WO2014182051A1 - Ａｓｍ 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Ａｓｍ 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2014182051A1
WO2014182051A1 PCT/KR2014/004025 KR2014004025W WO2014182051A1 WO 2014182051 A1 WO2014182051 A1 WO 2014182051A1 KR 2014004025 W KR2014004025 W KR 2014004025W WO 2014182051 A1 WO2014182051 A1 WO 2014182051A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
asm
mice
disease
app
alzheimer
Prior art date
Application number
PCT/KR2014/004025
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
배재성
진희경
이종길
Original Assignee
경북대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 경북대학교 산학협력단 filed Critical 경북대학교 산학협력단
Priority to US14/889,293 priority Critical patent/US10098855B2/en
Publication of WO2014182051A1 publication Critical patent/WO2014182051A1/ko
Priority to US15/994,934 priority patent/US10682373B2/en
Priority to US16/863,942 priority patent/US11242529B2/en
Priority to US17/562,774 priority patent/US20220135703A1/en

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/133—Amines having hydroxy groups, e.g. sphingosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/137—Arylalkylamines, e.g. amphetamine, epinephrine, salbutamol, ephedrine or methadone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/005—Enzyme inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G01N33/559—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody through a gel, e.g. Ouchterlony technique
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G01N33/561—Immunoelectrophoresis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A01K2217/052—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing gain of function
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • A01K2267/0312—Animal model for Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • A01K2267/0318—Animal model for neurodegenerative disease, e.g. non- Alzheimer's
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/04—Phosphoric diester hydrolases (3.1.4)
    • C12Y301/04012—Sphingomyelin phosphodiesterase (3.1.4.12)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease

Definitions

  • the present invention relates to a composition for the prevention or treatment of neurodegenerative diseases comprising an acid sphingomyelinase (ASM) inhibitor as an active ingredient.
  • ASM acid sphingomyelinase
  • Dementia is defined as the gradual deterioration of memory and cognitive abilities that impair everyday life, and can be divided into vascular dementia and Alzheimer's dementia.
  • Vascular dementia mainly corresponds to a case in which cerebral infarction or stroke occurs due to a blood clot formed in a blood vessel, and is known to cause damage to brain cells around the onset and loss of memory.
  • AD Alzheimer's disease
  • vascular dementia mainly corresponds to a case in which cerebral infarction or stroke occurs due to a blood clot formed in a blood vessel, and is known to cause damage to brain cells around the onset and loss of memory.
  • AD Alzheimer's disease
  • vascular dementia is a progressive, progressive brain disease that initially causes memory loss, personality changes, and decreased thinking. Dies of pneumonia within a year; It is estimated that 3.5-10% of senior citizens over 65 years of age suffer from the disease, with an estimated 4 million patients in the United States alone. The social cost of treating the disease alone is a typical disease of the elderly, with $ 100 billion annually spent in the
  • ⁇ -amyloid is released from amyloid precursor protein (APP), and the released ⁇ -amyloid aggregates with each other to produce insoluble amyloid plaques.
  • APP amyloid precursor protein
  • the production of amyloid plaques leads to the degeneration of nerve cells, which in turn leads to the production of neurofibrillary tangles.
  • the accumulation of ⁇ -amyloid in the brain tissue and its neurotoxicity have been shown to be a very important pathogenesis of Alzheimer's dementia. Intensive research is being conducted around the world for the prevention of substances with relatively low side effects.
  • ⁇ -amyloid is a fragment of the amyloid precursor protein produced by the action of the protease APP called gamma-secretase and beta-secretase.
  • the enzyme beta-secretase which plays a major role in the production of ⁇ -amyloid, is generally called BACE, and two types are known, BACE-1 and BACE-2. Among them, BACE-1 has most of the activity of beta-secretase (about 90%) and is known to play a much more important role than BACE-2 in the process of ⁇ -amyloid production.
  • AD Alzheimer's dementia
  • acetylcholinesterase inhibitors As described above, the only drugs approved for treating Alzheimer's dementia are acetylcholinesterase inhibitors, but these drugs show only temporary relief in some patients with Alzheimer's dementia (40-50%). The disadvantage is that it doesn't last long. In addition, due to the nature of the disease requires long-term administration, the acetylcholinesterase inhibitors developed so far have also been accompanied with various side effects, including hepatotoxicity is also a problem. In other words, the therapeutic agents developed to date only temporarily alleviate the symptoms, and thus, there is an urgent need for the development of drugs that fundamentally cure the disease or inhibit progression.
  • FDA US Food and Drug Administration
  • ASM sphingomyelinase
  • the present inventors have discovered the pathogenesis of ASM against Alzheimer's disease, and when ASM is partially deleted in Alzheimer's disease model mice, a model in which the ASM gene is partially deficient and Alzheimer's disease model mouse is combined.
  • ASM was suppressed in Alzheimer's disease model mice, such as when the serum of ASM gene-deficient mice was injected into Alzheimer's disease model mice, it was confirmed that ⁇ -amyloid deposition in brain tissues was inhibited and learning and memory were improved.
  • the present invention has been completed.
  • It is an object of the present invention to provide a composition for the prevention or treatment of degenerative neurological diseases comprising an acid sphingomyelinase (ASM) activity inhibitor or expression inhibitor as an active ingredient.
  • ASM acid sphingomyelinase
  • Another object of the present invention to provide a method for preventing or treating degenerative neurological disease, comprising administering to a subject a therapeutically effective amount of the composition.
  • Another object of the present invention is to provide a method for screening a prophylactic or therapeutic substance for degenerative neurological diseases using a change in the amount of expression of ASM.
  • the present invention provides a composition for the prevention or treatment of degenerative neurological diseases comprising an acid sphingomyelinase (ASM) activity inhibitor or expression inhibitor as an active ingredient.
  • ASM acid sphingomyelinase
  • the present invention also provides a method of preventing or treating degenerative neurological disease, comprising the step of administering to a subject a therapeutically effective amount of the composition.
  • the present invention also provides a method for screening a material for preventing or treating degenerative neurological disease, comprising: measuring a change in the amount of expression of ASM by treating a candidate with a biological sample.
  • ASM inhibitors can be usefully used for the prevention or treatment of degenerative neurological diseases including Alzheimer's disease.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a manufacturing process of an APP / PS1 / ASM +/- mouse.
  • FIG. 2 shows ASM concentration levels in plasma, brain tissues and fibroblasts of Alzheimer's disease model mice (APP / PS1) and mice partially deficient in ASM (APP / PS1 / ASM +/- ).
  • Figure 3 is a diagram confirming the degree of ⁇ -amyloid deposition in the cerebral cortex of the brain tissue of APP / PS1 mice and APP / PS1 / ASM + /-mice using thioflavin S staining.
  • FIG. 4 is a diagram confirming the degree of ⁇ -amyloid deposition in the hippocampus in the brain tissue of APP / PS1 mice and APP / PS1 / ASM + /-mice using thioflavin S staining.
  • FIG. 5 is a diagram confirming the degree of ⁇ -amyloid deposition in the brain tissue of APP / PS1 mice and APP / PS1 / ASM + /-mice using immunofluorescence.
  • Figure 6 is a diagram confirming the degree of deposition of ⁇ -amyloid in the brain tissue of APP / PS1 mice and APP / PS1 / ASM + /-mice using ELISA.
  • FIG. 7 and 8 are diagrams confirming the improvement effect on the learning and memory of APP / PS1 / ASM + /-mice using the MWM (Morris water maze) test.
  • 9 and 10 illustrate the effect of improving memory capacity of APP / PS1 / ASM +/- mice using a fear conditioning test.
  • FIG. 11 is a diagram confirming the expression level of autophagy-related protein in tail fibroblasts of WT, APP / PS1 mice and APP / PS1 / ASM +/- mice using Western blotting.
  • FIG. 12 is a diagram confirming the expression levels of autophagy-related proteins in the tail fibroblasts of WT, APP / PS1 mice and APP / PS1 / ASM + /-mice using density quantification method.
  • Figure 13 is a diagram confirming the expression level of autophagy-related proteins in the brain tissue of WT, APP / PS1 mice and APP / PS1 / ASM + /-mice using Western blotting.
  • FIG. 14 is a diagram confirming the expression level of autophagy-related proteins in the brain tissue of WT, APP / PS1 mice and APP / PS1 / ASM + /-mice using density quantification method.
  • 15 is a diagram confirming the proteolytic activity in the tail fibroblasts of WT, APP / PS1 and APP / PS1 / ASM + /-mice.
  • FIG. 16 is a diagram illustrating brain tissue of WT, APP / PS1, and APP / PS1 / ASM +/ ⁇ mice using a transmission electron microscope (TEM).
  • TEM transmission electron microscope
  • 17 is a diagram confirming the expression level of autophagy-related proteins when human fibroblasts are treated with ASM (1 ⁇ M to 10 ⁇ M) using western blotting.
  • FIG. 18 is a diagram confirming the expression level of autophagy-related proteins when ASM (1 ⁇ M to 10 ⁇ M) is treated to human fibroblasts using density quantification.
  • 19 is a diagram confirming the expression level of autophagy-related proteins when M6P is treated in human fibroblasts using Western blotting and density quantification.
  • FIG. 20 is a diagram showing the conversion ratio of LC3-I to LC3-II when ASM was treated in human fibroblasts with or without NH 4 Cl in human fibroblasts.
  • 21 is a diagram showing the conversion ratio of LC3-I to LC3-II when human fibroblasts were cultured in serum-free medium or complete medium and treated with NH 4 Cl.
  • FIG. 22 is a diagram showing the conversion ratio of LC3-I to LC3-II when human fibroblasts were cultured in serum-free medium or complete medium and treated with ASM.
  • FIG. 23 is a diagram showing an experimental design for verifying Alzheimer's disease treatment effect by administering AMI to APP / PS1 mice.
  • FIG. 24 is a diagram showing the concentration of ASM in the serum and brain tissue of mice when AMI was administered to APP / PS1 mice.
  • FIG. 25 shows the degree of ⁇ -amyloid deposition in brain tissue (cerebral cortex and hippocampus) of mice when AMI is administered to APP / PS1 mice.
  • FIG. 26 is a diagram showing the effect of improving memory when AMI was administered to APP / PS1 mice and a Morris water maze (MWM) test was performed.
  • MMI Morris water maze
  • FIG. 27 shows an experimental design for verifying Alzheimer's disease treatment effect using a pathogen binding system [Isochronic; APP / PS1-APP / PS1: Alzheimer's disease model mice, APP / PS1 mice are combined with each other), heterochromic I (APP / PS1-ASM +/- : APP / PS1 and ASM +/- mice) , Heterochromic II (APP / PS1-WT: pathological binding between APP / PS1 mice and wild type mice).
  • pathogen binding system Isochronic; APP / PS1-APP / PS1: Alzheimer's disease model mice, APP / PS1 mice are combined with each other
  • heterochromic I APP / PS1-ASM +/- : APP / PS1 and ASM +/- mice
  • Heterochromic II APP / PS1-WT: pathological binding between APP / PS1 mice and wild type mice.
  • FIG. 28 shows ASM concentrations in serum and brain tissue of pathologically coupled mice.
  • 29 is a diagram confirming the degree of deposition of ⁇ -amyloid in the brain tissue (cerebral cortex and hippocampus) of pathologically coupled mice.
  • FIG. 30 is a diagram showing the expression of each protein in the brain tissue of pathologically coupled mice using Western blotting.
  • FIG. 31 shows an experimental design for verifying Alzheimer's disease treatment effect using serum infusion.
  • FIG. 32 shows ASM concentrations in serum and brain tissue of APP / PS1 mice receiving serum from each mouse.
  • FIG. 33 shows the degree of ⁇ -amyloid deposition in brain tissue (cerebral cortex and hippocampus) of APP / PS1 mice receiving serum from each mouse.
  • Figure 34 is a diagram showing the expression level of each protein in the brain tissue of APP / PS1 mice received the serum of each mouse using Western blotting.
  • 35 is a diagram showing the memory improvement effect of APP / PS1 mice received the serum of each mouse using the MWM (Morris water maze) test.
  • 36 is a diagram showing the effect of improving the memory capacity of APP / PS1 mice received the serum of each mouse using the fear conditioning test (fear conditioning) test.
  • FIG. 37 is a diagram schematically showing the role of ASM in the pathogenesis of Alzheimer's disease.
  • the present invention provides a composition for the prevention or treatment of neurodegenerative diseases comprising an activity inhibitor or expression inhibitor of ASM (acid sphingomyelinase) as an active ingredient.
  • ASM acid sphingomyelinase
  • the composition comprises a pharmaceutical composition or a food composition.
  • Alzheimer's disease when ASM is partially deficient in Alzheimer's disease model mouse, the Alzheimer's disease is deficient in the case of a model in which the ASM gene is partially deficient and Alzheimer's disease mouse.
  • ASM was inhibited in Alzheimer's disease model mice, such as when injected into model mice, it was confirmed that the deposition of ⁇ -amyloid in brain tissues was inhibited and the learning and memory were improved. Therefore, ASM inhibitors can be usefully used for the prevention or treatment of degenerative neurological diseases including Alzheimer's disease.
  • the ASM activity inhibitor according to the present invention may be one or more selected from the group consisting of compounds, peptides, peptide mimetics, matrix analogs, aptamers and antibodies that specifically bind to ASM proteins, but are not limited thereto.
  • the peptide mimetics is to inhibit the activity of the ASM protein by inhibiting the binding domain of the ASM protein.
  • Peptide mimetics can be peptides or non-peptides and are amino acids bound by non-peptide bonds, such as psi bonds (Benkirane, N., et al. J. Biol. Chem., 271: 33218-33224, 1996). Can be configured.
  • cyclic mimetics comprising “conformationally constrained” peptides, cyclic mimetics, at least one exocyclic domain, binding moieties (binding amino acids) and active sites Can be a sieve.
  • Peptide mimetics are structured similar to the secondary structure of UBAP2 (Ubiquitin-Associated Protein 2) protein and are either antibodies (Park, BW et al. Nat Biotechnol 18, 194-198, 2000) or water soluble receptors (Takasaki, W. et al. Nat Biotechnol 15, 1266-1270, 1997), which can mimic the inhibitory properties of large molecules, and may be novel small molecules that can act equivalent to natural antagonists (Wrighton, NC et al. Nat Biotechnol 15). , 1261-1265, 1997).
  • the aptamer is a single-chain DNA or RNA molecule, and has a high affinity for a specific chemical molecule or biological molecule by an evolutionary method using an oligonucleotide library called systemic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX). Oligomers that have the ability to select and bind can be obtained by isolation (C. Tuerand L. Gold, Science 249, 505-510, 2005; AD Ellington and JW Szostak, Nature 346, 818-822, 1990; M. Famulok, et. al., Acc. Chem. Res. 33, 591-599, 2000; DS Wilson and Szostak, Annu. Rev. Biochem. 68, 611-647, 1999). Aptamers can specifically bind to targets and modulate the activity of the targets, such as by blocking the function of the targets through binding.
  • the antibody may specifically and directly bind to ASM to effectively inhibit the activity of ASM.
  • As the antibody specifically binding to the ASM it is preferable to use a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • Antibodies that specifically bind to the ASM may be prepared by known methods known to those skilled in the art, and commercially known ASM antibodies may be purchased and used.
  • the antibody can be prepared by injecting an immunogen ASM protein into an external host according to conventional methods known to those skilled in the art. External hosts include mammals such as mice, rats, sheep, rabbits. Immunogens are injected intramuscularly, intraperitoneally or subcutaneously, and can generally be administered in conjunction with an adjuvant to increase antigenicity.
  • Antibodies can be isolated by collecting blood from an external host at regular intervals and collecting serum showing specificity for antigens and antigens formed.
  • ASM expression inhibitor according to the present invention is an antisense nucleotide, small hairpin RNA (shRNA), small interfering RNA (siRNA) complementary to the ASM gene or mRNA of the gene that promotes the expression of ASM And ribozyme (ribozyme) may be one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the siRNA is composed of a sense sequence of 15 to 30 mer (mer) selected from the base sequence of the mRNA of the gene encoding the ASM protein and an antisense sequence complementary to the sense sequence, wherein the sense sequence is Although not particularly limited thereto, it is preferably composed of about 25 bases.
  • the antisense nucleotide binds (hybridizes) the complementary sequence of DNA, immature-mRNA or mature mRNA, as defined in Watson-Crick base pairs, thereby interfering with the flow of genetic information as a protein in DNA. will be.
  • the nature of antisense nucleotides specific to the target sequence makes them exceptionally multifunctional. Since antisense nucleotides are long chains of monomeric units they can be easily synthesized for the target RNA sequence. Many recent studies have demonstrated the utility of antisense nucleotides as biochemical means for studying target proteins (Rothenberg et al., J. Natl. Cancer Inst., 81: 1539-1544, 1999).
  • antisense nucleotides can be considered as a new type of inhibitor because of recent advances in the field of nucleotide synthesis that exhibit oligonucleotide chemistry and enhanced cell adsorption, affinity of target binding and nuclease resistance.
  • Neurodegenerative diseases in accordance with the present invention include Alzheimer's disease, Parkinson's disease, advanced nuclear palsy, multiple system atrophy, olive nucleus-brain-cerebellar atrophy (OPCA), Shire-Dragger syndrome, striatum-black degenerative disease, Huntington's disease, muscular dystrophy Including but not limited to lateral sclerosis (ALS), essential tremor, cortical-basal nucleus degeneration, diffuse Lewis body disease, Parkin-ALS-dementia complications, pick disease, cerebral ischemia and cerebral infarction.
  • ALS lateral sclerosis
  • essential tremor cortical-basal nucleus degeneration
  • diffuse Lewis body disease Parkin-ALS-dementia complications
  • pick disease cerebral ischemia and cerebral infarction.
