CN102921007B - 防治胰岛素抵抗和糖尿病的方法和试剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及防治胰岛素抵抗和糖尿病的方法和试剂。首次证实了胰岛素抵抗或糖尿病患者外周血中淀粉样蛋白或蛋白片段含量显著上升，为胰岛素抵抗和2型糖尿病的诊断提供了新的途径。并且，本发明还首次揭示了淀粉样蛋白β(Aβ)能诱导外周组织产生胰岛素抵抗，其是通过激活JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路而实现的。因此，可以以JAK2/STAT3-SOCS-1通路或其通路蛋白作为筛选药物的靶点，研究防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿病的药物。

Description

防治胰岛素抵抗和糖尿病的方法和试剂

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及防治胰岛素抵抗和糖尿病的方法和试剂。

背景技术

糖尿病主要分为1型糖尿病和2型糖尿病两种类型。1型糖尿病是由于自身免疫系统紊乱，引起胰腺中胰岛β细胞受损，导致胰岛素分泌不足。2型糖尿病是糖尿病的主要形式，90%以上的糖尿病患者属于2型糖尿病，其特点是胰岛素刺激的靶组织出现胰岛素抵抗症状，即胰岛素相对不足。在正常情况下，胰岛β细胞分泌的胰岛素对于血糖水平的动态平衡起着重要作用。胰岛素通过促进肌肉组织和脂肪组织对葡萄糖的吸收，同时抑制肝脏组织的糖异生来降低血糖水平。而在胰岛素抵抗情况下，正常浓度的胰岛素不能达到预期的降糖效果，机体不得不产生更多的胰岛素来补偿，从而维持血糖浓度的稳定。当β细胞分泌的胰岛素不能满足这种补偿时，就会引起高血糖症，表现为糖耐量和空腹血糖值异常，继而引发胰岛β细胞凋亡，最终发展成为2型糖尿病。可见，胰岛素抵抗在2型糖尿病的发生发展中起了至关重要的作用。

胰岛素抵抗与肥胖及静坐的生活方式密切相关，是一种涉及多个组织器官的代谢疾病，其发病机制目前还不是完全清楚。已有的研究认为，血液循环中的激素、细胞因子、来源于脂肪等组织的脂肪酸和葡萄糖等能源物质与胰岛素抵抗密切相关。例如，脂肪组织中脂质的过度积累，能诱导脂肪细胞本身对胰岛素抑制的脂解作用的抵抗，这将导致脂肪组织释放出更多脂肪酸和甘油进入血液循环，继而诱导肌肉和肝脏的胰岛素抵抗。2型糖尿病的动物模型中，自发突变型肥胖症的纯合子小鼠（ob/ob和db/db）被公认为具有重要价值，它们会在出生后2-8周先后表现出高胰岛素血症、高血糖和β细胞功能下降等与人类2型糖尿病相似的症状。

在分子水平，胰岛素通过胰岛素信号通路行使其生物功能。胰岛素信号通路由一个复杂、高度整合的网络组成。概括起来，胰岛素结合到胰岛素受体后，激发其受体酪氨酸激酶活性，使其磷酸化胰岛素受体底物(Insulin receptor substrate，IRS)，激活的IRS随后通过PI3K/Akt通路发挥其代谢调控作用。目前研究表明，胰岛素抵抗可能通过以下几种机制抑制胰岛素信号通路：①蛋白水平的下调，包括促进通路中重要蛋白质的降解，抑制其转录或转录后翻译。例如有报道显示SREBP-1c能抑制IRS-2的转录，导致IRS-2蛋白水平下调。②蛋白质的翻译后修饰，抑制其活性。例如胰岛素受体和IRS能被PKC、S6K1、ERK、JNK及IKKβ等激酶磷酸化丝氨酸残基，抑制胰岛素信号的转导。③促进胰岛素信号通路抑制酶的酶活或表达，包括酪氨酸磷酸酶PTP1B、PIP₃的磷酸酶PTEN、SHIP等。④信号通路中的重要蛋白和其抑制蛋白的结合。例如炎性细胞因子IL-6等能上调细胞因子信号通路的抑制子(Suppressor ofcytokine signaling，SOCS)的蛋白表达，SOCS能结合到胰岛素受体抑制信号转导。

阿尔茨海默病(AD)是老年痴呆病中最常见的一种，是一种以记忆能力减退、认知功能障碍、行为异常为特征的慢性进行性神经退行性疾病，其发病率随年龄增大而增加。

AD的主要病理特征是大脑内出现以沉积的Aβ为中心的淀粉样斑块(amyloidplaque)，或称老年斑(senile plaque)和由高度磷酸化的微管相关蛋白tau蛋白形成的神经丝缠结(neurofibrillary tangle)。Aβ是细胞一种正常的代谢产物，能在其受体帮助下透过血脑屏障。健康人血液和脑脊液中的Aβ浓度处于一种平衡状态。大量证据支持Aβ是AD的主要致病因子。目前被广泛接受的淀粉样蛋白级联假说(Amyloidcascade hypothesis)认为，Aβ在AD的发生、发展中起着主导作用，脑中Aβ的生成和清除的失衡，使得Aβ在脑中积累，进而导致神经元和其突触功能的损伤，最终造成认知的损害。

目前认为Aβ主要由脑中的神经元产生。Aβ由APP经过β-分泌酶和γ-分泌酶酶解形成。由于γ-分泌酶的切割位点不同，主要产生两种形式：Aβ40和Aβ42。Aβ42的聚集能力较强因而毒性也较大。APP和γ-分泌酶分布都相对广泛，在很多组织中都有表达。β-分泌酶最初认为只在脑中的神经元高表达，但近来有研究显示，β-分泌酶也表达在神经胶质细胞和其它外周的细胞，例如脂肪细胞和肝细胞，这提示外周组织也可能产生Aβ。

研究表明，在外周组织能检测到Aβ。Joachim等最先报道在AD病人的血管、皮肤、皮下组织和肠等非神经组织检测到Aβ沉积，在一部分正常的老年个体中也能在非神经组织检测到Aβ的沉积。Lee等报道在正常人皮下脂肪和内脏脂肪中都能检测到Aβ的沉积。另外，包涵体肌炎的病灶处也能检测到Aβ。这些沉积的Aβ，可能是由脑中产生，再经过循环系统运送到外周，也有可能是由外周的细胞产生的。但目前的研究都只检测到外周Aβ，而它们有什么功能还不清楚，血浆中的Aβ浓度本身也并不适合作为AD的生物标记（Liu,J.K.,et al.,J Alzheimers Dis.2010;20(4):1233-42.）。

除Aβ外目前还发现多种淀粉样蛋白(Amyloid protein)，其在各种器官和组织的异常沉积会造成系列病变。截至2010年，已知的淀粉样蛋白有27种，其中公认为与糖尿病有密切关系的是胰岛淀粉样多肽(IAPP)，IAPP是胰岛β细胞分泌的一种正常产物，含37个氨基酸，但与Aβ在序列和剪切机制上大为不同。尸体病理解剖检验发现，90%的2型糖尿病患者胰岛中有IAPP沉积，伴β细胞数量减少，且胰岛淀粉样变性程度与糖尿病的病变程度一致，说明IAPP与2型糖尿病发病相关。人源IAPP可诱导β细胞凋亡，且二者呈剂量相关性。转入人源IAPP基因的纯合子肥胖小鼠在高糖、高脂饮食、生长激素或糖皮质激素处理后胰岛内很快出现大量IAPP变性沉积，β细胞凋亡水平大于复制水平，数量下降，最终发展为2型糖尿病。这些证据表明，IAPP在胰岛中变性沉积，导致β细胞凋亡，数量减少是2型糖尿病致病机制之一。但没有在先证据显示，同为淀粉样蛋白的Aβ在胰岛素的靶组织如肝脏等能诱导2型糖尿病的另一特征胰岛素抵抗，或者Aβ在2型糖尿病的发病中具有与IAPP类似的功能。

流行病学的研究显示，糖尿病患者相对于正常人有高约两倍的罹患AD的风险。虽然其机理目前仍不清楚，有人认为糖尿病能影响Aβ的代谢。例如Ho等报道在AD模型小鼠中用高脂诱导胰岛素抵抗能显著增加Aβ40和Aβ42的生成，同时脑中老年斑的沉积加剧，学习记忆能力的损害也恶化。Cao等报道在AD模型小鼠中用糖水诱导胰岛素抵抗，脑中老年斑的沉积也加剧，主要是由于脑中沉积的Aβ42增高了约2倍，水迷宫实验结果也显示了学习记忆能力的损害恶化。但是Takeda等的研究表明，AD模型小鼠与2型糖尿病模型小鼠杂交的后代，显示学习记忆能力的损害发生加剧，脑中Aβ的总量没有变化，而是显示脑血管出现炎性并伴随淀粉样血管病变。

综上，尽管现有技术中对于糖尿病或胰岛素抵抗与AD的关系有过研究，然而还没有明确的、可信的结论，在机理也不明确。因此，本领域还需要进一步地研究Aβ与糖尿病或胰岛素抵抗的相关性，并找到有用的、适于药物开发的靶点。

发明内容

本发明的目的在于提供防治胰岛素抵抗和糖尿病的方法和试剂。

在本发明的第一方面，提供抑制JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路激活，抑制JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路蛋白表达或活性，或抑制淀粉样蛋白β的表达或活性的抑制剂的用途，用于制备防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿病的药物。

在另一优选例中，所述的JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路蛋白包括：JAK2蛋白，STAT3蛋白或SOCS-1蛋白。

在另一优选例中，所述的JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路激活是：淀粉样蛋白β(Aβ)导致的JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路激活。

