KR101552021B1 - Rab5 발현 저해 물질을 유효 성분으로 포함하는 파브리 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 파브리 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 Rab5 발현을 저해하는 물질을 포함하는 파브리 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 Rab5 발현 저해 물질을 포함하는 파브리 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물, 건강 기능 식품 조성물, 사료 또는 사료 첨가제, 음용수 또는 음용수 첨가제, 및 상기 조성물을 이용하여 파브리 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 Rab5 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 파브리 질환 진단용 조성물 및 파브리 질환 진단을 위하여 Rab5 발현 수준을 측정하고 검출하는 방법에 관한 것이다.

Description

Rab5 발현 저해 물질을 유효 성분으로 포함하는 파브리 질환의 예방 또는 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING FABRY DISEASE COMPRISING RAB5 INHIBITOR}
본 발명은 파브리 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 Rab5 발현을 저해하는 물질을 포함하는 파브리 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 Rab5 발현 저해 물질을 포함하는 파브리 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물, 건강 기능 식품 조성물, 사료 또는 사료 첨가제, 음용수 또는 음용수 첨가제, 및 상기 조성물을 이용하여 파브리 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 Rab5 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 파브리 질환 진단용 조성물 및 파브리 질환 진단을 위하여 Rab5 발현 수준을 측정하고 검출하는 방법에 관한 것이다.
파브리 질환 (Fabry disease)은 X-염색체 연관 열성 유전 질환의 하나로 대표적인 리소좀 저장 질환 (Lysosomal Storage Disease; LSD)에 해당한다. 상기 파브리 질환은 리소좀 효소인 알파-갈락토시다아제 A (α-Galactosidase A)의 결핍으로 야기되는 것으로 알려져 있다. 알파-갈락토시다아제 A는 당지질의 말단 부위에 존재하는 알파-갈락토시드 (a-Galactoside) 결합 부위를 가수분해시키는 작용을 하는 효소로서, 상기 효소가 결핍되는 경우 체내에 말단 알파-갈락토스 잔기를 포함하는 당지질이 축적되어 파브리 질환이 발병되게 된다. 상기 효소의 결핍으로 축적되는 주요 당지질은 트리헥소실세라미드 (Trihexosylceramide)라는 관용명으로도 불리는 글로보트리아오실세라미드 (Globotriaosylceramide; Gb3 또는 GL3)로, 이 물질은 환자의 혈장 내에 다량 분포하며, 신장, 간, 심장, 비장 등 신체 각 장기에 축적되어 이들 장기들의 기능 부전을 유발하고 만성 통증, 각막 혼탁, 자율 신경 기능 이상, 피부 상해 등을 다양한 증상을 일으킬 수 있으며 급기야는 사망에까지 이르게 한다. 특히 혈장과 직접 접촉하는 혈관내피세포는 Gb3가 축적되는 가장 대표적인 세포로, 혈관내피세포 기능 부전은 혈관 기능 부전에 의한 혈관 질환과 파브리 질환의 특징적인 신장 질환을 유발한다 (비특허문헌 1 참조).
이러한 파브리 질환을 치료하기 위하여 현재 알려진 방법으로는 효소 대체 치료 (Enzyme Replacement Therapy; ERT)가 있다. 효소 대체 치료는 재조합된 알파-갈락토시다아제 A를 파브리 환자에게 투여함으로써 결핍된 리소좀 효소를 보충해주는 치료법으로서, 2003년 미국에서 승인된바 있으며 현재까지 알려진 파브리 질환에 대한 유일한 치료법이다. 효소 대체 치료에 이용되는 재조합 알파-갈락토시다아제 A로 시판되는 것으로는 미국 젠자임사 (Genzyme)의 파브라자임 (Fabrazyme), 유럽 TKT사 (TransKaryotic Therapeutics, Inc.)의 레플라갈 (Replagal)이 있다.
효소 대체는 결핍된 효소를 공급하여 효소 결핍에 의한 Gb3 축적을 억제하여 파브리 질환의 진행을 억제할 수 있다. 그러므로 효소 대체 요법은 혈장과 소변의 Gb3 농도를 낮추고, 신경 통증을 완화하고 심장 질환 발생을 완화하고, 콩팥 기능을 안정화시키는 등 파브리 질환에 대한 치료 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 효소 대체 치료가 현재 파브리 질환을 치료하기 위한 유일한 치료법임에도 불구하고, 중간 혹은 심한 정도의 콩팥 기능 손상 증상을 보이는 파브리 질환에서는 효소 대체 치료가 제한적이거나 효과가 없는 경우도 보고되고 있다 (비특허문헌 2 및 3). 그러므로, 파브리 질환의 유일한 치료법인 효소 대체 치료법이 효과가 미약하거나 없는 경우 이를 대체할 수 있는 치료법, 즉 축적되는 Gb3의 효과를 억제하는 방법의 개발이 필요하다. 한편 파브리 질환의 주요 증상들은 혈관내피세포 기능 부전에 의한 혈관 질환에서 유래한다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 Gb3에 의한 혈관내피세포 기능 부전을 개선하여 파브리 질환을 효과적으로 치료할 수 있는 방법에 대하여 연구하였으며, 이에 Rab5의 발현을 억제시킬 경우 파브리 질환으로 기능이 저하된 혈관 내피 세포의 기능이 정상화되는 등 파브리 질환을 효과적으로 치료할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
R.J. Desnick et al., α-Galactosidase A deficiency: Fabry disease, in: C.R. Scriver et al., The metabolic and molecular bases of inherited disease, 8th ed., McGraw-Hill, New York, 2001, pp. 3733~3774. Tondel C. et al., Agalsidase benefits renal histology in young patients with Fabry disease, J Am Soc Nephrol., 2013, 24(1):137-48. West M. et al., Agalsidase alfa and kidney dysfunction in Fabry disease, J Am Soc Nephrol., 2009, 20:1132-1139. Kaushal V. et al., J. Neurosci., 2007, 27(1):234-244. Si H. et al., Circ. Res., 2006, 99(5):537-544. Seonghee Park. et al., Cardiovasc. Res., 2011, 89(2):290-299.
본 발명은 Rab5의 발현을 저해함으로써 파브리 질환을 예방, 개선 또는 치료하는 것을 목적으로 한다.
