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위해 수행할 수 있다. 목적하는 치료 효과에는 질병의 발생 또는 재발을 예방하고, 증상을 완화시키며, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키며, 질병 진행 속도를 감소시키며, 질병 상태를 경감 또는 일시적 완화시키며, 차도시키거나 예후를 개선시키는 것이 포함된다. 구체적으로 본 발명의 조성물의 투여로 퇴행성 뇌질환 또는 이의 관련 증상을 호전시키는 모든 행위를 포함한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 1-페닐-3-{6-[3-(트리플루오로메틸)페녹시]피리딘-3-닐}유레아 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 1-페닐-3-{6-[3-(트리플루오로메틸)페녹시]피리딘-3-닐}유레아 화합물, 퇴행성 뇌질환, 및 예방 등은 다른 양태에서 기재된 바와 같다.
본 발명의 용어, "식품적으로 허용 가능한 염"은 양이온과 음이온이 정전기적 인력에 의해 결합하고 있는 물질인 염 중에서도 식품학적으로 사용될 수 있는 형태의 염을 의미하며, 통상적으로 금속염, 유기염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산과의 염 등이 될 수 있으나, 식품학적으로 허용된다면 그 종류에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합체, 건강 기능 식품 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미의 식품을 모두 포함한다.
상기 건강기능(성) 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 식품은 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
상기 건강 식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)는 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용된다.
구체적으로, 상기 건강 기능 식품은 1-페닐-3-{6-[3-(트리플루오로메틸)페녹시]피리딘-3-닐}유레아 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.
본 발명의 식품 조성물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 높은 퇴행성 뇌질환 치매 예방 또는 개선 효과를 기대할 수 있어 매우 유용하다.
상기 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
상기 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 식품 조성물은 식품 또는 음료에 대하여 50 중량부 이하, 구체적으로 20 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 함량을 포함할 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물의 일 예로 건강음료 조성물로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 구체적으로는 약 0.02 ~ 0.03 g 일 수 있다.
상기 외에 건강음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 식품 조성물은 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선 효과를 나타낼 수 있다면 다양한 중량%로 포함할 수 있으나, 구체적으로 1-페닐-3-{6-[3-(트리플루오로메틸)페녹시]피리딘-3-닐}유레아 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 식품 조성물의 총중량 대비 0.00001 내지 100 중량% 또는 0.01 내지 80 중량%로 포함할 수 있다.
본 발명에서 "개선"은 본 발명의 식품, 의약외품, 또는 사료 조성물의 투여로 퇴행성 뇌질환이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 1-페닐-3-{6-[3-(트리플루오로메틸)페녹시]피리딘-3-닐}유레아 화합물 또는 이의 의약외품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
상기 1-페닐-3-{6-[3-(트리플루오로메틸)페녹시]피리딘-3-닐}유레아 화합물, 퇴행성 뇌질환, 예방, 및 개선 등은 다른 양태에서 기재된 바와 같다.
본 발명의 용어, "의약외품학적으로 허용 가능한 염"은 양이온과 음이온이 정전기적 인력에 의해 결합하고 있는 물질인 염 중에서도 의약외품학적으로 사용될 수 있는 형태의 염을 의미하며, 통상적으로 금속염, 유기염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산과의 염 등이 될 수 있으나, 의약외품적으로 허용된다면 그 종류에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "의약외품"은 의약외품에 해당되는 내복용 제제, 저함량 비타민, 미네랄 제제, 소독 청결제, 세정제, 및 연고제로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 의약외품 조성물에는 상기 성분 외에 필요에 따라 의약외품학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더욱 포함할 수 있다. 상기 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제는 본 발명의 효과를 해하지 않는 한 제한되지 않으며, 예를 들어 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 의약외품학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제의 대표적인 예로는, 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 젤라틴, 글리세린, 아카시아 고무, 알지네이트, 칼슘포스페이트, 칼슘카보네이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 식물성 오일, 주사가능한 에스테르, 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우리지 등을 들 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 이의 의약외품학적으로 허용 가능한 염을 의약외품의 유효성분으로 사용하는 경우, 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 상기 성분 추가 시에는 복합 사용에 따른 안전성, 제형화의 용이성, 유효성분들의 안정성을 고려할 수 있다.
