KR20220160483A - Asm 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 뇌질환 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 ASM(acid sphingomyelinase) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ASM 단백질에 특이적으로 높은 결합력으로 결합하고, 세포막에 존재하는 ASM 단백질의 활성을 유의적으로 억제하며, 알츠하이머 동물 모델에서 독성을 나타내지 않으면서 인지 기억력 개선 효과, ASM 단백질 활성 억제 효과, 아밀로이드-β 및 타우 단백질 축적 억제 효과, 및 신경염증 생성 억제 효과를 나타냄으로써, 뇌질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ASM 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 뇌질환 치료용 약학적 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING OF BRAIN DIEASES COMPRISING ANTIBODIES SPECIFICALLY BINDING TO ASM PROTEIN}
본 발명은 ASM(acid sphingomyelinase) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 용도에 관한 것이다.
스핑고지질 대사는 정상적인 세포 신호전달을 조절하며, 스핑고지질 대사의 비정상적 변화는 알츠하이머 질환을 포함하는 다양한 신경퇴행성 질환에 영향을 미친다. 스핑고지질 대사를 조절하는 효소인 ASM(acid sphingomyelinase) 단백질은 거의 모든 종류의 세포에서 발현되는 단백질로서, 스핑고지질 대사 및 세포막 턴오버(turnover)에 중요한 역할을 한다.
알츠하이머 질환과 같은 신경퇴행성 질환 환자의 뇌에서는 정상인에 비해 ASM 단백질의 활성이 현저히 증가되어 있다. 이와 관련하여, 대한민국 특허등록 제10-1521117호는 과발현된 ASM 단백질의 활성을 저해하거나, ASM 단백질로의 발현을 억제하면 β-아밀로이드의 축적이 억제되고 학습능력 및 기억력이 개선되어 신경퇴행성 질환을 치료할 수 있음을 개시하고 있다. 또한, 최근 우울증과 같은 신경 질환에서도 ASM 단백질의 활성이 증가되어 있어, 상기 ASM 단백질의 발현 또는 활성을 억제하여 우울증을 개선하는 효과가 있음이 알려졌다.
그러나 ASM 단백질의 발현 또는 활성을 직접 억제하는 물질은 개발되지 않았으며, 다만, ASM 단백질의 발현을 간접적으로 억제하는 몇 종류의 억제제가 동정되었다. 예를 들어, 우울증의 치료에 사용되고 있는 삼환계 항우울제(tricyclic antidepressant)가 있으며, 여기에는 아미트리프틸린(amitriptyline), 데시프라민(desipramine), 미프라민(mipramine) 등이 포함된다. 이들 삼환계 항우울제는 ASM 단백질 억제제로서 개발된 것은 아니나, 다양한 연구결과에 의해 ASM 단백질 억제 효과를 나타내는 것이 증명되었다. 삼환계 항우울제의 주요 약리기전은 신경세포에서 신경전달물질의 재흡수를 억제하여 이들의 활성을 증가시키는 것이며, ASM 억제제로서의 작용은 부수적인 작용으로 확인되었다. 그러나, 삼환계 항우울제는 신경계 및 신경세표에 작용하여 몽롱함, 빛 감수성 증가, 구토 등의 부작용을 유발할 수 있다.
대한민국 특허등록 제10-1521117호
본 발명의 목적은 ASM 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ASM(acid sphingomyelinase) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 ASM 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ASM 단백질에 특이적으로 높은 결합력으로 결합하고, 세포막에 존재하는 ASM 단백질의 활성을 유의적으로 억제하며, 알츠하이머 동물 모델에서 독성을 나타내지 않으면서 인지 기억력 개선 효과, ASM 단백질 활성 억제 효과, 아밀로이드-β 및 타우 단백질 축적 억제 효과, 및 신경염증 생성 억제 효과를 나타냄으로써, 뇌질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역 아미노산 서열을 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 제조된 항체의 ASM 단백질과의 결합을 ELISA 분석 방법으로 확인한 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 항체의 ASM 단백질 구조 모델에 결합 위치를 표시한 모식도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 제조된 항체의 ASM 단백질 사포신(saposin) 도메인에 대한 중수소 치환율을 히트맵으로 나타낸 결과 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 제조된 항체의 알츠하이머 환자 세포막에 위치하는 ASM 단백질의 활성 억제를 확인한 결과 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 항체가 알츠하이머 환자 세포막에 위치하는 ASM 단백질의 활성을 농도 의존적으로 억제하는 것을 확인한 결과 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 항체의 알츠하이머 환자 세포막에서 스핑고미엘린의 대사 변화를 확인한 결과 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 항체를 알츠하이머 동물 모델에 투여하는 것을 나타내는 모식도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에서 제조된 항체를 투여한 알츠하이머 동물 모델의 수중 미로 실험을 수행한 결과 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 항체를 투여한 알츠하이머 동물 모델의 수영 경로를 확인한 결과 도면이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 항체를 투여한 알츠하이머 동물 모델이 표적(A0) 또는 비-표적(A1, A2, A3) 사분면에 머무르는 시간을 확인한 결과 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에서 제조된 항체를 투여한 알츠하이머 동물 모델의 수영 거리(A), 수영 속도(B) 및 플랫폼이 있던 위치를 지나가는 횟수(C)를 확인한 결과 그래프이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 항체를 투여한 알츠하이머 동물 모델의 상황(A) 또는 분위기(B)에 따른 공포 조건 테스트를 수행한 결과 그래프이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에서 제조된 항체를 투여한 알츠하이머 동물 모델의 혈액 플라즈마에서 ASM의 활성 억제를 확인한 결과 그래프이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에서 제조된 항체를 투여한 알츠하이머 동물 모델의 혈액 플라즈마에서 ASM 단백질의 수준을 확인한 결과 그래프이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 항체를 투여한 알츠하이머 동물 모델의 뇌 피질 또는 해마에서 고밀도(dense-core) 아밀로이드-β 플라크의 발현을 확인한 결과이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 항체를 투여한 알츠하이머 동물 모델의 뇌 피질 또는 해마에서 고밀도 및 확산형(diffuse) 아밀로이드-β 플라크의 발현을 확인한 결과이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 항체를 투여한 알츠하이머 동물 모델의 뇌 피질 또는 해마에서 아밀로이드-β40 또는 아밀로이드-β42의 발현을 확인한 결과 그래프이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에서 제조된 항체를 투여한 알츠하이머 동물 모델의 뇌 피질 또는 해마에서 타우 단백질의 발현을 확인한 결과이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 항체를 투여한 알츠하이머 동물 모델의 뇌 피질 또는 해마에서 lba-1 단백질의 발현을 확인한 결과이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 항체를 투여한 알츠하이머 동물 모델의 뇌 피질 또는 해마에서 GFAP 단백질의 발현을 확인한 결과이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에서 제조된 항체를 투여한 알츠하이머 동물 모델의 생존율(A) 및 체중 변화(B)를 확인한 결과 그래프이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 항체를 투여한 알츠하이머 동물 모델의 장기독성을 확인한 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 ASM(acid sphingomyelinase) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, 'ASM(acid sphingomyelinase) 단백질'은 스핑고지질 대사를 조절하는 SMase(sphingomyelinase) 패밀리 중 하나인 효소를 의미한다. 상기 ASM 단백질은 스핑고미엘린(sphingomyelin)을 세라마이드(ceramide) 및 포스포릴콜린(phosphorylcholine)으로 분해하는 과정을 촉매하며, 최적의 효소 활성을 나타내는 pH에 따라 알칼리성, 중성 또는 산성으로 구분할 수 있다.
상기 ASM 단백질은 통상의 기술분야에 알려진 모든 종류의 ASM 단백질을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 ASM 단백질은 포유동물 유래일 수 있고, 더욱 구체적으로는 인간, 원숭이, 랫트 또는 마우스 유래일 수 있다. 또한, 상기 ASM 단백질은 통상의 기술분야에 ASM 단백질로 알려진 모든 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일례로, 상기 ASM 단백질은 서열번호 66 및 67로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드 또는 이를 암호화하는 핵산일 수 있다.
상기 ASM 단백질은 이와 동일하거나 이에 상응하는 생물학적 활성을 유지하는 한, 서열번호 66 또는 67로 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 첨가, 결실 또는 치환된 것일 수 있다. 이때, 아미노산의 치환은 전체 단백질의 전하, 즉, 극성 또는 소수성에 영향을 주지 않거나 약하게 주는 범위 내에서 수행되는 보존적 치환일 수 있다. 또한, 상기 ASM 단백질은 서열번호 66 및 67로 각각 기재된 아미노산 서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다. 또한, 상기 ASM 단백질은 이와 동일하거나 이에 상응하는 생물학적 활성을 유지하는 한, ASM 단백질의 일부만을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, '항체(antibody)'는 항원과 결합하여 항원의 작용을 방해하거나, 항원을 제거하는 면역 단백질을 의미한다. 상기 항체는 통상의 기술분야에 포함되는 모든 종류의 항체를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE를 포함할 수 있으며, 이들 각각은 중쇄 불변영역을 암호화하는 유전자인 μ, δ, γ, α 및 ε으로부터 만들어진 중쇄를 포함할 수 있다. 통상적으로 항체기술에서는 주로 IgG가 사용되는데, 이는 다시 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 동종(isotype)으로 구성되며, 이들 각각의 구조 및 기능적 특성은 상이할 수 있다. 상기 항체는 비-인간 항체로부터 유래된 최소 서열을 포함하는 인간화 항체, 인간으로부터 유래된 서열로 구성된 인간 항체, 또는 서로 다른 종으로부터 유래된 서열이 혼합된 키메라 항체를 모두 포함할 수 있다.
