CN109477088A - 通过肝分泌代谢调节剂抑制作用的肥胖相关疾病的治疗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了通过使用候选药物抑制穿透素‑4的能力作为指标来筛选用于治疗肥胖相关疾病的药物的方法，以及包含穿透素‑4抑制剂作为活性成分的用于治疗肥胖相关疾病的药物组合物。通过上述方法筛选的药物和药物组合物可用于治疗肥胖相关疾病，特别是用于非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。

Description

通过肝分泌代谢调节剂抑制作用的肥胖相关疾病的治疗剂
相关申请的交叉引用
本专利申请伴随有基于在日本在先提交的日本专利申请2016-097233(提交日：2016年5月13日)的优先权要求。此后，该专利申请中的全部公开内容通过引用并入本文。
发明背景
技术领域
本发明涉及对肝分泌代谢调节因子具有抑制效果的用于肥胖相关疾病的治疗剂。
背景技术
在现代社会，肥胖和并发肥胖的代谢综合征已成为国家公共卫生的主要问题之一。在这种综合征中，一个本质上重要的点是导致动脉粥样硬化的风险因素形成集丛，并且因此迫切需要阐明动脉粥样硬化的分子机制，并根据其基本发现构建一种新的治疗策略。在考虑代谢综合征的病因学时，有必要了解胰岛素抵抗的发作机制，但其尚未完全阐明。
本发明人已经提出在胰岛素抵抗的能量代谢中发生比脂质同化更少的葡萄糖/碳水化合物同化。换句话说，碳水化合物/脂质代谢的扰乱的平衡(碳水化合物-脂质失衡)对于胰岛素抵抗的发作是必不可少的(非专利文献1)。通过阐明碳水化合物/脂质代谢(碳水化合物-脂质平衡)的调节机制，将澄清不能从每个器官的代谢特征中的单独方面解释的整合的代谢调节机制。从这个观点来看，本发明人显示，代谢信息响应于饥饿时肝脏中的糖原消耗而通过肝迷走神经诱导生理性脂解(非专利文献2)。本发明人揭示能够检测糖原消耗的新的“糖原传感器”的存在，其作为这些调节机制下的肝内代谢的基础(非专利文献2)。此外，本发明人还揭示调节代谢的神经元回路经由肝迷走神经将神经元信号传递到中枢神经系统，脂肪组织通过传出交感神经从中受到刺激，导致脂解(非专利文献2)。
然而，Katagiri等人2006年已经在日本的东北大学首次报道过神经元回路本身参与代谢调节，并且引起全世界的关注(非专利文献3)。然而，这种机制如何将来自肝脏的代谢相关信息转化为神经信息仍然没有得到解决。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Ide T.Nature Cell Boil.2004年4月；6(4)：351-7
非专利文献2：Izumida Y.Nature Commun 4：2316，2013
非专利文献3：Uno K，Katagiri H，et al.，Science.16；312(5780)：1656-9，2006
发明概述
本发明人致力于通过研究能将肝脏代谢模式转化为包括神经原性信息在内的常见代谢信息的机制来阐明用于控制由神经代谢调节所介导的能量稳态的潜在机制。因此，本发明人发现，肝脏中合成的穿透素-4(pentraxin-4)的抑制促进甘油三酯的燃烧，作为比以糖原储存的碳水化合物更为主要的肝细胞内能量来源，也通过促进脂肪组织中的脂解来降低脂肪量，并且转化脂肪组织为棕色脂肪组织。总的来说，这些机制导致肝脏中增强的β-氧化、被抑制的炎症和减少的氧化应激。本发明基于这些发现。
因此，根据本发明，提供一种药物筛选的方法以及用于治疗肥胖相关疾病的药物组合物。
本发明包括以下内容：
(1)筛选用于治疗肥胖相关疾病的药物的方法，其特征在于使用候选药物抑制穿透素-4作用的能力作为指标，以及在于鉴定具有作为治疗肥胖相关疾病的药物的能力的候选药物。
(2)根据(1)所述的方法，其中所述指标是抑制穿透素-4基因表达的能力。
(3)根据(2)所述的方法，其中所述指标是抑制从穿透素-4基因到mRNA的转录的起始的能力，降解来自穿透素-4基因的mRNA的能力，或抑制从穿透素-4mRNA翻译为蛋白质的能力。
(4)根据(2)或(3)的方法，其特征在于使用核酸分子，在其中包含穿透素-4基因的转录调节区的DNA片段和包含报告基因的DNA片段可操作地连接。
(5)根据(1)所述的方法，其中所述指标是抑制穿透素-4蛋白功能的能力。
(6)根据(5)所述的方法，其中所述指标是抑制所述穿透素-4蛋白的胞外分泌的能力，抑制穿透素-4蛋白向神经元中转移的能力，或抑制从穿透素-4蛋白信号转导的能力。
