JP2002253225A - ウシの脳由来の細胞表面スフィンゴミエリナーゼ、その単離方法及び抗スフィンゴミエリナーゼモノクローナル抗体 - Google Patents
ウシの脳由来の細胞表面スフィンゴミエリナーゼ、その単離方法及び抗スフィンゴミエリナーゼモノクローナル抗体Info
- Publication number
- JP2002253225A JP2002253225A JP2001037192A JP2001037192A JP2002253225A JP 2002253225 A JP2002253225 A JP 2002253225A JP 2001037192 A JP2001037192 A JP 2001037192A JP 2001037192 A JP2001037192 A JP 2001037192A JP 2002253225 A JP2002253225 A JP 2002253225A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sphingomyelinase
- activity
- chromatography
- msmase
- high performance
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 ウシ脳由来の細胞表面スフインゴミエリナー
ゼ、その単離法及び抗スフインゴミエリナーゼ抗体の提
供。 【解決手段】 分子量６０ｋＤａ、Ｍｇ2+依存性、最適
ｐＨ６．０〜９．０であるウシ脳由来のスフインゴミエ
リナーゼ。該酵素は次の順序で分離精製される。ウシの
脳組織を均質化、遠心分離して細胞デブリ及び細胞核を
除去し；その上清から細胞膜を分離してペレットとし；
これを特定成分含有のバッファーで処理して該酵素を膜
から分離し；得られた抽出物をアニオン交換クロマトグ
ラフイーに付し；当該画分を特定成分含有のバッファー
中で超音波処理し、さらに遠心分離して該酵素を含む上
清を得て；疎水性相互作用、アニオン交換高速液体、疎
水性相互作用高速液体、及びカチオン交換高速蛋白液体
の各クロマトグラフイ処理に付す。モノクロナール抗体
はハイブリドーマＳＭＩＡ５により得られる。
ゼ、その単離法及び抗スフインゴミエリナーゼ抗体の提
供。 【解決手段】 分子量６０ｋＤａ、Ｍｇ2+依存性、最適
ｐＨ６．０〜９．０であるウシ脳由来のスフインゴミエ
リナーゼ。該酵素は次の順序で分離精製される。ウシの
脳組織を均質化、遠心分離して細胞デブリ及び細胞核を
除去し；その上清から細胞膜を分離してペレットとし；
これを特定成分含有のバッファーで処理して該酵素を膜
から分離し；得られた抽出物をアニオン交換クロマトグ
ラフイーに付し；当該画分を特定成分含有のバッファー
中で超音波処理し、さらに遠心分離して該酵素を含む上
清を得て；疎水性相互作用、アニオン交換高速液体、疎
水性相互作用高速液体、及びカチオン交換高速蛋白液体
の各クロマトグラフイ処理に付す。モノクロナール抗体
はハイブリドーマＳＭＩＡ５により得られる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、最適ｐＨが中性で
ある 細胞表面(membrane-associated)スフィンゴミエリ
ナーゼ、その単離方法及びそれに対するモノクローナル
抗体に関する。
ある 細胞表面(membrane-associated)スフィンゴミエリ
ナーゼ、その単離方法及びそれに対するモノクローナル
抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術】信号変換(signal transduction)におけ
る第二伝達物質として働くセラミドは、細胞分化、細胞
周期の一時的停止(cell cycle suspension)、細胞老
化、細胞自滅(apoptosis)等を含む様々な細胞応答に関
連する。セラミドは、膜リン脂質であるスフィンゴミエ
リナーゼの加水分解の結果として主に生成される。
る第二伝達物質として働くセラミドは、細胞分化、細胞
周期の一時的停止(cell cycle suspension)、細胞老
化、細胞自滅(apoptosis)等を含む様々な細胞応答に関
連する。セラミドは、膜リン脂質であるスフィンゴミエ
リナーゼの加水分解の結果として主に生成される。
【０００３】スフィンゴミエリナーゼ（ＳＭａｓｅ）
は、スフィンゴミエリンをセラミドとホスホコリンとに
加水分解する働きがあり、そのアイソザイム(isozyme
s)、即ち、中性ｐＨに最適なリポソームＳＭａｓｅ（Ａ
-ＳＭａｓｅ）；酸性ｐＨに最適な亜鉛依存性細胞質Ｓ
Ｍａｓｅ；アルカリ性ｐＨに最適なＳＭａｓｅ；中性ｐ
Ｈに最適なＭｇ2+依存性細胞質ＳＭａｓｅ（Ｎ−ｃＳＭ
ａｓｅ）；及び中性ｐＨに最適なＭｇ2+依存性細胞表面
ＳＭａｓｅ（Ｎ−ｍＳＭａｓｅ）が知られている。Ａ−
ＳＭａｓｅ及び中性型ＳＭａｓｅ類は、１α,２５-ジヒ
ドロキシビタミンＤ 3、腫瘍壊死因子(tumor necrosis f
actor)-α、インターロイキン-１β、神経成長因子類、
化学療法薬剤類、血漿欠乏等の細胞外刺激に応じて濃度
が増加することが知られている。
は、スフィンゴミエリンをセラミドとホスホコリンとに
加水分解する働きがあり、そのアイソザイム(isozyme
s)、即ち、中性ｐＨに最適なリポソームＳＭａｓｅ（Ａ
-ＳＭａｓｅ）；酸性ｐＨに最適な亜鉛依存性細胞質Ｓ
Ｍａｓｅ；アルカリ性ｐＨに最適なＳＭａｓｅ；中性ｐ
Ｈに最適なＭｇ2+依存性細胞質ＳＭａｓｅ（Ｎ−ｃＳＭ
ａｓｅ）；及び中性ｐＨに最適なＭｇ2+依存性細胞表面
ＳＭａｓｅ（Ｎ−ｍＳＭａｓｅ）が知られている。Ａ−
ＳＭａｓｅ及び中性型ＳＭａｓｅ類は、１α,２５-ジヒ
ドロキシビタミンＤ 3、腫瘍壊死因子(tumor necrosis f
actor)-α、インターロイキン-１β、神経成長因子類、
化学療法薬剤類、血漿欠乏等の細胞外刺激に応じて濃度
が増加することが知られている。
【０００４】近年、酸性ｐＨに最適なヒトの尿由来のＳ
Ｍａｓｅが単離され、この酵素をコードするｃＤＮＡの
クローニングに成功した(キンターン(Quintern), L.E.
ら、EMBO J., 8, 2469-2473(1989))。本発明者らもま
た、活性がＭｇ2+に依存し、かつグルタチオン及びＤＴ
Ｔ感受性である７５ｋＤａの細胞質Ｎ-ｃＳＭａｓｅを
単離し、特性を調べその内容を特許出願した（韓国特許
出願第９８-２８１８７号）。
Ｍａｓｅが単離され、この酵素をコードするｃＤＮＡの
クローニングに成功した(キンターン(Quintern), L.E.
ら、EMBO J., 8, 2469-2473(1989))。本発明者らもま
た、活性がＭｇ2+に依存し、かつグルタチオン及びＤＴ
Ｔ感受性である７５ｋＤａの細胞質Ｎ-ｃＳＭａｓｅを
単離し、特性を調べその内容を特許出願した（韓国特許
出願第９８-２８１８７号）。
【０００５】一方、殆どのＮ-ｍＳＭａｓｅ類は、疎水
性が高いため単離することが非常に困難であるので、そ
の特性は未だ完全には解明されていない。そのような困
難にもかかわらず、分子量が４７．５ｋＤａのＮ-ｍＳ
Ｍａｓｅが哺乳類細胞からクローニングされた（トミウ
ク(Tomiuk),Ｓら、Proc.Natl.Acad.Sci.米国、95、3638
-3643A(1998)）。しかし、このＮ-ｍＳＭａｓｅは、ト
リトンＸ-１００を用いて分離され得る細胞表面蛋白質
であるが、ＴＮＦ-α信号変換経路には無関係であると
記載されている。トリトンＸ-１００を用いて、ラット
の脳から部分的に精製された状態で別のＮ-ｍＳＭａｓ
ｅを単離することに成功した（リウ(Liu),B.ら、J.Bio
l.Chem.、273、34472-34479(1988)）。部分的に精製さ
れたＮ-ｍＳＭａｓｅの活性が、グルタチオン（酵素活
性が５０％阻害される濃度（ＩＣ50）；２．５ｍＭ）に
よって阻害され、ＤＴＴ及びホスファチジルセリンによ
って促進されることが報告されている。本発明者らは、
２種類の新規Ｎ-ｍＳＭａｓｅをウシの脳から完全に単
離することに成功した。この新規Ｎ-ｍＳＭａｓｅは、
一つは４種のアイソザイム（Ｔ-ｍＳＭａｓｅＡ、Ｂ、
Ｃ及びＤ）からなる分子量３５ｋＤａのものであり、他
方は２種のアイソザイム（Ｓ-ｍＳＭａｓｅＩ及びＩ
Ｉ）からなる分子量４０ｋＤａのものであり、前者をト
リトンＸ-１００を用いて単離し、後者を硫酸アンモニ
ウムを用いて単離して両者の特性の解明を行った。その
内容は特許出願中である（韓国特許出願第９８-２８１
８７）。
性が高いため単離することが非常に困難であるので、そ
の特性は未だ完全には解明されていない。そのような困
難にもかかわらず、分子量が４７．５ｋＤａのＮ-ｍＳ
Ｍａｓｅが哺乳類細胞からクローニングされた（トミウ
ク(Tomiuk),Ｓら、Proc.Natl.Acad.Sci.米国、95、3638
-3643A(1998)）。しかし、このＮ-ｍＳＭａｓｅは、ト
リトンＸ-１００を用いて分離され得る細胞表面蛋白質
であるが、ＴＮＦ-α信号変換経路には無関係であると
記載されている。トリトンＸ-１００を用いて、ラット
の脳から部分的に精製された状態で別のＮ-ｍＳＭａｓ
ｅを単離することに成功した（リウ(Liu),B.ら、J.Bio
l.Chem.、273、34472-34479(1988)）。部分的に精製さ
れたＮ-ｍＳＭａｓｅの活性が、グルタチオン（酵素活
性が５０％阻害される濃度（ＩＣ50）；２．５ｍＭ）に
よって阻害され、ＤＴＴ及びホスファチジルセリンによ
って促進されることが報告されている。本発明者らは、
２種類の新規Ｎ-ｍＳＭａｓｅをウシの脳から完全に単
離することに成功した。この新規Ｎ-ｍＳＭａｓｅは、
一つは４種のアイソザイム（Ｔ-ｍＳＭａｓｅＡ、Ｂ、
Ｃ及びＤ）からなる分子量３５ｋＤａのものであり、他
方は２種のアイソザイム（Ｓ-ｍＳＭａｓｅＩ及びＩ
Ｉ）からなる分子量４０ｋＤａのものであり、前者をト
リトンＸ-１００を用いて単離し、後者を硫酸アンモニ
ウムを用いて単離して両者の特性の解明を行った。その
内容は特許出願中である（韓国特許出願第９８-２８１
８７）。
【０００６】特に、脳細胞に存在するＮ-ｍＳＭａｓｅ
類は、脳疾患の主な病因であると考えられている。なぜ
なら、脳細胞においてセラミドにより伝達される信号変
換経路は、神経細胞の死滅を招き、その結果、パーキン
ソン病又はアルツハイマー症、低親和性ニューロトロフ
ィン(low affinitive neurotrophin)受容体（ｐ７５Ｎ
ＴＲ）の媒介に関与する乏突起神経膠細胞類(oligodend
rocytes)、ＰＣ１２細胞類及びＴ９細胞類の自滅、ＴＮ
Ｆ-αにより生じる乏突起神経膠細胞の自滅、及び虚血
性脳損傷などのいくつかの中枢神経系疾患の病理が引き
起こされるからである。
類は、脳疾患の主な病因であると考えられている。なぜ
なら、脳細胞においてセラミドにより伝達される信号変
換経路は、神経細胞の死滅を招き、その結果、パーキン
ソン病又はアルツハイマー症、低親和性ニューロトロフ
ィン(low affinitive neurotrophin)受容体（ｐ７５Ｎ
ＴＲ）の媒介に関与する乏突起神経膠細胞類(oligodend
rocytes)、ＰＣ１２細胞類及びＴ９細胞類の自滅、ＴＮ
Ｆ-αにより生じる乏突起神経膠細胞の自滅、及び虚血
性脳損傷などのいくつかの中枢神経系疾患の病理が引き
起こされるからである。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するため
の手段】そこで、本発明の目的は、パーキンソン病、ア
ルツハイマー症等の脳疾患のための治療薬の開発に役立
つ、ウシの脳から単離される中性ｐＨに最適な細胞表面
スフィンゴミエリナーゼを提供することである。本発明
のもう一つの目的は、そのようなスフィンゴミエリナー
ゼをウシの脳から調製する方法を提供することである。
本発明の更なる目的は、前記スフィンゴミエリナーゼに
特異的なモノクローナル抗体を提供することである。
の手段】そこで、本発明の目的は、パーキンソン病、ア
ルツハイマー症等の脳疾患のための治療薬の開発に役立
つ、ウシの脳から単離される中性ｐＨに最適な細胞表面
スフィンゴミエリナーゼを提供することである。本発明
のもう一つの目的は、そのようなスフィンゴミエリナー
ゼをウシの脳から調製する方法を提供することである。
本発明の更なる目的は、前記スフィンゴミエリナーゼに
特異的なモノクローナル抗体を提供することである。
【０００８】本発明の第一の態様によれば、分子量が６
０ｋＤａであり、活性がＭｇ2+に依存し、最適ｐＨが
６．０〜９．０の範囲であるウシの脳のニューロン膜由
来のスフィンゴミエリナーゼが提供される。
０ｋＤａであり、活性がＭｇ2+に依存し、最適ｐＨが
６．０〜９．０の範囲であるウシの脳のニューロン膜由
来のスフィンゴミエリナーゼが提供される。
【０００９】本発明の第二の態様によれば、以下の段階
を含む本発明によるスフィンゴミエリナーゼの単離方法
が提供される。即ち、ウシの脳細胞を均一化し(homogen
izing)、得られたホモジェネート(homogenate)を遠心分
離して細胞デブリ(debri)及び細胞核を除去し、遠心分
離により上清から細胞膜を分離してペレットを得る。硫
酸アンモニウム含有バッファーにより細胞膜ペレットを
処理し、この膜からスフィンゴミエリナーゼを分離し、
得られた抽出物をアニオン交換クロマトグラフィー(ani
on exchange chromatography)に付し、クロマトグラフ
ィー画分をトリトンＸ-１００含有バッファー中で超音
波処理する。超音波処理した画分を遠心分離してスフィ
ンゴミエリナーゼを含む上清を得て、その上清を、疎水
性相互作用クロマトグラフィー(hydrophobic interacti
on chromatography)、アニオン交換高速液体クロマトグ
ラフィー(anion exchange high-performance liquid ch
