JP2001512682A

JP2001512682A - 中性スフィンゴミエリナーゼ

Info

Publication number: JP2001512682A
Application number: JP2000506339A
Authority: JP
Inventors: ヴィルヘルムシュトッフェル; カイホフマン; ステファントミウク
Original assignee: メモレックシュトッフェルゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 1997-08-11
Filing date: 1998-08-11
Publication date: 2001-08-28
Also published as: AU9261798A; EP1021546A1; CA2300977A1; US6740512B1; WO1999007855A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、真核中性スフィンゴミエリナーゼ（nSMase）及びその使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、真核中性スフィンゴミエリナーゼ（eukaryotic neutral sphingomy
elinase）をコードする核酸及びその応用に関する。

【０００２】スフィンゴミエリンは、形質膜の重要な構成要素である。スフィンゴミエリン
の分解は、例えば、セラミド、スフィンゴシン又はスフィンゴシン−１−フォス
フェートのような潜在的な第２メッセンジャーの性質を有するいくつかの物質を
与える。

【０００３】バクテリアの中性スフィンゴミエリナーゼは、分泌された可溶性タンパクであ
る。

【０００４】本発明は、まず第一に真核中性スフィンゴミエリナーゼをコードする核酸を提
供する。真核中性スフィンゴミエリナーゼ（nSMase）は、スフィンゴミエリンを
セラミド及びホスホコリンに切断することを特徴とし、さらにその活性はマグネ
シウムイオンの添加に依存することを特徴とする。それは、膜結合酵素である。
その最大活性は、中性ｐＨ領域で達成される。

【０００５】好ましくは、本発明による核酸は、哺乳類の中性スフィンゴミエリナーゼをコ
ードする核酸である。さらに好ましくは、ヒト又はネズミの中性スフィンゴミエ
リナーゼをコードする。対応する核酸配列は、配列番号３（SEQ.ID.NO.3）及び
配列番号４（SEQ ID.NO.4）にそれぞれ開示されている。

【０００６】核酸配列の一部は、EST配列AA028477及びAA013912（ネズミ）並びにW32352及びAA056024（ヒト）と同一である。

【０００７】ヒト及びネズミの中性スフィンゴミエリナーゼのアミノ酸及び核酸構造を知っ
ている当業者であれば、ヒトnSMaseとネズミnSMaseとの間の高い相同性を考慮し
て、他の真核生物から対応する核酸及びタンパクを容易に発見することができる
。これを行うことにより、当業者は特異的なアフィニティークロマトグラフィー
による精製のための交差反応抗体を使用すること、又は核酸配列に基づいてオリ
ゴヌクレオチドプライマーを合成し、ポリメラーゼ鎖反応を利用した真核生物の
cDNAライブラリにおける所望の核酸を増幅することのいずれかができる。対応す
るcDNAライブラリは、組織試料からmRNAを単離することにより、それ自体知られ
た手法で得ることができ、その後逆転写される。核酸配列から、アミノ酸配列を
遺伝子コードを用いて得ることができる。代わりに、EST（expressed sequence
tags）データ・ベースにおける相同配列を調査することもでき、それらを組み合
わせることもできる。

【０００８】本発明による核酸は、原核又は真核系における真核中性スフィンゴミエリナー
ゼの発現に適している。さらに、遺伝子治療におけるインビボ（in vivo）のnSM
aseの発現にも適し、また特に、相補構造を有するフラグメントの形で、nSMase の発現を低減するためのアンチセンス・ヌクレオチドとしても適当である。

【０００９】本発明による核酸は、それ自体当業者に知られた方法によって化学合成又は遺
伝子設計された（genetically engineered）生物体における増幅によって製造す
ることができる。

【００１０】本発明は、本発明による核酸の発現によって得られ得る真核中性スフィンゴミ
エリナーゼにも関する。

【００１１】本発明によるnSMaseは、遺伝子設計された生物体における発現によって製造す
ることができる。真核発現系は、特に適当である。適当な真核発現系は、当業者
に知られており、例えば、pRc/CMV（Stratagene）である。遺伝子設計された生物体からの精製は、特に過剰発現の場合に、本発明によるnSMaseへの容易で直接
的なアクセスを提供し、さらに大量のそれらの単離を許容する。