(7)根据(5)或(6)的方法，包括选择特异性结合穿透素-4蛋白的物质作为初级候选物的步骤。
(8)根据(1)至(7)中任一项的方法，其中待筛选的药物是用于由脂解增强引起的肥胖的改善、胰岛素抵抗的改善、由米色脂肪生成引起的抗肥胖、肝脏脂肪积累减少、肝脏炎症减少、抗氧化应激或肝脏抗纤维化反应的药物。
(9)根据(1)至(8)中任一项的方法，其中所述肥胖相关疾病是非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)或糖尿病。
(10)一种药物组合物，包含穿透素-4抑制剂，用于治疗肥胖相关疾病。
(11)根据(10)所述的药物组合物，其中所述穿透素-4抑制剂是特异性抑制穿透素-4基因的表达的RNAi介导物(mediator)。
(12)根据(10)所述的药物组合物，其中所述穿透素-4抑制剂是表达RNAi介导物的载体，所述RNAi介导物特异性抑制穿透素-4基因的表达。
(13)根据(10)所述的药物组合物，其中所述穿透素-4抑制剂是特异性结合穿透素-4蛋白的抗体。
(14)根据(10)所述的药物组合物，其中所述穿透素-4抑制剂是识别SEQ ID NO 4所示氨基酸序列的肽的抗体。
(15)根据(13)或(14)所述的药物组合物，其中所述抗体是单克隆抗体。
(16)根据(10)至(15)中任一项的药物组合物，其用于由脂解增强引起的肥胖的改善、胰岛素抵抗的改善、由米色脂肪生成引起的抗肥胖、肝脏脂肪积累减少、肝脏炎症减少、抗氧化应激或肝脏抗纤维化反应。
(17)根据(10)～(16)中任一项所述的药物组合物，其中所述肥胖相关疾病是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或糖尿病。
(18)一种用于治疗的穿透素-4抑制剂。
(19)一种用于治疗肥胖相关疾病的穿透素-4抑制剂。
(20)穿透素-4抑制剂在制备用于治疗肥胖相关疾病的药物中的用途。
(21)一种治疗与肥胖相关疾病的方法，包括给有需要的对象施用治疗有效剂量的穿透素-4。
根据本发明，可以通过神经调节有意地修饰碳水化合物/脂质代谢的调节机制来优化能量代谢的调节。例如，根据本发明，可以由脂解加速改善肥胖、改善胰岛素抵抗、或者由生热作用(thermogenesis)来增强基础代谢。另外，根据本发明，可以获得几种效果，例如由于米色脂肪生成导致的抗肥胖、减少的肝脏脂肪蓄积、减少的肝脏炎症、或抗氧化应激或肝脏抗纤维化反应。此外，根据本发明，可以提供用于肥胖相关疾病(例如非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或糖尿病)的新型治疗剂。因此，根据本发明，优化能量代谢的调节，有意地修饰由神经元回路控制的碳水化合物/脂质代谢的调节机制，能为肥胖相关疾病(例如由于肥胖导致的过度中性脂肪积聚而出现的NASH以及糖尿病)提供新的治疗剂。
附图说明
图1显示野生型小鼠的肝脏组织匀浆悬浮液的外观。上清液漂浮物质(以空心箭头指示)是脂质组分，而沉淀(以阴影箭头指示)是糖化物质(如糖原)。
图2显示野生型小鼠肝脏组织中糖原和甘油三酯含量。空心条指示对照(LacZ-i)组，并且实心条指示Ptx4-抑制(Ptx4-i)组。
图3显示野生型小鼠的附睾脂肪组织的外观。上面一行指示显示白色色调的样品，获自对照(LacZ-i)组。下面一行指示获自Ptx4-抑制(Ptx4-i)组的显示红棕色的样品。比例尺为5毫米。
图4显示野生型小鼠的体重，以及附睾脂肪组织和棕色脂肪组织的重量。空心条指示对照(LacZ-i)组，并且实心条指示Ptx4-抑制(Ptx4-i)组。显示附睾脂肪组织重量结果的柱状图中的Y-轴以WAT(％)表示附睾脂肪组织的重量百分比。显示棕色脂肪组织重量结果的条形图中的Y-轴以BAT(％)表示棕色脂肪组织的重量百分比。
图5显示高脂肪饮食诱导的肥胖小鼠的白色脂肪组织中mRNA的表达水平。空心条指示对照(LacZ-i)组，并且实心条指示Ptx4-抑制(Ptx4-i)组。
图6显示非酒精性脂肪性肝炎模型小鼠的附睾脂肪组织中mRNA的表达水平。空心条指示对照(LacZ-i)组，并且实心条指示Ptx4-抑制(Ptx4-i)组。
图7显示，野生型小鼠的肝脏中碳水化合物和脂质代谢相关基因、炎症相关基因、和β-氧化相关基因的mRNA的表达水平。空心条指示对照(LacZ-i)组，并且实心条指示Ptx4-抑制(Ptx4-i)组。Y-轴表示相对于Ptx4-抑制组的表达水平相比于对照组中的表达水平的比率。