在另一优选例中，所述的淀粉样蛋白β(Aβ)包括：全长的淀粉样蛋白β，或其蛋白片段。更佳地，所述的蛋白片段选自：Aβ40、Aβ42、Aβ25-35等。

在另一优选例中，所述的抑制剂包括(但不限于)：

特异性干扰JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路蛋白表达的干扰分子(如小干扰RNA分子或反义核苷酸)；或

特异性与JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路蛋白结合的结合分子(如抗体或配体)；或

抑制JAK2的AG490；或

特异性干扰淀粉样蛋白β或其前体蛋白表达的干扰分子(如小干扰RNA分子或反义核苷酸)；或

特异性与淀粉样蛋白β结合的结合分子(如抗体或配体)；或

β-分泌酶抑制剂、γ-分泌酶抑制剂和调节剂或抗淀粉样蛋白聚集剂。

在另一优选例中，所述的干扰分子是siRNA，其序列选自SEQ ID NO:2-SEQ IDNO:7的一种或多种。

在另一优选例中，所述的干扰分子具有以下结构：

Seq_正向-X-Seq_反向；

其中，Seq_正向的核苷酸序列如SEQ ID NO:36所示；Seq_反向为与Seq_正向互补的序列；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_{反 向}不互补。

在另一优选例中，所述的干扰分子是腺病毒表达载体。

在另一优选例中，所述的干扰分子可形成以下结构：

其中，

Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述，

||表示在Seq_正向和Seq_反向之间形成的氢键。

在另一优选例中，所述的结合分子是抗淀粉样蛋白β的抗体。

在另一优选例中，所述的抗淀粉样蛋白β的抗体包括(但不限于)：3F5，BA27，BC05，1H3，6C8，solanezumab(Eli Lilly and Company)，Bapineuzumab(JANSSENAlzheimer Immunotherapy Research & Development，LLC；Elan Pharmaceuticals,Inc.,Wyeth)，MABT5102A(Genentech,Inc.)，Ponezumab(Pfizer,Inc.),IntravenousImmunoglobulin(Baxter Healthcare)。最近已经发现，人免疫球蛋白(Ig)包含结合Aβ的抗体(Weksler et al.,2005)，静脉注射Ig有助于促进Aβ的清除。

在本发明的另一方面，提供抑制JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路激活或抑制JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路蛋白表达或活性的抑制剂，其是siRNA，其序列选自SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:36。

在本发明的另一方面，提供一种筛选防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿病的潜在物质的方法，所述方法包括：

(1)将候选物质与含有淀粉样蛋白β和JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路的体系接触；

(2)筛选出抑制淀粉样蛋白β对JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路或通路蛋白的激活的物质，所述物质是防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿病的潜在物质。

在另一优选例中，步骤(1)包括：向含有淀粉样蛋白β和JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路的体系中添加候选物质；和

步骤(2)包括：检测JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路或通路蛋白的变化，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的、含有淀粉样蛋白β和JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路的体系；

若候选物质在统计学上(如显著抑制20%以上，较佳的50%以上；更佳的80%以上)抑制淀粉样蛋白β对JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路或通路蛋白的激活，则该候选物质是防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿病的潜在物质。

在另一优选例中，所述的含有淀粉样蛋白β和JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路的体系选自：细胞体系(或细胞培养物体系)、亚细胞体系、溶液体系、动物体系或组织体系。

在另一优选例中，所述的含有淀粉样蛋白β和JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路的体系是：细胞内包含淀粉样蛋白β和JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路的体系；或以淀粉样蛋白β处理包含JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路的细胞后获得的体系。

在另一优选例中，所述的含有淀粉样蛋白β和JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路的体系是胰岛素的靶器官的细胞如肝细胞、肌肉细胞或脂肪细胞。

在另一优选例中，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿病有用的物质。

在另一优选例中，所述的候选物质选自(但不限于)：针对JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路或信号通路中的蛋白设计的干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)、小分子化合物。

在本发明的另一方面，提供淀粉样蛋白β(包括：全长的淀粉样蛋白β，或其蛋白片段。更佳地，所述的蛋白片段选自：Aβ40、Aβ42、Aβ25-35等)用作检测胰岛素抵抗或糖尿病的血液(包括：血浆或血清)标志物的用途。

在本发明的另一方面，提供一种特异性识别淀粉样蛋白β(较佳地识别血液(包括：血浆或血清)中的淀粉样蛋白β)的试剂的用途，用于制备检测胰岛素抵抗或糖尿病的试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述的特异性识别淀粉样蛋白β的试剂选自：

特异性结合淀粉样蛋白β的结合分子(如抗体或配体)；

特异性扩增淀粉样蛋白β或其前体蛋白的编码基因或切割前体蛋白的蛋白酶的编码基因的引物；或

特异性识别淀粉样蛋白β或其前体蛋白的编码基因或切割前体蛋白的蛋白酶的编码基因的探针。

在另一优选例中，所述的特异性结合淀粉样蛋白β的结合分子是抗体，选自：3F5，1H3，6C8，10C11，7B10，BA27或BC05。

在本发明的另一方面，提供一种检测血液(包括：血浆或血清)中胰岛素抵抗或糖尿病的试剂盒，所述的试剂盒中含有：特异性识别淀粉样蛋白β的试剂。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、Aβ诱导肝原代细胞和H4IIE细胞胰岛素抵抗。

a，b，c，小鼠肝原代细胞给予Aβ25-35(a，b)和Aβ42(c)处理后对胰岛素信号通路的影响，给予的剂量和时间见图。免疫印迹法分析了小鼠肝原代细胞InsR，Akt和GSK-3β的磷酸化。其中，(a)为细胞用指定剂量的Aβ25-35孵育60h，(b)为细胞用10μM Aβ25-35孵育指定的时间，(c)为细胞用10μM Aβ42孵育60h；之后给予或不给予100nM胰岛素刺激20min。

d，大鼠肝癌细胞株H4IIE中糖质新生情况。细胞用指定剂量的Aβ25-35孵育60h，然后用50nM胰岛素再处理3h。数据以平均值和标准差表示，**P<0.01，***P<0.001。

图2、Aβ诱导HepG2细胞胰岛素抵抗。

a，b，HepG2细胞给予Aβ25-35处理后对胰岛素信号通路的影响，给予的剂量和时间见图。免疫印迹法分析了HepG2细胞InsR，Akt和GSK-3β的磷酸化。其中，(a)为用指定剂量的Aβ25-35孵育60h，(b)为10μMAβ25-35孵育指定时间；之后给予或不给予100nM胰岛素处理20min。

图3、高血糖病人血浆中Aβ水平显著升高。

ELISA检测正常血糖和高血糖人群的血浆中Aβ40/42水平。正常血糖n=26；高血糖n=35，数据以平均值和标准误表示。

图4、APP/PS1小鼠一些基本表型正常。

a，雄性APP/PS1小鼠(n=9)和同窝野生型(WT)小鼠(n=8)10-19周(w)的体重。

b，c，d，12周和16周的摄食(b)、体脂含量(c)、瘦体重含量(d)。

e，f，20周龄雄性APP/PS1小鼠(n=4)和同窝野生型(WT)小鼠(n=6)血脂中重要的主要脂质指标(e)，谷丙转氨酶和天冬氨酸转氨酶水平(f)。数据以平均值和标准差表示。

图5、APP/PS1小鼠显示随年龄加重的糖耐量受损和胰岛素抵抗症状。

a，b，10周或18周雄性APP/PS1小鼠(每一年龄n=14-16)和同窝野生型(WT)小鼠(每一年龄n=17-19)的葡萄糖耐受试验(2g kg^-1)。

c，d，13周或19周雄性APP/PS1小鼠(每一年龄n=16)和同窝野生型(WT)小鼠(每一年龄n=17-20)的葡萄糖耐受试验(0.75U kg^-1)。

e，f，葡萄糖耐受试验GTT(e)和胰岛素耐受试验ITT(f)的曲线下面积(AUC)。

g，饥饿和喂食状态下APP/PS1小鼠(n=6，4)和WT同窝小鼠(n=6，6)血浆胰岛素水平。

数据以平均值和标准差表示，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图6、APP/PS1小鼠肝脏和肌肉胰岛素刺激后的信号激活受损。

a，20周的APP/PS1小鼠和同窝野生型(WT)小鼠的肝中胰岛素刺激的InsR和Akt的磷酸化。b，(a)中InsR和Akt的磷酸化水平的定量。c，20周的APP/PS1小鼠和同窝野生型(WT)小鼠的肌肉中胰岛素刺激的Akt的磷酸化。d，(c)中Akt的磷酸化水平的定量。数据以平均值和标准差表示，*P<0.05，**P<0.01。

图7、肝脏、肌肉和脂肪中重要炎性因子及其下游基因表达变化。

a，b，c，20周的APP/PS1小鼠(n=4)和野生型(WT)对照(n=4)的肝(a)，肌肉(b)和白色脂肪组织(WAT)中炎性因子和相关基因表达的定量PCR分析。数据以平均值和标准差表示，与对照组相比，*P<0.05。

图8、APP/PS1小鼠肝脏中SOCS-1蛋白表达上调。

a，20周的APP/PS1小鼠(n=3)和野生型(WT)对照(n=3)的肝SOCS-1、SOCS-3蛋白表达的免疫印迹分析。b，a中SOCS-1、SOCS-3蛋白表达的定量分析。数据以平均值和标准差表示，**P<0.01。

图9、Aβ在肝原代细胞中上调SOCS-1的mRNA和蛋白水平。

a，b，c，d，定量PCR(a)和免疫印迹(b，c，d)分析小鼠肝原代细胞中SOCS-1和SOCS-3的表达。细胞以10μM Aβ25-35处理指定的时间(a，b)，以指定剂量的Aβ25-35(c)或10μM Aβ42(d)处理60h。数据以平均值和标准差表示，*P<0.05，**P<0.01。

