JP2001512682A - 中性スフィンゴミエリナーゼ - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、真核中性スフィンゴミエリナーゼ(nSMase)及びその使用に関する。
Description
【0001】 本発明は、真核中性スフィンゴミエリナーゼ(eukaryotic neutral sphingomy
elinase)をコードする核酸及びその応用に関する。
elinase)をコードする核酸及びその応用に関する。
【0002】 スフィンゴミエリンは、形質膜の重要な構成要素である。スフィンゴミエリン
の分解は、例えば、セラミド、スフィンゴシン又はスフィンゴシン−1−フォス
フェートのような潜在的な第2メッセンジャーの性質を有するいくつかの物質を
与える。
の分解は、例えば、セラミド、スフィンゴシン又はスフィンゴシン−1−フォス
フェートのような潜在的な第2メッセンジャーの性質を有するいくつかの物質を
与える。
【0003】 バクテリアの中性スフィンゴミエリナーゼは、分泌された可溶性タンパクであ
る。
る。
【0004】 本発明は、まず第一に真核中性スフィンゴミエリナーゼをコードする核酸を提
供する。真核中性スフィンゴミエリナーゼ(nSMase)は、スフィンゴミエリンを
セラミド及びホスホコリンに切断することを特徴とし、さらにその活性はマグネ
シウムイオンの添加に依存することを特徴とする。それは、膜結合酵素である。
その最大活性は、中性pH領域で達成される。
供する。真核中性スフィンゴミエリナーゼ(nSMase)は、スフィンゴミエリンを
セラミド及びホスホコリンに切断することを特徴とし、さらにその活性はマグネ
シウムイオンの添加に依存することを特徴とする。それは、膜結合酵素である。
その最大活性は、中性pH領域で達成される。
【0005】 好ましくは、本発明による核酸は、哺乳類の中性スフィンゴミエリナーゼをコ
ードする核酸である。さらに好ましくは、ヒト又はネズミの中性スフィンゴミエ
リナーゼをコードする。対応する核酸配列は、配列番号3(SEQ.ID.NO.3) 及び
配列番号4(SEQ ID.NO.4)にそれぞれ開示されている。
ードする核酸である。さらに好ましくは、ヒト又はネズミの中性スフィンゴミエ
リナーゼをコードする。対応する核酸配列は、配列番号3(SEQ.ID.NO.3) 及び
配列番号4(SEQ ID.NO.4)にそれぞれ開示されている。
【0006】 核酸配列の一部は、EST配列AA028477及びAA013912(ネズミ)並びにW32352及 びAA056024(ヒト)と同一である。
【0007】 ヒト及びネズミの中性スフィンゴミエリナーゼのアミノ酸及び核酸構造を知っ
ている当業者であれば、ヒトnSMaseとネズミnSMaseとの間の高い相同性を考慮し
て、他の真核生物から対応する核酸及びタンパクを容易に発見することができる
。これを行うことにより、当業者は特異的なアフィニティークロマトグラフィー
による精製のための交差反応抗体を使用すること、又は核酸配列に基づいてオリ
ゴヌクレオチドプライマーを合成し、ポリメラーゼ鎖反応を利用した真核生物の
cDNAライブラリにおける所望の核酸を増幅することのいずれかができる。対応す
るcDNAライブラリは、組織試料からmRNAを単離することにより、それ自体知られ
た手法で得ることができ、その後逆転写される。核酸配列から、アミノ酸配列を
遺伝子コードを用いて得ることができる。代わりに、EST(expressed sequence
tags)データ・ベースにおける相同配列を調査することもでき、それらを組み合
わせることもできる。
ている当業者であれば、ヒトnSMaseとネズミnSMaseとの間の高い相同性を考慮し
て、他の真核生物から対応する核酸及びタンパクを容易に発見することができる
。これを行うことにより、当業者は特異的なアフィニティークロマトグラフィー
による精製のための交差反応抗体を使用すること、又は核酸配列に基づいてオリ
ゴヌクレオチドプライマーを合成し、ポリメラーゼ鎖反応を利用した真核生物の
cDNAライブラリにおける所望の核酸を増幅することのいずれかができる。対応す
るcDNAライブラリは、組織試料からmRNAを単離することにより、それ自体知られ
た手法で得ることができ、その後逆転写される。核酸配列から、アミノ酸配列を
遺伝子コードを用いて得ることができる。代わりに、EST(expressed sequence
tags)データ・ベースにおける相同配列を調査することもでき、それらを組み合
わせることもできる。
【0008】 本発明による核酸は、原核又は真核系における真核中性スフィンゴミエリナー
ゼの発現に適している。さらに、遺伝子治療におけるインビボ(in vivo)のnSM
aseの発現にも適し、また特に、相補構造を有するフラグメントの形で、nSMase の発現を低減するためのアンチセンス・ヌクレオチドとしても適当である。