图8显示野生型小鼠肝脏中mRNA的表达水平。空心条指示对照(LacZ-i)组，并且实心条指示Ptx4-抑制(Ptx4-i)组。
图9显示野生型小鼠血浆葡萄糖和脂质含量。空心条指示对照(LacZ-i)组，并且实心条指示Ptx4-抑制(Ptx4-i)组。
图10显示通过蛋白质印迹(Western blotting)的野生型小鼠肝脏中胰岛素信号传导相关蛋白的表达水平。左侧：对照(LacZ-i)组。右侧：Ptx4-抑制(Ptx4-i)组。
图11显示瘦素基因缺陷小鼠中以过碘酸-希夫(periodic acid-schiff，PAS)染色的肝脏组织的照片。左侧：控制(LacZ-i)组。右侧：Ptx4-抑制(Ptx4-i)组。上部组图：40x放大。下部组图：200x放大。星号表示肝脏的中心静脉，并且箭头指出脂滴。
图12显示瘦素基因缺陷模型小鼠的肝脏组织中糖原和甘油三酯含量。空心条指示对照(LacZ-i)组，并且实心条指示Ptx4抑制(Ptx4-i)组。
图13显示瘦素基因缺陷小鼠肝脏中碳水化合物/脂质代谢相关基因、炎症相关基因和β-氧化相关基因的mRNA表达水平。空心条表示对照(LacZ-i)组，并且实心条表示Ptx4-抑制(Ptx4-i)组。Y-轴表示Ptx4-抑制组中的表达水平相比于对照组的表达水平的比率。
图14显示瘦素基因缺陷小鼠肝脏中氧化应激相关基因的mRNA表达水平。空心条表示对照(LacZ-i)组，并且实心条表示Ptx4-抑制(Ptx4-i)组。Y-轴显示Sod2基因表达水平相比于36b4基因表达水平的比率。
图15显示高脂肪饮食诱导的肥胖小鼠肝脏中脂质代谢相关基因、炎症相关基因、β-氧化相关基因和氧化应激相关基因的mRNA表达水平。空心条表示对照(LacZ-i)组，并且实心条表示Ptx4-抑制(Ptx4-i)组。在显示氧化应激相关基因结果的组图中，Y-轴表示Sod2基因表达水平相比于36b4基因表达水平的比率。
图16显示在高脂肪饮食诱导肥胖小鼠的血糖水平和血浆胰岛素浓度。空心条表示对照(LacZ-i)组，并且实心条表示Ptx4-抑制(Ptx4-i)组。
图17显示非酒精性脂肪性肝炎模型小鼠肝脏组织中糖原和甘油三酯的含量。空心条表示对照(LacZ-i)组，并且实心条表示Ptx4-抑制(Ptx4-i)组。
图18显示在非酒精性脂肪性肝炎模型小鼠中以苏木精-伊红(HE)染色的肝脏组织的照片。左侧：对照(LacZ-i)组。右侧：Ptx4-抑制(Ptx4-i)组。在Ptx4-抑制(Ptx4-i)组中，注意到门静脉(PV)周围的空隙区域的面积减少，表明脂滴减少。
图19显示非酒精性脂肪性肝炎模型小鼠肝脏中纤维化相关基因、氧化应激相关基因、碳水化合物/脂质代谢相关基因、炎症相关基因和β-氧化相关基因的mRNA表达水平。空心条表示对照(LacZ-i)组，并且实心条表示Ptx4-抑制(Ptx4-i)组。在显示氧化应激相关基因的结果的组图中，Y-轴表示Sod2基因表达水平相比于36b4基因表达水平的比率。类似地，在显示纤维化相关基因(Collagen3a)的结果的组图中，Y-轴表示Collagen3a基因表达水平相比于36b4基因表达水平的比率。
图20显示瘦素基因缺陷小鼠的体重和口服食物摄入的变化。在显示体重变化结果的组图中，X-轴表示小鼠接受Ptx4-i腺病毒载体(pAd-Ptx4i)后(当小鼠在第0天接受载体时)的喂养期的持续时间，并且Y-轴表示体重的变化(当第0天的体重定义为100％时)。实心圆圈表示对照(LacZ-i)组，并且空心圆圈表示Ptx4-抑制(Ptx4-i)组。在显示口服食物摄取结果的组图中，Y-轴表示在施用pAd-Ptx4i后7天每只小鼠每天口服食物摄入(g)。空心条表示对照(LacZ-i)组，并且实心条表示Ptx4-抑制(Ptx4-i)组。
图21显示野生型小鼠的呼吸代谢分析。空心条表示对照(LacZ-i)组，实心条表示Ptx4抑制(Ptx4-i)组。
图22显示瘦素基因缺陷小鼠中肝脏的直肠温度和UCP2的mRNA表达水平。空心条表示对照(LacZ-i)组，并且实心条表示Ptx4-抑制(Ptx4-i)组。在显示UCP2mRNA表达水平的结果的组图中，Y-轴表示Ptx4-抑制组中的表达水平相比于对照组表达水平的比率。
图23显示野生型小鼠的累积食物摄入。空心圆代表对照组(接受兔IgG抗体)，并且实心圆代表接受抗兔IgG多克隆抗体的实验组。
