KR100379240B1 - 소 뇌 유래의 막결합 중성형 스핑고 마이엘리네이즈의 정제방법 - Google Patents

소 뇌 유래의 막결합 중성형 스핑고 마이엘리네이즈의 정제방법 Download PDF

Info

Publication number
KR100379240B1
KR100379240B1 KR10-1999-0048275A KR19990048275A KR100379240B1 KR 100379240 B1 KR100379240 B1 KR 100379240B1 KR 19990048275 A KR19990048275 A KR 19990048275A KR 100379240 B1 KR100379240 B1 KR 100379240B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
msmase
activity
chromatography
liquid chromatography
column
Prior art date
Application number
KR10-1999-0048275A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20010045120A (ko
Inventor
김대경
정성윤
정광묵
Original Assignee
김대경
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 김대경 filed Critical 김대경
Priority to KR10-1999-0048275A priority Critical patent/KR100379240B1/ko
Publication of KR20010045120A publication Critical patent/KR20010045120A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100379240B1 publication Critical patent/KR100379240B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Abstract

본 발명은 소 뇌에서 분리된 막결합 중성형 스핑고마이엘리네이즈, 이의 정제 방법 및 이에 대한 모노클로날 항체에 관한 것으로, 본 발명에 따른 스핑고마이엘리네이즈는 소 뇌의 신경세포 막에서 유래하고 분자량이 60 kDa이며 Mg2+에 의존적이고 pH 6.0 내지 9.0에서 활성을 갖는 것을 특징으로 하며, 소 뇌 조직을 균질화하고 세포찌꺼기와 핵을 제거한 다음 원심분리하여 얻은 세포막 펠렛을 암모니움 설페이트가 함유된 완충액 중에서 추출하고 이 추출액으로부터 음이온 교환 크로마토그래피한 후 트리톤 X-100이 포함된 완충액 중에서 초음파 파쇄하고 원심분리하여 얻은 상층액을 소수성 크로마토그래피, 음이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피, 소수성 고성능 액체 크로마토그래피 및 양이온 교환 고속 단백질 액체 크로마토그래피를 차례로 수행하여 정제할 수 있으며, 본 발명에 따른 모노클로날 항체는 하이브리도마 SM1A5(기탁번호 제 KCLRF-BT-00025 호)에 의해 생산된다.

Description

소 뇌 유래의 막결합 중성형 스핑고마이엘리네이즈의 정제 방법{PROCESS FOR PURIFYING MEMBRANE-ASSOCIATED NEUTRAL PH OPTIMUM SPHINGOMYELINASE DERIVED FROM BOVINE BRAIN}
본 발명은 소 뇌에서 분리된 막결합 중성형 스핑고마이엘리네이즈, 이의 정제 방법 및 이에 대한 모노클로날 항체에 관한 것이다.
세라미드(ceramide)는 신호전달 경로의 2차 전달자로, 세포 분화, 세포주기의 정지, 세포 노화, 세포 사멸(apoptosis) 등의 다양한 세포 반응에 관여한다. 세라미드는 주로 세포막 인지질인 스핑고마이엘린(sphingomyelin)의 가수분해를 통해 생성된다.
스핑고마이엘리네이즈(sphingomyelinase, SMase)는 스핑고마이엘린을 가수분해하여 세라미드와 포스포콜린을 생성하는 효소로, 현재까지 리소좀 유래의 산성형 SMase(A-SMase), 세포질 유래의 아연 의존적 산성형 SMase, 최적 pH가 알칼리인 SMase, 세포질 유래의 Mg2+의존적이고 최적 pH가 중성인 중성형 SMase(N-cSMase), 및 막결합 Mg2+의존적이고 최적 pH가 중성인 막 결합 중성형SMase(N-mSMase)효소가 동종이형(isozyme)효소로서 보고되어 있다. 이 중 A-SMase와 중성형 SMase가 1α,25-디하이드록시비타민 D3, 종양 괴사 인자 α, 인터루킨 1β, 신경 성장 인자, 화학요법 약제, 혈장 결핍 등의 세포 외 자극들에 의해 활성화되어 세포내 세라미드 농도를 증가시키는 것으로 알려져 있다.
최근 인간 뇨 유래의 산성형 SMase가 정제되고 이를 코딩하는 cDNA가 클로닝된 바 있으며(Quintern, L. E., et al.,EMBO J.,8, 2469-2473(1989)), 본 발명자들도 세포질에 유래하고 분자량이 75 kDa이며 Mg2+의존적이고 글루타티온과 DTT에 대해 감수성인 75 kDa의 분자량을 갖는 N-cSMase를 정제하고 그 특성을 규명하여 특허출원 제 98-28187 호로 출원한 바 있다.
한편, N-mSMase는 매우 강한 소수성으로 인해 정제가 어려워 그 특성이 아직 규명되지 못한 실정이다. 다만 토미우크 등(Tomiuk, S., et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,95, 3638-3643(1998))은 포유동물 세포로부터 분자량이 47.5 kDa인 N-mSMase을 클로닝한 바 있으나, 이 N-mSMase는 트리톤 X-100(Triton X-100)에 의해 추출되는 막결합 단백질이지만 종양 괴사 인자(TNF)-α에 의해 유도되는 신호전달 경로에 참여하지 않는다고 개시하고 있다. 또한 리우 등(Liu, B., et al.,J. Biol. Chem.,273, 34472-34479(1998))은 래트 뇌로부터 트리톤 X-100를 사용하여 부분 정제된 N-mSMase를 얻고 이 효소의 활성이 글루타티온에 의해 저해되며(효소 활성을 50% 저해하는 농도(IC50): 2.5 mM), DTT와 포스파티딜세린에 의해 촉진된다고 보고한 바 있다. 최근 본 발명자들도 소 뇌로부터 트리톤 X-100로 추출된 35 kDa의 분자량을 갖는 4 종류의 N-mSMase(T-mSMase A, B, C 및 D)와 암모니움 설페이트로 추출된 40 kDa의 분자량을 갖는 2 종류의 N-mSMase(S-mSMase I 및 II)를 정제하고 그 특성을 규명하여 특허출원 제 98-28187 호로 출원한 바 있다.
특히, 뇌 조직에 존재하는 N-mSMase는 뇌 질환의 병인에 중요한 역할을 할 것으로 생각되고 있는데, 그 이유는 뇌 조직에서 세라미드를 경유하는 신호전달 경로가, 파킨슨 병과 알쯔하이머 병에 의한 신경 세포사멸, 저 친화성 뉴로트로핀 수용체(p75NTR)를 매개하는 올리고덴드로사이트(oligodendrocyte) 세포, PC12 세포 및 T9 세포의 사멸, TNF-α에 의해 유도되는 올리고덴드로사이트 세포사멸, 및 허혈성 뇌 손상 등의 중추신경계의 병태생리에 관련되기 때문이다.
따라서, 본 발명의 목적은 소 뇌 유래의 정제된 막결합 중성형 스핑고마이엘리네이즈를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 스핑고마이엘리네이즈의 정제 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 스핑고마이엘리네이즈에 특이적인 모노클로날 항체를 제공하는 데 있다.