ゼの発現に適している。さらに、遺伝子治療におけるインビボ(in vivo)のnSM
aseの発現にも適し、また特に、相補構造を有するフラグメントの形で、nSMase の発現を低減するためのアンチセンス・ヌクレオチドとしても適当である。
【0009】 本発明による核酸は、それ自体当業者に知られた方法によって化学合成又は遺
伝子設計された(genetically engineered)生物体における増幅によって製造す
ることができる。
伝子設計された(genetically engineered)生物体における増幅によって製造す
ることができる。
【0010】 本発明は、本発明による核酸の発現によって得られ得る真核中性スフィンゴミ
エリナーゼにも関する。
エリナーゼにも関する。
【0011】 本発明によるnSMaseは、遺伝子設計された生物体における発現によって製造す
ることができる。真核発現系は、特に適当である。適当な真核発現系は、当業者
に知られており、例えば、pRc/CMV(Stratagene)である。遺伝子設計された生 物体からの精製は、特に過剰発現の場合に、本発明によるnSMaseへの容易で直接
的なアクセスを提供し、さらに大量のそれらの単離を許容する。
ることができる。真核発現系は、特に適当である。適当な真核発現系は、当業者
に知られており、例えば、pRc/CMV(Stratagene)である。遺伝子設計された生 物体からの精製は、特に過剰発現の場合に、本発明によるnSMaseへの容易で直接
的なアクセスを提供し、さらに大量のそれらの単離を許容する。
【0012】 真核中性スフィンゴミエリナーゼは、好ましくは哺乳類、特にヒト又はネズミ
の中性スフィンゴミエリナーゼである。ヒト及びネズミの中性スフィンゴミエリ
ナーゼのアミノ酸配列は、配列番号1及び2(SEQ.ID.NO.1 and 2)として表さ れている。
の中性スフィンゴミエリナーゼである。ヒト及びネズミの中性スフィンゴミエリ
ナーゼのアミノ酸配列は、配列番号1及び2(SEQ.ID.NO.1 and 2)として表さ れている。
【0013】 ヒト及びネズミのスフィンゴミエリナーゼの分子量は、それぞれ47.6及び47.5
kDaである。バクテリアのnSMaseと比べて、本発明による哺乳類のnSMaseは、N末
端におけるシグナル配列は含まない。疎水性分析から、C末端における2つの隣 接する疎水性膜領域は、8つのアミノ酸によって分離されている。それ故、この
タンパクは、酵素の少量の部分だけが細胞外環境に接している間、その触媒活性
領域がシトゾル(cytosol)に向いている膜内在性タンパク(integral membrane
proteins)であると思われる。これは、分泌された可溶性タンパクであるバクテ リアのnSMaseと対照的であるが、哺乳類の中性スフィンゴミエリナーゼの性質に
関する従来の研究に従うものである。ノーザンブロット分析によれば、ネズミの
nSMaseの1.7kbのmRNAは、すべての組織において発現される。腎臓、脳、肝臓、 心臓及び肺において、ノーザンブロットは、脾臓における発現は低いようである
が、強いシグナルを示す。この測定は、対応する細胞の、測定された酵素活性と
一致しなかった。これは、nSMaseの後転写の調整があることを物語る。
kDaである。バクテリアのnSMaseと比べて、本発明による哺乳類のnSMaseは、N末
端におけるシグナル配列は含まない。疎水性分析から、C末端における2つの隣 接する疎水性膜領域は、8つのアミノ酸によって分離されている。それ故、この
タンパクは、酵素の少量の部分だけが細胞外環境に接している間、その触媒活性
領域がシトゾル(cytosol)に向いている膜内在性タンパク(integral membrane
proteins)であると思われる。これは、分泌された可溶性タンパクであるバクテ リアのnSMaseと対照的であるが、哺乳類の中性スフィンゴミエリナーゼの性質に
関する従来の研究に従うものである。ノーザンブロット分析によれば、ネズミの
nSMaseの1.7kbのmRNAは、すべての組織において発現される。腎臓、脳、肝臓、 心臓及び肺において、ノーザンブロットは、脾臓における発現は低いようである
が、強いシグナルを示す。この測定は、対応する細胞の、測定された酵素活性と
一致しなかった。これは、nSMaseの後転写の調整があることを物語る。
【0014】 本発明による中性スフィンゴミエリナーゼのpH最適条件は、C18スフィンゴミ エリンのKm値が1.0〜1.5×10-5Mの範囲内において6.5〜7.5の範囲内である。こ の活性は、マグネシウムイオンの存在に依存する。EDTAの添加は、SMaseの活性 を抑制する結果となるが、Mn2+又はMg2+イオンの添加によって復活させることが