图24显示野生型小鼠中附睾脂肪组织的重量。空心条代表对照组(接受兔IgG抗体)，实心条代表接受抗兔IgG多克隆抗体的实验组。
发明详述
本发明人鉴定一种穿透素-4基因，定义为其肝脏分泌的调节与肝糖原消耗相关的分子，并发现这种新发现的肝脏分泌代谢调节因子参与细胞内或细胞外信号的信号转导，同时不仅涉及肝细胞的代谢调节，还涉及脂肪组织中的脂解和褐色脂肪生成。在由这种新鉴定的肝脏分泌代谢调节因子诱导的糖原感应机制中，主动调节脂解、能量消耗和摄食行为受到强烈调节。因此，可以通过穿透素-4的功能性抑制来治疗肥胖相关疾病。
穿透素-4是穿透素超家族的成员，特征在于具有穿透素特异性结构域的多功能蛋白质，该结构域含有由在其C末端保守的8个氨基酸组成的共有序列。人穿透素-4基因的信息(包括其基因组序列、mRNA序列和基于相应mRNA的氨基酸序列)在NCBI数据库中登录为Gene ID：390667。在该数据库中登录的mRNA序列(cDNA)如SEQ ID NO 26所示，且氨基酸序列也显示在SEQ ID NO 27中。在本说明书中，穿透素-4基因和穿透素-4蛋白有时分别缩写为“Ptx4基因”和“Ptx4蛋白”。
在本发明中，肥胖相关疾病包括如非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和糖尿病的疾病，其治疗效果可以预期为与作为碳水化合物的糖原相比，优先燃烧甘油三酯。另外，本发明中肥胖相关疾病的治疗不仅包括疾病的根治性治疗，还包括其症状的改善。例如，改善包括由于增强的脂解引起的肥胖症的改善，胰岛素抵抗的改善和由于生热增加引起的基础代谢增加。此外，根据另一个实施方案，本发明中肥胖相关疾病的治疗包括由于增强的脂解引起的肥胖症的改善、胰岛素抵抗的改善、由米色脂肪形成引起的抗肥胖、肝脏脂肪积累减少、肝脏炎症减少、抗氧化应激和肝脏抗纤维化反应。
根据本发明，能提供用于肥胖相关疾病的药物筛选方法。在这些方法中，潜在药物候选物抑制穿透素-4作用的能力被用作指标，因此具有这种能力的候选物鉴定为用于肥胖相关疾病的药物。这里，抑制穿透素-4的作用可以是抑制穿透素-4基因表达或抑制穿透素-4蛋白功能。
根据本发明的一个实施方案，使用其抑制穿透素-4基因表达的能力作为指标筛选上述药物。这些能力包括抑制从穿透素-4基因到mRNA转录的起始、降解来自穿透素-4基因的mRNA、以及抑制从穿透素-4mRNA到其相应蛋白质的翻译的能力。
根据本发明的另一个实施方案，使用其抑制穿透素-4蛋白功能的能力作为指标筛选上述药物。这些能力包括抑制穿透素-4蛋白的细胞外分泌、抑制其转移到神经元中和抑制信号转导的能力。
本领域技术人员根据用于药物筛选的指标能够充分地进行本发明的筛选方法。在与人体中相同的条件下制备表达穿透素-4基因的细胞(例如，能够表达由基因转移诱导的穿透素-4基因的肝细胞或遗传修饰细胞)后，使用所述制备的细胞在存在或不存在候选化合物下进行穿透素-4基因的表达测定。随后，能够通过比较穿透素-4mRNA或穿透素-4蛋白的量来测量它们对穿透素-4基因表达的抑制效力。类似地，在制备其中穿透素-4蛋白在与人体中相同的条件下起作用的测定系统后，候选化合物抑制穿透素-4蛋白功能(如细胞外分泌，转移到神经元，以及信号转导)的能力能够通过在候选化合物存在或不存在下进行测试，以及比较穿透素-4蛋白的能力来测量。根据本发明的一个实施方案，在将脂多糖(LPS)施用于源自基质细胞系(stromal cell line)的细胞后，使用荧光钙指示剂以荧光强度的变化测量细胞内钙浓度，其源自当穿透素-4转录得到促进(Martinez de la Torre Y etal.，J.Immunol.184(9)，5055-5064.2010)和/或穿透素-4的细胞外分泌得到诱发时出现的涌入(influx)。通过使用该测定系统，能够通过选择对穿透素-4具有抑制效果的候选化合物来鉴定和筛选用于肥胖相关疾病的药物。