상기 IgG는 약 50 kDa의 중쇄(heavy chain) 단백질 2개와 약 25 kDa의 경쇄(light chain) 단백질 2개로 만들어진 Y자 모양의 매우 안정된 구조(약 150 kDa)를 형성할 수 있다. 항체를 구성하는 경쇄 및 중쇄는 항체 사이에서 아미노산 서열이 다른 가변영역(variable region) 및 아미노산 서열이 같은 불변영역(constant region)으로 나뉠 수 있다. 이때, 중쇄 불변영역은 CH1, 힌지(hinge, H), CH2 및 CH3 도메인을 포함하며, 각 도메인은 두 개의 β-시트(β-sheet)로 구성되고, 분자 내 이황화결합(disulfide bond)으로 연결될 수 있다. 또한, 경쇄 불변영역은 CL 도메인을 포함할 수 있다. 한편, 중쇄 및 경쇄의 가변영역 두 개가 합쳐져 항원 결합 부위(antigen binding site)가 형성되며, 상기 항원 결합 부위는 Y자 모양의 두 개의 팔에 각각 한 개씩 존재할 수 있다. 전장의 항체에서 항원과 결합할 수 있는 부분을 Fab(antibody binding fragment), 항원과 결합하지 못하는 부분을 Fc(crystallizable fragment)라고 하며, Fab 및 Fc는 힌지로 연결될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 IgG는 마우스 유래의 IgG일 수 있고, 구체적으로 서열번호 74로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 마우스 IgG 중쇄 불변 영역 및 서열번호 서열번호 76으로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 마우스 경쇄 λ 불변 영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 마우스 유래의 IgG는 서열번호 75로 기재된 염기서열로 구성되는 마우스 IgG 중쇄 불변 영역 및 서열번호 77로 기재된 염기서열로 구성되는 마우스 경쇄 λ 불변 영역을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 전장의 항체뿐 아니라 이의 항원 결합 단편을 모두 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항원 결합 단편은 항원과의 결합 자극을 세포나 보체 등에 전달하는 기능을 하는 Fc를 제외한 부분을 의미할 수 있다. 일례로, 항체의 항원 결합 단편은 Fab, scFv, F(ab)2 및 Fv를 모두 포함할 수 있고, 단일 도메인 항체(single domain antibody)나 소형 항체(minibody) 등과 같은 3세대 항체 절편도 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 ASM 단백질의 N-말단으로부터 53 내지 72번째 아미노산 단편, 101 내지 123번째 아미노산 단편, 135 내지 159번째 아미노산 단편, 135 내지 155번째 아미노산 단편, 218 내지 228번째 아미노산 단편 또는 259 내지 269번째 아미노산 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 에피토프에 결합할 수 있다. 이때, 상기 ASM 단백질은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 ASM 단백질의 N-말단으로부터 53 내지 72번째 아미노산 단편은 서열번호 68(TAINLGLKKEPNVARVGSVA)로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드일 수 있고, 101 내지 123번째 아미노산 단편은 서열번호 69(VWRRSVLSPSEACGLLLGSTCGH)로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드일 수 있으며, 135 내지 159번째 아미노산 단편은 서열번호 70(PTVPKPPPKPPSPPAPGAPVSRILF)으로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드일 수 있고, 135 내지 155번째 아미노산 단편은 서열번호 71(PTVPKPPPKPPSPPAPGAPVS)로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드일 수 있으며, 218 내지 228번째 아미노산 단편은 서열번호 72(SGLGPAGPFDM)로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드일 수 있고, 259 내지 269번째 아미노산 단편은 서열번호 73(VRKFLGPVPVY)으로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드일 수 있다. 즉, 본 발명의 다른 측면에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 68 내지 73으로 각각 기재된 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 에피토프에 결합할 수 있다.
상기 용어, "에피토프(epitope)"는 항체가 항원을 식별할 수 있는 특정 부위로서, 항원이 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정부위를 의미한다. 상기 에피토프는 항원결합부위(paratope) 또는 항원결정부위(antigenic determinant) 등의 용어와 동일한 의미로 통용된다. 상기 에피토프는 화학적으로 활성을 갖는 표면 분자군, 예를 들어 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되며, 일반적으로 특정한 3차원의 구조적 특징뿐 아니라 특정한 전하 특성을 갖는다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 61로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 CDR1(X1YX2MS), 서열번호 62로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 CDR2(X3IX4X5X6X7X8X9X10YYADSVKG), 및 서열번호 27, 30, 33, 36, 39 및 42로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 63으로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 CDR1(X11GSSSNIGX12NX13VX14), 서열번호 64로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 CDR2(X15X16X17X18RPS), 및 서열번호 65로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 CDR3(X19X20WDX21SLX22X23YV)을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
상기 용어, 'CDR(complementarity determining region)'은 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역 내에 항체마다 다른 아미노산 서열을 갖는 부위인 초가변영역(hypervariable region)으로, 실제로 항원과 결합하는 부위를 의미한다. 항체의 입체구조에서 CDR은 고리(loop) 모양으로 항체의 표면에 위치하고, 고리 아래에는 이를 구조적으로 지지해주는 FR(framework region)이 존재할 수 있다. 중쇄 및 경쇄는 모두 각각 세 개씩 고리 구조가 존재하며, 이들 여섯 개의 고리 구조가 합쳐져서 항원과 직접 접촉할 수 있다. 상기 여섯 개의 고리 구조를 갖는 항원 결합 부위인 CDR을 각각 편의상 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 또는 경쇄 CDR3로 지칭할 수 있다.
일례로, 상기 서열번호 61로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 CDR1(X1YX2MS)에서 X1 및 X2는 각각 산성 및 중성 아미노산에서 선택될 수 있다. 구체적으로, 상기 X1은 산성 또는 중성 아미노산일 수 있고, X2는 중성 아미노산일 수 있다. 예를 들어, 상기 X1 및 X2는 각각 아스파라긴(asparagine, Asn), 글리신(glycine, Gly), 세린(serine, Ser), 아스파르트산(aspartic acid, Asp), 알라닌(alanine, Ala) 및 티로신(tyrosine, Tyr)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 구체적으로, 상기 X1은 아스파라긴, 글리신, 세린 또는 아스파르트산일 수 있고, X2는 알라닌 또는 티로신일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 중쇄 CDR1은 서열번호 25, 28, 31, 34, 37 또는 40로 기재된 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
또한, 상기 서열번호 62로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 CDR2(X3IX4X5X6X7X8X9X10YYADSVKG)에서 X3 내지 X10은 각각 중성 및 염기성 아미노산에서 선택될 수 있다. 구체적으로, 상기 X3 및 X4 내지 X9는 각각 중성 아미노산일 수 있고, X10은 중성 또는 염기성 아미노산일 수 있다. 예를 들어, 상기 X3 내지 X10은 각각 글리신, 류신(leucine, Leu), 알라닌, 세린, 티로신, 프롤린(proline, Pro), 아스파라긴, 리신(lysine, Lys) 및 이소류신(isoleucine, Ile)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 구체적으로, 상기 X3는 글리신, 류신, 알라닌 또는 세린일 수 있고, X4는 티로신 또는 세린일 수 있으며, X5는 프롤린 또는 티로신일 수 있고, X6은 아스파라긴 또는 글리신일 수 있으며, X7 및 X8은 각각 글리신 또는 세린일 수 있고, X9는 아스파라긴 또는 세린일 수 있으며, X10은 리신 또는 이소류신일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 중쇄 CDR2는 서열번호 26, 29, 32, 35, 38 또는 41로 기재된 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
또한, 상기 서열번호 63으로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 CDR1(X11GSSSNIGX12NX13VX14)에서 X11 내지 X14는 각각 중성 아미노산에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 X11 내지 X14는 각각 트레오닌(threonine, Thr), 세린, 아스파라긴, 알라닌, 프롤린 및 티로신으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 구체적으로, 상기 X11은 트레오닌 또는 세린일 수 있고, X12는 아스파라긴 또는 세린일 수 있으며, X13은 알라닌, 프롤린, 트레오닌 또는 티로신일 수 있고, X14는 아스파라긴, 티로신 또는 세린일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 경쇄 CDR1은 서열번호 43, 46, 49, 52, 55 또는 58로 기재된 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
또한, 상기 서열번호 64로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 CDR2(X15X16X17X18RPS)에서 X15 내지 X18은 각각 산성, 염기성 및 중성 아미노산에서 선택될 수 있다. 구체적으로, 상기 X15 및 X16은 각각 산성 또는 중성 아미노산일 수 있고, X17은 중성 아미노산일 수 있으며, X18은 염기성 또는 중성 아미노산일 수 있다. 예를 들어, 상기 X15 내지 X18은 각각 티로신, 알라닌, 아스파르트산, 세린, 아스파라긴, 히스티딘(histidine, His), 글루타민(glutamine, Gln) 및 리신으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 구체적으로, X15는 티로신, 알라닌, 아스파르트산 또는 세린일 수 있고, X16는 아스파르트산 또는 아스파라긴일 수 있으며, X17은 세린 또는 아스파라긴일 수 있고, X18은 히스티딘, 글루타민 또는 리신일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 경쇄 CDR2는 서열번호 44, 47, 50, 53, 56 또는 59로 기재된 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
또한, 상기 서열번호 65로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 CDR3(X19X20WDX21SLX22X23YV)에서 X19 내지 X23은 각각 중성 아미노산에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 X19 내지 X23은 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파르트산 및 아스파라긴으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 구체적으로, X19는 글리신 또는 알라닌일 수 있고, X20은 알라닌, 세린 또는 트레오닌일 수 있으며, X21은 티로신, 세린, 알라닌 또는 아스파르트산일 수 있고, X22는 세린 또는 아스파라긴일 수 있으며, X23은 알라닌 또는 글리신일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 경쇄 CDR3는 서열번호 45, 48, 51, 54, 57 또는 60으로 기재된 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 25, 28, 31, 34, 37 또는 40으로 기재된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 중쇄 CDR1, 서열번호 26, 29, 32, 35, 38 및 41로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 27, 30, 33, 36, 39 및 42로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 43, 46, 49, 52, 55 및 58로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR1, 서열번호 44, 47, 50, 53, 56 및 59로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 45, 48, 51, 54, 57 및 60으로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 25, 26 및 27로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 28, 29 및 30으로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 31, 32 및 33으로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 34, 35 및 36으로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 37, 38 및 39로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 40, 41 및 42로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역으로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 43, 44 및 45로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 46, 47 및 48로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 49, 50 및 51로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 52, 53 및 54로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 55, 56 및 57로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 및 서열번호 58, 59 및 60으로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역으로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
나아가, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 25, 26 및 27로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 43, 44 및 45로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역; 서열번호 28, 29 및 30으로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 46, 47 및 48로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역; 서열번호 31, 32 및 33으로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 49, 50 및 51로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역; 서열번호 34, 35 및 36으로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 52, 53 및 54로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역; 서열번호 37, 38 및 39로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 55, 56 및 57로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역; 또는 서열번호 40, 41 및 42로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 58, 59 및 60으로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
일례로, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드일 수 있고, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 13, 15, 17, 19, 21 또는 23으로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 필요에 따라 변형된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 접합(conjugation), 당화(glycosylation), 표지 부착 또는 이들의 조합으로 변형될 수 있다. 구체적으로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 HRP(horseradish peroxidase), 알칼린 포스파타아제, 햅텐(hapten), 비오틴, 스트렙타비딘, 형광 물질, 방사성 물질, 양자점, PEG(polyethylene glycol), 히스티딘 표지 등으로 변형될 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 필요에 따라 다른 약물이 접합될 수도 있다.