  • composition of the present invention may contain one or more known active ingredients having an effect of inhibiting the expression or activity of ASM or a known effective ingredient having a therapeutic effect of neurodegenerative diseases together with the activity inhibitor or expression inhibitor of ASM.
  • compositions of the present invention may be administered orally or parenterally (eg, applied intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) according to the desired method, and the dosage is based on the weight, age and sex of the individual.
  • the range varies depending on health, diet, time of administration, method of administration, duration or interval of administration, excretion rate, constitution specificity, and the nature of the formulation.
  • the daily dosage of the inhibitor of the expression or activity of ASM of the present invention is about 0.001 to 1000 mg / kg, preferably about 0.1 to 500 mg / kg, but may be added or subtracted according to clinical trial results. It is preferable to administer.
  • compositions of the present invention may be formulated in various preparations for administration.
  • Excipients which may be included in the present invention are non-toxic and inert pharmaceutically suitable solid, semisolid or liquid formulation aids of all types, for example fillers, weighting agents, binders, wetting agents, disintegrants, dispersants, interfaces Active agents or diluents;
  • compositions of the present invention are formulated as tablets, coated tablets, capsules, pills, granules, suppositories, solutions, suspensions and emulsions, pastes, ointments, gels, creams, lotions, powders or sprays. Can be converted.
  • the composition of the present invention can be added to a dietary supplement for the improvement of neurodegenerative diseases.
  • the active ingredient can be added as it is, or used with other foods or food ingredients, and can be suitably used according to a conventional method.
  • the mixed amount of the active ingredient may be appropriately determined depending on the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment).
  • the active ingredient of the present invention in the production of food or beverage is added in an amount of 15% by weight or less, preferably 10% by weight or less based on the raw material.
  • the amount may be below the above range, and the active ingredient may be used in an amount above the above range because there is no problem in terms of safety.
  • Examples of the food to which the substance can be added include dairy products including meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, ice cream, various soups, drinks, tea, drinks, Alcoholic beverages and vitamin complexes, and includes all of the dietary supplements in the conventional sense.
  • the health beverage composition of the present invention may contain various flavors or natural carbohydrates, etc. as additional components, as in the general beverage.
  • Natural carbohydrates described above are monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol.
  • sweetening agent natural sweetening agents such as tautin and stevia extract, synthetic sweetening agents such as saccharin and aspartame, and the like can be used.
  • the proportion of the natural carbohydrate is generally about 0.01-0.20 g, preferably about 0.04-0.10 g per 100 g of the composition of the present invention.
  • the composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, coloring agents, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, And a carbonation agent used for the carbonated beverage.
  • the composition of the present invention may contain a pulp for the production of natural fruit juices, fruit juice drinks and vegetable drinks. These components can be used independently or in combination. The proportion of such additives is not critical but is usually selected in the range of 0.01 to 0.20 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • the present invention also provides a method of preventing or treating degenerative neurological disease, comprising the step of administering to a subject a therapeutically effective amount of the composition.
  • the therapeutically effective amount can be determined within the right medical judgment.
  • the specific therapeutically effective amount for a particular patient may be based on the specific composition, including the type and severity of the reaction to be achieved, whether or not other agents are used in some cases, the age, weight, general health, sex and diet of the patient, time of administration, It is desirable to apply differently depending on the route of administration and the rate of release of the composition, the duration of treatment, and the various factors and similar factors well known in the medical arts, including drugs used with or concurrent with the specific composition. Therefore, the effective amount of the composition suitable for the purpose of the present invention is preferably determined in consideration of the above matters.
  • a known neurodegenerative disease treatment agent may be co-administered with the composition of the present invention to increase the effect of treating neurodegenerative disease.
  • the present invention is applicable to any mammal having degenerative neurological diseases, which include humans and primates, as well as domestic animals such as cattle, pigs, sheep, horses, dogs and cats.
  • step 2) measuring a change in the amount of mRNA or protein expression of the acid sphingomyelinase (ASM) in the biological sample of step 1) provides a screening method of preventing or treating a degenerative neurological disease.
  • ASM acid sphingomyelinase
  • the biological sample of step 1) includes, but is not limited to, blood, urine, saliva or tissue of an animal suffering from degenerative neurological disease.
  • Method for measuring the change in the amount of mRNA expression in step 2) includes reverse transcriptase (RT-PCR), competitive reverse transcriptase (Competitive RT-PCR), real time reverse transcriptase (Realtime RT-PCR), RNase RNase protection assay (RPA), Northern blotting, DNA chips and the like.
  • Method for measuring the change in the amount of protein expression in step 2) is Western blotting, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony (Ouchterlony) Immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS), protein chip, etc. Including, but not limited to.
  • mice mice overexpressing APPswe
  • PS1 mice presenilin Mice overexpressing -1M146V; GlaxoSmithKline
  • APP / PS1 / ASM +/ ⁇ mice were prepared by crossing ASM +/ ⁇ mice (only one of the pair of ASM genes missing) and APP / PS1 mice. The specific process is shown in FIG.
  • Concentration levels of ASM were measured in serum, brain tissue and fibroblasts of 9-month-old wild-type (WT) mice, APP / PS1 mice and APP / PS1 / ASM +/ ⁇ mice prepared in Example 1-1. More specifically, 3 ⁇ l of serum, brain tissue and fibroblast samples of each mouse were mixed with ASM activity buffer and stored at 37 ° C. 114 ⁇ l of ethanol was added to the mixture to terminate the hydrolysis reaction, followed by centrifugation. 30 ⁇ l of supernatant was transferred to a glass vial and then 5 ⁇ l was applied to the UPLC system.
  • ASM concentration levels were quantified by comparing Bodipy (aminoacetaldehyde) combined with sphingomyelin and ceramide. Extraction and quantification of the sphingomyelin and ceramide is performed by extracting lipids from a sample according to a known method, and resuspending the dried lipid extract in 25 ⁇ l of 0.2% Igepal CA-630 (Sigma-Aldrich), The concentration level of each lipid was performed by quantification using an UPLC system. The results are shown in FIG. 2 (left: plasma; center: brain tissue; right: fibroblasts).
  • ASM concentrations in plasma, brain tissue and fibroblasts of APP / PS1 / ASM +/ ⁇ mice compared to levels of ASM concentrations in plasma, brain tissue and fibroblasts of APP / PS1 mice It was confirmed that the level of is significantly low.
  • Example 1-2 in order to determine how the reduction in ASM concentration levels in APP / PS1 / ASM +/- mice affects the pathological aspects of Alzheimer's disease, the degree of ⁇ -amyloid deposition in brain tissue was analyzed.
  • Example 1-1 the cerebral cortex and hippocampal tissue of each mouse prepared in Example 1-1 were isolated, and then tissue sections were obtained and stained with thioflavin S according to a conventionally known method. The results are shown in Figure 3 (cerebral cortex) and Figure 4 (horse hippocampus).
  • anti-20G10 for A ⁇ 42 (mouse, 1: 1000) and anti-G30 (rabbit, 1: 1000) for A ⁇ 40 anti-Iba-1 (rabbit, 1: 500, Wako), anti-GFAP (rabbit) , 1: 500, DAKO) and anti-active caspase 3 (rabbit, 1:50, Chemicon) antibodies were performed using immunofluorescence according to a conventionally known method. Tissue sections were observed using a laser scanning confocal microscope or Olympus BX51 microscope equipped with Fluoview SV1000 imaging software (Olympus FV1000, Japan), and metamorphic software (Molecular Devices) of the stained area for the total tissue area. Percentage of area was quantified.
  • ⁇ -amyloid deposition was confirmed using a commercially available ELISA kit (Biosource). More specifically, the hemispheres of each mouse's brain were homogenized in a buffer containing 0.02 M guanidine. Thereafter, according to the manufacturer's manual, ELISA for A ⁇ 40 and A ⁇ 42 was performed.
  • Example 1-1 In order to determine whether the APP / PS1 / ASM +/- mouse prepared in Example 1-1 has a learning and memory improvement effect, a MWM (Morris water maze) test was performed according to a conventionally known method.
  • mice More specifically, wild-type mice, APP / PS1 / ASM +/- mice, ASM +/- mice, and APP / PS1 mice were used, the task was learned four times a day for 10 days, and the platform was released on the 11th day. It was removed and a probe trial was performed. The escape time during the experiment and the time spent on the target platform on day 11 were measured. The results are shown in FIGS. 7 and 8.
  • APP / PS1 mouse was confirmed that the impairment in the formation of spatial memory, such as no change in the escape time during the experiment, there is no difference in the time spent on the target platform and non-target platform, APP It was confirmed that / PS1 / ASM +/- mice improved learning and memory to similar levels as wild type mice.
  • a fear conditioning test was performed to evaluate learning and memory by associating an environmental context or conditional stimulus with an electric shock according to a conventionally known method.
  • mice More specifically, wild-type mice, APP / PS1 / ASM +/- mice, ASM +/- mice and APP / PS1 mice were used.
  • each mouse was individually placed in a conditioning chamber and explored for 60 seconds. Over time, 10 seconds of sound stimulation (tone, 10 kHz, 70 dB) was given. This is called conditioned stimulus (CS).
  • CS was terminated with electric plantar shock (0.3 mA, 1 s), an unconditioned stimulus (US).
  • CS-US was performed twice in pairs at 20 second intervals.
  • each mouse was placed back in a fear-conditioned chamber without CS or plantar shock, followed by a 5 minute freezing response.
  • each mouse was placed in a different experimental chamber than the conditioning chamber, and after 60 seconds of exploration time, 60 seconds of sound stimulation was performed without sole shock. The freeze response was measured to measure memory for fear. The results are shown in FIGS. 9 and 10.
  • LC3 (rabbit, 1: 1000, Cell Signaling Technologies, 4108S) Beclin-1 (rabbit, 1: 1000, Cell Signaling Technologies, 3738S), p62 (rabbit, 1: 1000, Cell Signaling Technologies, 5114S), Western blotting was performed using cathepsin D (goat, 1: 500, R & D Systems, BAF1029) and ⁇ -actin (1: 1000, Santa Cruz, SC-1615) antibodies according to a conventionally known method, using ImageJ software ( Densitometric quantification was performed using the US National Institutes of Health. The results are shown in FIGS. 11 to 14.
  • Proteolytic activity was confirmed in tail fibroblasts of wild-type mice, APP / PS1 mice, and APP / PS1 / ASM +/- mice prepared in Example 1-1 of 9 months of age.
  • Pulse-chase experiments were performed by pulses using [ 3 H] -leucine (2 ⁇ Ci / ml) for 48 hours to label long-lived proteins. Labeled cells were washed and cultured in a complete medium in an environment where autophagy is inhibited or in a medium lacking serum in which autophagy is induced. Aliquots of media were collected at different time points, precipitated with 10% TCA, filtered on membranes with pores of 0.22 ⁇ m and analyzed for proteolytic activity by measuring radioactivity. The results are shown in FIG.
  • Human fibroblast lines were obtained from Coriell Institute and incubated at 37 ° C. and 5% CO 2 in DMEM medium containing 15% FBS. After treating the cell lines with recombinant ASM (1 ⁇ M to 10 ⁇ M), Western blotting and density quantification were performed in the same manner as in Example 2-1. The results are shown in FIGS. 17 and 18.
  • an autophagic flux assay was performed. More specifically, the ratio of LC3-I to LC3-II conversion in cells with or without NH 4 Cl, which inhibits the decomposition of autophagosomes but does not affect the formation of autophagosomes, is determined by Western blotting. It was measured by. The result is shown in FIG.
  • the cells were cultured in a serum-free medium to induce autophagy, and when NH 4 Cl was added, the level of LC3-II was significantly increased.
  • FIG. 22 Induced autophagy by culturing cells in a serum-free medium, and when ASM was treated, the accumulation of LC3-II was significantly increased.
  • ASM does not induce autophagy but inhibits proteolysis of autophagosomes.
  • APP / PS1 mice Alzheimer's disease model mice, were administered for four months with amitriptyline-hydrochloride (AMI), a known inhibitor of ASM and known to pass BBB, followed by a water maze (WM) test (FIG. 23).
  • AMI amitriptyline-hydrochloride
  • WM water maze
  • FIGS. 24-26 Each experimental result is shown to FIGS. 24-26.
  • mice administered with the AMI confirmed that the escape time (escape latency) is reduced compared to the control group to recover the memory.
  • mice are surgically linked to skin and soft tissue, induce new neovascularization between two mice, and then share blood flow, thereby isochronic (APP / PS1-APP / PS1: Alzheimer's disease).
  • APP / PS1 mice which are model mice, have a pathogenetic bond), heterochronic I (APP / PS1-ASM +/- : a pathogenetic bond between APP / PS1 mice and ASM +/- mice), and heterochronic II (heterochronic II) APP / PS1-WT: Pathogen binding between APP / PS1 mice and wild-type mice) mice were prepared (FIG. 27).
  • Serum and brain tissue were obtained in the same manner as in Example 4-1, and the expression level of ASM was measured, and the degree of ⁇ -amyloid deposition and protein expression in brain tissue was measured. Each experimental result is shown in FIGS. 28-30.
  • heterochromic I APP / PS1-ASM +/ ⁇
  • isochronic APP / PS1-APP / PS1
  • heterochromic II APP / PS1-WT mice. It was confirmed that the concentration of ASM in the serum and brain tissue of the mouse is low, and through this it was confirmed that the ASM +/- mouse lowers the concentration of ASM.
  • the conversion of the heterochromic I (APP / PS1-ASM +/- ) mouse brain tissue to LC3-II is reduced compared to isochronic (APP / PS1-APP / PS1) mice. It was confirmed that the expression of p62 and cathepsin D was decreased, and the expression of TFEB and Lamp1, which are proteins related to ALP function, was increased.
  • Serum from APP / PS1 or ASM ⁇ / ⁇ mice was injected into APP / PS1 mice. More specifically, blood was obtained from the heart of APP / PS1 or ASM ⁇ / ⁇ mice and then collected in a tube coated with EDTA. Collected blood was centrifuged to obtain serum, and 100 ⁇ l of serum was injected into the vein of 8-month-old APP / PS1 mice for a total of 8 times for 3 weeks (FIG. 31). After the experiment, serum and brain tissues were obtained in the same manner as in Example 4-1, and the expression level of ASM was measured, and the degree of ⁇ -amyloid deposition and protein expression in brain tissues was measured. In addition, behavioral experiments were performed in the same manner as in Example 1-4. Each experimental result is shown in FIGS. 32-36.
  • ⁇ -amyloid deposition in brain tissue of APP / PS1 mice given serum of ASM ⁇ / ⁇ mice was reduced compared to APP / PS1 mice given serum of APP / PS1 mice. 33 (Fig. 33), the conversion to LC3-II was reduced, and the expression of p62 and cathepsin D was reduced (Fig. 34).
  • MWM and fear conditioning test results showed that memory of APP / PS1 mice given serum of ASM ⁇ / ⁇ mice was lower than that of APP / PS1 mice given serum of APP / PS1 mice. The improvement was confirmed.
  • tablets were prepared by tableting according to a conventional method for producing tablets.
  • the capsule was prepared by filling in gelatin capsules according to the conventional method for producing a capsule.
  • Vitamin B6 0.5 mg
  • composition ratio of the above-mentioned vitamin and mineral mixtures is mixed with a component suitable for a health food in a preferred embodiment, the compounding ratio may be arbitrarily modified, and the above ingredients are mixed according to a conventional health food manufacturing method.
  • the granules may be prepared and used for preparing a health food composition according to a conventional method.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)