【００１２】真核中性スフィンゴミエリナーゼは、好ましくは哺乳類、特にヒト又はネズミ
の中性スフィンゴミエリナーゼである。ヒト及びネズミの中性スフィンゴミエリ
ナーゼのアミノ酸配列は、配列番号１及び２（SEQ.ID.NO.1 and 2）として表されている。

【００１３】ヒト及びネズミのスフィンゴミエリナーゼの分子量は、それぞれ47.6及び47.5
kDaである。バクテリアのnSMaseと比べて、本発明による哺乳類のnSMaseは、N末
端におけるシグナル配列は含まない。疎水性分析から、C末端における２つの隣接する疎水性膜領域は、８つのアミノ酸によって分離されている。それ故、この
タンパクは、酵素の少量の部分だけが細胞外環境に接している間、その触媒活性
領域がシトゾル（cytosol）に向いている膜内在性タンパク(integral membrane
proteins)であると思われる。これは、分泌された可溶性タンパクであるバクテリアのnSMaseと対照的であるが、哺乳類の中性スフィンゴミエリナーゼの性質に
関する従来の研究に従うものである。ノーザンブロット分析によれば、ネズミの
nSMaseの1.7kbのmRNAは、すべての組織において発現される。腎臓、脳、肝臓、心臓及び肺において、ノーザンブロットは、脾臓における発現は低いようである
が、強いシグナルを示す。この測定は、対応する細胞の、測定された酵素活性と
一致しなかった。これは、nSMaseの後転写の調整があることを物語る。

【００１４】本発明による中性スフィンゴミエリナーゼのpH最適条件は、C18スフィンゴミエリンのKm値が1.0〜1.5×10^-5Mの範囲内において6.5〜7.5の範囲内である。この活性は、マグネシウムイオンの存在に依存する。EDTAの添加は、SMaseの活性を抑制する結果となるが、Mn²⁺又はMg²⁺イオンの添加によって復活させることが
できる。0.3〜0.5％のトリトン（Triton）X-100の添加は、酵素活性を増加させる。この活性は、DTT又は2-メルカプトエタノールでの処理による影響は受けないのに対して、20mMのグルタチオン（glutathione）の添加により阻害される。n
SMaseの活性は、スフィンゴミエリンに制限されないが、構造上関連するホスファチジルコリンも、約3％活性で切断される。

【００１５】真核中性スフィンゴミエリナーゼの変異体もまた請求される。「変異体」とい
う用語は、真核中性スフィンゴミエリナーゼの自然発生する対立遺伝子の変化及
び組換えDNA技術によって（特に化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを用いたインビトロにおける突然変異生成によって）製造され、生物学的及び／又は免
疫学的活性に関する真核中性スフィンゴミエリナーゼに対応する発現が起こった
タンパクを包含する。これは、アミノ酸の削除、挿入又は保存的な置換を含むこ
ともある。「保存的な置換」とは、アミノ酸が同じような物理化学的性質を有す
る他のアミノ酸によって置換されることを意味する。

【００１６】従って、例えば以下のアミノ酸は交換することができる。セリンとアラニン、
アラニンとグリシン、メチオニンとセリン、リジンとアルギニン、リジンとセリ
ン。

【００１７】特に、「変異体」という用語は、N末端及び／又はC末端の切断されたタンパク
と同様に、アセチル化、グリコシル化、アミド化及び／又は燐酸化された誘導体
をも含む。

【００１８】 nSMaseの活性の少なくとも一部は、ネズミのnSMaseのフラグメント1-282が、H
EK293細胞において発現したときに、スフィンゴミエリナーゼ活性の増加を示すことが出来なかったので、C末端領域に属するようである。本発明はまた、nSMas
eのC末端フラグメントに関する。nSMase又はその変形が、例えば色素、放射性核
種又はアフィニティー成分のような他の分子と結合される化合物もまた、本発明
による変異体である。

【００１９】真核中性スフィンゴミエリナーゼをコードし、又はそのような核酸と相補的な
核酸もまた請求される。核酸は、例えばDNA、RNA、PNA又はそれらのヌクレアーゼ耐性アナログである場合もある。特に、ヌクレダーゼ耐性アナログは、加水分
解安定化合物によって修飾されたホスホジエステル架橋を有する化合物、例えば
ホスホチオエート、メチルホスホネート等を含む。