当使用抑制穿透素-4基因表达的能力作为指标筛选用于肥胖相关疾病的药物时，期望使用在其中可操作地连接有包含穿透素-4基因的转录调节区的DNA片段和包含报告基因的DNA片段的核酸分子。这里，人穿透素-4基因的转录调节区的碱基序列能够从登录在NCBI数据库中的Gene ID：390667的信息中获得。另外，小鼠穿透素-4基因的转录调节区的碱基序列能够从登录在NCBI数据库中的Gene ID：68509的信息中获得。此外，如果已经建立基因产物的定量检测的方法，则能够使用任何报告基因系统。例如，可用以下基因：编码生物发光蛋白的基因(如萤光素酶)、编码酶(如β-半乳糖苷酶和氯霉素乙酰转移酶(CAT))、以及编码荧光蛋白(如人源化Azami绿(HmAG)荧光蛋白、绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(DS-RED))。其中，更优选使用编码生物发光蛋白的基因，并且更优选使用编码荧光素酶的基因。此外，“可操作地连接”意味着与转录调节区的上游(5’侧)或下游(3’侧)连接的基因被连接从而通过转录调节区而具有增强的或降低的转录活性。当检测或评价候选化合物抑制穿透素-4基因表达的能力时，能够使用其中引入上述核酸分子的用于转录活性的体外测定系统，或由所述核酸分子转化的细胞。这种用于此测定的细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母以及大肠杆菌。然而，更优选使用哺乳动物细胞。当候选化合物施用于上述用于转录活性的体外测定系统或与上述转化细胞混合时，能够基于报告基因表达的程度检测或评价抑制穿透素-4基因表达的能力。对于与上述相关的方法(例如基因工程技术、报告基因表达的检测和候选化合物的筛选)，能够使用本领域技术人员熟知的技术。
当基于其抑制穿透素-4蛋白的功能的能力作为指标筛选候选化合物时，期望具有选择特异性结合穿透素-4蛋白的物质作为初级候选物的步骤。这里，更优选穿透素-4蛋白是固定化的。在选择步骤中，能够使用任何本领域技术人员通常已知的技术。例如，当测试物质为环肽，根据TRAP显示方法(T.Ishizawa，T.Kawakami，P.C.Reid，H.Murakami(2013)J.Am.Chem.50c.135，5433-5440)，或日本未审查专利申请公开号2014-127352，日本未审查专利申请公开号2013-046637，WO2014/119600，或WO2011/049157中记载的方法来进行所述选择。由上述这些选择方法获得的初级候选物质能够通过将其用于本发明描述的用于肥胖相关疾病的测定系统以得到进一步筛选。
在本发明的筛选方法中，多种类型的物质，如小分子、低分子化合物、高分子化合物、核酸分子、蛋白质和肽(包括环肽)能用作候选化合物。
根据本发明，能够提供包含穿透素-4抑制剂的用于治疗肥胖相关疾病的药物组合物。此外，根据本发明，能提供用于治疗或预防肥胖相关疾病的方法，包括向需要医学治疗的对象施用治疗有效剂量的穿透素-4抑制剂。此外，根据本发明，能提供穿透素-4抑制剂在制备用于治疗肥胖相关疾病的药物中的用途。另外，根据本发明，能提供用于治疗肥胖相关疾病的穿透素-4抑制剂。能使用多种类型的物质作为穿透素-4抑制剂，例如小分子、低分子化合物、高分子化合物、核酸分子、蛋白质和肽(包括环肽)。
接受治疗或预防的受试者优选为哺乳动物，例如人类或非人类哺乳动物。
根据本发明的优选实施方案，穿透素-4抑制剂是特异性抑制穿透素-4基因表达的RNAi介导物。在本说明书中，“RNAi介导物”不仅指siRNA本身，还指更长并且能将siRNA转移到靶细胞中的双链RNA分子。RNAi介导物是众所周知的工具，其能通过RNA干扰(RNAi)抑制特定基因表达(Elbashir，S.M.et al.，Nature 411，494-498，2001)。通常，siRNA包含19至21个碱基对的核苷酸序列，其与特异于靶基因mRNA的序列同源。上述双链RNA分子通常包含具有对应于siRNA的一部分的较长核苷酸序列。所述双链RNA分子可具有发夹结构。基于表达被抑制的基因的序列，本领域技术人员能容易地设计所述RNAi介导物。
此外，上述RNAi介导物能通过递送到细胞中的合适载体表达。因此，穿透素-4抑制剂可以是表达特异性抑制穿透素-4基因表达的RNAi介导物的载体。这些载体能通过本领域熟知的标准方法(Bass，B.L.，Cell 101，235-238，2000，Tavernarakis，N.et al.，Nat.Genet.24，180-183，2000；Malagon，F.et al.，Mol.Gen.Genet.259，639-644，1998；Parrish，S.et al.，Mol.Cell 6，1077-1087，2000)而容易地构建。
下表1显示用于本发明的对穿透素-4具有抑制效果的RNAi介导物的碱基序列的实例(RNAi碱基序列1)。
[表1]