Abstract

본 발명은 ASM 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 알츠하이머병 모델 마우스에 ASM을 부분적으로 결손시킨 경우, ASM 유전자가 부분적으로 결손된 마우스와 알츠하이머병 모델 마우스를병체 결합시킨 모델의 경우 및 ASM 유전자가 결손된 마우스의 혈청을 알츠하이머병 모델 마우스에 주입한 경우 등, 알츠하이머병 모델 마우스에서 ASM을 억제하였을 때, 뇌 조직 내 β-아밀로이드의 침착이 저해되고, 학습 및 기억력이 개선되는 우수한 효과가 있음을 확인하였다. 따라서, ASM 억제제는 알츠하이머병을 비롯한 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

ＡＳＭ 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 ASM (acid sphingomyelinase) 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
치매(dementia)는 일상생활에 장애를 주는 기억과 인지 능력의 점차적인 악화로 정의되며, 크게 혈관성 치매와 알츠하이머형 치매로 나눌 수 있다. 혈관성 치매는 주로 혈관 내에 형성된 혈전에 의해 뇌경색 또는 뇌졸중 등이 발생하는 경우에 해당되며 발병 주변의 뇌 세포가 손상을 입어 기억력 상실 등의 증상이 유발되는 것으로 알려져 있다. 반면, 혈관성 치매보다 훨씬 더 많은 비중을 차지하고 있는 알츠하이머형 치매(Alzheimer's Diseases : AD)는 서서히 진행되는 뇌 질환으로서 처음에는 기억력 감퇴, 성격의 변화 그리고 사고력이 감소하는 질병으로서 대부분의 환자는 8-10년 내에 폐렴 등으로 사망한다. 전 세계적으로 65세 이상의 노인 중 3.5-10% 가량이 이 질환을 앓고 있으며 미국에서만 400만 명의 환자가 있는 것으로 추정된다. 이 질환을 치료하기 위하여 소요되는 사회적 비용만도 미국에서만 연 1000억불이 지출되고 있을 정도로 노인의 대표적인 질병이다.
현재까지 밝혀진 알츠하이머형 치매의 발생 기전으로는 아밀로이드 전구 단백질(APP)에서 β-아밀로이드가 유리되고, 유리된 β-아밀로이드는 서로 응집되어 불용성 아밀로이드 플라크를 생성하는데, 이 β-아밀로이드의 응집 및 아밀로이드 플라크(amyloid plaques)의 생성이 신경 세포의 퇴행을 일으키게 되고, 그 결과 이차적으로 신경섬유 농축체(neurofibrillary tangle)의 생성이 유발된다는 것이다. 이와 같이 뇌 조직 내 β-아밀로이드의 축적과 그로 인한 신경독성이 알츠하이머형 치매의 매우 중요한 발병원인으로 작용하고 있음이 밝혀짐에 따라 BACE-1 억제제와 같이 β-아밀로이드의 생성 저지, 응집 저지 또는 독성 저지 효과를 지니면서 상대적으로 부작용이 적은 물질의 탐색 연구가 전 세계적으로 집중 연구되고 있다. β-아밀로이드는 아밀로이드 단백질의 전구체인 APP가 감마-시크리타제 및 베타-시크리타제라는 단백분해효소들의 작용을 받아 생성된 아밀로이드 전구 단백질의 절편이다. β-아밀로이드의 생성에 가장 주요한 역할을 하고 있는 효소 베타-시크리타제는 일반적으로 BACE로 불리우고 있으며, BACE-1과 BACE-2 등 두 개의 타입이 알려져 있다. 이 중 BACE-1은 베타-시크리타제의 대부분의 활성(약 90%)을 지니고 있어 β-아밀로이드 생성 과정에 있어 BACE-2에 비하여 훨씬 더 중요한 역할을 담당하고 있다고 알려져 있다.
또한, 최근의 역학 연구에 의하면 고혈압, 당뇨병, 고지혈증 및 심장질환 등 뇌혈관 질환의 위험인자들이 혈관성 치매뿐만 아니라 알츠하이머형 치매의 발병률을 증가시킨다고 보고되었다. 알츠하이머형 치매(AD)로 인한 인지기능 저하현상에 대한 현대 의학적 관점은 대부분 뇌 콜린성 신경세포의 광범위한 변성 및 소실을 인지기능감퇴의 가장 주요한 원인으로 간주하고 있으며, 이를 극복하기 위한 방편으로 손상되지 않고 남아있는 콜린성 신경계의 활성을 증가시켜 손상된 인지기능을 부분적으로 회복시킬 수 있는 약물들을 개발하고자 하는 연구가 주종을 이루고 있다.
현재 미국 식품의약국(FDA)으로부터 알츠하이머형 치매의 치료제로 공인받은 네 가지 약물(타크린, 리바스티그민, 도네페질, 갈란타민)은 모두 아세틸콜린 분해 효소의 활성을 저해함으로써 인지기능을 항진시키고자하는 일명 아세틸콜린에스테라제 억제제(acetylcholinesterase inhibitors)들이다. 이와 같이 지금까지 알려진 알츠하이머형 치매의 치료제로 승인된 의약품은 아세틸콜린에스테라제 억제제가 유일한 실정이나, 이들 약제들은 일부 알츠하이머형 치매 환자(40-50%)에서 일시적인 병증 완화 효과만을 보이고 그 약효가 오래 지속되지 못하는 단점이 있다. 또한 질환의 특성상 장기 복용을 요하는데, 지금까지 개발된 아세틸콜린에스테라제 억제제는 간독성을 비롯한 여러 가지 부작용을 수반하는 것 또한 문제점으로 드러나고 있다. 즉, 현재까지 개발된 치료제들은 단지 일시적으로 증상만 완화시킬 뿐이므로, 병을 근본적으로 치료하거나 진행을 억제하는 약물의 개발이 절실히 요구되고 있다.
한편, 스핑고지질 대사는 정상적인 세포 신호전달을 조절하며, 스핑고지질 대사를 조절하는 효소인 ASM(acid sphingomyelinase)은 거의 모든 종류의 세포에서 발현되는 단백질로서, 스핑고지질 대사 및 세포막 턴오버(turnover)에 중요한 역할을 한다. 상기 ASM은 대부분 엔도좀/리소좀 부위 안에 위치하고, 세포 스트레스 반응 시, 세포막의 바깥쪽으로 이동한다. ASM은 윌슨병, 당뇨병, 낭포성 섬유증, 폐기종 등 다양한 질병에서 증가되어 있으며 질병의 발병과 상당한 연관성을 지니고 있다. 그러나 ASM의 상기와 같은 역할에도 불구하고, ASM과 알츠하이머병과의 관련성에 관한 연구는 현재 미미한 실정이다.
이에 본 발명자들은 ASM의 알츠하이머병에 대한 발병기전을 발견하고, 알츠하이머병 모델 마우스에 ASM을 부분적으로 결손시킨 경우, ASM 유전자가 부분적으로 결손된 마우스와 알츠하이머병 모델 마우스를 병체 결합시킨 모델의 경우 및 ASM 유전자가 결손된 마우스의 혈청을 알츠하이머병 모델 마우스에 주입한 경우 등 알츠하이머병 모델 마우스에서 ASM을 억제하였을 때, 뇌 조직 내 β-아밀로이드의 침착이 저해되고, 학습 및 기억력이 개선됨을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 ASM(acid sphingomyelinase) 활성 억제제 또는 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물의 치료적 유효량을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는, 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료방법을 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 ASM의 발현양 변화를 이용한 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료물질의 스크리닝 방법을 제공함에 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ASM(acid sphingomyelinase) 활성 억제제 또는 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물의 치료적 유효량을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는, 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 생물학적 시료에 후보물질을 처리하여 ASM의 발현양 변화를 측정하는 단계;를 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 알츠하이머병 모델 마우스에 ASM을 부분적으로 결손시킨 경우, ASM 유전자가 부분적으로 결손된 마우스와 알츠하이머병 모델 마우스를병체 결합시킨 모델의 경우 및 ASM 유전자가 결손된 마우스의 혈청을 알츠하이머병 모델 마우스에 주입한 경우 등, 알츠하이머병 모델 마우스에서 ASM을 억제하였을 때, 뇌 조직 내 β-아밀로이드의 침착이 저해되고, 학습 및 기억력이 개선되는 우수한 효과가 있음을 확인하였다. 따라서, ASM 억제제는 알츠하이머병을 비롯한 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 APP/PS1/ASM+/- 마우스의 제조 과정을 나타낸 도이다.
도 2는 알츠하이머병 모델 마우스(APP/PS1) 및 상기 마우스에 ASM을 부분 결손시킨 마우스(APP/PS1/ASM+/-)의 혈장, 뇌 조직 및 섬유아세포에서 ASM 농도 수준을 나타낸 도이다(왼쪽: 혈장; 중앙: 뇌 조직; 오른쪽: 섬유아세포).
도 3은 티오플라빈 S 염색을 이용하여 APP/PS1 마우스 및 APP/PS1/ASM+/- 마우스의 뇌 조직 중 대뇌 피질에서 β-아밀로이드의 침착 정도를 확인한 도이다.
도 4는 티오플라빈 S 염색을 이용하여 APP/PS1 마우스 및 APP/PS1/ASM+/- 마우스의 뇌 조직 중 해마에서 β-아밀로이드의 침착 정도를 확인한 도이다.
도 5는 면역형광법을 이용하여 APP/PS1 마우스 및 APP/PS1/ASM+/- 마우스의 뇌 조직 내 β-아밀로이드의 침착 정도를 확인한 도이다.
도 6은 ELISA를 이용하여 APP/PS1 마우스 및 APP/PS1/ASM+/- 마우스의 뇌 조직 내 β-아밀로이드의 침착 정도를 확인한 도이다.
도 7 및 도 8은 MWM(Morris water maze) 테스트를 이용하여 APP/PS1/ASM+/- 마우스의 학습 및 기억력에 대한 개선효과를 확인한 도이다.
도 9 및 도 10은 공포 조건화(fear conditioning) 테스트를 이용하여 APP/PS1/ASM+/- 마우스의 기억 능력 개선효과를 확인한 도이다.
도 11은 웨스턴 블롯팅을 이용하여 WT, APP/PS1 마우스 및 APP/PS1/ASM+/- 마우스의 꼬리 섬유아세포에서 자가포식작용 관련 단백질의 발현 수준을 확인한 도이다.
도 12는 밀도 정량화법을 이용하여 WT, APP/PS1 마우스 및 APP/PS1/ASM+/- 마우스의 꼬리 섬유아세포에서 자가포식작용 관련 단백질의 발현 수준을 확인한 도이다.
도 13은 웨스턴 블롯팅을 이용하여 WT, APP/PS1 마우스 및 APP/PS1/ASM+/- 마우스의 뇌 조직에서 자가포식작용 관련 단백질의 발현 수준을 확인한 도이다.
도 14는 밀도 정량화법을 이용하여 WT, APP/PS1 마우스 및 APP/PS1/ASM+/- 마우스의 뇌 조직에서 자가포식작용 관련 단백질의 발현 수준을 확인한 도이다.
도 15는 WT, APP/PS1 및 APP/PS1/ASM+/- 마우스의 꼬리 섬유아세포에서 단백질 분해 활성을 확인한 도이다.
도 16은 투과전자현미경(TEM)을 이용하여 WT, APP/PS1 및 APP/PS1/ASM+/- 마우스의 뇌 조직을 관찰한 도이다.
도 17은 웨스턴 블롯팅을 이용하여 인간 섬유아세포에 ASM(1 μM 내지 10 μM)을 처리하는 경우 자가포식작용 관련 단백질의 발현 수준을 확인한 도이다.
도 18은 밀도 정량화법을 이용하여 인간 섬유아세포에 ASM(1 μM 내지 10 μM)을 처리하는 경우 자가포식작용 관련 단백질의 발현 수준을 확인한 도이다.
도 19는 웨스턴 블롯팅 및 밀도 정량화법을 이용하여 인간 섬유아세포에 M6P를 처리하는 경우 자가포식작용 관련 단백질의 발현 수준을 확인한 도이다.
도 20은 웨스턴 블롯팅을 이용하여 인간 섬유아세포에 NH4Cl의 존재 또는 비 존재 하에서 ASM을 처리한 경우, LC3-Ⅰ에서 LC3-Ⅱ로의 전환 비율을 나타낸 도이다.
도 21은 혈청 없는 배지 또는 완전 배지에서 인간의 섬유아세포를 배양하고 NH4Cl를 처리한 경우, LC3-Ⅰ에서 LC3-Ⅱ로의 전환 비율을 나타낸 도이다.
도 22는 혈청 없는 배지 또는 완전 배지에서 인간의 섬유아세포를 배양하고 ASM을 처리한 경우, LC3-Ⅰ에서 LC3-Ⅱ로의 전환 비율을 나타낸 도이다.
도 23은 APP/PS1 마우스에 AMI를 투여하여 알츠하이머병 치료 효과를 검증하기 위한 실험 디자인을 나타낸 도이다.
도 24는 APP/PS1 마우스에 AMI를 투여하였을 때, 마우스의 혈청 및 뇌 조직에서의 ASM 농도를 나타낸 도이다.
도 25는 APP/PS1 마우스에 AMI를 투여하였을 때, 마우스의 뇌 조직(대뇌 피질 및 해마) 내 β-아밀로이드의 침착 정도를 확인한 도이다.
도 26은 APP/PS1 마우스에 AMI를 투여하고 MWM(Morris water maze) 테스트를 수행하였을 때, 기억력 개선 효과를 확인한 도이다.
도 27은 병체 결합 시스템을 이용하여 알츠하이머병 치료 효과를 검증하기 위한 실험 디자인을 나타낸 도이다[아이소크로닉; APP/PS1-APP/PS1: 알츠하이머병 모델 마우스인 APP/PS1 마우스끼리 병체결합), 헤테로크로닉 Ⅰ(APP/PS1-ASM+/-:APP/PS1마우스와 ASM+/-마우스간의 병체결합), 헤테로크로닉 Ⅱ(APP/PS1-WT: APP/PS1 마우스와 야생형 마우스간의 병체결합].
도 28은 병체 결합 마우스의 혈청 및 뇌 조직에서의 ASM 농도를 나타낸 도이다.
도 29는 병체 결합 마우스의 뇌 조직(대뇌 피질 및 해마) 내 β-아밀로이드의 침착 정도를 확인한 도이다.
도 30은 웨스턴 블롯팅을 이용하여 병체 결합 마우스의 뇌 조직에서 각 단백질의 발현 정도를 나타낸 도이다.
도 31은 혈청 주입을 이용하여 알츠하이머병 치료 효과를 검증하기 위한 실험 디자인을 나타낸 도이다.
도 32는 각 마우스의 혈청을 제공받은 APP/PS1 마우스의 혈청 및 뇌 조직에서의 ASM 농도를 나타낸 도이다.
도 33은 각 마우스의 혈청을 제공받은 APP/PS1 마우스의 뇌 조직(대뇌 피질 및 해마) 내 β-아밀로이드의 침착 정도를 확인한 도이다.
도 34는 웨스턴 블롯팅을 이용하여 각 마우스의 혈청을 제공받은 APP/PS1 마우스의 뇌 조직에서 각 단백질의 발현 정도를 나타낸 도이다.
도 35는 MWM(Morris water maze) 테스트를 이용하여, 각 마우스의 혈청을 제공받은 APP/PS1 마우스의 기억력 개선 효과를 확인한 도이다.
도 36은 공포 조건화 (fear conditioning) 테스트를 이용하여 각 마우스의 혈청을 제공받은 APP/PS1 마우스의 기억 능력 개선효과를 확인한 도이다.
도 37은 ASM의 알츠하이머병의 발병 기전에 대한 역할을 개략적으로 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 ASM(acid sphingomyelinase)의 활성 억제제 또는 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물을 포함한다.
본 발명에 따르면, 알츠하이머병 모델 마우스에 ASM을 부분적으로 결손시킨 경우, ASM 유전자가 부분적으로 결손된 마우스와 알츠하이머병 모델 마우스를병체 결합시킨 모델의 경우 및 ASM 유전자가 결손된 마우스의 혈청을 알츠하이머병 모델 마우스에 주입한 경우 등, 알츠하이머병 모델 마우스에서 ASM을 억제하였을 때, 뇌 조직 내 β-아밀로이드의 침착이 저해되고, 학습 및 기억력이 개선되는 우수한 효과가 있음을 확인하였다. 따라서, ASM 억제제는 알츠하이머병을 비롯한 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 ASM 활성 억제제는 ASM 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상 일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 펩티드 모방체(Peptide mimetics)는 ASM 단백질의 결합 도메인을 억제하여 ASM 단백질의 활성을 억제하는 것이다. 펩티드 모방체는 펩티드 또는 비펩티드일 수 있고, psi 결합(Benkirane, N., et al. J.Biol. Chem., 271:33218-33224, 1996)과 같은, 비펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산으로 구성될 수 있다. 또한, "구조적으로 강제된(conformationally constrained)" 펩티드, 사이클릭 모방체(cyclic mimetics), 적어도 하나의 엑소사이클릭 도메인(exocyclic domain), 결합 부분(결합 아미노산) 및 활성 부위를 포함하는 사이클릭 모방체일 수 있다. 펩티드 모방체는 UBAP2(Ubiquitin-Associated Protein 2) 단백질의 이차구조 특성과 유사하게 구조화되고 항체(Park, B. W. et al. Nat Biotechnol 18, 194-198, 2000) 또는 수용성 수용체(Takasaki, W. et al. Nat Biotechnol 15, 1266-1270, 1997)와 같은 거대한 분자의 억제 특성을 모방할 수 있으며, 천연의 길항제와 동등한 효과로 작용할 수 있는 신규한 소분자일 수 있다(Wrighton, N. C. et al. Nat Biotechnol 15, 1261-1265, 1997).