도 1은 소 뇌의 암모니아 추출액으로 DEAE-셀룰로즈 음이온 교환 크로마토그래피를 수행한 결과이다.
도 2는 음이온 교환 크로마토그래피로 얻은 활성분획으로 부틸-토요펄 650M 소수성 크로마토그래피를 수행한 결과이다.
도 3는 소수성 크로마토그래피로 얻은 활성분획으로 DEAE-5PW 음이온 교환 HPLC를 수행한 결과이다.
도 4는 음이온 교환 HPLC로 얻은 활성분획으로 페닐-5PW 소수성 HPLC를 수행한 결과이다.
도 5는 소수성 HPLC로 얻은 활성분획으로 모노 S 양이온 교환 FPLC를 수행한 결과이다.
도 6a 및 6b는 양이온 교환 FPLC로 얻은 피크 α 및 β 각각에 대한 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 7는 본 발명에 따른 스핑고마이엘리네이즈 활성의 면역 침전 결과이다.
도 8은 본 발명에 따른 스핑고마이엘리네이즈의 웨스턴 블랏 결과이다.
도 9a는 본 발명에 따른 스핑고마이엘리네이즈를 리네위버-버크 분석한 결과를 보여주는 그래프이고, 도 9b는 소디움 데옥시콜레이트 존재 하에 본 발명에 따른 스핑고마이엘리네이즈를 리네위버-버크 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 10은 Mg2+농도에 따른 본 발명의 스핑고마이엘리네이즈의 활성 변화를 나타내는 그래프이다.
도 11은 pH에 따른 본 발명의 스핑고마이엘리네이즈의 활성 변화를 나타내는 그래프이다.
도 12는 Ca2+, Fe3+, Fe2+, Zn2+및 Cu2+의 농도에 따른 본 발명의 스핑고마이엘리네이즈의 활성 변화를 나타내는 그래프이다.
도 13a는 글루타티온(GSH), 디티오트레이톨(DTT) 및 2-머캅토에탄올의 농도에 따른 본 발명의 스핑고마이엘리네이즈의 활성 변화를 나타내는 그래프이고, 도 13b는 산화형글루타티온(GSSG), 시스테인, 시스테인-글라이신 및 γ-글루타르산-시스테인의 농도에 따른 본 발명의 스핑고마이엘리네이즈의 활성 변화를 나타내는 그래프이다.
도 14a 및 14b는 각각 소디움 데옥시설페이트 및 트리톤 X-100의 농도에 따른 본 발명의 스핑고마이엘리네이즈의 활성 변화를 나타내는 그래프이다.
도 15는 소 뇌 신경세포의 막 분획에 대한 SDS-PAGE를 수행한 결과이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 소 뇌의 신경세포 막에서 유래하고 분자량이 60 kDa이며 Mg2+에 의존적이고 pH 6.0 내지 9.0에서 활성을 갖는 스핑고마이엘리네이즈를 제공한다.
또한 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 소 뇌 조직을 균질화하고 세포찌꺼기와 핵을 제거한 다음 원심분리하여 얻은 세포막 펠렛을 암모니움 설페이트가 함유된 완충액 중에서 추출하고 이 추출액을 음이온 교환 크로마토그래피한 후 트리톤 X-100이 포함된 완충액 중에서 초음파 파쇄하고 원심분리하여 얻은 상층액을 소수성 크로마토그래피, 음이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피, 소수성 고성능 액체 크로마토그래피 및 양이온 교환 고속 단백질 액체 크로마토그래피를 차례로 수행하는 단계를 포함하는 상기 스핑고마이엘리네이즈의 정제 방법을 제공한다.
또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 하이브리도마 SM1A5(기탁번호 제 KCLRF-BT-00025 호)에 의해 생산되는, 상기 스핑고마이엘리네이즈에 특이적인 모노클로날 항체를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 스핑고마이엘리네이즈는, 소 뇌의 신경세포 막에서 유래하는 막결합 단백질로서, 스핑고마이엘린의 가수분해를 매개하여 세라미드와 포스포콜린을 생성한다.
본 발명의 스핑고마이엘리네이즈는 스핑고마이엘린에 대해Km47 μM,Vmax1,587 nmol/분/㎎ 이상의 높은 활성을 가지며, 이것은 다른 인지질을 기질로 사용한 경우의 50 배에 이른다.
본 발명의 스핑고마이엘리네이즈의 활성은 Mg2+에 의존적이며, pH 6.0 내지 9.0의 범위에서 활성을 보이며, pH 7.5 에서 최적 활성을 보인다.
또한 본 발명의 스핑고마이엘리네이즈의 활성은 양이온의 영향을 받는데, Cu2+, Zn2+및 Fe2+에 의해 저해되지만(IC50값은 각각 28 μM, 32 μM 및 47 μM임),Fe3+에 의해 약 1.8 배 증가된다. 특히 스핑고마이엘리네이즈의 활성이 Fe2+에 의해 저해되지만 Fe3+에 의해 증가되는 양상은 매우 특이한 현상이다.
또한 본 발명에 따른 스핑고마이엘리네이즈의 활성은 글루타티온, 산화형 글루타티온, 시스테인, 시스테인-글라이신, γ-글루타르산-시스테인 등의 환원제의 영향도 받는데, 글루타티온의 경우 글루타티온 농도로 3 mM 이하의 범위에서는 농도 증가에 따라 활성도 증가하지만 3 mM 이상의 범위에서는 농도 증가에 따라 점차 활성이 감소하다가 10 mM의 농도에서는 완전히 저해되는(IC50: 8.0 mM) 두 형태의 저해양식을 보이는 반면, GSSG, 시스테인, 시스테인-글라이신, γ-글루타르산-시스테인의 경우에는 이들의 농도 증가에 따라 활성이 점차 저해된다. 특히 글루타티온 고갈에 대한 본 발명의 스핑고마이엘리네이즈의 감수성은 리우 등(Liu, B., et al.,J. Biol. Chem.,273, 34472-34479(1998))에 의해 부분 정제된 N-mSMase의 경우(IC50: 2.5 mM)보다도 훨씬 크다. 한편 본 발명의 스핑고마이엘리네이즈의 활성은 디티오트레이톨과 2-머캅토에탄올의 영향을 전혀 받지 않는 특성이 있다.
본 발명의 스핑고마이엘리네이즈의 활성은 소디움 데옥시콜레이트, 트리톤 X-100 등의 계면활성제의 영향도 받는데, 최적 활성을 보이는 소디움 데옥시콜레이트의 농도는 1 mM로 소디움 데옥시콜레이트를 포함하지 않는 경우보다 30 배 증가된 활성을 보이며, 최적 활성을 보이는 트리톤 X-100 농도는 0.005%로 트리톤 X-100을 포함하지 않는 경우보다 1.5 배 증가된 활성을 보인다.