구체적으로, 본 발명의 하나의 목적은 Rab5 발현을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 파브리 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 Rab5 발현을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 파브리 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물, 건강 기능 식품 조성물, 사료 첨가제, 음용수 첨가제, 사료 또는 음용수를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 파브리 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 Rab5의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 파브리 질환 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 파브리 질환 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 파브리 질환 마커 Rab5를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, Rab5 발현을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 파브리 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "Rab5"는 GTP 가수분해 효소 (GTPase)의 하나로 초기 엔도좀 (early endosomes)과 세포막 (plasma membrane)간의 융합을 조절하여 멤브레인 트래픽 (membrane traffic)을 조절하는 역할을 하는 단백질을 말한다. Rab5는 구조적으로 서로 이소폼 (isoform) 관계에 있는 3 가지 형태로 하위 분류될 수 있으며 이들 각각의 명칭은 Rab5A, Rab5B, 및 Rab5C이다. 이들 3 가지 형태의 Rab5A, Rab5B, 및 Rab5C는 멤브레인 트래픽을 조절하는 역할에 있어서는 모두 유사하게 기능할 수 있으며, 본 발명에서 의미하는 Rab5는 이들 3 가지 형태를 모두 포함하는 개념이나, 바람직하게는 Rab5C일 수 있다.
본 발명의 Rab5A, Rab5B 및 Rab5C의 서열 정보는 미국 국립생물정보센터 (National Center for Biotechnology Information; NCBI) 등과 같은 공지의 데이터 베이스로부터 얻을 수 있다. 예를 들어 본 발명의 Rab5A는 NCBI GenBank Accession No. NM_004162일 수 있으며, Rab5B는 NCBI GenBank Accession No. AF498937일 수 있고, Rab5C는 NCBI GenBank Accession No. AF498938일 수 있으나, 이들 각각은 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 알파-갈락토시다아제 A를 녹아웃 (Gla-knokout) 시킨 마우스의 대동맥 혈관 내피 세포 (mouse aortic endothelial cells; MAECs)에서 Rab5의 발현이 증가된다는 것이 확인되었다 (도 1(a) 및 1(b)). 이에 본 발명자들은 Rab5의 발현 수준이 파브리 질환과 관련이 있음을 깨닫고 나아가 후술하는 바와 같이 파브리 질환 발병시 비정상적으로 증가되는 Rab5의 발현을 억제함으로써 파브리 질환을 예방 또는 치료할 수 있을 것으로 판단하여 본 발명을 개발하게 되었다. 이는 종래 파브리 질환 관련 분야에서 알려진 바 없는 내용에 해당한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "Rab5 발현을 저해하는 물질"은 Rab5의 발현 또는 활성을 감소시키는 물질을 통칭하는 의미로 사용되며, 보다 구체적으로는 Rab5에 직접적으로 작용하거나 그의 리간드에 간접적으로 작용하는 등의 방식을 통해 Rab5의 발현을 전사 수준에서 감소시키거나 그 활성을 방해함으로써 Rab5의 발현 또는 활성을 감소시키는 모든 물질을 포함할 수 있다. 상기 Rab5 발현을 저해하는 물질은 Rab5를 표적으로 하여 Rab5의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 화합물, 핵산, 펩타이드, 바이러스 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터 등 그 형태에 제한없이 사용 가능하다. 상기 Rab5 발현을 저해하는 물질의 예로, 바람직하게는 Rab5 mRNA의 발현을 저해하는 올리고 뉴클레오티드, Rab5 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편 등을 들 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "올리고 뉴클레오티드"는 수 개 내지 수십 개의 뉴클레오티드가 인산디에스테르 결합 (phosphodiester bond)으로 중합되어 형성된 중합체를 의미한다. 상기 Rab5 mRNA의 발현을 저해하는 올리고 뉴클레오티드로의 예로, 바람직하게는 Rab5에 특이적인 안티센스 올리고 뉴클레오티드 (antisense oligonucleotides), 앱타머 (aptamer) 또는 siRNA (small interfering RNA) 등을 들 수 있으나 이들에 한정되지 아니한다. 본 발명에서 사용되는 올리고 뉴클레오티드로 보다 바람직하게는 siRNA를 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "안티센스 올리고 뉴클레오티드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA, 또는 이들의 유도체를 의미하는 것으로서 mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명에서 상기 Rab5 mRNA의 발현을 저해하는 올리고 뉴클레오티드는 Rab5 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 DNA 또는 RNA, 또는 이들의 유도체로서, 상기 Rab5 mRNA에 결합하여 상기 Rab5 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위 (translocation), 성숙 (maturation) 등을 방해하거나 또는 Rab5 mRNA의 그 밖의 다른 모든 생물학적 기능 또는 활성을 저해할 수 있다. 본 발명의 안티센스 올리고 뉴클레오티드는 본 발명의 Rab5가 Rab5A, Rab5B 또는 Rab5C인지에 따라 적절하게 선택되어 사용될 수 있다.
상기 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 길이는 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 6 내지 100 염기일 수 있고, 보다 바람직하게는 8 내지 60 염기일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 10 내지 40 염기일 수 있다. 상기 안티센스 올리고 뉴클레오티드는 당해 기술 분야에서 사용되는 통상의 방법에 따라 생체 내 (in vivo) 에서 합성되거나, 시험관 내 (in vitro) 에서 합성되어 생체 내로 투여될 수 있다. 생체 내에서 안티센스 RNA를 합성하는 방법의 비제한적인 예로 다중 클로닝 부위 (Multi-cloning site; MCS)의 기원 (origin)이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 방법을 들 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 RNA를 합성하는 방법의 비제한적인 예로 RNA 중합효소 I를 이용하는 방법을 들 수 있다.
본 발명의 Rab5 mRNA의 발현을 억제하는 안티센스 올리고 뉴클레오티드는 Rab5의 염기 서열을 참조하여 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 공지의 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "앱타머"는 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드로를 의미하는 것으로, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 상기 앱타머는 그 염기 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가질 수 있으며, 항원-항체 반응과 같이 특정 물질에 대하여 높은 친화력을 가질 수 있다. 앱타머는 소정의 표적 분자에 결합함으로써 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다.
본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 변형된 (modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 그 형태가 직쇄상 또는 환상 (環狀)일 수 있으나 이들에 한정되지 아니한다. 본 발명의 앱타머는 본 발명의 Rab5가 Rab5A, Rab5B 또는 Rab5C인지에 따라 적절하게 선택되어 사용될 수 있다. 본 발명의 Rab5 mRNA의 발현을 억제하는 앱타머는 Rab5의 염기 서열을 참조하여 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 공지의 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "siRNA (Small interfering RNA)"는 RNA 간섭 (interference) 또는 유전자 사일런싱 (silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자로서, 20 내지 25 뉴클레오티드 크기의 작은 이중 가닥 RNA 조각을 의미한다. siRNA의 이중 가닥은 각 3'-말단의 2개 뉴클레오타이드가 돌출 (overhang)된 구조를 갖는다. 상기 siRNA는 표적 유전자의 발현을 저해할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹다운 (knockdown) 방법 또는 유전자 치료 방법으로 사용될 수 있다. 이중 가닥의 RNA가 다이서 (dicer)에 의해 절단되어 생성될 수 있는 상기 siRNA는 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 해당 mRNA의 발현을 억제할 수 있다.