상기 앱타머(aptamer)는 단일 사슬 DNA 또는 RNA 분자로서, SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 불리는 올리고 뉴클레오티드(oligonucleotide) 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득할 수 있다(C. Tuerand L. Gold, Science 249, 505 - 510, 2005; A. D. Ellington and J. W. Szostak, Nature 346, 818 - 822, 1990; M. Famulok, et. al., Acc. Chem. Res. 33, 591 - 599, 2000; D. S. Wilson and Szostak, Annu. Rev. Biochem. 68, 611 - 647, 1999). 앱타머는 표적에 특이적으로 결합하고 표적의 활성을 조정할 수 있는데, 예컨대, 결합을 통하여 표적의 기능을 차단할 수 있다.
상기 항체는 ASM에 특이적이고 직접적으로 결합하여 ASM의 활성을 효과적으로 억제할 수 있다. 상기 ASM에 특이적으로 결합하는 항체로는 폴리클로날(polyclonal) 항체 또는 모노클로날(monoclonal) 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 ASM에 특이적으로 결합하는 항체는 당업자에게 알려진 공지의 방법으로 제작하여도 무방하며, 상업적으로 알려진 ASM 항체를 구입하여 사용할 수 있다. 상기 항체는 당업자에게 알려진 종래 방법에 따라 면역원인 ASM 단백질을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 랫트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근육 내, 복강 내 또는 피하 주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여할 수 있다. 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 형성된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하여 항체를 분리할 수 있다.
본 발명에 따른 ASM 발현 억제제는 ASM 유전자 또는 ASM의 발현을 촉진하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 짧은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA; shRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상 일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 siRNA는 ASM 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 염기서열 내에서 선택되는 15 내지 30머(mer)의 센스 서열 및 상기 센스 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성되며, 이때, 상기 센스 서열은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 약 25개의 염기로 구성되는 것이 바람직하다.
상기 안티센스 뉴클레오티드는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙-mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합(혼성화)하여 DNA에서 단백질로서 유전정보의 흐름을 방해하는 것이다. 표적 서열에 특이성이 있는 안티센스 뉴클레오티드의 성질은 그것들을 예외적으로 다기능이 되도록 한다. 안티센스 뉴클레오티드는 모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 이들은 표적 RNA 서열에 대해 쉽게 합성될 수 있다. 최근 많은 연구들은 표적 단백질을 연구하기 위한 생화학적 수단으로 안티센스 뉴클레오티드의 유용성을 증명하였다(Rothenberg et al., J. Natl. Cancer Inst., 81:1539-1544, 1999). 올리고뉴클레오티드 화학 및 향상된 세포흡착, 표적결합의 친화도 및 뉴클레아제(nuclease) 내성을 나타내는 뉴클레오티드 합성 분야에서 최근 많은 진보가 있었으므로 안티센스 뉴클레오티드의 사용은 새로운 형태의 억제제로 고려될 수 있다.
본 발명에 따른 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 진행성 핵상마비, 다계통 위축증, 감람핵-뇌교-소뇌 위축증(OPCA), 샤이-드래거 증후군, 선조체-흑질 퇴행증, 헌팅톤병, 근위축성 측색 경화증(ALS), 본태성 진전증, 피질-기저핵 퇴행증, 미만성 루이 소체 질환, 파킨스-ALS-치매 복합증, 픽병, 뇌허혈 및 뇌경색을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물은 상기 ASM의 활성 억제제 또는 발현 억제제와 함께 ASM의 발현 또는 활성 억제 효과를 갖는 공지의 유효성분 또는 퇴행성 신경질환의 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1 종 이상 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용) 할 수 있으며, 투여량은 개체의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 투여기간 또는 간격, 배설율, 체질 특이성, 제제의 성질 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 ASM의 발현 또는 활성 억제제의 일일 투여량은 약 0.001~1000 mg/kg, 바람직하게는 약 0.1~500 mg/kg이나, 임상실험결과에 따라 가감될 수 있으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학적 조성물은 투여를 위하여 여러 가지 제제로 제형화될 수 있다. 본 발명에 포함될 수 있는 부형제는 비독성이고 불활성인 약제학적으로 적합한 고상, 준고상 또는 액상의 모든 유형의 제형 보조물로서, 예를 들면, 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 분산제, 계면활성제 또는 희석제 등을 들 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 정제, 피복 정제, 캡슐제, 환제, 과립제, 좌약, 액제, 현탁액제 및 에멀전제, 페이스트제 (pastes), 연고제, 겔제, 크림제, 로션제, 산제 또는 분무제로 제형화될 수 있다.
본 발명의 조성물은 퇴행성 신경질환의 개선을 위한 건강기능식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 ASM의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 유효성분을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시 본 발명의 유효성분은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 g당 일반적으로 약 0.01~0.20 g, 바람직하게는 약 0.04~0.10 g이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01~0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 상기 조성물의 치료적 유효량을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는, 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
상기 치료적 유효량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.
또한, 경우에 따라, 본 발명의 조성물과 함께 공지의 퇴행성 신경질환 치료제를 병용 투여하여 퇴행성 신경질환 치료의 효과를 증대시킬 수 있다.
본 발명은 퇴행성 신경질환을 갖는 임의의 포유동물에 적용가능하고, 상기 포유동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.
또한, 본 발명은
1) 생물학적 시료에 후보물질을 처리하는 단계; 및
2) 상기 1) 단계의 생물학적 시료에서 ASM(acid sphingomyelinase)의 mRNA 또는 단백질 발현양의 변화를 측정하는 단계;를 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 1) 단계의 생물학적 시료는 퇴행성 신경질환에 걸린 동물의 혈액, 소변, 타액 또는 조직 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 2) 단계에서 mRNA 발현양의 변화를 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 2) 단계에서 단백질 발현양의 변화를 측정하는 방법은 웨스턴 블롯팅, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] ASM (acid sphingomyelinase) 돌연변이 마우스에서 ASM 억제의 알츠하이머병에 대한 치료 효과 확인
1. ASM 돌연변이 마우스의 제조
알츠하이머병의 실험 동물 모델인 APP/PS1(APP/presenilin) 이중 돌연변이(double mutant) 마우스 및 APP/PS1/ASM+/- 삼중 돌연변이 마우스(ASM의 부분적 유전적 결손)를 이용하여 실험을 수행하였다.
동물 실험은 IACUC(Kyungpook National University Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인을 받아 이루어졌다. C57BL/6 마우스(Charles River, UK)를 바탕으로 APPswe(hAPP695swe) 또는 PS1(presenilin-1M146V)을 과발현시킨 형질전환 마우스 라인을 이용하였다[이하, APP 마우스: APPswe를 과발현하는 마우스, PS1 마우스: presenilin-1M146V를 과발현하는 마우스; GlaxoSmithKline]. ASM+/- 마우스(한 쌍의 ASM 유전자 중 하나만 결손)와 APP/PS1 마우스를 교배시켜 APP/PS1/ASM+/- 마우스를 제조하였다. 그 구체적인 과정을 도 1에 나타내었다.
2. ASM 돌연변이 마우스에서 ASM 농도 수준 확인
9개월령의 야생형(WT) 마우스, APP/PS1 마우스 및 상기 실시예 1-1에서 제조한 APP/PS1/ASM+/- 마우스의 혈청, 뇌 조직 및 섬유아세포에서 ASM의 농도 수준을 측정하였다. 보다 구체적으로, 각 마우스의 혈청, 뇌 조직 및 섬유아세포 시료 3 ㎕를 ASM 활성 완충액과 혼합하여 37 ℃에서 보관하였다. 상기 혼합액에 114 ㎕의 에탄올을 가하여 가수분해 반응을 종료시킨 후, 원심분리하였다. 30 ㎕의 상층액을 유리 바이알에 옮긴 후, 5 ㎕를 UPLC 시스템에 적용시켰다. ASM 농도 수준은 스핑고미엘린 및 세라마이드와 결합된 Bodipy(aminoacetaldehyde)와 비교함으로써 정량화하였다. 상기 스핑고미엘린 및 세라미이드의 추출 및 정량화는 공지된 방법에 따라 시료에서 지질을 추출하고, 상기 건조된 지질 추출물을 25 ㎕의 0.2% Igepal CA-630(Sigma-Aldrich)에 재부유시키고, 각각의 지질의 농도 수준을 UPLC 시스템을 이용하여 정량화함으로써 수행되었다. 그 결과를 도 2(왼쪽: 혈장; 중앙: 뇌 조직; 오른쪽: 섬유아세포)에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, APP/PS1 마우스의 혈장, 뇌 조직 및 섬유아세포에서의 ASM 농도의 수준과 비교하여, APP/PS1/ASM+/- 마우스의 혈장, 뇌 조직 및 섬유아세포에서의 ASM 농도의 수준이 현저히 낮음을 확인하였다.
3. ASM 돌연변이 마우스에서 뇌 조직 내 β-아밀로이드 침착 억제 확인
상기 실시예 1-2에서 확인한 바와 같이, APP/PS1/ASM+/- 마우스에서 ASM 농도 수준의 감소가 알츠하이머병의 병리학적인 측면에서 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 뇌 조직 내 β-아밀로이드 침착 정도를 분석하였다.
먼저, 실시예 1-1에서 제조된 각 마우스의 대뇌피질 및 해마 조직을 분리한 후, 조직 절편을 수득하고 종래 공지된 방법에 따라 티오플라빈 S로 염색하였다. 그 결과를 도 3(대뇌피질) 및 도 4(해마)에 나타내었다.
도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, APP/PS1 마우스의 뇌 조직과 비교하여, APP/PS1/ASM+/- 마우스의 뇌 조직에 침착된 Aβ40 및 Aβ42가 현저히 감소함을 확인하였다.
또한, Aβ42에 대한 항-20G10(마우스, 1:1000) 및 Aβ40에 대한 항-G30(토끼, 1:1000), 항-Iba-1(토끼, 1:500, Wako), 항-GFAP(토끼, 1:500, DAKO) 및 항-활성 카스파제3(토끼, 1:50, Chemicon) 항체를 이용하여 종래 공지된 방법에 따라 면역형광법을 수행하였다. Fluoview SV1000 이미징 소프트웨어(Olympus FV1000, Japan)를 장착한 레이저 스캐닝 공초점 현미경 또는 Olympus BX51 현미경을 이용하여 조직 절편을 관찰하였으며, Metamorph software(Molecular Devices)를 이용하여 총 조직의 넓이에 대한 염색된 부위의 넓이의 퍼센트를 정량화하였다.
또한, 상업적으로 이용가능한 ELISA 키트(Biosource)를 이용하여 β-아밀로이드 침착을 확인하였다. 보다 구체적으로, 각 마우스의 뇌의 반구를 0.02 M의 구아니딘(guanidine)을 포함하는 완충액에서 균질화하였다. 이 후, 제조사의 메뉴얼에 따라, Aβ40 및 Aβ42에 대한 ELISA를 수행하였다.
그 결과를 도 5(면역형광법) 및 도 6(ELISA)에 나타내었다.
도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, APP/PS1 마우스의 뇌 조직과 비교하여, APP/PS1/ASM+/- 마우스의 뇌 조직에 침착된 Aβ40 및 Aβ42가 현저히 감소함을 확인하였다.
4. ASM 돌연변이 마우스에서 학습 및 기억능력 향상 확인
상기 실시예 1-1에서 제조한 APP/PS1/ASM+/- 마우스에서 학습 및 기억능력 향상 효과가 있는지를 확인하기 위하여, 종래 공지된 방법에 따라 MWM(Morris water maze) 테스트를 수행하였다.
보다 구체적으로, 야생형 마우스, APP/PS1/ASM+/- 마우스, ASM+/- 마우스 및 APP/PS1 마우스를 이용하였으며, 10일 동안 하루에 4 번씩 과제를 학습시키고, 11일째 되는 날에 플랫폼을 제거하고, 탐침시험(probe trial)을 수행하였다. 실험 기간 동안의 탈출 시간 및 11일 째 되는 날 표적 플랫폼에서 보내는 시간을 측정하였다. 그 결과를 도 7 및 도 8에 나타내었다.
도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, APP/PS1 마우스는 실험 기간 동안 탈출 시간에 변화가 없고, 표적 플랫폼과 비 표적 플랫폼에서 보내는 시간에도 차이가 없는 등 공간 기억 형성에 장애가 나타남을 확인하였으나, APP/PS1/ASM+/- 마우스는 야생형 마우스와 유사한 수준으로 학습 및 기억능력이 향상됨을 확인하였다.
