TWI839741B - 包含與酸性鞘磷脂酶蛋白特異性結合的抗體作為有效成分的用於治療腦部疾病的藥物組合物 - Google Patents
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Abstract
本發明是關於一種與酸性鞘磷脂酶（ASM，acid sphingomyelinase）蛋白特異性結合的抗體的用途。具體地，本發明的抗體或其抗原結合片段以高的結合力與酸性鞘磷脂酶蛋白結合，顯著抑制存在於細胞膜中的酸性鞘磷脂酶蛋白的活性，在阿爾茨海默疾病動物模型中不呈現毒性並具有認知記憶力改善效果、抑制酸性鞘磷脂酶蛋白活性的效果、抑制β澱粉樣蛋白以及tau蛋白積累的效果以及抑制神經炎症產生的效果，從而可用於治療腦部疾病。
Description
本發明是關於與酸性鞘磷脂酶（acid sphingomyelinase）蛋白特異性結合的抗體的用途。
鞘脂代謝會對正常細胞訊號傳遞進行調節，鞘脂代謝的不正常變化會對包括阿爾茨海默疾病在內的多種神經退行性疾病產生影響。作為調節鞘脂代謝的酶的酸性鞘磷脂酶（ASM，acid sphingomyelinase）蛋白為幾乎在所有種類的細胞表達的蛋白質，對鞘脂代謝以及細胞膜周轉（turnover）起到重要作用。
在阿爾茨海默疾病等神經退行性疾病患者的大腦中，酸性鞘磷脂酶蛋白的活性比正常人明顯增加。與之相關的內容有韓國專利授權第10-1521117號，其中揭示了通過抑制過表達的酸性鞘磷脂酶蛋白的活性或抑制表達成酸性鞘磷脂酶蛋白來抑制β-澱粉樣蛋白的堆積並改善學習能力以及記憶力，從而可治療神經退行性疾病。並且，近期在抑鬱症等神經疾病中也表現出酸性鞘磷脂酶蛋白的活性增加，因而可通過抑制上述酸性鞘磷脂酶蛋白的表達或活性來改善抑鬱症。
但是，直接抑制酸性鞘磷脂酶蛋白的表達或活性的物質尚未被開發，只是間接抑制酸性鞘磷脂酶蛋白的表達的幾種抑制劑問世。例如，在抑鬱症的治療中會用到三環抗抑鬱藥（tricyclic antidepressant），其中有阿米替林（amitriptyline）、地昔帕明（desipramine）、米帕明（mipramine）等。這些三環抗抑鬱藥的開發雖不是以酸性鞘磷脂酶蛋白抑制劑作為目的，但通過多種研究結果證明了呈現出酸性鞘磷脂酶蛋白抑制效果。三環抗抑鬱藥的主要藥理機制為通過在神經細胞中抑制神經遞質的再吸收來增加它們的活性，作為酸性鞘磷脂酶抑制劑的作用為附帶作用。但是，三環抗抑鬱藥可通過對神經系統以及神經細胞產生作用來誘發視線模糊、光感受性增加、嘔吐等的副作用。
[發明所欲解決之問題]
本發明的目的在於，提供與酸性鞘磷脂酶蛋白特異性結合的抗體的用途。
[解決問題之技術手段]
為了實現上述目的，本發明提供一種用於預防或治療腦部疾病的藥物組合物，其包含與酸性鞘磷脂酶（ASM，acid sphingomyelinase）蛋白特異性結合的抗體或其抗原結合片段作為有效成分。
並且，本發明提供一種用於預防或改善腦部疾病的保健功能食品，其包含與酸性鞘磷脂酶蛋白特異性結合的抗體或其抗原結合片段作為有效成分。
[對照先前技術之功效]
本發明的抗體或其抗原結合片段以高的結合力與酸性鞘磷脂酶蛋白特異性結合，顯著抑制存在於細胞膜中的酸性鞘磷脂酶蛋白的活性，在阿爾茨海默疾病動物模型中不呈現毒性並具有認知記憶力改善效果、抑制酸性鞘磷脂酶蛋白活性的效果、抑制β澱粉樣蛋白以及tau蛋白積累的效果以及抑制神經炎症產生的效果，從而可用於治療腦部疾病。
以下，詳細說明本發明。
本發明提供一種用於預防或治療腦部疾病的藥物組合物，其包含與酸性鞘磷脂酶（ASM，acid sphingomyelinase）蛋白特異性結合的抗體或其抗原結合片段作為有效成分。
在本說明書中使用的術語“酸性鞘磷脂酶（ASM，acid sphingomyelinase）蛋白”意味著作為調節鞘脂代謝的SMase（sphingomyelinase）族之一的酶。上述酸性鞘磷脂酶蛋白促進將鞘磷脂（sphingomyelin）分解成神經醯胺（ceramide）以及磷酸膽鹼（phosphorylcholine）的過程，可根據表示最佳酶活性的pH來分為鹼性、中性或酸性。
上述酸性鞘磷脂酶蛋白可包括發明所屬技術領域中周知的所有種類的酸性鞘磷脂酶蛋白。具體地，上述酸性鞘磷脂酶蛋白可源自哺乳動物，更具體地，可源自人、猴子、大鼠或小鼠。並且，上述酸性鞘磷脂酶蛋白可包含發明所屬技術領域中被知曉為酸性鞘磷脂酶蛋白的所有胺基酸序列。作為一例，上述酸性鞘磷脂酶蛋白可以為由分別由序列識別號66或67所示的胺基酸序列組成的多肽或對其進行編碼的核酸。
只要可維持相同或相對應的生物學活性，則上述酸性鞘磷脂酶蛋白可以為在由序列識別號66或67所示的胺基酸序列添加、缺失或置換一個或一個以上的胺基酸的。在此情況下，胺基酸的置換可以為在不對整個蛋白質的電荷，即極性或疏水性產生影響的情況或影響程度低的範圍內執行的保守性置換。並且，上述酸性鞘磷脂酶蛋白可與分別由序列識別號66或67所示的胺基酸序列具有80％以上、90％以上、95％以上、97％以上或99％以上的同源性。並且，只要能夠維持相同或相對應的生物學活性，則上述酸性鞘磷脂酶蛋白可以僅包含酸性鞘磷脂酶蛋白的一部分。
在本說明書中使用的術語“抗體（antibody）”意味著通過與抗原相結合來妨礙抗原的作用或去除抗原的免疫蛋白。上述抗體可包括發明所屬技術領域中所包含的所有種類的抗體。具體地，上述抗體可包括IgM、IgD、IgG、IgA以及IgE，分別包括由作為對重鏈恆定區域進行編碼的基因的μ、δ、γ、α以及ε組成的重鏈。通常，在抗體技術中主要使用IgG，這重新由IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的同型（isotype）組成，它們各自的結構以及功能特性可不同。上述抗體可包括將源自非-人抗體的最小序列包含在其中的人化抗體、由源自人的序列組成的人抗體或混合源自不同物種的序列的嵌合抗體等的全部。
上述IgG可由2個約50kDa的重鏈（heavy chain）蛋白和2個約25kDa的輕鏈（light chain）蛋白形成Y字形的非常穩定的結構（約150kDa）。組成抗體的輕鏈以及重鏈可在抗體之間劃分為胺基酸序列不同的可變區域（variable region）以及胺基酸序列相同的恆定區域（constant region）。在此情況下，重鏈恆定區域包括CH1域、絞合（hinge，H）域、CH2域以及CH3域，各個域由兩個β-折疊（β-sheet）組成，可由分子內二硫鍵（disulfide bond）相連接。並且，輕鏈恆定區域可包括CL域。另一方面，由重鏈的可變區域以及輕鏈的可變區域這兩個相結合來形成抗原結合部位（antigen binding site），上述抗原結合部位可在Y字形的兩個分支各存在一個。在全長的抗體中，將可與抗原相結合的部分稱作Fab（antibody binding fragment），將不與抗原相結合的部分稱作Fc（crystallizable fragment），Fab以及Fc可由絞合相連接。在本發明的一實施例中，上述IgG可以為源自小鼠的IgG，具體地，可包括由序列識別號74所示的胺基酸序列組成的小鼠IgG重鏈恆定區域以及由序列識別號76所示的胺基酸序列組成的小鼠輕鏈λ恆定區域。並且，源自上述小鼠的IgG可包括由序列識別號75所示的鹼基序列組成的小鼠IgG重鏈恆定區域以及由序列識別號77所示的鹼基序列組成的小鼠輕鏈λ恆定區域。
本發明的抗體不僅包括全長的抗體，還包括其的抗原結合片段。具體地，上述抗原結合片段可意味著除了起到向細胞或補體傳遞與抗原之間的結合刺激的功能的Fc的部分。作為一例，抗體的抗原結合片段可包括Fab、scFv、F（ab）2以及Fv等的全部，還可包括單域抗體（single domain antibody）或微型抗體（minibody）等的第三代抗體片段。
在本發明的一實施方式中，上述抗體或抗原結合片段與選自由從酸性鞘磷脂酶蛋白的N-末端起第53位胺基酸片段至第72位胺基酸片段、第101位胺基酸片段至第123位胺基酸片段、第135位胺基酸片段至第159位胺基酸片段、第135位胺基酸片段至第155位胺基酸片段、第218位胺基酸片段至第228位胺基酸片段以及第259位胺基酸片段至第269位胺基酸片段組成的組中的一個以上的表位相結合。在此情況下，上述酸性鞘磷脂酶蛋白可具有如上所述的特徵。在本發明的一實施例中，從上述酸性鞘磷脂酶蛋白的N-末端起第53位胺基酸片段至第72位胺基酸片段可以為由序列識別號68（TAINLGLKKEPNVARVGSVA）所示的胺基酸序列組成的多肽，第101位胺基酸片段至第123位胺基酸片段可以為由序列識別號69（VWRRSVLSPSEACGLLLGSTCGH）所示的胺基酸序列組成的多肽，第135位胺基酸片段至第159位胺基酸片段可以為由序列識別號70（PTVPKPPPKPPSPPAPGAPVSRILF）所示的胺基酸序列組成的多肽，第135位胺基酸片段至第155位胺基酸片段可以為由序列識別號71（PTVPKPPPKPPSPPAPGAPVS）所示的胺基酸序列組成的多肽，第218位胺基酸片段至第228位胺基酸片段可以為由序列識別號72（SGLGPAGPFDM）所示的胺基酸序列組成的多肽，第259位胺基酸片段至第269位胺基酸片段可以為由序列識別號73（VRKFLGPVPVY）所示的胺基酸序列組成的多肽。即，在本發明的另一實施方式中，上述抗體或抗原結合片段可與選自由分別由序列識別號68至73所示的多肽組成的組中的一個以上的表位相結合。
上述“表位（epitope）”這一術語為抗體可識別抗原的特定部位，意味著可使抗體 特異性結合的蛋白質決定部位。上述表位以相同的含義來與與決定部位（determinant）或抗原決定部位（antigenic determinant）等的術語通用。上述表位由具有化學活性的表面分子組組成，例如由胺基酸或糖側鏈組成，通常具備特定三維結構特徵，不僅如此，具備特定電荷特性。