의약외품의 제제화 방법, 용량, 이용방법, 구성성분 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 1-페닐-3-{6-[3-(트리플루오로메틸)페녹시]피리딘-3-닐}유레아 화합물 또는 이의 사료학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
상기 1-페닐-3-{6-[3-(트리플루오로메틸)페녹시]피리딘-3-닐}유레아 화합물, 퇴행성 뇌질환, 예방, 및 개선 등은 다른 양태에서 기재된 바와 같다.
본 발명의 용어, "사료학적으로 허용 가능한 염"은 양이온과 음이온이 정전기적 인력에 의해 결합하고 있는 물질인 염 중에서도 사료학적으로 사용될 수 있는 형태의 염을 의미하며, 통상적으로 금속염, 유기염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산과의 염 등이 될 수 있으나, 사료적으로 허용된다면 그 종류에 제한되지 않는다.
상기 사료 조성물에는 상기 화합물 또는 이의 사료학적으로 허용 가능한 염 외에도 약학적, 식품학적 또는 사료용으로 허용되는 공지의 담체, 안정화제, 또는 첨가제가 포함될 수 있다. 예를 들어, 품질 저하를 방지하기 위하여 첨가하는 결착제, 유화제, 보존제 등이 있고, 효용 증대를 위하여 사료에 첨가하는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 향미제, 비단백질태질소화합물, 규산염제, 완충제, 추출제, 올리고당 등이 있다. 그 외에도 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있으며 이에 한정된 것은 아니다. 상기 사료 조성물은 필요에 따라 비타민, 아미노산류, 미네랄 등의 각종 양분, 항산화제 및 기타의 첨가제 등을 포함할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있다. 본 발명의 사료 조성물은 단위 동물에 대하여 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다. 본 발명의 사료는 특별히 한정되는 것은 아니고, 분말 사료, 고형 사료, 건사료, 습식사료, 모이스트 펠릿 사료, 드라이 펠릿 사료, EP(Extruder Pellet) 사료, 날먹이 등 어떠한 사료라도 무방하다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 본 발명의 식품, 의약외품, 또는 사료 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 식품 조성물, 의약외품 조성물, 사료 조성물, 개체, 투여, 퇴행성 뇌질환, 예방, 및 개선 등은 다른 양태에서 기재된 바와 같다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 1-페닐-3-{6-[3-(트리플루오로메틸)페녹시]피리딘-3-닐}유레아 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; 또는 이를 포함하는 조성물의 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 1-페닐-3-{6-[3-(트리플루오로메틸)페녹시]피리딘-3-닐}유레아 화합물. 이의 식품학적으로 허용 가능한 염, 의약외품학적으로 허용 가능한 염, 사료학적으로 허용 가능한 염; 또는 이를 포함하는 조성물의 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 1-페닐-3-{6-[3-(트리플루오로메틸)페녹시]피리딘-3-닐}유레아 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 의약외품학적으로 허용 가능한 염, 사료학적으로 허용 가능한 염; 또는 이를 포함하는 조성물의 MeCP2 저해용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 1-페닐-3-{6-[3-(트리플루오로메틸)페녹시]피리딘-3-닐}유레아 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 의약외품학적으로 허용 가능한 염, 사료학적으로 허용 가능한 염; 또는 이를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 MeCP2 저해 방법을 제공한다.
상기 1-페닐-3-{6-[3-(트리플루오로메틸)페녹시]피리딘-3-닐}유레아 화합물, 약학적으로 허용 가능한 염, 식품학적으로 허용 가능한 염, 의약외품학적으로 허용 가능한 염, 사료학적으로 허용 가능한 염, 개체, MeCP2, 투여, 예방, 치료, 및 개선 등은 다른 양태에서 기재된 바와 같다.