romatography)、疎水性相互作用高速クロマトグラフィ
ー(hydrophobic interaction high performance liquid
chromatography)及びカチオン交換高速蛋白質液体クロ
マトグラフィー(cation exchange fast protein liquid
chromatography)にこの順序で付してスフィンゴミエリ
ナーゼを精製する。
を含む本発明によるスフィンゴミエリナーゼの単離方法
が提供される。即ち、ウシの脳細胞を均一化し(homogen
izing)、得られたホモジェネート(homogenate)を遠心分
離して細胞デブリ(debri)及び細胞核を除去し、遠心分
離により上清から細胞膜を分離してペレットを得る。硫
酸アンモニウム含有バッファーにより細胞膜ペレットを
処理し、この膜からスフィンゴミエリナーゼを分離し、
得られた抽出物をアニオン交換クロマトグラフィー(ani
on exchange chromatography)に付し、クロマトグラフ
ィー画分をトリトンＸ-１００含有バッファー中で超音
波処理する。超音波処理した画分を遠心分離してスフィ
ンゴミエリナーゼを含む上清を得て、その上清を、疎水
性相互作用クロマトグラフィー(hydrophobic interacti
on chromatography)、アニオン交換高速液体クロマトグ
ラフィー(anion exchange high-performance liquid ch
romatography)、疎水性相互作用高速クロマトグラフィ
ー(hydrophobic interaction high performance liquid
chromatography)及びカチオン交換高速蛋白質液体クロ
マトグラフィー(cation exchange fast protein liquid
chromatography)にこの順序で付してスフィンゴミエリ
ナーゼを精製する。
【００１０】本発明の第三の態様によれば、ハイブリド
ーマ(Hybridoma)ＳＭ１Ａ５（寄託番号ＫＣＬＲＦ-ＢＴ
-０００２５号）により生成されるスフィンゴミエリナ
ーゼに対するモノクローナル抗体が提供される。
ーマ(Hybridoma)ＳＭ１Ａ５（寄託番号ＫＣＬＲＦ-ＢＴ
-０００２５号）により生成されるスフィンゴミエリナ
ーゼに対するモノクローナル抗体が提供される。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明は、スフィンゴミエリンを
セラミドとホスホコリンとに加水分解する酵素活性を有
するウシの脳の神経細胞膜から単離される細胞表面(mem
brane-bound)蛋白質に関する。
セラミドとホスホコリンとに加水分解する酵素活性を有
するウシの脳の神経細胞膜から単離される細胞表面(mem
brane-bound)蛋白質に関する。
【００１２】本発明のスフィンゴミエリナーゼは、スフ
ィンゴミエリンに対して他のリン脂質を基質として使用
した場合の活性よりも５０倍高い酵素活性を示し、Ｋm
が４７μｍでＶmaxが１，５８７ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍ
ｇである。
ィンゴミエリンに対して他のリン脂質を基質として使用
した場合の活性よりも５０倍高い酵素活性を示し、Ｋm
が４７μｍでＶmaxが１，５８７ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍ
ｇである。
【００１３】このスフィンゴミエリナーゼは、Ｍｇ2+に
依存することに加え、６．０〜９．０のｐＨ範囲で活性
を示し、最適活性はｐＨ７．５の場合に示される。ま
た、本発明のスフィンゴミエリナーゼの活性は、陽イオ
ンの影響を受ける。酵素活性は、Ｃｕ2+、Ｚｎ2+及びＦ
ｅ2+の全てによって阻害されるが（ＩＣ50値はそれぞれ
２８μＭ、３２μＭ及び４７μＭ）、Ｆｅ3+の存在下で
は１．８倍に増加する。興味深いことに、スフィンゴミ
エリナーゼの活性は、Ｆｅ2+により減少するが、Ｆｅ3+
により向上する。
依存することに加え、６．０〜９．０のｐＨ範囲で活性
を示し、最適活性はｐＨ７．５の場合に示される。ま
た、本発明のスフィンゴミエリナーゼの活性は、陽イオ
ンの影響を受ける。酵素活性は、Ｃｕ2+、Ｚｎ2+及びＦ
ｅ2+の全てによって阻害されるが（ＩＣ50値はそれぞれ
２８μＭ、３２μＭ及び４７μＭ）、Ｆｅ3+の存在下で
は１．８倍に増加する。興味深いことに、スフィンゴミ
エリナーゼの活性は、Ｆｅ2+により減少するが、Ｆｅ3+
により向上する。
【００１４】本発明のスフィンゴミエリナーゼの活性に
影響し得る別の種類の化合物としては、グルタチオン、
酸化グルタチオン、システイン、システイン-グリシ
ン、及びγ-グルタル酸-システインが挙げられる。本発
明のスフィンゴミエリナーゼは、グルタチオンの濃度に
対して２つの異なる挙動を示す。グルタチオンの濃度が
３ｍＭまで増加する場合にはスフィンゴミエリナーゼの
活性は増加する。一方、グルタチオン濃度が３ｍＭを超
えて増加するとスフィンゴミエリナーゼの活性は減少
し、１０ｍＭ（ＩＣ50；８．０ｍＭ）のグルタチオン濃
度において完全に阻害される。ＧＳＳＧ、システイン、
システイン-グリシン、及びγ-グルタル酸-システイン
のそれぞれの濃度の増加は、スフィンゴミエリナーゼの
活性の低下をもたらす。特に、本発明のスフィンゴミエ
リナーゼのグルタチオン枯渇に対する感度は、リウ(Li
u)の部分精製Ｎ-ｍＳＭａｓｅのものよりもはるかに高
い（リウ(Liu),Ｂ．ら、J.Biol.Chem.、273、34472-344
79(1998)）。一方、ジチオスレイトール及び２-メルカ
プトエタノールのいずれも、スフィンゴミエリナーゼの
活性に影響を与えない。
影響し得る別の種類の化合物としては、グルタチオン、
酸化グルタチオン、システイン、システイン-グリシ
ン、及びγ-グルタル酸-システインが挙げられる。本発
明のスフィンゴミエリナーゼは、グルタチオンの濃度に
対して２つの異なる挙動を示す。グルタチオンの濃度が
３ｍＭまで増加する場合にはスフィンゴミエリナーゼの
活性は増加する。一方、グルタチオン濃度が３ｍＭを超
えて増加するとスフィンゴミエリナーゼの活性は減少
し、１０ｍＭ（ＩＣ50；８．０ｍＭ）のグルタチオン濃
度において完全に阻害される。ＧＳＳＧ、システイン、
システイン-グリシン、及びγ-グルタル酸-システイン
のそれぞれの濃度の増加は、スフィンゴミエリナーゼの
活性の低下をもたらす。特に、本発明のスフィンゴミエ
リナーゼのグルタチオン枯渇に対する感度は、リウ(Li
u)の部分精製Ｎ-ｍＳＭａｓｅのものよりもはるかに高
い（リウ(Liu),Ｂ．ら、J.Biol.Chem.、273、34472-344
79(1998)）。一方、ジチオスレイトール及び２-メルカ
プトエタノールのいずれも、スフィンゴミエリナーゼの
活性に影響を与えない。
【００１５】本発明のスフィンゴミエリナーゼの活性
は、デオキシコール酸ナトリウム(sodium deoxycholat
e)やトリトンＸ-１００のような活性剤からも影響を受
け得る。本発明のスフィンゴミエリナーゼは、デオキシ
コール酸ナトリウムの濃度が１ｍＭの場合に、デオキシ
コール酸ナトリウムが存在しない場合よりも３０倍高い
最適活性を示す。本発明のスフィンゴミエリナーゼは、
トリトンＸ-１００の濃度が０．００５％の場合に、ト
リトンＸ-１００が存在しない場合よりも１．５倍高い
最適活性を示す。
は、デオキシコール酸ナトリウム(sodium deoxycholat
e)やトリトンＸ-１００のような活性剤からも影響を受
け得る。本発明のスフィンゴミエリナーゼは、デオキシ
コール酸ナトリウムの濃度が１ｍＭの場合に、デオキシ
コール酸ナトリウムが存在しない場合よりも３０倍高い
最適活性を示す。本発明のスフィンゴミエリナーゼは、
トリトンＸ-１００の濃度が０．００５％の場合に、ト
リトンＸ-１００が存在しない場合よりも１．５倍高い
最適活性を示す。
【００１６】本発明のスフィンゴミエリナーゼは、神経
膠(neuroglial)細胞中ではなく、ウシの脳皮質中のニュ
ーロン膜中で確認される。スフィンゴミエリナーゼは、
疎水性が非常に高く、且つ塩化ナトリウム又は硫酸アン
モニウムによって膜から可溶化され得るという事実から
推論した結果、イオン結合を介して膜に結合する周辺蛋
白質(peripheral protein)の一種であると考えられてい
る。
膠(neuroglial)細胞中ではなく、ウシの脳皮質中のニュ
ーロン膜中で確認される。スフィンゴミエリナーゼは、
疎水性が非常に高く、且つ塩化ナトリウム又は硫酸アン
モニウムによって膜から可溶化され得るという事実から
推論した結果、イオン結合を介して膜に結合する周辺蛋
白質(peripheral protein)の一種であると考えられてい
る。
【００１７】本発明のスフィンゴミエリナーゼは、これ
らの特徴を利用することによって以下のように精製され
得る。まず初めに、ウシの脳組織を通常の手法により均
質化し、次いでホモジェネートを遠心分離して細胞デブ
リ及び細胞核を除去する。上清を再度遠心分離して細胞
膜ペレットを得る。この細胞ペレット上で、硫酸アンモ
ニウムを含むバッファーを用いて通常の蛋白質分離法を
行う。ここでは、トリトンＸ-１００によって単離され
るスフィンゴミエリナーゼは、硫酸アンモニウムによっ
ては単離されない。こうして得られた硫酸アンモニウム
抽出物は、次の段階においてスフィンゴミエリナーゼ源
として使用される。
らの特徴を利用することによって以下のように精製され
得る。まず初めに、ウシの脳組織を通常の手法により均
質化し、次いでホモジェネートを遠心分離して細胞デブ
リ及び細胞核を除去する。上清を再度遠心分離して細胞
膜ペレットを得る。この細胞ペレット上で、硫酸アンモ
ニウムを含むバッファーを用いて通常の蛋白質分離法を
行う。ここでは、トリトンＸ-１００によって単離され
るスフィンゴミエリナーゼは、硫酸アンモニウムによっ
ては単離されない。こうして得られた硫酸アンモニウム
抽出物は、次の段階においてスフィンゴミエリナーゼ源
として使用される。
【００１８】次いで、硫酸アンモニウム抽出物をアニオ
ン交換クロマトグラフィーで処理する。アニオン交換ク
ロマトグラフィーにおいて有用なカラムとしては、ＤＥ
ＡＥ-セルロース（ワットマン・バイオシステム社(What
man Biosystem Ltd.)、英国）、ＱＡＥ-セルロース（ワ
ットマン・バイオシステム社(Whatman Biosystem Lt
d.)、英国）、ＤＥＡＥ-セファロース(cephalose)（フ
ァルマシア・バイオテクノロジー社(Pharmacia Biotech
nology Inc.)、スウェーデン）、ＤＥＡＥ-トヨパール
(Toyopearl)（東ソー株式会社、日本）、及びＱＡＥ-ト
ヨパール（東ソー株式会社、日本）が挙げられ、ＤＥＡ
Ｅ-セルロースが好ましい。クロマトグラフィーにおい
て使用するために、ＤＥＡＥ-セルロースカラムをバッ
ファーＤ（ｐＨ７．５の２５ｍＭ トリス-ＨＣｌ、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ及び１０ｍＭ ２-メルカプトエタノール）
によってあらかじめ平衡化する。硫酸アンモニウム抽出
物を、平衡化されたＤＥＡＥ-セルロースカラムに注入
後、０．５Ｍの硫酸アンモニウム及び０．１％のトリト
ンＸ-１００を含むバッファーＤによって溶出を行う。
活性画分は単一ピークとして検出される。
ン交換クロマトグラフィーで処理する。アニオン交換ク
ロマトグラフィーにおいて有用なカラムとしては、ＤＥ
ＡＥ-セルロース（ワットマン・バイオシステム社(What
man Biosystem Ltd.)、英国）、ＱＡＥ-セルロース（ワ
ットマン・バイオシステム社(Whatman Biosystem Lt
d.)、英国）、ＤＥＡＥ-セファロース(cephalose)（フ
ァルマシア・バイオテクノロジー社(Pharmacia Biotech
nology Inc.)、スウェーデン）、ＤＥＡＥ-トヨパール
(Toyopearl)（東ソー株式会社、日本）、及びＱＡＥ-ト
ヨパール（東ソー株式会社、日本）が挙げられ、ＤＥＡ
Ｅ-セルロースが好ましい。クロマトグラフィーにおい
て使用するために、ＤＥＡＥ-セルロースカラムをバッ
ファーＤ（ｐＨ７．５の２５ｍＭ トリス-ＨＣｌ、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ及び１０ｍＭ ２-メルカプトエタノール）
によってあらかじめ平衡化する。硫酸アンモニウム抽出
物を、平衡化されたＤＥＡＥ-セルロースカラムに注入
後、０．５Ｍの硫酸アンモニウム及び０．１％のトリト
ンＸ-１００を含むバッファーＤによって溶出を行う。
活性画分は単一ピークとして検出される。
【００１９】スフィンゴミエリナーゼを可溶化するため
に０．１％のトリトンＸ-１００を含有するバッファー
中で超音波処理した後、活性画分から不溶性脂質成分を
遠心分離によって除去する。この段階は、スフィンゴミ
エリナーゼを効率的に回収するために非常に重要であ
る。この段階を経ない場合、高い疎水性を有する細胞表
面スフィンゴミエリナーゼが他の脂質成分と凝集してし
まい、その凝集物からスフィンゴミエリナーゼを回収す
ることは極めて困難である。不溶性脂質成分を含まない
上清は、硫酸アンモニウム溶液を添加した後疎水性相互
作用クロマトグラフィーで処理される。このクロマトグ
ラフィーにおいて有用なカラムとしては、ブチル-トヨ
パール６５０Ｍ（東ソー株式会社、日本）、フェニル-
トヨパール６５０Ｍ（東ソー株式会社、日本）、ブチル
-セファロース（ファルマシア・バイオテクノロジー
社）が挙げられる。中でも、ブチル-トヨパール６５０
Ｍカラムが好ましい。ブチル-トヨパール６５０Ｍカラ