表1.一个对穿透素-4基因的功能具有抑制效果的RNAi介导物的核苷酸序列的实例(RNAi碱基序列1)
1)所有小写字母表示有意插入的不匹配的碱基
除上述“RNAi碱基序列1”中所示的碱基序列之外，碱基序列可以具有突变，包括核苷酸残基的插入、缺失和取代，只要具有对穿透素-4基因表达的抑制效果即可。这种突变的位置不受特别限制。此外，这种突变的数量没有特别限制，但是，例如，一或几个，优选1至5个，更优选1至3个，进一步更优选1个或2个，以及最优选1个。该突变可以是插入、缺失和取代中的任何一种或其组合，但优选是取代。
根据本发明的另一个优选实施方案，穿透素-4抑制剂是识别穿透素-4蛋白的全部或部分肽的抗体。更优选地，穿透素-4抑制剂是特异性结合穿透素-4蛋白的抗体。抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，但优选是单克隆抗体。此外，优选抗体不仅特异性结合穿透素-4蛋白，还能抑制穿透素-4蛋白的功能。
用于产生本发明中使用的抗体的抗原肽的氨基酸序列的实例示于下表2中(氨基酸序列1至3)。氨基酸序列1和氨基酸序列2分别含有小鼠穿透素-4蛋白221至234位和406至418位的氨基酸残基。氨基酸序列3含有人穿透素-4蛋白的氨基酸残基，其对应于小鼠穿透素-4蛋白的406至418位的氨基酸残基。氨基酸序列2和氨基酸序列3高度同源，并且使用对应于氨基酸序列2的抗原肽产生的抗体更可能具有对人穿透素-4蛋白的交叉免疫反应性。
[表2]
表2.用于产生特异性结合穿透素-4蛋白的抗体的抗原肽的氨基酸序列的实例。
SEQ ID NO 氨基酸序列<sup>1)</sup>
氨基酸序列1 3 NH<sub>2</sub>-C+QVAKSSPQHRSSPH-COOH
氨基酸序列2 4 NH<sub>2</sub>-C+EQDTVGGEFDSSE-COOH
氨基酸序列3 5 NH<sub>2</sub>-C+EQDSVGGGFDSSE-COOH
1)示出在产生特异性结合穿透素-4蛋白的抗体时使用的抗原肽的氨基酸序列。这些序列含有有意添加到N-末端的半胱氨酸残基。
除上述氨基酸序列1至3之外，氨基酸序列可以具有突变(包括氨基酸残基的插入、缺失或取代)，只要抗体对穿透素-4具有抑制效力即可。这种突变的位置没有特别限制。此外，这种突变的数量没有特别限制，但是例如，一或几个，优选1至5个，更优选1至3个，进一步更优选1个或2个，以及最优选1个。这些突变可以是插入、缺失和取代中的任何一种或其组合，但优选取代，更优选保守取代(用具有相似特性的不同氨基酸取代特定氨基酸)。
根据本发明的另一个优选实施方案，穿透素-4抑制剂是小分子。这些小分子能通过本发明的筛选方法获得。
穿透素-4抑制剂能通过适当的途径(例如局部、静脉内、皮下、肌肉内、口服、直肠和粘膜途径)施用。根据症状的严重程度、对象的年龄、以及所用的每种药物的有效性、施用途径和施用频率等，医生或兽医能充分确定穿透素-4抑制剂的治疗有效剂量。通常，治疗有效剂量为每天约0.001至1000mg/体重(kg)，优选每天约0.01至10mg/体重(kg)，更优选每天约0.01至1mg/体重(kg)。
穿透素-4抑制剂能与穿透素-4抑制剂以外的药物联合施用用于肥胖相关疾病。本文中，“与......联合施用”可以是以下任一种：(i)在一种制剂中作为穿透素-4抑制剂和其他药物的混合物施用，(ii)分别制备穿透素-4抑制剂和其他药物并在相同时间施用它们，(iii)分别制备穿透素-4抑制剂和其他药物并在不同时间施用它们。穿透素-4抑制剂和其他药物的剂量和施用、施用时间和施用间隔能通过本领域技术人员公知的普通技术知识来确定。
穿透素-4抑制剂能与药学上可接受的载体联合施用。因此，根据本发明，提供用于治疗肥胖相关疾病的药物组合物，其包含穿透素-4抑制剂和药学上可接受的载体。
药学上可接受的载体(例如载体、赋形剂、和稀释剂)，根据所使用的各个药物的施用途径和性质由本领域的技术人员适当选择。
实施例
将基于以下实施例具体解释本发明，但是本发明不限于这些实施例。
实施例A：方法
实施例A(1)：动物
雄性C57BL/6J小鼠(7周龄)购自日本CREA，Sankyo Laboratory。瘦素基因缺陷小鼠(LepOb/LepOb)获自Japan CREA。将小鼠圈养在笼子中并在室温(24℃)下在12小时光-暗循环下放置，除非后面另外指定不同的温度。
