JP6959913B2 - 肝分泌型代謝制御因子阻害作用による肥満関連疾患治療剤 - Google Patents
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Description
(1)肥満関連疾患を治療するための薬物をスクリーニングする方法であって、ペントラキシン4の作用を阻害する候補薬物の能力を指標として用い、該能力を有する候補薬物を肥満関連疾患を治療するための薬物として特定することを特徴とする、方法。
(2)前記指標が、ペントラキシン4遺伝子の発現を阻害する能力である、(1)に記載の方法。
(3)前記指標が、ペントラキシン4遺伝子のmRNAの転写開始を阻害する能力、ペントラキシン4遺伝子のmRNAを分解する能力、または該mRNAからタンパク質への翻訳を阻害する能力である、(2)に記載の方法。
(4)ペントラキシン4遺伝子の転写調節領域を含んでなるDNA断片とレポーター遺伝子を含んでなるDNA断片が作動可能なように連結された核酸分子を用いることを特徴とする、(2)または(3)に記載の方法。
(5)前記指標が、ペントラキシン4タンパク質の機能を阻害する能力である、(1)に記載の方法。
(6)前記指標が、ペントラキシン4タンパク質の細胞外分泌を阻害する能力、神経細胞への移行を阻害する能力またはシグナル伝達機能を阻害する能力である、(5)に記載の方法。
(7)ペントラキシン4タンパク質に特異的に結合する物質を一次候補物質として選抜する工程を含むことを特徴とする、(5)または(6)に記載の方法。
(8)スクリーニングされる薬物が、脂肪分解亢進による肥満の改善、インスリン抵抗性の改善、ベージュ脂肪細胞化による耐肥満性の獲得、肝脂肪蓄積低減、肝炎症低減、抗酸化ストレス獲得、または肝抗線維化のための薬物である、(1)〜(7)のいずれかに記載の方法。
(9)肥満関連疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)または糖尿病である、(1)〜(8)のいずれかに記載の方法。
(10)ペントラキシン4阻害剤を含んでなる、肥満関連疾患を治療するための医薬組成物。
(11)ペントラキシン4阻害剤が、ペントラキシン4遺伝子の発現を特異的に阻害するRNAiメディエーターである、(10)に記載の医薬組成物。
(12)ペントラキシン4阻害剤が、ペントラキシン4遺伝子の発現を特異的に阻害するRNAiメディエーターを発現するベクターである、(10)に記載の医薬組成物。
(13)ペントラキシン4阻害剤が、ペントラキシン4タンパク質に特異的に結合する抗体である、(10)に記載の医薬組成物。
(14)ペントラキシン4阻害剤が、配列番号4に記載されたペプチドを認識する抗体である、(10)に記載の医薬組成物。
(15)前記抗体がモノクローナル抗体である、(13)または(14)に記載の医薬組成物。
(16)脂肪分解亢進による肥満の改善、インスリン抵抗性の改善、ベージュ脂肪細胞化による耐肥満性の獲得、肝脂肪蓄積低減、肝炎症低減、抗酸化ストレス獲得、または肝抗線維化のための、(10)〜(15)のいずれかに記載の医薬組成物。
(17)肥満関連疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)または糖尿病である、(10)〜(16)のいずれかに記載の医薬組成物。
(18)療法に使用するための、ペントラキシン4阻害剤。
(19)肥満関連疾患の治療において使用するための、ペントラキシン4阻害剤。
(20)肥満関連疾患の治療を目的とする薬剤の製造のための、ペントラキシン4阻害剤の使用。
(21)治療上有効量のペントラキシン4阻害剤を、それを必要とする被験体に投与することを含んでなる、肥満関連疾患を治療する方法。
また、このような変異の数は特に制限されるものではないが、例えば1〜数個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1または2個、さらに好ましくは1個とされる。さらに、この変異は、挿入、欠失および置換のいずれか一つまたは複数の組み合わせであってよいが、好ましくは置換とされる。