ムは、疎水性相互作用クロマトグラフィーにおいて使用
するために０．５Ｍの硫酸アンモニウムを含むバッファ
ーＤによってあらかじめ平衡化される。硫酸アンモニウ
ムを含む上清を、平衡化されたカラムに注入した後、
０．２Ｍの硫酸アンモニウムを含むバッファーＤによ
り、その後水により、スフィンゴミエリナーゼを溶出す
ることができる。活性画分は単一ピークとして検出され
る。
に０．１％のトリトンＸ-１００を含有するバッファー
中で超音波処理した後、活性画分から不溶性脂質成分を
遠心分離によって除去する。この段階は、スフィンゴミ
エリナーゼを効率的に回収するために非常に重要であ
る。この段階を経ない場合、高い疎水性を有する細胞表
面スフィンゴミエリナーゼが他の脂質成分と凝集してし
まい、その凝集物からスフィンゴミエリナーゼを回収す
ることは極めて困難である。不溶性脂質成分を含まない
上清は、硫酸アンモニウム溶液を添加した後疎水性相互
作用クロマトグラフィーで処理される。このクロマトグ
ラフィーにおいて有用なカラムとしては、ブチル-トヨ
パール６５０Ｍ（東ソー株式会社、日本）、フェニル-
トヨパール６５０Ｍ（東ソー株式会社、日本）、ブチル
-セファロース（ファルマシア・バイオテクノロジー
社）が挙げられる。中でも、ブチル-トヨパール６５０
Ｍカラムが好ましい。ブチル-トヨパール６５０Ｍカラ
ムは、疎水性相互作用クロマトグラフィーにおいて使用
するために０．５Ｍの硫酸アンモニウムを含むバッファ
ーＤによってあらかじめ平衡化される。硫酸アンモニウ
ムを含む上清を、平衡化されたカラムに注入した後、
０．２Ｍの硫酸アンモニウムを含むバッファーＤによ
り、その後水により、スフィンゴミエリナーゼを溶出す
ることができる。活性画分は単一ピークとして検出され
る。
【００２０】その後、アニオン交換高速液体クロマトグ
ラフィー（ＨＰＬＣ）によって活性画分を更に精製す
る。アニオン交換ＨＰＬＣには、ＤＥＡＥ-５ＰＷ（東
ソー株式会社、日本）、モノ(Mono)Ｑ（ファルマシア・
バイオテクノロジー社、スウェーデン）、モノＰ（ファ
ルマシア・バイオテクノロジー社、スウェーデン）、リ
ソース(Resource)Ｑ（ファルマシア・バイオテクノロジ
ー社、スウェーデン）、のような市販のカラムを使用す
ることができ、中でもＤＥＡＥ-５ＰＷが好ましい。Ｄ
ＥＡＥ-５ＰＷ ＨＰＬＣを、クロマトグラフィーに使用
する前にバッファーＤによって平衡化する。平衡化した
カラムに活性画分を注入し、次いで０．５Ｍの硫酸アン
モニウム及び０．１％のトリトンＸ-１００を含むバッ
ファーＤを用いて線形勾配(linear gradient)をかけて
溶出する。活性画分は単一ピークとして検出される。
ラフィー（ＨＰＬＣ）によって活性画分を更に精製す
る。アニオン交換ＨＰＬＣには、ＤＥＡＥ-５ＰＷ（東
ソー株式会社、日本）、モノ(Mono)Ｑ（ファルマシア・
バイオテクノロジー社、スウェーデン）、モノＰ（ファ
ルマシア・バイオテクノロジー社、スウェーデン）、リ
ソース(Resource)Ｑ（ファルマシア・バイオテクノロジ
ー社、スウェーデン）、のような市販のカラムを使用す
ることができ、中でもＤＥＡＥ-５ＰＷが好ましい。Ｄ
ＥＡＥ-５ＰＷ ＨＰＬＣを、クロマトグラフィーに使用
する前にバッファーＤによって平衡化する。平衡化した
カラムに活性画分を注入し、次いで０．５Ｍの硫酸アン
モニウム及び０．１％のトリトンＸ-１００を含むバッ
ファーＤを用いて線形勾配(linear gradient)をかけて
溶出する。活性画分は単一ピークとして検出される。
【００２１】次いで、得られた活性画分を疎水性相互作
用ＨＰＬＣで処理する。この疎水性相互作用ＨＰＬＣに
おける使用に適したカラムとしては、フェニル-５ＰＷ
ガラス、エーテル-５ＰＷガラス、エーテル-５ＰＷ、ブ
チル-ＮＰＲ（東ソー株式会社、日本）、ＳＯＵＲＣＥ
１５ＥＴＨ、ＳＯＵＲＣＥ １５ＩＳＯ、ＳＯＵＲＣＥ
１５ＰＨＥ、フェニルセファロース高速、ブチルセファ
ロース４高速(fast flow)、オクチルセファロース４高
速、及びフェニルセファロース６高速（ファルマシア・
バイオテクノロジー社）が挙げられ、中でもフェニル-
５ＰＷカラムが好ましい。フェニル-５ＰＷカラムは、
活性画分を注入する前に０．２Ｍの硫酸アンモニウムを
含むバッファーＤによって平衡化される。蒸留水を用い
て線形勾配をかけて溶出を行う。目的の活性画分は、そ
れぞれピークε及びζと名付けた２つのピークとして検
出される。
用ＨＰＬＣで処理する。この疎水性相互作用ＨＰＬＣに
おける使用に適したカラムとしては、フェニル-５ＰＷ
ガラス、エーテル-５ＰＷガラス、エーテル-５ＰＷ、ブ
チル-ＮＰＲ（東ソー株式会社、日本）、ＳＯＵＲＣＥ
１５ＥＴＨ、ＳＯＵＲＣＥ １５ＩＳＯ、ＳＯＵＲＣＥ
１５ＰＨＥ、フェニルセファロース高速、ブチルセファ
ロース４高速(fast flow)、オクチルセファロース４高
速、及びフェニルセファロース６高速（ファルマシア・
バイオテクノロジー社）が挙げられ、中でもフェニル-
５ＰＷカラムが好ましい。フェニル-５ＰＷカラムは、
活性画分を注入する前に０．２Ｍの硫酸アンモニウムを
含むバッファーＤによって平衡化される。蒸留水を用い
て線形勾配をかけて溶出を行う。目的の活性画分は、そ
れぞれピークε及びζと名付けた２つのピークとして検
出される。
【００２２】最後に、こうして得られた活性画分をカチ
オン交換高速蛋白質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬ
Ｃ）で処理する。このＦＰＬＣにおける使用に適したカ
ラムとしては、モノ(Mono)Ｓ ＦＰＬＣ（ファルマシア
・バイオテクノロジー社、スウェーデン）、リソースＳ
（ファルマシア・バイオテクノロジー社、スウェーデ
ン）及びＳＰ-５ＰＷ（東ソー株式会社、日本）が挙げ
られ、モノＳ ＦＰＬＣカラムが好ましい。モノＳカチ
オン交換ＦＰＬＣカラムは、活性にするためにバッファ
ーＳ（ｐＨ６．５の２５ｍＭ 酢酸ナトリウム及び１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ）によってあらかじめ平衡化される。活性
画分とバッファーＳとの混合物を平衡化されたＦＰＬＣ
カラムに注入し、次いで塩化ナトリウム並びに１．０Ｍ
の塩化ナトリウム及び０．１％のトリトンＸ-１００を
含むバッファーＳをこの順に用いて線形勾配をかけて溶
出を行う。目的の活性画分は、それぞれピークＡ及びＢ
と名付けた２つのピークとして検出される。
オン交換高速蛋白質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬ
Ｃ）で処理する。このＦＰＬＣにおける使用に適したカ
ラムとしては、モノ(Mono)Ｓ ＦＰＬＣ（ファルマシア
・バイオテクノロジー社、スウェーデン）、リソースＳ
（ファルマシア・バイオテクノロジー社、スウェーデ
ン）及びＳＰ-５ＰＷ（東ソー株式会社、日本）が挙げ
られ、モノＳ ＦＰＬＣカラムが好ましい。モノＳカチ
オン交換ＦＰＬＣカラムは、活性にするためにバッファ
ーＳ（ｐＨ６．５の２５ｍＭ 酢酸ナトリウム及び１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ）によってあらかじめ平衡化される。活性
画分とバッファーＳとの混合物を平衡化されたＦＰＬＣ
カラムに注入し、次いで塩化ナトリウム並びに１．０Ｍ
の塩化ナトリウム及び０．１％のトリトンＸ-１００を
含むバッファーＳをこの順に用いて線形勾配をかけて溶
出を行う。目的の活性画分は、それぞれピークＡ及びＢ
と名付けた２つのピークとして検出される。
【００２３】ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、イムノプレシピテーシ
ョン(immunoprecipitation)、及びウエスタンブロット
分析によって得られたデータを総合すると、ピークＡ及
びＢとして検出される各活性画分が、６０ｋＤａの分子
量の本発明のスフィンゴミエリナーゼを含むことが示さ
れる。また、ピークＢの活性画分は、ピークＡよりも総
活性が１．４倍高く、比活性が４倍高いことも判明し
た。本発明によりこうして得られたスフィンゴミエリナ
ーゼを、Ｎ-ｍＳＭａｓｅ εと名付ける。
ョン(immunoprecipitation)、及びウエスタンブロット
分析によって得られたデータを総合すると、ピークＡ及
びＢとして検出される各活性画分が、６０ｋＤａの分子
量の本発明のスフィンゴミエリナーゼを含むことが示さ
れる。また、ピークＢの活性画分は、ピークＡよりも総
活性が１．４倍高く、比活性が４倍高いことも判明し
た。本発明によりこうして得られたスフィンゴミエリナ
ーゼを、Ｎ-ｍＳＭａｓｅ εと名付ける。
【００２４】また、本発明は、スフィンゴミエリナーゼ
に対するモノクローナル抗体に関する。モノクローナル
抗スフィンゴミエリナーゼ抗体を得るために、ＳＭ１Ａ
５と名付けたハイブリドーマ細胞が既知の技術に従って
調製された。モノクローナル抗体を生成することができ
るハイブリドーマＳＭ１Ａ５は、１９９９年９月１５日
に、韓国細胞系研究機関（Korean Cell Line RESEARCH
Foundation;KCLRF）に寄託番号ＫＣＬＲＦ-ＢＴ-０００
２５号として寄託された。
に対するモノクローナル抗体に関する。モノクローナル
抗スフィンゴミエリナーゼ抗体を得るために、ＳＭ１Ａ
５と名付けたハイブリドーマ細胞が既知の技術に従って
調製された。モノクローナル抗体を生成することができ
るハイブリドーマＳＭ１Ａ５は、１９９９年９月１５日
に、韓国細胞系研究機関（Korean Cell Line RESEARCH
Foundation;KCLRF）に寄託番号ＫＣＬＲＦ-ＢＴ-０００
２５号として寄託された。
【００２５】本発明は、以下に示す明確に説明された実
施例により、更に理解され得るが、これにより本発明が
限定されるものではない。
施例により、更に理解され得るが、これにより本発明が
限定されるものではない。
【００２６】
【実施例】実験例１ Ｎ-ｍＳＭａｓｅ活性分析 [Ｎ-メチル-14Ｃ]スフィンゴミエリン（14Ｃでラベルさ
れたコリン残基）を窒素気流によって乾燥させた後、エ
タノール中で懸濁させた。試料１０μｌを、反応溶液１
００μｌ（１０ｍＭ ＭｇＳＯ4、５０μＭ [Ｎ-メチル-
14Ｃ]スフィンゴミエリン（約６０，０００ｃｐｍ）、
２ｍＭ デオキシコール酸ナトリウム、１００ｍＭ トリ
ス-ＨＣｌ（ｐＨ７．０））と混合し、３７℃において
３０分間インキュベートした。クロロホルム／メタノー
ル混合溶媒（体積比１：１）３２０μｌ及び２Ｎ塩酸３
０μｌを加えて反応を終了させた。得られた混合物をボ
ルテックスミキサーで攪拌し、１０，０００×ｇで遠心
分離した後、水相２００μｌを米国のパッカード・イン
スツルメント社(Packard Instrument Co.)製“インスタ
ゲル(Insta gel)-ＸＦ”のようなシンチレーションカク
テル(scintillationcocktail) ２．５ｍｌと混合し、次
いでパッカード・トリカーブ液体βシンチレーション計
測器(Packard Tricarb liquid β-scintillation count
er)を用いて放射能を測定した。
れたコリン残基）を窒素気流によって乾燥させた後、エ
タノール中で懸濁させた。試料１０μｌを、反応溶液１
００μｌ（１０ｍＭ ＭｇＳＯ4、５０μＭ [Ｎ-メチル-
14Ｃ]スフィンゴミエリン（約６０，０００ｃｐｍ）、
２ｍＭ デオキシコール酸ナトリウム、１００ｍＭ トリ
ス-ＨＣｌ（ｐＨ７．０））と混合し、３７℃において
３０分間インキュベートした。クロロホルム／メタノー
ル混合溶媒（体積比１：１）３２０μｌ及び２Ｎ塩酸３
０μｌを加えて反応を終了させた。得られた混合物をボ
ルテックスミキサーで攪拌し、１０，０００×ｇで遠心
分離した後、水相２００μｌを米国のパッカード・イン
スツルメント社(Packard Instrument Co.)製“インスタ
ゲル(Insta gel)-ＸＦ”のようなシンチレーションカク
テル(scintillationcocktail) ２．５ｍｌと混合し、次
いでパッカード・トリカーブ液体βシンチレーション計
測器(Packard Tricarb liquid β-scintillation count
er)を用いて放射能を測定した。
【００２７】実験例２ 蛋白質の定量分析 ２８０ｎｍにおける吸光度をＵＶ検出器（ファルマシア
・バイオテクノロジー社、スウェーデン）で測定するこ
とにより、蛋白質を定量した。ここでは、ブラッドフォ
ード(Bradford)試薬を用いて試料中に含まれる蛋白質を
着色した後、測定された吸光度をウシ血清アルブミン濃
度勾配に基づき作成した検量線と比較することによって
その蛋白質濃度を決定した。
・バイオテクノロジー社、スウェーデン）で測定するこ
とにより、蛋白質を定量した。ここでは、ブラッドフォ
ード(Bradford)試薬を用いて試料中に含まれる蛋白質を
着色した後、測定された吸光度をウシ血清アルブミン濃
度勾配に基づき作成した検量線と比較することによって
その蛋白質濃度を決定した。
【００２８】実施例１ Ｎ-ｍＳＭａｓｅ εの精製段階１：酵素源の調製 ５ｋｇのウシの脳を、スイスのキネマティカ(Kinematic
a)製ポリトロム・ホモジェナイザー・型番ＰＴ−ＭＲ６
０００(Polytrom Homogenizer Model PT-MR6000)のよう
なホモジェナイザー(homogenizer)を用いて、２５リッ
トルの均質化バッファー(homogenization buffer)（ｐ
Ｈ７．５の５０ｍＭ トリス-ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、３ｍＭ ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ ＫＣｌ及び１０ｍＭ
２-メルカプトエタノール）中で均質化した。ホモジェ