在除产生高脂肪饮食诱导的肥胖(饮食诱导的肥胖(Diet-induced obesity，DIO))小鼠和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)模型小鼠的目的之外的所有实验中，使用含有25.6％(wt/wt)蛋白质、3.8％纤维、6.9％灰分(ash constituent)、50.5％碳水化合物、4％脂肪和9.2％水分含量的标准饲料。给雄性C57BL/6J小鼠(7周龄)喂食高脂肪饮食(通过使用猪油，60％脂肪含量)以产生高脂肪饮食诱导的肥胖(饮食诱导的肥胖(DIO))小鼠。另外，雄性C57BL/6J小鼠(7周龄)也由Research Diet Corporation提供的胆碱缺乏的甲硫氨酸定义的高脂肪饮食(CDAHFD，A06071302)喂食三周以产生非酒精性脂肪性肝炎(NASH)模型小鼠。
实施例A(2)：Ptx4 RNAi腺病毒载体的制备
为构建表达特异性抑制穿透素-4基因表达的RNAi介导物的载体，将“RNAi碱基序列1”中给出的HEK293细胞的寡聚体(序列列于表1)插入入门载体pENTR/U6中，并且将重组载体与腺病毒载体pAd-DEST和Gateway LR Clonase(Invitrogen)混合，并将混合物引入DH5α大肠杆菌菌株，以获得腺病毒重组DNA(shPtx4腺病毒载体；pAd-Ptx4i)。将获得的pAd-Ptx4i转染并扩增到HEK293细胞中。随后，使用PD-10柱(BD healthcare)将载体浓缩并纯化至1×1011至5×1011噬斑形成单位(plaque-forming units，p.f.u.)/ml。
实施例A(3)：将Ptx4 RNAi腺病毒载体转染到小鼠中并制备各组织样品
将Ptx4i腺病毒载体(pAd-Ptx4i)以2×108至8×108噬斑形成单位(p.f.u.)/只的剂量静脉内施用到小鼠中。在每个时间点从小鼠解剖附睾脂肪组织和肝脏，并在液氮中快速冷冻。将等分的解剖组织用4％多聚甲醛(PFA)固定作为组织学样品。
实施例B：分析
实施例B(1)：肝脏脂肪含量的分析
将储存在液氮中的肝脏组织(每个0.2g)用破碎设备均化后，将每个匀浆在微管中称重。从匀浆中取出每200mg等份。向每个等份中加入2ml氯仿/甲醇(2∶1，v/v)后，将肝内脂质在4℃下萃取到有机溶剂中48小时。随后，将100μl所得提取物注入玻璃管中，并干燥提取物，并自然干燥有机溶剂提取溶液中的有机溶剂，并然后除去。将提取物的沉淀溶解在异丙醇中，并通过酶测定(Wako TG测量试剂盒)测量其脂质含量。测量反应溶液的吸光度，并计算每1g肝脏组织的脂质的量(mg)。
实施例B(2)：肝糖原含量分析
使用破碎设备将肝脏组织在5体积(v/w，肝重量)的0.6N高氯酸中匀浆。向匀浆(0.1g)中加入250μl的30％氢氧化钾溶液，并在搅拌下将混合物煮沸5分钟，然后在冰上冷却。随后，向混合物中加入50μl的2％硫酸钠和800μl的66％乙醇，并然后搅拌混合物。将沉淀在66％乙醇中再洗涤并悬浮在3ml蒸馏水中。将淀粉葡萄糖苷酶溶液加入悬浮液中后，将悬浮液在搅拌下在55℃的温浴中孵育30分钟。通过葡萄糖氧化酶(GOD)测定在570nm的吸光度下测量所得上清液中的糖原含量。由吸光度计算每1g肝脏组织的糖原量(mg)。
实施例B(3)：血浆生化分析
在血浆分析中，使用超灵敏小鼠胰岛素测量试剂盒(Ultrasensitive MouseInsulin Measurement Kit，Morinaga)测量小鼠血浆中的胰岛素量。分别通过使用Triglyceride TestWako、Glucose CII Test Wako和NEFA C-Test Wako(Wako PureChemicals)测量小鼠血浆中甘油三酯、葡萄糖和游离脂肪酸的量。
实施例B(4)：组织的基因表达水平分析
RNA表达水平的测量
将一片肝脏组织置于1.5ml TRIzol(Invitrogen)中，并立即使用破碎设备将混合物均化。将匀浆以15000rpm离心5分钟以收集上清液。将上清液加入0.3ml氯仿中。搅拌后，将混合物再次以15000rpm离心15分钟以收集溶液的上层。向所得上层加入0.75ml异丙醇，并将混合物以15000rpm离心15分钟以沉淀mRNA。将含有mRNA的沉淀在80％乙醇中洗涤两次，溶解在0.5ml蒸馏水中，并用于测量mRNA量。在将mRNA调节至相同量后，使用逆转录酶(High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit；Applied Biosystems)产生cDNA。使用获得的cDNA和通过定量RT-PCR(SYBR Green Dye；Roche Applied Science)制备的靶基因的引物测量基因表达水平。用于测量基因表达水平的靶基因和引物设计如下所示(表3和4)。