상기 조성물은 약학적 조성물, 식품 조성물, 의약외품 조성물, 및 사료 조성물 중 어느 하나일 수 있다. 상기 개체는 개체 전체 또는 일부를 모두 포함하고, 인간, 쥐, 생쥐, 가축, 및 반려동물 등의 세포, 조직, 장기, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: ensECBS를 이용한 신규한 MeCP2 저해제 화합물 발굴
기존의 퇴행성 뇌질환 치료제 연구에서 한걸음 더 나아가 후성유전학적 기전과 관련된 MeCP2를 저해하는 화합물을 이용한 치료제를 발굴하고자 하였다. 구체적으로, 기존의 치료제와는 달리, 퇴행성 뇌질환, 특히 알츠하이머성 치매 발병 및 진행과 관련된 후성유전학과 관련이 있는 MeCP2(Methyl-CpG-binding protein 2)를 저해하는 신규한 물질을 발굴하고자 하였다.
구체적으로, 인공지능(Artificial Intelligence: AI) 딥러닝 기술(ensECBS)을 이용한 스크리닝 방법을 통해 신규한 MeCP2 저해제를 발굴하였다. 이러한 방법의 모식도는 도 1에 나타내었다.
기존의 MeCP2를 저해한다고 알려진 6종의 화합물(US 9034574 B2)을 학습시킨 후 서로 다른 특징을 갖는 화합물 결합 유사성 (chemical binding similarity) 예측 모델(ensECBS)을 이용하여 화합물을 확인하였다. ensECBS 모델은 지정된 타겟 없이 일반적인 화합물 결합 유사성을 계산하는 특징을 가진다. 상기 모델을 이용하여 MeCP2에 결합하는 화합물을 발굴하였으며, MeCP2 저해제 후보 화합물을 화합물 데이터베이스로부터 선별하였다.
실시예 2: 발굴한 화합물의 MeCP2 저해 확인
MeCP2의 C-말단에서 EGFP를 발현하는 stable cell line을 구축하였고, 이를 대상으로 화합물의 MeCP2 저해 여부를 확인하였다. 이를 위하여, MeCP2에 EGFP (녹색 형광) 가　부착된 단백질과 Dsred (붉은　형광) 벡터를　HEK293 (신장세포) 에　transduction하여, MeCP2-EGFP를 지속적으로 발현하는 stable cell line을 구축하였다 (도 2).
이후, MeCP2 stable cell line (Mecp2 C-말단에 EGFP가 부착된 단백질과 DsRed를 독립적으로 발현하는 stable cell line) 이 적절하게 구축되었는지 확인하기 위해, stable cell line에서 MeCP2 mRNA 수준의 증가를 qRT-PCR을 통해 확인하였고(도 3), stable cell line에서 MeCP2 단백질 수준의 증가를 웨스턴 블럿을 통해 확인하였다(도 4).
qRT-PCR은 역전사를 통해 cDNA를 제조하기 위해, control stable cell line과 MeCP2 stable cell line에서 세포를 채취한 후, 이로부터 총 50ng의 RNA를 분리하였다. mRNA의 경우 제조업체의 프로토콜에 따라 ReverseTra Ace qPCR RT Mix (TOYOBO)를 사용하여 cDNA를 증폭시켰다. 다음으로, iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad)에 MeCP2 와 GAPDH primer를 섞어준 후 quantitative real-time PCR (qRT-PCR)을 사용하여 mRNA의 발현을 정량화하였다. 상기 qRT-PCR 반응은 CFX connect(Bio-Rad)에서 수행하였다. 상기 결과로부터 측정된 miRNA와 mRNA의 상대비 (relative abundance)는 2-ddCt 방법으로 확인하였다. GAPDH는 stable cell line에 있는 MeCP2 정량화를 위한 표준화 대조군으로 사용하였다.