ネートを１０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、細胞
デブリ及び細胞核を含まない上清を、４℃において１
０，０００×ｇで再度１時間遠心分離した。ペレットを
２．５リットルの均質化バッファー中で懸濁させた後、
４℃において４０，０００×ｇで１時間遠心分離した。
こうして得られたペレットを、０．５Ｍの硫酸アンモニ
ウムを含む均質化バッファー２．５リットル中で再度懸
濁させ、懸濁液を４℃において１時間攪拌し、その後４
℃において４０，０００×ｇで１時間遠心分離する。上
清（硫酸アンモニウム抽出物）を採取し、そこからＮ-
ｍＳＭａｓｅを生成することができる酵素源として使用
した。
a)製ポリトロム・ホモジェナイザー・型番ＰＴ−ＭＲ６
０００(Polytrom Homogenizer Model PT-MR6000)のよう
なホモジェナイザー(homogenizer)を用いて、２５リッ
トルの均質化バッファー(homogenization buffer)（ｐ
Ｈ７．５の５０ｍＭ トリス-ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、３ｍＭ ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ ＫＣｌ及び１０ｍＭ
２-メルカプトエタノール）中で均質化した。ホモジェ
ネートを１０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、細胞
デブリ及び細胞核を含まない上清を、４℃において１
０，０００×ｇで再度１時間遠心分離した。ペレットを
２．５リットルの均質化バッファー中で懸濁させた後、
４℃において４０，０００×ｇで１時間遠心分離した。
こうして得られたペレットを、０．５Ｍの硫酸アンモニ
ウムを含む均質化バッファー２．５リットル中で再度懸
濁させ、懸濁液を４℃において１時間攪拌し、その後４
℃において４０，０００×ｇで１時間遠心分離する。上
清（硫酸アンモニウム抽出物）を採取し、そこからＮ-
ｍＳＭａｓｅを生成することができる酵素源として使用
した。
【００２９】段階２：ＤＥＡＥ-セルロースアニオン交
換クロマトグラフィー ２．０リットルのＤＥ５２ゲルが充填されたＤＥＡＥ-
セルロースカラム（ワットマン・バイオシステム社、英
国）をバッファーＤ（ｐＨ７．５の２５ｍＭトリス-Ｈ
Ｃｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１０ｍＭ ２-メルカプトエ
タノール）によりあらかじめ平衡化し、段階１において
調製された硫酸アンモニウム抽出物２．５リットルを平
衡化されたカラムに注入した。注入された上清を、０．
５Ｍの硫酸アンモニウム及び０．１％のトリトンＸ-１
００を含むバッファーＤを徐々に加えることにより２０
ｍｌ／ｍｉｎの流速で溶出し、その間４０ｍｌ毎に画分
を採取した。各画分を１０μｌずつ採取し、実験例１記
載の方法によってＮ-ｍＳＭａｓｅ活性を分析した。ク
ロマトグラフィーの結果を図１に示す。クロマトグラム
に示すように、Ｎ-ｍＳＭａｓｅ活性は単一ピークとし
て検出された。
換クロマトグラフィー ２．０リットルのＤＥ５２ゲルが充填されたＤＥＡＥ-
セルロースカラム（ワットマン・バイオシステム社、英
国）をバッファーＤ（ｐＨ７．５の２５ｍＭトリス-Ｈ
Ｃｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１０ｍＭ ２-メルカプトエ
タノール）によりあらかじめ平衡化し、段階１において
調製された硫酸アンモニウム抽出物２．５リットルを平
衡化されたカラムに注入した。注入された上清を、０．
５Ｍの硫酸アンモニウム及び０．１％のトリトンＸ-１
００を含むバッファーＤを徐々に加えることにより２０
ｍｌ／ｍｉｎの流速で溶出し、その間４０ｍｌ毎に画分
を採取した。各画分を１０μｌずつ採取し、実験例１記
載の方法によってＮ-ｍＳＭａｓｅ活性を分析した。ク
ロマトグラフィーの結果を図１に示す。クロマトグラム
に示すように、Ｎ-ｍＳＭａｓｅ活性は単一ピークとし
て検出された。
【００３０】段階３：ブチル-トヨパール６５０Ｍ疎水
性相互作用クロマトグラフィー 段階２において得られた活性画分を、４℃において細胞
破砕機(cell crusher)（ソニックス・アンド・マテリア
ルズ社(Sonics & Materials Inc.)、キャンベリー(Canb
ury)、米国）中で、５分間隔で６回、１回の超音波処理
当たり３秒間７０％の振幅強度で超音波処理した後、１
００，０００×ｇで１時間遠心分離した。こうして得ら
れた上清によって、４．０Ｍの硫酸アンモニウム溶液を
０．５Ｍの試料に希釈した。この試料を、ブチル-トヨ
パール６５０Ｍカラム（東ソー株式会社、日本、床容量
(bed volume)１５０ｍｌ）に注入した後、０．２Ｍの硫
酸アンモニウムを含むバッファーＤを徐々に加え、その
後蒸留水を加えた。流速１５ｍｌ／ｍｉｎで溶出を行
い、その間３０ｍｌ毎に画分を回収した。各画分を１０
μｌずつ採取し、活性画分を測定するために実験例１に
記載の方法によってＮ-ｍＳＭａｓｅ活性を分析した。
分析結果を示すクロマトグラムを図２に示す。クロマト
グラムに示すように、Ｎ-ｍＳＭａｓｅ活性は単一ピー
クとして検出された。
性相互作用クロマトグラフィー 段階２において得られた活性画分を、４℃において細胞
破砕機(cell crusher)（ソニックス・アンド・マテリア
ルズ社(Sonics & Materials Inc.)、キャンベリー(Canb
ury)、米国）中で、５分間隔で６回、１回の超音波処理
当たり３秒間７０％の振幅強度で超音波処理した後、１
００，０００×ｇで１時間遠心分離した。こうして得ら
れた上清によって、４．０Ｍの硫酸アンモニウム溶液を
０．５Ｍの試料に希釈した。この試料を、ブチル-トヨ
パール６５０Ｍカラム（東ソー株式会社、日本、床容量
(bed volume)１５０ｍｌ）に注入した後、０．２Ｍの硫
酸アンモニウムを含むバッファーＤを徐々に加え、その
後蒸留水を加えた。流速１５ｍｌ／ｍｉｎで溶出を行
い、その間３０ｍｌ毎に画分を回収した。各画分を１０
μｌずつ採取し、活性画分を測定するために実験例１に
記載の方法によってＮ-ｍＳＭａｓｅ活性を分析した。
分析結果を示すクロマトグラムを図２に示す。クロマト
グラムに示すように、Ｎ-ｍＳＭａｓｅ活性は単一ピー
クとして検出された。
【００３１】段階４：ＤＥＡＥ-５ＰＷアニオン交換Ｈ
ＰＬＣ 段階３において得られた活性画分を、バッファーＤによ
って平衡化されたＤＥＡＥ-５ＰＷ ＨＰＬＣカラム（２
１．５ｍｍ×１５ｃｍ、東ソー株式会社、日本）に注入
した後、０．５Ｍの硫酸アンモニウム及び０．１％のト
リトンＸ-１００を含むバッファーＤ２００ｍｌを用い
て線形勾配をかけて５ｍｌ／ｍｉｎの流速で溶出を行
い、その間５ｍｌ毎に画分を回収した。各画分を３μｌ
ずつ採取し、実験例１に記載の方法によってＮ-ｍＳＭ
ａｓｅ活性を分析し、活性画分を得た。結果を図３に示
す。クロマトグラムに示すように、Ｎ-ｍＳＭａｓｅ活
性は単一ピークとして検出された。
ＰＬＣ 段階３において得られた活性画分を、バッファーＤによ
って平衡化されたＤＥＡＥ-５ＰＷ ＨＰＬＣカラム（２
１．５ｍｍ×１５ｃｍ、東ソー株式会社、日本）に注入
した後、０．５Ｍの硫酸アンモニウム及び０．１％のト
リトンＸ-１００を含むバッファーＤ２００ｍｌを用い
て線形勾配をかけて５ｍｌ／ｍｉｎの流速で溶出を行
い、その間５ｍｌ毎に画分を回収した。各画分を３μｌ
ずつ採取し、実験例１に記載の方法によってＮ-ｍＳＭ
ａｓｅ活性を分析し、活性画分を得た。結果を図３に示
す。クロマトグラムに示すように、Ｎ-ｍＳＭａｓｅ活
性は単一ピークとして検出された。
【００３２】段階５：フェニル-５ＰＷ疎水性相互作用
ＨＰＬＣ バッファーＤによって平衡化されたフェニル-５ＰＷ Ｈ
ＰＬＣカラム（２１．５ｍｍ×１５ｃｍ、東ソー株式会
社、日本）に段階４で得られた活性画分を注入した後、
蒸留水を用いて線形勾配をかけて５ｍｌ／ｍｉｎの流速
で溶出を行い、その間５ｍｌ毎に画分を回収した。各画
分を３μｌずつ採取し、実験例１に記載の方法でＮ-ｍ
ＳＭａｓｅ活性を分析し活性画分を得た。結果を図４に
示す。クロマトグラムに示すように、Ｎ-ｍＳＭａｓｅ
活性は、それぞれピークε及びζと名付けた２つのピー
クとして検出された。
ＨＰＬＣ バッファーＤによって平衡化されたフェニル-５ＰＷ Ｈ
ＰＬＣカラム（２１．５ｍｍ×１５ｃｍ、東ソー株式会
社、日本）に段階４で得られた活性画分を注入した後、
蒸留水を用いて線形勾配をかけて５ｍｌ／ｍｉｎの流速
で溶出を行い、その間５ｍｌ毎に画分を回収した。各画
分を３μｌずつ採取し、実験例１に記載の方法でＮ-ｍ
ＳＭａｓｅ活性を分析し活性画分を得た。結果を図４に
示す。クロマトグラムに示すように、Ｎ-ｍＳＭａｓｅ
活性は、それぞれピークε及びζと名付けた２つのピー
クとして検出された。
【００３３】段階６：モノＳカチオン交換ＦＰＬＣ ピークεの画分のみを回収し、同体積のバッファーＳ
（ｐＨ６．５の２５ｍＭ酢酸ナトリウム及び１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ）と混合してバッファーＳによってあらかじめ平
衡化されたモノＳカチオン交換ＦＰＬＣカラム（５．０
ｃｍ×５．０ｍｍ、ファルマシア・バイオテクノロジー
社、スウェーデン）に注入した後、１ｍｌ／ｍｉｎの流
速で２０ｍｌの塩化ナトリウムを用いて０．０〜１．０
Ｍの線形勾配をかけて溶出を行い、次いで１．０Ｍの塩
化ナトリウム及び０．１％のトリトンＸ-１００を含む
バッファーＳを用いて徐々に勾配をかけて溶出を行い、
その間１ｍｌ毎に画分を回収した。各画分を３μｌずつ
採取し、どの画分が酵素活性を有するかを決定するため
に実験例１に記載の方法によってＮ-ｍＳＭａｓｅ活性
を分析した。分析結果を示すクロマトグラムを図５に示
す。クロマトグラムに示すように、Ｎ-ｍＳＭａｓｅ活
性はピークＡ及びＢと名付けた２つのピークとして検出
された。これらの活性ピークから得られたＮ-ｍＳＭａ
ｓｅを、Ｎ-ｍＳＭａｓｅ εと呼ぶ。各段階で得られた
蛋白質の合計量、総活性、収率、比活性及び精製率を下
記表１に要約する。
（ｐＨ６．５の２５ｍＭ酢酸ナトリウム及び１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ）と混合してバッファーＳによってあらかじめ平
衡化されたモノＳカチオン交換ＦＰＬＣカラム（５．０
ｃｍ×５．０ｍｍ、ファルマシア・バイオテクノロジー
社、スウェーデン）に注入した後、１ｍｌ／ｍｉｎの流
速で２０ｍｌの塩化ナトリウムを用いて０．０〜１．０
Ｍの線形勾配をかけて溶出を行い、次いで１．０Ｍの塩
化ナトリウム及び０．１％のトリトンＸ-１００を含む
バッファーＳを用いて徐々に勾配をかけて溶出を行い、
その間１ｍｌ毎に画分を回収した。各画分を３μｌずつ
採取し、どの画分が酵素活性を有するかを決定するため
に実験例１に記載の方法によってＮ-ｍＳＭａｓｅ活性
を分析した。分析結果を示すクロマトグラムを図５に示
す。クロマトグラムに示すように、Ｎ-ｍＳＭａｓｅ活
性はピークＡ及びＢと名付けた２つのピークとして検出
された。これらの活性ピークから得られたＮ-ｍＳＭａ
ｓｅを、Ｎ-ｍＳＭａｓｅ εと呼ぶ。各段階で得られた
蛋白質の合計量、総活性、収率、比活性及び精製率を下
記表１に要約する。
【００３４】
【表１】
【００３５】実施例２ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ レムリ法(Laemmli method)（英国、ネイチャー(Natur
e)、227、680-685(1970)）に従ってＳＤＳ-ＰＡＧＥに
より蛋白質を分析した。実施例１の段階６において得ら
れたピークＡ及びＢそれぞれの活性画分を１０μｌず
つ、５倍のレムリバッファー（ｐＨ６．８の０．１２５
Ｍ トリス-ＨＣｌ、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール及
び０．００２％ブロモフェノールブルー）２μｌと混合
し、５分間煮沸した後室温まで冷却し、次いで１０％Ｓ
ＤＳ-ポリアクリルアミドゲル上に試料を流した。肉眼
で識別できるようにするために、分離された蛋白質をプ
ラスワン・シルバー・ステイニング・キット(PlusOne S
ilver Staining Kit)（ファルマシアＬＣＢ社、スウェ
ーデン）を用いて着色した。
e)、227、680-685(1970)）に従ってＳＤＳ-ＰＡＧＥに
より蛋白質を分析した。実施例１の段階６において得ら
れたピークＡ及びＢそれぞれの活性画分を１０μｌず
つ、５倍のレムリバッファー（ｐＨ６．８の０．１２５
Ｍ トリス-ＨＣｌ、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール及
び０．００２％ブロモフェノールブルー）２μｌと混合
し、５分間煮沸した後室温まで冷却し、次いで１０％Ｓ
ＤＳ-ポリアクリルアミドゲル上に試料を流した。肉眼
で識別できるようにするために、分離された蛋白質をプ
ラスワン・シルバー・ステイニング・キット(PlusOne S
ilver Staining Kit)（ファルマシアＬＣＢ社、スウェ
ーデン）を用いて着色した。
【００３６】電気泳動の結果を図６ａ（ピークＡ）及び
６ｂ（ピークＢ）に示す。各図において、左側に矢印で
示した分子量を有するミオシン（２２ｋＤａ）、β-ガ
ラクトシダーゼ（１１６ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン
（８４ｋＤａ）、オボアルブミン(ovalbumin)（５０．
１ｋＤａ）、炭酸脱水酵素（３５．７ｋＤａ）を標準蛋
白質マーカーとして用いた。図５に示されたピークＡの