상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 통상의 기술분야에 알려진 단일클론항체 제조 방법에 따라 제조될 수 있고, 상기 제조 방법은 통상의 기술자에 의해 적절히 변형될 수 있다. 일례로, 상기 항체는 항원으로 면역화된 동물로부터 수득된 B 림프구를 사용하여 하이브리도마를 제조함으로써 제조되거나, 파지 디스플레이 기술을 이용하여 제조될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 구성하는 아미노산 서열이 공지된 바, 이를 암호화하는 핵산 서열 또한 통상의 기술자에게 자명하다. 또한, 상기 핵산 서열은 이로부터 번역되는 항체 또는 이의 항원 단편의 활성을 유지하는 한, 하나 또는 그 이상의 염기가 첨가, 결실 또는 치환된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산을 포함하는 발현벡터를 포함할 수 있다. 상기 용어, '발현벡터(expression vector)'는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터, 코스미드 백터, 박테리오파지 벡터, 바이러스 벡터 등을 모두 포함할 수 있다. 상기 발현벡터는 이에 포함되는 핵산으로부터 펩티드를 생성하기 위해 필요한 요소를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 발현벡터는 신호서열, 복제기점, 마커 유전자, 프로모터, 전사 종결 서열 등을 포함할 수 있다. 이때, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 암호화된 핵산은 프로모터와 작동적으로 연결될 수 있다.
일례로, 원핵세포에 사용되는 발현벡터는 전사를 진행시키는 프로모터, 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리, 및 전사와 해독의 종결서열을 포함할 수 있다. 한편, 진핵세포에 사용되는 발현벡터는 포유동물 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 폴리아데닐화 서열을 포함할 수 있다.
또한, 상기 발현벡터에 포함되는 마커 유전자로는 통상의 기술분야에 알려진 것을 모두 사용할 수 있으며, 구체적으로 항생제 내성 유전자일 수 있다. 구체적으로, 상기 항생제 내성 유전자는 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 네오마이신, 테트라사이클린 등을 포함하는 항생제에 대해 내성을 나타내는 유전자일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 서술한 바와 같은 핵산 또는 발현벡터를 포함하는 숙주세포를 유효성분으로 포함할 수 있다. 상기 숙주세포는 통상의 기술분야에 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하기 위해 사용될 수 있다고 알려진 모든 종류의 세포를 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 숙주세포는 원핵세포, 효모 또는 진핵세포일 수 있다. 상기 원핵세포는 대장균(E. coli), 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스 속 균주, 슈도모나스 속 균주, 스타필로코쿠스 속 균주 등을 포함할 수 있고, 상기 효모는 사카로마이세스 세레비지애 등을 포함할 수 있다. 한편, 상기 진핵세포는 COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PERC6, SP2/0, NS-0, U20S 및 HT1080 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 숙주세포는 통상의 기술분야에 알려진 방법에 따라 상술한 바와 같은 핵산 또는 발현벡터가 형질주입된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 형질주입은 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개 형질감염(DEAE dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법, 유전자 총(gene gun) 등의 방법으로 수행될 수 있다. 또한, 상기 방법은 통상의 기술자에 의해 적절히 변형될 수 있다.
상기 뇌질환은 통상의 기술분야에 알려진 모든 종류의 뇌질환을 포함할 수 있고, 구체적으로 상기 뇌질환은 퇴행성 뇌질환일 수 있다. 일례로, 상기 퇴행성 뇌질환은 아밀로이드-β의 발현 또는 응집 수준이 정상보다 높거나 높을 위험이 있는 질환일 수 있다. 예를 들어, 상기 퇴행성 뇌질환은 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 경도인지장애, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 다운증후군, 아밀로이드성 뇌졸증, 전신성 아밀로이드병, 더취(Dutch)형 아밀로이드증, 니만-픽병, 노인성 치매, 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 척수소뇌성 운동실조증(spinocerebellar atrophy), 뚜렛 증후군(Tourette's syndrome), 프리드리히 보행실조(Friedrich's Ataxia), 마차도-조셉병(Machado-Joseph's disease), 루이소체 치매, 근육긴장이상(dystonia), 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy) 또는 전두측두엽 치매일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 ASM 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 조성물을 생체 내에 전달하는데 적합한 것이면 모두 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 담체는 Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 덱스트로스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등과 같은 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
상기 조성물을 제제화하는 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 첨가할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구용 제제 또는 비경구용 제제로 제형화될 수 있다. 경구용 제제로는 고형 제제 및 액상 제제가 포함될 수 있다. 상기 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 또는 트로키제일 수 있고, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제를 첨가하여 조제할 수 있다. 상기 부형제는 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 상기 고형 제제는 윤활제를 포함할 수 있고, 그 예로는 마그네슘 스티레이트, 탈크 등이 있다. 한편, 상기 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제일 수 있다. 이때, 상기 액상 제제에는 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등과 같은 부형제가 포함될 수 있다.
상기 비경구용 제제는 주사제, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 파우더 및 크림 등을 포함할 수 있다. 상기 주사제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제 등을 포함할 수 있다. 이때, 비수성용제 또는 현탁용제로서는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름이나, 에틸올레이트와 같이 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 복강내, 직장내, 피하, 정맥, 근육내 또는 흉부내 주사 방식을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 환자의 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간, 동시에 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함되는 유효성분의 양은 0.0001 내지 1,000 ㎎/㎏, 구체적으로 0.001 내지 500 ㎎/㎏일 수 있다. 상기 투여는 하루에 1회 또는 수회일 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 투여 시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다.
또한, 본 발명은 ASM 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에 따른 건강기능식품에 유효성분으로 포함되는 ASM 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
본 발명의 ASM 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 식품에 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있다. 이때, 첨가되는 유효성분의 함량은 목적에 따라 결정될 수 있고, 일반적으로는 전체 식품 중량의 0.01 내지 90 중량부일 수 있다.
건강기능식품의 형태 및 종류는 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 건강기능식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환의 형태일 수 있다. 상기 건강기능식품은 추가성분으로서 여러 가지 향미제, 감미제 또는 천연 탄수화물을 포함할 수 있다. 상기 감미제는 천연 또는 합성 감미제일 수 있고, 천연 감미제의 예로는 타우마틴, 스테비아 추출물 등이 있다. 한편, 합성 감미제의 예로는 사카린, 아스파르탐 등이 있다. 또한, 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드, 디사카라이드, 폴리사카라이드, 올리고당 및 당알코올 등일 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 상기 서술한 추가성분 외에, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙스탄 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 등을 더 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 상기 첨가제의 비율은 본 발명의 조성물의 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다, 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 청구범위에 기재된 기술적 사상과 실질적으로 동일한 구성을 갖고 동일한 작용 효과를 이루는 것은 어떠한 것이라도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
실시예 1. ASM(acid sphingomyelinase) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 제작
인간 ASM 단백질(서열번호 66) 및 마우스 ASM 단백질(서열번호 67)에 특이적으로 결합하는 항체를 다음과 같은 방법으로 제작하였다.