본 발명의 siRNA는 본 발명의 Rab5가 Rab5A, Rab5B 또는 Rab5C인지에 따라 적절하게 선택되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 지칭하는 Rab5가 Rab5C일 경우 상기 siRNA는 Rab5C mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 서열을 갖는 siRNA를 사용할 수 있으며, 상기 siRNA가 Rab5C mRNA의 발현을 저해할 수 있는 것이라면 그 서열은 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용될 수 있는 Rab5의 siRNA는 표적에 따라 공지의 데이터 베이스 또는 프로그램을 사용하여 설계 또는 선택하여 사용할 수 있다. 하기 표 1은 본 발명에서 사용될 수 있는 Rab5 siRNA의 구체적인 예를 제시한 것이다.
타겟 서열(5'-3') 서열번호
Rab5A_human AACCAAAACACAAACACUCAA 1
GAGUGUUUGUGUUUUGGUUCG 2
Rab5A_mouse AACCAAAACACAAACACUCGG 3
GAGUGUUUGUGUUUUGGUUCG 4
Rab5A_rat UUUAUUUCCAGUAUUUGGCCC 5
GCCAAAUACUGGAAAUAAAAU 6
Rab5A_chimpanzee AACCAAAACACAAACACUCAA 7
GAGUGUUUGUGUUUUGGUUCG 8
Rab5B_human UUUGAACUGGCAAAUUUUGCU 9
CAAAAUUUGCCAGUUCAAAUU 10
Rab5B_mouse UAGUCAUAGCCAGGUUAUCAA 11
GAUAACCUGGCUAUGACUAGC 12
Rab5B_rat UAGUCAUAGCCAGGUUAUCAA 13
GAUAACCUGGCUAUGACUAGC 14
Rab5B_chimpanze UUUGAACUGGCAAAUUUUGCU 15
CAAAAUUUGCCAGUUCAAAUU 16
Rab5C_human UUAAGUUUUGGAAUUGCAGAC 17
CUGCAAUUCCAAAACUUAACA 18
Rab5C_mouse AAACUUGACCGUUGUAUCGUC 19
CGAUACAACGGUCAAGUUUGA 20
Rab5C_rat AUGUCAUAGACCACAAUGGCU 21
CCAUUGUGGUCUAUGACAUCA 22
Rab5C_chimpanze AAUUGACAGAUCUUGUUCCCA 23
GGAACAAGAUCUGUCAAUUUA 24
본 발명에서 사용될 수 있는 Rab5의 siRNA의 보다 다양한 예를 하기 표 2 내지 3에 나타낸다.
Figure 112013106746811-pat00001
Figure 112013106746811-pat00002
Figure 112013106746811-pat00003
Figure 112013106746811-pat00004
Figure 112013106746811-pat00005

Figure 112013106746811-pat00006
Figure 112013106746811-pat00007
Figure 112013106746811-pat00008
Figure 112013106746811-pat00009
Figure 112013106746811-pat00010

Figure 112013106746811-pat00011
Figure 112013106746811-pat00012

본 발명에서 사용될 수 있는 siRNA는 Rab5의 염기 서열을 참조하여 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 공지의 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다. 상기 siRNA를 제작하는 방법의 비제한적인 예로는 siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법, 시험관 내 전사를 이용하여 siRNA를 합성하는 방법, 시험관 내 전사에 의해 합성된 긴 이중 가닥 RNA를 다이서를 이용해 절단하여 제작하는 방법, shRNA 발현 플라스미드 또는 바이러스성 벡터의 세포 내 전달을 통하여 발현시키는 방법 또는 PCR (polymerase chain reaction) 유도 siRNA 발현 카세트 (cassette)의 세포 내 전달을 통하여 발현시키는 방법 등을 들 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역 글로불린 분자를 포함하는 단백질 분자로, 체내에 특정 항원이 침입한 경우 이를 특이적으로 인식하여 반응하는 항원 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 말한다. 하나의 항체 분자는 두 개의 중사슬 (heavy chain) 및 두 개의 경사슬 (light chain)로 구성되어 있으며, 이들 각각의 중사슬 및 경사슬은 가변 영역과 고정 영역을 포함한다. 상기 가변 영역은 3개의 상보성 결정 부위 (Complementarity Cetermining Region: CDR) 및 4개의 구조 형성 부위 (Framework Region; FR)를 포함하며, 상기 상보성 결정 부위들에 의해 항체와 항원 사이의 결합 부위가 형성되어 특정 항원에 대한 항체의 결합 특이성이 생성될 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 항체는 Rab5 단백질의 활성을 억제하는 항체라면 특별히 제한되지 아니하며, 예를 들어, 다클론 항체, 단일클론 항체 또는 항체 단편 등을 모두 포함할 수 있다. 또한 키메라성 항체 또는 이종 결합 항체 등과 같이 유전 공학적으로 제작된 항체들도 모두 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "파브리 질환"은 X-염색체 연관 열성 유전 질환의 하나로 대표적인 리소좀 저장 질환 (Lysosomal Storage Disease; LSD)에 해당한다. 상기 파브리 질환은 리소좀 효소인 알파-갈락토시다아제 A (a-Galactosidase A)의 결핍으로 야기되는 것으로 알려져 있다. 알파-갈락토시다아제 A는 당지질의 말단 부위에 존재하는 알파-갈락토시드 (a-Galactoside) 결합 부위를 가수분해시키는 작용을 하는 효소로서, 상기 효소가 결핍되는 경우 체내에 말단 알파-갈락토스 잔기를 포함하는 당지질이 축적되어 파브르 질환이 발병될 수 있다. 상기 효소의 결핍으로 축적되는 주요 당지질은 트리헥소실세라미드 (Trihexosylceramide)라는 관용명으로도 불리는 글로보트리아오실세라미드 (Globotriaosylceramide; Gb3 또는 GL3)로, 이는 환자의 혈장 내에 다량 분포하며, 주로 신장, 심장, 간, 비장 등의 혈관 내피 세포에 침착된다. 이러한 당지질의 축적이 심화되면 만성 통증, 각막 혼탁, 자율 신경 기능 이상, 간이나 신장 손상, 혈관 질환 또는 피부 상해 등을 일으킬 수 있으며 급기야는 사망에까지 이를 수 있다.
