KR20140132147A - Ａｓｍ 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Ａｓｍ 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 ASM 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서는 알츠하이머 마우스에 유전적으로 부분적인 ASM을 결손시킨 경우, ASM 유전자의 부분적으로 결손된 마우스와 알츠하이머 마우스와 병체 결합시킨 모델의 경우 및 ASM 유전자가 결손된 마우스의 혈청을 알츠하이머 마우스에 주입한 경우, 아밀로이드-β 침착이 저해되고, 학습 및 기억력이 개선됨을 확인함으로써, ASM의 활성 억제제 또는 발현 억제제는 퇴행성 신경질환에 대한 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ＡＳＭ 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating neurodegenerative disorder comprising acid sphingomyelinase inhibitor}
본 발명은 ASM 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
치매(dementia)는 일상생활에 장애를 주는 기억과 인지 능력의 점차적인 악화로 정의되며, 크게 혈관성 치매와 알츠하이머형 치매로 나눌 수 있다. 혈관성 치매는 주로 혈관 내에 형성된 혈전에 의해 뇌경색 또는 뇌졸중 등이 발생하는 경우에 해당되며 발병 주변의 뇌세포가 손상을 입어 기억력 상실 등의 증상이 유발되는 것으로 알려져 있다. 반면, 혈관성 치매보다 훨씬 더 많은 비중을 차지하고 있는 알츠하이머형 치매(Alzheimer's Diseases : AD)는 서서히 진행되는 뇌 질환으로서 처음에는 기억력 감퇴, 성격의 변화 그리고 사고력이 감소하는 질병으로서 대부분의 환자는 8-10년 내에 폐렴 등으로 사망한다. 전 세계적으로 65세 이상의 노인 중 3.5-10% 가량이 이 질환을 앓고 있으며 미국에서만 400만 명의 환자가 있는 것으로 추정된다. 이 질환을 치료하기 위하여 소요되는 사회적 비용만도 미국에서만 연 1000억불이 지출되고 있는 노인의 대표적인 질병이다. 알츠하이머형 치매의 특징적인 병변으로 뇌조직 중에 아밀로이드-β가 포함된 아밀로이드 플라크(amyloid plaques), 신경섬유 농축체(neurofibrillary tangles) 등이 형성되어 면역세포에 염증반응을 일으키고, Ca2 + 채널을 파괴할 뿐 아니라, 신경전달물질인 아세틸콜린의 양을 감소시킴으로써 기억력, 인지기능의 감퇴증상이 서서히 나타나는 것으로 보고되고 있으나 아직 정확한 병인이나 치료법은 알려지지 않고 있는 실정이다. 또한, 최근의 역학연구에 의하면 고혈압, 당뇨병, 고지혈증 및 심장질환 등 뇌혈관 질환의 위험인자들이 혈관성 치매뿐만 아니라 알츠하이머형 치매의 발병율을 증가시킨다는 보고도 있다. 알츠하이머형 치매(AD)로 인한 인지기능저하현상에 대한 현대 의학적 관점은 대부분 뇌 콜린성 신경세포의 광범위한 변성 및 소실을 인지기능감퇴의 가장 주요한 원인으로 간주하고 있으며, 이를 극복하기 위한 방편으로 손상되지 않고 남아있는 콜린성 신경계의 활성을 증가시켜 손상된 인지기능을 부분적으로 회복시킬 수 있는 약물들을 개발하고자 하는 연구가 주종을 이루고 있다. 현재 미국 식품의약국(FDA)으로부터 알츠하이머형 치매의 치료제로 공인받은 네가지 약물(타크린, 리바스티그민, 도네페질, 갈란타민) 모두 아세틸콜린 분해 효소의 활성을 저해함으로써 인지기능을 항진시키고자하는 일명 아세틸콜린에스테라제 억제제(acetylcholinesterase inhibitors)들이다. 실제로 지금까지 알려진 알츠하이머형 치매의 치료제로 승인된 의약품은 아세틸콜린에스테라제 억제제가 유일한 실정이나, 이들 약제들은 일부 알츠하이머형 치매 환자(40-50%)에서 일시적인 병증 완화 효과만을 보이고 그 약효 역시 오래 지속되지 못하는 단점이 있다. 또한 질환의 특성상 장기 복용을 요하는데, 지금까지 개발된 아세틸콜린에스테라제 억제제는 간독성을 비롯한 여러 가지 부작용을 수반하는 것 또한 문제점으로 드러나고 있다. 알츠하이머형 치매에 대한 치료제의 개발이 힘들었던 가장 큰 이유는 알츠하이머형 치매의 발병원인이 정확히 밝혀지지 않았기 때문이다. 그러나 최근의 유전학적, 세포생물학적 및 분자생물학적 발달에 따라, 알츠하이머형 치매의 발병 기전에 대한 가설로서 아밀로이드 가설이 제시되고 있다. 즉, 아밀로이드 전구 단백질(APP)에서 아밀로이드-β가 유리되고 유리된 아밀로이드-β는 서로 응집되어 불용성 아밀로이드 플라크를 생성하는데, 이 아밀로이드-β의 응집 및 아밀로이드 플라크의 생성이 신경 세포의 퇴행을 일으키게 되고, 그 결과로 이차적으로 신경섬유 농축체(neurofibrillary tangle)의 생성이 유발된다는 것이다. 이와 같이 아밀로이드-β의 뇌에 축적과 그로 인한 신경독성이 알츠하이머형 치매의 매우 중요한 발병원인으로 작용하고 있음이 밝혀짐에 따라 BACE-1 억제제와 같이 아밀로이드-β의 생성저지, 응집저지 또는 독성저지 효과를 지니면서 상대적으로 부작용이 적은 물질의 탐색연구가 전 세계적으로 집중 연구되어지고 있다. 아밀로이드-β는 아밀로이드 단백질의 전구체인 APP(아밀로이드-β 전구 단백질)가 감마-시크리타제 및 베타-시크리타제라는 단백분해효소들의 작용을 받아 생성된 아밀로이드 전구 단백질의 절편이다. 또, 아밀로이드-β의 생성에 가장 주요한 역할을 하고 있는 효소 베타-시크리타제는 일반적으로 BACE로 불리우고 있으며, BACE-1과 BACE-2 두 개의 타입이 알려져 있다. 이 중 BACE-1은 베타-시크리타제의 대부분의 활성 (약 90%)을 지니고 있어 아밀로이드-β 생성과정에 있어 BACE-2에 비하여 훨씬 더 중요한 역할을 담당하고 있다고 알려져있다. 현재까지 개발된 치료제들은 단지 일시적으로 증상만 완화시킬 뿐이므로, 병을 근본적으로 치료하거나 진행을 억제하는 약물의 개발이 절실히 요구되고 있다.