구체적으로, 재조합 인간 및 마우스 ASM 단백질, 및 인간 합성 scFv-파아지 라이브러리를 이용하여 통상적인 방법으로 패닝(panning)을 수행하여 인간 ASM 단백질 또는 마우스 ASM 단백질에 특이적으로 결합하는 scFv를 갖는 파아지를 선별하였다. 선별된 scFv를 암호화하는 핵산 서열을 분석하고, 이로부터 생성되는 아미노산 서열을 확인하였다. 확인된 scFv 서열의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역 각각의 카복시 말단(carboxy terminus)에, 서열번호 75 및 77로 각각 기재된 염기 서열로 구성되는 마우스 중쇄 불변영역(constant region) 및 마우스 경쇄 λ 불변영역이 연결된 형태로 발현되도록 발현벡터를 제작하였다. 이때, 제작된 발현벡터에 포함된 scFv를 구성하는 중쇄 가변영역의 아미노산 서열 및 핵산 서열을 하기 표 1에, 경쇄 가변영역의 아미노산 서열 및 핵산 서열을 하기 표 2에 나타내었다.
항체# 서열 서열번호
#9101 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIYPNGGNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNAYRFDYWGQGTLVTVSS 서열번호 1
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAATTATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGGATCTATCCTAATGGTGGTAATAAATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAAAATGCTTATCGTTTCGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA 서열번호 2
#9102 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYYMSWVRQAPGKGLEWVSLISPGSGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSWHHFDYWGQGTLVTVSS 서열번호 3
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCGGTTATTATATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATTGATCTCTCCTGGTAGTGGTAGTATATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAATCTTGGCATCATTTCGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA 서열번호 4
#9104 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMSWVRQAPGKGLEWVSGIYYGSGNIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDTPGFDYWGQGTLVTVSS 서열번호 5
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAATTATTATATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGGATCTATTATGGTAGTGGTAATATATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATACGCCTGGGTTCGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA 서열번호 6
#9108 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIYPGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVLGLTPKPFDYWGQGTLVTVSS 서열번호 7
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAATTATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCGATCTATCCTGGTGGTGGTAGTATATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATGTTTTGGGTCTGACTCCTAAGCCGTTCGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA 서열번호 8
#9113 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMSWVRQAPGKGLEWVSSISPGGSSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGASLFDYWGQGTLVTVSS 서열번호 9
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#9123 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISYGGGNIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVGGMCTRRQCYYDYGMDVWGQGTLVTVSS 서열번호 11
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항체# 서열 서열번호
#9101 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYADSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAIGGLRSEDEADYYCGSWDYSLNAYVFGGGTKLTVL 서열번호 13
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCTAGCGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTAGTGGCTCTTCATCCAATATTGGCAATAATTATGTCTCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGCTGATAGTAAGCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCGCTGGCCATCGGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGGTTCTTGGGATTATAGCCTGAATGCTTATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTTACGGTCCTA 서열번호 14
#9102 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNPVYWYQQLPGTAPKLLIYANNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDSSLSGYVFGGGTKLTVL 서열번호 15
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCTAGCGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTAGTGGCTCTTCATCTAATATTGGCAATAATCCTGTCTACTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGCTAATAATCAGCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCTGCTTGGGATTCTAGCCTGAGTGGTTATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTTACGGTCCTA 서열번호 16
#9104 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGNNAVNWYQQLPGTAPKLLIYYDSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGAWDYSLSAYVFGGGTKLTVL 서열번호 17
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCTAGCGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTACTGGCTCTTCATCTAATATTGGCAATAATGCTGTCAACTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATTATGATAGTCATCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGGTGCTTGGGATTATAGCCTGAGTGCTTATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTTACGGTCCTA 서열번호 18
#9108 QSVLTQPPSASGTPGQRVTLSCTGSSSNIGSNTVYWYQQLPGTAPKLLIYANSQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDYSLSGYVFGGGTKLTVL 서열번호 19
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCTAGCGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCCTCTCTTGTACTGGCTCTTCATCTAATATTGGCAGTAATACTGTCTACTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGCTAATAGTCAGCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGGTTCTTGGGATTATAGCCTGAGTGGTTATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTTACGGTCCTA 서열번호 20
#9113 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNAVSWYQQLPGTAPKLLIYSDNKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDASLNAYVFGGGTKLTVL 서열번호 21
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCTAGTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTAGTGGCTCTTCATCTAATATTGGCAATAATGCTGTCTCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATTCTGATAATAAGCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGGTACTTGGGATGCTAGCCTGAATGCTTATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTTACGGTCCTA 서열번호 22
#9123 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQLPGTAPKLLIYDNSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDDSLSGYVFGGGTKLTVL 서열번호 23
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCTAGCGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTAGTGGCTCTTCATCTAATATTGGCAGTAATACTGTCAACTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGATAATAGTAAGCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAAGATGAGGCTGATTATTACTGTGGTACTTGGGATGATAGCCTGAGTGGTTATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTTACGGTCCTA 서열번호 24
이때, 발현벡터는 포유류 발현벡터(mammalian expression vector)를 사용하였다. 제작된 발현벡터를 CHO 또는 HEK293 세포주에 형질전환시켜 인간 ASM 단백질에 결합하거나, 인간 및 마우스의 ASM 단백질에 모두 결합하는 전장의 항체를 제조하였다.
실시예 2. 상보성 결정영역(complementarity determining region, CDR)의 결정
상기 제조된 scFv에서 상보성 결정영역을 통상적인 방법으로 확인하고, 그 결과, 중쇄 가변영역의 CDR 서열을 표 3에, 경쇄 가변영역의 CDR 서열을 표 4에 나타내었다.
항체# CDR 서열 서열번호
#9101 CDR1 NYAMS 서열번호 25
CDR2 GIYPNGGNKYYADSVKG 서열번호 26
CDR3 NAYRFDY 서열번호 27
#9102 CDR1 GYYMS 서열번호 28
CDR2 LISPGSGSIYYADSVKG 서열번호 29
CDR3 SWHHFDY 서열번호 30
#9104 CDR1 NYYMS 서열번호 31
CDR2 GIYYGSGNIYYADSVKG 서열번호 32
CDR3 DTPGFDY 서열번호 33
#9108 CDR1 NYAMS 서열번호 34
CDR2 AIYPGGGSIYYADSVKG 서열번호 35
CDR3 DVLGLTPKPFDY 서열번호 36
#9113 CDR1 SYYMS 서열번호 37
CDR2 SISPGGSSIYYADSVKG 서열번호 38
CDR3 GASLFDY 서열번호 39
#9123 CDR1 DYAMS 서열번호 40
CDR2 AISYGGGNIYYADSVKG 서열번호 41
CDR3 VGGMCTRRQCYYDYGMDV 서열번호 42
항체# CDR 서열 서열번호
#9101 CDR1 SGSSSNIGNNYVS 서열번호 43
CDR2 ADSKRPS 서열번호 44
CDR3 GSWDYSLNAYV 서열번호 45
#9102 CDR1 SGSSSNIGNNPVY 서열번호 46
CDR2 ANNQRPS 서열번호 47
CDR3 AAWDSSLSGYV 서열번호 48
#9104 CDR1 TGSSSNIGNNAVN 서열번호 49
CDR2 YDSHRPS 서열번호 50
CDR3 GAWDYSLSAYV 서열번호 51
#9108 CDR1 TGSSSNIGSNTVY 서열번호 52
CDR2 ANSQRPS 서열번호 53
CDR3 GSWDYSLSGYV 서열번호 54
#9113 CDR1 SGSSSNIGNNAVS 서열번호 55
CDR2 SDNKRPS 서열번호 56
CDR3 GTWDASLNAYV 서열번호 57
#9123 CDR1 SGSSSNIGSNTVN 서열번호 58
CDR2 DNSKRPS 서열번호 59
CDR3 GTWDDSLSGYV 서열번호 60
실험예 1. ASM 단백질과의 결합 확인
상기에서 제조된 ASM 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 ASM 단백질과의 결합을 ELISA 분석 방법으로 확인하였다.
먼저, 멀티-어레이 96-웰 플레이트(Thermo scientific)에 1 ㎍/㎖의 재조합 인간 ASM 단백질(R&D systems)을 100 ㎕ 첨가하여 4℃에서 16시간 동안 방치하여 플레이트를 코팅하였다. 코팅된 플레이트에 5% BSA가 포함된 200 ㎕의 PBS를 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 전처리한 후, 0.05%의 트윈 20(Tween 20)이 포함된 PBS로 이를 3회 세척하였다. 여기에 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10 또는 100 nM의 항-ASM 항체를 처리하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 플레이트를 0.05%의 트윈이 포함된 PBS로 3회 세척하고, 2차 항체로서 100 ㎕의 염소-항-마우스 IgG-HRP(Jackson Immunoresearch) 항체를 첨가하였다. 이를 다시 37℃에서 1시간 동안 반응시키고, 0.05%의 트윈이 포함된 PBS로 3회 세척하였다. 여기에 100 ㎕의 TMB 기질(tetramethylbenzidine)을 첨가하고, 상온에서 5분 동안 추가 반응시킨 후, 100 ㎕의 2 N 황산용액으로 반응을 중단시키고, 450 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 측정된 흡광도를 도 2에, 흡광도 값으로부터 계산된 항체의 EC50 값을 표 5에 나타내었다.