본 발명에서 지칭하는 파브리 질환은 개체에 나타나거나 나타날 것으로 예상되는 구체적인 병증의 종류에 제한됨이 없이, 예를 들어 앞서 언급한 만성 통증, 각막 혼탁, 자율 신경 기능 이상, 간 및 신장 손상, 혈관 질환 또는 피부 상해 등의 병증이 나타나거나 나타나지 않는 지에 상관없이 알파-갈락토시다아제 A의 결핍에 따라 유발되는 질환을 의미하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"이란, 본 발명의 Rab5 발현을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하여 파브리 질환의 발병을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"란, 본 발명의 Rab5 발현을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 조성물을 파브리 질환 의심 개체에 투여하여 파브리 질환의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 상기 Rab5 발현을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 파브리 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 포함된 Rab5 발현을 저해하는 물질의 함량은 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 5 pmol/L 내지 1,000 pmol/L일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 본 발명자들은 글로보트리아오실세라미드 (Gb3)를 처리한 배양한 마우스 대동맥 혈관내피세포와, Gb3가 세포에 포화될 정도로 축적되는 28주령 이상의 파브리 질환 마우스 모델의 대동맥을 이용하여 배양한 혈관내피세포에서 정상 대조군에 비해 해당 세포에서의 Rab5의 발현이 증가되면서 KCa3.1 채널의 발현은 감소되고 이에 따라 KCa3.1 채널 전류도 감소된다는 것을 확인할 수 있었다 (도 2, 도 3 및 도 4). 또한 본 발명의 다른 일 실시예에서 Rab5의 발현이 증가되면서 아세틸콜린에 의해 유도되는 혈관 내피 세포의 의존성 이완 (endothelium-dependent relaxation; EDR)이 억제된다는 것도 확인할 수 있었다 (도 5). 즉, 글로보트리아오실세라미드의 축적에 의해 Rab5의 발현이 증가하게 되면 KCa3.1 채널의 발현 감소 및 KCa3.1 채널 전류의 감소가 일어나게 되며, 이와 더불어 혈관 내피 세포의 의존성 이완이 억제되어 혈관 내피 세포 기능이 비정상화되고, 이로 인해 파브리 질환 병증이 나타나게 된다는 것을 알 수 있었다. 이에 본 발명자들은 Rab5의 발현을 억제하는 것이 파브리 질환 치료에 효과가 있을 것으로 판단하고 상기 세포에 Rab5 mRNA의 siRNA를 투여하였다. 그 결과 KCa3.1 채널의 발현이 다시 증가하고 KCa3.1 채널 전류도 다시 증가하게 되며 혈관 내피 세포의 의존성 이완 또한 회복된다는 것을 확인할 수 있었고, 이에 본 발명의 조성물을 개발하게 되었다 (도 3, 4 내지 도 5).
상기 KCa3.1 채널은 신경 세포, 적혈구, 섬유아세포, 증식하는 혈관 평활근 세포, 혈관 내피 세포, 면역 세포 (T 세포와 B 세포) 등에 분포하고 있는 채널로, 이들 세포의 기능을 조절하는 데에 기여하는 것으로 알려져 있다 (비특허문헌 3). 구체적으로 심혈관계에서 KCa3.1 채널은 주로 혈관내피세포에 분포하므로, KCa3.1 채널 기능 이상은 혈관내피세포 기능 이상을 야기하여 혈압을 증가시키는 것으로 알려져 있다 (비특허문헌 4).
본 발명의 상기 Rab5 발현을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 파브리 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체와 함께 제제화되어 식품, 의약품, 사료 첨가제 및 음용수 첨가제 등으로 제공될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 투여되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다.
본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
또한, 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있으며, 희석제, 분산제, 계면 활성제, 결합제 및/또는 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화하여 사용할 수 있다.
본 발명의 상기 Rab5 발현을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 파브리 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 상기 투여 방식의 비제한적인 예로, 조성물을 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다.
상기 Rab5 발현을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 파브리 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 목적하는 투여 방식에 따라 다양한 제형으로 제작될 수 있다. 경구 투여용 제형의 비제한적인 예로는, 트로키제 (troches), 로젠지 (lozenge), 정제, 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 등을 들 수 있다.
본 발명의 조성물을 정제 또는 캡슐 등과 같은 경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여, 락토오스, 사카로오스 (Saccharose), 솔비톨 (Sorbitol), 만니톨 (Mannitol), 전분, 아밀로펙틴 (Amylopectin), 셀룰로오스 (Cellulose) 또는 젤라틴 (Gelatin) 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트 (dicalcium phosphate) 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕괴제; 스테아르산 마그네슘 (magnesium stearate), 스테아르산 칼슘 (calcium stearate), 스테아릴 푸마르산 나트륨 (sodium stearyl fumarate) 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스 (polyethylene glycol wax) 등과 같은 윤활유 등을 포함할 수 있다. 나아가 캡슐 제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체 등을 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 상기 조성물을 비경구 투여하는 방법으로는, 예를 들어 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여 등을 이용할 수 있으며, 상기 조성물을 질환 부위에 도포하거나 분무하는 방법 또한 이용할 수 있으나 이들에 제한되지 아니한다.
상기 비경구 투여를 위한 제형으로는, 예를 들어 피하 주사, 정맥 주사 또는 근육 내 주사 등의 주사용 형태; 좌제 주입 방식; 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있으나 이에 제한되지 아니한다. 상기 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 (ampoule) 또는 바이알 (vial)의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 상기 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.
본 발명의 상기 Rab5 발현을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 파브리 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 적합한 도포, 분무 또는 투여량은, 상기 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로는 물론, 투여 대상이 되는 동물의 나이, 체중, 성별, 질병 증상의 정도, 섭취하는 음식, 배설 속도 등과 같은 요인들에 의해 다양해 질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, Rab5 발현을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 파브리 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 섬유ㆍ고무 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염병을 막기 위한 살균ㆍ살충제 등이 이에 포함된다. 본 발명의 의약외품 조성물의 종류나 제형은 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 소독 청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제 비누, 핸드 워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터 충진제 등일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, Rab5 발현을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 파브리 질환의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 건강 기능 식품 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 비제한적인 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.
본 발명의 상기 건강 기능 식품 조성물이 음료 조성물인 경우, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비제한적인 예로 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 수크로오스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 들 수 있다. 상기 첨가되는 추가 성분의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강 기능 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강 기능 식품 조성물은 천연 과일 주스, 과일 음료 또는 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 사용되거나 2 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가물의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, Rab5 발현을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 파브리 질환의 예방 또는 개선용 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제를 제공한다.
본 발명의 상기 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제는 상기 Rab5 발현을 저해하는 물질을 포함하는 조성물을 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제 형태로 따로 제조하여 사료 또는 음용수에 혼합시키는 방식으로 사용하거나, 상기 Rab5 발현을 저해하는 물질을 포함하는 조성물을 사료 또는 음용수 제조시 직접 첨가하는 방식으로 사용할 수 있다.
본 발명의 상기 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제는 액상 또는 건조 상태일 수 있으며, 바람직하게는 건조된 분말 형태일 수 있다. 본 발명의 상기 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제를 건조된 분말 형태로 제조하기 위한 건조 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법을 사용할 수 있다. 상기 건조 방법의 비제한적인 예로는, 통풍 건조, 자연 건조, 분무 건조, 동결 건조 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 가지 이상의 방법을 함께 이용하는 방식으로 수행될 수 있다.