在本發明的一實施方式中，上述抗體或其抗原結合片段可包括：重鏈可變區域，包含由序列識別號61所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1（X1YX2MS）、由序列識別號62所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR2（X3IX4X5X6X7X8X9X10YYADSVKG）以及選自由分別由序列識別號27、30、33、36、39以及42所示的胺基酸序列組成的組中的重鏈CDR3；以及輕鏈可變區域，包含由序列識別號63所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1（X11GSSSNIGX12NX13VX14）、由序列識別號64所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR2（X15X16X17X18RPS）以及由序列識別號65所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR3（X19X20WDX21SLX22X23YV）。
上述術語“CDR（complementarity determining region）”為作為每個抗體在抗體的重鏈以及輕鏈可變區域內具有不同胺基酸序列的部位的高變區（hypervariable region），意味著實際與抗原相結合的部位。在抗體的立體結構中，CDR以環狀（loop）位於抗體的表面，可在環下方存在結構性地對其進行支撐的FR（framework region）。重鏈以及輕鏈均分別具有三個環結構，這些六個環結構可相合併與抗原直接接觸。方便起見，可將作為具有上述六個環結構的抗原結合部位的CDR分別稱作重鏈CDR1、重鏈CDR2、重鏈CDR3、輕鏈CDR1、輕鏈CDR2或輕鏈CDR3。
作為一例，在由上述序列識別號61所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1（X1YX2MS）中，X1以及X2可分別從酸性胺基酸以及中性胺基酸中選擇。具體地上述X1可以是酸性胺基酸或中性胺基酸，X2可以是中性胺基酸。例如，上述X1以及X2可分別從由天冬醯胺（asparagine，Asn）、甘胺酸（glycine，Gly）、絲胺酸（serine，Ser）、天冬胺酸（aspartic acid，Asp）、丙胺酸（alanine，Ala）以及酪胺酸（tyrosine，Tyr）組成的組中選擇。具體地，上述X1可以是天冬醯胺、甘胺酸、絲胺酸或天冬胺酸，X2可以是丙胺酸或酪胺酸。在本發明的一實施例中，上述重鏈CDR1可由序列識別號25、28、31、34、37或40所示的胺基酸序列組成。
並且，在由上述序列識別號62所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR2（X3IX4X5X6X7X8X9X10YYADSVKG）中，X3至X10可分別從中性胺基酸以及鹼性胺基酸中選擇。具體地，上述X3以及X4至X9可分別是中性胺基酸，X10可以是中性胺基酸或鹼性胺基酸。例如，上述X3至X10可分別從由甘胺酸、白胺酸（leucine，Leu）、丙胺酸、絲胺酸、酪胺酸、脯胺酸（proline，Pro）、天冬醯胺、離胺酸（lysine，Lys）以及異白胺酸（isoleucine，Ile）組成的組中選擇。具體地，上述X3可以是甘胺酸、白胺酸、丙胺酸或絲胺酸，X4可以是酪胺酸或絲胺酸，X5可以是脯胺酸或酪胺酸，X6可以是天冬醯胺或甘胺酸，X7以及X8可分別是甘胺酸或絲胺酸，X9可以是天冬醯胺或絲胺酸，X10可以是離胺酸或異白胺酸。在本發明的一實施例中，上述重鏈CDR2可由序列識別號26、29、32、35、38或41所示的胺基酸序列組成。
並且，在由上述序列識別號63所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1（X11GSSSNIGX12NX13VX14）中，X11至X14可分別從中性胺基酸中選擇。例如上述X11至X14可分別從由蘇胺酸（threonine，Thr）、絲胺酸、天冬醯胺、丙胺酸、脯胺酸以及酪胺酸組成的組中選擇。具體地，上述X11可以是蘇胺酸或絲胺酸，X12可以是天冬醯胺或絲胺酸，X13可以是丙胺酸、脯胺酸、蘇胺酸或酪胺酸，X14可以是天冬醯胺、酪胺酸或絲胺酸。在本發明的一實施例中，上述輕鏈CDR1可由序列識別號43、46、49、52、55或58所示的胺基酸序列組成。
並且，在由上述序列識別號64所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR2（X15X16X17X18RPS）中，X15至X18可分別從酸性胺基酸、鹼性胺基酸以及中性胺基酸選擇。具體地，上述X15以及X16可分別是酸性胺基酸或中性胺基酸，X17可以是中性胺基酸，X18可以是鹼性胺基酸或中性胺基酸。例如，上述X15至X18可分別從由酪胺酸、丙胺酸、天冬胺酸、絲胺酸、天冬醯胺、組胺酸（histidine，His）、麩醯胺酸（glutamine，Gln）以及離胺酸組成的組中選擇。具體地，X15可以是酪胺酸、丙胺酸、天冬胺酸或絲胺酸，X16可以是天冬胺酸或天冬醯胺，X17可以是絲胺酸或天冬醯胺，X18可以是組胺酸、麩醯胺酸或離胺酸。在本發明的一實施例中，上述輕鏈CDR2由序列識別號44、47、50、53、56或59所示的胺基酸序列組成。
並且，在由上述序列識別號65所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR3（X19X20WDX21SLX22X23YV）中，X19至X23可分別從中性胺基酸選擇。例如，上述X19至X23可從由甘胺酸、丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、天冬胺酸以及天冬醯胺組成的組中選擇。具體地，X19可以是甘胺酸或丙胺酸，X20可以是丙胺酸、絲胺酸或蘇胺酸，X21可以是酪胺酸、絲胺酸、丙胺酸或天冬胺酸，X22可以是絲胺酸或天冬醯胺，X23可以是丙胺酸或甘胺酸。在本發明的一實施例中，上述輕鏈CDR3由序列識別號45、48、51、54、57或60所示的胺基酸序列組成。
在本發明的另一實施方式中，上述抗體或其抗原結合片段可包括：重鏈可變區域，包含選自由分别由序列識別號25、28、31、34、37以及40所示的胺基酸序列組成的組中的重鏈CDR1、選自由分別由序列識別號26、29、32、35、38以及41所示的胺基酸序列組成的組中的重鏈CDR2以及選自由分別由序列識別號27、30、33、36、39以及42所示的胺基酸序列組成的組中的重鏈CDR3；以及輕鏈可變區域，包含選自由分別由序列識別號43、46、49、52、55以及58所示的胺基酸序列組成的組中的輕鏈CDR1、選自由分別由序列識別號44、47、50、53、56以及59所示的胺基酸序列組成的組中的輕鏈CDR2以及選自由分別由序列識別號45、48、51、54、57以及60所示的胺基酸序列組成的組中的輕鏈CDR3。
並且，上述抗體或其抗原結合片段可包括：重鏈可變區域，選自由將由分別由序列識別號25、26以及27所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3包含在其中的重鏈可變區域、將由分別由序列識別號28、29以及30所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3包含在其中的重鏈可變區域、將由分別由序列識別號31、32以及33所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3包含在其中的重鏈可變區域、將由分別由序列識別號34、35以及36所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3包含在其中的重鏈可變區域、將由分別由序列識別號37、38以及39所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3包含在其中的重鏈可變區域以及將由分別由序列識別號40、41以及42所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3包含在其中的重鏈可變區域組成的組；以及輕鏈可變區域，選自由將由分別由序列識別號43、44以及45所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3包含在其中的輕鏈可變區域、將由分別由序列識別號46、47以及48所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3包含在其中的輕鏈可變區域、將由分別由序列識別號49、50以及51所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3包含在其中的輕鏈可變區域、將由分別由序列識別號52、53以及54所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3包含在其中的輕鏈可變區域、將由分別由序列識別號55、56以及57所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3包含在其中的輕鏈可變區域以及將由分別由序列識別號58、59以及60所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3包含在其中的輕鏈可變區域組成的組。