実施例A(1)動物
オスC57BL/6Jマウス(週齢7)はJapan CREA、三協ラボから購入した。レプチン遺伝子欠損モデルマウス(Lepob/Lepob)は、Japan CREAから入手した。マウスはケージに入れて、後に別の温度管理条件を明記する場合を除き常温(24℃)の温度管理の下、12時間の明暗サイクルで飼育した。
ペントラキシン4遺伝子の発現を特異的に抑制するRNAiメディエーターを発現するベクターを作製するために、HEK293細胞株に対するRNAi塩基配列1オリゴマー(その塩基配列は表1に記載されている)をエントリーベクターpENTR/U6に挿入し、組換体をアデノウイルスベクター pAd−DESTおよびGateway LR clonase (Invitrogen)に混合し、DH5α大腸菌株に導入し、アデノウイルス組換体DNA(shPtx4アデノウイルスベクター;pAd−Ptx4i)を得た。上記で得られたPtx4iアデノウイルスベクター(pAd−Ptx4i)をHEK293細胞株へトランスフェクションに供し増幅し、PD−10 column(BD health care)を用いて1−5x1011plaque−forming units (p.f.u.)/mlに濃縮精製した。
Ptx4iアデノウイルスベクター(pAd−Ptx4i)を、2−8x108Plaque−forming units (p.f.u.)/bodyの投与量で、マウスに静脈注射した。各タイムポイントでマウスの精巣上脂肪組織と肝を速やかに切除し液体窒素中で凍結した。また組織学的検索試料として、4%PFAに浸し固定した。
実施例B(1)肝脂肪含有量分析
液体窒素中に保存された0.2gの肝臓組織試料を破砕装置で均一にホモジェナイズし、マイクロチューブにて試料を秤量した。このホモジェナイズされた組織試料から200mgサンプリングし、これに2mlのクロロホルム/メタノール(2:1、v/v)を添加して、肝含有脂質を48時間4℃で有機溶媒中に抽出した。その後、得られた抽出液をガラス管中に100μl注入し乾燥させ有機溶媒抽出液中の有機溶媒を自然乾燥させ除去した。ペレットとなった抽出物をイソプロパノールで溶解し、酵素法(ワコーTG測定キット)による脂質測定を行った。反応液の吸光度を測定し、肝臓組織1g当たりの脂質量(mg)を算出した。
肝重量に対して5倍量の0.6N過塩素酸を加え、破砕装置で均一にホモジェナイズし、このホモジェナイズされた組織試料0.1gに30%水酸化カリウム溶液250μlを加え5分煮沸撹拌し氷冷した。その後、2%硫酸化ナトリウム50μlと66%エタノール800μlを加え撹拌し、再度66%エタノールでペレットを洗浄し3ml蒸留水に懸濁した。アミログルコシダーゼ溶液を加え、55℃温浴槽で30分煮沸撹拌した。得られた上清中のグリコーゲンを570nmの吸光度によりグルコースオキシダーゼ(GOD)色素法で測定した。得られた吸光度から、肝臓組織1g当たりのグリコーゲン質量(mg)を算出した。
血漿中解析において、マウスの血漿中のインスリン量はマウス高感度インスリン測定キット(モリナガ)を用いて測定した。マウスの血漿中の血漿中性脂肪量、グルコース量、遊離脂肪酸量は、それぞれワコー トリグリセリドテストワコー、グルコースCIIテストワコー、NEFA C−テストワコー (Wako Pure Chemicals)を用いて測定した。
RNA発現量の測定
TRIzol(Invitrogen)1.5ml中に肝臓1片を入れ、破砕装置で均一に、即座にホモジナイズした。このホモジナイズ溶液を遠心分離(15000r.p.m、5分間)して上清を採取し、0.3mlのクロロホルムを添加し、攪拌後に再度遠心分離を行い(15000r.p.m、15分間)、上層を回収した。得られた上層に0.75mlのイソプロパノールを加えて遠心分離(15000r.p.m、15分間)を行いmRNAを沈殿させた。mRNA含有沈殿物を80%エタノールで2回洗浄し、0.5mlの蒸留水に溶解してmRNA量の測定に供した。mRNAを一定量に合わせ、逆転写酵素(High Capacity cDNA reverse transcription kit ;Applied Biosystems)を用いてcDNAを作製した。作製したcDNAと標的遺伝子のプライマーを用いて定量RT−PCR法(SYBR Green Dye; Roche Applied Science)で遺伝子発現量を測定した。遺伝子発現量の測定のために使用した標的遺伝子とプライマーデザインは以下に示す(表3および表4)。