스핑고지질 대사는 정상적인 세포 신호전달을 조절하며, 스핑고지질 대사의 비정상적 변화는 알츠하이머 병을 포함한 다양한 신경퇴행성 질환에 영향을 미친다. 한편, 스핑고지질 대사를 조절하는 효소인 ASM(acid sphingomyelinase)은 거의 모든 종류의 세포에서 발현되는 단백질로서, 스핑고지질 대사 및 세포막 턴오버(turnover)에 중요한 역할을 한다. 상기 ASM은 대부분 엔도좀/리소좀 부위 안에 위치하고, 세포 스트레스 반응 시, 세포막의 바깥쪽으로 이동한다. ASM은 윌슨병, 당뇨병, 낭포성 섬유증, 폐기종 등 다양한 질병에서 증가되어 있으며 질병의 발병과 상당한 연관성을 지니고 있다. 그러나 ASM의 상기와 같은 역할에도 불구하고, ASM과 알츠하이머 병과의 관련성에 관한 연구는 현재 미미한 실정이다.
이에 본 발명자들은 ASM의 알츠하이머 병에 대한 발병기전을 발견하고, 알츠하이머 마우스에 유전적으로 부분적인 ASM을 결손시킨 경우, ASM 유전자가 부분적으로 결손된 마우스와 알츠하이머 마우스와 병체 결합시킨 모델의 경우 및 ASM 유전자가 결손된 마우스의 혈청을 알츠하이머 마우스에 주입한 경우, 아밀로이드-β 침착이 저해되고, 학습 및 기억력이 개선됨을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 ASM(acid sphingomyelinase) 활성 억제제 또는 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료물질의 스크리닝 방법을 제공함에 있다.
본 발명은 ASM(acid sphingomyelinase) 활성 억제제 또는 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 후보물질을 생물학적 시료에 처리하여 ASM(acid sphingomyelinase)의 발현양 변화를 측정하는 단계;를 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서는 알츠하이머 마우스에 유전적으로 부분적인 ASM을 결손시킨 경우, ASM 유전자의 부분적으로 결손된 마우스와 알츠하이머 마우스와 병체 결합시킨 모델의 경우 및 ASM 유전자가 결손된 마우스의 혈청을 알츠하이머 마우스에 주입한 경우, 아밀로이드-β 침착이 저해되고, 학습 및 기억력이 개선됨을 확인함으로써, ASM의 활성 억제제 또는 발현 억제제는 퇴행성 신경질환에 대한 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 알츠하이머 마우스(APP/PS1) 및 상기 마우스에 ASM을 유전적으로 부분 결손시킨 마우스(APP/PS1/ASM+/-)의 혈장, 뇌조직 및 섬유아세포에서 ASM 농도 수준을 나타낸 도이다(왼쪽:마우스 혈장; 중앙: 뇌조직; 오른쪽; 섬유아세포).
도 2는 티오플라빈 S 염색을 이용하여 APP/PS1 마우스 및 APP/PS1/ASM+/- 마우스의 대뇌피질에서 아밀로이드-β 침착을 확인한 도이다.
도 3은 티오플라빈 S 염색을 이용하여 APP/PS1 마우스 및 APP/PS1/ASM+/- 마우스의 해마에서 아밀로이드-β 침착을 확인한 도이다.
도 4는 면역형광법을 이용하여 APP/PS1 마우스 및 APP/PS1/ASM+/- 마우스의 아밀로이드-β 침착을 확인한 도이다.
도 5는 ELISA를 이용하여 APP/PS1 마우스 및 APP/PS1/ASM+/- 마우스의 아밀로이드-β 침착을 확인한 도이다.
도 6 및 도 7은 APP/PS1 마우스 및 APP/PS1/ASM+/- 마우스의 학습 및 기억력에 대한 개선효과를 확인한 도이다.
도 8은 웨스턴 블로팅을 이용한 APP/PS1 마우스 및 APP/PS1/ASM+/- 마우스의 꼬리 섬유아세포에서 자가포식작용 관련 유전자의 발현수준을 확인한 도이다.
도 9는 밀도 정량화법을 이용한 APP/PS1 마우스 및 APP/PS1/ASM+/- 마우스의 꼬리 섬유아세포에서 자가포식작용 관련 유전자의 발현수준 변화를 확인한 도이다.
도 10은 웨스턴 블로팅을 이용한 APP/PS1 마우스 및 APP/PS1/ASM+/- 마우스의 뇌조직에서의 자가포식작용 관련 유전자의 발현수준을 확인한 도이다.
도 11은 밀도 정량화법을 이용한 APP/PS1 마우스 및 APP/PS1/ASM+/- 마우스의 뇌조직에서의 자가포식작용 관련 유전자의 발현수준을 확인한 도이다.
도 12는 APP/PS1 및 APP/PS1/ASM+/- 마우스의 섬유아세포에서 단백질 분해 활성을 확인한 도이다.
도 13은 투과전자현미경(TEM)을 이용한 APP/PS1 및 APP/PS1/ASM+/- 마우스의 뇌를 관찰한 도이다.
도 14는 웨스턴 블롯팅을 이용한 인간의 섬유아세포에 ASM(1μM 내지 10μM)을 처리하는 경우, 자가포식작용 관련 유전자의 발현수준을 나타낸 도이다.
도 15는 밀도 정량화법을 이용한 인간의 섬유아세포에 ASM(1μM 내지 10μM)을 처리하는 경우, 자가포식작용 관련 유전자의 발현수준을 나타낸 도이다.
도 16은 인간의 섬유아세포에서 M6P를 이용하여 리소좀으로 ASM 흡수를 억제하는 경우, 자가포식작용 관련 단백질인 LC3-Ι및 LC3-Ⅱ의 양을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 알츠하이머 병에 걸린 인간의 섬유아세포에 siRNA를 이용하여 ASM을 억제한 경우, 웨스턴 블롯팅을 이용한 LC3-Ι및 LC3-Ⅱ의 양을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 알츠하이머 병에 걸린 인간의 섬유아세포에 siRNA를 이용하여 ASM을 억제한 경우, 밀도 정량법을 이용한 LC3-Ι및 LC3-Ⅱ의 양을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 19는 인간의 섬유아세포에서 NH4Cl의 존재 또는 비 존재 하에서 ASM을 처리한 경우, LC3-Ι에서 LC3-Ⅱ로 전환 비율 나타낸 도이다.
도 20은 혈청 없는 배지 또는 완전 배지에서 인간의 섬유아세포를 배양 후, NH4Cl를 처리한 경우 LC3-Ι에서 LC3-Ⅱ로 전환 비율을 나타낸 도이다.