【００２０】特に、核酸の短いフラグメントは、アンチセンスヌクレオチドとして適当であ
る。特異性の理由で、それらは好ましくは6以上、さらに好ましくは8以上、最も
好ましくは12以上のヌクレオチドを含むべきである。普及と費用の理由で、それ
らは30ヌクレオチド未満の長さを通常有し、好ましくは24以下、さらに好ましく
は18以下のヌクレオチドを有する。

【００２１】本発明は、診断又は治療の目的のために他の分子、例えば蛍光性色素、放射性
活性ラベル又はアフィニティー成分と結合される核酸の誘導体、本発明による核
酸のフラグメント、これらの核酸に相補的な核酸、及び前記核酸の変異体にも関
する。

【００２２】ここで使われる「フラグメント」とは、5'又は3'又は両方の末端で切断された
核酸を意味する。「変異体」という用語は、これらの核酸が本発明による核酸又
は厳しい条件下でそれらと相補的な核酸とハイブリダイズすることを意味する。
「厳しい環境」という語は、ハイブリダイゼーションが、温度が、正確に相補的
な核酸をアニールするのにちょうど十分なほど低い温度よりも10℃まで低い（そ
の他の条件は同一である）条件で行われることを意味する。例えば、正確に相補
的な核酸が、与えられた条件下で約55℃まで温度を下げてアニールされるならば
、その後の厳しい条件は、45℃以上の温度である。好ましくは、厳しい条件の温
度範囲は、5℃以内であり、さらに好ましくは3℃以内である。

【００２３】さらに、本発明は、本発明によるnSMase又は本発明による核酸に対する抗体に
関する。これらの物質は、特に、診断又はそれ自体が当業者に知られた免疫分析
における使用のため、組織学のため及びnSMaseの過剰発現に関連する条件の処置
のための医薬として適当である。本発明によるそのような抗体は、アジュバンの
存在下で、本発明によるnSMase若しくは核酸又はペプチド及び核酸フラグメント
を用いた予防接種を通じて、それ自体が当業者に知られた方法によって得られる
。

【００２４】さらに、本発明は、本発明によるnSMaseを過剰発現する細胞系に関する。その
ような細胞系は、nSMaseをコードする本発明による核酸を含むベクターの移入に
よって得られる。真核細胞系の場合は、例えば、移入は電気穿孔法によってもた
らされることもある。好ましくは、細胞系は安定して移入される。

【００２５】この関係で、「過剰発現」は、細胞系が本発明による核酸が移入されなかった
細胞系よりもより高いnSMaseの活性を有することを意味する。例えば、適当な真
核細胞系は、細胞系U937、HEK293又はジャーカットを含む。

【００２６】実験において、細胞系は、単位時間あたりのタンパクの0.3〜10μmol／mgの間
の特異的なnSMase活性を示した。

【００２７】図１０は、移入細胞系におけるnSMase発現のノーザン及びウエスタンブロット
分析を示す。部位Aは、ヒト及びネズミのnSMaseのcDNAとハイブリダイズするプライマーを用いた全細胞RNAのRT PCRの結果を示す。部位Bは、コントロールとし
て、ヒトのβ−アクチンのcDNAとハイブリダイズするプライマーを用いた全RNA のT PCRを示す。部位Cは、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動及びポリクローナルの抗nSMase抗体を用いたハイブリダイズ後の異なるHEK293細胞系の形質膜細
胞抽出物のウエスタンブロットを示す。

【００２８】 0.5mMのアラキドン酸の添加は、HEK細胞の過剰発現におけるnSMase活性が３倍
増加する結果となった。

【００２９】さらに本発明は、本発明によるnSMaseのための過剰発現（機能の修得）又は遺
伝的欠乏若しくは欠損（機能の損失）を示すトランスジェニック哺乳類に関する
。哺乳類は、好ましくはげっ歯類、特にマウスである。そのようなトランスジェ
ニック哺乳類は、それ自体が当業者に知られた方法によって得られ、中性スフィ
ンゴミエリナーゼの機能を明らかにするために特に適している。トランスジェニ
ック哺乳類のために、所定の遺伝子の構成は、追加の遺伝子の発現を達成するた
めにDNAマイクロインジェクションによって受精卵の前核内に注入される。胚盤胞内に次に注入されるES細胞のゲノムにおける遺伝子の選択的な変化によって、
遺伝子の機能をスイッチオフする。