图10、Aβ通过上调SOCS-1诱导肝细胞产生胰岛素抵抗。

a，两种不同的siRNA对原代肝细胞中SOCS-1表达的抑制。b，在指定的siRNA存在下，给予Aβ25-35(10μM)或不给于Aβ25-35处理60h的原代肝细胞中InsR和Akt的磷酸化水平，其中，SOCS-1RNAi1的用量是40nM；SOCS-1RNAi2的用量是40nM。c，(b)中InsR和Akt的磷酸化水平的定量，其中，SOCS-1RNAi1的用量是40nM；SOCS-1RNAi2的用量是40nM。数据以平均值和标准差表示，*P<0.05。

图11、Aβ能诱导STAT3和JAK2的磷酸化激活。

a，b，c，小鼠原代肝细胞以指定剂量的Aβ25-35处理36h(a)，10μM Aβ25-35处理指定时间(b)或10μM Aβ42处理36h(c)，磷酸化STAT1(Tyr701)磷酸化STAT3(Tyr705)和磷酸化JAK2(Tyr1007/1008)的蛋白水平的免疫印迹分析。d，20周的APP/PS1小鼠和野生型对照小鼠肝中STAT3和JAK2的酪氨酸残基磷酸化水平。e，(d)中STAT3和JAK2的酪氨酸残基磷酸化水平的定量分析。

图12、Aβ(10μM)诱导SOCS-1上调依赖于STAT3和JAK2。

a，b，c，通过RNAi下调STAT3或JAK2(a，c)或AG490(b)抑制JAK2阻止由Aβ介导的SOCS-1蛋白水平的上升。其中，STAT3RNAi1的用量是40nM；STAT3

RNAi2的用量是40nM；AG490的用量是10μM；JAK2RNAi1的用量是40nM；JAK2RNAi2的用量是40nM。

图13、Aβ诱导的胰岛素抵抗依赖于STAT3和JAK2。

a，c，e，在Aβ(10μM)诱导的胰岛素抵抗状态下，通过RNAi(a，e)下调STAT3或JAK2或通过AG490(c)抑制JAK2使得InsR和Akt的磷酸化水平降低得到了显著回复；其中，STAT3RNAi1的用量是40nM；STAT3RNAi2的用量是40nM；AG490的用量是10μM；JAK2RNAi1的用量是40nM；JAK2RNAi2的用量是40nM。b，d，f，(a，c，e)中磷酸化的InsR和Akt水平的定量分析，数据以平均值和标准差表示，*P<0.05。

图14、Aβ的抗体1H3、6C8的降糖作用，以抗体IgG作为对照。

图15、6C8抗体注射9个月后(每周注射一次)，检测饥饿4小时的小鼠血糖(A)、胰岛素(B)水平以及HOMA-IR，显示APP/PS1小鼠的血糖显著下降更为显著。

图16、注射Aβ的抗体1H3(A、B)和6C8(C、D)，能显著降低APP/PS1小鼠肝脏中的STAT3和JAK2活性和SOCS-1的表达。B、D图分别是A、C图的灰度统计结果。

图17、下调JAK2蛋白水平能显著降低JAK2的磷酸化水平，STAT3的磷酸化水平也显著下调，SOCS-1的蛋白表达也显著下降。B图是A图的灰度统计结果。

图18、葡萄糖耐受实验显示(A和B)，注射了JAK2siRNA的腺病毒的APP/PS1小鼠糖耐量有显示提高。胰岛素耐受实验显示(C和D)，注射了JAK2siRNA的腺病毒的APP/PS1小鼠胰岛素明显改善。胰岛素刺激后，注射了JAK2siRNA的腺病毒的APP/PS1小鼠肝脏组织InsR和Akt磷酸化水平显著高于注射对照病毒的APP/PS1小鼠(E和F)。

具体实施方式

本发明人经过广泛的研究，首次证实了胰岛素抵抗或糖尿病患者外周血中淀粉样蛋白或蛋白片段含量显著上升，为胰岛素抵抗和2型糖尿病的诊断提供了新的途径。并且，本发明还首次揭示了淀粉样蛋白β(Aβ)能诱导外周组织产生胰岛素抵抗，其是通过激活JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路(即诱导JAK2/STAT3依赖的SOCS-1上调)而实现的。因此，可以以JAK2/STAT3-SOCS-1通路或其通路蛋白作为筛选药物的靶点，研究防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿病的药物。

检测胰岛素抵抗或糖尿病的试剂或试剂盒

基于本发明人的上述新发现，可以将Aβ或其蛋白片段(包括Aβ40、Aβ42、Aβ25-35等)作为诊断胰岛素抵抗或糖尿病的标志物：(i)进行胰岛素抵抗或糖尿病的分型、鉴别诊断、和/或易感性分析；(ii)评估相关人群的胰岛素抵抗或糖尿病治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法；(iii)早期评估相关人群胰岛素抵抗或糖尿病患病风险，早期监测早期防治。比如，可分离出由Aβ在血液(血浆或血清)含量升高而导致胰岛素抵抗或糖尿病的人群，从而可进行更有针对性地治疗。

因此，本发明提供了Aβ(包括其前体蛋白或蛋白片段)或其编码基因的用途，用于制备诊断(或检测)胰岛素抵抗或糖尿病的试剂或试剂盒。

可采用各种本领域已知的技术来检测Aβ(包括其前体蛋白或蛋白片段)的存在与否以及表达、沉积情况，这些技术均包含在本发明中。例如可用已有的技术如ELISA法、Western印迹法、Southern印迹法、DNA序列分析、PCR等，这些方法可结合使用。

本发明还提供了用于在分析物(血液)中检测Aβ(包括其前体蛋白或蛋白片段)的存在与否以及表达情况的试剂。优选的，当进行基因水平的检测时，可以采用特异性扩增Aβ(包括其前体蛋白或蛋白片段)基因的引物；或特异性识别Aβ基因的探针来确定Aβ基因的存在与否；当进行蛋白水平的检测时，可以采用特异性结合Aβ蛋白的结合分子(如抗体或配体)来确定Aβ蛋白的表达情况。

作为本发明的优选方式，所述的试剂是抗体(单抗或多抗)，其可特异性结合Aβ或其蛋白片段。利用特异性结合Aβ蛋白的抗体来检测分析物中Aβ蛋白表达情况的方法是本领域人员熟知的技术。例如，采用所述的抗体，可通过ELISA方法检测到血液中Aβ或其蛋白片段的存在情况。ELISA技术是本领域技术人员所熟知的。

针对Aβ基因的特异性引物或探针的设计是本领域人员熟知的技术，例如，制备一种探针，其可与Aβ基因上特定位点发生特异性结合，而不与Aβ基因以外的其它基因特异性结合，且所述探针带有可检测信号。或制备一对引物，其可特异性扩增出Aβ基因。

本发明还提供了用于在分析物中检测Aβ基因的存在与否以及表达情况的试剂盒，该试剂盒包括：特异性结合Aβ蛋白的抗体或配体；特异性扩增Aβ基因的引物或特异性识别Aβ基因的探针。

此外，所述的试剂盒中还可包括用于抗原抗体反应、杂交、显色、提取DNA、PCR等所需的其它各种试剂，包括但不限于：显色液、酶标液、包被液、洗涤液、抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液等。

此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或蛋白、核酸序列分析软件等。

信号通路及相关蛋白

如本发明所用，所述的“(信号)通路”是指由一系列蛋白或基因发生相互制约或相互作用而形成的信号系统，其一般会导致一些细胞事件的发生。所述的JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路包括(但不限于)：JAK2基因(和/或其编码的蛋白)、STAT3基因(和/或其编码的蛋白)、SOCS-1(和/或其编码的蛋白)。

所述的JAK2基因的核苷酸序列例如如GenBank登录号NM_004972所示；其蛋白氨基酸序列例如如GenBank登录号NP_004963所示。

所述的STAT3基因的核苷酸序列例如如GenBank登录号NM_139276，NM_213662，NM_003150所示；其蛋白氨基酸序列例如如GenBank登录号NP_644805，NP_998827，NP_003141所示。

所述的SOCS-1基因的核苷酸序列例如如GenBank登录号NM_003745所示；其蛋白氨基酸序列例如如GenBank登录号NP_003736所示。

SOCS蛋白家族包括8个成员：CIS和SOCS-1―SOCS-7。细胞内SOCS蛋白表达通常较低，但在受细胞因子刺激时能明显上调。SOCS蛋白与胰岛素信号的关系以SOCS-1和SOCS-3的研究最多。SOCS-1敲除小鼠血糖很低，其胚胎成纤维细胞分化为脂肪细胞的能力增强(Kawazoe，Y.，et al.，Signal transducer and activator oftranscription(STAT)-induced STAT inhibitor1(SSI-1)/suppressor of cytokine signaling1(SOCS1)inhibits insulin signal transduction pathway through modulating insulinreceptor substrate1(IRS-1)phosphorylation.J Exp Med，2001.193(2):p.263-9)，提示胰岛素信号在这种SOCS-1敲除细胞中的增强。通过腺病毒，直接在小鼠肝脏中过表达SOCS-1或SOCS-3，都能诱导明显的胰岛素抵抗。SOCS-1和SOCS-3在2型糖尿病的模型小鼠db/db小鼠的肝脏中也是高表达的。这些研究结果提示，SOCS蛋白在某些因素导致的胰岛素抵抗中发挥了重要作用。