Western blot 은, Control stable cell line과 MeCP2 stable cell line로부터 RIPA 완충용액(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 단백질을 추출하였다. 이때, 추출과정은 제조사 프로토콜에 따라 진행하였다. 추출한 단백질 시료에서 단백질의 농도는 Pierce BCA protein assay (Thermo Fisher Scientific)와 분광광도계(spectrophotometer)를 통해 정량화하였다. 우선 상기 단백질 (75ug/lane) 시료를 SDS-PAGE에 로딩하고, PVDF막으로 옮겼다. 상기 PVDF 막을 5% BSA (Bovine Serum Albumin)로 1시간 동안 처리한 후, 세척하였다. 여기에 4도에서 일차 항체를 처리하고, 밤새(overnight) 반응시킨 다음 상온에서 2시간 배양하였다. 이때 사용한 일차 항체는 다음과 같다. : rabbit anti-MeCP2(Millipore; 1:750), mouse anti-b actin(Santa Cruz; 1:2000). 이어서, 일차 항체가 결합된 막을 세척하고 Goat anti-Rabbit IgG-HRP (Abcam; 1:2000) 또는 Goat anti-mouse IgG-HRP(Invitrogen; 1:5000)를 상온에서 2시간도안 배양하였다. HRP 신호는 SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Fisher Scientific)과 Image Quant LAS4000(GE Healthcare Bio-science)를 사용하여 가시화 하였다. 정량적 밀도 측정 비교 (Quantitative densitometric comparison)를 위해, Image J를 사용하였다. 본 실험에서, 동일한 시료에 대한 블롯으로부터 시료를 대응되게 처리하고, 로딩 대조군(B-actin)은 타겟 (MeCP2)로써 동일한 플롯에서 수행하였다.
그 결과, 도 3 및 도 4에 나타난 바와 같이, stable cell line에 MeCP2-EGFP가 안정적으로 발현되고 있음을 확인하였다.
또한, 화합물의 MeCP2 저해를 확인하기 위해, 용해된 화합물을 0.1nM, 1nM, 10nM, 100nM, 1uM, 10uM, 및 100uM 농도로 culture media(DMEM + FBS 10%)에 혼합한 후, MeCP2의 C-말단에서 EGFP를 발현하고, DsRed를 독립적으로 발현하는 하는 stable cell line에 분주하였다. 대조군(DMSO)과 실험군(화합물+DMSO)에서 DMSO의 함량은 전체 배양 배지(culture media)에서 1%가 되도록 하여 실험을 진행하였다. 배양 배지가 제거된 상태에서 분광광도계(spectrophotometer)를 사용하여 EGFP는 Exc/Emi = 488/509에서 측정하였고, DsRed는 Exc/Emi = 558/583에서 측정하였다.　DsRed는 stable cell line에 존재하는 MeCP2-EGFP 정량화를 위한 표준화 대조군으로서 사용하였다. 측정한 MeCP2-EGFP(green)와 DsRed(red) 강도를 비교하여 표준화하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 1-페닐-3-{6-[3-(트리플루오로메틸)페녹시]피리딘-3-닐}유레아는 MeCP2를 가장 효과적으로 감소시켰고 IC50은 14.97nM을 나타내었다.
실시예 3: 1-페닐-3-{6-[3-(트리플루오로메틸)페녹시]피리딘-3-닐}유레아의 퇴행성 뇌질환 치료 효과 확인
실시예 3-1: 실험 개요
1-페닐-3-{6-[3-(트리플루오로메틸)페녹시]피리딘-3-닐}유레아를 실제　알츠하이머병　질병 마우스(APP/PS1)에 복강내 주사(Intraperitoneal injection; IP injection)하고 행동실험 후 MeCP2, NeuN, 및 amyloid B plaque의 발현 수준을 측정하였다.
1-페닐-3-{6-[3-(트리플루오로메틸)페녹시]피리딘-3-닐}유레아를 PEG400, Saline, 및 DMSO를　40 : 57 : 3 비율로 만든 용액에 녹였다. 이의 전체적인 투여(IP 주사) 방식은 도 6에 나타내었으며,　구체적으로, 투여는 하루에 한 번씩　15mg/Kg로 4 주 동안 수행하였고 알츠하이머 마우스 (APP/PS1)의 인지저하가 일어난다고 알려진 9개월 이전으로서, 8개월령부터 실험을 수행하였다. 각각의 투여 시료에 따라 WT-vehicle, WT-chemical, APP/PS1-vehicle, 및 APP/PS1-chemical 와 같은 4개의 군으로 다음과 같이 구분하였다. 이 때, chemical은 1-페닐-3-{6-[3-(트리플루오로메틸)페녹시]피리딘-3-닐}유레아를 의미한다.