活性画分（第３３〜４３画分）がそれぞれ、図６ａの第
１列〜第１１列上で電気泳動された。図６ｂ中の第１列
〜第１０列は、図５において得られたピークＢの活性画
分（第５３〜６２画分）から分離された蛋白質をそれぞ
れ示す。図６ａ及び６ｂに示すように、ピークＡ及びＢ
の画分から分離されたＮ-ｍＳＭａｓｅ εは全て約６０
ｋＤａの分子量を有することが明らかになり、その中に
はこれら以外の蛋白質は確認されなかった。
６ｂ（ピークＢ）に示す。各図において、左側に矢印で
示した分子量を有するミオシン（２２ｋＤａ）、β-ガ
ラクトシダーゼ（１１６ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン
（８４ｋＤａ）、オボアルブミン(ovalbumin)（５０．
１ｋＤａ）、炭酸脱水酵素（３５．７ｋＤａ）を標準蛋
白質マーカーとして用いた。図５に示されたピークＡの
活性画分（第３３〜４３画分）がそれぞれ、図６ａの第
１列〜第１１列上で電気泳動された。図６ｂ中の第１列
〜第１０列は、図５において得られたピークＢの活性画
分（第５３〜６２画分）から分離された蛋白質をそれぞ
れ示す。図６ａ及び６ｂに示すように、ピークＡ及びＢ
の画分から分離されたＮ-ｍＳＭａｓｅ εは全て約６０
ｋＤａの分子量を有することが明らかになり、その中に
はこれら以外の蛋白質は確認されなかった。
【００３７】実施例３ Ｎ-ｍＳＭａｓｅ εに対するモノクローナル抗体の生成 実施例１の段階６において得られたＮ-ｍＳＭａｓｅε
５０μｌを、フロイント完全アジュバント(Freund's co
mplete adjuvant)（ギブコＢＲＬライフテクノロジーズ
社(Gibco BRL Life Technologies, Inc.)、米国）と混
合してＢＡＬＢ／ｃマウス（韓国の韓国実験動物センタ
ー(Korean Experimental Animal Centerより購入)に腹
膜注射した。フロインド不完全免疫助成剤(Freund's in
completeadjuvant)中で乳化したＮ-ｍＳＭａｓｅ ε
を、５０μｇの投与量で３週間隔で更に３回注射するこ
とによって更に免疫化を行った。融合(fusion)の３日前
に、免疫助成剤を含まないＮ-ｍＳＭａｓｅ εを投与量
５０μｇで最後に注射した後、マウスから血液をサンプ
リングした。１０，０００×ｇで３０分間遠心分離する
ことにより、抗血清を得た。
５０μｌを、フロイント完全アジュバント(Freund's co
mplete adjuvant)（ギブコＢＲＬライフテクノロジーズ
社(Gibco BRL Life Technologies, Inc.)、米国）と混
合してＢＡＬＢ／ｃマウス（韓国の韓国実験動物センタ
ー(Korean Experimental Animal Centerより購入)に腹
膜注射した。フロインド不完全免疫助成剤(Freund's in
completeadjuvant)中で乳化したＮ-ｍＳＭａｓｅ ε
を、５０μｇの投与量で３週間隔で更に３回注射するこ
とによって更に免疫化を行った。融合(fusion)の３日前
に、免疫助成剤を含まないＮ-ｍＳＭａｓｅ εを投与量
５０μｇで最後に注射した後、マウスから血液をサンプ
リングした。１０，０００×ｇで３０分間遠心分離する
ことにより、抗血清を得た。
【００３８】ゴーディングの(Goding's)プロトコル（ゴ
ーディング(Goding),J.W. モノクローナル・アンチボデ
ィズ(Monoclonal Antibodies)；プリンシプルズ・アン
ド・プラクティス(Principles and Practice)、アカデ
ミックプレス(Academic Press)、ロンドン(1986)）に従
って、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）５０（シグマ
社(Sigma Co.)、米国）を用いて、マウスからの脾臓細
胞（２×１０8個）をＳＰ２／Ｏマウスからの骨髄腫細
胞と融合した後、１０％のハイブリッド促進培地（シグ
マ社、米国）、２０％のウシ胎児血清（ハイクローン(H
yclone)）、３５％のＳＰ２０並びに３５％のＨＥＦＭ
バッファー及びＲＰＭＩ-１６４０（ギブコＢＲＬ、グ
ランド・アイランド(Grand Island)、ニューヨーク、米
国）が補充されたＨＡＴ培地（シグマ社、米国）を含む
９６-ウェル・プレート上にそれらを塗布した。３７℃
で２週間培養した後、オーシュベル(Ausubel)の説明
（オーシュベル,F.M.、カレントプロトコルズ・イン・
モレュラー・バイオロジー(Current Protocols in Mole
cular Biology)、ワイリー-インターサイエンス(Willey
-Interscience)、ニューヨーク(1987)）に従って、ハイ
ブリドーマ上清を使用して、細胞が抗Ｎ-ｍＳＭａｓｅ
ε抗体を生成するか否かを決定した。これにより、Ｎ-
ｍＳＭａｓｅ εに対するモノクローナル抗体を生成し
得る、ＳＭ１Ａ５、ＳＭ１Ｈ６及びＳＭ１Ｅ１と呼ばれ
る３種のハイブリドーマが確認された。ＳＭ１Ａ５は、
１９９９年９月１５日に、寄託番号ＫＣＬＲＦ-ＢＴ-０
００２５号として韓国細胞系調査機関（ＫＣＬＲＦ）に
寄託された。
ーディング(Goding),J.W. モノクローナル・アンチボデ
ィズ(Monoclonal Antibodies)；プリンシプルズ・アン
ド・プラクティス(Principles and Practice)、アカデ
ミックプレス(Academic Press)、ロンドン(1986)）に従
って、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）５０（シグマ
社(Sigma Co.)、米国）を用いて、マウスからの脾臓細
胞（２×１０8個）をＳＰ２／Ｏマウスからの骨髄腫細
胞と融合した後、１０％のハイブリッド促進培地（シグ
マ社、米国）、２０％のウシ胎児血清（ハイクローン(H
yclone)）、３５％のＳＰ２０並びに３５％のＨＥＦＭ
バッファー及びＲＰＭＩ-１６４０（ギブコＢＲＬ、グ
ランド・アイランド(Grand Island)、ニューヨーク、米
国）が補充されたＨＡＴ培地（シグマ社、米国）を含む
９６-ウェル・プレート上にそれらを塗布した。３７℃
で２週間培養した後、オーシュベル(Ausubel)の説明
（オーシュベル,F.M.、カレントプロトコルズ・イン・
モレュラー・バイオロジー(Current Protocols in Mole
cular Biology)、ワイリー-インターサイエンス(Willey
-Interscience)、ニューヨーク(1987)）に従って、ハイ
ブリドーマ上清を使用して、細胞が抗Ｎ-ｍＳＭａｓｅ
ε抗体を生成するか否かを決定した。これにより、Ｎ-
ｍＳＭａｓｅ εに対するモノクローナル抗体を生成し
得る、ＳＭ１Ａ５、ＳＭ１Ｈ６及びＳＭ１Ｅ１と呼ばれ
る３種のハイブリドーマが確認された。ＳＭ１Ａ５は、
１９９９年９月１５日に、寄託番号ＫＣＬＲＦ-ＢＴ-０
００２５号として韓国細胞系調査機関（ＫＣＬＲＦ）に
寄託された。
【００３９】実施例４ Ｎ-ｍＳＭａｓｅ εのイムノプレシピテーション 実施例３において得られた抗血清２５μｌ、ハイブリド
ーマＳＭ１Ａ５、ＳＨ１Ｅ１又はＳＭ１Ｅ１用培地５０
０μｌ、及び免疫化前に得られた血清２５μｌを、蛋白
質Ａ-セファロースＣＬ-４Ｂビーズ（ファルマシア・バ
イオテクノロジー社、スウェーデン）５０μｌを用いて
４℃で１２時間、攪拌しながらそれぞれ反応させた。こ
の反応の前にバッファーＩ（ｐＨ７．５の２０ｍＭトリ
ス-ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１０％ ＢＳＡ（２
０：１ ｖ／ｖ）を用いてビーズを平衡化した。ビーズ
は、１ｍｌのバッファーＩを用いて６回洗浄した後、
０、１５、３０、４５又は６０分間４℃でバッファーＩ
中で実施例１の段階６において得られたＮ-ｍＳＭａｓ
ｅ ε（１００ｎｇ）と攪拌しながら反応させた。４℃
で３０秒間１３，０００×ｇで遠心分離し、次いで実験
例１の方法に従い上清のＮ-ｍＳＭａｓｅ活性を分析し
た。結果を図７に示す。図７に示すように、ハイブリド
ーマ・クローンＳＭ１Ａ５及びＳＭ１Ｅ１から生成され
た抗体のＮ-ｍＳＭａｓｅ ε活性は、両者とも同程度ま
で減少した。これにより、両者の抗原に対する親和性が
類似していることがわかる。
ーマＳＭ１Ａ５、ＳＨ１Ｅ１又はＳＭ１Ｅ１用培地５０
０μｌ、及び免疫化前に得られた血清２５μｌを、蛋白
質Ａ-セファロースＣＬ-４Ｂビーズ（ファルマシア・バ
イオテクノロジー社、スウェーデン）５０μｌを用いて
４℃で１２時間、攪拌しながらそれぞれ反応させた。こ
の反応の前にバッファーＩ（ｐＨ７．５の２０ｍＭトリ
ス-ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１０％ ＢＳＡ（２
０：１ ｖ／ｖ）を用いてビーズを平衡化した。ビーズ
は、１ｍｌのバッファーＩを用いて６回洗浄した後、
０、１５、３０、４５又は６０分間４℃でバッファーＩ
中で実施例１の段階６において得られたＮ-ｍＳＭａｓ
ｅ ε（１００ｎｇ）と攪拌しながら反応させた。４℃
で３０秒間１３，０００×ｇで遠心分離し、次いで実験
例１の方法に従い上清のＮ-ｍＳＭａｓｅ活性を分析し
た。結果を図７に示す。図７に示すように、ハイブリド
ーマ・クローンＳＭ１Ａ５及びＳＭ１Ｅ１から生成され
た抗体のＮ-ｍＳＭａｓｅ ε活性は、両者とも同程度ま
で減少した。これにより、両者の抗原に対する親和性が
類似していることがわかる。
【００４０】実施例５ ウエスタン・ブロット 実施例１の段階５において得られた活性画分約１００ｎ
ｇを、１０％ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル上で電気
泳動させ、分離された蛋白質を、ホファー・エレクトロ
ブロッター・システム(Hoefer Electroblotter system)
（ＴＥ２２マイティー・スモール・トランスフォー・ユ
ニット(TE22 Mighty Small Transphor Unit)、ホファー
・サイエンティフィク・インスツルメンツ(Hoefer Scie
ntific Instruments)、カナダ）を用いて、ニトロセル
ロース膜上に２００ｍＡで電気的に移した。このセルロ
ース膜を、５％の無脂肪乾燥乳を含有するトリスバッフ
ァー食塩水（ｐＨ８．０の２５ｍＭ トリス-ＨＣｌ、１
３７ｍＭ ＮａＣｌ及び２．７ｍＭ ＫＣｌ）によって処
理して移された蛋白質を遮断し(block)、０．１％のツ
イーン２０(Tween 20)を含有するＴＢＳを用いて洗浄
し、コントロールとして用いられる抗血清、ハイブリド
ーマＳＭ１Ａ５、ＳＭ１Ｈ６又はＳＭ１Ｅ１用培地、又
はあらかじめ免疫化された血清と併せて６時間インキュ
ベートした。膜上に移された蛋白質を、０．１％のツイ
ーン２０を含むＴＢＳを用いて洗浄した後、ヤギアンチ
マウスＩｇＧとアルカリホスファターゼとの複合体（サ
ンタ・クルツ・バイオテクノロジー(Santa Cruz Biotec
hnology)、米国）（希釈率１：２，０００）と２時間反
応させ、上記の方法により洗浄し、基質キット（ＭＢＴ
／ＢＣＩＰ、ピエルス(Pierce)、米国）を用いて着色反
応を観察した。ハイブリドーマ培地用洗浄バッファーと
しては、ＴＢＳのみが使用された。ブロッティング(Blo
tting)の結果を図８に示す。図８からわかるように、ハ
イブリドーマＳＭ１Ａ５から生成されたモノクローナル
抗体は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上で、変性されたＮ-ｍＳ
Ｍａｓｅ εと強固に結合する。
ｇを、１０％ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル上で電気
泳動させ、分離された蛋白質を、ホファー・エレクトロ
ブロッター・システム(Hoefer Electroblotter system)
（ＴＥ２２マイティー・スモール・トランスフォー・ユ
ニット(TE22 Mighty Small Transphor Unit)、ホファー
・サイエンティフィク・インスツルメンツ(Hoefer Scie
ntific Instruments)、カナダ）を用いて、ニトロセル
ロース膜上に２００ｍＡで電気的に移した。このセルロ
ース膜を、５％の無脂肪乾燥乳を含有するトリスバッフ
ァー食塩水（ｐＨ８．０の２５ｍＭ トリス-ＨＣｌ、１
３７ｍＭ ＮａＣｌ及び２．７ｍＭ ＫＣｌ）によって処
理して移された蛋白質を遮断し(block)、０．１％のツ
イーン２０(Tween 20)を含有するＴＢＳを用いて洗浄
し、コントロールとして用いられる抗血清、ハイブリド
ーマＳＭ１Ａ５、ＳＭ１Ｈ６又はＳＭ１Ｅ１用培地、又
はあらかじめ免疫化された血清と併せて６時間インキュ
ベートした。膜上に移された蛋白質を、０．１％のツイ
ーン２０を含むＴＢＳを用いて洗浄した後、ヤギアンチ
マウスＩｇＧとアルカリホスファターゼとの複合体（サ
ンタ・クルツ・バイオテクノロジー(Santa Cruz Biotec
hnology)、米国）（希釈率１：２，０００）と２時間反
応させ、上記の方法により洗浄し、基質キット（ＭＢＴ
／ＢＣＩＰ、ピエルス(Pierce)、米国）を用いて着色反
応を観察した。ハイブリドーマ培地用洗浄バッファーと
しては、ＴＢＳのみが使用された。ブロッティング(Blo
tting)の結果を図８に示す。図８からわかるように、ハ
イブリドーマＳＭ１Ａ５から生成されたモノクローナル
抗体は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上で、変性されたＮ-ｍＳ
Ｍａｓｅ εと強固に結合する。
【００４１】実施例６ Ｎ-ｍＳＭａｓｅ εの物理化学特性 １．反応速度分析(Kinetic Analysis) 実施例１の段階６において調製されたＮ-ｍＳＭａｓｅ