できる。0.3〜0.5%のトリトン(Triton)X-100の添加は、酵素活性を増加させ る。この活性は、DTT又は2-メルカプトエタノールでの処理による影響は受けな いのに対して、20mMのグルタチオン(glutathione)の添加により阻害される。n
SMaseの活性は、スフィンゴミエリンに制限されないが、構造上関連するホスフ ァチジルコリンも、約3%活性で切断される。
できる。0.3〜0.5%のトリトン(Triton)X-100の添加は、酵素活性を増加させ る。この活性は、DTT又は2-メルカプトエタノールでの処理による影響は受けな いのに対して、20mMのグルタチオン(glutathione)の添加により阻害される。n
SMaseの活性は、スフィンゴミエリンに制限されないが、構造上関連するホスフ ァチジルコリンも、約3%活性で切断される。
【0015】 真核中性スフィンゴミエリナーゼの変異体もまた請求される。「変異体」とい
う用語は、真核中性スフィンゴミエリナーゼの自然発生する対立遺伝子の変化及
び組換えDNA技術によって(特に化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを用い たインビトロにおける突然変異生成によって)製造され、生物学的及び/又は免
疫学的活性に関する真核中性スフィンゴミエリナーゼに対応する発現が起こった
タンパクを包含する。これは、アミノ酸の削除、挿入又は保存的な置換を含むこ
ともある。「保存的な置換」とは、アミノ酸が同じような物理化学的性質を有す
る他のアミノ酸によって置換されることを意味する。
う用語は、真核中性スフィンゴミエリナーゼの自然発生する対立遺伝子の変化及
び組換えDNA技術によって(特に化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを用い たインビトロにおける突然変異生成によって)製造され、生物学的及び/又は免
疫学的活性に関する真核中性スフィンゴミエリナーゼに対応する発現が起こった
タンパクを包含する。これは、アミノ酸の削除、挿入又は保存的な置換を含むこ
ともある。「保存的な置換」とは、アミノ酸が同じような物理化学的性質を有す
る他のアミノ酸によって置換されることを意味する。
【0016】 従って、例えば以下のアミノ酸は交換することができる。セリンとアラニン、
アラニンとグリシン、メチオニンとセリン、リジンとアルギニン、リジンとセリ
ン。
アラニンとグリシン、メチオニンとセリン、リジンとアルギニン、リジンとセリ
ン。
【0017】 特に、「変異体」という用語は、N末端及び/又はC末端の切断されたタンパク
と同様に、アセチル化、グリコシル化、アミド化及び/又は燐酸化された誘導体
をも含む。
と同様に、アセチル化、グリコシル化、アミド化及び/又は燐酸化された誘導体
をも含む。
【0018】 nSMaseの活性の少なくとも一部は、ネズミのnSMaseのフラグメント1-282が、H
EK293細胞において発現したときに、スフィンゴミエリナーゼ活性の増加を示す ことが出来なかったので、C末端領域に属するようである。本発明はまた、nSMas
eのC末端フラグメントに関する。nSMase又はその変形が、例えば色素、放射性核
種又はアフィニティー成分のような他の分子と結合される化合物もまた、本発明
による変異体である。
EK293細胞において発現したときに、スフィンゴミエリナーゼ活性の増加を示す ことが出来なかったので、C末端領域に属するようである。本発明はまた、nSMas
eのC末端フラグメントに関する。nSMase又はその変形が、例えば色素、放射性核
種又はアフィニティー成分のような他の分子と結合される化合物もまた、本発明
による変異体である。
【0019】 真核中性スフィンゴミエリナーゼをコードし、又はそのような核酸と相補的な
核酸もまた請求される。核酸は、例えばDNA、RNA、PNA又はそれらのヌクレアー ゼ耐性アナログである場合もある。特に、ヌクレダーゼ耐性アナログは、加水分
解安定化合物によって修飾されたホスホジエステル架橋を有する化合物、例えば
ホスホチオエート、メチルホスホネート等を含む。
核酸もまた請求される。核酸は、例えばDNA、RNA、PNA又はそれらのヌクレアー ゼ耐性アナログである場合もある。特に、ヌクレダーゼ耐性アナログは、加水分
解安定化合物によって修飾されたホスホジエステル架橋を有する化合物、例えば
ホスホチオエート、メチルホスホネート等を含む。
【0020】 特に、核酸の短いフラグメントは、アンチセンスヌクレオチドとして適当であ
る。特異性の理由で、それらは好ましくは6以上、さらに好ましくは8以上、最も
好ましくは12以上のヌクレオチドを含むべきである。普及と費用の理由で、それ
らは30ヌクレオチド未満の長さを通常有し、好ましくは24以下、さらに好ましく
は18以下のヌクレオチドを有する。
る。特異性の理由で、それらは好ましくは6以上、さらに好ましくは8以上、最も
好ましくは12以上のヌクレオチドを含むべきである。普及と費用の理由で、それ