Group
WT-vehicle Vehicle (PEG400 + Saline + DMSO)
WT- chemical Vehicle (PEG400 + Saline + DMSO)+ Chemical
APP/PS1- vehicle Vehicle (PEG400 + Saline + DMSO)
APP/PS1- chemical Vehicle (PEG400 + Saline + DMSO)+ Chemical
복강 내 주입 후 마우스의　인지 기능을　확인을 위한 행동실험으로, Y-maze 테스트, 새로운 사물 인지 실험(Novel object recognition test; NOR), 및 수동회피실험(passive avoidance; PA); 사회성을 확인하기 위한 three chamber test(3CT); 운동능(locomotor) 및 불안 수준(anxiety level)를 확인하기 위한 열린 공간 실험(Open field test; OF); 및 운동 능력을 확인하기 위한 로타로드 실험(rotarod test; Rotarod)를 진행하였다. 상기 Y-maze, NOR, PA, 3CT, OF, 및 Rotarod 실험 모두 공지된 방법을 이용하였다.
또한, MeCP2, NeuN, 및 amyloid plaque의 발현 수준을 측정하기 위해 마우스 뇌에서 면역조직화학 (immunohistochemistry; IHC) 분석 및 Thioflavin S 염색을 진행하였다.　
실시예 3-2. 인지기능 개선 확인(Y-maze, NOR, 및 PA)
Y-maze 테스트는 마우스가 Y자 모양 미로에서 앞서 들어갔던 통로를 기억하고 3개의 통로를 순차적으로 돌아다닌다는 습성을 이용한 것으로서, 상기 표 1와 같이 제작한 마우스를 Y자 미로에 놓고 순차적으로 통로를 돌아다닌 정도를 확인하여 인지능력을 측정하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 알츠하이머 마우스(APP/PS1- vehicle) 그룹에서 순차적으로 통로를 돌아다닌 정도가 감소하였던 반면, chemical을 투여한 알츠하이머 마우스(APP/PS1-chemical) 그룹에서는 정상군(WT-vehicle 및 WT-chemical)에서와 유사하게 그 정도가 증가함을 확인하였다.
새로운 사물 인지 실험(NOR)은 마우스가 새로운 물체에 더 많은 관심을 보이는 습성을 이용한 것으로서, 상기 표 1와 같이 제작한 마우스에 물체를 먼저 보여주고, 24시간 후에 미리 봤던 물체(familiar object) 및 새로운 물체(novel object)를 동시에 보여줬을 때 어떤 물체에 더 관심을 많이 갖는지 확인하여 인지 능력을 측정하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 알츠하이머 마우스(APP/PS1- chemical) 그룹에서는 새로운 물체에 대한 선호도가 낮았던 반면, chemical을 투여한 알츠하이머 마우스(APP/PS1-chemical) 그룹에서는 정상군(WT-vehicle 및 WT-chemical)에서와 유사하게 그 정도가 증가함을 확인하였다.
수동회피실험은 어두운 방과 밝은 방으로 나뉜 회피학습 상자를 이용하였다. 상자의 밝은 방에 마우스를 넣으면 어두운 방으로 넘어가는데 그 순간 2 초간 0.45 mA의 전기충격을 가하고 다음 날 실험동물을 밝은 방에 다시 넣었을 때 어두운 방에서의 전기충격을 기억하여 밝은 방에 머무르게 되는데, 이때 체류하는 시간(entry latency)을 측정하여 기억력을 평가하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 알츠하이머 마우스(APP/PS1- chemical) 그룹에서는 새로운 물체에 대한 체류시간이 낮았던 반면, chemical을 투여한 알츠하이머 마우스(APP/PS1-chemical) 그룹에서는 정상군(WT-vehicle 및 WT-chemical)에서와 유사하게 그 정도가 증가함을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 인지 저하를 보는 행동실험인 Y-maze, NOR, 및 Passive avoidance 실험 결과 Vehicle을 투여한 알츠하이머 마우스인 APP/PS1-vehicle 그룹이 다른 그룹에 비해 유의미한 인지저하가 나타났다. 그러나, chemical을 투여한 알츠하이머 마우스인 APP/PS1-chemical 그룹은 APP/PS1 vehicle 그룹에 비해 인지 기능이 향상되었다. WT-vehicle, WT-chemical, 및 APP/PS1-chemical　group 간의　유의적인 차이는 없었다.　