【００３０】マウスの突然変異体の発生のための戦略及び構成を、図１１及び１２に示す。

【００３１】トランスジェニック動物は、好ましくは、外部誘導による組織特異方法におい
て一時的に遺伝子をスイッチオンさせたりオフさせたりすることができる動物で
ある。そのようなトランスジェニック動物は、本発明によるnSMaseに関する代謝
及び単一導入経路を明らかにするために特に適している。これは、診断又は治療
適用を順番に可能にする。特に、トランスジェニック哺乳類は、医薬活性物質の
スクリーニングのために適している。

【００３２】本発明による真核中性スフィンゴミエリナーゼ、本発明による核酸及び本発明
による抗体は、医薬及び診断薬中に含まれ、任意にさらに補助剤とともに含まれ
る。そのような医薬及び診断薬は、過剰又は過少発現に基づく、並びに／又は真
核中間スフィンゴミエリナーゼの増加若しくは減少した活性、並びに／又は細胞
増殖、分化、及び／若しくはアポトーシスの障害に基づく疾患の診断及び処置の
ために適している。

【００３３】特に、これらは炎症過程、細胞成長障害、及び代謝障害を含む疾患である。例
えば、それらは、癌又はコレステロールホメオスタシス（アテローム性動脈硬化
）であることもある。

【００３４】本発明による医薬的なスクリーニング法は、少なくとも１つの潜在的な医薬活
性物質の添加と同時に起こるnSMase過剰発現細胞系内の本発明によるnSMaseの発
現又は活性の変化に依存する。それ故、細胞系は、医薬誘導構造の発達及び試験
のために特に適している。

【００３５】本発明は、以下の実施例において更に例示される。

【実施例】

実施例1 核酸のクローニング中性スフィンゴミエリナーゼをコードしている本発明の核酸は、真核発現ベク
ターpRc/CMV(ストラタジーン)のクローニングサイト、NotＩ制限サイトにクロー
ンされた。得られたDNAの配列は、パーキンエルマーDNAシーケンサー 377Aを用いた配列決定法により決定された。

【００３６】実施例２ RNAのクローニング全RNAは、８匹の3週齢CD1ネズミの異なる器官から公知の方法で単離され、ポリ(A⁺)RNAが、オリゴ(dT)セルロース(ベーリンガーマンハイム(Boehringer Man
nheim)、ドイツ)上でのアフィニティー精製で標準方法により単離された。

【００３７】実施例３ U937細胞は、10%の胎児ウシ血清、1μg/mlのペニシリン／ストレプトマイシン
及び0.03%のグルタミンを含むPRMＩ 1640培地中、37℃、5% CO₂下で培養された。遺伝子パルサー(バイオ-ラド)を用いた電気穿孔法により、5×10⁶の細胞は、本発明のnSMaseをコードする1μgの線状プラズミドDNAと共にトランスフェクションされた。安定なクローンの選択は、1mg/mlジーンチシン(geneticin)(G418、
ライフテクノロジーズ、ガイザーズブルグ(Gaithersburg)、MD)を用いて行われた。

【００３８】細胞系から精製されたnSMaseは、タンパク質／時間で0.3から10μmol/mgの間の比活性を有していた。最適pH値は、6.5及び7.5であった。C18スフィンゴミエリンのK_M値は、1.0から1.5×10^-5Mであった。活性は、マグネシウムイオンの存在に依存しており、EDTAの添加により活性は阻害された。

【００３９】実施例４ nSMase活性の測定酵素的活性は、細胞及びネズミの組織において試験された。細胞は、氷で冷や
されたPBSで２回洗浄され、1000×gで沈殿させられた。ペレットは、細胞溶解緩
衝液に再懸濁され、細胞は、凍結及び解凍のサイクルを繰り返すことにより破壊
された。2500×gで2分間遠心した後、0.2%のトリトンX-100を含む細胞溶解緩衝液による抽出が行われ、100,000×gで15分間の遠心が続いて行われた。