상기 MWM 테스트 결과를 검증하기 위하여, 종래 공지된 방법에 따라 환경적 맥락 또는 조건자극을 전기쇼크와 연합시켜 학습과 기억을 평가하는 공포 조건화 (fear conditioning) 테스트를 수행하였다.
보다 구체적으로, 야생형 마우스, APP/PS1/ASM+/- 마우스, ASM+/- 마우스 및 APP/PS1 마우스를 이용하였으며, 실험 첫째 날, 각 마우스를 개별적으로 조건화 챔버에 위치시킨 후 60 초간의 탐험 시간이 지나고, 10 초간 소리자극(tone, 10 kHz, 70 dB)을 주었다. 이를 조건 자극(conditioned stimulus, CS)이라고 하였다. CS는 무조건 자극(unconditioned stimulus, US)인 전기적인 발바닥 쇼크(0.3 mA, 1 s)와 함께 종결되었다. CS-US는 짝지어 20초 간격으로 2회 시행되었다. 실험 둘째 날, 각 마우스를 CS 또는 발바닥 쇼크의 집행이 없는 공포-조건화 챔버에 다시 위치시킨 후, 5분간 동결반응(freezing response)을 관찰하였다. 실험 셋째 날, 각 마우스를 조건화 챔버와는 다른 실험 챔버에 위치시킨 후 60 초간의 탐험 시간이 지나고, 발바닥 쇼크 없이 60초간 소리 자극을 주었다. 공포에 대한 기억을 측정하기 위하여 동결 반응을 측정하였다. 그 결과를 도 9 및 도 10에 나타내었다.
도 9 및 도 10에 나타낸 바와 같이, APP/PS1/ASM+/- 마우스는 APP/PS1 마우스에 비해 기억능력이 향상됨을 확인하였다.
[실시예 2] ASM (acid sphingomyelinase) 돌연변이 마우스에서 ASM 억제가 자가포식작용(autophagy)에 미치는 영향 확인
1. ASM 억제에 의한 자가포식작용 관련 유전자 발현 확인
유전적인 ASM 억제가 알츠하이머병의 자가포식작용 관련 경로에서 어떻게 작용하는지 확인하기 위하여, 9개월령의 야생형 마우스, APP/PS1 마우스 및 상기 실시예 1-1에서 제조한 APP/PS1/ASM+/- 마우스의 꼬리 섬유아세포 및 뇌 조직 시료를 분석하였다.
보다 구체적으로, LC3 (rabbit, 1:1000, Cell Signaling Technologies, 4108S) Beclin-1 (rabbit, 1:1000, Cell Signaling Technologies, 3738S), p62 (rabbit, 1:1000, Cell Signaling Technologies, 5114S), cathepsin D (goat, 1:500, R&D Systems, BAF1029) 및 β-actin (1:1000, Santa Cruz, SC-1615) 항체를 이용하여 종래 공지된 방법에 따라 웨스턴 블롯팅을 수행하였으며, ImageJ 소프트웨어(US National Institutes of Health)를 이용하여 밀도 정량화(densitometric quantification)를 수행하였다. 그 결과를 도 11 내지 도 14에 나타내었다.
도 11 내지 도 14에 나타낸 바와 같이, WT 마우스와 비교하여, APP/PS1 마우스에서 LC3-Ⅰ에서 LC3-Ⅱ로의 전환이 증가함을 확인하였고, APP/PS1/ASM+/- 마우스에서 증가된 LC3-Ⅱ의 발현이 감소함을 확인하였다. 베클린-1의 발현에는 각 군간 유의한 차이가 나타나지 않았다. 또한, 자가포식작용 턴오버(turnover)의 지표인 카텝신 D(lysosomal hydrolase) 및 p62의 발현은 알츠하이머 환자에서 증가하여 알츠하이머와 병리학적으로 관련이 있는데, WT 마우스와 비교하여, APP/PS1 마우스에서 카텝신 D 및 p62의 발현이 증가함을 확인하였고, APP/PS1/ASM+/- 마우스에서 상기 증가된 카텝신 D 및 p62의 발현이 감소함을 확인하였다.
2. ASM 억제에 의한 단백질 분해 활성 평가
9개월령의 야생형 마우스, APP/PS1 마우스 및 상기 실시예 1-1에서 제조한 APP/PS1/ASM+/- 마우스의 꼬리 섬유아세포에서 단백질 분해 활성을 확인하였다.
수명이 긴 단백질(long-lived protein)을 표지시키기 위하여 48시간 동안 [3H]-류신(leucine; 2μCi/ml)을 이용하여 펄스를 주어 펄스-채이스 실험(Pulse-chase experiment)을 수행하였다. 표지화된 세포를 세척하고, 이를 자가포식작용이 억제되는 환경의 완전 배지(complete medium) 또는 자가포식작용이 유도되는 혈청(serum)이 결핍된 배지에서 배양하였다. 배지의 분취량 (Aliquots)을 서로 다른 시점에서 수거하여 10% TCA로 침전시킨 후, 0.22 μm의 구멍을 갖는 막에서 여과하였고, 방사성 활성을 측정하여 단백질 분해 활성을 분석하였다. 그 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 자가포식작용(혈청이 결핍된 배지에서 배양)이 유도되면, WT 마우스에서 유래한 세포에 비하여, APP/PS1/ASM+/- 마우스로부터 유래한 세포에서 단백질 분해가 높아짐을 확인하였다.
3. 투과전자현미경(TEM)을 이용한 마우스 뇌 조직 분석
9개월령의 야생형 마우스, APP/PS1 마우스 및 상기 실시예 1-1에서 제조한 APP/PS1/ASM+/- 마우스의 뇌 조직을 3%의 글루타르알데히드(glutaraldehyde)가 포함된 0.1M, pH 7.4의 인산염 완충액으로 고정시킨 후, 오스뮴 테트록사이드(osmium tetroxide)를 포함하는 Sorensen`s 인산염 완충액에서 추가적으로 고정하였다. 상기 조직을 에틸 알코올로 탈수시킨 후, Epon(Electron Microscopy Sciences)에 끼어넣었다(embbeded). 상기 조직을 순차적으로 자른 후, 투과전자현미경(Transmission Electron Microscope; Tecnai)을 이용하여 분석하였다. 디지털 카메라 및 Xplore3D tomography 소프트웨어를 이용하여 이미지를 수득하였다. 그 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타낸 바와 같이, APP/PS1 마우스의 뇌 조직에서 자가포식액포(autophagic vacuole; AV)의 크기 및 수가 증가됨을 확인하였고, APP/PS1/ASM+/- 마우스의 뇌 조직에서는 WT 마우스보다는 다소 증가된 크기 및 수의 액포가 관찰되었으나, APP/PS1 마우스보다는 작은 크기 및 적은 수의 액포가 관찰됨을 확인하였다.
[실시예 3] 인간 세포에서 ASM 억제의 자가포식작용(autophagy)에 대한 영향 확인
1. 인간의 섬유아세포에서 재조합 ASM 단백질에 의한 자가포식작용 관련 유전자 발현 변화 확인
인간 섬유아세포주는 Coriell Institute에서 수득하였으며, 15% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 37℃ 및 5%의 CO2에서 배양하였다. 상기 세포주에 재조합 ASM(1 μM 내지 10 μM)을 처리한 후, 실시예 2-1과 같은 방법으로 웨스턴 블롯팅 및 밀도 정량화를 수행하였다. 그 결과를 도 17 및 도 18에 나타내었다.
도 17 및 도 18에 나타낸 바와 같이, 재조합 ASM의 처리 농도에 의존적으로 LC3-Ⅰ에서 LC3-Ⅱ로의 전환이 진행됨을 확인하였으며, 베클린-1의 발현에는 유의한 변화가 없음을 확인하였다.
2. M6P(mannose-6-phosphate)를 이용한 ASM의 작용 기전 확인
ASM이 어떠한 경로를 통하여 자가포식작용에 영향을 주는지 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 인간 섬유아세포에 ASM을 단독으로 처리하거나, 단백질을 리소좀에 위치시키는 작용과 관련 있는 M6P(mannose-6-phosphate; 10 mM)의 존재 하에서 처리한 후, 자가포식소체(autophagosome)의 축적을 웨스턴 블롯팅 및 밀도 정량을 이용하여 확인하였다. 그 결과를 도 19에 나타내었다.
도 19에 나타낸 바와 같이, M6P를 이용하여 리소좀 ASM의 흡수를 억제하는 경우, LC3-Ⅱ로의 전환이 감소하여 ASM-유도 자가포식소체의 축적이 감소됨을 확인하였다.
ASM이 자가포식소체의 형성 속도를 증가시키는 것인지, 자가포식소체의 분해 속도를 감소시키는 것인지 확인하기 위하여, autophagic flux assay를 수행하였다. 보다 구체적으로, 자가포식소체의 분해를 억제하지만, 자가포식소체의 형성에는 영향을 주지 않는 NH4Cl의 존재 또는 비 존재하의 세포에서 LC3-Ⅰ에서 LC3-Ⅱ로의 전환 비율을 웨스턴 블롯팅을 이용하여 측정하였다. 그 결과를 도 20에 나타내었다.
도 20에 나타낸 바와 같이, 세포에 ASM 및 NH4Cl를 처리하는 경우에 LC3-Ⅱ의 양에 유의적인 변화가 없음을 확인하였다.
또한, 혈청이 없는 배지 또는 완전 배지에서 키운 알츠하이머병에 걸린 인간 섬유아세포를 배양한 후, NH4Cl또는 ASM을 처리한 경우에 LC3-Ⅰ에서 LC3-Ⅱ로의 전환 비율을 웨스턴 블롯팅을 이용하여 측정하였다. 그 결과를 도 21 및 도 22에 나타내었다.
도 21에 나타낸 바와 같이, 혈청이 없는 배지에서 세포를 배양하여 자가포식작용을 유도한 후, NH4Cl를 가하면 LC3-Ⅱ의 수준이 유의적으로 증가함을 확인하였으며, 도 22에 나타낸 바와 같이, 혈청 없는 배지에서 세포를 배양하여 자가포식작용을 유도한 후, ASM을 처리하는 경우, LC3-Ⅱ의 축적이 유의적으로 증가함을 확인하였다.
이러한 실험 결과를 통하여, 알츠하이머병에서 ASM이 자가포식소체의 형성을 유발하는 것이 아니라, 자가포식소체의 단백질 분해를 억제함을 확인하였다.
[실시예 4] 알츠하이머병 모델 마우스에서 ASM 억제의 병리학적인 개선 효과 검증
1. APP/PS1 마우스에 AMI 투여 후 알츠하이머병 치료 효과 검증
알츠하이머병 모델 마우스인 APP/PS1 마우스에 ASM의 알려진 억제제이며, BBB를 통과할 수 있다고 알려진 AMI(amitriptyline-hydrochloride)를 4개월간 투여한 후, WM(water maze) 테스트를 수행하였다(도 23). 마우스가 9개월령이 되었을 때 혈청 및 뇌 조직을 수득하여 ASM의 발현 정도를 측정하였으며(실시예 1-2와 동일한 방법), 뇌 조직 내 β-아밀로이드의 침착 정도를 측정하였다(실시예 1-3과 동일한 방법). 각 실험 결과를 도 24 내지 26에 나타내었다.
도 24에 나타낸 바와 같이, AMI의 투여를 통해 마우스의 혈청 및 뇌 조직에서 ASM이 감소되었음을 확인하였으며, 도 25에 나타낸 바와 같이, AMI를 투여한 마우스의 대뇌 피질 및 해마에서 β-아밀로이드 침착 정도가 억제됨을 확인하였다. 또한, 도 26에 나타낸 바와 같이, AMI를 투여한 마우스가 대조군에 비해 탈출 시간(escape latency)이 감소하여 기억력이 회복됨을 확인하였다.
2. 병체 결합 시스템(parabiotic system)을 이용한 알츠하이머병 치료 효과 검증
APP/PS1 마우스의 병체 결합 시스템(parabiotic system)을 이용하여 ASM 억제의 효과를 확인하였다. 보다 구체적으로, 마우스들을 수술적 기법으로 피부 및 연조직을 연결하고 새로운 신생혈관이 두 마우스 사이에 생기게 유도한 후 혈류를 공유하게 하여, 아이소크로닉(isochronic; APP/PS1-APP/PS1: 알츠하이머병 모델 마우스인 APP/PS1 마우스끼리 병체결합), 헤테로크로닉 Ⅰ(heterochronic Ⅰ;APP/PS1-ASM+/-: APP/PS1 마우스와 ASM+/-마우스간의 병체결합), 헤테로크로닉 Ⅱ(heterochronic Ⅱ; APP/PS1-WT: APP/PS1 마우스와 야생형 마우스간의 병체 결합) 마우스를 제조하였다 (도 27). 상기 실시예 4-1과 동일한 방법으로 혈청 및 뇌 조직을 수득하여 ASM의 발현 정도를 측정하였으며, 뇌 조직 내 β-아밀로이드 침착 정도 및 단백질 발현 정도를 측정하였다. 각 실험 결과를 도 28 내지 30에 나타내었다.
도 28에 나타낸 바와 같이, 아이소크로닉(isochronic; APP/PS1-APP/PS1) 및 헤테로크로닉 Ⅱ(APP/PS1-WT) 마우스에 비하여, 헤테로크로닉 Ⅰ(APP/PS1-ASM+/-)마우스의 혈청 및 뇌 조직에서 ASM의 농도가 낮음을 확인하였으며, 이를 통해 ASM+/- 마우스가 ASM의 농도를 낮추는 역할을 함을 확인하였다.
또한, 도 29에 나타낸 바와 같이, 아이소크로닉(APP/PS1-APP/PS1) 마우스에 비하여 헤테로크로닉 Ⅰ(APP/PS1-ASM+/-)마우스의 대뇌 피질 및 해마에서 β-아밀로이드 침착이 현저히 감소함을 확인하였다.
또한, 도 30에 나타낸 바와 같이, 아이소크로닉(APP/PS1-APP/PS1) 마우스에 비하여 헤테로크로닉 Ⅰ(APP/PS1-ASM+/-)마우스의 뇌 조직에서 LC3-Ⅱ로의 전환이 감소하였고, p62 및 카텝신 D의 발현이 감소함을 확인하였으며, ALP 기능과 관련된 단백질인 TFEB 및 Lamp1의 발현이 증가함을 확인하였다.
3. 혈청주입을 이용한 알츠하이머병 치료 효과 검증
APP/PS1 또는 ASM-/- 마우스의 혈청을 APP/PS1 마우스에 주입하였다. 보다 구체적으로, APP/PS1 또는 ASM-/- 마우스의 심장으로부터 혈액을 수득한 후 EDTA로 코팅된 튜브에 수집하였다. 수집된 혈액을 원심분리하여 혈청을 수득하였으며, 혈청 100 μl를 3주 동안 총 8번, 8개월령의 APP/PS1 마우스의 정맥 내에 주입하였다(도 31). 실험 종료 후, 상기 실시예 4-1과 동일한 방법으로 혈청 및 뇌 조직을 수득하여 ASM의 발현 정도를 측정하였으며, 뇌 조직 내 β-아밀로이드 침착 정도 및 단백질 발현 정도를 측정하였다. 또한, 상기 실시예 1-4와 동일한 방법으로 행동 실험을 수행하였다. 각 실험 결과를 도 32 내지 36에 나타내었다.
도 32에 나타낸 바와 같이, APP/PS1 마우스의 혈청을 제공받은 APP/PS1 마우스에 비하여, ASM-/- 마우스의 혈청을 제공받은 APP/PS1 마우스의 혈청 및 뇌 조직에서 ASM이 감소되었음을 확인하였다.
도 33 및 도 34에 나타낸 바와 같이, APP/PS1 마우스의 혈청을 제공받은 APP/PS1 마우스에 비하여, ASM-/- 마우스의 혈청을 제공받은 APP/PS1 마우스의 뇌 조직 내 β-아밀로이드 침착이 감소하였으며(도 33), LC3-Ⅱ로의 전환이 감소하였고, p62 및 카텝신 D의 발현이 감소함을 확인하였다(도 34).
도 35 및 도 36에 나타낸 바와 같이, MWM 및 공포 조건화 테스트 결과, APP/PS1 마우스의 혈청을 제공받은 APP/PS1 마우스에 비하여, ASM-/- 마우스의 혈청을 제공받은 APP/PS1 마우스에서 기억력이 향상됨을 확인하였다.
이하 본 발명의 약학적 조성물 및 식품 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 약학적 제제의 제조
1-1. 산제의 제조
ASM 발현 또는 활성 억제제 2 g
유당 1 g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
1-2. 정제의 제조
ASM 발현 또는 활성 억제제 100 mg
옥수수전분 100 mg
유 당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
1-3. 캡슐제의 제조
ASM 발현 또는 활성 억제제 100 mg
옥수수전분 100 mg
유 당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
제제예 2. 식품 제제의 제조
2-1. 건강식품의 제조
ASM 발현 또는 활성 억제제 100 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 g
비타민 E 1.0 mg
비타민 B1 0.13 mg
비타민 B2 0.15 mg
비타민 B6 0.5 mg
비타민 B12 0.2 g
비타민 C 10 mg
비오틴 10 g
니코틴산아미드 1.7 mg
엽산 50 g
판토텐산 칼슘 0.5 mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 mg
산화아연 0.82 mg
탄산마그네슘 25.3 mg
제1인산칼륨 15 mg
제2인산칼슘 55 mg
구연산칼륨 90 mg
탄산칼슘 100 mg
염화마그네슘 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