도 21은 혈청 없는 배지 또는 완전 배지에서 인간의 섬유아세포를 배양 후, ASM을 처리한 경우 LC3-Ι에서 LC3-Ⅱ로 전환 비율을 나타낸 도이다.
도 22는 마우스의 병체 결합의 대략도를 나타낸 도이다[아이소크로닉; APP/PS1-APP/PS1: 알츠하이머 마우스인 APP/PS1 마우스끼리 병체결합), 헤테로크로닉 Ι(APP/PS1-ASM+/-: APP/PS1 마우스와 ASM+/- 마우스 병체결합), 헤테로크로닉 Ⅱ(APP/PS1-WT: APP/PS1 마우스와 야생형 마우스 병체 결합].
도 23은 병체 결합 마우스의 혈청에서 ASM 농도를 나타낸 도이다.
도 24는 병체 결합 마우스의 뇌조직에서 ASM 농도를 나타낸 도이다.
도 25는 병체 결합 시스템의 마우스의 대뇌피질 및 해마에서 아밀로이드-β의 침착을 확인한 도이다.
도 26은 웨스턴 블롯팅을 이용한 병체 결합 시스템의 마우스의 뇌조직에서 LC3-Ι에서 LC3-Ⅱ로의 전환, 베클린-1, p62, 카텝신 D의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 27은 밀도 정량법을 이용한 병체 결합 시스템의 마우스의 뇌조직에서 LC3-Ι에서 LC3-Ⅱ로의 전환, 베클린-1, p62, 카텝신 D의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 28은 APP/PS1 또는 ASM-/- 마우스의 혈청을 APP/PS1 마우스에 주입한 실험의 대략적인 방법을 나타낸 도이다.
도 29는 혈청을 제공받은 마우스(APP/PS1)의 혈청에서 ASM 농도변화를 나타낸 도이다.
도 30은 혈청을 제공받은 마우스의 뇌조직에서 ASM 농도변화를 나타낸 도이다.
도 31은 혈청을 제공받은 마우스의 대뇌피질 및 해마에서 아밀로이드-β의 침착을 확인한 도이다.
도 32는 웨스턴 블롯팅을 이용한 혈청을 제공받은 APP/PS1 마우스에서 LC3-Ι에서 LC3-Ⅱ로의 전환, 베클린-1, p62, 카텝신 D의 발현을 확인한 도이다.
도 33은 밀도 정량법을 이용한 혈청을 제공받은 APP/PS1 마우스에서 LC3-Ι에서 LC3-Ⅱ로의 전환, 베클린-1, p62, 카텝신 D의 발현을 확인한 도이다.
도 34 및 도 35는 혈청을 제공받은 APP/PS1 마우스의 학습 및 기억력 변화를 나타낸 도이다.
도 36은 ASM의 알츠하이머의 발병 기전에 대한 역할을 개략적으로 나타낸 도이다.
본 발명은 ASM(acid sphingomyelinase)의 활성 억제제 또는 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물을 포함한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서는 알츠하이머 마우스에 유전적으로 부분적인 ASM을 결손시킨 경우, ASM 유전자의 부분적으로 결손된 마우스와 알츠하이머 마우스와 병체 결합시킨 모델의 경우 및 ASM 유전자가 결손된 마우스의 혈청을 알츠하이머 마우스에 주입한 경우, 아밀로이드-β 침착이 저해되고, 학습 및 기억력이 개선됨을 확인함으로써, ASM의 활성 억제제 또는 발현 억제제는 퇴행성 신경질환에 대한 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
상기 ASM의 발현 억제제는 ASM 유전자 또는 ASM의 발현을 촉진하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 짧은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA; shRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상 일 수 있고, 상기 ASM 활성 억제제는 ASM 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 siRNA는 ASM 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 염기서열 내에서 선택되는 15 내지 30머(mer)의 센스 서열 및 상기 센스 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성되며, 이때, 상기 센스 서열은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 25개의 염기로 구성되는 것이 바람직하다.
상기 안티센스 뉴클레오티드는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙-mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합(혼성화)하여 DNA에서 단백질로서 유전정보의 흐름을 방해하는 것이다. 표적 서열에 특이성이 있는 안티센스 뉴클레오티드의 성질은 그것들을 예외적으로 다기능이 되도록 한다. 안티센스 뉴클레오티드는 모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 이들은 표적 RNA 서열에 대해 쉽게 합성될 수 있다. 최근 많은 연구들은 표적 단백질을 연구하기 위한 생화학적 수단으로 안티센스 뉴클레오티드의 유용성을 증명하였다(Rothenberg et al., J. Natl. Cancer Inst., 81:1539-1544, 1999). 올리고뉴클레오티드 화학 및 향상된 세포흡착, 표적결합의 친화도 및 뉴클레아제(nuclease) 내성을 나타내는 뉴클레오티드 합성 분야에서 최근 많은 진보가 있었으므로 안티센스 뉴클레오티드의 사용은 새로운 형태의 억제제로 고려될 수 있다.
상기 펩티드 모방체(Peptide mimetics)는 ASM 단백질의 결합 도메인을 억제하여 ASM 단백질의 활성을 억제하는 것이다. 펩티드 모방체는 펩티드 또는 비펩티드일 수 있고, psi 결합(Benkirane, N., et al. J.Biol. Chem., 271:33218-33224, 1996)과 같은, 비펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산으로 구성될 수 있다. 또한, "구조적으로 강제된(conformationally constrained)" 펩티드, 사이클릭 모방체(cyclic mimetics), 적어도 하나의 엑소사이클릭 도메인(exocyclic domain), 결합 부분(결합 아미노산) 및 활성 부위를 포함하는 사이클릭 모방체일 수 있다. 펩티드 모방체는 UBAP2(Ubiquitin-Associated Protein 2) 단백질의 이차구조 특성과 유사하게 구조화되고 항체(Park, B. W. et al. Nat Biotechnol 18, 194-198, 2000) 또는 수용성 수용체(Takasaki, W. et al. Nat Biotechnol 15, 1266-1270, 1997)와 같은 거대한 분자의 억제 특성을 모방할 수 있으며, 천연의 길항제와 동등한 효과로 작용할 수 있는 신규한 소분자일 수 있다(Wrighton, N. C. et al. Nat Biotechnol 15, 1261-1265, 1997).