当用于作为筛选的靶标时或人为建立筛选系统时，以上的蛋白或编码基因可以是天然存在的，比如其可被纯化和分离自哺乳动物；也可以是重组制备的，比如可以根据常规的基因重组技术来生产重组的蛋白。此外，任何不影响这些蛋白的生物活性的变化形式都是可用的，如它们的功能未发生改变的衍生物或变异体。

用途及筛选方法

本发明人研究显示，Aβ能在小鼠肝原代细胞中上调胰岛素通路的抑制蛋白SOCS-1，并且APP/PS1小鼠肝脏中SOCS-1表达也升高。在小鼠肝原代细胞中下调SOCS-1蛋白表达能缓解Aβ对胰岛素信号通路的抑制。Aβ还能在肝原代细胞中激活JAK2/STAT3，并且APP/PS1小鼠肝脏中JAK2/STAT3活性也更高。通过RNAi或抑制剂在小鼠肝原代细胞中下调或抑制JAK2/STAT3，能缓解Aβ对SOCS-1的上调及对胰岛素信号通路转导的抑制。

基于本发明人的新发现，对Aβ与JAK2/STAT3-SOCS-1通路的研究有着多方面的用途，所述的用途包括(但不限于)：筛选抑制Aβ对该信号通路的激活的物质，该物质可用于制备防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿病的药物。

因此，本发明提供了筛选防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿病的潜在物质的方法，将候选物质与含有Aβ和JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路的体系接触；筛选出抑制Aβ对JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路或通路蛋白的激活的物质，所述物质是防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿病的潜在物质。

如本文所用，所述的“抑制”是指具有统计学意义的“抑制”。即：显著地“抑制”。如与对照组的蛋白活性、蛋白表达、蛋白相互作用相比，显著“抑制”、20%以上，较佳的50%以上；更佳的80%以上。

所述的含有Aβ和JAK2/STAT3-SOCS-1通路的体系选自：细胞体系(或细胞培养物体系)、亚细胞体系、溶液体系、动物体系或组织体系。可以是：细胞内包含Aβ和JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路的体系；或以Aβ处理包含JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路的细胞后获得的体系。例如，所述的含有JAK2/STAT3-SOCS-1通路的体系是肝细胞。

作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿病有用的物质。

当进行筛选时，可以采用本领域熟知的各种技术来确定蛋白或其编码基因的变化情况以及相互作用情况。

可以采用多种常规的技术来鉴定系统中基因的转录或蛋白表达情况。这些技术包括但不限于：寡核苷酸杂交技术(如探针)，多聚酶链反应(PCR)，聚丙烯酰胺凝胶电泳，免疫印迹(如Western印迹)等。

通过上述方法初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿病真正有用的物质。

本发明还提供了采用所述筛选方法获得的可用于防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿病的潜在物质。所述物质是抑制Aβ导致的JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路激活的物质，或是JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路或通路蛋白的抑制剂。

基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种抑制JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路激活、抑制JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路蛋白表达或活性或抑制淀粉样蛋白β的表达或活性的抑制剂的用途，用于制备防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿病的组合物。

如本文所用，所述的抑制JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路激活、抑制JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路蛋白表达或活性或抑制淀粉样蛋白β的表达或活性的抑制剂包括了拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等。

所述的抑制JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路激活、抑制JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路蛋白表达或活性或抑制淀粉样蛋白β的表达或活性的抑制剂是指任何可降低JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路蛋白的活性、降低JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路基因或蛋白的稳定性、下调JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路蛋白的表达、减少JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路蛋白有效作用时间、或抑制JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路有用的物质，从而可用于防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿病。例如，所述的抑制剂是：特异性干扰JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路蛋白表达的干扰分子；或特异性与JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路蛋白结合的结合分子；或抑制JAK2的AG490；或特异性干扰淀粉样蛋白β或其前体蛋白表达的干扰分子；或特异性与淀粉样蛋白β结合的结合分子

作为本发明的一种优选方式，所述的抑制剂是一种特异性抗淀粉样蛋白β的抗体。所述的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。可用淀粉样蛋白β免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等来生产多克隆抗体；多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。与之相似的，表达淀粉样蛋白β或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。所述的抗体也可以是单克隆抗体，此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In MonoclonalAntibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier，N.Y.，1981)。

作为本发明的一种优选方式，所述的抑制剂是一种小干扰RNA分子(siRNA)。如本文所用，所述的“小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNA interference)过程。

小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。

作为本发明的特别优选的方式，提供了一种效果良好的小干扰RNA分子，所述的小干扰RNA分子具有良好的抑制JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路的效果。所述的小干扰RNA分子是具有SEQ ID NO:2-7所示的核苷酸序列的小干扰RNA分子。

此外，小干扰RNA包含的正义链和反义链可通过一个或多个编码正义链和反义链的表达盒来制备。当正义链和反义链由一个单独的表达盒编码时，它们可以从生成的转录物中断裂形成分离的正义链和反义链，其后杂交生成双链小干扰RNA。

所述的小干扰RNA可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。

本发明还提供了一种制备防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿病的药物的方法，所述方法包括：合成和/或纯化前述筛选获得的对于防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿病有用的物质，作为用于防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿病的药物。

可将获得的对于防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿病有用的物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、静脉内、或皮下给药。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

I.材料和方法

哺乳动物细胞株

HepG2：人肝癌细胞；购自ATCC。

H4IIE：大鼠肝癌细胞；购自ATCC。

人群样品收集与诊断评估

在获得了中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所伦理道德委员会的批准以及受试者知情同意的情况下进行试验。正常血糖组和高血糖组空腹外周静脉血样品和空腹血糖、血脂数据从上海市徐汇区中心医院获得。正常血糖组共26人(男性17人，女性9人，平均年龄58.6岁，SD=5.5)。高血糖患者共35人(男性21人，女性14人，平均年龄59.6岁，SD=6.7)。按照WHO于1999年颁发的标准，空腹血糖受损的判定为：空腹血糖浓度大于或等于6.1mmol/L并小于7.0mmol/L，并且对于测定2小时餐后血糖的情况，血糖浓度必须小于7.8mmol/L；糖尿病的判定为：空腹血糖浓度大于或等于7.0mmol/L或餐后2小时血糖浓度大于或等于11.1mmol/L。本发明中把空腹血糖受损和糖尿病合并为高血糖组进行研究。正常组血糖平均值为5.3mmol/L，SD=0.5。高血糖组血糖平均值为8.1mmol/L，SD=2.5。

小鼠品系和饲养条件

APPswe/PSENdE9小鼠及其同窝野生型对照均购自南京大学模式动物研究所，饲养于中国科学院营养科学研究所动物房。所有小鼠均按照实验动物管理和使用委员会的规程进行饲养，由斯莱克公司提供充足的水源和标准饲料。

主要试剂和试剂盒

Aβ25-35：Sigma公司，货号A4559；

Aβ42：Apeptide公司，货号AP3006；

AG490：Sigma公司，货号T3434；

胶原酶：Sigma公司，货号C0130；

胶原：Millipore公司，货号08-115；

酪氨酸磷酸酶抑制剂混合液：Sigma公司，货号P2850；

丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂混合液：Sigma公司，货号P5726；

蛋白酶抑制剂混合液：Sigma公司，货号P8340；

Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit：Invitrogen公司，货号A22189；

Lipofectamine2000：Invitrogen公司，货号11668019；

注射用胰岛素：Lilly France S.A.S.公司，商品名，优泌林。通用名，重组人胰岛素注射液。

胰岛素放射免疫分析盒：北京北方生物技术研究所；

Aβ40ELISA kit：Covance公司，货号SIG-38950，其中结合Aβ40的一抗是BA27；

Aβ42ELISA kit：Covance公司，货号SIG-38952，其中结合Aβ42的一抗是BC05；

DMEM：Invitrogen公司，货号12100-046；

无糖DMEM：Invitrogen公司，货号11966-025；

FBS：Invitrogen公司，货号16000-044；

Trizol：Invitrogen公司，货号15596-018；

核酸分析电泳用琼脂糖：Biowest公司；

反转录试剂盒(M-MLV)：Promega公司；

SYBR Green PCR mixture：ABI公司；

蛋白印迹化学发光试剂SuperSignal West Pico：Pierce公司；

PVDF膜：Millipore公司。

抗体

实验仪器

微量移液器购自Gilson公司，超低温冰箱购自Thermo Scientific Forma公司，PCR仪、垂直电泳槽、湿转转膜仪和配套电源购自Bio-Rad公司，冷冻离心机购自Eppendorf公司，高速离心机购自Beckman公司，高速匀浆机购自Qiagen公司，精密天平及pH计购自Mettler Toledo公司，0.22μm、0.45μm针头式过滤器购自Millipore公司，ChemiDoc化学发光成像系统购自Wealtec公司，酶联免疫检测仪购自MolecularDevice公司，X光片及X光片洗片机购自Kodak公司。FreeStyle血糖检测仪及血糖试纸，购自TheraSense公司，The minispec mq20型核磁共振仪(NMR)购自Bruker公司，HITACHI7020全自动生化分析仪购自HITACHI公司，ABI7900HT实时定量PCR仪购自Applied Biosystems公司。