らは30ヌクレオチド未満の長さを通常有し、好ましくは24以下、さらに好ましく
は18以下のヌクレオチドを有する。
【0021】 本発明は、診断又は治療の目的のために他の分子、例えば蛍光性色素、放射性
活性ラベル又はアフィニティー成分と結合される核酸の誘導体、本発明による核
酸のフラグメント、これらの核酸に相補的な核酸、及び前記核酸の変異体にも関
する。
活性ラベル又はアフィニティー成分と結合される核酸の誘導体、本発明による核
酸のフラグメント、これらの核酸に相補的な核酸、及び前記核酸の変異体にも関
する。
【0022】 ここで使われる「フラグメント」とは、5'又は3'又は両方の末端で切断された
核酸を意味する。「変異体」という用語は、これらの核酸が本発明による核酸又
は厳しい条件下でそれらと相補的な核酸とハイブリダイズすることを意味する。
「厳しい環境」という語は、ハイブリダイゼーションが、温度が、正確に相補的
な核酸をアニールするのにちょうど十分なほど低い温度よりも10℃まで低い(そ
の他の条件は同一である)条件で行われることを意味する。例えば、正確に相補
的な核酸が、与えられた条件下で約55℃まで温度を下げてアニールされるならば
、その後の厳しい条件は、45℃以上の温度である。好ましくは、厳しい条件の温
度範囲は、5℃以内であり、さらに好ましくは3℃以内である。
核酸を意味する。「変異体」という用語は、これらの核酸が本発明による核酸又
は厳しい条件下でそれらと相補的な核酸とハイブリダイズすることを意味する。
「厳しい環境」という語は、ハイブリダイゼーションが、温度が、正確に相補的
な核酸をアニールするのにちょうど十分なほど低い温度よりも10℃まで低い(そ
の他の条件は同一である)条件で行われることを意味する。例えば、正確に相補
的な核酸が、与えられた条件下で約55℃まで温度を下げてアニールされるならば
、その後の厳しい条件は、45℃以上の温度である。好ましくは、厳しい条件の温
度範囲は、5℃以内であり、さらに好ましくは3℃以内である。
【0023】 さらに、本発明は、本発明によるnSMase又は本発明による核酸に対する抗体に
関する。これらの物質は、特に、診断又はそれ自体が当業者に知られた免疫分析
における使用のため、組織学のため及びnSMaseの過剰発現に関連する条件の処置
のための医薬として適当である。本発明によるそのような抗体は、アジュバンの
存在下で、本発明によるnSMase若しくは核酸又はペプチド及び核酸フラグメント
を用いた予防接種を通じて、それ自体が当業者に知られた方法によって得られる
。
関する。これらの物質は、特に、診断又はそれ自体が当業者に知られた免疫分析
における使用のため、組織学のため及びnSMaseの過剰発現に関連する条件の処置
のための医薬として適当である。本発明によるそのような抗体は、アジュバンの
存在下で、本発明によるnSMase若しくは核酸又はペプチド及び核酸フラグメント
を用いた予防接種を通じて、それ自体が当業者に知られた方法によって得られる
。
【0024】 さらに、本発明は、本発明によるnSMaseを過剰発現する細胞系に関する。その
ような細胞系は、nSMaseをコードする本発明による核酸を含むベクターの移入に
よって得られる。真核細胞系の場合は、例えば、移入は電気穿孔法によってもた
らされることもある。好ましくは、細胞系は安定して移入される。
ような細胞系は、nSMaseをコードする本発明による核酸を含むベクターの移入に
よって得られる。真核細胞系の場合は、例えば、移入は電気穿孔法によってもた
らされることもある。好ましくは、細胞系は安定して移入される。
【0025】 この関係で、「過剰発現」は、細胞系が本発明による核酸が移入されなかった
細胞系よりもより高いnSMaseの活性を有することを意味する。例えば、適当な真
核細胞系は、細胞系U937、HEK293又はジャーカットを含む。
細胞系よりもより高いnSMaseの活性を有することを意味する。例えば、適当な真
核細胞系は、細胞系U937、HEK293又はジャーカットを含む。
【0026】 実験において、細胞系は、単位時間あたりのタンパクの0.3〜10μmol/mgの間
の特異的なnSMase活性を示した。
の特異的なnSMase活性を示した。
【0027】 図10は、移入細胞系におけるnSMase発現のノーザン及びウエスタンブロット
分析を示す。部位Aは、ヒト及びネズミのnSMaseのcDNAとハイブリダイズするプ ライマーを用いた全細胞RNAのRT PCRの結果を示す。部位Bは、コントロールとし
て、ヒトのβ−アクチンのcDNAとハイブリダイズするプライマーを用いた全RNA のT PCRを示す。部位Cは、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動及びポリクロー ナルの抗nSMase抗体を用いたハイブリダイズ後の異なるHEK293細胞系の形質膜細