본 발명의 스핑고마이엘리네이즈는 소 뇌 피질의 신경세포의 세포막에 존재하며, 신경교세포에는 존재하지 않는다. 또한 본 발명의 스핑고마이엘리네이즈는 소수성이 매우 크고 염화나트륨 또는 암모니움 설페이트에 의해 세포막으로부터 가용화되므로, 이온 결합에 의해 세포막에 결합되어 있는 주변 단백질(peripheral protein)로 보인다.
이러한 특성을 갖는 본 발명의 스핑고마이엘리네이즈는 소 뇌로부터 다음과 같은 방법에 의해 정제될 수 있다.
먼저, 소 뇌 조직을 호모게나이저를 사용하는 통상적인 방법에 따라 균질화한 후 균질화액을 원심분리하여 세포 찌꺼기와 핵 침전을 제거한 다음, 상층액을 다시 원심분리하여 세포막 펠렛을 얻는다. 세포막 펠렛은 암모니움 설페이트가 포함된 완충액중에서 통상적인 추출방법에 따라 추출한다. 이 과정에서 트리톤 X-100에 의해 추출되는 스핑고마이엘리네이즈들은 암모니움 설페이트에 의하여는 추출되지 않는다. 얻어진 암모니움 설페이트 추출액은 후속 단계에서 스핑고마이엘리네이즈 효소원으로 사용한다.
이어서, 암모니움 설페이트 추출액을 이용하여 음이온 교환 크로마토그래피를 수행한다. 상기 음이온 교환 크로마토그래피에는 DEAE-셀룰로즈(Whatman Biosystem Ltd., 영국), QAE-셀룰로즈(Whatman Biosystem Ltd., 영국), DEAE-세파로스(Pharmacia Biotechnology Inc., 스웨덴), QAE-세파로스(Pharmacia Biotechnology Inc., 스웨덴), DEAE-토요펄(Tosoh Co., 일본), QAE-토요펄(Tosoh Co., 일본) 등의 칼럼을 사용할 수 있으며, 이중 DEAE-셀룰로즈 칼럼이 바람직하다. DEAE-셀룰로즈 칼럼을 사용하는 크로마토그래피 방법으로는 DEAE-셀룰로즈 칼럼을 완충액 D(25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 및 10 mM 2-머캅토에탄올)로 미리 평형화한 후 여기에 암모니움 설페이트 추출액을 가한 다음, 0.5 M 암모니움 설페이트와 0.1 % 트리톤 X-100을 함유하는 완충액 D로 용출할 수 있다. 활성 분획은 단일 피크로 나타난다.
얻어진 활성 분획을 트리톤 X-100이 포함된 완충액 중에서 초음파 파쇄한 후 원심분리하여 스핑고마이엘리네이즈를 가용화하고 불용성 지질 성분을 제거한다. 이 과정은 스핑고마이엘리네이즈의 효율적인 회수를 가능하게 하는 매우 중요한 단계로, 이 과정을 거치지 않을 경우 소수성이 매우 큰 본 발명의 막결합 스핑고마이엘리네이즈가 기타 지질 성분과 응집하며 응집된 덩어리로부터 스핑고마이엘리네이즈를 회수하는 것이 매우 어려워진다. 원심분리하여 얻은 상층액에 암모니움 설페이트 용액을 가한 다음, 소수성 크로마토그래피를 수행한다. 상기 소수성 크로마토그래피에는 부틸-토요펄 650M(Tosoh Co., 일본), 페닐-토요펄 650M(Tosoh Co., 일본), 부틸-세파로스(Pharmacia Biotechnology Inc.), 페닐-세파로스(Pharmacia Biotechnology Inc.) 등의 칼럼을 사용할 수 있으며, 이중 부틸-토요펄 650M 칼럼이 바람직하다. 부틸-토요펄 650M 칼럼을 사용하는 크로마토그래피 방법으로는 부틸-토요펄 650M 칼럼을 0.5 M 암모니움 설페이트가 함유된 완충액 D로 미리 평형화한 후 여기에 암모니움 설페이트가 포함된 상층액을 가한 다음 0.2 M 암모니움 설페이트가 함유된 완충액 D와 물을 차례로 가하여 용출할 수 있다. 활성 분획은 단일 피크로 나타난다.
얻어진 활성 분획을 이용하여 음이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 수행한다. 상기 음이온 교환 HPLC에는 DEAE-5PW(Tosoh Co., 일본), DEAE-5PW(Tosoh Co., 일본), 모노 Q(Pharmacia Biotechnology Inc., 스웨덴), 모노 P(Pharmacia Biotechnology Inc., 스웨덴), Resource Q(Pharmacia Biotechnology Inc., 스웨덴)등의 칼럼을 사용할 수 있으며, 이중 DEAE-5PW 칼럼이 바람직하다. DEAE-5PW 칼럼을 사용하는 크로마토그래피 방법으로는 DEAE-5PW HPLC 칼럼을 완충액 D로 전평형화한 후 여기에 활성 분획을 가한 다음 0.5 M 암모니움 설페이트 및 0.1 % 트리톤 X-100이 함유된 완충액 D의 선형 구배로 용출할 수 있다. 활성 분획은 단일 피크로 나타난다.
얻어진 활성분획을 이용하여 소수성 HPLC를 수행한다. 상기 소수성 HPLC에는 페닐-5PW, 페닐-5PW 글래스, 에테르-5PW 글래스, 에테르-5PW, 부틸-NPR(Tosoh Co., 일본), SOURCE 15ETH, SOURCE 15ISO, SOURCE 15PHE, 페닐 세파로스 고성능, 부틸 세파로스 4 고속(fast flow), 옥틸 세파로스 4 고속 및 페닐 세파로스 6 고속(Pharmacia Biotechnology Inc.) 등의 칼럼을 사용할 수 있으며, 이중 페닐-5PW 칼럼이 바람직하다. 페닐-5PW 칼럼을 사용하는 크로마토그래피 방법으로는, 페닐-5PW 칼럼을 0.2 M 암모니움 설페이트가 함유된 완충액 D로 미리 평형화한 후 여기에 활성 분획을 가한 다음 증류수의 선형 구배로 용출할 수 있다. 활성 분획은 두 개의 피크로 나타나며, 이를 각각 피크 ε과 ζ로 명명한다.
얻어진 활성 분획을 양이온 교환 고속 단백질 액체 크로마토그래피(fast protein liquid chromatography, FPLC)를 수행한다. 양이온 교환 FPLC에는 모노 SFPLC(Pharmacia Biotechnology Co., 스웨덴), Resource S(Pharmacia Biotechnology Co., 스웨덴), SP-5PW(Tosoh Co., 일본) 등의 칼럼을 사용할 수 있으며, 이중 모노 S FPLC 칼럼이 바람직하다. 모노 S FPLC 칼럼을 사용하는 크로마토그래피 방법으로는, 모노 S 양이온 교환 FPLC 칼럼을 완충액 S(25 mM 소디움 아세테이트(pH 6.5) 및 1 mM EDTA)로 미리 평형화한 후 여기에 활성 분획과 완충액 S의 혼합 용액을 가한 다음, 염화나트륨 선형 구배와, 1.0 M 염화나트륨 및 0.1% Triton X-100를 포함하는 완충액 S의 구배로 차례로 용출할 수 있다. 활성 분획은 두 개의 피크로 나타나며, 이를 각각 피크 A와 B로 명명한다. 두 피크의 SDS-PAGE 분석, 면역 침전 및 웨스턴 블랏 결과에 따르면, 두 피크의 활성 분획은 모두 60 kDa의 분자량을 나타내는 본 발명의 스핑고마이엘리네이즈이며, 피크 B의 활성 분획이 피크 A의 활성 분획보다 총활성이 1.4배 크고 비활성도 4배 이상 크다. 본 발명의 스핑고마이엘리네이즈는 N-mSMase ε으로 명명하였다.