小鼠肝原代细胞分离与培养

10周龄的C57BL/6J雄鼠麻醉后打开腹腔，从下腔静脉以7ml/min的速率灌入50ml在37℃预热的灌流液P1(含有4.8mM KCl，1.2mM MgSO₄，1.2mM KH₂PO₄，7.455mM HEPES，7mg/ml NaCl，2mg/ml NaHCO₃，0.1mM EGTA，3.6mg/ml葡萄糖)，之后再灌入50mL37℃预热的灌流液P2(含有4.8mM KCl，1.2mM MgSO₄，1.2mM KH₂PO₄，7.455mM HEPES，7mg/ml NaCl，2mg/ml NaHCO₃，3.6mg/ml葡萄糖，1.372mM CaCl₂，0.66mg/ml胶原酶)进行消化。消化好的肝脏置于预先放入20ml不含胶原酶的预冷灌流液P2的10cm培养皿中，剪碎后用移液管反复吹打并用70μm孔径细胞筛网过滤至50ml的离心管中。4℃50g离心2分钟后重悬，随即用不含胶原酶的预冷灌流液P2洗3遍，再用15ml含有20U/ml的青霉素，20μg/ml的链霉素，10%FBS的DMEM培液重悬。台盼蓝染色确定细胞存活率并进行细胞计数后用含有10%FBS的DMEM培液稀释，按照5×10⁵细胞每孔铺于用胶原包被过的12孔板。过夜培养后，更换培养液用于后续试验。

HepG2、H4IIE细胞培养

HepG2，H4IIE细胞株培养于含10%FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和25mM葡萄糖的DMEM培养液中。细胞培养箱保持37℃，并含5%二氧化碳。细胞一般每2-3天传代一次，保持传代前的密度超过80%。细胞在使用前16-24小时接种到12孔板中。

Aβ的配制、预处理

Aβ25-35的配制：称取适量Aβ25-35粉末，溶于PBS中至终浓度为1mM，分装后储存于-80℃冰箱备用。孵育：参照文献方法(Coraci，I.S.，et al.，CD36，a class Bscavenger receptor，is expressed on microglia in Alzheimer’s disease brains and canmediate production of reactive oxygen species in response to beta-amyloid fibrils.Am JPathol，2002.160(1):p.101-12)，将储存的1mM Aβ25-35在37℃、5%CO₂培养箱中孵育2天后使用。

Aβ42的配制：称取适量Aβ42粉末，溶于去离子水中至终浓度为2mM，分装后储存于-80℃冰箱备用。孵育：参照文献方法(Jana，M.，C.A.Palencia，and K.Pahan，Fibrillar amyloid-beta peptides activate microglia via TLR2:implications for Alzheimer’sdisease.J Immunol，2008.181(10):p.7254-62)，将储存的2mM Aβ42在37℃、5%CO₂培养箱中孵育5天后使用。

细胞处理和转染

铺好细胞的12孔板，过夜培养后，换无血清的含有25mM葡萄糖的DMEM培液，同时加入指定浓度的Aβ25-35或Aβ42。AG490在加入Aβ25-35后24小时加入。需要胰岛素刺激的，加入100nM胰岛素刺激细胞20分钟后收集细胞样品。

需要转染的细胞，细胞在转染前16-24小时接种到12孔板中。采用Lipofectamine2000转染。转染结束后48小时加入Aβ处理。

Western blot

细胞用SDS-PAGE上样缓冲液(50mM Tris-Cl，pH6.8，2%SDS，10%甘油，100mMDTT)裂解，100℃煮沸10分钟变性。组织用加了蛋白酶抑制剂(10μg/ml pepstatin，5μg/ml leupeptin，20μg/ml aprotinin，1mM PMSF和50nM trichostatin A)和磷酸酶抑制剂混合物的RIPA裂解液(20mM Tris，pH7.5，100mM KCl，0.1%Nonidet P-40，1mM EDTA，10%glycerol，50mM NaF，10mM sodium pyrophosphate)裂解后，进行蛋白浓度测定，相同量的蛋白(～60μg)加入适量5X上样缓冲液100℃加热约10分钟。细胞或组织样品离心后取上清上样于9%或12%SDS聚丙烯酰胺凝胶，电泳，湿转，PVDF膜用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭1小时。封闭结束后，用TBST室温、中速在摇床上洗涤3次，每次5分钟，随后加入配制在含5%BSA的TBST中的一抗，室温孵育3小时或者4℃过夜。一抗中一般加入0.02～0.05%的叠氮钠抑菌以便重复使用。一抗结合完成后，用TBST室温、中速在摇床上洗涤3次，每次5分钟。加入配制在含5%脱脂奶粉的TBST中的二抗(1:1000～1:5000)，室温孵育1～3小时，再用TBST洗膜3次。加入蛋白印迹化学发光试剂SuperSignal West Pico反应2～5分钟，用保鲜膜包好压片，先依次以5、15、30、60秒曝光显影曝光在Kodak X-Omat胶片上，再根据结果调整曝光时间或者显影时间。

葡萄糖输出实验

经过指定药物处理过的培养在12孔板内的H4IIE细胞，用PBS洗三遍，每孔加入400μl含有20mM乳酸钠，2mM丙酮酸钠的无糖DMEM培养液，需要胰岛素刺激的，同时加入50nM胰岛素刺激。3小时后收集培养液，用RedGlucose/Glucose Oxidase Assay试剂盒测定培养液中的葡萄糖水平，同时测定每孔细胞裂解后的蛋白浓度作为内标。

人群血液样本的血浆分离和Aβ40/42测定

外周静脉血，加入EDTA混匀抗凝。血浆样品是将血液4℃2700g离心10min，收集上层血浆部分，分装保存在-80℃冰箱。血浆中的Aβ40/42用Covance公司的ELISA试剂盒按照说明书测定。

RNA抽提，反转录

12孔板每孔细胞用1ml Trizol裂解，组织约100mg用1ml Trizol裂解，室温放置5分钟，然后加入0.2ml的氯仿，剧烈摇晃15秒后，室温静置2-3分钟，12,000×g，4℃离心15分钟后，取上清至新的离心管中(约0.45ml)，再加入0.5ml的异丙醇混匀，室温放置10分钟后，12,000×g，4℃离心10分钟，沉淀用1ml75%的酒精洗涤后，去上清，晾干残留乙醇，将沉淀溶于适量DEPC水中，检测纯度及浓度。用Takara公司的RNase-free DNase I处理抽提得到的总RNA，以除去可能的DNA污染，然后按照DNase I的说明书纯化经过消化的总RNA，再检测其纯度及浓度。OD260/280>1.9即符合使用标准。取2-4μg总RNA，按照M-MLV reverse transcriptase(Promega)反转录系统提供的说明书进行反转录，引物选用random hexamer。反转录得到cDNA，用于后续的PCR检测。

实时定量PCR

Real-time PCR用384孔板，以三复孔方式进行。每孔含有5μl Power GreenPCR Master Mix(ABI)和1μl模板DNA(反转录获得的cDNA根据基因的表达丰度稀释10-60倍不等)，正向和反向引物的浓度均为0.5μM，用ABI公司的7900system来实时监测荧光。PCR反应条件为50℃2min，95℃10min，随后是95℃15s和60℃1min，40个循环。为了确定没有非特异性扩增，每一PCR产物都用熔解曲线进行分析，同时也进行琼脂糖电泳以确保产物的特异性。同一块板检测actin作为内参，用于比较其它基因的相对表达量。各种基因的常规PCR及qRT-PCR引物见表1实时定量PCR部分。

表1

小鼠基因型鉴定

幼鼠年龄为22-23天时断奶，分笼，进行基因型鉴定。将剪刀用酒精灯烧烫，迅速剪取5mm左右小鼠尾巴尖端，加200μl50mM NaOH，100℃加热1小时，充分振荡至小鼠尾巴松散，加15μl1M Tris-HCl(pH8.0)，振荡混匀，离心使残渣沉淀，得到基因组DNA即可用于PCR鉴定基因型。使用的PCR引物见表1转基因小鼠基因型鉴定PCR。

小鼠基本表型分析

所有实验对照组小鼠都是和APPswe/PSENdE9转基因小鼠相同性别的同窝小鼠。小鼠在10-19周龄每周测量体重。小鼠在12周到16周中，每两天测量一次小鼠的进食量，得到每天摄食量的平均值。小鼠的体脂重量(fat mass)和瘦体重(lean mass)通过核磁共振用Minispec Mq7.5Analyzer(Bruker，Germany)测出，然后用体重标准化后得到体脂含量和瘦体重含量值。

葡萄糖耐受实验(GTT，glucose tolerance test)

葡萄糖耐受性实验前，将小鼠饥饿15小时，检测空腹血糖后，腹腔注射葡萄糖溶液(根据小鼠体重，2g/kg)，然后分别用血糖仪检测注射后15、30、60和120分钟小鼠尾静脉血液中葡萄糖的浓度。血糖用血糖仪(FreeStyle，Alameda，California，USA)检测。

胰岛素耐受实验(ITT，insulin tolerance test)

胰岛素耐受性实验，实验前小鼠禁食4小时，检测空腹血糖后，根据体重注射0.75U/kg的人胰岛素注射液，分别用血糖仪检测注射后15，30，60和120分钟小鼠的血糖水平。

小鼠血浆胰岛素水平、血脂含量和Aβ40/42的检测

小鼠眼眶取血。检测空腹胰岛素水平须将小鼠饥饿16h。血浆样品是将血液4℃2700g离心10min，收集上层血浆部分，保存在-80℃冰箱。血浆胰岛素水平用北京北方生物制品研究所的放射性免疫试剂盒，根据说明书进行检测。甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的血浆水平是用HITACHI7020全自动生化分析仪测定。血浆中的Aβ40/42用Covance公司的ELISA试剂盒按照说明说测定。

小鼠肝脏、肌肉中胰岛素敏感性的检测

20周龄的小鼠饥饿16小时后称重，麻醉后打开腹腔，先取一片肝和一侧大腿上肌肉一块，迅速冻入液氮作为未处理的对照。随后按照体重从门静脉注射2U/kg的人胰岛素注射液，5分钟后取余下肝脏，10min后取另一侧大腿上肌肉。取下的组织立即冻入液氮，组织采集完毕后将样品转移至-80℃冰箱。后续进行蛋白抽提和westernblot实验检测胰岛素信号通路关键蛋白的激活水平。