εに対して、ラインウエーバ−・バーク分析(Lineweave
r-Burk analysis)を行った。ここで、６．２５〜１００
μＭの濃度の基質スフィンゴミエリンとともに、酵素Ｎ
-ｍＳＭａｓｅεを１０ｎｇ以上の量で使用した。結果
を図９ａに示す。ラインウエーバー・プロットに示すよ
うに、Ｎ-ｍＳＭａｓｅ ε活性は、４７μＭのＫm及び
１．５８７ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇを超えるＶmaxを示
し、ミカエリス・メンテン反応速度論(Michaelis-Mente
n kinetics)に従う典型的な直線を描いた。それとは別
に、同様のラインウエーバー-バーク分析を、０．４、
１．０及び２．０ｍＭのデオキシコール酸ナトリウム存
在下で行った。図９ｂに示した分析結果から、デオキシ
コール酸ナトリウムが、Ｎ-ｓＭａｓｅ εのスフィンゴ
ミエリナーゼに対するＫm値を変えることができること
がわかった。
εに対して、ラインウエーバ−・バーク分析(Lineweave
r-Burk analysis)を行った。ここで、６．２５〜１００
μＭの濃度の基質スフィンゴミエリンとともに、酵素Ｎ
-ｍＳＭａｓｅεを１０ｎｇ以上の量で使用した。結果
を図９ａに示す。ラインウエーバー・プロットに示すよ
うに、Ｎ-ｍＳＭａｓｅ ε活性は、４７μＭのＫm及び
１．５８７ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇを超えるＶmaxを示
し、ミカエリス・メンテン反応速度論(Michaelis-Mente
n kinetics)に従う典型的な直線を描いた。それとは別
に、同様のラインウエーバー-バーク分析を、０．４、
１．０及び２．０ｍＭのデオキシコール酸ナトリウム存
在下で行った。図９ｂに示した分析結果から、デオキシ
コール酸ナトリウムが、Ｎ-ｓＭａｓｅ εのスフィンゴ
ミエリナーゼに対するＫm値を変えることができること
がわかった。
【００４２】Ｂ．基質特異性 ［Ｎ-メチル-14Ｃ］スフィンゴミエリン、１，２-ジパ
ルミトイル-３-ホスファチジル［Ｎ-メチル-3Ｈ］コリ
ン、ホスファチジル［２-3Ｈ］イノシトール４，５-ビ
ホスフェート、１-ステアロイル-２-［１-14Ｃ］アラキ
ドノイル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスホコリン、及び１-ア
シル-２-［１-14Ｃ］アラキドノイル-ｓｎ-グリセロ-３
-ホスホエタノールアミンを用いてＮ-ｍＳＭａｓｅ ε
の基質特異性を調べた。実験例１に記載の方法によっ
て、これらの基質に対するＮ-ｓＭａｓｅ活性を測定し
た結果、スフィンゴミエリンに対する特異性が、他の基
質に対するものよりも５０倍高いことが判明した。
ルミトイル-３-ホスファチジル［Ｎ-メチル-3Ｈ］コリ
ン、ホスファチジル［２-3Ｈ］イノシトール４，５-ビ
ホスフェート、１-ステアロイル-２-［１-14Ｃ］アラキ
ドノイル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスホコリン、及び１-ア
シル-２-［１-14Ｃ］アラキドノイル-ｓｎ-グリセロ-３
-ホスホエタノールアミンを用いてＮ-ｍＳＭａｓｅ ε
の基質特異性を調べた。実験例１に記載の方法によっ
て、これらの基質に対するＮ-ｓＭａｓｅ活性を測定し
た結果、スフィンゴミエリンに対する特異性が、他の基
質に対するものよりも５０倍高いことが判明した。
【００４３】Ｃ．Ｍｇ2+依存性 Ｎ-ｍＳＭａｓｅ ε活性のＭｇ2+依存性を調べるため
に、実施例１の段階６において得られた画分Ｂを、ＰＤ
-１０カラム（セファデックス(Sephadex)Ｇ-２５、ファ
ルマシア・バイオテクノロジー社、スウェーデン）に適
用することにより脱塩した。使用するために、カラムを
蒸留水によってあらかじめ２回平衡化した。実験例１に
記載の方法により、１、５、１０及び２５ｍＭのＭｇＣ
ｌ2存在下で、脱塩された蛋白質画分（蛋白質１０ｎｇ
に相当）のＮ-ｍＳＭａｓｅε活性を測定した。結果を
図１０に示す。プロットに示すように、Ｎ-ｍＳＭａｓ
ｅ ε活性は、Ｍｇ2+濃度に依存する。
に、実施例１の段階６において得られた画分Ｂを、ＰＤ
-１０カラム（セファデックス(Sephadex)Ｇ-２５、ファ
ルマシア・バイオテクノロジー社、スウェーデン）に適
用することにより脱塩した。使用するために、カラムを
蒸留水によってあらかじめ２回平衡化した。実験例１に
記載の方法により、１、５、１０及び２５ｍＭのＭｇＣ
ｌ2存在下で、脱塩された蛋白質画分（蛋白質１０ｎｇ
に相当）のＮ-ｍＳＭａｓｅε活性を測定した。結果を
図１０に示す。プロットに示すように、Ｎ-ｍＳＭａｓ
ｅ ε活性は、Ｍｇ2+濃度に依存する。
【００４４】Ｄ．最適ｐＨ Ｃにおいて得られた脱塩された蛋白質画分（蛋白質１０
ｎｇに相当）及び５ｍＭのＭｇＣｌ2を含む反応溶液
を、グリシン-ＨＣｌを用いてｐＨ４．５、５．５若し
くは６．０に、イミダゾール-ＨＣｌを用いてｐＨ６．
０若しくは７．０に、トリス-ＨＣｌを用いてｐＨ７．
０、７．５、８．０若しくは９．０に、又はグリシン-
ＮａＯＨを用いてｐＨ９、１０若しくは１１に調製した
後、実験例１の手順に従い酵素活性を測定した。結果を
図１１に示す。図１１に示すように、Ｎ-ｍＳＭａｓｅ
εは、中性ｐＨ領域において最も高い活性を示し、ｐＨ
が６．０よりも低くなると、又は９．０よりも高くなる
と、活性が急激に減少した。従って、本発明のＮ-ｍＳ
Ｍａｓｅεは、中性ｐＨにおいて最適な酵素である。
ｎｇに相当）及び５ｍＭのＭｇＣｌ2を含む反応溶液
を、グリシン-ＨＣｌを用いてｐＨ４．５、５．５若し
くは６．０に、イミダゾール-ＨＣｌを用いてｐＨ６．
０若しくは７．０に、トリス-ＨＣｌを用いてｐＨ７．
０、７．５、８．０若しくは９．０に、又はグリシン-
ＮａＯＨを用いてｐＨ９、１０若しくは１１に調製した
後、実験例１の手順に従い酵素活性を測定した。結果を
図１１に示す。図１１に示すように、Ｎ-ｍＳＭａｓｅ
εは、中性ｐＨ領域において最も高い活性を示し、ｐＨ
が６．０よりも低くなると、又は９．０よりも高くなる
と、活性が急激に減少した。従って、本発明のＮ-ｍＳ
Ｍａｓｅεは、中性ｐＨにおいて最適な酵素である。
【００４５】Ｅ．他のカチオンの影響 Ｃａ2+、Ｆｅ3+、Ｆｅ2+、Ｚｎ2+、Ｃｕ2+及びＭｇ2+の
ような他のカチオンのＮ-ｍＳＭａｓｅ ε活性への影響
を調べた。Ｃにおいて得られた脱塩された蛋白質画分
（蛋白質１０ｎｇに相当）及び５ｍＭのＭｇＣｌ2を含
む溶液に、ＣａＣｌ2、ＦｅＣｌ3、ＦｅＣｌ2、ＺｎＣ
ｌ2又はＣｕＣｌ2を最終濃度が０．０１、０．０２、
０．０５、０．１、０．２５又は０．５ｍＭとなるよう
に加えた後、実験例１の方法に従ってＮ−ｍＳＭａｓｅ
ε活性を測定した。結果を図１２に示す。プロットに
示すように、０．５ｍＭ以下の濃度では、Ｃａ2+はＮ-
ｍＳＭａｓｅ ε活性に何ら影響を及ぼさないのに対
し、Ｃｕ2+、Ｚｎ 2+及びＦｅ2+は、それぞれ２８μＭ、
３２μＭ及び４７μＭのＩＣ50値で酵素活性を阻害す
る。一方、Ｆｅ3+は、好影響をもたらし、Ｎ-ｍＳＭａ
ｓｅ ε活性を１．８倍に増加させる。
ような他のカチオンのＮ-ｍＳＭａｓｅ ε活性への影響
を調べた。Ｃにおいて得られた脱塩された蛋白質画分
（蛋白質１０ｎｇに相当）及び５ｍＭのＭｇＣｌ2を含
む溶液に、ＣａＣｌ2、ＦｅＣｌ3、ＦｅＣｌ2、ＺｎＣ
ｌ2又はＣｕＣｌ2を最終濃度が０．０１、０．０２、
０．０５、０．１、０．２５又は０．５ｍＭとなるよう
に加えた後、実験例１の方法に従ってＮ−ｍＳＭａｓｅ
ε活性を測定した。結果を図１２に示す。プロットに
示すように、０．５ｍＭ以下の濃度では、Ｃａ2+はＮ-
ｍＳＭａｓｅ ε活性に何ら影響を及ぼさないのに対
し、Ｃｕ2+、Ｚｎ 2+及びＦｅ2+は、それぞれ２８μＭ、
３２μＭ及び４７μＭのＩＣ50値で酵素活性を阻害す
る。一方、Ｆｅ3+は、好影響をもたらし、Ｎ-ｍＳＭａ
ｓｅ ε活性を１．８倍に増加させる。
【００４６】Ｆ．阻害剤 Ｎ−ｍＳＭａｓｅ ε活性に対する還元剤の影響を調べ
た。実施例１の段階６において得られた活性画分（１０
ｎｇの蛋白質に相当）を、０．５、１、２、３、４、
５、７．５若しくは１０ｍＭのグルタチオン、ＤＴＴ、
又は２-メルカプトエタノールを含むトリス-ＨＣｌ ９
０μｌに加え、３７℃で１０分間インキュベートした。
１０μｌの[Ｎ-メチル-14Ｃ]スフィンゴミエリンを添加
した後、実験例１の手順に従いＮ−ｍＳＭａｓｅ ε活
性を測定した。比較のため、還元剤を含まないトリス-
ＨＣｌバッファーをコントロールとして使用した。還元
剤による影響を受けたＮ−ｍＳＭａｓｅ ε活性を、コ
ントロールとの相対比率として表した。結果を図１３ａ
に示す。図１３ａに示すように、グルタチオンは、Ｎ−
ｍＳＭａｓｅ ε活性に影響を及ぼす。Ｎ−ｍＳＭａｓ
ｅ ε活性は、グルタチオン濃度が３ｍＭまで増加する
と増加するが、その後は減少し、最終的にグルタチオン
濃度が１０ｍＭになると完全に阻害されるという２つの
態様(bimodal profile)を示す。一方、Ｎ-ｍＳＭａｓｅ
ε活性はＤＴＴ及び２-メルカプトエタノールによって
阻害されないことがわかった。
た。実施例１の段階６において得られた活性画分（１０
ｎｇの蛋白質に相当）を、０．５、１、２、３、４、
５、７．５若しくは１０ｍＭのグルタチオン、ＤＴＴ、
又は２-メルカプトエタノールを含むトリス-ＨＣｌ ９
０μｌに加え、３７℃で１０分間インキュベートした。
１０μｌの[Ｎ-メチル-14Ｃ]スフィンゴミエリンを添加
した後、実験例１の手順に従いＮ−ｍＳＭａｓｅ ε活
性を測定した。比較のため、還元剤を含まないトリス-
ＨＣｌバッファーをコントロールとして使用した。還元
剤による影響を受けたＮ−ｍＳＭａｓｅ ε活性を、コ
ントロールとの相対比率として表した。結果を図１３ａ
に示す。図１３ａに示すように、グルタチオンは、Ｎ−
ｍＳＭａｓｅ ε活性に影響を及ぼす。Ｎ−ｍＳＭａｓ
ｅ ε活性は、グルタチオン濃度が３ｍＭまで増加する
と増加するが、その後は減少し、最終的にグルタチオン
濃度が１０ｍＭになると完全に阻害されるという２つの
態様(bimodal profile)を示す。一方、Ｎ-ｍＳＭａｓｅ
ε活性はＤＴＴ及び２-メルカプトエタノールによって
阻害されないことがわかった。
【００４７】グルタチオンの影響の結果と併せて、グル
タチオンと類似の還元剤のＮ−ｍＳＭａｓｅ ε活性へ
の影響も調べた。１、３、５若しくは１０ｍＭのＧＳＳ
Ｇ、システイン、システイン-グリシン又はγ-グルタル
酸-システインによって処理した後、Ｎ-ｍＳＭａｓｅ
ε活性を同様の方法で測定した。結果を図１３ｂに示
す。図１３ｂに示すように、Ｎ-ｍＳＭａｓｅ ε活性が
ＧＳＳＧ、システイン、システイン-グリシン又はγ-グ
ルタル酸-システインによって阻害されることがわかっ
た。
タチオンと類似の還元剤のＮ−ｍＳＭａｓｅ ε活性へ
の影響も調べた。１、３、５若しくは１０ｍＭのＧＳＳ
Ｇ、システイン、システイン-グリシン又はγ-グルタル
酸-システインによって処理した後、Ｎ-ｍＳＭａｓｅ
ε活性を同様の方法で測定した。結果を図１３ｂに示
す。図１３ｂに示すように、Ｎ-ｍＳＭａｓｅ ε活性が
ＧＳＳＧ、システイン、システイン-グリシン又はγ-グ
ルタル酸-システインによって阻害されることがわかっ
た。
【００４８】Ｇ．活性剤の影響 デオキシコール酸ナトリウム及びトリトンＸ-１００を
試験されるべき活性剤として選択した。実験例１の手順
に従い、０．５、１、２、及び５ｍＭのデオキシコール
酸ナトリウムをそれぞれ含む反応溶液中で、Ｃにおいて
得られた蛋白質画分（１０ｎｇの蛋白質に相当）のＮ−
ｍＳＭａｓｅ ε活性を測定した。トリトンＸ-１００の
場合は、０．０５、０．０１、０．５及び０．１％の濃
度で調製した。
試験されるべき活性剤として選択した。実験例１の手順
に従い、０．５、１、２、及び５ｍＭのデオキシコール
酸ナトリウムをそれぞれ含む反応溶液中で、Ｃにおいて
得られた蛋白質画分（１０ｎｇの蛋白質に相当）のＮ−
ｍＳＭａｓｅ ε活性を測定した。トリトンＸ-１００の
場合は、０．０５、０．０１、０．５及び０．１％の濃
度で調製した。
【００４９】デオキシコレート及びトリトンＸ-１００
のＮ-ｍＳＭａｓｅ ε活性への影響を、図１４ａ及び１
４ｂにそれぞれ示す。これらのプロットに示すように、
Ｎ-ｍＳＭａｓｅ ε活性は、１ｍＭのデオキシコール酸
ナトリウム存在下で３倍増加し、０．００５％のトリト
ンＸ-１００存在下で１．５倍増加する。
のＮ-ｍＳＭａｓｅ ε活性への影響を、図１４ａ及び１
４ｂにそれぞれ示す。これらのプロットに示すように、
Ｎ-ｍＳＭａｓｅ ε活性は、１ｍＭのデオキシコール酸
ナトリウム存在下で３倍増加し、０．００５％のトリト
ンＸ-１００存在下で１．５倍増加する。
【００５０】実施例７ 脳組織中のＮ−ｍＳＭａｓｅ ε活性分布 妊娠１６日目のスプレーグ-ダウリー(Sprague-Dawley)
・ラットの胎児から、コー(Koh),J.Y.らの教え（Exp, N
eurol.、135、 153-159(1996)）に従って皮質ニューロ
ン培養液を以下のように調製した。ラット胎児から摘出
された皮質神経組織を、Ｃａ2+及びＭｇ2+を含まないハ
ンクス平衡塩溶液(Hank's balanced salt solution; HB
SS)（１ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び１０ｍＭのＨ
ＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）へ添加し、その後、炎で細くし
たパスツールピペットを用いて遊離細胞を単離した。単
離した遊離細胞を、底部がポリ-Ｄ-ライシン(lycine)で
被覆された培養プレート中のＤＭＥＭ（ダルベッコ変形