또한 본 발명의 스핑고마이엘리네이즈에 대한 모노클로날 항체는, 하이브리도마 SM1A5에 의해 생산된다. 이 항체를 생산하는 하이브리도마 SM1A5는 통상적인 하이브리도마 제조방법에 따라 제조되었으며, 기탁기관 한국세포주연구재단(KCLRF)에 1999년 9월 15일자 기탁번호 제 KCLRF-BT-00025 호로 기탁되었다.
이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 상세히 설명하나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
참고예 1: N-mSMase 활성 분석
[N-메틸-14C]스핑고마이엘린(콜린 잔기에14C로 표지됨)을 질소 기류하에 건조시킨 후 에탄올에 현탁하였다. 시료 10 ㎕를 100 ㎕의 반응액(10 mM MgSO4, 50 μM [N-메틸-14C]스핑고마이엘린(약 60,000 cpm), 2 mM 소디움 데옥시콜레이트, 100 mM Tris-HCl(pH 7.0))과 혼합하고 37 ℃에서 30 분 동안 반응시킨 후 여기에 320 ㎕의 클로로포름/메탄올(1:1 부피비)과 30 ㎕의 2N 염산을 가하여 반응을 종료시켰다. 혼합물을 교반하고, 10,000 x g에서 원심분리한 후 수층 200 ㎕를 2.5 ㎖의 신틸레이션 용액(Insta gel-XF, Packard Instrument Co., 미국)과 혼합한 후 팩카드 트리카브(Packard Tri-carb) 액체 β-신틸레이션 계수기로 방사능을 측정하였다.
참고예 2: 단백질 정량
N-mSMase 단백질의 정량은, UV 검출기(Pharmacia Biotechnology Co., 스웨덴)를 이용하여 280 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 결정하였다. 시료중의 단백질 농도는 브래드포드 시약을 이용하여 측정한 후, 소 혈청 알부민을 기준으로 작성한 검량선으로부터 정량하였다.
실시예 1: N-mSMase ε의 정제
(단계 1) 효소원의 제조
소 뇌 5㎏을 25 ℓ의 균질화 완충액(50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 1 mM EDTA, 3mM MgCl2, 50 mM KCl 및 10 mM 2-머캅토에탄올)중에서 폴리트론 호모게나이저(Polytrom homogenizer Model PT-MR 6000, Kinematica, 스위스)를 이용하여 균질화하였다. 균질화액을 10,000 x g에서 10 분 동안 원심분리하여 세포 찌거기와 핵을 제거한 후 상층액을 다시 4 ℃, 10,000 x g에서 1 시간 동안 원심분리하였다. 펠렛을 2.5 ℓ의 균질화 완충액으로 현탁하고, 4 ℃, 40,000 x g에서 1 시간 동안 원심분리한 후 얻어진 펠렛을 다시 0.5 M 암모니움 설페이트를 함유하는 균질화 완충액 2.5 ℓ로 재현탁하고 4 ℃에서 1 시간 동안 교반한 다음 4℃, 40,000 x g에서 1 시간 동안 원심분리하였다. 상층액(암모니움 설페이트 추출액)을 수집하여 N-mSMase 정제를 위한 효소원으로 사용하였다.
(단계 2) DEAE-셀룰로즈 음이온 교환 크로마토그래피
2.0 ℓ의 DE52 겔(Whatman Biosystem Ltd., 영국)이 충진된 DEAE-셀룰로즈 칼럼을 완충액 D(25 mM Tris-HCl(pH 7.5), 1 mM EDTA, 및 10 mM 2-머캅토에탄올)로 미리 평형화하고, 단계 1에서 얻은 암모니움 설페이트 추출액 2.5 ℓ를 가하였다. 0.5 M 암모니움 설페이트와 0.1 % 트리톤 X-100을 함유하는 완충액 D를 단계적으로 가하면서 20 ㎖/분의 유속으로 용출하여 40 ㎖씩의 분획을 취하였다. 각 분획 10 ㎕를 취하여 참고예 1의 방법으로 N-mSMase 활성을 분석하여 활성 분획을 얻었다.
크로마토그래피 결과는 도 1과 같다. 도 1에서 보듯이, N-mSMase 활성은 단일 피크로 나타났다.
(단계 3) 부틸-토요펄 650M 소수성 크로마토그래피
단계 2에서 얻은 활성 분획을 세포파쇄기(Sonics Materials Inc., Canbury, 미국)를 이용하여 4 ℃에서 5초 간격으로 3 초 동안 진폭(amplitude) 70%의 출력으로 6 회 초음파 파쇄한 후, 4 ℃, 100,000 x g에서 1 시간 동안 원심분리하였다. 상층액에 4.0 M 암모니움 설페이트 용액을 최종 농도 0.5 M이 되도록 가하여 시료를 얻었다.
이 시료를, 0.5 M 암모니움 설페이트가 함유된 완충액 D로 미리 평형화된 부틸-토요펄 650M 칼럼(Tosoh Co., 일본, bed volume 150 ㎖)에 가한 후, 0.2 M 암모니움 설페이트가 함유된 완충액 D를 단계적으로 가하고 이어서 증류수를 가하여 15 ㎖/분의 유속으로 용출하면서, 30 ㎖씩의 분획을 취하였다. 각 분획 10 ㎕를 취하여 참고예 1의 방법으로 N-mSMase 활성을 분석하여 활성 분획을 얻었다.
크로마토그래피 결과는 도 2와 같다. 도 2에서 보듯이, N-mSMase 활성은 단일 피크로 나타났다.
(단계 4) DEAE-5PW 음이온 교환 HPLC
단계 3에서 얻은 활성 분획을, 완충액 D로 미리 평형화된 DEAE-5PW HPLC 칼럼(21.5 ㎜ x 15 ㎝, Tosoh Co., 일본)에 가한 후, 0.5 M 암모니움 설페이트 및 0.1 % 트리톤 X-100이 함유된 완충액 D 200 ㎖의 선형 구배로 5 ㎖/분의 유속으로 용출하면서, 5 ㎖씩의 분획을 취하였다. 각 분획 3 ㎕를 취하여 참고예 1의 방법으로 N-mSMase 활성을 분석하여 활성 분획을 얻었다.