数据分析和统计

统计学分析采用GraphPad5.0软件，除特别标注外，所有定量数据均以平均值(Mean)±标准偏差(SD)表示。两组间差异的显著性分析采用非成对Student’s t-test。多因素比较用Two-Way ANOVA进行差异的显著性分析。P<0.05代表具有统计学意义的显著性差异，P<0.01代表差异极显著。

II.实施例

实施例1、Aβ诱导肝细胞产生胰岛素抵抗

由于外周血液循环中的Aβ主要是由肝脏吸收和代谢(Ghiso，J.，et al.，Systemiccatabolism of Alzheimer’s Abeta40 and Abeta42.J Biol Chem，2004.279(44):p.45897-908)，本发明人选用肝细胞检测Aβ对胰岛素信号通路的影响。

先使用Aβ25-35片段处理肝细胞，这个片段是全长Aβ42的毒性核心(Pike，C.J.，et al.，Structure-activity analyses of beta-amyloid peptides:contributions of the beta25-35region to aggregation and neurotoxicity.J Neurochem，1995.64(1):p.253-65)。Westernblot实验显示，Aβ25-35能抑制小鼠肝原代细胞受胰岛素刺激后的胰岛素信号通路并具有剂量和时间效应，表现为Insulin receptor(InsR)、Akt、Glycogen synthase kinase3β(GSK3β)的磷酸化水平的下降(图1a和1b)。

本发明人同时也使用了全长的Aβ42处理小鼠肝原代细胞，发现Aβ42也能抑制胰岛素对胰岛素信号通路的激活，Western blot实验显示InsR、Akt、GSK3β的磷酸化水平也下降了(图1c)。胰岛素的重要功能之一是抑制肝细胞的糖质新生。在大鼠肝癌细胞株H4IIE中，胰岛素能将对照组的糖质新生降低约60%。但在加入Aβ的实验组，随着加入Aβ25-35浓度的升高，胰岛素对糖质新生的抑制作用也逐渐降低(图1d)。

本发明人在人肝癌细胞株HepG2中也得到了类似的结果。Western blot实验显示Aβ25-35能抑制HepG2细胞受胰岛素刺激后的胰岛素信号通路并具剂量效应和时间效应，表现为胰岛素受体(InsR)、Akt、GSK3β的磷酸化水平的下降(图2a和2b)。

以上数据表明，Aβ能在培养的肝细胞中诱导胰岛素抵抗。

实施例2、高血糖病人血浆中Aβ水平显著升高

Aβ能诱导体外培养的细胞胰岛素抵抗，而体内胰岛素抵抗又能导致高血糖血症，于是本发明人检测了血糖正常的人群以及高血糖人群(包括临床确诊空腹血糖受损病人和糖尿病病人)血浆中的Aβ水平。ELISA结果显示，高血糖人群血浆中Aβ40/42水平均显著高于血糖正常的人群(图3)。

此结果提示，血浆中Aβ40/42升高与高血糖血症相关，而胰岛素抵抗又是高血糖血症的重要诱因，提示血浆中Aβ40/42升高与胰岛素抵抗相关。

实施例3、过表达Aβ的APPswe/PSENdE9(APP/PS1)小鼠显示胰岛素抵抗的症状

1、APP/PS1小鼠血浆中Aβ显著升高

如前述实施例所述，在细胞水平Aβ能在肝细胞中诱导胰岛素抵抗并且高血糖病人血浆Aβ水平提高，这些发现促使本发明人进一步在动物水平研究Aβ能否诱导胰岛素抵抗。

本发明人选取了AD的模型小鼠APP/PS1作为研究对象。APP/PS1小鼠是常用的双转基因AD小鼠模型。它是由朊蛋白启动子启动表达含瑞典突变(KM594/5N)的小鼠/人嵌合淀粉样蛋白前体蛋白APP和缺失外显子9的剪切APP的γ-分泌酶PS1(PSENdE9)两个质粒共同注射入小鼠受精卵而建立的(Jankowsky，J.L.，et al.，Co-expression of multiple transgenes in mouse CNS:a comparison of strategies.BiomolEng，2001.17(6):p.157-65)。文献报道在6个月大的这种小鼠的脑中能观察到少量的淀粉样沉淀，同时脑中也能检测到微量的聚集状的Aβ40和Aβ42，而其认知能力没有受到损害(Savonenko，A.，et al.，Neurobiol Dis，2005.18(3):p.602-17)。在小于6个月的小鼠脑中并没有检测到聚集状的Aβ40和Aβ42(Garcia-Alloza，M.，et al.，Neurobiol Dis，2006.24(3):p.516-24；Jankowsky，J.L.，et al.，Hum Mol Genet，2004.13(2):p.159-70)，而20周龄转基因小鼠血液中的Aβ已经显著增加了(Burgess，B.L.，et al.，Elevated plasma triglyceride levels precede amyloid deposition in Alzheimer’sdisease mouse models with abundant A beta in plasma.Neurobiol Dis，2006.24(1):p.114-27)。本发明人通过ELISA实验也检测到Aβ40和Aβ42在20周龄的APP/PS1小鼠血浆中与同窝对照小鼠比显著增加(表2)。已有研究指出，2-3月大的APP/PS1转基因小鼠血浆中Aβ即有显著增加(Takeda，S.，et al.，Biochem Biophys Res Commun，2009.385(2):p.193-7)。

表2、20周龄APP/PS1小鼠和同窝对照小鼠ELISA检测血浆中Aβ水平

	WT	APP/PS1
			Aβ40(pg/ml)	N.D.	263.6±42.9
Aβ42(pg/ml)	N.D.	136.8±37.1

2、APP/PS1小鼠一些基本表型正常

本发明人观察了APP/PS1小鼠10-20周龄的一些基本表型，发现APP/PS1小鼠和同窝对照小鼠相比，10-19周的体重(图4a)，12周和16周的摄食(图4b)、体脂含量(图4c)、瘦体重含量(图4d)，20周龄血脂中重要的主要脂质指标(图4e)都没有显著差异。由于外周的Aβ主要是由肝脏吸收和代谢(Ghiso，J.，et al.，Systemic catabolism ofAlzheimer’s Abeta40 and Abeta42.J Biol Chem，2004.279(44):p.45897-908)，本发明人同时也检测了20周龄小鼠肝功能的重要指标谷丙转氨酶和天冬氨酸转氨酶(图4f)，发现也没有显著变化，提示外周Aβ的显著升高对肝脏功能没有造成明显损伤。

以上结果显示，APP/PS1小鼠在10-20周龄时的一些基本表型是正常的。

3、APP/PS1小鼠显示随年龄增长而加重的糖耐量受损和胰岛素抵抗症状

本发明人检测了APP/PS1小鼠和同窝野生型小鼠的糖耐量和胰岛素敏感性的变化。葡萄糖耐受实验显示，APP/PS1小鼠糖耐量在10周时有轻微受损，到18周时显示更加严重的糖耐量受损，表明有随年龄增加而糖耐量损伤加重的表型(图5a，5b，5e)。胰岛素耐受实验显示，APP/PS1小鼠胰岛素敏感性的损害更显著，表现为13周龄时胰岛素耐受已有显著损伤，到19周时损伤更加显著(图5c，5d，5f)。20周时测定APP/PS1小鼠和同窝对照小鼠饥饿和喂食状态下的胰岛素水平发现，APP/PS1的胰岛素水平均显著高于同窝对照小鼠，显示由于胰岛素抵抗引起的胰岛素代偿性分泌升高(图5g)。

以上结果显示，APP/PS1小鼠随年龄增长呈现糖耐量受损和胰岛素抵抗加重的趋势。

4、肌肉的胰岛素抵抗情况

为了确认APP/PS1小鼠肝脏和肌肉中是否出现胰岛素抵抗，本发明人在小鼠肝脏和肌肉中检测了胰岛素诱导的下游信号通路的激活。结果显示，胰岛素刺激后，APP/PS1小鼠肝脏组织的InsR和Akt的磷酸化水平要显著低于同窝对照小鼠(图6a，6b)，表明在APP/PS1小鼠肝脏组织中胰岛素下游的信号转导受损。相一致的是，在肌肉组织中也观察到了与肝脏组织类似的现象。胰岛素刺激后，APP/PS1小鼠肌肉的Akt磷酸化水平也显著低于同窝对照小鼠(图6c，6d)，显示肌肉中胰岛素信号转导也受到抑制。

以上结果显示，APP/PS1小鼠肝脏和肌肉中确实存在着胰岛素抵抗现象。

5、Aβ的抗体的降糖作用

本发明人对3个月大的雄性APP/PS1小鼠使用Aβ的抗体3F5(购自Yes BiotechLaboratories Ltd，效价1:50-1:500)进行腹腔注射治疗，给药量为每次10mg/kg。每周注射一次，对照的雄性APP/PS1小鼠注射同剂量IgG。

注射3个月后，检测饥饿4小时的小鼠血糖显示，APP/PS1小鼠的血糖从152.3mg/dl降低到127mg/dl，说明Aβ的抗体3F5治疗有显著的降糖效果。

本发明人对3个月大的雄性APP/PS1小鼠使用Aβ的抗体1H3(购自Yes BiotechLaboratories Ltd，效价1:50-1:500)，6C8(购自Yes Biotech Laboratories Ltd，效价1:50-1:500)进行腹腔注射治疗，给药量为每次10mg/kg。每周注射一次，对照的雄性APP/PS1小鼠注射同剂量IgG。