進而，上述抗體或其抗原結合片段可包括：將由分別由序列識別號25、26以及27所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3包含在其中的重鏈可變區域以及將由分別由序列識別號43、44以及45所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3包含在其中的輕鏈可變區域；將由分別由序列識別號28、29以及30所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3包含在其中的重鏈可變區域以及將由分別由序列識別號46、47以及48所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3包含在其中的輕鏈可變區域；將由分別由序列識別號31、32以及33所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3包含在其中的重鏈可變區域以及將由分別由序列識別號49、50以及51所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3包含在其中的輕鏈可變區域；將由分別由序列識別號34、35以及36所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3包含在其中的重鏈可變區域以及將由分別由序列識別號52、53以及54所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3包含在其中的輕鏈可變區域；將由分別由序列識別號37、38以及39所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3包含在其中的重鏈可變區域以及將由分別由序列識別號55、56以及57所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3包含在其中的輕鏈可變區域；或將由分別由序列識別號40、41以及42所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3包含在其中的重鏈可變區域以及將由分別由序列識別號58、59以及60所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3包含在其中的輕鏈可變區域。
作為一例，上述重鏈可變區域可以是由序列識別號1、3、5、7、9或11所示的胺基酸序列組成的多肽，上述輕鏈可變區域可以是由序列識別號13、15、17、19、21或23所示的胺基酸序列組成的多肽。
並且，本發明的抗體或其抗原結合片段可根據需求變形而得。具體地，上述抗體或其抗原結合片段可通過綴合（conjugation）、糖化（glycosylation）、標記或它們的組合來變形。具體地，上述抗體或其抗原結合片段可通過辣根過氧化物酶（HRP，horseradish peroxidase）、鹼性磷酸酶（alkaline phosphatase）、半抗原（hapten）、生物素、鏈酶親和素、螢光物質、放射性物質、量子點、聚乙二醇（PEG，polyethylene glycol）、組胺酸標記等變形。不僅如此，上述抗體或其抗原結合片段還可根據需求來與其他藥物綴合。
上述抗體或其抗原結合片段可根據發明所屬技術領域中周知的單克隆抗體製備方法來製備，上述製備方法可由發明所屬技術領域中具有通常知識者進行適當變形。作為一例，上述抗體可通過在使用從由抗原實現免疫的動物獲取的B淋巴細胞製備雜交瘤來實現製備，或可利用噬菌體顯示技術來製備。
在本發明的實施方式中，本發明的藥物組合物中所包含的抗體或其抗原結合片段可以包含編碼上述抗體或其抗原結合片段的核酸。組成上述抗體或其抗原結合片段的胺基酸序列是公知的，因此，編碼它們的核酸序列對發明所屬技術領域中具有通常知識者也是顯而易見的。並且，只要上述核酸序列維持由此翻譯的抗體或該抗體的抗原結合片段的活性，則可以是添加、缺失或置換一個或一個以上的鹼基的。
在本發明的再一實施方式中，本發明的藥物組合物可以包含表達載體，上述表達載體包含編碼上述抗體或其抗原結合片段的核酸。
在本說明書中使用的術語“表達載體（expression vector）”作為在宿主細胞中表達靶基因的手段，可包括質粒載體、黏粒載體、噬菌體載體、病毒載體等全部。上述表達載體可為了從其所包含的核酸生成肽而包含必要的要素。具體地，上述表達載體可包含訊號序列、複製源、標記基因、啟動子、轉錄終止序列等。在此情況下，本發明的抗體或其抗原結合片段被編碼的核酸可與啟動子動作性地相連接。
作為一例，用於原核細胞的表達載體可包含進行轉錄的啟動子、用於開始解讀的核糖體結合位置以及轉錄和解讀的終止序列。另一方面，用於真核細胞的表達載體可包含源自哺乳動物或哺乳動物病毒的啟動子以及多腺苷酸化序列。
並且，上述表達載體所包含的標記基因可使用發明所屬技術領域中周知的所有標記基因，具體地，可以是抗生素耐藥性基因。具體地，上述抗生素耐藥性基因可以是包括氨苄西林、艮他黴素、羧比西林、氯黴素、鏈黴素、卡那黴素、新黴素、四環素等在內的對抗生素表現出耐藥性的基因。
在本發明的另一實施方式中，本發明的藥物組合物可以包含宿主細胞作為有效成分，上述宿主細胞包含如上所述的核酸或表達載體。上述宿主細胞可使用在發明所屬技術領域中可用於抗體或其抗原結合片段生產的所有種類的細胞。具體地，上述宿主細胞可以是原核細胞、酵母或真核細胞。上述原核細胞可包括大腸菌（E.coli）、芽孢桿菌屬菌株、碳黴素屬菌株、假單胞菌屬菌株、葡萄球菌屬菌株等，上述酵母可包括釀酒酵母等。另一方面，上述真核細胞可包括COS-7、BHK、CHO、CHOK1、DXB-11、DG-44、CHO/-DHFR、CV1、HEK293、TM4、VERO、HELA、MDCK、BRL 3A、W138、Hep G2、SK-Hep、MMT、TRI、MRC 5、FS4、3T3、RIN、A549、PC12、K562、PERC6、SP2/0、NS-0、U20S以及HT1080等。
並且，上述宿主細胞可以是根據發明所屬技術領域中周知的方法轉染如上所述的核酸或表達載體的。具體地，上述轉染可通過暫態轉染（transient transfection）、微注射、轉導（transduction）、細胞融合、磷酸鈣沉澱法、脂質體介導轉染（liposome-mediated transfection）、DEAE葡聚糖-介導轉染（DEAE dextran-mediated transfection）、凝聚胺-介導轉染（polybrene-mediated transfection）、電穿孔法、基因槍（gene gun）等的方法來執行。並且，上述方法可由發明所屬技術領域中具有通常知識者進行適當變形。
上述腦部疾病可以包含發明所屬技術領域已知的所有種類的腦部疾病，具體地，上述腦部疾病可以為退行性腦部疾病。例如，上述退行性腦部疾病可以為β澱粉樣蛋白的表達或聚集水準比正常高或有高的風險的疾病。例如，上述退行性腦部疾病可以為癡呆、阿爾茨海默疾病、帕金森病、亨廷頓氏病、輕度認知障礙、澱粉樣腦血管病、唐氏綜合征、澱粉樣蛋白性中風、系統性澱粉樣變性病、Dutch型澱粉樣變性症、尼曼-皮克病、老年性癡呆、肌萎縮側索硬化（amyotrophic lateral sclerosis）、脊髓小腦萎縮症（spinocerebellar atrophy）、圖雷特綜合征（Tourette’s syndrome）、弗裡德希氏共濟失調（Friedrich’s Ataxia）、馬查多-約瑟夫病（Machado-Joseph’s disease）、路易體癡呆、肌張力障礙（dystonia）、進行性核上性麻痹（progressive supranuclear palsy）或額顳葉癡呆。
在本發明的藥物組合物中，相對於組合物總重量，可以包含10重量百分比至95重量百分比的作為有效成分的與酸性鞘磷脂酶蛋白特異性結合的抗體或其抗原結合片段。並且，本發明的藥物組合物除了上述有效成分以外，還可以額外包含一種以上功能相同或類似的有效成分。
本發明的藥物組合物可以包含在生物製劑中通常使用的載體、稀釋劑、賦形劑或它們的混合物。藥學上可接受的載體為只要是適合將組合物傳遞到體內，都可以使用。具體地，上述載體可以為在默克索引（Merck Index，第13版，默克公司）中記載的化合物、食鹽水、滅菌水、點滴液、葡萄糖溶液、麥芽糖糊精溶液、甘油、乙醇或它們的混合物。並且，根據需要可以添加如抗氧化劑、緩衝液、抑菌劑等常規添加劑。
在將上述組合物製劑化的情況下，可以添加通常使用的稀釋劑或賦形劑，如填充劑、增量劑、黏合劑、潤濕劑、崩解劑、表面活性劑等。
本發明的組合物可以製成口服給藥用製劑或腸胃外給藥用製劑。作為口服給藥用製劑可以包含固體製劑以及液體製劑。上述固體製劑可以為片劑、丸劑、散劑、顆粒劑、膠囊劑或錠劑，可通過在上述組合物中添加至少一種以上賦形劑來配製這種固體製劑。上述賦形劑可以為澱粉、碳酸鈣、蔗糖、乳糖、明膠或其混合物。並且，上述固體製劑可以包含例如檸檬酸鎂、滑石等潤滑劑。另一方面，上述液體製劑可以為懸浮劑、內用液劑、乳劑或糖漿劑。此時，上述液體製劑可以包含如潤濕劑、甜味劑、芳香劑、保存劑等的賦形劑。
上述腸胃外給藥用製劑可以包含注射劑、栓劑、呼吸系統吸入用粉末、噴霧用氣霧劑、粉末以及霜劑等。上述注射劑可以包含滅菌的水溶液、非水溶劑、懸浮溶劑、乳劑等。此時，可以使用如丙二醇、聚乙二醇、橄欖油等植物性油或者如油酸乙酯等可注射的酯類作為非水溶劑或懸浮溶劑。
本發明的組合物可以根據所需的方法進行口服給藥或腸胃外給藥。腸胃外給藥可以包含腹腔內、直腸內、皮下、靜脈、肌肉內或胸部內注射方式。
上述組合物可以以藥學上有效的量給藥。這根據疾病的種類、重症程度、藥物的活性、對於藥物的患者的敏感度、給藥時間、給藥方式、治療時間、同時使用的藥物等而有所不同。但是，為了達到理想的效果，本發明的藥物組合物中所包含的有效成分的量可以為0.0001g/kg至1000g/kg，具體可以為0.001g/kg至500g/kg。上述給藥可以以一天一次或數次的方式進行。