항체# EC50(nM)
#9101 0.0815
#9102 0.0954
#9104 1.948
#9108 0.3269
#9123 0.7578
도 2에 나타난 바와 같이, 상기에서 제조된 5종류의 항체가 모두 농도 의존적으로 ASM 단백질에 결합하였다. 특히, 표 5에 나타난 바와 같이, #9101 항체가 가장 낮은 EC50값을 나타내어 ASM 단백질에 대한 결합력이 가장 높았다.
실험예 2. ASM 단백질과의 결합 친화성 확인
상기에서 제조된 ASM 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 ASM 단백질과의 결합 친화성 및 상호작용 동역학을 Octet® QK384 시스템(Pall Life Sciences)을 사용하여 측정하였다.
먼저, AR2G 센서(ForteBio)에 20 mM의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드(EDC) 및 40 mM의 N-히드록시술포숙신이미드(술포-NHS) 용액을 처리하여 카르복시기를 활성화시켰다. 한편, 10 ㎍/㎖의 재조합 인간 ASM 단백질 또는 2.5 ㎍/㎖의 재조합 마우스 ASM 단백질은 10 mM의 소듐 아세테이트(pH 5.0)(ForteBio) 용액에 희석하여 준비하였다. 상기 ASM 단백질이 희석된 용액을 카르복시기가 활성화된 AR2G 센서에 가하여 재조합 인간 또는 마우스 ASM 단백질이 고정된 AR2G 센서를 수득하였다. 수득된 ASM 단백질이 고정된 센서에 1 M의 에탄올아민(ForteBio)을 첨가하여 미반응의 잔여 카르복시기를 불활성화시켰다. 여기에 0.4, 2 또는 10 nM 농도의 실시예 1에서 제조된 항체를 첨가하고 약 900초까지 반응물의 결합상을 관찰하였다. 이후, 1× 동역학 완충액(kinetics buffer)(ForteBio)을 첨가하고, 약 1,200초 동안 반응물의 분리상을 관찰하였다. Octet® 분석 소프트웨어(Pall Life Sciences)를 사용하여 각 항체에 대한 흡착율 상수(association constant: Kon), 분리율 상수(dissociation constant: Kdis) 및 평형분리상수(equilibrium dissociation constant: KD)를 결정하였다. 그 결과, 재조합 인간 ASM 단백질에 대한 분석 결과를 표 6에, 재조합 마우스 ASM 단백질에 대한 분석 결과를 표 7에 나타내었다.
항체# KD(M) Kon(1/Ms) Kdis(1/s) RMax Full R2
#9101 1.16E-09 6.26E+05 7.28E-04 0.4527 0.9861
#9102 2.52E-10 4.16E+05 1.05E-04 0.8652 0.997
#9104 2.09E-10 3.92E+05 8.18E-05 0.3324 0.9759
#9108 1.19E-10 2.49E+05 2.96E-05 0.45 0.999
#9113 5.64E-10 1.16E+06 6.56E-04 0.2868 0.9635
항체# KD(M) Kon(1/Ms) Kdis(1/s) RMax Full R2
#9101 4.25E-11 3.76E+06 1.59E-04 0.0185 0.5527
#9102 4.98E-10 4.89E+05 2.43E-04 0.4281 0.9944
#9104 6.38E-10 3.10E+05 1.98E-04 0.7027 0.9971
#9108 3.39E-09 4.59E+05 1.56E-03 0.3921 0.9865
#9113 <1.0E-12 1.00E+06 <1.0E-07 0 0
표 6에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 제조된 5종류의 항체가 10-10 내지 10-9 M 수준의 결합력으로 인간 ASM 단백질과 결합하였다. 한편, 표 7에 나타난 바와 같이, 마우스 ASM 단백질에 대해서는 #9102, #9104 또는 #9108의 항체만 10-10 내지 10-9 M 수준의 결합력을 보였다.
실험예 3. ASM 단백질의 항원 결정부위 확인
본 발명에 따른 항체가 ASM 단백질에 결합하는 부위인, 항원 결정부위를 HDX-MS(hydrogen deuterium exchange mass spectrometry) 방법으로 확인하였다.
먼저, 1,000 ㎍/㎖의 ASM 단백질, 1,000 ㎍/㎖의 #9101 mIgG1, 1,250 ㎍/㎖의 #9102 mIgG2, 1,000 ㎍/㎖의 #9104 mIgG4,1,000 ㎍/㎖의 #9108 mIgG1, 3,300 ㎍/㎖의 #9113 mIgG1 또는 2,932 ㎍/㎖의 #9123 mIgG1 항체를 연속으로 2배수씩 희석하여 128배 희석액까지 준비하였다. 준비된 희석액을 1 ㎕씩 취하여 동량의 10 ㎎/㎖의 시나핀산 매트릭스(K200 MALDI kit, CovalX)와 혼합하고, 상기 혼합물의 1 ㎕를 SCOUT 384 MALDI 플레이트에 분주하고 상온에서 결정화시켰다. 이후, 상기 결정을 MALDI 질량분석기(mass spectrometer)를 사용하여 측정하였다. 한편, 비공유 상호작용 분석을 위한 크로스-링크(cross-link) 데이터를 위해 1 ㎕의 128배 희석액을 동량의 2 ㎎/㎖의 K200 안정화 용액(K200 stabilizer reagent, K200 MALDI kit, CovalX)과 혼합하고, 이를 3시간 동안 상온에서 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 1 ㎕의 혼합액을 이용하여, 상기와 동일하게 MALDI 질량분석기를 사용하여 측정하고, 측정한 결과는 하이-매스 MALDI MS(high-mass MALDI MS) 모드로 분석하였다. 그 결과, 중수소 치환 감소가 확인된 부위의 펩타이드 서열을 하기 표 8에, 인간 ASM 단백질 구조 모델에 결합 위치를 표시한 결과를 도 3에 나타내었다. 또한, ASM 단백질 중, 사포신(saposin) 도메인에 대한 각 항체의 중수소 치환율 히트맵을 도 4에 나타내었다.
#항체 펩타이드 영역 아미노산 서열
#9101 135-159 PTVPKPPPKPPSPPAPGAPVSRILF
#9102 135-159 PTVPKPPPKPPSPPAPGAPVSRILF
218-228 SGLGPAGPFDM
#9104 53-72 TAINLGLKKEPNVARVGSVA
135-159 PTVPKPPPKPPSPPAPGAPVSRILF
#9108 53-72 TAINLGLKKEPNVARVGSVA
135-155 PTVPKPPPKPPSPPAPGAPVS
259-269 VRKFLGPVPVY
#9113 53-72 TAINLGLKKEPNVARVGSVA
101-123 VWRRSVLSPSEACGLLLGSTCGH
135-155 PTVPKPPPKPPSPPAPGAPVS
259-269 VRKFLGPVPVY
#9123 259-269 VRKFLGPVPVY
표 8 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 항체는 ASM 단백질의 N-말단으로부터 53 내지 72번째 아미노산 단편(서열번호 68: TAINLGLKKEPNVARVGSVA), 101 내지 123번째 아미노산 단편(서열번호 69: VWRRSVLSPSEACGLLLGSTCGH), 135 내지 159번째 아미노산 단편(서열번호 70: PTVPKPPPKPPSPPAPGAPVSRILF), 135 내지 155번째 아미노산 단편(서열번호 71: PTVPKPPPKPPSPPAPGAPVS), 218 내지 228번째 아미노산 단편(서열번호 72: SGLGPAGPFDM) 또는 259 내지 269번째 아미노산 단편(서열번호 73: VRKFLGPVPVY)에 결합하였다. 특히, 도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 항체는 사포신 도메인 중 α-헬릭스 1 및 α-헬릭스 2 부위에 주로 결합하였다.
실험예 4. ASM 단백질의 활성 억제 확인
4-1. ASM 단백질의 활성 억제 확인
상기에서 제조된 ASM 단백질에 특이적으로 결합하는 항체가 세포막에 위치하는 ASM 단백질의 활성을 억제하는지 확인하였다.
먼저, 알츠하이머 환자의 섬유아세포(Coriell institute)에 실시예 1에서 제조된 항체를 3 ㎍/㎖의 농도로 처리하고, 37℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 이후, 세포를 모아서 Mem-PER™ 플러스 멤브레인 단백질 추출 키트(Mem-PER™ Plus Membrane Protein Extraction Kit, Thermo)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 세포막을 분리하고 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질을 시료로서 사용하여 UPLC용 주입구(insert)에 넣고, 통상적인 방법으로 UPLC 분석(Waters, 186004800)을 수행하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 이때, 대조군으로서는 ASM 단백질에 결합하지 않는 것으로 확인된 #9105 항체를 사용하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 제조된 6종류의 항체 중, #9104 항체가 알츠하이머 환자의 세포막에서 증가한 ASM 단백질의 활성을 유의적으로 억제하였다.