1H3和6C8抗体注射3个月后，检测饥饿4小时的小鼠血糖显示，APP/PS1小鼠的血糖显著下降(如图14所示)，说明Aβ的抗体1H3，6C8治疗有显著的降糖效果。

6C8抗体注射9个月后，检测饥饿4小时的小鼠血糖和胰岛素水平显示，APP/PS1小鼠的血糖显著下降更为显著(图15A)，并且小鼠的血浆胰岛素也显著下降(图15B)。根据小鼠空腹血糖和空腹胰岛素计算出的稳态模型的胰岛素抵抗指数(homeostasismodel assessment-estimated insulin resistance，HOMA-IR)也显示Aβ的抗体6C8治疗能显著提高APP/PS1小鼠的胰岛素敏感性(图15C)。

实施例4、Aβ通过上调SOCS-1诱导胰岛素抵抗

1、Aβ能上调小鼠肝脏和肝原代细胞中的SOCS-1表达水平

本发明人的研究发现，APP/PS1小鼠显示出随着年龄增加而严重的胰岛素抵抗现象，但导致这种现象的机制还不太清楚。由于炎性反应在Aβ诱导的神经损伤中起重要作用，并且炎性反应同样也是胰岛素抵抗的一个重要诱因，因此本发明人猜想Aβ是否可能通过激活外周组织的炎性反应来诱导胰岛素抵抗的。本发明人通过定量PCR检测了APP/PS1小鼠及其同窝对照组小鼠胰岛素的靶器官——肝脏、肌肉和脂肪组织的一些重要炎性因子以及介导其信号通路的下游因子的基因表达情况。本发明人发现，APP/PS小鼠肝脏和肌肉中SOCS-1和SOCS-3，肝脏中GP130，脂肪中IL-1α，IL-8基因表达显著升高。其余的炎性因子和其下游蛋白表达没有明显变化(图7a，7b，7c)，说明在APP/PS小鼠的胰岛素靶器官中没有明显的炎性反应。

SOCS蛋白最初被发现是细胞因子信号通路的抑制因子，本发明人重点研究了SOCS蛋白在胰岛素信号通路中的作用。Western blot实验显示，与同窝对照小鼠相比，APP/PS1小鼠肝脏中的SOCS-1蛋白表达显著上调了，而SOCS-3蛋白表达没有变化(图8a，8b)。

以上结果提示，SOCS-1参与APP/PS1小鼠的胰岛素抵抗形成。

为了验证SOCS-1蛋白表达的上调是否是由Aβ直接诱导的，本发明人用Aβ处理小鼠肝原代细胞。定量PCR结果显示Aβ25-35能上调SOCS-1基因转录并具有时间效应，而SOCS-3基因表达没有变化(图9a)。Western blot也显示，Aβ25-35能上调SOCS-1蛋白表达水平，并且存在剂量效应和时间效应，而SOCS-3的蛋白表达水平则不受影响(图9b，9c)。全长的Aβ42同样也能上调SOCS-1蛋白表达，并且也不影响SOCS-3的蛋白水平(图9d)。

以上结果显示，Aβ能直接上调SOCS-1基因转录和蛋白表达。

实施例5、Aβ通过上调SOCS-1诱导肝细胞产生胰岛素抵抗

本发明人进一步检测了Aβ诱导的胰岛素抵抗是否依赖于SOCS-1的上调。通过两条不同的RNAi序列(见表3，SOCS-1siRNA-1和SOCS-1siRNA-2)来下调SOCS-1以后(图10a)，Aβ25-35对肝原代细胞受胰岛素刺激后的胰岛素信号通路的抑制作用都得到缓解，表现为InsR、Akt磷酸化水平的显著回复(图10b，10c)。

表3

siRNA名称

siRNA序列

Scrambled siRNA	UUC UCC GAA CGU GUC ACG U(SEQ ID NO:1)
		SOCS-1siRNA-1	CCA GGU GGC AGC CGA CAA U(SEQ ID NO:2)
SOCS-1siRNA-2	GAG ACC UUC GAC UGC CUU U(SEQ ID NO:3)
		STAT3siRNA-1	UAU CAU CGA CCU UGU GAA A(SEQ ID NO:4)
STAT3siRNA-2	CCA ACG ACC UGC AGC AAU A(SEQ ID NO:5)
		JAK2siRNA-1	GCA AAC CAG GAA UGC UCA A(SEQ ID NO:6)
JAK2siRNA-2	GGA AUG GCC UGC CUU ACA A(SEQ ID NO:7)

以上结果显示，Aβ主要通过上调SOCS-1诱导肝细胞产生胰岛素抵抗。

JAK2/STAT3信号通路介导了Aβ诱导的SOCS-1上调和胰岛素抵抗

Aβ能诱导STAT3和JAK2的磷酸化激活

已知SOCS蛋白在静息状态的细胞中通常表达较低，在受细胞因子刺激后，主要通过激活JAK/STAT信号通路诱导SOCS基因转录(Ronn，S.G.，N.Billestrup，and T.Mandrup-Poulsen，Diabetes and suppressors of cytokine signaling proteins.Diabetes，2007.56(2):p.541-8)。而Aβ又能在神经细胞中激活STAT3和JAK2/Tyk2(Wan，J.，et al.，Tyk2/STAT3 signaling mediates beta-amyloid-induced neuronal cell death:implications in Alzheimer’s disease.J Neurosci，2010.30(20):p.6873-8；Chiba，T.，etal.，Amyloid-beta causes memory impairment by disturbing the JAK2/STAT3 axis inhippocampal neurons.Mol Psychiatry，2009.14(2):p.206-22)，因此本发明人检测了Aβ是否能在肝原代细胞中激活STAT3和JAK2。Western blot实验显示，Aβ25-35能以剂量依赖地诱导STAT3酪氨酸残基磷酸化，而STAT1的酪氨酸残基磷酸化水平则不受Aβ25-35调控，说明Aβ能特异性地激活STAT3。Aβ处理后，JAK2的酪氨酸残基磷酸化变化呈现和STAT3类似的趋势(图11a)。进一步的研究显示，Aβ25-35诱导STAT3和JAK2的酪氨酸残基磷酸化具有良好的时间效应，随着诱导时间的延长STAT3和JAK2的酪氨酸残基磷酸化水平总体上逐渐升高(图11b)。全长的Aβ42同样也能诱导STAT3和JAK2的酪氨酸残基磷酸化(图11c)。同时，本发明人还检测发现APP/PS1小鼠肝脏组织的STAT3和JAK2酪氨酸残基磷酸化水平要显著高于同窝对照小鼠(图11d，11e)，说明APP/PS1小鼠肝脏中的STAT3和JAK2处于相对高活性状态，并且该状态也很可能是由Aβ诱导产生的。

以上结果表明，Aβ能在肝原代细胞诱导STAT3和JAK2的磷酸化激活，而且APP/PS1小鼠肝脏中的STAT3和JAK2活性也较高。

本发明人对3个月大的雄性APP/PS1小鼠使用Aβ的抗体1H3(购自Yes BiotechLaboratories Ltd，效价1:50-1:500)，6C8(购自Yes Biotech Laboratories Ltd，效价1:50-1:500)进行腹腔注射治疗，给药量为每次10mg/kg。每周注射一次，对照的雄性APP/PS1小鼠注射同剂量IgG。

分别注射1H33个月后，注射6C89个月后检测APP/PS1小鼠肝脏中的STAT3和JAK2活性和SOCS-1的表达，发现注射Aβ的抗体能显著降低APP/PS1小鼠肝脏中的STAT3和JAK2活性和SOCS-1的表达，如图16所示。

实施例6、Aβ诱导的SOCS-1上调依赖于STAT3和JAK2

基于JAK/STAT信号通路对于SOCS表达的重要调控作用，本发明人检测了Aβ对SOCS-1的上调是否是由STAT3和JAK2所介导的。本发明人设计了2条针对STAT3的不同siRNA序列(见表3，STAT3siRNA-1和STAT3siRNA-2)，发现当STAT3下调时，Aβ对于SOCS-1的上调作用被抑制(图12a)。用抑制剂AG490抑制JAK2或通过两条不同的RNAi序列(见表3，JAK2siRNA-1和JAK2siRNA-2)来下调JAK2，Aβ对于SOCS-1的上调作用被抑制(图12b，12c)。

以上结果显示，Aβ对SOCS-1的上调是依赖于STAT3和JAK2的。

实施例7、Aβ诱导的胰岛素抵抗依赖于STAT3和JAK2

最后，本发明人检测了Aβ是否通过激活JAK2/STAT3信号通路来诱导胰岛素抵抗。当通过RNAi降低STAT3蛋白表达后，Aβ对胰岛素信号通路激活的抑制作用显著缓解，Aβ导致的InsR和Akt的磷酸化水平降低得到了显著回复(图13a，13b)。类似地，通过抑制剂抑制JAK2或通过RNAi下调JAK2，Aβ对胰岛素诱导的胰岛素信号通路激活的抑制作用显著缓解，Aβ导致的InsR和Akt的磷酸化水平降低也得到了显著回复(图13c，13d，13e，13f)。

以上结果显示，STAT3和JAK2介导了Aβ诱导的胰岛素抵抗。

为了在体内验证Aβ诱导的胰岛素抵抗依赖于JAK2/STAT3/SOCS-1信号通路，本发明人包装了特异性下调JAK2表达的siRNA腺病毒(针对序列为5'-GCAAACCAGGAATGCTCA-3'，SEQ ID NO:36)通过尾静脉注射使其在APP/PS1小鼠肝脏内过表达。结果，过表达JAK2siRNA的腺病毒能下调JAK2的蛋白水平(JAK2i)，STAT3的蛋白水平未受影响。与预期一致，下调JAK2蛋白水平能显著降低JAK2的磷酸化水平，STAT3的磷酸化水平也显著下调，SOCS-1的蛋白表达也显著下降了，如图17所示。LacZi用于作为实验对照，可沉默细菌的LacZ基因。