イーグル培地(Dulbecco'sModified Eagle Medium)）／
Ｆ-１２（ギブコＢＲＬ、グランド・アイランド、ニュ
ーヨーク、米国）上に塗布した後、５％ＣＯ2雰囲気中
で３７℃でインキュベートした。１８時間インキュベー
トした後、非神経細胞の成長を妨げるために１０μＭの
β-Ｄ-シトシンアラビノフラノシド(cytosine arabinof
uranoside)を培地に添加した。
・ラットの胎児から、コー(Koh),J.Y.らの教え（Exp, N
eurol.、135、 153-159(1996)）に従って皮質ニューロ
ン培養液を以下のように調製した。ラット胎児から摘出
された皮質神経組織を、Ｃａ2+及びＭｇ2+を含まないハ
ンクス平衡塩溶液(Hank's balanced salt solution; HB
SS)（１ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び１０ｍＭのＨ
ＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）へ添加し、その後、炎で細くし
たパスツールピペットを用いて遊離細胞を単離した。単
離した遊離細胞を、底部がポリ-Ｄ-ライシン(lycine)で
被覆された培養プレート中のＤＭＥＭ（ダルベッコ変形
イーグル培地(Dulbecco'sModified Eagle Medium)）／
Ｆ-１２（ギブコＢＲＬ、グランド・アイランド、ニュ
ーヨーク、米国）上に塗布した後、５％ＣＯ2雰囲気中
で３７℃でインキュベートした。１８時間インキュベー
トした後、非神経細胞の成長を妨げるために１０μＭの
β-Ｄ-シトシンアラビノフラノシド(cytosine arabinof
uranoside)を培地に添加した。
【００５１】それとは別に、出生後１〜３日のラットの
脳新皮質(brain neocortex)から、神経膠細胞の培養液
を調製した。この培養液を、６-ウェルプレート中０．
２５〜０．５ウェル容量を満たした１０％のウシ胎児血
清及び１０％のウマ血清が補充された培地上に塗布し、
２時間培養した。培地は毎週新しいものに変えた。神経
膠細胞を、１４〜２８日培養した後塗布した。
脳新皮質(brain neocortex)から、神経膠細胞の培養液
を調製した。この培養液を、６-ウェルプレート中０．
２５〜０．５ウェル容量を満たした１０％のウシ胎児血
清及び１０％のウマ血清が補充された培地上に塗布し、
２時間培養した。培地は毎週新しいものに変えた。神経
膠細胞を、１４〜２８日培養した後塗布した。
【００５２】培養された皮質ニューロン及び神経膠細胞
を、ＴＢＳによって３回洗浄した後、それぞれ均質化バ
ッファー（ｐＨ７．５の２０ｍＭ トリス-ＨＣｌ、１ｍ
ＭＥＤＴＡ、１０ｍＭ ２-メルカプトエタノール、１μ
ｇ／ｍｌ ロイペプチン(leupeptin)、及び１ｍＭ フェ
ニルメチルスルホニルフルオライド(phenylmethylsulfo
nyl fluoride)へ添加し、２６ゲージ針を３０回前後さ
せてせん断した。４℃において１０分間２，０００×ｇ
でホモジェネートを遠心分離することにより、ニューロ
ンデブリ及び神経膠細胞デブリが得られる。神経膠細胞
デブリについては、４℃において１００，０００×ｇで
再度１時間遠心分離した。上清を水溶性画分（Ｓ１０
０）として除去するとともに、膜質材料(membranous ma
terials)（Ｐ１００）を含むペレットを上清の半分の体
積の均質化バッファー中で懸濁させた。
を、ＴＢＳによって３回洗浄した後、それぞれ均質化バ
ッファー（ｐＨ７．５の２０ｍＭ トリス-ＨＣｌ、１ｍ
ＭＥＤＴＡ、１０ｍＭ ２-メルカプトエタノール、１μ
ｇ／ｍｌ ロイペプチン(leupeptin)、及び１ｍＭ フェ
ニルメチルスルホニルフルオライド(phenylmethylsulfo
nyl fluoride)へ添加し、２６ゲージ針を３０回前後さ
せてせん断した。４℃において１０分間２，０００×ｇ
でホモジェネートを遠心分離することにより、ニューロ
ンデブリ及び神経膠細胞デブリが得られる。神経膠細胞
デブリについては、４℃において１００，０００×ｇで
再度１時間遠心分離した。上清を水溶性画分（Ｓ１０
０）として除去するとともに、膜質材料(membranous ma
terials)（Ｐ１００）を含むペレットを上清の半分の体
積の均質化バッファー中で懸濁させた。
【００５３】ニューロン水溶性画分、ニューロン膜画
分、神経膠細胞ホモジェネート、及び実施例１の段階６
において得られたＮ-ｍＳＭａｓｅ εを混合して１０％
ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させた。
６０ｋＤａの分子量を有する蛋白質に対する実施例３で
得られた抗血清を１０，０００倍に希釈して用いて、実
施例５と同様の方法でウエスタン・ブロットを行った。
結果を図１５に示す。ブロット図から明らかなように、
Ｎ-ｍＳＭａｓｅ εは、ニューロン膜画分中に存在する
が、ニューロン水溶性画分及び神経膠細胞ホモジェネー
ト中には存在しない。
分、神経膠細胞ホモジェネート、及び実施例１の段階６
において得られたＮ-ｍＳＭａｓｅ εを混合して１０％
ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させた。
６０ｋＤａの分子量を有する蛋白質に対する実施例３で
得られた抗血清を１０，０００倍に希釈して用いて、実
施例５と同様の方法でウエスタン・ブロットを行った。
結果を図１５に示す。ブロット図から明らかなように、
Ｎ-ｍＳＭａｓｅ εは、ニューロン膜画分中に存在する
が、ニューロン水溶性画分及び神経膠細胞ホモジェネー
ト中には存在しない。
【００５４】上記の結果からわかるように、本発明のス
フィンゴミエリナーゼＮ-ｍＳＭａｓｅ εは、ニューロ
ン膜のみに存在するので、パーキンソン病、アルツハイ
マー症等の脳疾患に対する治療薬の開発のために有用で
ある。更に、本発明のスフィンゴミエリナーゼＮ-ｍＳ
Ｍａｓｅ εは、その阻害剤及び活性化因子の研究並び
にＸ線又はＮＭＲによる構造分析において有用であるこ
とがわかる。一方、本発明のＮ-ｍＳＭａｓｅ εに対し
て特異的なモノクローナル抗体を用いることにより、本
発明のＮ-ｍＳＭａｓｅ εが有する機能及び細胞内調節
機構を調べることができる。これらモノクローナル抗体
は、Ｎ-ｍＳＭａｓｅ εを効率的に単離するため並びに
癌及び変性疾患(degenerative diseases)を診断するた
めにも有用である。
フィンゴミエリナーゼＮ-ｍＳＭａｓｅ εは、ニューロ
ン膜のみに存在するので、パーキンソン病、アルツハイ
マー症等の脳疾患に対する治療薬の開発のために有用で
ある。更に、本発明のスフィンゴミエリナーゼＮ-ｍＳ
Ｍａｓｅ εは、その阻害剤及び活性化因子の研究並び
にＸ線又はＮＭＲによる構造分析において有用であるこ
とがわかる。一方、本発明のＮ-ｍＳＭａｓｅ εに対し
て特異的なモノクローナル抗体を用いることにより、本
発明のＮ-ｍＳＭａｓｅ εが有する機能及び細胞内調節
機構を調べることができる。これらモノクローナル抗体
は、Ｎ-ｍＳＭａｓｅ εを効率的に単離するため並びに
癌及び変性疾患(degenerative diseases)を診断するた
めにも有用である。
【００５５】本発明は、例示的に記載され、使用された
専門用語は限定するよりもむしろ説明することを目的と
している。本発明の多くの修正及び変形は、上記の説明
に照らして可能である。それ故、添付の特許請求の範囲
内で、本発明は具体的に説明された以外の別の方法で実
施することもできる。
専門用語は限定するよりもむしろ説明することを目的と
している。本発明の多くの修正及び変形は、上記の説明
に照らして可能である。それ故、添付の特許請求の範囲
内で、本発明は具体的に説明された以外の別の方法で実
施することもできる。
【図１】 ウシの脳の硫酸アンモニウム抽出物のＤＥＡ
Ｅ-セルロースアニオン交換クロマトグラフィー後のク
ロマトグラムである。
Ｅ-セルロースアニオン交換クロマトグラフィー後のク
ロマトグラムである。
【図２】 アニオン交換カラムクロマトグラフィーによ
って得られた活性画分のブチル-トヨパール６５０Ｍ疎
水性相互作用クロマトグラフィー後のクロマトグラムで
ある。
って得られた活性画分のブチル-トヨパール６５０Ｍ疎
水性相互作用クロマトグラフィー後のクロマトグラムで
ある。
【図３】 疎水性相互作用クロマトグラフィーによって
得られた活性画分のＤＥＡＥ−５ＰＷアニオン交換ＨＰ
ＬＣ後のクロマトグラムである。
得られた活性画分のＤＥＡＥ−５ＰＷアニオン交換ＨＰ
ＬＣ後のクロマトグラムである。
【図４】 アニオン交換ＨＰＬＣによって得られた活性
成分のフェニル-５ＰＷ疎水性相互作用クロマトグラフ
ィーのクロマトグラムである。
成分のフェニル-５ＰＷ疎水性相互作用クロマトグラフ
ィーのクロマトグラムである。
【図５】 疎水性相互作用ＨＰＬＣによって得られた活
性画分のモノＳカチオン交換ＦＰＬＣ後のクロマトグラ
ムである。
性画分のモノＳカチオン交換ＦＰＬＣ後のクロマトグラ
ムである。
【図６】 カチオン交換ＦＰＬＣによって得られたピー
クα（ａ）及びピークβ（ｂ）のＳＤＳ-ＰＡＧＥの結
果を示す。
クα（ａ）及びピークβ（ｂ）のＳＤＳ-ＰＡＧＥの結
果を示す。
【図７】 本発明のスフィンゴミエリナーゼに対するイ
ムノプレシピテーションの結果を示す。
ムノプレシピテーションの結果を示す。
【図８】 本発明のスフィンゴミエリナーゼに対するウ
エスタン・ブロットの結果を示す。
エスタン・ブロットの結果を示す。
【図９】 活性剤が存在しない場合（ａ）及び０．１、
１．０及び２．０ｍＭのデオキシコール酸ナトリウム存
在下での（ｂ）基質濃度の逆数に対してプロットしたス
フィンゴミエリナーゼの速度の逆数のラインウエーバー
-バーク・プロットを示す。
１．０及び２．０ｍＭのデオキシコール酸ナトリウム存
在下での（ｂ）基質濃度の逆数に対してプロットしたス
フィンゴミエリナーゼの速度の逆数のラインウエーバー
-バーク・プロットを示す。
【図１０】 Ｍｇ2+濃度に対してプロットした本発明の
スフィンゴミエリナーゼの活性のグラフである。
スフィンゴミエリナーゼの活性のグラフである。
【図１１】 ｐＨ変化に対してプロットした本発明のス
フィンゴミエリナーゼの活性のグラフである。
フィンゴミエリナーゼの活性のグラフである。
【図１２】 Ｃａ2+、Ｆｅ2+、Ｆｅ3+、Ｚｎ2+及びＣｕ
2+の濃度に対してプロットした本発明のスフィンゴミエ
リナーゼの活性のグラフである。
2+の濃度に対してプロットした本発明のスフィンゴミエ
リナーゼの活性のグラフである。
【図１３】 ＧＳＨ、ＤＴＴ及び２-メルカプトエタノ
ールの濃度に対して（ａ）並びにＧＳＳＧ、システイ
ン、システイン-グリシン及びγ-グルタル酸-システイ
ンの濃度に対して（ｂ）プロットされた本発明のスフィ
ンゴミエリナーゼの活性のグラフを示す。
ールの濃度に対して（ａ）並びにＧＳＳＧ、システイ
ン、システイン-グリシン及びγ-グルタル酸-システイ
ンの濃度に対して（ｂ）プロットされた本発明のスフィ
ンゴミエリナーゼの活性のグラフを示す。
【図１４】 デオキシコール酸ナトリウムの濃度（ａ）
及びトリトンＸ-１００の濃度（ｂ）に対してプロット
された本発明のスフィンゴミエリナーゼの活性のグラフ
を示す。
及びトリトンＸ-１００の濃度（ｂ）に対してプロット
された本発明のスフィンゴミエリナーゼの活性のグラフ
を示す。
【図１５】 ウシの脳から得られたニューロン膜画分の
ＳＤＳ-ＰＡＧＥの結果を示す。
ＳＤＳ-ＰＡＧＥの結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 キム デ キョン 大韓民国、ソウル 137−069、ソチョク、 バンベボンドン 754−１、ジュンアン アパート ガ−203 (72)発明者 ジョン ソン ユン 大韓民国、クワンジュシ 500−110、ブク ク、ムンフンドン 787−１、ウサンジュ ゴン アパート 106−1306 (72)発明者 ジョン クワン ムク 大韓民国、キョンギド 463−050、ソンナ ンシ、ブンダンク、ソヒョンドン 91、ハ ンヤン アパート 312−905 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA53 GA03 HA15 4B050 CC01 DD11 FF02C FF11C FF20C LL05 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA13 DA14 DA20 4H045 AA11 BA10 CA40 DA76 EA50 FA72
Claims (9)
- 【請求項１】 分子量が６０ｋＤａであり、活性がＭｇ
2+依存性であり、且つ最適ｐＨが６．０〜９．０の範囲
であるウシの脳のニューロン膜由来のスフィンゴミエリ
ナーゼ。 - 【請求項２】 スフィンゴミエリナーゼ活性が８．０ｍ
ＭのＩＣ50を有するグルタチオンによって阻害される請
求項１記載のスフィンゴミエリナーゼ。 - 【請求項３】 ウシの脳組織を均質化し、得られたホモ
ジェネートを遠心分離して細胞デブリ及び細胞核を除去
し；遠心分離により上清から細胞膜を分離してペレット
とし；硫酸アンモニウムを含有するバッファーを用いて
細胞膜ペレットを処理してスフィンゴミエリナーゼを膜
から分離し；得られた抽出物をアニオン交換クロマトグ
ラフィーに付し；クロマトグラフィー画分をトリトンＸ
-１００を含むバッファー中で超音波処理し、超音波処
理した画分を遠心分離してスフィンゴミエリナーゼを含
む上清を得て；前記上清を疎水性相互作用クロマトグラ
フィー、アニオン交換高速液体クロマトグラフィー、疎
水性相互作用高速液体クロマトグラフィー、及びカチオ
ン交換高速蛋白質液体クロマトグラフィーにこの順序で
付すことにより精製する段階を含む請求項１記載のスフ