4%PFA固定肝組織を脱パラフィン処理し、1%過ヨウ素酸水溶液にて10%反応させ、流水で5分洗浄した。シッフ試薬にて10分反応させ、次いで0.5%重亜硫酸水溶液にて反応させた後、流水で洗浄5分した。マイヤー・ヘマトキシリン液にて核染色して再度流水で洗浄し、95%アルコール、次いで100%アルコールにより脱水して透徹・封入した。
4%PFA固定肝組織を脱パラフィン処理し、ヘマトキシリン液の入った染色瓶に浸漬し、1〜5分反応させた。その後5分間流水で水洗した後、エオジン溶液と5〜10分間反応させ、水でリンスした。その後、90%エタノール、次いで95%エタノール、次いで無水エタノールに浸漬し、脱水し、キシレンに浸漬した後、封入した。
インスリンシグナルタンパク質(p−IR、p−Akt、p−S6K、p−GS、p−Foxo)の1次抗体として、それぞれCell signaling社製Phospho−Insulin Receptorβ(Tyr1361)(84B2)Rabbit mAb#3023、Phospho−Akt(Ser473)Antibody#9271、Phospho−p70S6Kinase(Thr389)Antibody#9205、Phospho−GlycogenSynthase(Ser641)Antibody#3891、Phospho−FoxO1(Thr24)/FoxO3a(Thr32)Antibody#9464を入手して使用し、そのキットに添付されたプロトコールに従って、実施した。
アルコシステム社製の呼吸代謝ケージ(ARCO−2000シリーズ)を用い、至適環境下で、呼吸代謝ケージ分析を実施した。
実施例C(1)糖/脂質バランスの崩れ(Carbohydrate-lipid imbalance)の改善
肥満患者において糖/脂質バランスが破綻し、糖質に比して脂肪合成が有意になり、これを発露としたインスリン抵抗性を基盤とする疾病発症を説明する病態メカニズムが存在し(Ide T. Nature cell biol 2004 Apr;6(4):351-7)、この糖/脂質バランスの崩れ(Carbohydrate-lipid imbalance)の改善が根源的な治療基盤となる。本発明者らはPtx4遺伝子の機能に着目し、Ptx4遺伝子をPtx4iアデノウイルスベクター(pAd−Ptx4i)で転写阻害したC57BL/6Jマウスの肝臓内のグリコーゲン含有量と中性脂肪含有量を測定した結果、Ptx4遺伝子の機能を阻害することにより、C57BL/6Jマウスの肝臓内において、糖質/脂質比率が増加し、脂質合成と比較して糖質合成が増強されることを見出した。
脂肪組織は、一定の条件の下で、易熱産生能をもつ赤褐色のベージュ脂肪細胞(Beige−adipocyte)へ形質転換する事が知られている。また、ベージュ様脂肪細胞ではUCP1の遺伝子発現が亢進し、これが熱産生性に寄与することで、エネルギー燃焼を亢進することが報告されている(Lowell, B.B.,et al. Nature404, 652-660.2000)。そこで、発明者らは、Ptx4遺伝子の機能を阻害することで、このような脂肪組織の変化が起るかどうかを観察した。
肝臓内のグリコーゲン含有量の増加と中性脂肪含有量の低下に伴い、インスリン抵抗性の改善が報告されている(Nakagawa Y et al. Nat Med. 2006 Jan;12(1):107-13.)。そこで、発明者らは、Ptx4遺伝子の機能を阻害することで、このような肝臓内のインスリン感受性の亢進につながる肝臓組織内の転写制御が起るかどうかを観察した。