본 발명의 상기 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제는 필요에 따라 기타 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 사용 가능한 첨가제의 비제한적인 예로는, 사료 또는 음용수의 품질 저하를 방지하기 위하여 첨가하는 결착제, 유화제, 보존제 등; 사료 또는 음용수의 효용 증대를 위하여 첨가하는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 생균제, 향미제, 비단백질태질소화합물 (非蛋白質態窒素化合物), 규산염제, 완충제, 착색제, 추출제 또는 올리고당 등이 있으며, 그 외에 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 함께 첨가될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, Rab5 발현을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 파브리 질환의 예방 또는 개선용 사료 또는 음용수를 제공한다.
상기 사료 또는 음용수는, 사료 또는 음용수에 본 발명의 상기 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제를 첨가하여 제조하거나, 상기 Rab5 발현을 저해하는 물질 또는 이를 포함하는 조성물을 직접 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명에서 상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 음용수의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 음용수를 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, Rab5 발현을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 파브리 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "개체"란, 파브리 질환이 발병되었거나 발병할 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다.
본 발명의 상기 예방 또는 치료 방법은 구체적으로, 파브리 질환이 발병하였거나 발병할 위험이 있는 개체에 상기 Rab5 발현을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함한다. 상기 Rab5 발현을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 조성물의 적합 한 1 일 총 사용량은 올바른 의학적 판단 범위 내에서 당업자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
특정 동물에 대한 상기 Rab5 발현을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 조성물의 구체적인 약학적 유효량은, 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 해당 개체의 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 성별 또는 식이는 물론, 상기 Rab5 발현을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간 등을 고려하여 결정될 수 있으며, 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있다.
본 발명의 상기 예방 또는 치료 방법에서 상기 Rab5 발현을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 조성물을 투여하는 투여 경로 및 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며 목적하는 해당 부위에 상기 Rab5 발현을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 조성물이 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 구체적으로, 상기 Rab5 발현을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 그 투여 경로의 비제한적인 예로는, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내 또는 흡입 등을 통하여 투여되는 것을 들 수 있다.
본 발명의 상기 파브리 질환의 예방 또는 치료 방법은 효소 대체 치료 (Enzyme Replacement Therapy; ERT)를 병행하여 수행할 수 있다. 본 발명의 상기 효소 대체 치료는 재조합된 알파-갈락토시다아제 A를 파브리 질환자에게 투여함으로써 결핍된 리소좀 효소를 보충해주는 치료법으로서, 2003년 미국에서 승인된바 있다. 상기 효소 대체 치료에 사용 가능한 재조합 알파-갈락토시다아제 A로 시판되는 것으로는 미국 젠자임사 (Genzyme)의 파브라자임 (Fabrazyme), 유럽 TKT사 (TransKaryotic Therapeutics, Inc.)의 레플라갈 (Replagal) 등이 있다. 상기 효소 대체 치료 방법은 통상적으로 사용되는 방식에 따라 수행될 수 있다.
파브리 질환을 예방 또는 치료하기 위하여 Rab5 발현을 저해하는 물질을 포함하는 본 발명의 조성물의 투여 및 효소 대체 치료를 병행하는 경우, 보다 효과적인 예방 또는 치료 효과를 얻을 수 있을 것으로 기대된다. 파브리 질환을 예방 또는 치료하기 위하여 효소 대체 요법만을 이용한 경우에, 특히 심한 파브리 질환의 경우 치료 효과가 크지 않다는 논문이 최근 발표된 바 있다 (비특허문헌 2). 반면 전술한 바와 같이 본 발명의 일 실시예에 따르면, 파브리 질환 개체에 본 발명의 Rab5 발현을 저해하는 물질을 포함하는 조성물을 투여한 경우, 해당 질환으로 인해 비정상적으로 증가되었던 Rab5의 발현이 억제되고 이에 따라 역시 질환으로 인해 비정상적으로 감소되었던 KCa3.1 채널의 발현이 다시 증가되면서 KCa3.1 채널 전류 역시 다시 증가하게 되고, 또한 감소되었던 혈관 내피 세포의 아세틸콜린 의존성 이완이 회복되면서 혈관 내피 세포의 기능이 정상화됨을 확인하였다 (도 3, 4 내지 도 5).
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, Rab5의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 파브리 질환 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, (a) 분리된 생물학적 시료로부터 Rab5의 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 Rab5의 발현 수준을 정상 대조구 시료의 Rab5 발현 수준과 비교하는 단계; 및 (c) 상기 분리된 생물학적 시료의 Rab5 발현 수준이 상기 정상 대조구 시료의 Rab5 발현 수준보다 높을 경우 파브리 질환으로 판정하는 단계를 포함하는, 파브리 질환 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 파브리 질환 마커 Rab5를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "진단"이란, 생물학적 시료 또는 조직 샘플에서 본 발명의 Rab5의 존재 또는 부재를 측정함으로써 파브리 질환의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 또한, 상기 "마커" 또는 "진단 마커 (diagnosis marker)"란, 파브리 질환을 가진 개체를 정상 세포 또는 정상 개체와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 파브리 질환을 가진 세포 또는 개체에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산 (예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당 (단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자들을 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 파브리 질환 진단 마커는 정상 세포 또는 조직의 세포에 비하여 파브리 질환 세포에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이는 Rab5이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "Rab5의 발현 수준"이란 Rab5 mRNA의 발현 수준 또는 Rab5 단백질의 발현 수준을 모두 포함하는 개념이며, 본 발명에서 "Rab5의 발현 수준 측정"은 상기 Rab5 mRNA의 발현 수준 측정 또는 Rab5 단백질의 발현 수준 측정을 통해 수행될 수 있다.
상기 Rab5 mRNA의 발현 수준 측정은 파브리 질환을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 파브리 질환 마커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정을 의미하는 것으로, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법은 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 따를 수 있다. 상기 분석 방법의 비제한적인 예로는 RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction), 경쟁적 RT-PCR (Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RNase protection assay; RPA), 노던 블럿 (Northern Blot), DNA 칩 등을 들 수 있다.
상기 Rab5 단백질의 발현 수준 측정은 파브리 질환을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서의 파브리 질환 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인하는 방식으로 수행될 수 있다. 이를 위한 방법은 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 따를 수 있다. 상기 분석 방법의 비제한적인 예로는 웨스턴 블럿 (Western Blot), ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Asay), 방사선면역분석 (RIA: Radioimmunoassay), 방사면역 확산법 (Radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로켓 면역 전기 영동 (Rocket Immuno Electrophoresis), 조직 면역 염색, 면역 침전 분석법 (Immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법 (Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩 (protein chip) 등을 들 수 있다.