크로마토그래피 결과는 도 3과 같다. 도 3에서 보듯이, N-mSMase 활성은 단일 피크로 나타났다.
(단계 5) 페닐-5PW 소수성 HPLC
단계 4에서 얻은 활성 분획을, 0.2 M 암모니움 설페이트가 함유된 완충액 D로 미리 평형화된 페닐-5PW HPLC 칼럼(21.5 ㎜ x 15 ㎝, Tosoh Co., 일본)에 가한 후, 증류수의 선형 구배로 5 ㎖/분의 유속으로 용출하면서, 5 ㎖씩의 분획을 취하였다. 각 분획 3 ㎕를 취하여 참고예 1의 방법으로 N-mSMase 활성을 분석하여 활성 분획을 얻었다.
크로마토그래피 결과는 도 4와 같다. 도 4에서 보듯이, N-mSMase 활성은 두 개의 피크로 나타났으며, 이를 각각 피크 ε과 ζ로 명명하였다.
(단계 6) 모노 S 양이온 교환 FPLC
단계 5에서 얻은 활성 분획 중 피크 ε의 분획들만을 모으고 동일 부피의 완충액 S(25 mM 소디움 아세테이트(pH 6.5) 및 1 mM EDTA)와 혼합한 후, 완충액 S로 미리 평형화한 모노 S 양이온 교환 FPLC 칼럼(5.0 ㎝ x 5.0 ㎜, Pharmacia Biotechnology Co., 스웨덴)에 가한 다음, 0.0 내지 1.0 M 염화나트륨 20 ㎖의 선형 구배로, 이어서 1.0 M 염화나트륨 및 0.1% Triton X-100를 포함하는 완충액 S의 계단식 구배로 1 ㎖/분의 유속으로 용출하면서, 1 ㎖씩의 분획을 취하였다. 각 분획 3 ㎕를 취하여 참고예 1의 방법으로 N-mSMase 활성을 분석하여 활성 분획을 얻었다.
크로마토그래피 결과는 도 5와 같다. 도 5에서 보듯이, N-mSMase 활성은 2개의 피크로 나타났으며, 이를 각각 피크 A와 B로 명명하였으며, 이 피크들에서 얻어진 N-mSMase를 N-mSMase ε으로 명명하였다.
각 단계에서 정제된 단백질의 총 단백질, 총 활성, 수율, 비활성 및 순도는 하기 표 1과 같다.
정제 단계 총 단백질(㎎) 총 활성(nmol/분) 수율(%) 비활성nmol/분/㎎ 순도(배)
40,000 x g 펠렛 6250 895 100 0.15 1
암모니움 설페이트 추출액 2500 1440 161 0.60 4
DEAE-셀룰로즈 532 630 70.4 1.20 8
초음파 추출액 352 545 60.9 1.55 10
부틸-토요펄 12 240 26.8 20.00 133
DEAE-5PW HPLC 3.70 95 10.6 25.70 171
페닐-5PW HPLC 피크 ε 0.27 32 3.6 118.50 790
페닐-5PW HPLC 피크 ζ 0.38 21 2.3 55.25 368
모노 S FPLC 피크 A 0.03 9 1.0 300.00 2000
모노 S FPLC 피크 B <0.01 11.5 1.3 1150.00 7667
실시예 2: SDS-PAGE
실시예 1의 단계 6에서 얻은 활성 분획인 피크 A와 B 각각 10 ㎕씩을 램리의 방법(Laemmli, U. K.,Nature,227, 680-685(1970))에 따라 5 x 램리 완충액(0.125 M Tris-HCl(pH 6.8), 4% SDS, 20% 글리세롤 및 0.002% 브로모페놀블루)와 2 ㎕와 혼합한 후 시료를 5 분 동안 끓이고 실온으로 냉각시켰다. 이어서 10% SDS-PAGE을 수행하였다. 분리된 단백질은 플러스원 실버 스테이닝 키트(PlusOne Silverstaining kit, Pharmacia LKB Co., 스웨덴)를 이용하여 염색하였다.
피크 A와 B에 대한 결과는 각각 도 6a 및 6b와 같다. 도 6a와 6b에서 표준 단백질 마커로서 미오신(202 kDa), β-갈락토시다제(116 kDa), 소 혈청 알부민(84 kDa), 오브알부민(50.1 kDa), 카보닉 언하이드레이즈(35.7 kDa)의 분자량을 왼쪽에 화살표로 표시하였으며, 도 6a에서 제1열 내지 제11열은 도 5에 나타낸 피크 A의 활성 분획들(분획 번호 33 내지 43)이고 도 6b에서 제1열 내지 제10열은 도 5에 나타낸 피크 B의 활성 분획들(분획 번호 53 내지 62)이다. 도 6a와 6b에서 보듯이, 피크 A와 B에 분리된 N-mSMase ε은 모두 60 kDa의 분자량을 갖는 것으로 확인되었으며, 이외의 다른 단백질은 관찰되지 않았다.
실시예 3: N-mSMase ε에 대한 모노클로날 항체의 제조
실시예 1의 단계 6에서 얻어진 N-mSMase ε 50 ㎍을 프루인드 완전 부형제(Feund's complete adjuvant, Gibco BRL Life Technologies, Inc., 미국)와 혼합하고 BALB/c 마우스(대한실험동물센타, 충북 음성)에 복강 주사하여, 면역화시켰다. 이후 프루인드 불완전 부형제에 유화시킨 N-mSMase ε 50 ㎍씩을 3주 간격으로 3회 더 주사하였다. 융합하기 3일 전에 마지막으로 부형제 없이 N-mSMase ε 50 ㎍을 주사한 후 채혈하였다. 혈액을 10,000 x g에서 30 분 동안 원심분리하여 항혈청을 얻었다.
이 마우스의 비장세포(2x108개)와 SP2/0 마우스 마이엘로마 세포를, 고딩의방법(Goding, J.W., in Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, London(1986))에 따라 43% 폴리에틸렌글리콜(PEG) 50(Sigma Co., 미국)을 사용하여 융합한 후 96 웰 플레이트의 각 웰에 넣고, 10% 하이브리도마 촉진 배지(Sigma Co., 미국), 20 % 소 태아 혈청(Hyclone사), 35% SP20 및 35% HEPES 완충액과 RPMI-1640(GIBCO BRL, Grand Island, NY 미국)를 포함하는 하이포잰틴/아미노프테린/티미딘 배지(Sigma Co., 미국)에서 37 ℃로 2주 동안 배양하였다. 하이브리도마 상층액을 이용하여, 오수벨의 방법(Ausubel, F.M., in Current Protocols in Molecular Biology, Willey-Interscience, New York(1987))에 따라 N-mSMase ε에 대한 항체 생산 여부를 확인하였다. 그 결과 본 발명의 N-mSMase ε에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 3개의 하이브리도마 클론이 확인되었으며, 이를 각각 SM1A5, SM1H6 및 SM1E1로 명명하였으며, 이중 SM1A5를 한국세포주연구재단에 1999년 9월 15일자 기탁번호 제 KCLRF-BT-00025 호로 기탁하였다.