상기 앱타머(aptamer)는 단일 사슬 DNA 또는 RNA 분자로서, SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 불리는 올리고 뉴클레오티드 (oligonucleotide) 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득할 수 있다(C. Tuerand L. Gold, Science 249, 505 - 510, 2005; A. D. Ellington and J. W. Szostak, Nature 346, 818 - 822, 1990; M. Famulok, et. al., Acc. Chem. Res. 33, 591 - 599, 2000; D. S. Wilson and Szostak, Annu. Rev. Biochem. 68, 611 - 647, 1999). 앱타머는 표적에 특이적으로 결합하고 표적의 활성을 조정할 수 있는데, 예컨대, 결합을 통하여 표적의 기능을 차단할 수 있다.
상기 항체는 ASM에 특이적이고 직접적으로 결합하여 ASM의 활성을 효과적으로 억제할 수 있다. 상기 ASM에 특이적으로 결합하는 항체로는 폴리클로날(polyclonal) 항체 또는 모노클로날(monoclonal) 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 ASM에 특이적으로 결합하는 항체는 당업자에게 알려진 공지의 방법으로 제작하여도 무방하며, 상업적으로 알려진 ASM 항체를 구입하여 사용할 수 있다. 상기 항체는 당업자에게 알려진 종래 방법에 따라 면역원인 ASM 단백질을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 랫트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근육 내, 복강 내 또는 피하 주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여할 수 있다. 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 형성된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하여 항체를 분리할 수 있다.
본 발명의 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 진행성 핵상마비, 다계통 위축증, 감람핵-뇌교-소뇌 위축증(OPCA), 샤이-드래거 증후군, 선조체-흑질 퇴행증, 헌팅톤병, 근위축성 측색 경화증(ALS), 본태성 진전증, 피질-기저핵 퇴행증, 미만성 루이 소체 질환, 파킨스-ALS-치매 복합증, 픽병, 뇌허혈 및 뇌경색을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 조성물은 상기 ASM의 활성 억제제 또는 발현 억제제와 함께 ASM의 발현 또는 활성 억제 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1 종 이상 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용) 할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 투여기간 또는 간격, 배설율, 체질 특이성, 제제의 성질 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 p34의 발현 또는 활성 억제제의 일일 투여량은 약 0.001~1000mg/kg, 바람직하게는 약 0.1~500mg/kg이나, 임상실험결과에 따라 가감될 수 있으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학적 조성물은 투여를 위하여 여러 가지 제제로 제형화될 수 있으며, 부형제를 첨가하여 다양한 형태로 제형화될 수 있다. 상기 부형제는 비독성이고 불활성인 약제학적으로 적합한 고상, 준고상 또는 액상의 모든 유형의 제형 보조물로서, 예를 들면, 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 분산제, 계면활성제 또는 희석제 등을 들 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 투약 단위 형태로 제형화 될 수 있다. 예를 들면, 상기 제형화된 투약 단위는 상기 유효 화합물의 1일 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배로, 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 개별 투약량은 유효 화합물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 정제, 피복 정제, 캡슐제, 환제, 과립제, 좌약, 액제, 현탁액제 및 에멀전제, 페이스트제 (pastes), 연고제, 겔제, 크림제, 로션제, 산제 또는 분무제로 제형화될 수 있다.
본 발명의 ASM의 발현억제제 또는 활성억제제는 퇴행성 신경질환 개선용 건강기능식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 ASM의 발현억제제 또는 활성억제제를 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 발현억제제 또는 활성억제제를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 바이칼린의 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100당 일반적으로 약 0.01~0.20g, 바람직하게는 약 0.04~0.10g 이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01~0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 상기 조성물의 치료적 유효량을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는, 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 치료방법은 본 발명의 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 조성물을 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.
또한, 경우에 따라, 본 발명의 조성물과 함께 공지의 퇴행성 신경질환 치료제를 병용 투여하여 퇴행성 신경질환 치료의 효과를 증대시킬 수 있다.
본 발명은 신경질환을 갖는 임의의 포유동물에 적용가능하고, 상기 포유동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.
또한, 본 발명은
1)후보물질을 생물학적 시료에 처리하는 단계;
2)상기 제1)단계의 생물학적 시료에서 ASM(acid sphingomyelinase)의 mRNA 또는 단백질 발현양의 변화를 측정하는 단계;를 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 시료는 퇴행성 신경질환에 걸린 동물의 혈액, 소변, 타액, 조직을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
상기 mRNA 발현양 변화를 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩을 포함한다.
상기 단백질 발현양 변화를 측정하는 방법은 웨스턴 블롯팅, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip)을 포함한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 1]유전적 ASM ( acid sphingomyelinase )억제에 의한 알츠하이머 질환 치료효과 확인.
1.돌연변이 마우스에서 ASM 수준 확인
알츠하이머와 환자의 실험동물 모델인 APP/PS1(APP/presenilin) 이중 돌연변이(double mutant) 및 APP/PS1/ASM+/- 삼중 돌연변이 마우스(ASM의 부분적 유전적 결손)를 이용하여, 상기 마우스의 혈청, 뇌조직 및 섬유아세포에서 ASM 농도 수준을 확인하였다.
보다 구체적으로, IACUC(Kyungpook National University Institutional Animal Care and Use Committee)에서 마우스 실험에 대한 승인을 받았다. C57BL/6 마우스(Charles River, UK)를 바탕으로 APPswe(hAPP695swe) 또는 PS1(presenilin-1M146V)를 과발현시킨 형질전환 마우스 라인을 이용하였다[이하, APP 마우스: APPswe를 과발현하는 마우스, PS1 마우스: presenilin-1M146V를 과발현하는 마우스; GlaxoSmithKline]
ASM+/-(한쌍의 ASM 유전자 중 하나만 결손) 및 ASM-/-(한쌍의 ASM 유전자 모두 결손)과 APP 마우스 및 APP/PS1 마우스와 교배시켜 APP/ASM-/- 및 APP/PS1/ASM+/- 마우스를 제조하였다.
이 후, 공지된 방법에 따라 ASM의 농도 수준을 측정하였다. 구체적으로 마이크로리터의 마우스의 혈청, 뇌조직 및 섬유아세포 시료 3㎕를 ASM 활성 완충액과 혼합하여 37℃에서 보관하였다. 114㎕의 에탄올을 가하여 가수분해 반응을 종료시킨 후, 원심분리하였다. 30㎕의 상층액을 유리 바이알에 옮긴 후, 5㎕를 UPLC 시스템에 적용시켰다. 상기 ASM 농도 수준을 스핑고미엘린 및 세라마이드와 결합된 Bodipy(aminoacetaldehyde)와 비교함으로써 정량화하였다. 상기 스핑고미엘린 및 세라미이드의 추출 및 정량화는 공지된 방법 시료에서 지질을 추출하고, 상기 건조된 지질 추출물을 25㎕의 0.2% Igepal CA-630(Sigma-Aldrich)에 재부유시키고, 각각의 지질의 농도 수준을 UPLC 시스템을 이용하여 정량화하였다.