【００４０】３週齢のネズミの組織は、冷たい細胞溶解緩衝液中で均質化された。試験する
量のタンパク質及び均質化された組織は、10nM (80,000dpm)[N-¹⁴CH₃]スフィンゴミエリンと共に、最終体積200μlとされ、30分間37℃でインキュベートされた
。その後、100μlの水が添加され、反応しなかった基質はクロロホルム-メタノール(2：1、v/v)抽出により除去された。酵素的に放出されたホスホコリンを含む水相のラジオ活性は、シンチレーションカウンターで測定された。

【００４１】実施例５ポリクローナル抗体ウサギは、鍵穴ツタノハガイ(keyhole limpet)ヘモシアニンにカップリングし
ている合成ペプチドCDPHSDKPFSDHE(ネズミnSMaseの261から273のアミノ酸に対応
している)により免疫化された。ポリクローナル抗体血清は、ハイドロキシアパタイトを用いたクロマトグラフィー及び上記合成ペプチドが結合するカラムを用
いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製された。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトの中性スフィンゴミエリナーゼの遺伝子配列。

【図２】ヒトの中性スフィンゴミエリナーゼの遺伝子配列。

【図３】ヒトの中性スフィンゴミエリナーゼの遺伝子配列。

【図４】ネズミの中性スフィンゴミエリナーゼの遺伝子配列。

【図５】ネズミの中性スフィンゴミエリナーゼの遺伝子配列。

【図６】ネズミの中性スフィンゴミエリナーゼの遺伝子配列。

【図７】ネズミの中性スフィンゴミエリナーゼの遺伝子配列。

【図８】ネズミの中性スフィンゴミエリナーゼの遺伝子配列。

【図９】ネズミの中性スフィンゴミエリナーゼの遺伝子配列。

【図１０】 nSMase過剰発現細胞系のノーザン及びウエスタンブロットの結果。

【図１１】ネズミのノックアウト突然変異体を製造するための戦略。文字は制
限部位を示す。

【図１２】トランスジェニックマウス突然変異体を得るための設計。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年２月１４日（２０００．２．１４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 9/10 Ａ６１Ｐ 35/00 ４Ｃ０８５ 29/00 Ｃ０７Ｋ 16/40 ４Ｈ０４５ 35/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 16/40 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/16 Ｄ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｔ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 9/16 Ａ６１Ｋ 37/54 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＡ (31)優先権主張番号６０／０７８，３８６ (32)優先日平成10年３月18日(1998．3．18) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ホフマンカイドイツ連邦国、ケルンＤ−50931、ヨーゼフ−シュテルツマン−シュトラーセ 52、メドファク、インスティチュートフュアバイオケミー、ラブラトリウムフュアモレキュラーノイロヴィッセンシャフテン (72)発明者トミウクステファンドイツ連邦国、ケルンＤ−50931、ヨーゼフ−シュテルツマン−シュトラーセ 52、メドファク、インスティチュートフュアバイオケミー、ラブラトリウムフュアモレキュラーノイロヴィッセンシャフテンＦターム(参考） 2G045 DA12 DA13 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA11 CA03 CA04 CA12 DA02 GA14 HA01 4B050 CC03 DD11 LL01 LL03 4B065 AA91Y AA94X AC14 BA02 CA31 CA44 CA46 4C084 AA01 AA02 AA06 AA13 BA44 CA53 CA59 DA39 DC22 ZA452 ZB112 ZB212 ZB262 ZC332 4C085 AA13 BB22 DD33 DD88 4H045 AA11 AA30 CA40 DA76 EA50 FA72