胞抽出物のウエスタンブロットを示す。
分析を示す。部位Aは、ヒト及びネズミのnSMaseのcDNAとハイブリダイズするプ ライマーを用いた全細胞RNAのRT PCRの結果を示す。部位Bは、コントロールとし
て、ヒトのβ−アクチンのcDNAとハイブリダイズするプライマーを用いた全RNA のT PCRを示す。部位Cは、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動及びポリクロー ナルの抗nSMase抗体を用いたハイブリダイズ後の異なるHEK293細胞系の形質膜細
胞抽出物のウエスタンブロットを示す。
【0028】 0.5mMのアラキドン酸の添加は、HEK細胞の過剰発現におけるnSMase活性が3倍
増加する結果となった。
増加する結果となった。
【0029】 さらに本発明は、本発明によるnSMaseのための過剰発現(機能の修得)又は遺
伝的欠乏若しくは欠損(機能の損失)を示すトランスジェニック哺乳類に関する
。哺乳類は、好ましくはげっ歯類、特にマウスである。そのようなトランスジェ
ニック哺乳類は、それ自体が当業者に知られた方法によって得られ、中性スフィ
ンゴミエリナーゼの機能を明らかにするために特に適している。トランスジェニ
ック哺乳類のために、所定の遺伝子の構成は、追加の遺伝子の発現を達成するた
めにDNAマイクロインジェクションによって受精卵の前核内に注入される。胚盤 胞内に次に注入されるES細胞のゲノムにおける遺伝子の選択的な変化によって、
遺伝子の機能をスイッチオフする。
伝的欠乏若しくは欠損(機能の損失)を示すトランスジェニック哺乳類に関する
。哺乳類は、好ましくはげっ歯類、特にマウスである。そのようなトランスジェ
ニック哺乳類は、それ自体が当業者に知られた方法によって得られ、中性スフィ
ンゴミエリナーゼの機能を明らかにするために特に適している。トランスジェニ
ック哺乳類のために、所定の遺伝子の構成は、追加の遺伝子の発現を達成するた
めにDNAマイクロインジェクションによって受精卵の前核内に注入される。胚盤 胞内に次に注入されるES細胞のゲノムにおける遺伝子の選択的な変化によって、
遺伝子の機能をスイッチオフする。
【0030】 マウスの突然変異体の発生のための戦略及び構成を、図11及び12に示す。
【0031】 トランスジェニック動物は、好ましくは、外部誘導による組織特異方法におい
て一時的に遺伝子をスイッチオンさせたりオフさせたりすることができる動物で
ある。そのようなトランスジェニック動物は、本発明によるnSMaseに関する代謝
及び単一導入経路を明らかにするために特に適している。これは、診断又は治療
適用を順番に可能にする。特に、トランスジェニック哺乳類は、医薬活性物質の
スクリーニングのために適している。
て一時的に遺伝子をスイッチオンさせたりオフさせたりすることができる動物で
ある。そのようなトランスジェニック動物は、本発明によるnSMaseに関する代謝
及び単一導入経路を明らかにするために特に適している。これは、診断又は治療
適用を順番に可能にする。特に、トランスジェニック哺乳類は、医薬活性物質の
スクリーニングのために適している。
【0032】 本発明による真核中性スフィンゴミエリナーゼ、本発明による核酸及び本発明
による抗体は、医薬及び診断薬中に含まれ、任意にさらに補助剤とともに含まれ
る。そのような医薬及び診断薬は、過剰又は過少発現に基づく、並びに/又は真
核中間スフィンゴミエリナーゼの増加若しくは減少した活性、並びに/又は細胞
増殖、分化、及び/若しくはアポトーシスの障害に基づく疾患の診断及び処置の
ために適している。
による抗体は、医薬及び診断薬中に含まれ、任意にさらに補助剤とともに含まれ
る。そのような医薬及び診断薬は、過剰又は過少発現に基づく、並びに/又は真
核中間スフィンゴミエリナーゼの増加若しくは減少した活性、並びに/又は細胞
増殖、分化、及び/若しくはアポトーシスの障害に基づく疾患の診断及び処置の
ために適している。
【0033】 特に、これらは炎症過程、細胞成長障害、及び代謝障害を含む疾患である。例
えば、それらは、癌又はコレステロールホメオスタシス(アテローム性動脈硬化
)であることもある。
えば、それらは、癌又はコレステロールホメオスタシス(アテローム性動脈硬化
)であることもある。
【0034】 本発明による医薬的なスクリーニング法は、少なくとも1つの潜在的な医薬活
性物質の添加と同時に起こるnSMase過剰発現細胞系内の本発明によるnSMaseの発
現又は活性の変化に依存する。それ故、細胞系は、医薬誘導構造の発達及び試験
のために特に適している。
性物質の添加と同時に起こるnSMase過剰発現細胞系内の本発明によるnSMaseの発
現又は活性の変化に依存する。それ故、細胞系は、医薬誘導構造の発達及び試験
のために特に適している。
【0035】 本発明は、以下の実施例において更に例示される。