상기 마우스에서 ASM 농도 수준을 도 1(왼쪽:마우스 혈장; 중앙: 뇌조직; 오른쪽; 섬유아세포)에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 9개월령의 APP/PS1 마우스의 혈장, 뇌조직 및 섬유아세포의 ASM 농도의 수준과 비교하여, 9개월령의 APP/PS1/ASM+/- 마우스의 혈장, 뇌조직 및 섬유아세포의 ASM 농도의 수준이 현저히 낮음을 확인하였다.
2.유전적 ASM 결손의 아밀로이드 침착 억제 확인
APP/PS1/ASM+/- 마우스에서 ASM 수준의 감소가 알츠하이머에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 티오플라빈(thioflavin)S 염색, 면역형광법 및 ELISA를 이용하여 아밀로이드의 침착을 확인하였다.
먼저, 실시예 1-1에서 제조된 마우스의 대뇌피질 및 해마 부위를 공지된 방법에 따라 티오플라빈 S로 염색하여 아밀로이드-β 침착을 확인하였다.
또한, 면역형광법을 이용하여 아밀로이드 침착을 확인하였다. 보다 구체적으로, 상기 마우스의 대뇌피질 및 해마를 얼린 후, Aβ 42에 대한 항-20G10(마우스, 1:1000) 및 Aβ 40에 대한 항-G30(토끼, 1:1000), 항-Iba-1(토끼, 1:500, Wako), 항-GFAP(토끼, 1:500, DAKO) 및 항-활성 카스파제3(토끼, 1:50, Chemicon)을 함께 배양하였다. 상기 부위를 Fluoview SV1000 이미징 소프트웨어(Olympus FV1000, Japan)를 장착한 레이저 스캐닝 공초점 현미경 또는 Olympus BX51 현미경을 이용하여 분석하였다. Metamorph software(Molecular Devices)를 이용하여 총 조직의 넓이에 대한 염색된 부위의 넓이의 퍼센트를 정량화하였다.
또한, Aβ ELISA를 이용하여 아밀로이드 침착을 확인하였다. 보다 구체적으로 상업적으로 이용가능한 ELISA 키트(Biosource)를 이용하였고, 마우스의 반구를균질화하여 0.02M의 구아니딘(guanidine)을 포함하는 완충액에 넣었다. 이 후, 제조사의 메뉴얼에 따라, Aβ40 및 Aβ42에 대한 ELISA를 수행하였다.
티오플라빈 S 염색으로 아밀로이드-β 침착을 확인한 결과를 도 2(대뇌피질) 및 도 3(해마) 나타내었고, 면역현광법을 이용하여 아밀로이드-β 침착을 확인한 결과를 도 4에 나타내었고, ELISA를 이용하여 아밀로이드-β 침착을 확인한 결과를 도 5에 나타내었다.
도 2 내지 5에 나타난 바와 같이, 9개월령의 APP/PS1 마우스의 뇌조직 부위와 비교하여, APP/PS1/ASM+/- 마우스의 뇌조직에 침착된 Aβ40 및 Aβ42가 현저히 감소함을 확인하였다.
3.유전적으로 ASM 의 결손에 의한 학습 및 기억능력 향상확인.
유전적으로 부분적인 ASM 억제를 통하여, ASM 억제의 학습 및 기억에 대한 잠재적 효과를 확인하기 위하여, MWM(Morris water maze) 테스트를 수행하였다.
보다 구체적으로, 실시예 1-1의 마우스에 대하여 10일 동안 하루에 4 번씩 과제를 학습시켰고, 11일째 되는 날에 플랫폼을 제거하고, 탐침시험(probe trial)을 수행하였다. 이의 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.
도 6 및 도 7에 나타난 바와 같이, APP/PS1 마우스는 공간 기억 형성에 심각한 장애를 보였고, APP/PS1/ASM+/- 마우스는 이러한 장애가 크게 개선됨을 확인하였다.
상기의 결과를 종합하면, APP/PS1/ASM+/- 마우스에서 ASM 농도 수준의 감소는 Aβ 플라크 침착을 감소시키고, 학습 및 기억능력을 향상시킴으로써, 알츠하이머를 포함하는 퇴행성 뇌질환에 ASM을 이용할 수 있음을 확인하였다.
[ 실시예 2]유전적 돌연변이 마우스를 이용한 ASM 억제의 자가포식작용( autophagy )에 대한 영향 확인
1. ASM 억제의 자가포식작용 관련 유전자에 대한 효과 확인.
유전적인 ASM 억제가 자가포식작용 관련 경로에서 어떻게 작용하는지 확인하기 위하여, 9개월령의 WT, APP/PS1 및 APP/PS1/ASM+/-의 섬유아세포 및 뇌조직 시료에서 LC3-Ι에서 LC3-Ⅱ로 전환, 베클린-1(Beclin-1), 카텝신 D(cathepsin D) 및 p62의 발현 수준을 확인하였다.
보다 구체적으로, 웨스턴 블롯팅을 이용하여 상기 유전자들의 발현을 분석하였다. 우선, BACE-1(Millipore), LC3, 베클린-1, p62, rab5, rab7[모두, cell signaling Technologies에서 구입], 카뎁신 D(R＆D systems), 6E10(Signet), 및 β-액틴(Santa Cruz)에 대한 항체를 이용하였고, 밀도 정량화(densitometric quantification)는 ImageJ 소프트웨어(US National Institutes of Health)를 이용하여 수행하였다.
상기 마우스들의 꼬리 섬유아세포에서 웨스턴 블롯팅 결과를 도 8에 나타내었고, 마우스들의 꼬리 섬유아세포에서 밀도 정량화법을 이용하여 단백질 양을 분석한 결과를 도 9에 나타내었고, 상기 마우스들의 뇌조직에서의 웨스턴 블롯팅 결과를 도 10 에 나타내었고, 밀도 정량화법을 이용하여 단백질 양을 분석한 결과를 도 11에 나타내었다.
도 8 내지 11에서 나타난 바와 같이, WT 마우스와 비교하여, APP/PS1 마우스에서 LC3-Ι에서 LC3-Ⅱ로의 전환은 증가함을 확인하였고, APP/PS1/ASM+/- 마우스에서 상기 전환은 감소함을 확인하였다.
또한, 베클린-1의 발현은 상기 세 그룹에서 큰 차이가 없음을 확인하였다.