4-2. 항-ASM 항체의 처리 농도에 따른 ASM 단백질 활성 억제 확인
실시예 1에서 제조된 #9104 항체를 0.03, 0.3, 3, 30, 300 또는 3,000 ng/㎖의 농도로 처리한 것을 제외하고는, 상기 실험예 4-1과 동일한 방법으로 세포막에 위치하는 ASM 단백질의 활성 변화를 확인하였다. 그 결과, 분석된 ASM 단백질의 활성 억제율(%)을 도 6 및 표 9에 나타내었다. 이때, 대조군으로서 #9105 항체를 사용하였다.
처리농도(ng/㎖) ASM 단백질 활성 억제율(%)
#9104 #9105
0.03 0 -
0.3 7.9 -
3 16 -
30 21 -
300 28 -
3,000 32 9
도 6 및 표 9에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 #9104 항체는 처리농도 의존적으로 세포막에 위치하는 ASM 단백질의 활성을 유의적으로 억제하였다. 반면, 대조군으로 사용된 #9105 항체는 3,000 ng/㎖ 이상의 농도로 처리한 경우에만 세포막에 위치하는 ASM 단백질의 활성을 약간 억제하였다.
실험예 5. 스핑고지질의 대사 변화 확인
실험예 4-1에 기재된 바와 같이 3 ㎍/㎖의 #9104 항체가 처리된 세포의 세포막에서 스핑고지질의 대사 변화를 스핑고미엘린(sphingomyelin) 및 세라마이드(ceramide)의 함량 변화를 통해 확인하였다. 실험은 통상적인 방법으로 수행되었으며, 측정된 스핑고미엘린 및 세라마이드의 함량은 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, #9104 항체의 처리에 의해 알츠하이머 환자의 섬유아세포 세포막에 존재하는 세라마이드의 함량은 유의적으로 감소하였으나, 스핑고미엘린의 함량에는 큰 변화가 없었다.
따라서, 상기로부터 본 발명에 따른 항체가 ASM 단백질에 의한 스핑고미엘린의 분해를 억제하는 것을 알 수 있었다.
실험예 6. 인지 기억력 개선 확인
알츠하이머 동물 모델인 APP/PS1 마우스에 #9104 항체를 투여하여 상기 마우스의 인지 기억력 변화를 확인하였다.
6-1. 항-ASM 항체의 투여
7개월령 APP/PS1 마우스에 50 ㎎/㎏의 투여량으로 324 ㎕의 #9104 항체를 8주 동안 복강 투여하였다. 투여는 1주일에 2회(3일 간격) 수행되었으며, #9104 항체는 총 16회 투여되었다(도 8). 이때, C57BL/6 마우스 및 APP/PS1 마우스의 교배로 태어난 후손에 아무것도 처리하지 않은 경우를 무처리 대조군으로, APP/PS1 마우스에 324 ㎕의 PBS를 처리한 경우를 음성 대조군으로 하였다.
6-2. 인지 기억력 개선 확인-(1)
#9104 항체의 투여 41일째부터 마지막날까지 행동기능검사를 수행하여, 항체의 투여에 의한 인지 기억력 변화를 확인하였다.
먼저, 투여 41일째부터 5분 동안 모든 마우스의 꼬리를 잡고 시험자의 팔 및 손등에 올리기를 반복하여 시험자에 대한 마우스의 거부감을 없애고, 이후 30분 동안 물에 적응시켜 물에 대한 거부감을 없앤 후 실험에 사용하였다. 한편, 수조는 4면위에 큐(cue)를 제거한 상태로 플랫폼(platform)을 설치하고, 이를 중심으로 삼각형의 작은 수조를 설치하였다. 상기 마우스를 수조에 넣어 수영연습 및 플랫폼에 올라가는 연습을 10회 실시하였다. 이때, 수영을 연습한 후, 10초 후 플랫폼에 올라갈 때마다 10초씩 머무를 수 있게 하고, 10초 후에 마우스를 물에 다시 들어가게 하였다. 이를 10회 반복하고, 반복하는 동안 플랫폼에 대해 접근 방향을 변화시켜 다양한 방향에서 플랫폼에 올라갈 수 있도록 교육하였다. 다음날인 투여 42일째부터 51일까지 수중 미로 실험(morris water maze test)을 수행하였다. 구체적으로, 수조의 4면 위에 큐를 설치하고 매일 동일한 시간에 각 마우스당 4회 실험을 수행하고(회당 60초의 시간제한), 이를 총 10회 반복하여 플랫폼에 올라갈 때까지 소요되는 시간을 기록하였다. 또한, 투여 52일째에는 프로브 테스트(probe test)를 수행하여 플랫폼을 제거한 수조에서 기존에 플랫폼이 있던 위치 및 다른 사분면을 지나 수영하는 거리 및 속도 등을 기록하였다. 그 결과, 수중 미로 실험 결과를 도 9에, 프로브 테스트 결과를 도 10 내지 12에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, 시험을 반복함에 따라 #9104 항체를 투여한 마우스는 탈출 지연 시간(escape latency time)이 유의적으로 감소하였다. 한편, 음성 대조군의 마우스는 평균 30초의 탈출 지연 시간을 보여 인지 기능이 손상되었고, 무처리 대조군의 마우스는 시험을 반복하면서 탈출 지연 시간이 줄어들었다. 구체적으로, #9104 항체를 투여한 군은 음성 대조군의 마우스와 비교하여 탈출 지연시간이 9회차에 31.5% 및 10회차에 30.8% 감소하였다.
또한, 도 10 및 11에 나타난 바와 같이, #9104 항체를 투여한 마우스는 표적 사분면에 머무는 시간이 비-표적 사분면에 머무는 시간에 비해 유의적으로 증가하였다. 이는 무처리 대조군과 유사하였고, 표적 사분면 및 비-표적 사분면에 머무르는 시간의 차이가 거의 없었던 음성 대조군과 차이를 보였다.
또한, 도 12C에 나타난 바와 같이, 플랫폼이 있던 위치를 지나가는 횟수(crossing platform)의 경우 #9104 항체를 투여한 군에서 유의적으로 증가한 반면, 음성 대조군은 감소한 것을 확인하였다. 한편, 도 12A 및 12B에 나타난 바와 같이, 모든 마우스군에서 수영 거리 및 속도는 유사한 것으로 확인되어 #9104 항체의 투여가 운동력에는 영향을 주지 않음을 알 수 있었다.
6-3. 인지 기억력 개선 확인-(2)
알츠하이머 동물 모델인 APP/PS1 마우스에 #9104 항체를 50 ㎎/㎏의 투여량으로 투여하여 상기 마우스의 인지 기억력 변화를 확인하였다. 실험은 상기 실험예 6-1과 동일한 방법으로 #9104 항체를 투여하고, 통상적인 방법으로 상황 및 쿠 공포 조건 테스트(contextual and cued fear conditioning test)를 수행한 후, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타난 바와 같이, #9104 항체를 투여한 마우스는 상황(contextual)이나 분위기(tone)에 따라 경직(freezing)이 유의적으로 증가한 반면, 음성 대조군의 마우스는 경직정도가 감소하였다.
따라서, 상기 결과로부터, 본 발명에 따른 항체가 알츠하이머 동물 모델의 인지 기억력을 유의적으로 개선시킴을 확인하였다.
실험예 7. ASM 단백질 활성 확인
7-1. ASM 단백질 활성 확인
상기 실험예 6에서 인지 기억력 개선을 확인한 동물 모델의 혈액 및 뇌조직에 존재하는 ASM 단백질의 활성을 확인하였다. 구체적으로, 실험은 마우스의 혈액 플라즈마(plasma)에서 단백질을 통상적인 방법으로 수득하고, 수득된 단백질을 시료로 사용하여 실험예 4-1에 기재된 바와 동일한 방법으로 UPLC를 수행하였다. 그 결과, 음성 대조군 마우스의 ASM 단백질 활성을 기준으로 무처리 대조군 마우스 및 #9104를 투여한 마우스군의 ASM 활성(%)을 계산한 결과를 도 14에 나타내었다.
도 14에 나타난 바와 같이, #9104 항체의 투여에 의해 혈액 플라즈마에 존재하는 ASM 단백질의 활성이 약 64% 억제되었다.
7-2. ASM 단백질 농도 확인
실험예 7-1에서 확인된 ASM 단백질의 활성 억제가 단백질의 발현 수준 감소에 의한 것인지 확인하기 위해 ELISA 분석을 수행하였다. 실험은 실험예 7-1에서 수득된 혈액 플라즈마 조직을 시료로 사용하고, 마우스 ASM ELISA 키트(Mybiosource)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 분석을 통해 수행한 후, 그 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15에 나타난 바와 같이, #9104 항체를 투여한 마우스에서 오히려 무처리 대조군이나 음성 대조군보다 ASM 단백질의 농도가 유의적으로 증가하였다.
따라서, 상기 결과로부터 본 발명에 따른 항체는 ASM 단백질의 농도에는 영향을 미치지 않으면서 그 활성을 유의적으로 억제시킴을 알 수 있었다.
실험예 8. 아밀로이드-β(Aβ) 축적 억제 확인
상기 실험예 6에서 인지 기억력 개선을 확인한 동물 모델의 뇌조직에 존재하는 아밀로이드-β의 축적을 티오플라빈-S(tioflavin-S) 염색 및 6E10 항체를 이용한 웨스턴블롯과, ELISA 분석 방법으로 다음과 같이 확인하였다.