따라서, 1-페닐-3-{6-[3-(트리플루오로메틸)페녹시]피리딘-3-닐}유레아가 알츠하이머 마우스의 인지 기능을 향상시킴을 확인하였다.
또한, 모든 자료는 mean(S.E.M)으로 표시하였고,　실험 군　간의 차이는 two-way ANOVA를 이용하여 확인하였다. p>0.05인 경우는 통계적으로 차이가 있다고 판정하였다. p>0.05 ;*, P>0.01 ; **.p>0.001 ; ***
실시예 3-3. 운동 및 불안 수준 확인(OPM, Rotarod)
마우스의 자발적인 보행성 활동량을 측정하고, 불안 수준을 비교하기 위해 열린 공간 테스트(Open field test; OPM)를 수행하였다. 본 실험에 사용된 open field 박스는 가로 40 cm, 세로 40 cm, 높이 40 cm이며, 영상 추적 프로그램(Noldus EthoVision XT)을 사용하여 총 이동 거리 및 가운데 구간에 체류한 시간을 계산하였다. 마우스가 새로운 환경에 적응할 수 있는 시간을 준 이후에, 각 마우스를 같은 코너에 올려두고 행동 관찰을 시작하여 움직이는 경로를 추적하였다. 마우스가 실험 외적인 요인에 의해 원치 않는 어는 행동(freezing behavior)을 보이는 것을 방지하기 위해 조용하고 어두운 방에서 본 실험을 진행하였다.
운동(Locomotor)의 경우 열린 공간 실험에서의 이동 거리로 측정하였으며, 불안 수준(Anxiety level)은 열린 공간 실험에서의 중간 체류(Center duration) 시간을 통해 측정하였다.
또한, 알츠하이머 유도 및 chemical 투여에 따른 운동기능을 확인하기 위해 로타로드 실험을 수행하였다. 로타로드 실험은 5일간 하루에　3번 진행하였고, 10분 동안 4 내지 40　rpm까지 가속하는　로드(rod)에 얼마나　잘 버티는지를　시간(latency)을 통해 확인하였다.
그 결과, 도 10 및 도 11에 나타난 열린 공간 실험 및 도 12에 나타난 로타로드 실험에서 모두 WT-vehicle, WT-chemical, APP/PS1-vehicle, APP/PS1-chemical　group 간의 유의미한 차이는　없었다.
실시예 3-4. 사회성 개선 확인(3CT)
동물의 사회성을 확인하기 위해 3 챔버 테스트를 진행하였다.
정상적인 사회성을 지닌 마우스는 사회적 선호도 (social preference) 비어있는 곳(E) 보다 마우스(stranger 1)에 관심을 보이고, 사회적 인지도 (social recognition) 이전에 만난 마우스(stranger 1) 보다 새로운 마우스(stranger 2)에 더 관심을 보이는 경향이 있지만, 사회성이 낮은 알츠하이머 마우스의 경우에는 사회적 선호도 (social preference)에서는 정상 마우스와 비슷한 경향을 보이지만, 사회적 인지도 (social recognition)에서는 그렇지 않은 경향을 보이는 바, 이를 이용한 실험이 3 챔버 테스트이다. 구체적으로, 비어있는 곳(E) 및 마우스(stranger 1)가 주어지거나(사회적 선호도; social preference) 또는 이전에 만난 마우스(stranger 1) 및 새로운 마우스(stranger 2)가 주어졌을 때(사회적 인지도; social recognition), 각 방에서 비어있는 곳(E), 마우스 (stranger 1 and stranger 2) 와 상호작용 (sniffing) 하는 시간을 측정하여, WT-vehicle, WT-chemical, APP/PS1-vehicle, APP/PS1-chemical　그룹의 사회성을 측정하였다.