또한, 자가포식작용 턴오버(turnover)의 지표인 카텝신 D(lysosomal hydrolase) 및 p62의 발현은 알츠하이머 환자에서 증가하여, 알츠하이머와 병리학적으로 관련이 있는데, WT 마우스와 비교하여, APP/PS1 마우스에서 카텝신 D의 수준이 증가함을 확인하였고, 상기 증가된 카텝신 D의 발현 수준은 APP/PS1/ASM+/-마우스에서 감소되는 것을 확인하였다.
또한, 상기 p62에 발현 패턴은 카텝신 D의 결과와 유사함을 확인하였다.
2. ASM 억제에 의한 단백질 분해 활성 평가
유전적인 ASM 억제가 자가포식작용 경로에서 어떻게 작용하는지 확인하기 위하여, 9개월령의 WT, APP/PS1 및 APP/PS1/ASM+/-의 섬유아세포 및 뇌조직 시료에서 단백질 분해 활성을 확인하였다.
상기 배양된 시료에서 총 단백질 분해를 측정하기 위하여, 수명이 긴 단백질을 표지시키기 위하여 48시간 동안[3H]-류신(leucine; 2μCi/ml)을 이용하여 펄스를 주어 펄스-채이스 실험(Pulse-chase experiment)을 수행하였다. 표지화 시킨후, 세포들을 세척하고, 자가포식작용이 억제되는 환경의 완전 배지(complete medium) 또는 자가포식작용이 유도되는 세륨이 결핍된 배지에서 배양하였다. 배지의 분취량 (Aliquots)을 다른 시점에서 수거하여 10% TCA로 침전시킨 후, 0.22㎛의 구멍을 갖는 막에서 여과하였고, 흐름을 통해 방사성 활성을 측정하였다. 상기 단백질의 분해 활성을 측정 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타난 바와 같이, 자가포식작용(세륨이 결핍됨 배지에서 배양)이 유도되면, WT 마우스에서 유래한 세포에 비하여, APP/PS1 마우스로부터 유래한 세포에서는 긴-수명을 갖는 단백질의 분해활성이 다소 낮아졌으며, APP/PS1/ASM+/- 마우스로부터 유래한 세포에서는 단백질 분해가 높아짐을 확인하였다.
3.투과전자현미경( TEM )을 이용한 마우스 뇌 조직 분석
뇌 조직을 3%의 글루타르알데히드(glutaraldehyde)가 포함된 0.1M, pH 7.4의 인산염 완충액으로 고정시켰고, 이 후, Sorensen`s 인산염 완충액에서 1%의 오스뮴 테트록사이드(osmium tetroxide)로 추가적으로 고정하였다. 에틸 알코올로 탈수시킨 후, 조직을 Epon(Electron Microscopy Sciences)에 끼어넣었다(embbeded). 조직을 순차적으로 자르고, 구리 석쇠(copper gride)에 올려놓고 투과전자현미경(Transmission Electron Microscope; Tecnai)을 이용하여 분석하였다. 디지털 카메라 및 Xplore3D tomography 소프트웨어를 이용하여 이미지를 수득하였다. 상기의 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타난 바와 같이, APP/PS1 마우스의 뇌영역에서 자가포식액포(autophagic vacuole; AV)의 크기 및 수가 증가됨을 확인하였고, APP/PS1/ASM+/- 마우스의 뇌조직에서는 WT 마우스보다는 다소 증가된 크기 및 수의 액포가 관찰되었으나, APP/PS1 마우스보다는 작은 크기 및 적은 수의 액포가 관찰되었다.
이러한 결과들은 APP/PS1 마우스에서 AV의 턴오버에서 이상적인 변화를 보임을 나타내며, ASM의 억제를 통하여 이러한 이상을 되돌릴 수 있으며, 자가포식작용으로 단백질 분해를 증가시킬 수 있음을 나타내는 결과이다.
[ 실시예 3]인간 세포에서 ASM 억제의 자가포식작용( autophagy )에 대한 영향 확인
1.인간의 섬유아세포의 재조합 ASM 단백질을 처리하는 경우, 자가포식작용 관련 유전자 발현 변화 확인
인간의 섬유아세포 주(nomal, PS1, 및 ApoE4)를 Coriell Institute에서 얻어 15% FBS를 포함하는 DMEM에서 37℃ 및 5%의 CO2에서 배양하여 사용하였다. 이 후, 상기 세포주에 ASM(1μM 내지 10μM)을 처리하여 실시예 2와 같은 방법으로 웨스턴 블롯 및 밀도 정량화를 수행하였다.
인간의 섬유아세포에 ASM(1μM 내지 10μM)을 처리하는 경우, LC3-Ι에서 LC3-Ⅱ으로 전환 및 베클린-1 발현을 웨스턴 블롯을 통하여 확인한 결과를 도 14에 나타내었고, 밀도 정량화를 수행한 결과를 도 15에 나타내었다.
도 14 및 도 15에 나타난 바와 같이, ASM의 처리농도 의존적으로 LC3-Ι에서 LC3-Ⅱ으로 전환이 진행됨을 확인하였다. 하지만, 베클린-1의 발현에는 ASM이 영향을 주지 않는다는 것을 확인하였다.
2. M6P ( mannose -6- phosphate )를 이용한 자가포식소체 ( autophagosome ) 축적과 관련된 ASM 의 세포 내 존재 형태 확인
ASM이 어떠한 경로를 통하여 자가포식작용에 영향을 주는지 확인하기 위하여, ASM을 단독으로 처리하는 경우, 단백질을 리소좀에 위치시키는 작용과 관련 있는 M6P(mannose-6-phosphate; 10mM)의 존재 하에서 처리하는 경우, 자가포식소체(autophagosome)의 축적을 웨스턴 블롯팅 및 밀도 정량을 이용한 LC3-Ι및 LC3-Ⅱ의 양을 측정하여 확인하였고, 이의 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타난 바와 같이, M6P를 이용하여 리소좀으로 ASM 흡수를 억제하는 경우, LC3-Ⅱ로의 전환이 감소하여 ASM-유도 자가포식소체의 축적이 감소됨을 확인하였다.
따라서, 리소좀 내의 ASM이 자가포식소체 축적을 유발하는 것으로 판단된다.
3. siRNA 를 이용한 ASM 과 자가포식소체의 형성과 관련성 확인
ASM과 자가포식소체와의 관련성을 확인하기 위하여, 실시예 2의 웨스턴 블롯팅 및 밀도 정량화 방법을 이용하여 이를 확인하였다.
보다 구체적으로, ASM의 발현을 억제하기 위하여 ASM의 생산을 조절하는 유전자인 SMAD1에 대한 siRNA를 Dharmacon(Chicago, IL)로부터 구입하였고, 이의 SMAD1에 대한 타겟서열을 하기의 표 1에 나타내었다.