8-1. Aβ 축적 억제 확인-(1)
실험예 6의 동물 모델을 2.5% 아베르틴(avertin)으로 마취하고, 흉강을 개복하여 1 cc 주사기를 이용하여 심장으로부터 혈액을 수득하였다. 혈액을 수득한 후, 20 ㎖의 PBS로 관류(perfusion)를 수행하고, 20~30 ㎖의 4% PFA(paraformaldehyde)로 추가 관류를 수행하였다. 상기 마우스의 뇌를 적출하여 4% PFA 용액에 넣어 하룻밤 동안 방치하고, 비브라톰(vibratome)을 이용하여 상기 조직을 30 ㎛ 두께로 절편화하였다. 수득된 뇌조직 절편을 12웰 플레이트에 넣은 후, 1 ㎖의 PBS 용액을 첨가하고 실온에서 33 rpm의 조건으로 5분 동안 교반하였다. PBS 용액을 제거하고, 에탄올에 희석된 500 ㎕의 0.5% 티오플라빈-S 시약을 처리하여 Aβ 플라크(plaque)를 10분 동안 염색하였다. 이후, 상기 절편을 50% 에탄올로 2회 세척하고, 1 ㎖의 PBS 용액으로 1회 세척하였다. 여기에 DAPI가 포함된 마운트 배지(mount media)를 첨가하여 마운팅하였다.
한편, 모든 형태의 Aβ 단백질을 염색하기 위해 상기 뇌조직 절편을 12웰 플레이트에 넣은 후, 1 ㎖의 PBS 용액을 첨가하여 실온에서 33 rpm의 조건으로 5분 동안 교반하고, PBS 용액을 제거하였다. 여기에 1 ㎖의 0.2%의 트리톤 X-100이 포함된 PBS 용액을 첨가하고 33 rpm의 조건으로 1시간 동안 교반하였다. 교반 후, 트리톤 X-100이 포함된 PBS 용액을 제거하고, 0.05%의 트리톤 X-100이 포함된 PBS 용액으로 1시간 동안 전처리하였다. 전처리된 뇌조직 절편에 6E10 항체(Biolegend)를 0.05%의 트리톤 X-100이 포함된 PBS 용액과 1:1의 부피비로 혼합하여 500 ㎕의 양으로 첨가하였다. 이를 4℃에서 하룻밤 동안 교반하면서 반응시키고, 트리톤 X-100이 포함된 PBS 용액으로 3회 세척하였다. 여기에 마우스-488 2차 항체를 처리하고 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 다시 트리톤 X-100이 포함된 PBS 용액으로 3회 세척하였다. 여기에 DAPI가 포함된 마운트 배지(mount media)를 첨가하여 마운팅하였다.
염색된 뇌조직 절편은 레이저-스캐닝 공초점 현미경(FV3000, Olympus)을 사용하여 20배의 배율로 촬영하고, 메타모르프 소프트웨어(MetaMorph software, Molecular Devices)를 사용하여 염색 면적을 분석한 후, 분석 결과를 도 16 및 17에 나타내었다.
도 16 및 17에 나타난 바와 같이, 뇌의 피질 및 해마에 존재하는 고밀도(dense-core) 및 확산형(diffuse) 아밀로이드-β 플라크가 #9104 항체의 처리에 의해 유의적으로 감소하였다.
8-2. Aβ 축적 억제 확인-(2)
상기에서 수득된 뇌조직을 피질 및 해마로 분리하고, 100 mM PMSF 및 1% 프로테아제 억제제가 포함된 RIPA 완충액을 첨가하고, 조직을 균질화시켰다. 균질화된 조직을 4℃ 및 13,000 rpm의 조건하에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 수득하였다. 수득된 상층액을 동일한 조건으로 30분 동안 추가 원심분리하여 상층액을 다시 수득하고, 이를 시료로 사용하여 아밀로이드-β40 ELISA 키트(KHB3481, invitrogen) 및 아밀로이드-β42 ELISA 키트(KHB3441, invitrogen)로 Aβ의 수준을 측정하였다. 이후, 수득된 결과를 도 18에 나타내었다.
도 18에 나타난 바와 같이, 뇌의 피질 및 해마에 존재하는 Aβ40은 #9104 항체에 의해 각각 30.9% 및 30.9%로 감소하였고, 이는 음성 대조군과 비교하여 유의적이었다. Aβ42 또한 음성 대조군과 비교하여 #9104 항체의 투여에 의해 유의적으로 감소하였다.
실험예 9. 타우(tau) 축적 확인
상기 실험예 8에서 수득된 뇌조직 절편을 이용하여 타우의 축적 변화를 타우 단백질을 염색하여 확인하였다. 구체적으로, 실험은 1차 항체로서 항-AT8 항체(ThermoFisher Scientific, MN1020)을 사용한 것을 제외하고는, 실험예 8-1과 동일한 조건 및 방법으로 수행되었고, 분석 결과를 도 19에 나타내었다.
도 19에 나타난 바와 같이, 뇌의 피질 및 해마에 존재하는 타우 단백질이 #9104 항체의 처리에 의해 유의적으로 감소하였다.
실험예 10. 신경염증 개선 확인
상기 실험예 6에서 인지 기억력 개선을 확인한 동물 모델의 뇌조직에서 #9104 항체에 의한 신경염증 개선 효과를 미세아교세포(microglia) 및 별아교세포(astrocyte) 활성화를 통해 확인하였다. 실험은 1차 항체로서 항-lba-1 항체(Wako, 019-19941) 또는 항-GFAP 항체(Dako, N1506)를 사용하고, 2차 항체로서 토끼-488 2차 항체를 사용한 것을 제외하고는, 실험예 8-1과 동일한 조건 및 방법으로 수행되었고, 분석 결과는 도 20 및 21에 나타내었다.
도 20 및 21에 나타난 바와 같이, 뇌의 피질 및 해마에 존재하는 lba-1 및 GFAP 단백질의 발현이 유의적으로 감소함으로써, #9104 항체에 의해 뇌조직 내 미세아교세포 및 별아교세포의 활성이 억제됨을 확인하였다.
따라서, 상기 결과로부터 본 발명에 따른 항체는 뇌 신경염증을 개선하는 효과가 있음을 알 수 있었다.
실험예 11. 독성 확인
#9104 항체의 독성을 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
실험은, 상기 실험예 6에서 #9104 항체를 투여하면서 진행되었다. 구체적으로, 매주 2회 마우스의 움직임 및 이상징후를 육안으로 관찰하여 생존율을 평가하였고, 매주 1회 동일한 요일 및 시간에 마우스의 체중을 측정하였다. 한편, 투여가 완료된 마우스를 통상적인 방법으로 부검하여 장기를 관찰함으로써, #9104 항체에 의한 장기독성을 보이는지 확인하였다. 그 결과, 마우스의 생존율 및 체중 변화를 도 22에, 장기 독성을 확인한 결과를 도 23에 나타내었다.
도 22 및 23에 나타낸 바와 같이, #9104 항체의 처리에 의해 생존율 및 체중은 유의적인 변화를 나타내지 않았으며, 장기 또한 정상인 것으로 확인되었다.