ィンゴミエリナーゼの単離方法。 - 【請求項４】 ＤＥＡＥ-セルロースカラムを用いてア
ニオン交換クロマトグラフィーを行う請求項３記載の方
法。 - 【請求項５】 ブチル-トヨパール６５０Ｍカラムを用
いて疎水性相互作用クロマトグラフィーを行う請求項３
記載の方法。 - 【請求項６】 ＤＥＡＥ-５ＰＷカラムを用いてアニオ
ン交換高速液体クロマトグラフィーを行う請求項３記載
の方法。 - 【請求項７】 フェニル-５ＰＷカラムを用いて疎水性
高速液体クロマトグラフィーを行う請求項３記載の方
法。 - 【請求項８】 モノ-Ｓ高速蛋白質液体クロマトグラフ
ィーカラムを用いてカチオン交換高速蛋白質液体クロマ
トグラフィーを行う請求項３記載の方法。 - 【請求項９】 ハイブリドーマＳＭ１Ａ５（寄託番号Ｋ
ＣＬＲＦ−ＢＴ−０００２５）によって生成される請求
項１のスフィンゴミエリナーゼに対するモノクローナル
抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001037192A JP2002253225A (ja) | 2001-02-14 | 2001-02-14 | ウシの脳由来の細胞表面スフィンゴミエリナーゼ、その単離方法及び抗スフィンゴミエリナーゼモノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001037192A JP2002253225A (ja) | 2001-02-14 | 2001-02-14 | ウシの脳由来の細胞表面スフィンゴミエリナーゼ、その単離方法及び抗スフィンゴミエリナーゼモノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002253225A true JP2002253225A (ja) | 2002-09-10 |
Family
ID=18900360
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001037192A Pending JP2002253225A (ja) | 2001-02-14 | 2001-02-14 | ウシの脳由来の細胞表面スフィンゴミエリナーゼ、その単離方法及び抗スフィンゴミエリナーゼモノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002253225A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1970645A1 (en) | 2002-08-30 | 2008-09-17 | Sanyo Electric Co., Ltd. | Compressor |
| JP2009022220A (ja) * | 2007-07-20 | 2009-02-05 | Nagase Chemtex Corp | セラミドの製造方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001507575A (ja) * | 1996-12-24 | 2001-06-12 | ザ ジョンズ ホプキンズ ユニバーシティ | 組換えｎ−ｓｍアーゼ、及び組換えｎ−ｓｍアーゼをエンコードする核酸 |
| JP2001512682A (ja) * | 1997-08-11 | 2001-08-28 | メモレック シュトッフェル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 中性スフィンゴミエリナーゼ |
-
2001
- 2001-02-14 JP JP2001037192A patent/JP2002253225A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001507575A (ja) * | 1996-12-24 | 2001-06-12 | ザ ジョンズ ホプキンズ ユニバーシティ | 組換えｎ−ｓｍアーゼ、及び組換えｎ−ｓｍアーゼをエンコードする核酸 |
| JP2001512682A (ja) * | 1997-08-11 | 2001-08-28 | メモレック シュトッフェル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 中性スフィンゴミエリナーゼ |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| JPN6010054735, "Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ", ２０００， Ｖｏｌ．７５， ｐｐ．１００４−１０１４ * |
| JPN6010054737, "Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ", ２０００， Ｖｏｌ．２７５， Ｎｏ．１１， ｐｐ．７６４１−７６４７ * |
| JPN6010054739, "Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ", ２０００， Ｖｏｌ．３９， ｐｐ．４８３８−４８４５ * |
| JPN6010054741, "Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ", １９８９， Ｖｏｌ．２６４， Ｎｏ．２１， ｐｐ．１２５５４−１２５６１ * |
| JPN6010054743, "Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ", １９９８， Ｖｏｌ．２７３， Ｎｏ．５１， ｐｐ．３４４７２−３４４７９ * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1970645A1 (en) | 2002-08-30 | 2008-09-17 | Sanyo Electric Co., Ltd. | Compressor |
| EP1970644A1 (en) | 2002-08-30 | 2008-09-17 | Sanyo Electric Co., Ltd. | Compressor with oil accumulator |
| EP1972870A2 (en) | 2002-08-30 | 2008-09-24 | Sanyo Electric Co., Ltd. | Refrigerant cycling device and compressor using the same |
| JP2009022220A (ja) * | 2007-07-20 | 2009-02-05 | Nagase Chemtex Corp | セラミドの製造方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Perdew et al. | A 50 kilodalton protein associated with raf and pp60 v-src protein kinases is a mammalian homolog of the cell cycle control protein cdc37 | |
| Mizuno et al. | MPTPδ, a putative murine homolog of HPTPδ, is expressed in specialized regions of the brain and in the B-cell lineage | |
| JP2001508646A (ja) | ヒト血漿ヒアルロニダーゼ | |
| WO2002074805A1 (fr) | Protéine rage soluble | |
| Nara et al. | Retinol-induced morphological changes of cultured bovine endothelial cells are accompanied by a marked increase in transglutaminase | |
| Owen et al. | Identification and characterization of the genes encoding human and mouse osteoactivin | |
| JP2013177395A (ja) | 哺乳動物を治療して体重減少又は肥満の減少を生じさせる方法 | |
| Sridevi et al. | Ceramide synthase 1 is regulated by proteasomal mediated turnover | |
| JP2002253225A (ja) | ウシの脳由来の細胞表面スフィンゴミエリナーゼ、その単離方法及び抗スフィンゴミエリナーゼモノクローナル抗体 | |
| Ghosh et al. | Identification, partial purification, and localization of a neutral sphingomyelinase in rabbit skeletal muscle: neutral sphingomyelinase in skeletal muscle | |
| EP0555286B1 (en) | Cell growth inhibitors | |
| Alliegro et al. | In vitro biological activities of echinonectin | |
| KR100379240B1 (ko) | 소 뇌 유래의 막결합 중성형 스핑고 마이엘리네이즈의 정제방법 | |
| EP1699460A2 (en) | Use of enzymatic inhibitors of h-prune for the prevention and treatment of the metastases of tumours overexpressing h-prune | |
| Kreindler et al. | Identification and membrane localization of electrogenic sodium bicarbonate cotransporters in Calu-3 cells | |
| KR100565437B1 (ko) | 신규한 스핑고마이엘리나제 효소, 그에 대한 항체, 안티센스 및 제조방법 | |
| IE83449B1 (en) | Cell growth inhibitors | |
| Faucette et al. | Induction of tissue factor activity in endothelial cells and monocytes by a modified form of albumin present in normal human plasma | |
| US20020137173A1 (en) | Membrane-associated sphingomyelinase derived from bovine brain, isolation method therefor and anti-sphingomyelinase monoclonal anitibody | |
| EP1258527A1 (en) | Membrane-associated shingomyelinase derived from bovine brain, isolation method therfor and anti-sphingomyelinase monocional antibody | |
| KR100482249B1 (ko) | 단백질 타이로신 포스파타아제의 세포내 도메인에 대한 항체 | |
| Muñoz et al. | Characterization of monoclonal antibodies specific for 14-kDa human group V secretory phospholipase A2 (hVPLA2) | |
| Nieto-Cerón et al. | Molecular properties of acetylcholinesterase in mouse spleen | |
| WO2001066709A2 (en) | Sphingomyelinase enzymes and uses relating thereto | |
| US20060099681A1 (en) | Human and mouse alkaline ceramidase 1 and skin diseases |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080115 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20080310 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20080310 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20080625 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20080625 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100921 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20101220 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20101224 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20110329 |