실시예 4: N-mSMase ε의 면역침전
실시예 3에서 얻은 항혈청 25 ㎕, 하이브리도마 SM1A5, SM1H6 또는 SM1E1 배양액 500 ㎕, 및 대조구로서 면역전 혈청 25 ㎕를 각각, 완충액 I(20 mM Tris-HCl(pH 7.5), 1 mM EDTA 및 10% BSA(20:1 부피비))로 미리 평형화한 단백질 A-세파로즈 CL-4B 비드(Pharmacia Biotechnology Inc., 스웨덴) 50 ㎕와 4 ℃에서 12 시간 동안 흔들어주면서 반응시켰다. 비드를 1 ㎖의 완충액 I로 6회 세척한 후, 실시예 1의 단계 6에서 얻은 N-mSMase ε 100 ng이 100 ㎕의 완충액 I에 혼합된 용액과 4 ℃에서 0, 15, 30, 45 또는 60 분 동안 흔들어주면서 반응시켰다. 반응액을 4℃, 13,000 x g에서 30 초 동안 원심분리한 후, 상층액을 이용하여 참고예 1의 방법에 따라 N-mSMase 활성을 분석하였다.
그 결과는 도 7과 같다. 도 7에서 보듯이, 하이브리도마 클론 SM1A5 및 SM1E1에서 생산된 항체가 N-mSMase ε 활성을 비슷한 친화도로 면역침전시켰다.
실시예 5: 웨스턴 블랏
실시예 1의 단계 5에서 얻은 N-mSMase 약 100 ng을 10% 겔에서 SDS-PAGE를 실시한 후 겔상에 분리된 단백질을 호퍼 일렉트로블랏터 시스템(Hoefer electroblotter system, TE22 Mighty Small Transphor Unit, Hoefer Scientific Instruments, 캐나다)을 사용하여 200 mA의 전류세기로 니트로셀룰로즈 막에 옮겼다. 이 니트로셀룰로즈 막을, 5% 비-지방 건조 탈지유를 트리스 완충 식염수(TBS, 25 mM Tris-HCl(pH 8.0), 137 mM NaCl 및 2.7 mM KCl)에 녹인 용액 중에 실온에서 2 시간 동안 처리하여 차단하고, 0.1 % 트윈 20이 함유된 TBS로 세척한 다음, 항혈청, 하이브리도마 SM1A5, SM1H6 또는 SM1E1 배양액, 또는 대조구로서 면역전 혈청과 함께 6 시간 동안 반응시켰다. 이 막을 0.1% 트윈 20이 포함된 TBS로 세척한 다음 염소 항 마우스 IgG-알칼리 포스파타제 콘쥬게이트(Santa Cruz Biotechnology, 미국)(희석도 1:2,000)와 2 시간 동안 반응시킨 후, 상기와 같이 세척하고, 기질 키트(MBT/BCIP, Pierce, 미국)를 사용하여 발색시켰다. 하이브리도마 배양액의 경우 세척용 완충액으로 TBS만을 사용하였다.
그 결과는 도 8과 같다. 도 8에서 보듯이, 하이브리도마 SM1A5에서 생산된 모노클로날 항체가 SDS-PAGE 겔상에서 변성된(denatured) N-mSMase ε과 강하게 반응하였다.
실시예 6: N-mSMase ε의 이화학적 특성
(1) 동력학 분석
실시예 1의 단계 6에서 얻은 N-mSMase ε에 대해 리네위버-버크 분석(Lineweaver-Burk analysis)을 수행하였다. 이때, 효소 N-mSMase ε은 10 ng 이하의 양으로 사용하고, 기질 스핑고마이엘린은 6.25 내지 100 μM의 양으로 사용하였다.
그 결과는 도 9a와 같다. 도 9a에서 보듯이, N-mSMase ε은 전형적인 미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 동력학에 따른 직선 그래프를 나타내었으며,Km47 μM,Vmax1,587 nmol/분/㎎ 이었다.
한편, 0.4, 1.0 및 2.0 mM 소디움 데옥시콜레이트를 첨가한다는 점을 제외하고는 상기와 동일하게 리네위버-버크 분석을 수행하였으며, 그 결과는 도 9b와 같다. 도 9b에서 보듯이, 소디움 데옥시콜레이트는 스핑고마이엘린에 대한 N-mSMase ε의Km값을 변화시키지 못하였다.
(2) 기질 특이성
N-mSMase ε의 기질 특이성을 조사하기 위해, 기질로서 [N-메틸-14C]스핑고마이엘린, 1,2-디팔미토일-3-포스파티딜 [N-메틸-3H]콜린, 및 포스파티딜 [2-3H]이노시톨 4,5-비포스페이트, 1-스테아로일-2-[1-14C]아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 및 1-아실-2-[1-14C]아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민을 사용하여 참고예 1의 방법으로 N-mSMase 활성을 측정하였다.
그 결과, N-mSMase ε은 스핑고마이엘린에 대해 높은 특이성을 나타내었으며, 이것은 다른 기질의 경우의 50 배에 이른다.
(3) Mg2+의존성
N-mSMase ε 활성의 Mg2+의존성을 조사하기 위해, 실시예 1의 단계 6에서 얻은 분획 B를, 증류수로 2회 미리 평형화한 PD-10 칼럼(세파덱스 G-25, Pharmacia Biotechnology Inc Co., 스웨덴)에 적용하여 염을 제거한 단백질 분획(단백질 10 ng 해당량)을 얻고, MgCl2가 1, 5, 10, 및 25 mM의 농도로 포함된 반응액 중에서 참고예 1의 방법에 따라 N-mSMase 활성을 측정하였다.
그 결과는 도 10과 같다. 도 10에서 보듯이, N-mSMase ε 활성은 Mg2+에 의존적이다.
(4) 최적 pH
N-mSMase ε의 최적 pH를 조사하기 위해, (3)에서 얻은 단백질 분획(단백질 10 ng 해당량)과 5 mM MgCl2를 포함하는 반응액을, 글라이신-HCl를 사용하여 pH 4.5, 5.5 또는 6.0로 조정하거나, 이미다졸-HCl를 사용하여 pH 6.0 또는 7.0로 조정하거나, 트리스-HCl을 사용하여 7.0, 7.5, 8.0 또는 9.0로 조정하거나, 글라이신-NaOH를 사용하여 pH 9, 10 또는 11로 조정한 후, 참고예 1의 방법에 따라 N-mSMase 활성을 측정하였다.
그 결과는 도 11과 같다. 도 11에서 보듯이, N-mSMase ε은 중성 pH에서 가장 높은 활성을 보였으며, 6.0 이하와 9.0 이상의 범위의 pH에서는 활성을 거의 나타내지 않는다. 따라서 본 발명의 N-mSMase ε은 중성 pH에서 최적 활성을 보이는 효소임을 알 수 있다.