그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 새로운 마우스(S1)와 비어있는 곳 (E) 중 새로운 마우스에 얼마나 더 관심을 보이는가를 측정하는 경우(사회적 선호도; social preference), WT-vehicle, WT-chemical, APP/PS1-vehicle, 및 APP/PS1- chemical 모든 그룹에서 비어있는 곳(E)에서 보다 새로운 마우스 S1과 상호작용 (sniffing) 하는 시간이 증가됨을 확인하였다.
또한, 도 14에 나타난 바와 같이, 새로운 마우스 (S1)과 또 다른 새로운 마우스 (S2) 중 또 다른 새로운 마우스에 얼마나 더 관심을　보이는가를 측정하는 경우(사회적 선호도; social preference), AD-vehicle 그룹은 또 다른 새로운 마우스에 대한 선호도가 없었던 반면, AD-chemical group은 새로운 마우스보다　또 다른　새로운 마우스에 더 관심을 갖고 있음을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 알츠하이머병　환자에서 나타나는 사회성의 결핍이 chemical에 의해 완화됨을 확인하였다.
모든 자료는 mean(S.E.M)으로 표시하였고,　실험 군　간의 차이는 two-way ANOVA를 이용하여 확인하였다. p>0.05인 경우는 통계적으로 차이가 있다고 판정하였다. p>0.05 ;*, P>0.01 ; **.p>0.001 ; ***, p>0.0001 ; ****, ns ; nonsignificant
실시예 3-5. 아밀로이드 플라크(amyloid plaque) 감소 확인
WT-vehicle, WT-chemical, APP/PS1-vehicle, APP/PS1-chemical 그룹의 마우스 뇌에서 아밀로이드 플라크(amyloid plaque)의 발현 양을 볼 수 있는 thioflavin S staining을 하였다.
이를 위하여, 상기 실시예 3-2 내지 3-4의 실험을 수행한 후 도 6에 나타난 시기에 마우스를 희생시켰다(Mouse sac). WT-vehicle, Wt-chemical, APP/PS1-vehicle, 및 APP/PS1-chemcial 그룹의 마우스에 Avertin을 복강 주사하여 마취하고, PBS (Phosphate buffer, pH 7.4) 용액과 4% paraformaldehyde 용액을 순서대로 관류하여 고정하였다. 이후, 뇌를 꺼내어 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에 16시간 담가둔 다음, 뇌를 다시 30% 수크로스(sucrose)가 포함된 PBS에 3일간 담가두었다. 그 다음, 동결 박절기를 이용하여 40um 두께로 연속관상절편을 제작하였다. 이와 같이 절편 된 뇌에서 유래한 부유 절편(floating section)을 PBS에 10분씩 3회 세척하였다. 70% 에탄올, 80%에탄올을 순서대로 1분씩 배양 후, 1% Thioflavin S (Sigma-Aldrich) solution에 15분간 배양하였다. 다시, 80% 에탄올 및 70% 에탄올에 순서대로 1분간 배양한 다음 Thioflavin S로 염색이 된 부유 절편(floating section)을 슬라이드에 올려 놓았다. 슬라이드에 mounting solution (No DAPI)을 넣고 커버 글라스로 덮은 후, 공초점 현미경을 사용하여 마우스 뇌조직에서 아밀로이드 B 플라크(amyloid B plaque)를 관찰하였다.
그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이, APP/PS1-vehicle 그룹의 마우스　뇌조직에 비해 APP/PS1-chemical group의 마우스 뇌조직에서 아밀로이드 B 플라크(amyloid B plaque)가 적게 관찰됨을 확인하였다.