本發明的組合物可以單獨使用或與其他治療劑聯用。當聯用時，可以依次給藥或同時給藥。
並且，本發明提供一種用於預防或改善腦部疾病的保健功能食品，其包含與酸性鞘磷脂酶蛋白特異性結合的抗體或其抗原結合片段作為有效成分。
本發明的保健功能食品中作為有效成分所包含的與酸性鞘磷脂酶蛋白特異性結合的抗體或其抗原結合片段可以具有如上所述的特徵。
本發明的與酸性鞘磷脂酶蛋白特異性結合的抗體或其抗原結合片段可以直接添加至食品中，也可以與其他食品或食品成分一起使用。此時，所添加的有效成分的含量可根據目的而定，一般可以為整個食品重量的0.01重量份至90重量份。
保健功能食品的形式以及種類沒有特別的限制。具體地，上述保健功能食品可以為片劑、膠囊、粉末、顆粒、液體及丸的形式。上述保健功能食品還可以包含各種增香劑、甜味劑或天然碳水化合物等額外成分。上述甜味劑可以為天然或合成甜味劑，天然甜味劑的例子有索馬甜、甜葉菊提取物等。另一方面，作為合成甜味劑的例子有糖精、阿斯巴甜等。並且，上述天然碳水化合物可以為單糖、二糖、多糖、寡糖以及糖醇等。
本發明的保健功能食品除了如上所述的額外成分以外，還可以包含營養補充劑、維生素、電解質、風味劑、著色劑、果膠酸及其鹽、海藻酸及其鹽、有機酸、保護性膠體增稠劑、pH調節劑、穩定劑、防腐劑、甘油、酒精等。這些成分可以單獨使用或組合使用。上述添加劑的比例可以在每100重量份的本發明的組合物0.01重量份至0.1重量份的範圍內選擇。
以下，通過以下實施例詳細說明本發明，但是，以下實施例僅用於例示本發明，本發明並不限於此。只要與本發明的發明要求保護範圍中所記載的技術思想實際上形成相同的結構並提供相同的作用效果，則都將屬於本發明的技術範圍內。
實施例1．製備與酸性鞘磷脂酶（ASM，acid sphingomyelinase）蛋白特異性結合的抗體
通過以下方法製備了與人酸性鞘磷脂酶蛋白（序列識別號66）以及小鼠酸性鞘磷脂酶蛋白（序列識別號67）特異性結合的抗體。
具體地，重組人以及小鼠酸性鞘磷脂酶蛋白以及人合成scFv-噬菌體展示文庫來按普通方法執行篩選（panning）來挑選了具有與人酸性鞘磷脂酶蛋白或小鼠與酸性鞘磷脂酶蛋白特異性結合的scFv的噬菌體。對所挑選的scFv進行編碼的核酸序列進行了分析並確認了由此生成的胺基酸序列。以在所確認到的scFv序列的重鏈可變區域以及輕鏈可變區域各自的羧基端（carboxy terminus）連接由分別由序列識別號75以及77所示的鹼基序列組成的小鼠重鏈恆定區域（constant region）以及小鼠輕鏈λ恆定區域的形態表達的方式製備了表達載體。在此情況下，將組成所製備的表達載體所包含的scFv的重鏈可變區域的胺基酸序列以及核酸序列顯示在表1，將輕鏈可變區域的胺基酸序列以及核酸序列顯示在表2。
表1
| 抗體# | 序列 | 序列識別號 |
| #9101 | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSGIYPNGGNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNAYRFDYWGQGTLVTVSS | 序列識別號1 |
| GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAATTATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGGATCTATCCTAATGGTGGTAATAAATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAAAATGCTTATCGTTTCGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA | 序列識別號2 | |
| #9102 | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYYMSWVRQAPGKGLEWVSLISPGSGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSWHHFDYWGQGTLVTVSS | 序列識別號3 |
| GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCGGTTATTATATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATTGATCTCTCCTGGTAGTGGTAGTATATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAATCTTGGCATCATTTCGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA | 序列識別號4 | |
| #9104 | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMSWVRQAPGKGLEWVSGIYYGSGNIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDTPGFDYWGQGTLVTVSS | 序列識別號5 |
| GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAATTATTATATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGGATCTATTATGGTAGTGGTAATATATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATACGCCTGGGTTCGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA | 序列識別號6 | |
| #9108 | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIYPGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVLGLTPKPFDYWGQGTLVTVSS | 序列識別號7 |
| GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAATTATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCGATCTATCCTGGTGGTGGTAGTATATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATGTTTTGGGTCTGACTCCTAAGCCGTTCGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA | 序列識別號8 | |
| #9113 | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMSWVRQAPGKGLEWVSSISPGGSSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGASLFDYWGQGTLVTVSS | 序列識別號9 |
| GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTTATTATATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCGATCTCTCCTGGTGGTAGTAGTATATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAAGGGGCGTCTCTGTTCGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA | 序列識別號10 | |
| #9123 | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISYGGGNIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVGGMCTRRQCYYDYGMDVWGQGTLVTVSS | 序列識別號11 |
| GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCGATTATGCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCGATCTCTTATGGTGGTGGTAATATATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGTTGGTGGTATGTGTACTAGGCGTCAGTGTTATTATGATTATGGTATGGACGTCTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA | 序列識別號12 |
表2
| 抗體# | 序列 | 序列識別號 |
| #9101 | QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYADSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAIGGLRSEDEADYYCGSWDYSLNAYVFGGGTKLTVL | 序列識別號13 |
| CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCTAGCGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTAGTGGCTCTTCATCCAATATTGGCAATAATTATGTCTCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGCTGATAGTAAGCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCGCTGGCCATCGGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGGTTCTTGGGATTATAGCCTGAATGCTTATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTTACGGTCCTA | 序列識別號14 | |
| #9102 | QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNPVYWYQQLPGTAPKLLIYANNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDSSLSGYVFGGGTKLTVL | 序列識別號15 |
| CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCTAGCGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTAGTGGCTCTTCATCTAATATTGGCAATAATCCTGTCTACTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGCTAATAATCAGCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCTGCTTGGGATTCTAGCCTGAGTGGTTATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTTACGGTCCTA | 序列識別號16 | |
| #9104 | QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGNNAVNWYQQLPGTAPKLLIYYDSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGAWDYSLSAYVFGGGTKLTVL | 序列識別號17 |
| CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCTAGCGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTACTGGCTCTTCATCTAATATTGGCAATAATGCTGTCAACTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATTATGATAGTCATCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGGTGCTTGGGATTATAGCCTGAGTGCTTATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTTACGGTCCTA | 序列識別號18 | |
| #9108 | QSVLTQPPSASGTPGQRVTLSCTGSSSNIGSNTVYWYQQLPGTAPKLLIYANSQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDYSLSGYVFGGGTKLTVL | 序列識別號19 |
| CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCTAGCGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCCTCTCTTGTACTGGCTCTTCATCTAATATTGGCAGTAATACTGTCTACTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGCTAATAGTCAGCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGGTTCTTGGGATTATAGCCTGAGTGGTTATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTTACGGTCCTA | 序列識別號20 | |
| #9113 | QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNAVSWYQQLPGTAPKLLIYSDNKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDASLNAYVFGGGTKLTVL | 序列識別號21 |
| CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCTAGTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTAGTGGCTCTTCATCTAATATTGGCAATAATGCTGTCTCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATTCTGATAATAAGCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGGTACTTGGGATGCTAGCCTGAATGCTTATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTTACGGTCCTA | 序列識別號22 | |
| #9123 | QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQLPGTAPKLLIYDNSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDDSLSGYVFGGGTKLTVL | 序列識別號23 |
| CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCTAGCGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTAGTGGCTCTTCATCTAATATTGGCAGTAATACTGTCAACTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATGATAATAGTAAGCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAAGATGAGGCTGATTATTACTGTGGTACTTGGGATGATAGCCTGAGTGGTTATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTTACGGTCCTA | 序列識別號24 |
在此情況下，表達載體使用了哺乳類表達載體（mammalian expression vector）。在CHO或HEK293細胞株將所製備的表達載體轉化，由此製備了與人酸性鞘磷脂酶蛋白相結合或與人酸性鞘磷脂酶蛋白以及小鼠酸性鞘磷脂酶蛋白均結合的全長抗體。
實施例2．確定互補性決定區域（complementarity determining region，CDR）
通過常規方法確認了根據上述內容製備的scFv中的互補性決定區域，最終，將重鏈可變區域的CDR序列顯示在表3，將輕鏈可變區域的CDR序列顯示在表4。
表3
| 抗體# | CDR | 序列 | 序列識別號 |
| #9101 | CDR1 | NYAMS | 序列識別號25 |
| CDR2 | GIYPNGGNKYYADSVKG | 序列識別號26 | |
| CDR3 | NAYRFDY | 序列識別號27 | |
| #9102 | CDR1 | GYYMS | 序列識別號28 |
| CDR2 | LISPGSGSIYYADSVKG | 序列識別號29 | |
| CDR3 | SWHHFDY | 序列識別號30 | |
| #9104 | CDR1 | NYYMS | 序列識別號31 |
| CDR2 | GIYYGSGNIYYADSVKG | 序列識別號32 | |
| CDR3 | DTPGFDY | 序列識別號33 | |
| #9108 | CDR1 | NYAMS | 序列識別號34 |
| CDR2 | AIYPGGGSIYYADSVKG | 序列識別號35 | |
| CDR3 | DVLGLTPKPFDY | 序列識別號36 | |
| #9113 | CDR1 | SYYMS | 序列識別號37 |
| CDR2 | SISPGGSSIYYADSVKG | 序列識別號38 | |
| CDR3 | GASLFDY | 序列識別號39 | |
| #9123 | CDR1 | DYAMS | 序列識別號40 |
| CDR2 | AISYGGGNIYYADSVKG | 序列識別號41 | |
| CDR3 | VGGMCTRRQCYYDYGMDV | 序列識別號42 |
表4
| 抗體# | CDR | 序列 | 序列識別號 |
| #9101 | CDR1 | SGSSSNIGNNYVS | 序列識別號43 |
| CDR2 | ADSKRPS | 序列識別號44 | |