上述した(1)〜(3)の野生型C57BL/6Jマウスでの解析結果から、Ptx4遺伝子の機能を阻害することにより、1)肝臓での糖/脂質バランスにおいて、脂肪酸優位に利用亢進(β酸化亢進)、2)de novo脂肪合成系遺伝子発現の低下、3)抗炎症作用の惹起、4)酸化ストレスの減少等が見出されたが、これらと同様の作用効果が、治療効果として肥満病態モデルにおいても発揮されるか確認を行った。肥満病態モデルとして、高脂肪食肥満(DIO(Diet induced obesity))モデルマウス、レプチン遺伝子欠損モデルマウス(Lepob/Lepob)を用いて解析を進めた。
これらにより、Ptx4遺伝子の機能を阻害することで、中性脂肪蓄積に伴う非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)の発症予防、治療効果が発揮されることが期待された。そこで、超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料(CDAHFD)を3週間給餌し、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)モデルマウス(CDAHFD NASHモデル)を作出した。その後Ptx4iアデノウイルスベクター(pAd−Ptx4i)を投与し、1週間後の肝臓中の中性脂肪(Triglyceride)及びグリコーゲン含有量を測定した。飼育温度条件はすべて19℃であった。その結果、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)モデルマウス(CDAHFD NASHモデル)において、Ptx4阻害群(Ptx4−i)では、肝臓中グリコーゲン含有量の増加傾向及び、中性脂肪含有量の低下傾向が観察された(図17)。
19℃の飼育温度条件下において、野生型マウス(C57BL/6J)にPtx4iアデノウイルスベクター(pAd−Ptx4i)を投与し、その後24時間の酸素消費量(VO2)及び呼吸商(RQ)を呼吸代謝ケージを用いて測定した。得られた結果からグラフを作成し、曲線下面積(Area Under the Curve: AUC)を求めた。その結果、Ptx4阻害群(Ptx4−i)の野生型マウスにて(C57BL6/J)、酸素消費量(VO2)が有意に低下し生体代謝反応を低下させるとともに、呼吸商(RQ)が低下することが確認された(図21)。
ペントラキシン4タンパク質を認識する抗体を調製するために、表2に記載されたアミノ酸配列2(配列番号4)のペプチドを用いて、ユーロフィンジェノミクス株式会社の抗体作製サービスにより、抗ペントラキシン4ウサギIgGポリクローナル抗体を調製した。
生体内における、抗ペントラキシン4ウサギIgGポリクローナル抗体の、ペントラキシン4タンパク質の機能の阻害効果について検討した。抗ペントラキシン4ウサギIgGポリクローナル抗体(50μg/body)およびコントロールとしてのウサギIgG抗体(50μg/body)を、それぞれ、19℃の飼育温度条件下において、野生型マウス(C57BL/6J)に静脈注射により投与し、その後7日間、当該抗体によるペントラキシン4タンパク質の機能の阻害効果を観察した。その結果、抗ペントラキシン4ウサギIgGポリクローナル抗体投与群において、投与後から累積摂餌量低下が観察された(図23)。また、抗ペントラキシン4ウサギIgGポリクローナル抗体投与群において、鼠径部脂肪細胞重量と比較して精巣上体周囲脂肪細胞重量の強い低下傾向が惹起され、インスリン抵抗性が改善されたことが示された(図24)。これらの結果から、当該抗体の投与により、Ptx4iアデノウイルスベクター(pAd−Ptx4i)を投与した場合に観察された結果と同様の、食欲の減少および精巣上体周囲脂肪細胞重量の強い低下傾向が認められ、ペントラキシン4タンパク質の機能の阻害効果が確認された。以上のことから、ペントラキシン4タンパク質を認識する抗体の投与により、肥満関連疾患の病態改善効果が発揮されることが示された。
Claims (15)
- 肥満関連疾患を治療するための薬物をスクリーニングする方法であって、ペントラキシン4の作用を阻害する候補薬物の能力を指標として用い、該能力を有する候補薬物を肥満関連疾患を治療するための薬物として特定することを特徴とする、方法。