Claims (10)

  1. ASM(acid sphingomyelinase)의 활성 억제제 또는 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 ASM 활성 억제제는 ASM 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드모방체, 기질유사체, 앱타머, 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 ASM 발현 억제제는, ASM 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA, shRNA 및 리보자임으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 진행성 핵상마비, 다계통 위축증, 감람핵-뇌교-소뇌 위축증(OPCA), 샤이-드래거 증후군, 선조체-흑질 퇴행증, 헌팅톤병, 근위축성 측색 경화증(ALS), 본태성 진전증, 피질-기저핵 퇴행증, 미만성 루이 소체 질환, 파킨스-ALS-치매 복합증, 픽병, 뇌허혈 및 뇌경색으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. ASM(acid sphingomyelinase)의 활성 억제제 또는 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  6. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 치료적 유효량을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는, 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료방법.
  7. 1) 생물학적 시료에 후보물질을 처리하는 단계; 및
    2) 상기 1) 단계의 생물학적 시료에서 ASM(acid sphingomyelinase)의 mRNA 또는 단백질 발현양 변화를 측정하는 단계;를 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료물질의 스크리닝 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 1) 단계의 생물학적 시료는 퇴행성 신경질환에 걸린 동물의 혈액, 소변, 타액 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료물질의 스크리닝 방법.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 2) 단계에서 mRNA 발현양 변화는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 방법을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는, 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료물질의 스크리닝 방법.
  10. 제 7항에 있어서, 상기 2) 단계에서 단백질 발현양 변화는 웨스턴 블롯팅, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는, 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료물질의 스크리닝 방법.
PCT/KR2014/004025 2013-05-07 2014-05-07 Ａｓｍ 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물 WO2014182051A1 (ko)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/889,293 US10098855B2 (en) 2013-05-07 2014-05-07 Composition comprising ASM inhibitor as active ingredient for preventing or treating degenerative neurological disorders
US15/994,934 US10682373B2 (en) 2013-05-07 2018-05-31 Method for treating a degenerative neurological disorders comprising administering ASM inhibitor
US16/863,942 US11242529B2 (en) 2013-05-07 2020-04-30 Method for treating a neurological disorder comprising administering ASM inhibitors
US17/562,774 US20220135703A1 (en) 2013-05-07 2021-12-27 Method for treating a degenerative neurological disorders comprising administering asm inhibitor