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】真核中性スフィンゴミエリナーゼをコードする核酸。
【請求項２】哺乳類の中性スフィンゴミエリナーゼ、特にヒト又はマウスの中性
スフィンゴミエリナーゼをコードすることを特徴とする請求項１に記載の核酸。
【請求項３】上記中性スフィンゴミエリナーゼがスフィンゴミエリンをセラミド
とホスホコリンに切断する能力を有し、かつその活性がマグネシウムイオンの添
加に依存することを特徴とする請求項１及び２の少なくとも一項に記載の核酸。
【請求項４】配列番号３（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３）又は配列番号４（ＳＥＱ．
ＩＤ．ＮＯ．４）に記載の配列を有する請求項１〜３の少なくとも一項に記載の
核酸。
【請求項５】ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ又はそれらのヌクレアーゼ耐性アナログで
あることを特徴とする請求項１〜４の少なくとも一項に記載の核酸。
【請求項６】ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はゲノミックＤＮＡであることを特徴とする
請求項１〜５の少なくとも一項に記載の核酸。
【請求項７】請求項１〜５の少なくとも一項に記載の核酸に相補的であることを
特徴とする核酸。
【請求項８】請求項１〜６に記載の核酸、特に配列番号１（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ
．１）又は配列番号２（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．２）に記載の配列を有する、核酸
の発現により得られ得る真核中性スフィンゴミエリナーゼ。
【請求項９】請求項８に記載の真核中性スフィンゴミエリナーゼ又は請求項１〜
７の少なくとも一項に記載の核酸に対して向けられることを特徴とする抗体。
【請求項１０】請求項８に記載の真核中性スフィンゴミエリナーゼを過剰発現す
ることを特徴とする細胞系。
【請求項１１】真核中性スフィンゴミエリナーゼを発現し、かつ細胞系Ｕ９３７
、ＨＥＫ２９３又はジャーカットに基づく細胞系であることを特徴とする請求項
１０に記載の細胞系。
【請求項１２】真核中性スフィンゴミエリナーゼについての過剰発現(機能の獲得)又は遺伝的欠乏若しくは欠損(機能の喪失)を示すトランスジェニック哺乳類。
【請求項１３】げっ歯類であることを特徴とする請求項１２に記載のトランスジ
ェニック哺乳類。
【請求項１４】さらなる補助剤とともに、請求項８に記載の真核中性スフィンゴ
ミエリナーゼ、請求項１〜７の少なくとも一項に記載の核酸、及び／又は請求項
９に記載の抗体を含有する医薬。
【請求項１５】さらなる補助剤とともに、請求項８に記載の真核中性スフィンゴ
ミエリナーゼ、請求項１〜７の少なくとも一項に記載の核酸、及び／又は請求項
９に記載の抗体を含有する診断薬。
【請求項１６】過剰若しくは過少発現、並びに／又は真核中性スフィンゴミエリ
ナーゼ活性の増加若しくは減少、並びに／又は細胞増殖、細胞分化、及び／若し
くはアポトーシスの障害に基づく疾患の診断及び処置のための請求項１４に記載
の医薬又は請求項１５に記載の診断薬の使用。
【請求項１７】前記疾患が炎症過程、細胞成長障害、癌及び／又はコレステロー
ルホメオスタシス（アテローム性動脈硬化）のような代謝障害である請求項１５
に記載の使用。
【請求項１８】少なくとも１つの潜在的医薬活性物質の添加と同時に請求項１０
に記載の細胞系中の真核中性スフィンゴミエリナーゼの発現又は活性の変化を測
定することを特徴とする活性物質のスクリーニング方法。
【請求項１９】医薬誘導構造を開発し、かつ試験するための請求項１０に記載の
細胞系の使用。
【請求項２０】化学ペプチド合成による、又は遺伝子設計された生物体、特に真
核発現系における発現による、請求項８に記載の真核中性スフィンゴミエリナー
ゼの調製方法。
【請求項２１】化学合成による、又は遺伝子設計された生物体における増幅によ
る、請求項１〜７の少なくとも一項に記載の核酸の調製方法。
【請求項２２】コード領域（エクソン）、特に配列番号５（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ
．５）又は配列番号６（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．６）に記載の配列を有する遺伝子
に加えて、非コード領域（イントロン）を含む真核中性スフィンゴミエリナーゼ
遺伝子であることを特徴とする請求項５に記載の核酸。
【請求項２３】請求項８に記載の中性スフィンゴミエリナーゼの変異体。
【請求項２４】誘導体、フラグメント又はそのような核酸の変異体であることを
特徴とする請求項１〜７又は２２の少なくとも一項に記載の核酸。