(5) 기타 양이온의 영향
기타 양이온 Ca2+, Fe3+, Fe2+, Zn2+, Cu2+가 Mg2+이 N-mSMase ε의 활성에 미치는 효과를 조사하기 위해, (3)에서 얻은 단백질 분획(단백질 10 ng 해당량)과 5 mM MgCl2를 포함하는 반응액에, CaCl2, FeCl3, FeCl2, ZnCl2또는 CuCl2를 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.25 또는 0.5 mM의 농도가 되도록 가한 후, 참고예 1의 방법에 따라 N-mSMase 활성을 측정하였다.
그 결과는 도 12와 같다. 도 12에서 보듯이, Ca2+는 0.5 mM 이하의 농도에서 N-mSMase ε의 활성에 영향을 미치지 않는다. 반면 Cu2+, Zn2+및 Fe2+는 N-mSMase ε의 활성을 저해하며, IC50값은 각각 28 μM, 32 μM 및 47 μM이다. 또한 Fe3+는 N-mSMase ε의 활성을 1.8 배로 증가시킨다.
(6) 저해제
글루타티온, DTT, 2-머캅토에탄올 등의 환원제가 N-mSMase ε의 활성에 미치는 영향을 조사하기 위해, 실시예 1의 단계 6에서 얻은 활성 분획(단백질 10 ng 해당량)을, 글루타티온, DTT 또는 2-머캅토에탄올을 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 7.5 또는 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) 완충액 90 ㎕에 가하고 37 ℃에서 10 분 동안 전처리한 후, [N-메틸-14C]스핑고마이엘린 10 ㎕를 가하고, 참고예 1의 방법에 따라 N-mSMase 활성을 측정하였다. 이때 대조구로는 환원제를 포함하지 않는 경우를 사용하였으며, 환원제를 포함하는 경우의 N-mSMase ε의 활성은 대조구의 활성에 대한 백분율로 나타내었다.
그 결과는 도 13a와 같다. 도 13a에서 보듯이, N-mSMase ε의 활성은 글루타티온에 의해 영향을 받는데, 글루타티온 농도로 3 mM까지는 증가하지만 농도가 증가함에 따라 점차 감소하다가 10 mM의 농도에서는 완전히 저해되는 두 형태의 프로필(bimodal profile)을 보인다. 반면 N-mSMase ε의 활성은 DTT와 2-머캅토에탄올에 의해 저해되지 않는다.
글루타티온과 유사한 환원제에 따른 N-mSMase ε의 활성을 조사하기 위해, GSSG, 시스테인, 시스테인-글라이신 또는 γ-글루타르산-시스테인을 1, 3, 5 또는 10 mM로 사용하여 동일한 방법으로 전처리한 후 N-mSMase 활성을 측정하였다.
그 결과는 도 13b와 같다. 도 13b에서 보듯이, N-mSMase ε의 활성은 GSSG, 시스테인, 시스테인-글라이신 또는 γ-글루타르산-시스테인에 의해 저해된다.
(7) 계면활성제의 영향
계면활성제가 N-mSMase ε의 활성에 미치는 효과를 조사하기 위해, (3)에서 얻은 단백질 분획(단백질 10 ng 해당량)을 0.5, 1, 2 및 5 mM의 소디움 데옥시콜레이트 또는 0.05, 0.01, 0.05 및 0.1 % 트리톤 X-100을 포함하는 반응액 중에서 참고예 1의 방법에 따라 N-mSMase 활성을 측정하였다.
그 결과는 각각 도 14a 및 14b과 같다. 도 14a에서 보듯이, N-mSMase ε의 활성은 1 mM 소디움 데옥시콜레이트 중에서 3.0 배 증가하며, 0.005% 트리톤 X-100 중에서 1.5 배 증가한다.
실시예 7: N-mSMase ε의 뇌 조직내 분포
임신 16일째의 스프라그-다우리 래트 태아로부터 코 등의 방법(Koh, J.Y., et al.,Exp. Neurol.,135, 153-159(1996))에 따라 피질 신경세포(neuron) 배양액을 다음과 같이 제조하였다. 래트 태아의 피질 신경조직을 적출한 후 이 조직을Ca2+및 Mg2+부재의 행크 평형 염 용액(HBSS, 1 mM 소디움 피루베이트 및 10 mM HEPES, pH 7.4)에 넣은 다음, 불꽃을 이용하여 좁게 만든 파스퇴르 피펫을 사용하여 유리된 세포를 분리하였다. 유리 세포를 폴리-D-라이신이 코팅된 배양 플레이트에 담긴 둘베코 변형 이글 배지/F-12(GIBCO BRL, Grand Island, NY 미국)중에 도말하고, 95% 습윤 공기 및 5% CO2하에 37 ℃에서 배양하였다. 18 시간 후 10 μM β-D-시토신 아라비노푸라노시드를 가하여 비신경세포의 성장을 방지하였다.
한편, 출생 후 1 내지 3일인 래트의 뇌 신피질로부터 신경교세포(glia)의 배양액을 제조하고, 10% 소태아혈청과 10% 말 혈청이 보충된 배지중에, 6웰 용기당 0.25 내지 0.5 반구로 도말하고 2 시간 동안 배양한 후 매주 동일한 배지를 공급하였다. 신경교세포는 실험관내에서 14 내지 28일에 도말하는 데 사용하였다.
배양된 피질 신경세포와 신경교 세포를 각각 TBS로 3 회 세척한 다음 균질화 완충액(20 mM Tris-HCl(pH 7.5), 1mM EDTA, 10 mM 2-머캅토에탄올, 1 ㎍/㎖ 루펩틴(leupeptin) 및 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드)을 가하고 26 게이지 바늘을 통해 앞뒤로 30 회 이동시켜 균질화시킨 후 균질화액을 4 ℃, 2,000 x g에서 10 분 동안 원심분리하여 신경세포와 신경교 세포의 파쇄물을 얻었다. 이중 신경세포 파쇄물은 다시 4 ℃, 100,000 x g에서 1 시간 동안 원심분리하여 상층액을 수용성 분획(S100)으로 얻고 펠렛을 막 분획(P100)으로 얻었으며, 얻어진 펠렛을 상층액의 1/2 부피의 균질화 완충액에 현탁하였다.
신경세포의 수용성 분획, 막 분획, 신경교세포 파쇄물, 및 실시예 1의 단계6에서 얻은 N-mSMase ε에 대해 10 % SDS-PAGE를 수행하였다. 실시예 3에서 얻은 60 kDa 단백질에 대한 항혈청을 10,000 배 희석 사용하여 실시예 5에서와 동일한 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하였다.
그 결과는 도 15와 같다. 도 15에서 보듯이, N-mSMase ε은 신경 세포의 막 분획에 위치하며, 신경 세포의 수용성 분획과 신경교 세포의 균질화액에는 존재하지 않는 것으로 확인되었다.
본 발명의 스핑고마이엘리네이즈 N-mSMase ε은 신경세포의 막에만 존재하므로, 파킨슨 병, 알쯔하이머 병 등의 뇌 질환에 대한 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 스핑고마이엘리네이즈 N-mSMase ε은 그 저해제 또는 활성화제의 탐색 뿐만 아니라 X-ray 또는 NMR에 의한 구조분석에도 유용하게 사용될 수 있다.