- 前記指標が、ペントラキシン4遺伝子の発現を阻害する能力である、請求項1に記載の方法。
- 前記指標が、ペントラキシン4遺伝子のmRNAの転写開始を阻害する能力、ペントラキシン4遺伝子のmRNAを分解する能力、または該mRNAからタンパク質への翻訳を阻害する能力である、請求項2に記載の方法。
- ペントラキシン4遺伝子の転写調節領域を含んでなるDNA断片とレポーター遺伝子を含んでなるDNA断片が作動可能なように連結された核酸分子を用いることを特徴とする、請求項2または3に記載の方法。
- 前記指標が、ペントラキシン4タンパク質の機能を阻害する能力である、請求項1に記載の方法。
- 前記指標が、ペントラキシン4タンパク質の細胞外分泌を阻害する能力、神経細胞への移行を阻害する能力またはシグナル伝達機能を阻害する能力である、請求項5に記載の方法。
- ペントラキシン4タンパク質に特異的に結合する物質を一次候補物質として選抜する工程を含むことを特徴とする、請求項5または6に記載の方法。
- 前記候補物質が、小分子、低分子物質、高分子物質、核酸分子、タンパク質およびペプチドからなる群から選択される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- スクリーニングされる薬物が、脂肪分解亢進による肥満の改善、インスリン抵抗性の改善、ベージュ脂肪細胞化による耐肥満性の獲得、肝脂肪蓄積低減、肝炎症低減、抗酸化ストレス獲得、または肝抗線維化のための薬物である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 肥満関連疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)または糖尿病である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- ペントラキシン4阻害剤を含んでなる、肥満関連疾患を治療するための医薬組成物であって、前記ペントラキシン4阻害剤が、ペントラキシン4遺伝子の発現を特異的に阻害するRNAiメディエーター、ペントラキシン4遺伝子の発現を特異的に阻害するRNAiメディエーターを発現するベクター、ペントラキシン4タンパク質に特異的に結合する抗体および配列番号4に記載されたペプチドを認識する抗体からなる群から選択される、医薬組成物。
- 前記ペントラキシン阻害剤がペントラキシン4タンパク質に特異的に結合する抗体または配列番号4に記載されたペプチドを認識する抗体であって、前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項11に記載の医薬組成物。
- 脂肪分解亢進による肥満の改善、インスリン抵抗性の改善、ベージュ脂肪細胞化による耐肥満性の獲得、肝脂肪蓄積低減、肝炎症低減、抗酸化ストレス獲得、または肝抗線維化のための、請求項11または12に記載の医薬組成物。
- 肥満関連疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)または糖尿病である、請求項11〜13のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 脂肪分解亢進による肥満の改善、インスリン抵抗性の改善、ベージュ脂肪細胞化による耐肥満性の獲得、肝脂肪蓄積低減、肝炎症低減、抗酸化ストレス獲得、または肝抗繊維化のための、ペントラキシン4阻害剤を含んでなる医薬組成物であって、前記ペントラキシン4阻害剤が、ペントラキシン4遺伝子の発現を特異的に阻害するRNAiメディエーター、ペントラキシン4遺伝子の発現を特異的に阻害するRNAiメディエーターを発現するベクター、ペントラキシン4タンパク質に特異的に結合する抗体および配列番号4に記載されたペプチドを認識する抗体からなる群から選択される、医薬組成物。
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