JAK2siRNA腺病毒载体(Ad-JAK2i)构建方法具体如下：腺病毒的构建按照Invitrogen公司的BLOCK-iT^TM腺病毒RNAi表达系统的说明书构建。简要步骤如下，设计了针对JAK2编码序列5'-GCAAACCAGGAATGCTCA-3'(SEQ ID NO:36)的寡核苷酸：5'-CACCGCAAACCAGGAATGCTCAACGAATTGAGCATTCCTGGTTTGC-3'(SEQ ID NO:37)以及5'-AAAAGCAAACCAGGAATGCTCAATTCGTTGAGCATTCCTG GTTTGC-3'(SEQ ID NO:38)，合成后退火，插入到U6-entry载体(Invitrogen)中。随后与pAd/BLOCK-iT^TMDEST质粒进行重组。重组完成后得到的质粒用Pac1内切酶线性化后转染293A细胞进行第二次重组，转染10天左右得到重组腺病毒。腺病毒的纯化利用CsCl梯度超速离心进行纯化。

LacZi siRNA腺病毒载体(Ad-LacZi)构建方法具体如下：用Invitrogen的腺病毒试剂盒提供的针对细菌LacZ基因干扰片段的寡核苷酸，退火，插入到U6-entry载体中。余下步骤与JAK2siRNA腺病毒载体构建方法一致。

进一步本发明人研究了注射了JAK2siRNA的腺病毒的APP/PS1小鼠的的糖耐量和胰岛素敏感性的变化。葡萄糖耐受实验显示，注射了JAK2siRNA的腺病毒的APP/PS1小鼠糖耐量有显示提高(图18A和B)。胰岛素耐受实验显示，注射了JAK2siRNA的腺病毒的APP/PS1小鼠胰岛素明显改善(图18C和D)。为了确认APP/PS1小鼠肝脏胰岛素抵抗的改善，本发明人在注射了JAK2siRNA的腺病毒的APP/PS1小鼠肝脏中检测了胰岛素诱导的下游信号通路的激活。结果显示，胰岛素刺激后，注射了JAK2siRNA的腺病毒的APP/PS1小鼠肝脏组织的InsR和Akt的磷酸化水平要显著高于注射了对照病毒的APP/PS1小鼠(图18E和F)，表明在APP/PS1小鼠肝脏中下调JAK2能调高APP/PS1小鼠的胰岛素敏感性。提示Aβ在体内的诱导胰岛素抵抗效应是由JAK2信号通路介导的。

实施例8、筛选方法

细胞模型：前面所述的小鼠原代肝细胞，其中包含JAK2/STAT3信号通路及其下游的SOCS-1，并以10μM Aβ42处理小鼠原代肝细胞36h。

测试组：用候选物质处理的上述细胞模型；

对照组：不用候选物质处理的上述细胞模型。

如果与对照组相比，测试组中的Aβ42对JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路的激活显著下降50%以上，则说明该候选物质是潜在可防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿病的物质。

采用上述方法，将由SEQ ID NO:4-7(依次为候选物质1-4)，以及SEQ ID NO:1的siRNA(候选物质5)作为候选物质，处理所述细胞模型。结果发现，候选物质1-4是潜在可防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿病的物质；而候选物质5没有作用。

实施例9.检测试剂盒

一种检测胰岛素抵抗的试剂盒，该试剂盒中含有：

容器1，以及装于该容器中特异性结合Aβ的抗体；

以及，其它一些容器，其中分别装有显色液、酶标液、包被液、洗涤液。

以及，说明检测方法的使用说明书。

讨论

本发明人先在细胞水平研究了Aβ与胰岛素抵抗的相关性，发现Aβ能抑制小鼠肝原代细胞受胰岛素刺激后的胰岛素信号通路，降低胰岛素对肝细胞糖质新生的抑制作用。在人群样本中本发明人发现高血糖病人血浆中的Aβ显著升高，由于胰岛素抵抗是高血糖的重要诱因，提示体内Aβ与胰岛素抵抗相关。血浆中过表达Aβ的APP/PS1小鼠显示随年龄增长而加重的糖耐量受损和胰岛素抵抗症状，APP/PS1小鼠肝脏和肌肉中胰岛素信号通路的激活受到抑制，表明APP/PS1小鼠肝脏和肌肉中确实存在着胰岛素抵抗现象，提示血浆中Aβ的过表达能直接诱导胰岛素抵抗。最后本发明人研究发现Aβ通过激活JAK2/STAT3信号通路上调SOCS-1而产生其诱导胰岛素抵抗的作用。以上研究说明，外周Aβ的异常升高能诱导胰岛素抵抗。

本发明人的实验选择的是小于或等于20周龄的APP/PS1小鼠，此时小鼠脑内淀粉样沉淀很不明显，小鼠的认知能力也没有受损，显示此时产生的胰岛素抵抗不是由于老年痴呆导致的，并提示外周的胰岛素抵抗有可能由外周Aβ的升高引起。与广泛接受的一些2型糖尿病的小鼠模型相似，APP/PS1在10周左右开始表现出高胰岛素血症和高血糖等人类2型糖尿病的类似症状，是一种潜在的新的2型糖尿病动物模型。

AD病人脑中Aβ的沉积是一个重要的病理特征，AD病人血浆中Aβ的水平有研究报道是显著升高了，但也有报道没有显著变化。造成这些研究结果不同的原因可能来自实验设计，例如测试对象的年龄、疾病的严重程度不同等。很多AD病人外周Aβ水平没有显著变化也部分解释了只有小部分的AD病人发展出空腹血糖受损和2型糖尿病。另一方面，尽管有报道显示糖尿病患者血浆中抗Aβ的抗体比起对照人群显著升高，提示糖尿病人血浆中Aβ有可能也升高了，但糖尿病人血浆中Aβ水平是否有变化还未见报道。本发明人的研究发现在高血糖人群(包括空腹血糖受损和糖尿病)血浆中Aβ的显著升高，提示血浆中的Aβ水平可能成为胰岛素抵抗和2型糖尿病的一个潜在生物标志物。

本发明人的研究发现Aβ通过激活JAK/STAT继而上调SOCS-1。SOCS蛋白最初被发现是细胞因子信号通路的抑制子，细胞因子通过激活JAK/STAT信号通路上调SOCS蛋白，SOCS蛋白结合到JAK蛋白，抑制信号通路的转导形成一个负反馈通路，从而调控细胞因子产生的生物效应。后续研究发现SOCS蛋白也能抑制胰岛素信号通路，有些细胞因子诱导的胰岛素抵抗需要SOCS蛋白参与。虽然Aβ也能诱导胶质细胞表达TNF-α等细胞因子，但是本发明人并没有在APP/PS1小鼠外周组织中检测到IL-1β，IL-6，TNF-α等炎性因子的表达升高，而且细胞因子诱导的SOCS基因转录往往比较宽泛，一种细胞因子能诱导多个SOCS基因表达(Fasshauer，M.，et al.，Insulinresistance-inducing cytokines differentially regulate SOCS mRNA expression via growthfactor-and Jak/Stat-signaling pathways in3T3-L1adipocytes.J Endocrinol，2004.181(1):p.129-38)。本发明人的研究发现，Aβ处理肝原代细胞时，只有SOCS-1的转录被激活。这些结果都提示Aβ不是通过上调一些炎性因子诱导SOCS-1表达的。另一方面，Aβ有较强的促氧化应激能力，例如Aβ能诱导人和小鼠小胶质细胞和巨噬细胞产生活性氧分子(reactive oxygen species，ROS)。ROS又能激活JAK/STAT信号通路。这些结果提示Aβ有可能是通过产生ROS继而激活JAK/STAT/SOCS信号通路的。本发明人还发现Aβ在肝原代细胞能激活ERK(数据未列出)，而ERK能磷酸化STAT3的丝氨酸残基调控STAT3的活性，这些细胞内信号的整合有可能决定了Aβ上调SOCS-1的特异性。

胰岛素抵抗发生发展过程非常复杂，不同因素引起的胰岛素抵抗虽然最终都可能导致糖尿病，但针对糖尿病诱因不同应采取不同的治疗方法，因此阐明胰岛素抵抗的机理对于2型糖尿病的治疗具有指导性意义。本发明人在小鼠体外和体内的研究结果都显示外周Aβ能通过激活JAK2/STAT3/SOCS-1信号通路诱导胰岛素抵抗。这些结果加深了对胰岛素抵抗和2型糖尿病致病机理的理解，提示外周Aβ水平有可成为胰岛素抵抗和2型糖尿病的一个生物标记物。降低Aβ的生成、下调外周Aβ、抑制Aβ激活的信号通路等都有可能成为治疗胰岛素抵抗和2型糖尿病的重要策略。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (2)

1.抑制JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路激活，抑制JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路蛋白表达或活性，或抑制淀粉样蛋白β的表达或活性的抑制剂的用途，用于制备防治或缓解胰岛素抵抗或糖尿病的药物；所述的抑制剂是特异性干扰JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路蛋白表达的干扰分子，所述的干扰分子是siRNA，其序列选自SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4；或

所述的干扰分子具有以下结构：

Seq_正向-X-Seq_反向；

其中，Seq_正向的核苷酸序列如SEQ ID NO:36所示；Seq_反向为与Seq_正向互补的序列；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_{反 向}不互补。

2.抑制JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路激活或抑制JAK2/STAT3-SOCS-1信号通路蛋白表达或活性的抑制剂，其是siRNA，其序列选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:36。