타겟 서열
SMPD1 siRNA 1 5`GCACUGGGAUCAUGACUAC3`
SMPD1 siRNA 2 5`GCACACCUGUCAAUAGCUU3`
SMPD1 siRNA 3 5`CAGGUUACAUCGCAUAGUG3`
SMPD1 siRNA 4 5`GGCACAACCUGGUAUAUCG3`
표 1의 siRNA를 혼합한 후, 인간의 섬유아세포에 100nM 농도로 리포펙타민 2000 시약(Invitrogen)을 사용하여 siRNA를 형질감염하였고, 형질감염하지 않은 세포와 유전자 발현차이를 확인한 결과, 형질감염된 세포에서 SMPD1의 발현이 88% 감소한 것을 확인하였다. 이 후, 상기 siRNA를 PS1 세포 및 ApoE4 세포에 처리하여, 자가포식소체의 형성과 관련된 LC3-Ι 및 LC3-Ⅱ에 대하여 웨스턴 블롯팅 및 밀도 정량법을 수행하여, 웨스턴 블롯팅 결과를 도 17에 나타내었고, 밀도 정량한 결과를 도 18에 나타내었다.
도 17(PS1 세포) 및 도 18(ApoE4 세포)에 나타난 바와 같이, siRNA를 처리한 세포에서 LC3-Ⅱ로의 전환이 현저히 감소하여, ASM의 상향조절 유전자의 siRNA를 처리한 경우, 자가포식소체 형성이 억제됨을 확인하였다.
상기의 결과는 리소좀 내의 ASM의 증가가 자가포식소체 형성에 영향을 주는 것을 암시한다.
4. ASM 의 자가포식소체 형성 기전 결정
ASM이 자가포식소체의 형성 속도를 증가시키는 것인지, 자가포식소체의 분해 속도를 감소시키는 것인지 결정하기 위하여, 자가포식소체의 분해를 억제하지만, 자가포식소체의 형성에 영향을 주지 않는 NH4Cl의 존재 또는 비 존재하의 세포들에서 LC3-Ι에서 LC3-Ⅱ로 전환 비율을 웨스턴 블롯팅을 이용하여 측정하였고, 이의 결과를 도 19에 나타내었다.
또한, 혈청 없는 배지 또는 완전 배지에서 키운 알츠하이머에 걸린 인간의 섬유아세포를 배양 후, NH4Cl 또는 ASM을 처리한 경우 LC3-Ι에서 LC3-Ⅱ로 전환 비율을 웨스턴 블롯팅을 이용하여 측정하였다. 이의 결과를 도 20 및 도 21에 나타내었다.
도 19에 나타난 바와 같이, ASM 및 NH4Cl를 처리하는 경우 LC3-Ⅱ의 양에 유의적인 변화가 없음을 확인하였다.
도 20에 나타난 바와 같이, 혈청 없는 배지에서 세포를 배양하여 자가포식작용을 유발한 후, NH4Cl를 가하면 LC3-Ⅱ의 수준이 유의적으로 증가하였다.
도 21에 나타난 바와 같이, 혈청 없는 배지에서 세포를 배양하여 자가포식작용을 유발한 후, ASM을 처리하는 경우, LC3-Ⅱ의 축적이 유의적으로 증가함을 확인하였다.
이러한 결과들을 종합하면, ASM이 자가포식소체의 형성을 유발하는 것이 아니라, 자가포식소체의 단백질 분해를 억제하는 것을 나타낸다.
[ 실시예 4] 병체 결합 시스템( parabiotic system )을 이용한 ASM 농도의 감소를 통한 알츠하이머 치료 효과 검증
1. 병체 결합 시스템( parabiotic system )의 마우스 혈청 및 뇌조직에서 ASM 활성 확인.
APP/PS1 마우스의 병체 결합 시스템을 이용하여 ASM 억제의 효과를 확인하였다. 보다 구체적으로, 마우스들을 수술적 기법으로 피부 및 연조직을 연결하여 새로운 신생혈관이 두 마우스 사이에 생기게 유도하여 혈류를 공유하게 하여, 아이소크로닉(isochronic; APP/PS1-APP/PS1: 알츠하이머 마우스인 APP/PS1 마우스끼리 병체결합), 헤테로크로닉 Ι(APP/PS1-ASM+/-: APP/PS1 마우스와 ASM+/- 마우스 병체결합), 헤테로크로닉 Ⅱ(heterochronic Ⅱ; APP/PS1-WT: APP/PS1 마우스와 야생형 마우스 병체 결합)를 제조하였다. 이 후, 실시예 1의 방법으로 혈청 및 뇌조직에서 ASM 농도를 측정하였다.
마우스의 병체 결합의 대략도를 도 22에 나타내었고, 병체 결합 마우스의 혈청에서 ASM 농도를 도 23에 나타내었고, 병체 결합 마우스의 뇌조직에서 ASM 농도를 도 24에 나타내었다.
도 23에 나타난 바와 같이, 아이소크로닉(isochronic; APP/PS1-APP/PS1) 및 헤테로크로닉 Ⅱ(heterochronic Ⅱ; APP/PS1-WT)의 혈청에 비하여, 헤테로크로닉 Ι(APP/PS1-ASM+/-)혈청에서 ASM 농도가 낮음을 확인하였다.
도 24에 나타난 바와 같이, 아이소크로닉 및 헤테로크로닉 Ⅱ 뇌조직에 비하여, 헤테로크로닉 Ι(APP/PS1-ASM+/-) 뇌조직에서 ASM 농도가 낮음을 확인하였다.
상기의 결과, 헤테로크로닉 마우스들에서 ASM+/- 마우스는 ASM의 농도를 낮추는 것을 확인하였다.
2. 병체 결합 시스템에서 아밀로이드-β 침착 확인
실시예 2와 같은 방법으로, 병체 결합 시스템의 마우스의 대뇌피질 및 해마에서 아밀로이드-β의 침착을 확인하였다. 이의 결과를 도 25에 나타내었다.
도 25에 나타난 바와 같이, 아이소크로닉(APP/PS1-APP/PS1)에 비하여 헤테로크로닉 Ι(APP/PS1-ASM+/-)에서 플라크가 현저히 감소함을 확인하여, 아밀로이드 침착이 현저히 감소함을 확인하였다.
3. 병체 결합 시스템에서 자가포식작용 관련 유전자 발현 확인
실시예 2와 같은 방법으로, 병체 결합 시스템의 마우스의 뇌조직에서 LC3-Ι에서 LC3-Ⅱ로의 전환, 베클린-1, p62, 카텝신 D의 발현을 확인하였다. 이의 결과를 도 26 및 27에 나타내었다.