| CDR3 | GSWDYSLNAYV | 序列識別號45 | |
| #9102 | CDR1 | SGSSSNIGNNPVY | 序列識別號46 |
| CDR2 | ANNQRPS | 序列識別號47 | |
| CDR3 | AAWDSSLSGYV | 序列識別號48 | |
| #9104 | CDR1 | TGSSSNIGNNAVN | 序列識別號49 |
| CDR2 | YDSHRPS | 序列識別號50 | |
| CDR3 | GAWDYSLSAYV | 序列識別號51 | |
| #9108 | CDR1 | TGSSSNIGSNTVY | 序列識別號52 |
| CDR2 | ANSQRPS | 序列識別號53 | |
| CDR3 | GSWDYSLSGYV | 序列識別號54 | |
| #9113 | CDR1 | SGSSSNIGNNAVS | 序列識別號55 |
| CDR2 | SDNKRPS | 序列識別號56 | |
| CDR3 | GTWDASLNAYV | 序列識別號57 | |
| #9123 | CDR1 | SGSSSNIGSNTVN | 序列識別號58 |
| CDR2 | DNSKRPS | 序列識別號59 | |
| CDR3 | GTWDDSLSGYV | 序列識別號60 |
實驗例1．確認與酸性鞘磷脂酶蛋白之間的結合
通過ELISA分析方法確認了與根據上述內容製備的與酸性鞘磷脂酶蛋白特異性結合的抗體的酸性鞘磷脂酶蛋白之間的結合。
首先，向多方陣96-孔板（Thermo scientific）添加100µl的1µg/ml的重組人酸性鞘磷脂酶蛋白（R&D systems）並在4℃的溫度下放置16個小時，從而塗敷了板。向所塗敷的板添加含有5％的BSA的200µl的PBS，從而在37℃的溫度下進行2個小時的反應來進行預處理，之後用含有0.05％的吐溫20（Tween 20）的PBS進行了3次清洗。其中，進行0.0001nM、0.001nM、0.01nM、0.1nM、1nM、10nM或100nM的抗-酸性鞘磷脂酶抗體處理，在37℃的溫度下進行了1個小時的反應。反應之後，用含有0.05％的吐溫的PBS清洗3次板，作為2次抗體添加了100µl的山羊抗鼠IgG-HRP（Jackson Immunoresearch）抗體。在37℃的溫度下重新對其進行1個小時的反應，用含有0.05％的吐溫的PBS進行了3次清洗。其中，添加了100µl的TMB基質（tetramethylbenzidine），在常溫下追加反應5分鐘，之後用100µl的2N硫酸溶液中斷反應，在450nm的波長下測定了吸光度。最終，將所測定的吸光度顯示在圖2，將由吸光度值計算的抗體的EC50值顯示在表5。
表5
| 抗體# | EC50（nM） |
| #9101 | 0.0815 |
| #9102 | 0.0954 |
| #9104 | 1.948 |
| #9108 | 0.3269 |
| #9123 | 0.7578 |
如圖2所示，根據上述內容製備的5種抗體均以濃度依賴性地與酸性鞘磷脂酶蛋白相結合。尤其，如表5所示，#9101抗體呈現出最低的EC50值，與酸性鞘磷脂酶蛋白之間的結合力最高。
實驗例2．確認與酸性鞘磷脂酶蛋白之間的結合親和性
使用Octet® QK384系統（Pall Life Sciences）測定了與根據上述內容製備的與酸性鞘磷脂酶蛋白特異性結合的抗體的酸性鞘磷脂酶蛋白之間的結合親和性以及相互作用動力學。
首先，通過在AR2G感測器（ForteBio）處理20mM的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺（EDC）以及40mM的N-羥基磺基琥珀酸醯亞胺（磺-NHS）溶液來使羧基活性化。另一方面，在10mM的乙酸鈉（pH 5.0，ForteBio）溶液稀釋10µg/ml的重組人酸性鞘磷脂酶蛋白或2.5µg/ml的重組小鼠酸性鞘磷脂酶蛋白進行了準備。向羧基被活性化的AR2G感測器加上稀釋上述酸性鞘磷脂酶蛋白的溶液來獲得重組人或小鼠酸性鞘磷脂酶蛋白被固定的AR2G感測器。向所獲得的酸性鞘磷脂酶蛋白被固定的感測器添加1M的乙醇胺（ForteBio）來使得未反應的剩餘羧基非活性化。其中，添加0.4nM、2nM或10nM濃度的在實施例1中製備的抗體並觀察了約900秒為止的反應物的結合相。之後，添加1×動力學緩衝液（kinetics buffer，ForteBio）並觀察了約1200秒鐘的反應物的分離相。使用Octet®分析軟體（Pall Life Sciences）確定了對於各個抗體的締合常數（association constant：Kon）、離解常數（dissociation constant：Kdis）以及平衡解離常數（equilibrium dissociation constant：KD）。最終，將對於重組人酸性鞘磷脂酶蛋白的分析結果顯示在表6，將對於重組小鼠酸性鞘磷脂酶蛋白的分析結果顯示在表7。
表6
| 抗體# | KD（M） | Kon（1/Ms） | Kdis（1/s） | RMax | Full R2 |
| #9101 | 1.16E-09 | 6.26E+05 | 7.28E-04 | 0.4527 | 0.9861 |
| #9102 | 2.52E-10 | 4.16E+05 | 1.05E-04 | 0.8652 | 0.997 |
| #9104 | 2.09E-10 | 3.92E+05 | 8.18E-05 | 0.3324 | 0.9759 |
| #9108 | 1.19E-10 | 2.49E+05 | 2.96E-05 | 0.45 | 0.999 |
| #9113 | 5.64E-10 | 1.16E+06 | 6.56E-04 | 0.2868 | 0.9635 |
表7
| 抗體# | KD（M） | Kon（1/Ms） | Kdis（1/s） | RMax | Full R2 |
| #9101 | 4.25E-11 | 3.76E+06 | 1.59E-04 | 0.0185 | 0.5527 |
| #9102 | 4.98E-10 | 4.89E+05 | 2.43E-04 | 0.4281 | 0.9944 |
| #9104 | 6.38E-10 | 3.10E+05 | 1.98E-04 | 0.7027 | 0.9971 |
| #9108 | 3.39E-09 | 4.59E+05 | 1.56E-03 | 0.3921 | 0.9865 |
| #9113 | ＜1.0E-12 | 1.00E+06 | ＜1.0E-07 | 0 | 0 |
如表6所示，在實施例1中製備的5種抗體以10-10至10-9M水準的結合力與人酸性鞘磷脂酶蛋白相結合。另一方面，如表7所示，對於小鼠酸性鞘磷脂酶蛋白，只有#9102、#9104或#9108的抗體呈現出了10-10至10-9M水準的結合力。
實驗例3．確定酸性鞘磷脂酶蛋白的抗原決定部位
通過HDX-MS（hydrogen deuterium exchange mass spectrometry）方法確認了作為本發明的抗體與酸性鞘磷脂酶蛋白相結合的部位的抗原決定部位。
首先，將1000µg/ml的酸性鞘磷脂酶蛋白、1000µg/ml的#9101 mIgG1、1250µg/ml的#9102 mIgG2、1000µg/ml的#9104 mIgG4、1000µg/ml的#9108 mIgG1、3300µg/ml的#9113 mIgG1或2932µg/ml的#9123 mIgG1抗體連續稀釋成2倍，從而準備了128倍稀釋液。
將所準備的稀釋液分別取1µl來與等量的10mg/ml的芥子酸基質（K200 MALDI kit，CovalX）混合來形成混合物，將1µl的上述混合物噴注在SCOUT384MALDI板，並在常溫下實現結晶化而形成結晶。之後，使用MALDI品質分析儀（mass spectrometer）測定了）上述結晶。另一方面，為了得到用於非共價相互作用分析的交聯（cross-link）數據，將1µl的128倍稀釋液與等量的2mg/ml的K200穩定化溶液（K200stabilizer reagent，K200 MALDI kit，CovalX）進行混合，在常溫下對其進行了3個小時的反應。反應結束後，利用1µl的混合液並以與上述方式相同的MALDI品質分析儀進行測定，測定的結果將用高質量MALDI MS（high-mass MALDI MS）模式進行了分析。最終，將確認到與酸性鞘磷脂酶蛋白質內重氫插入存在明顯差異的部位的胺基酸序列顯示在表8，將在與酸性鞘磷脂酶蛋白質結構模型中的抗體結合的與酸性鞘磷脂酶蛋白質的結合位置顯示在圖3。並且，將對於酸性鞘磷脂酶蛋白中的以及蛋白皂角素（saposin）域的各個抗體的重氫置換率熱點圖顯示在圖4。
表8
| #抗體 | 肽區域 | 胺基酸序列 |
| #9101 | 135-159 | PTVPKPPPKPPSPPAPGAPVSRILF |
| #9102 | 135-159 | PTVPKPPPKPPSPPAPGAPVSRILF |
| 218-228 | SGLGPAGPFDM | |
| #9104 | 53-72 | TAINLGLKKEPNVARVGSVA |
| 135-159 | PTVPKPPPKPPSPPAPGAPVSRILF | |
| #9108 | 53-72 | TAINLGLKKEPNVARVGSVA |
| 135-155 | PTVPKPPPKPPSPPAPGAPVS | |
| 259-269 | VRKFLGPVPVY | |
| #9113 | 53-72 | TAINLGLKKEPNVARVGSVA |
| 101-123 | VWRRSVLSPSEACGLLLGSTCGH | |