따라서, 상기 결과로부터 본 발명에 따른 항체는 독성이 없으면서도 알츠하이머와 같은 뇌질환의 치료에 유의적으로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
<110> ISU ABXIS CO., LTD. KYUNGBOOK NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING OF BRAIN DIEASES COMPRISING ANTIBODIES SPECIFICALLY BINDING TO ASM PROTEIN <130> DP210200-1 <150> KR 10-2021-0068628 <151> 2021-05-27 <160> 77 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #9101 heavy chain variable region amino acid sequence <400> 1 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Tyr Pro Asn Gly Gly Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asn Ala Tyr Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #9101 heavy chain variable region nucleotide sequence <400> 2 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc aattatgcta tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggg atctatccta atggtggtaa taaatattac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaaatgct 300 tatcgtttcg actactgggg ccagggtaca ctggtcaccg tgagctca 348 <210> 3 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #9102 heavy chain variable region amino acid sequence <400> 3 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Leu Ile Ser Pro Gly Ser Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu 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ASM protein (135-155) <400> 71 Pro Thr Val Pro Lys Pro Pro Pro Lys Pro Pro Ser Pro Pro Ala Pro 1 5 10 15 Gly Ala Pro Val Ser 20 <210> 72 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope of ASM protein (218-228) <400> 72 Ser Gly Leu Gly Pro Ala Gly Pro Phe Asp Met 1 5 10 <210> 73 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope of ASM protein (259-269) <400> 73 Val Arg Lys Phe Leu Gly Pro Val Pro Val Tyr 1 5 10 <210> 74 <211> 324 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse IgG1 heavy chain constant region amino acid sequence <400> 74 Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala 1 5 10 15 Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu 50 55 60 Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Pro Arg Pro Ser Glu Thr Val 65 70 75 80 Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys 85 90 95 Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro 100 105 110 Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu 115 120 125 Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser 130 135 140 Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu 145 150 155 160 Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 165 170 175 Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn 180 185 190 Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro 195 200 205 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln 210 215 220 Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val 225 230 235 240 Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val 245 250 255 Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln 260 265 270 Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn 275 280 285 Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val 290 295 300 Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His 305 310 315 320 Ser Pro Gly Lys <210> 75 <211> 972 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse IgG1 heavy chain constant region nucleotide sequence <400> 75 gccaagacaa cacctcctag cgtgtaccct ctggctcctg gatctgccgc tcagaccaat 60 agcatggtca ccctgggctg tctggtcaag ggctactttc ctgagcctgt gaccgtgacc 120 tggaacagcg gatctctgtc tagcggcgtg cacacctttc cagccgtgct gcagagcgat 180 ctgtacaccc tgagcagcag cgtgaccgtg cctagctctc ctagacctag cgagacagtg 240 acctgcaacg tggcccatcc tgccagcagc accaaggtgg acaagaaaat cgtgcccaga 300 gactgcggct gcaagccctg catctgtacc gtgcctgaag tgtccagcgt gttcatcttc 360 ccacctaagc ctaaggacgt gctgaccatc acactgaccc ctaaagtgac ctgtgtggtg 420 gtggacatca gcaaggacga ccccgaggtg cagttcagtt ggttcgtgga cgacgtggaa 480 gtgcacacag cccagacaca gcctagagag gaacagttca acagcacctt cagaagcgtg 540 tccgagctgc ccatcatgca ccaggattgg ctgaacggca aagaattcaa gtgcagagtg 600 aacagcgccg cctttcctgc tcctatcgag aaaaccatct ccaagaccaa gggcagaccc 660 aaggctcccc aggtgtacac aatccctcca cctaaagaac agatggccaa ggacaaggtg 720 tccctgacct gcatgatcac cgatttcttc ccagaggaca tcaccgtgga atggcagtgg 780 aatggacagc ccgccgagaa ctacaagaat acccagccta tcatgaacac caacggcagc 840 tacttcgtgt acagcaagct gaacgtgcag aagtccaact gggaggccgg caacaccttc 900 acctgttctg tgctgcacga gggcctgcac aatcaccaca ccgagaagtc cctgagccac 960 tctcctggca ag 972 <210> 76 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse light chain lambda constant region amino acid sequence <400> 76 Gly Gln Pro Lys Ser Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 Glu Glu Leu Glu Thr Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Thr Ile Thr Asp 20 25 30 Phe Tyr Pro Gly Val Val Thr Val Asp Trp Lys Val Asp Gly Thr Pro 35 40 45 Val Thr Gln Gly Met Glu Thr Thr Gln Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 50 55 60 Lys Tyr Met Ala Ser Ser Tyr Leu Thr Leu Thr Ala Arg Ala Trp Glu 65 70 75 80 Arg His Ser Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly His Thr Val 85 90 95 Glu Lys Ser Leu Ser Arg Ala Asp Cys Ser 100 105 <210> 77 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse light chain lambda constant region nucleotide sequence <400> 77 ggccagccta agagcagccc tagcgtgacc ctgtttcctc caagcagcga ggaactggaa 60 acaaacaagg ccacactcgt gtgcaccatc accgacttct atcccggcgt ggtcaccgtg 120 gattggaagg tggacggaac ccctgtgaca caaggcatgg aaaccacaca gcccagcaag 180 cagagcaaca acaagtacat ggccagcagc tacctgacac tgaccgccag agcctgggag 240 agacacagct cctacagctg ccaagtgaca cacgagggcc acaccgtgga aaagtctctg 300 agcagagccg actgcagc 318

Claims (15)

  1. ASM(acid sphingomyelinase) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ASM 단백질의 N-말단으로부터 53 내지 72번째 아미노산 단편, 101 내지 123번째 아미노산 단편, 135 내지 159번째 아미노산 단편, 135 내지 155번째 아미노산 단편, 218 내지 228번째 아미노산 단편 또는 259 내지 269번째 아미노산 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 에피토프에 결합하는, 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 68 내지 73으로 각각 기재된 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 에피토프에 결합하는, 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    서열번호 61로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 CDR1(X1YX2MS), 서열번호 62로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 CDR2(X3IX4X5X6X7X8X9X10YYADSVKG), 및 서열번호 27, 30, 33, 36, 39 및 42로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
    서열번호 63으로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 CDR1(X11GSSSNIGX12NX13VX14), 서열번호 64로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 CDR2(X15X16X17X18RPS), 및 서열번호 65로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 CDR3(X19X20WDX21SLX22X23YV)을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 X1 및 X2는 각각 아스파라긴(asparagine, Asn), 글리신(glycine, Gly), 세린(serine, Ser), 아스파르트산(aspartic acid, Asp), 알라닌(alanine, Ala) 및 티로신(tyrosine, Tyr)으로 구성된 군으로부터 선택,
    상기 X3 내지 X10은 각각 글리신, 류신(leucine, Leu), 알라닌, 세린, 티로신, 프롤린(proline, Pro), 아스파라긴, 리신(lysine, Lys) 및 이소류신(isoleucine, Ile)으로 구성된 군으로부터 선택,
    상기 X11 내지 X14는 각각 트레오닌(threonine, Thr), 세린, 아스파라긴, 알라닌, 프롤린 및 티로신으로 구성된 군으로부터 선택,
    상기 X15 내지 X18은 각각 티로신, 알라닌, 아스파르트산, 세린, 아스파라긴, 히스티딘(histidine, His), 글루타민(glutamine, Gln) 및 리신으로 구성된 군으로부터 선택, 및
    상기 X19 내지 X23은 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파르트산 및 아스파라긴으로 구성된 군으로부터 선택되는, 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 X1은 아스파라긴, 글리신, 세린 또는 아스파르트산,
    상기 X2는 알라닌 또는 티로신,
    상기 X3는 글리신, 류신, 알라닌 또는 세린,
    상기 X4는 티로신 또는 세린,
    상기 X5는 프롤린 또는 티로신,
    상기 X6은 아스파라긴 또는 글리신,
    상기 X7 및 X8은 각각 글리신 또는 세린,
    상기 X9는 아스파라긴 또는 세린,
    상기 X10은 리신 또는 이소류신,
    상기 X11은 트레오닌 또는 세린,
    상기 X12는 아스파라긴 또는 세린,
    상기 X13은 알라닌, 프롤린, 트레오닌 또는 티로신,
    상기 X14는 아스파라긴, 티로신 또는 세린,
    상기 X15는 티로신, 알라닌, 아스파르트산 또는 세린,
    상기 X16는 아스파르트산 또는 아스파라긴,
    상기 X17은 세린 또는 아스파라긴,
    상기 X18은 히스티딘, 글루타민 또는 리신,
    상기 X19는 글리신 또는 알라닌,
    상기 X20은 알라닌, 세린 또는 트레오닌,
    상기 X21은 티로신, 세린, 알라닌 또는 아스파르트산,
    상기 X22는 세린 또는 아스파라긴, 및
    상기 X23은 알라닌 또는 글리신인, 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    서열번호 25, 28, 31, 34, 37 또는 40으로 기재된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 중쇄 CDR1,
    서열번호 26, 29, 32, 35, 38 및 41로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 중쇄 CDR2, 및
    서열번호 27, 30, 33, 36, 39 및 42로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
    서열번호 43, 46, 49, 52, 55 및 58로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR1,
    서열번호 44, 47, 50, 53, 56 및 59로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR2, 및
    서열번호 45, 48, 51, 54, 57 및 60으로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    서열번호 25, 26 및 27로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역,
    서열번호 28, 29 및 30으로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역,
    서열번호 31, 32 및 33으로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역,
    서열번호 34, 35 및 36으로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역,
    서열번호 37, 38 및 39로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및
    서열번호 40, 41 및 42로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역으로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 가변영역; 및
    서열번호 43, 44 및 45로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
    서열번호 46, 47 및 48로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
    서열번호 49, 50 및 51로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
    서열번호 52, 53 및 54로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
    서열번호 55, 56 및 57로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 및
    서열번호 58, 59 및 60으로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역으로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 가변영역을 포함하는, 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    서열번호 25, 26 및 27로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 43, 44 및 45로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역;
    서열번호 28, 29 및 30으로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 46, 47 및 48로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역;
    서열번호 31, 32 및 33으로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 49, 50 및 51로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역;
    서열번호 34, 35 및 36으로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 52, 53 및 54로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역;
    서열번호 37, 38 및 39로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 55, 56 및 57로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역; 또는
    서열번호 40, 41 및 42로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 58, 59 및 60으로 각각 기재된 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 ASM 단백질은 포유동물 유래인, 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 ASM 단백질은 서열번호 66 또는 67로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드인, 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 뇌질환은 퇴행성 뇌질환인, 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 아밀로이드-β의 발현 또는 응집 수준이 정상보다 높거나 높을 위험이 있는 것인, 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 경도인지장애, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 다운증후군, 아밀로이드성 뇌졸증, 전신성 아밀로이드병, 더취(Dutch)형 아밀로이드증, 니만-픽병, 노인성 치매, 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 척수소뇌성 운동실조증(spinocerebellar atrophy), 뚜렛 증후군(Tourette's syndrome), 프리드리히 보행실조(Friedrich's Ataxia), 마차도-조셉병(Machado-Joseph's disease), 루이소체 치매, 근육긴장이상(dystonia), 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy) 또는 전두측두엽 치매인, 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. ASM 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 뇌질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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