상기 mRNA 수준을 측정하는 제제의 예로, 바람직하게는 본 발명의 Rab5의 mRNA에 대한 프라이머 (primer) 쌍, 프로브 (probe), 또는 안티센스 뉴클레오티드 등을 들 수 있으며, 상기 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 뉴클레오티드 등의 서열은 본 발명의 Rab5의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 당업자가 용이하게 디자인할 수 있다. 또한, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제의 예로, 바람직하게는 항체를 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 Rab5는 파브리 질환 발병시 그 발현이 비정상적으로 증가되는 것으로, 상기 Rab5를 이용하여 파브리 질환 발병 여부를 진단할 수 있을 뿐만 아니라 파브리 질환을 예방하고 치료할 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 양태에 따른 Rab5 발현 저해 물질을 유효 성분으로 포함하는 조성물은 이를 개체에 투여시 Rab5의 발현을 억제하여 파브리 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있으며, 본 발명의 또 다른 일 양태에 따른 Rab5의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물은 파브리 질환의 발병 여부 또는 발병 가능성을 효과적으로 진단할 수 있다.
도 1(a) 및 1(b)는 알파-갈락토시다아제 A가 녹아웃 (Gla-Knockout) 처리된 마우스 대동맥 혈관 내피 세포 (MAECs)에서의 Rab5 mRNA의 발현 수준을 측정한 것이다.
도 2(a)는 정상 MAECs과 글로보트리아오실세라미드 (Gb3)에 노출된 MAECs에서의 Kca3.1 채널 단백질의 발현 수준을 비교 측정한 것이고, 도 2(b)는 정상 인간 제대 정맥 혈관 내피 세포 (HUVECs)와 Gb3에 노출된 HUVECs에서의 Kca3.1 채널 단백질의 발현 수준을 비교 측정한 것이다.
도 3은 글로보트리아오실세라미드에 노출된 MAECs (a) 혹은 파브리 생쥐 모델의 대동맥에서 배양한 MAECs에 Rab5의 발현을 저해하는 물질을 처리하여 Kca3.1 채널의 발현 수준이 회복되는 것을 측정한 것으로, 도 3(a)는 Gb3에 노출된 MAECs에 Rab5C에 대응하는 siRNA의 처리 전ㆍ후의 Kca3.1 채널 발현 수준을 측정한 것이고, 도 3(b)는 Gla-녹아웃된 MAECs에 Rab5C에 대응하는 siRNA의 처리 전ㆍ후의 Kca3.1 채널 발현 수준을 측정한 것이다.
도 4는 파브리 질환이 유도된 세포에 Rab5의 발현을 저해하는 물질을 처리하여 Kca3.1 전류가 회복되는 것을 측정한 것으로, 도 4(a)는 정상 대조군, 도 4(b)는 Gla-녹아웃된 MAECs, 도 4(c)는 Gla-녹아웃된 MAECs에 Rab5C에 대응하는 siRNA를 처리한 후의 Kca3.1 전류를 측정한 것이다. 도 4(d)는 상기 3 가지 경우에서 기록한 KCa3.1 전류의 전류 밀도 (current density)를 50 mV에서 측정한 것이다.
도 5는 파브리 질환이 유도된 세포에 Rab5의 발현을 저해하는 물질을 처리하여 아세틸콜린-유도 혈관내피세포 의존성 이완이 회복되는 것을 측정한 것으로, 정상 대조군의 대동맥 환 (aortic ring)은 검은 선 (a)과 검은 원 (b), Gla-녹아웃된 마우스의 대동맥 환은 진한 회색 선 (a)과 검은 사각 (b), Rab5C에 대응하는 siRNA를 처리한 Gla-녹아웃된 마우스의 대동맥 환은 연한 회색 선 (a)과 흰 원 (b)으로 나타내었다. 도 5(a)는 상기 3가지 혈관에서 기록한 아세틸콜린-유도 혈관 내피 세포 의존성 이완에 대한 대표 그림이며, 도 5(b)는 상기 3가지 경우의 아세틸콜린에 의한 혈관내피세포 의존성 이완 정도 (왼쪽 그림)와 sodium nitroprusside (SNP)에 의한 혈관내피세포 비의존성 이완 정도 (오른쪽 그림)를 노에피네프린에 의한 수축 정도에 대한 백분율로 나타낸 것이다. SNP에 의한 이완은 상기 3가지 혈관에서 차이가 없는 반면, 혈관내피세포 의존성 이완 정도는 3 가지 경우에서 차이가 있어, 파브리 질환에서 감소한 혈관내피세포 의존성 이완이 Rab5 발현을 억제하면 회복되는 것을 알 수 있다.
이하, 실시예들을 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것에 불과하므로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.
실시예 1: 파브리 질환 마우스 모델 세포에서의 Rab5 발현수준 측정 실험
파브리 질환 마우스 모델에서 배양한 대동맥 혈관내피세포에서의 Rab 5의 발현 수준을 측정하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.
28 주령의 알파-갈락토시다아제 A 녹아웃 (Gla-Knockout) 처리를 한 마우스에서 대동맥 혈관 내피 세포 (MAECs)를 분리하였다. 상기 대동맥 혈관내피세포에서 Rab5C의 mRNA 발현 수준을 polymerase chain reaction (PCR)로 측정하였다.
구체적으로, 28주령의 정상 및 파브리 마우스 대동맥에서 배양한 대동맥 혈관내피세포에서 각각 RNA를 추출한 다음 이를 역전사 (reverse transcription)한 다음 PCR을 시행하였다.
상기 실험 결과, 대조군 세포와 비교할 때, 알파-갈락토시다아제 A를 녹아웃 마우스의 MAECs에서 Rab5의 mRNA 발현 수준이 상당히 높은 것이 확인되었다 (도 1(a) 및 1(b)). 상기 결과에 비추어, 파브리 질환이 발병하는 경우 Rab5의 발현이 비정상적으로 증가된다는 것을 확인할 수 있었다.
한편, 도 1(a)에서 **는 대조군과 비교하여 P＜0.01이다.
실시예 2: 글로보트리아오실세라미드 ( Gb3 )를 처치한 세포에서의 Kca3 .1 채널 발현 수준 측정 실험
파브리 질환이 유도된 세포에서의 Kca3.1 채널의 발현 수준을 측정하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.
28 주령의 마우스의 MAECs 및 인간 제대 정맥 혈관 내피 세포 (HUVECs) 각각을, 농도를 달리한 글로보트리아오실세라미드 (Gb3)에 24 시간 동안 노출시킨 후, 웨스턴 블롯을 이용하여 KCa3.1 채널 단백질의 양을 측정하였다. 그리고 각 샘플에서 대조구로서 β-액틴 (β-actin)의 발현 수준을 측정하였다.
상기 실험 결과, Gb3에 노출된 MAECs 및 HUVECs 모두 Kca3.1 채널의 발현 수준이 감소되는 것으로 나타났으며, 이는 Gb3의 농도에 의존적인 것으로 확인되었다 (도 2(b)). 상기 결과에 비추어, 파브리 질환과 같이 Gb3에 노출되는 경우, Kca3.1 채널의 발현이 감소된다는 것을 확인할 수 있었다.