| 135-155 | PTVPKPPPKPPSPPAPGAPVS | |
| 259-269 | VRKFLGPVPVY | |
| #9123 | 259-269 | VRKFLGPVPVY |
如表8以及圖3所示，本發明的抗體與從酸性鞘磷脂酶蛋白的N-末端起第53位胺基酸片段至第72位胺基酸片段（序列識別號68:TAINLGLKKEPNVARVGSVA）、第101位胺基酸片段至第123位胺基酸片段（序列識別號69:VWRRSVLSPSEACGLLLGSTCGH）、第135位胺基酸片段至第159位胺基酸片段（序列識別號70:PTVPKPPPKPPSPPAPGAPVSRILF）、第135位胺基酸片段至第155位胺基酸片段（序列識別號71:PTVPKPPPKPPSPPAPGAPVS）、第218位胺基酸片段至第228位胺基酸片段（序列識別號72:SGLGPAGPFDM）或第259位胺基酸片段至第269位胺基酸片段（序列識別號73:VRKFLGPVPVY）相結合。尤其，如圖4所示，本發明的抗體主要與蛋白皂角素域中的α-螺旋1以及α-螺旋2部位相結合。
實驗例4．確認酸性鞘磷脂酶蛋白的活性抑制
4-1．確認酸性鞘磷脂酶蛋白的活性抑制
確認上述製備的與酸性鞘磷脂酶蛋白特異性結合的抗體是否抑制位於細胞膜中的酸性鞘磷脂酶蛋白的活性。
首先，用濃度為3µg/mL的實施例1中製備的抗體處理阿爾茨海默疾病患者的成纖維細胞（寇里爾研究所，Coriell institute），並在37℃的溫度下反應24小時。之後，收集細胞，根據製造商的方案利用Mem-PER™ Plus膜蛋白提取試劑盒（Mem-PER™ Plus Membrane Protein Extraction Kit，Thermo）分離細胞膜並提取蛋白。將提取的蛋白用作試樣放入UPLC用注入口（insert），通過常規方法進行UPLC分析（Waters，186004800），其結果如圖5所示。此時，使用確認為不與酸性鞘磷脂酶蛋白結合的#9105抗體作為對照組。
如圖5所示，在實施例1中製備的6種抗體中，#9104抗體顯著抑制阿爾茨海默疾病患者的細胞膜中增加的酸性鞘磷脂酶蛋白的活性。
4-2．確認不同處理濃度的抗-酸性鞘磷脂酶抗體對酸性鞘磷脂酶蛋白活性的抑制
除了將實施例1中製備的#9104抗體以0.03、0.3、3、30、300或3000ng/mL的濃度進行處理以外，通過與上述實驗例4-1相同的方法來確認位於細胞膜中的酸性鞘磷脂酶蛋白的活性變化。最終，所分析的酸性鞘磷脂酶蛋白的活性抑制率（％）如圖6以及表9所示。此時，使用#9105抗體作為對照組。
表9
| 處理濃度（ng/mL） | 酸性鞘磷脂酶蛋白活性抑制率（％） | |
| #9104 | #9105 | |
| 0.03 | 0 | - |
| 0.3 | 7.9 | - |
| 3 | 16 | - |
| 30 | 21 | - |
| 300 | 28 | - |
| 3000 | 32 | 9 |
如圖6以及表9所示，本發明的#9104抗體以處理濃度依賴性地顯著抑制位於細胞膜中的酸性鞘磷脂酶蛋白的活性。相反，作為對照組使用的#9105抗體，只有在以3000ng/mL以上的濃度進行處理的情況下，才會稍微抑制位於細胞膜中的酸性鞘磷脂酶蛋白的活性。
實驗例5．確認鞘脂的代謝變化
如實驗例4-1所示，通過鞘磷脂（sphingomyelin）以及神經醯胺（ceramide）的含量變化來確認在以3µg/mL的#9104抗體進行處理的細胞的細胞膜中的鞘脂的代謝變化。通過常規方法進行實驗，所測定的鞘磷脂以及神經醯胺的含量如圖7所示。
如圖7所示，用#9104抗體處理後，存在於阿爾茨海默疾病患者的成纖維細胞細胞膜中的神經醯胺的含量顯著減少，但鞘磷脂的含量沒有太大的變化。
因此，從以上可以看出，本發明的抗體抑制由酸性鞘磷脂酶蛋白引起的鞘磷脂的分解。
實驗例6．確認認知記憶力改善
通過向作為阿爾茨海默疾病動物模型的APP/PS1小鼠給藥#9104抗體來確認上述小鼠的認知記憶力變化。
6-1．抗-ASM抗體的給藥
向7月齡的APP/PS1小鼠以50g/kg的給藥量腹腔給藥324µL的#9104抗體，持續8周。每周給藥兩次（間隔3天），將#9104抗體總共給藥16次（圖8）。此時，將對C57BL/6小鼠與APP/PS1小鼠交配生出的後代不進行任何處理的情況作為未處理對照組，將向APP/PS1小鼠以324µL的PBS進行處理的情況作為陰性對照組。
6-2．確認認知記憶力改善（1）
通過從給藥#9104抗體的第41天至最後一天進行行為功能檢查來確認由於給藥抗體引起的認知記憶力變化。
首先，從給藥第41天開始，抓住所有小鼠的尾巴放到試驗人員的胳膊以及手背上，這樣反復五分鐘以消除小鼠對試驗人員的排斥感，之後使它們在水中適應30分鐘以消除對水的排斥感，然後使用於實驗。另一方面，在水槽中，在四面上除去杆（cue）的狀態下設置平臺（platform），並以此為中心設置三角形的小的水槽。將上述小鼠放進水槽進行10次游泳練習以及爬上平臺的練習。此時，練習完游泳10秒鐘後，每次爬上平臺都停留10秒鐘，10秒鐘後再次使小鼠進到水中。將其反復10次，在反復過程中，改變接近平臺的方向並教育使小鼠從不同方向爬上平臺。作為第二天的給藥第42天至第51天進行水迷宮實驗（morris water maze test）。具體地，水槽的四面上設置杆，每天在相同時間對每只小鼠進行4次實驗（每次時間限制為60秒鐘），將其反復10次並記錄爬上平臺所需要的時間。並且，在給藥第52天進行探針測試（probe test），並記錄在移除平臺的水槽中游過原先有平臺的位置及其他象限的距離以及速度等。最終，水迷宮實驗結果如圖9所示，探針測試結果如圖10至圖12所示。
如圖9所示，隨著反復試驗，給藥#9104抗體的小鼠的逃避潛伏期（escape latency time）顯著減少。另一方面，陰性對照組的小鼠表現平均30秒鐘的逃避潛伏期，因此認知功能受損，未處理對照組的小鼠隨著反復試驗其逃避潛伏期減少。具體地，與陰性對照組的小鼠相比，給藥#9104抗體的組的逃避潛伏期在第9次減少31.5％以及在第10次減少30.8％。
並且，如圖10以及圖11所示，給藥#9104抗體的小鼠與在非靶象限停留的時間相比在靶象限停留的時間顯著增加。這與未處理對照組相似，與停留在靶象限以及非靶象限的時間差不大的陰性對照組有差別。
並且，如圖12的C部分所示，確認給藥#9104抗體的組顯著增加穿過有過平臺的位置的次數（crossing platform），而陰性對照組反而減少。另一方面，如圖12的A部分以及圖12的B部分所示，確認所有小鼠組的游泳距離以及速度都相似，可以知道給藥#9104抗體不影響運動力。
6-3．確認認知記憶力改善（2）
通過向作為阿爾茨海默疾病動物模型的APP/PS1小鼠以50g/kg的給藥量給藥#9104抗體來確認上述小鼠的認知記憶力變化。在實驗中與上述實驗例6-1相同的方法給藥#9104抗體，通過常規方法進行暗示與關聯條件恐懼實驗（contextual and cued fear conditioning test），其結果如圖13所示。
如圖13所示，給藥#9104抗體的小鼠的凝滯（freezing）狀態根據場景（contextual）或氛圍（tone）顯著增加，而陰性對照組的小鼠的凝滯程度反而減少。
因此，從以上結果確認，本發明的抗體顯著改善阿爾茨海默疾病動物模型的認知記憶力。
實驗例7．確認酸性鞘磷脂酶蛋白活性
7-1．確認酸性鞘磷脂酶蛋白活性
確認存在於上述實驗例6中所確認改善認知記憶力的動物模型的血液以及腦組織中的酸性鞘磷脂酶蛋白的活性。具體地，在實驗中通過常規方法從小鼠的血漿（plasma）中獲取蛋白，將獲取的蛋白用作試樣，通過與實驗例4-1的相同的方法進行UPLC。最終，以陰性對照組小鼠的酸性鞘磷脂酶蛋白活性為基準，計算未處理對照組小鼠以及給藥#9104的小鼠組的酸性鞘磷脂酶活性（％），結果如圖14所示。
如圖14所示，通過給藥#9104抗體抑制約64％的存在於血漿中的酸性鞘磷脂酶蛋白的活性。
7-2．確認酸性鞘磷脂酶蛋白濃度
為了確認實驗例7-1中所確認的酸性鞘磷脂酶蛋白的活性抑制是否由蛋白的表達水準降低引起，進行了ELISA分析。在實驗中將實驗例7-1中獲取的血漿組織用作試樣，根據製造商的方案使用小鼠酸性鞘磷脂酶ELISA試劑盒（Mybiosource）進行分析，其結果如圖15所示。
如圖15所示，與未處理對照組或陰性對照組相比，給藥#9104抗體的小鼠的酸性鞘磷脂酶蛋白的濃度顯著增加。
因此，從以上結果可以知道，本發明的抗體在不影響酸性鞘磷脂酶蛋白的濃度的同時顯著抑制其活性。
實驗例8．確認β澱粉樣蛋白（Aβ）積累抑制
以下，通過硫黃素-S（Thioflavine-S）染色、利用6E10抗體的蛋白印跡以及ELISA分析方法，確認存在於上述實驗例6中所確認改善認知記憶力的動物模型的腦組織中的β澱粉樣蛋白的積累。
8-1．確認Aβ積累抑制（1）
將實驗例6中的動物模型用2.5％的阿佛丁（avertin）進行麻醉，打開胸腔後利用1cc注射器從心臟獲取血液。獲取血液後，用20mL的PBS進行灌注（perfusion），並用20mL至30mL的4％的多聚甲醛（PFA，paraformaldehyde）進一步進行灌注。取出上述小鼠的大腦，放入4％的多聚甲醛溶液中放置過夜，利用振動切片機（vibratome）將上述組織切片至30µm厚度。將獲取的腦組織切片放入12孔板後，添加1mL的PBS溶液並在室溫下以33rpm的條件攪拌5分鐘。去除PBS溶液後，用500µL的用乙醇稀釋的0.5％的硫黃素-S試劑進行處理來染色Aβ斑塊（plaque）10分鐘。之後，將上述切片用50％的乙醇清洗2次，再用1mL的PBS溶液清洗一次。在此添加包含DAPI的固定培養基（mount media）進行固定。