실시예 3-6. 면역조직화학적 분석
실시예 3-5와 마찬가지로, 희생시킨 마우스에서 뇌를 적출한 후, MeCP2 저해제 화합물이 실제로 마우스 뇌에서 MeCP2를 감소시키는지 여부를　확인하기 위해　MeCP2에 대한　IHC를 수행하였다. 그리고　알츠하이머병　질병 모델의　마우스에서 관찰되는 신경세포의 사멸을 관찰하기 위해, 신경세포 마커인 NeuN을 이용하여 IHC를 진행하였다.　실험은　알츠하이머병의　주요 뇌 부위인 해마 (hippocampus)　내 배측 해마 (dorsal hippocampus), 후각 피질(Entorhinal　cortex), 복측 해마 (Ventral hippocampus) 조직 및 복측 선조체(Ventral striatum) 조직을 대상으로 진행하였다.
구체적으로, 실시예 3-5에서 만들어진 40um 두께의 연속관상절편을 이용하였다. 절편된 뇌에서 유래한 부유 절편(floating section)을 TBS (Tris-Buffered saline, pH 7.4)에 10분씩 3회 세척 후, TBST (0.3% Triton-X100 (igma Aldrich) in TBS)에 10분씩 3회 세척하였다. NDS(normal donkey serum)를 TBST 용액에 5%가 되도록 만들어진 용액에 상온에서 한 시간 동안 배양하여 blocking 진행 후, mouse anti-NeuN (Millipore, 1:200)항체와 rabbit anti-MeCP2 (Millipore, 1:250) 항체를 넣은 1% NDS in TBST 용액을 이용하여 4도에서 이틀간 배양하였다. 그 후 TBST 용액에서 10분씩 3번 세척 후, donkey anti-mouse, Alexa Fluor 594 (Invitrogen; 1:400)과 donkey anti-rabbit, 및 Alexa Fluor 488 (Invitrogen; 1:400) 항체를 넣은 1% NDS in TBST 용액을 이용하여 상온에서 두 시간 배양하였다. 그 후, TBST용액에서 10분씩 3번 세척한 다음 항체를 이용하여 염색된 부유 절편(floating section)을 슬라이드에 올려 놓았다. 슬라이드에 DAPI가 포함된 mounting solution을 넣고 커버 글라스로 덮은 후, 공초점 현미경을 이용하여 마우스의 뇌조직에서 MeCP2 (488-green), NeuN (594-red), 및 DAPI(405-blue)를 관찰하였다.
그 결과, 도 16, 도 17, 도 18, 및 도 19에 나타난 바와 같이, WT-vehicle과 APP/PS1-vehicle 그룹에 비해 WT-chemcial과 APP/PS1-chemical 그룹에서 MeCP2의 발현량이 감소됨을　확인하였다. 또한, APP/PS1-vehicle 그룹의 마우스 조직에서 NeuN의 발현이 다른 그룹에 비해 감소됨을 확인하였다. 그러나, APP/PS1-chemical 그룹에서는 APP/PS1-vehicle 그룹에 비해 NeuN을 발현하는 신경세포들이 많음을 확인하였다.
상기 결과로부터, 본 발명에서 1-페닐-3-{6-[3-(트리플루오로메틸)페녹시]피리딘-3-닐}유레아는 알츠하이머 병 질병 마우스 모델인 APP/PS1의 뇌에서 감소한 신경세포를 증가시키는 등 퇴행성 뇌질환을 효과적으로 치료할 수 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (9)

1-페닐-3-{6-[3-(트리플루오로메틸)페녹시]피리딘-3-닐}유레아 (1-phenyl-3-{6-[3-(trifluoromethyl)phenoxy]pyridin-3-yl}urea) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 MeCP2(Methyl-CpG-binding protein 2) 저해용 조성물.
제1항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제3항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인, 약학적 조성물.
제3항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 파킨슨 병, 알츠하이머성 치매, 노인성 치매, 기억 장애, 및 기억상실로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 약학적 조성물.
제1항의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제1항의 화합물 또는 이의 의약외품학으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
제1항의 화합물 또는 이의 사료학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 개선용 사료 조성물.
제3항의 약학적 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료 방법.
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