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130051279A KR101521117B1 (ko) 2013-05-07 2013-05-07 Ａｓｍ 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR10-2013-0051279 2013-05-07

Related Child Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US14/889,293 A-371-Of-International US10098855B2 (en) 2013-05-07 2014-05-07 Composition comprising ASM inhibitor as active ingredient for preventing or treating degenerative neurological disorders
US14889293 A-371-Of-International 2015-11-05
US15/994,934 Continuation-In-Part US10682373B2 (en) 2013-05-07 2018-05-31 Method for treating a degenerative neurological disorders comprising administering ASM inhibitor

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014182051A1 true WO2014182051A1 (ko) 2014-11-13

Family

ID=51867466

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2014/004025 WO2014182051A1 (ko) 2013-05-07 2014-05-07 Ａｓｍ 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물

Country Status (3)

Country Link
US (2) US10098855B2 (ko)
KR (1) KR101521117B1 (ko)
WO (1) WO2014182051A1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11466305B2 (en) * 2016-11-22 2022-10-11 Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation Amyotrophic lateral sclerosis diagnostic composition using acid sphingomyelinase, and method for detecting diagnostic markers
TWI824534B (zh) * 2021-05-27 2023-12-01 南韓商梨樹愛博思股份有限公司 與酸性鞘磷脂酶蛋白特異性結合的抗體

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180036318A (ko) 2016-09-30 2018-04-09 경북대학교 산학협력단 2-아미노-2-(1-도데실-1h-1,2,3-트리아졸-4-일)프로판-1,3-디올 유도체를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 및 우울증 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR101811436B1 (ko) 2017-04-28 2017-12-21 경북대학교 산학협력단 신규 화합물 2-아미노-2-(1-(2-(2-히드록시에톡시)에틸)-1h-1,2,3-트리아졸-4-일)프로판-1,3-디올 유도체 및 이의 용도
WO2019182191A1 (ko) 2018-03-21 2019-09-26 경북대학교 산학협력단 C0x2 아세틸화제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR102017324B1 (ko) 2018-04-30 2019-09-02 경북대학교 산학협력단 신규한 asm 활성 직접 억제 화합물 2-아미노-2-(1,2,3-트리아졸-4-일)프로판-1,3-디올 유도체 및 이의 용도
KR20220160483A (ko) 2021-05-27 2022-12-06 주식회사 이수앱지스 Asm 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 뇌질환 치료용 약학적 조성물
KR20220160474A (ko) 2021-05-27 2022-12-06 주식회사 이수앱지스 Asm 단백질에 특이적으로 결합하는 항체
CA3219114A1 (en) 2021-05-27 2022-12-01 Seung Beom Hong Pharmaceutical composition for treating brain diseases comprising antibody specifically binding to asm protein as active ingredient
WO2023043257A1 (ko) * 2021-09-16 2023-03-23 경북대학교 산학협력단 Smpd1 조절제를 유효성분으로 함유하는 골관절염 예방 또는 치료용 약학 조성물

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20010045120A (ko) * 1999-11-03 2001-06-05 남창우 소 뇌 유래의 막결합 중성형 스핑고마이엘리네이즈, 이의정제 방법 및 이에 대한 모노클로날 항체
KR101214198B1 (ko) * 2010-09-01 2012-12-21 서울대학교산학협력단 파이토스핑고신 유도체를 유효성분으로 함유하는 뇌질환 치료 또는 예방용 약학조성물

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100565437B1 (ko) * 2003-07-31 2006-03-30 중앙대학교 산학협력단 신규한 스핑고마이엘리나제 효소, 그에 대한 항체, 안티센스 및 제조방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20010045120A (ko) * 1999-11-03 2001-06-05 남창우 소 뇌 유래의 막결합 중성형 스핑고마이엘리네이즈, 이의정제 방법 및 이에 대한 모노클로날 항체
KR101214198B1 (ko) * 2010-09-01 2012-12-21 서울대학교산학협력단 파이토스핑고신 유도체를 유효성분으로 함유하는 뇌질환 치료 또는 예방용 약학조성물

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11466305B2 (en) * 2016-11-22 2022-10-11 Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation Amyotrophic lateral sclerosis diagnostic composition using acid sphingomyelinase, and method for detecting diagnostic markers
TWI824534B (zh) * 2021-05-27 2023-12-01 南韓商梨樹愛博思股份有限公司 與酸性鞘磷脂酶蛋白特異性結合的抗體

Also Published As

Publication number Publication date
KR101521117B1 (ko) 2015-05-18
KR20140132147A (ko) 2014-11-17
US10098855B2 (en) 2018-10-16
US10682373B2 (en) 2020-06-16
US20180264027A1 (en) 2018-09-20
US20160101070A1 (en) 2016-04-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2014182051A1 (ko) Ａｓｍ 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물
Hu et al. Glial-derived proteins activate cultured astrocytes and enhance beta amyloid-induced glial activation
WO2016140527A1 (ko) 오스모틴 펩티드를 유효성분으로 함유하는 신경질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
KR20190110938A (ko) Cox2 아세틸화제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2017014502A1 (ko) 해당화 꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 il-6 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
US11242529B2 (en) Method for treating a neurological disorder comprising administering ASM inhibitors
WO2009093864A2 (ko) 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물
US20220135703A1 (en) Method for treating a degenerative neurological disorders comprising administering asm inhibitor
WO2021246755A1 (ko) 포스포리파아제 d2 억제제를 포함하는 대사성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
WO2018190608A1 (ko) 사포그릴레이트를 유효성분으로 포함하는 감각신경성 난청의 예방 또는 치료용 조성물
WO2022114906A1 (ko) 신규 퇴행성 신경질환 치료용 약학적 조성물
WO2010058517A1 (ja) ＩｇＧおよび／またはＩｇＧのＦｃ断片を含む神経細胞刺激剤
WO2021002664A1 (ko) 암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
WO2020247918A1 (en) Production and use of extracellular vesicle-contained enampt
WO2018135738A1 (ko) 매트릭스 gla 단백질을 유효성분으로 함유하는 미오스타틴 활성 저해용 조성물
WO2015108372A1 (ko) 오스모틴을 포함하는 흥분독성 또는 시냅스 기능 장애에 의한 신경 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 및 이를 이용한 신경 질환의 예방 또는 치료 방법
KR20180004242A (ko) 알쯔하이머병의 치료를 위한 뉴런 저장소-작동된 칼슘 진입 경로의 활성화
WO2020213982A1 (ko) Cd9을 이용한 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물과 퇴행성 신경질환 치료제 스크리닝 방법
WO2019078381A1 (ko) 엔테로코커스 패칼리스, 이의 배양액 또는 이의 사균체를 유효성분으로 함유하는 근육감퇴, 약화 및 근위축 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물, 식품 조성물 및 식품첨가제
WO2017014545A1 (ko) 멜라닌 응집 호르몬을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 치료 및 레보도파 부작용 억제용 약학 조성물
WO2022203395A1 (ko) 신규한 화합물 및 이를 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물
WO2023140505A1 (ko) 할로푸지논을 유효성분으로 함유하는 신경퇴행성 또는 운동신경 질환 예방 또는 치료용 조성물
WO2024090800A1 (ko) 리포칼린 2 억제제를 포함하는 간섬유화 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2023096233A1 (ko) 신규 펩티드 및 이의 용도
WO2023096232A1 (ko) 신규 펩티드 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14795213

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14889293

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 14795213

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1