한편, 도 2(a) 및 2(b)에서 **는 대조구와 비교하여 P＜0.01이다.
실시예 3: Gb3 노출 세포 또는 파브리 질환 세포에서 Rab5 발현 저해 물질 처리에 따른 Kca3 .1 채널 발현 수준 회복 측정 실험
Gb3에 노출한 세포 또는 파브리 질환 세포에서 Rab5의 발현을 저해하는 물질을 처리하는 경우 Kca3.1 채널의 발현 수준이 회복되는지 여부를 측정하기 위하여 하기의 실험들을 수행하였다.
(a) 28 주령의 정상 마우스의 MAECs, 15 μmol/L의 Gb3에 24 시간 노출시킨 MAECs, 그리고 15 μmol/L의 Gb3와 20 pmol/L의 Rab5C에 대한 siRNA (서열번호 19 및 20의 이중가닥으로 이루어짐)에 24시간 노출시킨 MAECs에서 KCa3.1 채널과 Rab5C의 발현 정도를 웨스턴 블롯으로 측정하였다.
상기 실험에서, i) Kca3.1 채널 및 Rab5C의 발현 수준에 대한 대조구로 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소 효소 (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; GAPDH)의 발현 수준을 측정하였고, ii) Rab5C에 대응하는 siRNA 처리에 대한 대조구로 스크램블 siRNA 용액 100 pmol/L을 처리하여 측정하였다.
(b) 또 다른 실험으로 파브리 마우스 모델에서 배양한 세포에서도 Rab5C siRNA가 KCa3.1 발현을 증가시키고 Rab5C 발현을 억제하는지 알아보았다. 28 주령의 정상 마우스에서 배양한 MAECs, 28주령 Gla-녹아웃 마우스에서 배양한 MAECs(스크램블 siRNA를 24 시간 또는 48 시간 처치), Gla-녹아웃 마우스에서 배양한 MAECs(Rab5C에 대한 siRNA (서열번호 19 및 20의 이중가닥으로 이루어짐)를 24 시간 또는 48 시간 처치)에서 Kca3.1 채널의 발현 수준 및 Rab5C의 발현 수준을 측정하였다.
상기 (b) 실험에서, i) Gla-녹아웃된 세포에 대한 대조구로 야생형 세포를 사용하였고, ii) Kca3.1 채널 및 Rab5C의 발현 수준에 대한 대조구로 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소 효소 (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; GAPDH)의 발현 수준을 측정하였으며, iii) Rab5C에 대응하는 siRNA 처리에 대한 대조구로 스크램블 siRNA 용액 100 pmol/L을 처리하여 측정하였다.
상기 실험 결과, Gb3에 노출된 MAECs 및 Gla-녹아웃된 MAECs 모두 Kca3.1 채널의 발현은 감소되고 Rab5C의 발현 수준은 증가되는 것으로 관찰되었다. 이에 Rab5C의 발현을 저해하는 물질로 서열번호 19 및 20의 이중가닥으로 이루어진 siRNA를 처리한 후 다시 측정한 결과, Kca3.1 채널의 발현은 다시 증가되고 Rab5C의 발현은 다시 감소되어 각 발현의 수준이 야생형 세포와 유사한 정도로 회복되는 것으로 확인되었다 (도 3(a), 및 3(b)).
상기 결과에 비추어, 파브리 질환은 Rab5C의 발현이 증가되고 Kca3.1 채널의 발현은 감소되는 이상을 야기하며, Rab5C의 발현을 저해시키는 경우 Kca3.1 채널의 발현이 다시 정상 수준으로 회복되는 것으로 보아 파브리 질환은 Rab5C 발현의 증가에 따라 Kca3.1 채널의 발현이 감소되면서 일어나는 것으로 생각되었으며, 반대로 Rab5C의 발현을 저해시켜 Kca3.1 채널의 발현을 정상화함으로써 파브리 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있을 것으로 생각되었다.
한편, 도 3(a) 및 3(b)에서 **는 스크램블 siRNA를 처리한 야생형 대조구와 비교하여 P＜0.01이며, ＃＃는 스크램블 siRNA를 처리한 Gb3 처리된 대조구 또는 스크램블 siRNA를 처리한 Gla-녹아웃 대조구와 비교하여 P＜0.01이다.
실시예 4: 파브리 질환 세포에서 Rab5 발현 저해 물질 처리에 따른 Kca3.1 채널 전류 회복 측정 실험
파브리 질환 세포에서 Rab5의 발현을 저해하는 물질을 처리하는 경우 KCa3.1 채널의 발현이 회복되었다. 이와 함께 Kca3.1 전류가 회복되는지 여부를 측정하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다. KCa3.1 전류는 whole cell clamp 실험 방법을 이용하여 기록하였다. KCa3.1 전류는 세포 내 Ca2 + 농도를 1 μM로 고정하고 KCa3.1 전류 활성제인 1-EBIO (100 μM)을 투여하여 최대로 활성화하였으며, KCa3.1 전류 억제제인 TRAM-34 (100 μM)로 억제하였다. KCa3.1 전류의 크기는 이와 같이 활성화시킨 다음 TRAM-34로 억제된 전류의 크기로 측정하였다.
28 주령의 정상 및 Gla-녹아웃 마우스에서 MAECs를 분리하였으며, 이 세포들에서 상기한 방법으로 Kca3.1 채널의 전류를 측정하였다. 스크램블 siRNA를 주입한 정상 MAECs, 스크램블 siRNA를 주입한 Gla-녹아웃 MAECs, 그리고 Rab5C에 대한 siRNA(서열번호 19 및 20의 이중가닥으로 이루어짐)를 주입한 Gla-녹아웃 MAECs에서 Kca3.1 전류를 측정하였다.
본 실험에서, i) Gla-녹아웃된 세포에 대한 대조구로서 정상 세포를 사용하였으며, ii) Rab5C에 대응하는 siRNA의 처리에 대한 대조구로서 스크램플 siRNA를 처리하여 측정하였다.
상기 실험 결과, Gla-녹아웃된 MAECs에서는 Kca3.1 채널 전류가 상당히 감소되는 것으로 관찰되었으며(도 4(a), 도 4(b), 도 4(d)), 이에 Rab5C에 대응하는 siRNA를 처리하는 경우 감소되었던 Kca3.1 채널 전류가 다시 회복되는 것으로 확인되었다 (도 4(b), 도 4(c), 도 4(d)).
한편, 도 4(d)에서 **는 스크램블 siRNA를 처리한 야생형 대조구와 비교하여 P＜0.01이며, ＃＃는 스크램블 siRNA를 처리한 Gla-녹아웃 대조구와 비교하여 P＜0.01이다.
실시예 5: Rab5 발현 저해 물질 처리에 따른 파브리 질환 혈관에서의 아세틸콜린-유도 혈관 내피 세포 의존성 이완 회복 실험
파브리 질환 혈관에 Rab5의 발현을 저해하는 물질을 처리하는 경우, 아세틸콜린에 의해 유도되는 내피 세포 의존성 이완이 회복되는지 여부를 측정하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.