另一方面，為了將所有形態的Aβ蛋白進行染色，將上述腦組織切片放入12孔板後，添加1mL的PBS溶液並在室溫下以33rpm的條件攪拌5分鐘，並去除PBS溶液。在此添加1mL的含有0.2％的氚核X-100的PBS溶液，以33rpm的條件攪拌1小時。攪拌後，去除含有氚核X-100的PBS溶液，使用含有0.05％的氚核X-100的PBS溶液進行預處理1小時。以1:1的體積比將6E10抗體（Biolegend）與含有0.05％氚核X-100的PBS溶液混合，並以500µL的量添加至預處理的腦組織切片中。將其在4℃的溫度下邊攪拌邊反應過夜，並用含有氚核X-100的PBS溶液清洗3次。在此處理小鼠-488第二抗體並在室溫下反應2小時後，再次用含有氚核X-100的PBS溶液清洗3次。在此添加包含DAPI的固定培養基（mount media）進行固定。
使用鐳射掃描共聚焦顯微鏡（FV3000，Olympus）將染色後的腦組織切片以20倍的倍率進行拍攝，使用MetaMorph軟體（MetaMorph software，分子設備（Molecular Devices））分析染色面積，分析結果如圖16以及圖17所示。
如圖16以及圖17所示，通過#9104抗體的處理顯著減少存在於大腦的皮層以及海馬體的高密度（dense-core）且彌漫性（diffuse）的β澱粉樣蛋白斑塊。
8-2．確認Aβ積累抑制（2）
將上述獲取的腦組織分離成皮層以及海馬體，添加含有100mM的PMSF及1％的蛋白酶抑制劑的RIPA緩衝溶液，並將組織均質化。將均質化的組織在4℃的溫度以及13000rpm的條件下進行10分鐘的離心分離來獲取上清液。將獲取的上清液在相同條件下進一步進行30分鐘的離心分離來再次獲取上清液，將其用作試樣並通過β澱粉樣蛋白40 ELISA試劑盒（KHB3481，invitrogen）以及β澱粉樣蛋白42 ELISA試劑盒（KHB3441，invitrogen）測定Aβ的水準。獲取的結果如圖18所示。
如圖18所示，通過#9104抗體分別減少30.9％以及30.9％的存在於大腦的皮層以及海馬體中的Aβ40，這與陰性對照組相比較是顯著的。與陰性對照組相比，給藥#9104抗體後，Aβ42也顯著減少。
實驗例9．確認tau蛋白積累
利用上述實驗例8中獲取的腦組織切片並通過對tau蛋白進行染色來確認tau蛋白的積累變化。具體地，除了使用抗-AT8抗體（ThermoFisher Scientific，MN1020）作為第一抗體以外，通過與實驗例8-1相同的條件以及方法進行實驗，分析結果如圖19所示。
如圖19所示，通過#9104抗體的處理顯著減少存在於大腦的皮層以及海馬體中的tau蛋白。
實驗例10．確認神經炎症改善
從上述實驗例6中所確認改善認知記憶力的動物模型的腦組織中，通過小膠質細胞（microglia）以及星形膠質細胞（astrocyte）的活性化，確認通過#9104抗體的神經炎症改善效果。除了使用抗-lba-1抗體（Wako，019-19941）或抗-GFAP抗體（Dako，N1506）作為第一抗體，使用兔-488第二抗體作為第二抗體以外，通過與實驗例8-1相同的條件以及方法進行實驗，分析結果如圖20以及圖21所示。
如圖20以及圖21所示，存在於大腦的皮層以及海馬體中的lba-1以及GFAP蛋白的表達顯著減少，從而確認通過#9104抗體抑制腦組織中小膠質細胞以及星形膠質細胞的活性。
因此，從以上結果可以知道，本發明的抗體具有改善大腦神經炎症的效果。
實驗例11．確認毒性
用以下方法確認#9104抗體的毒性。
在上述實驗例6中在給藥#9104抗體的同時進行實驗。具體地，通過每週2次用肉眼觀察小鼠的運動以及異常體徵來評價存活率，並且每週1次在相同日期以及時間測量小鼠的體重。另一方面，通過對給藥完的小鼠用常規方法進行屍檢並觀察器官，從而確認#9104抗體是否對器官有毒性。最終，小鼠的存活率以及體重變化如圖22所示，確認器官毒性的結果如圖23所示。
如圖22以及圖23所示，確認用#9104抗體處理後，存活率以及體重沒有呈現出顯著變化，並且器官也正常。
因此，從以上結果可以知道，本發明的抗體不僅沒有毒性，還可以顯著用於治療如阿爾茨海默疾病等腦部疾病。
無
圖1為示出在本發明一實施例中製備的抗體的重鏈以及輕鏈可變區域胺基酸序列的示意圖。
圖2為通過ELISA分析法對在本發明一實施例中製備的抗體與酸性鞘磷脂酶蛋白之間的結合進行確認的結果圖表。
圖3為在與酸性鞘磷脂酶蛋白質結構模型中表示抗體結合的與酸性鞘磷脂酶蛋白質的結合位置的示意圖。
圖4為以熱點圖示出對於在本發明一實施例中製備的抗體的酸性鞘磷脂酶蛋白蛋白皂角素（saposin）域的重氫替換的結果圖。
圖5為確認本發明一實施例中製備的抗體抑制位於阿爾茨海默疾病患者細胞膜的酸性鞘磷脂酶蛋白的活性的結果柱狀圖。
圖6為確認本發明一實施例中製備的抗體濃度依賴性地抑制位於阿爾茨海默疾病患者細胞膜的酸性鞘磷脂酶蛋白的活性的結果曲線圖。
圖7為確認本發明一實施例中製備的抗體在阿爾茨海默疾病患者細胞膜中對鞘磷脂代謝變化的結果柱狀圖。
圖8為示出將本發明一實施例中製備的抗體施用於阿爾茨海默疾病動物模型的示意圖。
圖9為對施用本發明一實施例中製備的抗體的阿爾茨海默疾病動物模型進行水迷宮實驗的結果曲線圖。
圖10為確認施用本發明一實施例中製備的抗體的阿爾茨海默疾病動物模型的游泳路徑的結果圖。
圖11為確認施用本發明一實施例中製備的抗體的阿爾茨海默疾病動物模型在靶（A0）象限（A0）或非靶（A1，A2，A3）象限停留的時間的結果柱狀圖。
圖12為確認施用本發明一實施例中製備的抗體的阿爾茨海默疾病動物模型的游泳距離（A）、游泳速度（B）以及經過平臺所在位置的次數（C）的結果柱狀圖。
圖13為對施用本發明一實施例中製備的抗體的阿爾茨海默疾病動物模型進行根據場景（A）或氛圍（B）的恐懼條件實驗的結果柱狀圖。
圖14為確認施用本發明一實施例中製備的抗體的阿爾茨海默疾病動物模型的血漿中酸性鞘磷脂酶的活性抑制的結果柱狀圖。
圖15為確認施用本發明一實施例中製備的抗體的阿爾茨海默疾病動物模型的血漿中的酸性鞘磷脂酶蛋白水準的結果柱狀圖。
圖16為確認施用本發明一實施例製備的抗體的阿爾茨海默疾病動物模型的大腦皮層或海馬體中表達高密度（dense-core）β澱粉樣蛋白斑塊的結果。
圖17為確認施用本發明一實施例中製備的抗體的阿爾茨海默疾病動物模型的大腦皮層或海馬體中表達高密度或彌漫性（diffuse）β澱粉樣蛋白斑塊的結果。
圖18為確認施用本發明一實施例中製備的抗體的阿爾茨海默疾病動物模型的大腦皮層或海馬體中表達β澱粉樣蛋白40或β澱粉樣蛋白42的結果圖表。
圖19為確認施用本發明一實施例中製備的抗體的阿爾茨海默疾病動物模型的大腦皮層或海馬體中表達tau蛋白的結果。
圖20為確認施用本發明一實施例中製備的抗體的阿爾茨海默疾病動物模型的大腦皮層或海馬體中表達lba-1蛋白的結果。
圖21為確認施用本發明一實施例中製備的抗體的阿爾茨海默疾病動物模型的大腦皮層或海馬體中表達GFAP蛋白的結果。
圖22為確認施用本發明一實施例中製備的抗體的阿爾茨海默疾病動物模型的存活率（A）以及體重變化（B）的結果曲線圖。
圖23為確認施用本發明一實施例中製備的抗體的阿爾茨海默疾病動物模型的器官毒性的圖。
無
Claims (6)
- 一種用於治療腦部疾病的藥物組合物，其中，包含與酸性鞘磷脂酶(ASM，acid sphingomyelinase)蛋白特異性結合的抗體或其抗原結合片段作為有效成分，其中該抗體或其抗原結合片段包含由分別如序列識別號31、32以及33所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3的重鏈可變區域以及包含由分別如序列識別號49、50以及51所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3的輕鏈可變區域，其中該腦部疾病為阿爾茨海默疾病。
- 如請求項1之用於治療腦部疾病的藥物組合物，其中，上述酸性鞘磷脂酶蛋白源自哺乳動物。
- 如請求項1之用於治療腦部疾病的藥物組合物，其中，上述酸性鞘磷脂酶蛋白為由如序列識別號66或67所示的胺基酸序列組成的多肽。
- 一種用於改善腦部疾病的保健功能食品，其中，包含與酸性鞘磷脂酶蛋白特異性結合的抗體或其抗原結合片段作為有效成分，其中該抗體或其抗原結合片段包含由分別如序列識別號31、32以及33所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3的重鏈可變區域以及包含由分別如序列識別號49、50以及51所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3 的輕鏈可變區域，其中該腦部疾病為阿爾茨海默疾病。
- 一種與酸性鞘磷脂酶蛋白特異性結合的抗體或其抗原結合片段用於製造治療腦部疾病的藥物組合物之用途，其中該抗體或其抗原結合片段包含由分別如序列識別號31、32以及33所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3的重鏈可變區域以及包含由分別如序列識別號49、50以及51所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3的輕鏈可變區域，其中該腦部疾病為阿爾茨海默疾病。
- 一種與酸性鞘磷脂酶蛋白特異性結合的抗體或其抗原結合片段用於製造改善腦部疾病的保健功能食品之用途，其中該抗體或其抗原結合片段包含由分別如序列識別號31、32以及33所示的胺基酸序列組成的重鏈CDR1、重鏈CDR2以及重鏈CDR3的重鏈可變區域以及包含由分別如序列識別號49、50以及51所示的胺基酸序列組成的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2以及輕鏈CDR3的輕鏈可變區域，其中該腦部疾病為阿爾茨海默疾病。
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