도 26 및 27에 나타난 바와 같이, 아이소크로닉(APP/PS1-APP/PS1)에 비하여 헤테로크로닉 Ι(APP/PS1-ASM+/-)에서 LC3-Ⅱ로 전환이 감소하였고, p62 및 카텝신 D의 발현이 감소함을 확인하였다. 그러나 베클린-1의 발현 수준은 양 시스템에서 유의적인 변화가 없었다.
[ 실시예 5]혈청주입 실험을 이용한 ASM 농도의 감소를 통한 알츠하이머 치료 효과 검증
1. APP / PS1 또는 ASM -/- 마우스의 혈청을 APP / PS1 마우스에 주입한 경우, ASM 농도 확인
APP/PS1 또는 ASM-/- 마우스를 심장 내에서 출혈을 일으켜 혈액을 EDTA로 코팅된 튜브에 수집하였다. 수집된 혈액을 원심분리하여 EDTA 혈청을 발생시켰다. 이 후, 분취량을 -80℃에 보관하였다. 상기 보관된 혈청을 PBS로 투석하였다. 혈청 100㎕를 3주동안 8번, 8개월령의 APP/PS1 마우스의 정맥 내에 주입하였다.
APP/PS1 또는 ASM-/- 마우스의 혈청을 APP/PS1 마우스에 주입한 경우 실험의 대략적인 방법을 도 28에 나타내었고, 혈청을 제공받은 마우스(APP/PS1)의 혈청에서 ASM 농도변화를 도 29에 나타내었고, 혈청을 제공받은 마우스의 뇌조직에서 ASM 농도변화를 도 30에 나타내었다.
도 29 및 도 30에 나타난 바와 같이, APP/PS1 마우스의 혈청을 제공받은 APP/PS1 마우스에 비하여, ASM-/- 마우스 혈청을 제공받은 APP/PS1의 마우스의 혈청에서 ASM 농도가 유의적으로 낮음을 확인하였다.
2. APP / PS1 또는 ASM -/- 마우스의 혈청을 APP / PS1 마우스에 주입한 경우, 아밀로이드-β 침착 확인
실시예 2와 같은 방법으로, 혈청을 제공받은 APP/PS1 마우스의 대뇌피질 및 해마에서 아밀로이드-β의 침착을 확인하였다. 이의 결과를 도 31에 나타내었다.
도 31에 나타난 바와 같이, APP/PS1 마우스의 혈청을 제공받은 APP/PS1 마우스에 비하여, ASM-/- 마우스 혈청을 제공받은 APP/PS1의 마우스 플라크가 현저히 감소함을 확인하여, 아밀로이드 침착이 현저히 감소함을 확인하였다.
3. APP / PS1 또는 ASM -/- 마우스의 혈청을 APP / PS1 마우스에 주입한 경우, 자가포식작용 관련 유전자 발현 확인
실시예 2와 같은 방법으로, 혈청을 제공받은 APP/PS1 마우스에서 LC3-Ι에서 LC3-Ⅱ로의 전환, 베클린-1, p62, 카텝신 D의 발현을 확인하였다. 이의 결과를 도 32 및 33에 나타내었다.
도 32 및 33에 나타난 바와 같이, APP/PS1 마우스의 혈청을 제공받은 APP/PS1 마우스에 비하여, ASM-/- 마우스 혈청을 제공받은 APP/PS1의 마우스에서 LC3-Ⅱ로 전환이 감소하였고, p62 및 카텝신 D의 발현은 감소함을 확인하였다. 그러나 베클린-1의 발현 수준은 양 시스템에서 유의적인 변화가 없었다.
4.APP / PS1 또는 ASM -/- 마우스의 혈청을 APP / PS1 마우스에 주입한 경우, 기억력 변화 확인
실시예 2와 같은 방법으로, APP/PS1 또는 ASM-/- 마우스의 혈청을 APP/PS1 마우스에 주입한 경우, 공간 기억력 변화를 확인하여, 이의 결과를 도 34 및 도 35에 나타내었다. 또한, ASM의 알츠하이머의 발병기전에 대한 역할을 개략적으로 도 36에 나타내었다.
도 34 및 도 35에 나타난 바와 같이, APP/PS1 마우스의 혈청을 제공받은 APP/PS1 마우스에서 공간 기억 형성의 장애를 보였고, ASM-/- 마우스 혈청을 제공받은 APP/PS1의 마우스에서 공간 기억 형성의 장애가 개선됨을 확인하였다.
따라서, ASM의 농도를 감소시키는 경우, 기억력이 향상됨을 알 수 있다.

Claims (11)

  1. ASM(acid sphingomyelinase)의 활성 억제제 또는 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 ASM 활성 억제제 또는 발현 억제제는 자가포식소체 분해를 촉진하는 것을 특징으로 하는, 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 ASM 활성 억제제 또는 발현 억제제는 아밀로이드-β 침착을 억제하고, 기억력을 개선시키는 것을 특징으로 하는, 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 ASM 활성 억제제는 ASM에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드모방체, 기질유사체, 앱타머, 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 ASM 발현억제제는, ASM 유전자 또는 ASM의 발현을 촉진하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA, shRNA 및 리보자임으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 진행성 핵상마비, 다계통 위축증, 감람핵-뇌교-소뇌 위축증(OPCA), 샤이-드래거 증후군, 선조체-흑질 퇴행증, 헌팅톤병, 근위축성 측색 경화증(ALS), 본태성 진전증, 피질-기저핵 퇴행증, 미만성 루이 소체 질환, 파킨스-ALS-치매 복합증, 픽병, 뇌허혈 및 뇌경색으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. ASM(acid sphingomyelinase)의 활성 억제제 또는 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  8. 1)후보물질을 생물학적 시료에 처리하는 단계;
    2)상기 제1)단계의 생물학적 시료에서 ASM(acid sphingomyelinase)의 mRNA 또는 단백질의 발현양 변화를 측정하는 단계;를 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료물질의 스크리닝 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 퇴행성 신경질환에 걸린 동물의 혈액, 소변, 타액, 조직으로 이루어진 군중 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료물질의 스크리닝 방법.
  10. 제 8항에 있어서, 상기 mRNA 발현양 변화는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군 중 선택된 1 종 이상의 방법을 이용하여 측정하는 것을 특징으로하는, 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료물질의 스크리닝 방법.
  11. 제 8항에 있어서, 상기 단백질 발현양 변화는 웨스턴 블롯팅, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip)로 이루어진 군 중 선택된 1종 이상의 방법을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는, 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료물질의 스크리닝 방법.
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