実施例1 核酸のクローニング 中性スフィンゴミエリナーゼをコードしている本発明の核酸は、真核発現ベク
ターpRc/CMV(ストラタジーン)のクローニングサイト、NotI制限サイトにクロー
ンされた。得られたDNAの配列は、パーキンエルマーDNAシーケンサー 377Aを用 いた配列決定法により決定された。
ターpRc/CMV(ストラタジーン)のクローニングサイト、NotI制限サイトにクロー
ンされた。得られたDNAの配列は、パーキンエルマーDNAシーケンサー 377Aを用 いた配列決定法により決定された。
【0036】 実施例2 RNAのクローニング 全RNAは、8匹の3週齢CD1ネズミの異なる器官から公知の方法で単離され、ポ リ(A+)RNAが、オリゴ(dT)セルロース(ベーリンガー マンハイム(Boehringer Man
nheim)、ドイツ)上でのアフィニティー精製で標準方法により単離された。
nheim)、ドイツ)上でのアフィニティー精製で標準方法により単離された。
【0037】 実施例3 U937細胞は、10%の胎児ウシ血清、1μg/mlのペニシリン/ストレプトマイシン
及び0.03%のグルタミンを含むPRMI 1640培地中、37℃、5% CO2下で培養された 。遺伝子パルサー(バイオ-ラド)を用いた電気穿孔法により、5×106の細胞は、 本発明のnSMaseをコードする1μgの線状プラズミドDNAと共にトランスフェクシ ョンされた。安定なクローンの選択は、1mg/mlジーンチシン(geneticin)(G418、
ライフテクノロジーズ、ガイザーズブルグ(Gaithersburg)、MD)を用いて行われ た。
及び0.03%のグルタミンを含むPRMI 1640培地中、37℃、5% CO2下で培養された 。遺伝子パルサー(バイオ-ラド)を用いた電気穿孔法により、5×106の細胞は、 本発明のnSMaseをコードする1μgの線状プラズミドDNAと共にトランスフェクシ ョンされた。安定なクローンの選択は、1mg/mlジーンチシン(geneticin)(G418、
ライフテクノロジーズ、ガイザーズブルグ(Gaithersburg)、MD)を用いて行われ た。
【0038】 細胞系から精製されたnSMaseは、タンパク質/時間で0.3から10μmol/mgの間 の比活性を有していた。最適pH値は、6.5及び7.5であった。C18スフィンゴミエ リンのKM値は、1.0から1.5×10-5Mであった。活性は、マグネシウムイオンの存 在に依存しており、EDTAの添加により活性は阻害された。
【0039】 実施例4 nSMase活性の測定 酵素的活性は、細胞及びネズミの組織において試験された。細胞は、氷で冷や
されたPBSで2回洗浄され、1000×gで沈殿させられた。ペレットは、細胞溶解緩
衝液に再懸濁され、細胞は、凍結及び解凍のサイクルを繰り返すことにより破壊
された。2500×gで2分間遠心した後、0.2%のトリトンX-100を含む細胞溶解緩衝 液による抽出が行われ、100,000×gで15分間の遠心が続いて行われた。
されたPBSで2回洗浄され、1000×gで沈殿させられた。ペレットは、細胞溶解緩
衝液に再懸濁され、細胞は、凍結及び解凍のサイクルを繰り返すことにより破壊
された。2500×gで2分間遠心した後、0.2%のトリトンX-100を含む細胞溶解緩衝 液による抽出が行われ、100,000×gで15分間の遠心が続いて行われた。
【0040】 3週齢のネズミの組織は、冷たい細胞溶解緩衝液中で均質化された。試験する
量のタンパク質及び均質化された組織は、10nM (80,000dpm)[N-14CH3]スフィン ゴミエリンと共に、最終体積200μlとされ、30分間37℃でインキュベートされた
。その後、100μlの水が添加され、反応しなかった基質はクロロホルム-メタノ ール(2:1、v/v)抽出により除去された。酵素的に放出されたホスホコリンを含 む水相のラジオ活性は、シンチレーションカウンターで測定された。
量のタンパク質及び均質化された組織は、10nM (80,000dpm)[N-14CH3]スフィン ゴミエリンと共に、最終体積200μlとされ、30分間37℃でインキュベートされた
。その後、100μlの水が添加され、反応しなかった基質はクロロホルム-メタノ ール(2:1、v/v)抽出により除去された。酵素的に放出されたホスホコリンを含 む水相のラジオ活性は、シンチレーションカウンターで測定された。
【0041】 実施例5 ポリクローナル抗体 ウサギは、鍵穴ツタノハガイ(keyhole limpet)ヘモシアニンにカップリングし
ている合成ペプチドCDPHSDKPFSDHE(ネズミnSMaseの261から273のアミノ酸に対応
している)により免疫化された。ポリクローナル抗体血清は、ハイドロキシアパ タイトを用いたクロマトグラフィー及び上記合成ペプチドが結合するカラムを用
いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製された。
ている合成ペプチドCDPHSDKPFSDHE(ネズミnSMaseの261から273のアミノ酸に対応
している)により免疫化された。ポリクローナル抗体血清は、ハイドロキシアパ タイトを用いたクロマトグラフィー及び上記合成ペプチドが結合するカラムを用
いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製された。
【配列表】
【図1】 ヒトの中性スフィンゴミエリナーゼの遺伝子配列。
【図2】 ヒトの中性スフィンゴミエリナーゼの遺伝子配列。
【図3】 ヒトの中性スフィンゴミエリナーゼの遺伝子配列。
【図4】 ネズミの中性スフィンゴミエリナーゼの遺伝子配列。
【図5】 ネズミの中性スフィンゴミエリナーゼの遺伝子配列。
【図6】 ネズミの中性スフィンゴミエリナーゼの遺伝子配列。
【図7】 ネズミの中性スフィンゴミエリナーゼの遺伝子配列。
【図8】 ネズミの中性スフィンゴミエリナーゼの遺伝子配列。
【図9】 ネズミの中性スフィンゴミエリナーゼの遺伝子配列。
【図10】 nSMase過剰発現細胞系のノーザン及びウエスタンブロットの結果。
【図11】 ネズミのノックアウト突然変異体を製造するための戦略。文字は制
限部位を示す。
限部位を示す。
【図12】 トランスジェニックマウス突然変異体を得るための設計。
【手続補正書】特許協力条約第34条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成12年2月14日(2000.2.14)
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61P 9/10 A61P 35/00 4C085 29/00 C07K 16/40 4H045 35/00 C12N 1/15 C07K 16/40 1/19 C12N 1/15 1/21 1/19 9/16 D 1/21 G01N 33/50 T 5/10 C12N 15/00 ZNAA 9/16 A61K 37/54 G01N 33/50 C12N 5/00 B A (31)優先権主張番号 60/078,386 (32)優先日 平成10年3月18日(1998.3.18) (33)優先権主張国 米国(US) (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SZ,UG,ZW),EA(AM ,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM) ,AL,AU,BA,BB,BG,BR,CA,CN, CU,CZ,DE,EE,GE,HR,HU,ID,I L,IS,JP,KP,KR,LC,LK,LR,LT ,LV,MG,MK,MN,MX,NO,NZ,PL, RO,SG,SI,SK,SL,TR,TT,UA,U S,UZ,VN,YU (72)発明者 ホフマン カイ ドイツ連邦国、ケルン D−50931、ヨー ゼフ−シュテルツマン−シュトラーセ 52、メド ファク、インスティチュート フュア バイオケミー、ラブラトリウム フュア モレキュラー ノイロヴィッセン シャフテン (72)発明者 トミウク ステファン ドイツ連邦国、ケルン D−50931、ヨー ゼフ−シュテルツマン−シュトラーセ 52、メド ファク、インスティチュート フュア バイオケミー、ラブラトリウム フュア モレキュラー ノイロヴィッセン シャフテン Fターム(参考) 2G045 DA12 DA13 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA11 CA03 CA04 CA12 DA02 GA14 HA01 4B050 CC03 DD11 LL01 LL03 4B065 AA91Y AA94X AC14 BA02 CA31 CA44 CA46 4C084 AA01 AA02 AA06 AA13 BA44 CA53 CA59 DA39 DC22 ZA452 ZB112 ZB212 ZB262 ZC332 4C085 AA13 BB22 DD33 DD88 4H045 AA11 AA30 CA40 DA76 EA50 FA72
Claims (24)
- 【請求項1】真核中性スフィンゴミエリナーゼをコードする核酸。
- 【請求項2】哺乳類の中性スフィンゴミエリナーゼ、特にヒト又はマウスの中性
スフィンゴミエリナーゼをコードすることを特徴とする請求項1に記載の核酸。 - 【請求項3】上記中性スフィンゴミエリナーゼがスフィンゴミエリンをセラミド
とホスホコリンに切断する能力を有し、かつその活性がマグネシウムイオンの添
加に依存することを特徴とする請求項1及び2の少なくとも一項に記載の核酸。 - 【請求項4】配列番号3(SEQ.ID.NO.3)又は配列番号4(SEQ.