한편, 본 발명의 스핑고마이엘리네이즈에 특이적인 모노클로날 항체는 스핑고마이엘리네이즈 N-mSMase ε의 기능과 세포내에서의 조절 기전 등에 대한 연구 뿐만 아니라 N-mSMase ε의 효율적인 분리정제에도 유용하게 사용될 수 있으며, 암과 퇴행성 질환의 진단용 키트에도 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (9)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 소 뇌 조직을 균질화하고 세포찌꺼기와 핵을 제거한 다음 원심분리하여 얻은 세포막 펠렛을 암모니움 설페이트가 함유된 완충액중에서 추출하고 이 추출액을 음이온 교환 크로마토그래피한 후 트리톤 X-100가 포함된 완충액 중에서 초음파 파쇄하고 원심분리하여 얻은 상층액을, 소수성 크로마토그래피, 음이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피, 소수성 고성능 액체 크로마토그래피 및 양이온 교환 고속 단백질 액체 크로마토그래피를 차례로 수행하여 정제하는 단계를 포함하는 소 뇌 유래의 분자량이 60kDa이고, Mg2+에 의존적이며, 최적 pH가 6.0 내지 9.0인 스핑고마이엘리네이즈의 정제 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 음이온 교환 크로마토그래피가 DEAE-셀룰로즈 칼럼을 사용하여 수행되는 방법.
  5. 제 3 항에 있어서,
    상기 소수성 크로마토그래피가 부틸-토요펄 650M 칼럼을 사용하여 수행되는 방법.
  6. 제 3 항에 있어서,
    상기 음이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피가 DEAE-5PW 칼럼을 사용하여 수행되는 방법.
  7. 제 3 항에 있어서,
    상기 소수성 고성능 액체 크로마토그래피가 페닐-5PW 칼럼을 사용하여 수행되는 방법.
  8. 제 3 항에 있어서,
    상기 양이온 교환 고속 단백질 액체 크로마토그래피가 모노 S 고속 단백질 액체 크로마토그래피 칼럼을 사용하여 수행되는 방법.
  9. 삭제
KR10-1999-0048275A 1999-11-03 1999-11-03 소 뇌 유래의 막결합 중성형 스핑고 마이엘리네이즈의 정제방법 KR100379240B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-1999-0048275A KR100379240B1 (ko) 1999-11-03 1999-11-03 소 뇌 유래의 막결합 중성형 스핑고 마이엘리네이즈의 정제방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-1999-0048275A KR100379240B1 (ko) 1999-11-03 1999-11-03 소 뇌 유래의 막결합 중성형 스핑고 마이엘리네이즈의 정제방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20010045120A KR20010045120A (ko) 2001-06-05
KR100379240B1 true KR100379240B1 (ko) 2003-04-11

Family

ID=19618266

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-1999-0048275A KR100379240B1 (ko) 1999-11-03 1999-11-03 소 뇌 유래의 막결합 중성형 스핑고 마이엘리네이즈의 정제방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100379240B1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003247216A1 (en) * 2003-07-31 2005-02-15 Dae-Kyong Kim Novel sphinogmyelinase, the antibody against it, the antisense and the preparation method thereof
US11242529B2 (en) 2013-05-07 2022-02-08 Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation Method for treating a neurological disorder comprising administering ASM inhibitors
KR101521117B1 (ko) 2013-05-07 2015-05-18 경북대학교 산학협력단 Ａｓｍ 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
KR20010045120A (ko) 2001-06-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lu et al. Purification and characterization of dihydropyrimidine dehydrogenase from human liver.
Faust et al. Subcellular localization of protein kinase CK2: a key to its function?
Brzezinski et al. Purification and characterization of a human liver cocaine carboxylesterase that catalyzes the production of benzoylecgonine and the formation of cocaethylene from alcohol and cocaine
US5955583A (en) Antibodies to cGMP-binding, cGMP-specific phospodiesterase
Lammich et al. Constitutive and regulated α-secretase cleavage of Alzheimer’s amyloid precursor protein by a disintegrin metalloprotease
Laxminarayan et al. Characterization of a cDNA encoding the 43-kDa membrane-associated inositol-polyphosphate 5-phosphatase.
US5532152A (en) Platelet-activating factor acetylhydrolase
Ohashi et al. Characterization of human glucocerebrosidase from different mutant alleles
Linder et al. Glycosylation differences contribute to distinct catalytic properties among bone alkaline phosphatase isoforms
Akita et al. Overproduction of a Ca (2+)-independent protein kinase C isozyme, nPKC epsilon, increases the secretion of prolactin from thyrotropin-releasing hormone-stimulated rat pituitary GH4C1 cells.
Nara et al. Retinol-induced morphological changes of cultured bovine endothelial cells are accompanied by a marked increase in transglutaminase
Pentchev et al. The isolation and characterization of sphingomyelinase from human placental tissue
Subramanian et al. A novel inhibitor of 5-lipoxygenase (5-LOX) prevents oxidative stress–induced cell death of retinal pigment epithelium (RPE) cells
Rogne et al. OPA1-anchored PKA phosphorylates perilipin 1 on S522 and S497 in adipocytes differentiated from human adipose stem cells
Pettmann et al. Isolation of a glial maturation factor from beef brain
Kusuda et al. Mutational analysis of the domain structure of mouse protein phosphatase 2Cβ
KR100379240B1 (ko) 소 뇌 유래의 막결합 중성형 스핑고 마이엘리네이즈의 정제방법
Bidwai et al. Purification and characterization of casein kinase II (CKII) from delta cka1 delta cka2 Saccharomyces cerevisiae rescued by Drosophila CKII subunits. The free catalytic subunit of casein kinase II is not toxic in vivo.
TWI272308B (en) Ceramidase gene
Tanabe et al. Neuronal RA175/SynCAM1 isoforms are processed by tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme (TACE)/ADAM17-like proteases
US20020137173A1 (en) Membrane-associated sphingomyelinase derived from bovine brain, isolation method therefor and anti-sphingomyelinase monoclonal anitibody
EP1258527A1 (en) Membrane-associated shingomyelinase derived from bovine brain, isolation method therfor and anti-sphingomyelinase monocional antibody
KR100565437B1 (ko) 신규한 스핑고마이엘리나제 효소, 그에 대한 항체, 안티센스 및 제조방법
Ye et al. Isolation and characterization of angiogenin-1 and a novel protein designated lactogenin from bovine milk
JP2002253225A (ja) ウシの脳由来の細胞表面スフィンゴミエリナーゼ、その単離方法及び抗スフィンゴミエリナーゼモノクローナル抗体

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
N231 Notification of change of applicant
N231 Notification of change of applicant
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application
J201 Request for trial against refusal decision
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
B701 Decision to grant
GRNT Written decision to grant
N231 Notification of change of applicant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130207

Year of fee payment: 11

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20131231

Year of fee payment: 12

LAPS Lapse due to unpaid annual fee