28 주령의 정상 및 Gla-녹아웃 마우스에서 대동맥 환 (aortic ring)을 분리하였다. 분리한 정상 또는 Gla-녹아웃 대동맥 환을 스크램블 siRNA, 또는 Rab 5C에 대한 siRNA(서열번호 19 및 20의 이중가닥으로 이루어짐)에 24시간 노출한 다음 근수축 측정기를 이용하여 혈관평활근의 수축력을 측정하였다. 상기 대동맥 환에서 혈관 수축제인 노에피네프린을 투여하여 수축을 유발하였으며, 수축이 안정 상태에 도달하였을 때 아세틸콜린을 투여하여 내피세포 의존성 이완을 유발하였다.
본 실험에서, i) Gla-녹아웃된 대동맥 환에 대한 대조구로서 야생형 대동맥 환을 사용하였으며, ii) Rab5C에 대응하는 siRNA의 처리에 대한 대조구로서 스크램플 siRNA를 처리하여 측정하였다.
상기 실험 결과, Gla-녹아웃된 대동맥 환에서는 아세틸콜린-유도 혈관 내피 세포 의존성 이완이 상당히 저해되는 것으로 관찰되었으며, 이에 Rab5C에 대응하는 siRNA를 처리하는 경우 저해되었던 아세틸콜린-유도 혈관 내피 세포 의존성 이완이 다시 회복되는 것으로 확인되었다 (도 5(a) 내지 5(d)).
한편, 도 5(d)에서 **는 스크램블 siRNA를 처리한 야생형 대동맥 환 대조구와 비교하여 P＜0.01이며, ＃＃는 스크램블 siRNA를 처리한 Gla-녹아웃 대동맥 환 대조구와 비교하여 P＜0.01이다.
본 명세서는 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 내용은 그 상세한 기재를 생략하였으며, 본 명세서에 기재된 구체적인 예시들 이외에 본 발명의 기술적 사상이나 필수적 구성을 변경하지 않는 범위내에서 보다 다양한 변형이 가능하다. 따라서 본 발명은 본 명세서에서 구체적으로 설명하고 예시한 것과 다른 방식으로 실시될 수 있으며, 이는 본 발명의 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자이면 이해할 수 있는 사항이다.
<110> Ewha University Industry Collaboration Foundation <120> COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING FABRY DISEASE COMPRISING RAB5 INHIBITOR <130> PA130708/KR <160> 24 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA of Rab5A_human <400> 1 aaccaaaaca caaacacuca a 21 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA of Rab5A_human <400> 2 gaguguuugu guuuugguuc g 21 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA of Rab5A_mouse <400> 3 aaccaaaaca caaacacucg g 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA of Rab5A_mouse <400> 4 gaguguuugu guuuugguuc g 21 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA of Rab5A_rat <400> 5 uuuauuucca guauuuggcc c 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA of Rab5A_rat <400> 6 gccaaauacu ggaaauaaaa u 21 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA of Rab5A_chimpanzee <400> 7 aaccaaaaca caaacacuca a 21 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA of Rab5A_chimpanzee <400> 8 gaguguuugu guuuugguuc g 21 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA of Rab5B_human <400> 9 uuugaacugg caaauuuugc u 21 <210> 10 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA of Rab5B_human <400> 10 caaaauuugc caguucaaau u 21 <210> 11 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA of Rab5B_mouse <400> 11 uagucauagc cagguuauca a 21 <210> 12 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA of Rab5B_mouse <400> 12 gauaaccugg cuaugacuag c 21 <210> 13 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA of Rab5B_mouse <400> 13 uagucauagc cagguuauc 19 <210> 14 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA of Rab5B_rat <400> 14 gauaaccugg cuaugacuag c 21 <210> 15 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA of Rab5B_chimpanze <400> 15 uuugaacugg caaauuuugc u 21 <210> 16 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA of Rab5B_chimpanze <400> 16 caaaauuugc caguucaaau u 21 <210> 17 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA of Rab5C_human <400> 17 uuaaguuuug gaauugcaga c 21 <210> 18 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA of Rab5C_human <400> 18 cugcaauucc aaaacuuaac a 21 <210> 19 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA of Rab5C_mouse <400> 19 aaacuugacc guuguaucgu c 21 <210> 20 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA of Rab5C_mouse <400> 20 cgauacaacg gucaaguuug a 21 <210> 21 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA of Rab5C_rat <400> 21 augucauaga ccacaauggc u 21 <210> 22 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA of Rab5C_rat <400> 22 ccauuguggu cuaugacauc a 21 <210> 23 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA of Rab5C_chimpanze <400> 23 aauugacaga ucuuguuccc a 21 <210> 24 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA of Rab5C_chimpanze <400> 24 ggaacaagau cugucaauuu a 21

Claims (12)

  1. Rab5C에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, 및 앱타머로 구성되는 군으로부터 선택되는 Rab5C 발현을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 파브리 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. Rab5C에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, 및 앱타머로 구성되는 군으로부터 선택되는 Rab5C 발현을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 파브리 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
  6. Rab5C에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, 및 앱타머로 구성되는 군으로부터 선택되는 Rab5C 발현을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 파브리 질환의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품 조성물.
  7. Rab5C에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, 및 앱타머로 구성되는 군으로부터 선택되는 Rab5C 발현을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 파브리 질환의 예방 또는 개선용 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제.
  8. Rab5C에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, 및 앱타머로 구성되는 군으로부터 선택되는 Rab5C 발현을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 파브리 질환의 예방 또는 개선용 사료 또는 음용수.
  9. 제1항에 따른 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는 파브리 질환의 예방 또는 치료 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 파브리 질환의 예방 또는 치료 방법은 효소 대체 치료 (ERT)를 병행하여 수행하는 것을 포함하는 방법.
  11. Rab5C의 발현 수준을 측정하는 제제로서, Rab5C mRNA 프로브, 프라이머 쌍, 및 안티센스 뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 파브리 질환 진단용 조성물.
  12. (a) 분리된 생물학적 시료로부터 Rab5C의 발현 수준을 측정하는 단계;
    (b) 상기 Rab5C의 발현 수준을 정상 대조구 시료의 Rab5C 발현 수준과 비교하는 단계; 및
    (c) 상기 분리된 생물학적 시료의 Rab5C 발현 수준이 상기 정상 대조구 시료의 Rab5C 발현 수준보다 높을 경우 파브리 질환으로 판정하는 단계를 포함하는, 파브리 질환 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 파브리 질환 마커 Rab5C를 검출하는 방법.
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WO2017061809A1 (ko) * 2015-10-07 2017-04-13 이화여자대학교 산학협력단 혈관내피세포 기능 부전 진단용 조성물 및 이의 용도

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