ID.NO.4)に記載の配列を有する請求項1〜3の少なくとも一項に記載の
核酸。 - 【請求項5】DNA、RNA、PNA又はそれらのヌクレアーゼ耐性アナログで
あることを特徴とする請求項1〜4の少なくとも一項に記載の核酸。 - 【請求項6】mRNA、cDNA又はゲノミックDNAであることを特徴とする
請求項1〜5の少なくとも一項に記載の核酸。 - 【請求項7】請求項1〜5の少なくとも一項に記載の核酸に相補的であることを
特徴とする核酸。 - 【請求項8】請求項1〜6に記載の核酸、特に配列番号1(SEQ.ID.NO
.1)又は配列番号2(SEQ.ID.NO.2)に記載の配列を有する、核酸
の発現により得られ得る真核中性スフィンゴミエリナーゼ。 - 【請求項9】請求項8に記載の真核中性スフィンゴミエリナーゼ又は請求項1〜
7の少なくとも一項に記載の核酸に対して向けられることを特徴とする抗体。 - 【請求項10】請求項8に記載の真核中性スフィンゴミエリナーゼを過剰発現す
ることを特徴とする細胞系。 - 【請求項11】真核中性スフィンゴミエリナーゼを発現し、かつ細胞系U937
、HEK293又はジャーカットに基づく細胞系であることを特徴とする請求項
10に記載の細胞系。 - 【請求項12】真核中性スフィンゴミエリナーゼについての過剰発現(機能の獲 得)又は遺伝的欠乏若しくは欠損(機能の喪失)を示すトランスジェニック哺乳類 。
- 【請求項13】げっ歯類であることを特徴とする請求項12に記載のトランスジ
ェニック哺乳類。 - 【請求項14】さらなる補助剤とともに、請求項8に記載の真核中性スフィンゴ
ミエリナーゼ、請求項1〜7の少なくとも一項に記載の核酸、及び/又は請求項
9に記載の抗体を含有する医薬。 - 【請求項15】さらなる補助剤とともに、請求項8に記載の真核中性スフィンゴ
ミエリナーゼ、請求項1〜7の少なくとも一項に記載の核酸、及び/又は請求項
9に記載の抗体を含有する診断薬。 - 【請求項16】過剰若しくは過少発現、並びに/又は真核中性スフィンゴミエリ
ナーゼ活性の増加若しくは減少、並びに/又は細胞増殖、細胞分化、及び/若し
くはアポトーシスの障害に基づく疾患の診断及び処置のための請求項14に記載
の医薬又は請求項15に記載の診断薬の使用。 - 【請求項17】前記疾患が炎症過程、細胞成長障害、癌及び/又はコレステロー
ルホメオスタシス(アテローム性動脈硬化)のような代謝障害である請求項15
に記載の使用。 - 【請求項18】少なくとも1つの潜在的医薬活性物質の添加と同時に請求項10
に記載の細胞系中の真核中性スフィンゴミエリナーゼの発現又は活性の変化を測
定することを特徴とする活性物質のスクリーニング方法。 - 【請求項19】医薬誘導構造を開発し、かつ試験するための請求項10に記載の
細胞系の使用。 - 【請求項20】化学ペプチド合成による、又は遺伝子設計された生物体、特に真
核発現系における発現による、請求項8に記載の真核中性スフィンゴミエリナー
ゼの調製方法。 - 【請求項21】化学合成による、又は遺伝子設計された生物体における増幅によ
る、請求項1〜7の少なくとも一項に記載の核酸の調製方法。 - 【請求項22】コード領域(エクソン)、特に配列番号5(SEQ.ID.NO
.5)又は配列番号6(SEQ.ID.NO.6)に記載の配列を有する遺伝子
に加えて、非コード領域(イントロン)を含む真核中性スフィンゴミエリナーゼ
遺伝子であることを特徴とする請求項5に記載の核酸。 - 【請求項23】請求項8に記載の中性スフィンゴミエリナーゼの変異体。
- 【請求項24】誘導体、フラグメント又はそのような核酸の変異体であることを
特徴とする請求項1〜7又は22の少なくとも一項に記載の核酸。
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---|---|---|---|
DE19734764 | 1997-08-11 | ||
DE19758501 | 1997-10-15 | ||
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US60/078,386 | 1998-03-18 | ||
US19734764.9 | 1998-03-18 | ||
US19758501.9 | 1998-03-18 | ||
PCT/EP1998/005127 WO1999007855A1 (de) | 1997-08-11 | 1998-08-11 | Neutrale sphingomyelinase |
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
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---|---|---|---|
JP2000506339A Pending JP2001512682A (ja) | 1997-08-11 | 1998-08-11 | 中性スフィンゴミエリナーゼ |
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AU (1) | AU9261798A (ja) |
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WO (1) | WO1999007855A1 (ja) |
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