[表3]
表3.用于定量基因表达水平的靶基因和引物设计(No.l)
[表4]
表4.用于定量基因表达水平的靶基因和引物设计(No.2)
实施例B(5)：肝脏组织的PAS染色
将用4％PFA固定的肝脏组织脱蜡，然后与1％高碘酸水溶液反应10分钟，并在流水下洗涤5分钟。然后，使其与Schiff试剂反应10分钟，与0.5％亚硫酸氢盐水溶液反应，并在流水下洗涤5分钟。用Mayer′s Hematoxylin溶液进行核染色后，在流水下再次洗涤，在95％乙醇中脱水，然后在100％乙醇中洗涤，并然后渗透并包埋。
实施例B(6)：肝脏组织的HE染色
将用4％PFA固定的肝脏组织脱蜡后，在Hematoxylin溶液的染色瓶中浸渍并反应1至5分钟。在流水下洗涤5分钟后，将组织与Eosin溶液反应5至10分钟并用水冲洗。随后，为脱水，将组织浸入90％乙醇中，然后浸入95％乙醇和无水乙醇中。浸入二甲苯后，将其包埋。
实施例B(7)：蛋白质免疫印迹
作为胰岛素信号转导蛋白的一抗(p-IR、p-Akt、p-S6K、p-GS、p-Foxo)、Phospho-InsulinReceptor β(Tyr1361)(8482)兔mAb#3023、Phospho-Akt(Ser473)抗体#9271、Phospho-p70S6Kinase(Thr389)抗体#9205、Phospho-Glycogen Synthase(Ser641)抗体#3891、Phospho-Fox01(Thr24)/Fox03a(Thr32)抗体#9464从cell signaling公司获得，并且蛋白质免疫印迹根据试剂盒附上的方案进行。
实施例B(8)：呼吸代谢的分析
使用由Arco System Inc.制造的代谢笼(ARCO-2000系列)，在最佳条件下进行呼吸代谢分析。
实施例C：结果
实施例C(1)：碳水化合物/脂质失衡的改善
有一种病因机制能解释肥胖患者中碳水化合物/脂质代谢紊乱引起的胰岛素抵抗疾病的发病以及脂肪生成比碳水化合物合成更显著(lde T.Nature Cell 8iol 2004.4；6(4)：351-7)。因此，碳水化合物/脂质代谢(碳水化合物-脂质失衡)的扰乱平衡的改善成为治疗的根本方法。本发明人着眼于Ptx4基因的功能，并测量使用Ptx4i腺病毒载体(pAd-Ptx4i)抑制Ptx4转录的C57BL/6J小鼠肝脏中糖原和甘油三酯的含量。因此，本发明人发现，通过抑制Ptx4基因的功能，C57BL/6J小鼠的肝脏组织中碳水化合物对脂质的比例增加，并且与脂肪生成相比，碳水化合物合成得到增强。
当将在0.6N高氯酸中加热的肝脏提取溶液静置时，在Ptx4-抑制(Ptx4-i)组的上清液中未发现漂浮的脂质，而对照(LacZ-i)组中的漂浮脂质丰富。此外，在对照(LacZ-i)组中确认少量白色沉淀物，但在Ptx4-抑制(Ptx4-i)组中沉淀层中观察到大量白色沉淀物(图1)。当在C578L/6J小鼠的肝脏中测量糖原和甘油三酯的含量时，发现Ptx4-抑制(Ptx4-i)组中的糖原含量增加至比对照(LacZ-i)组中的高约1.6倍，和甘油三酯含量降低至对照(LacZ-i)组的低约0.68倍(图2)。
根据这些结果，在正常生理饥饿状态下，首先利用碳水化合物衍生的能量(糖原)，并然后，作为脂肪酸衍生能量的来源，利用由脂肪组织脂解产生的甘油三酯。然而，当抑制Ptx4基因的功能时，发现脂肪组织或肝细胞中的甘油三酯首先用作来源，然后利用基于碳水化合物的能量。因此，生物能源的使用发生“范式转换(paradigm shift)”。从上述发现可以预期，通过抑制Ptx4基因的功能，能够改善肥胖患者中脂肪生成而非碳水化合物合成占优势的碳水化合物/脂质代谢的异常平衡。
实施例C(2)：增强脂肪组织中的脂解并转化成米色脂肪细胞
已知脂肪组织在一定条件下转化为具有有效产热性质的米色脂肪细胞。还报道在米色脂肪细胞中UCPl基因表达增强，并且增强的UCP1基因表达可归因于产热，导致能量消耗的增加(Lowell，B.B.，et al.Nature 404，652-660.2000)。因此，本发明人通过抑制Ptx4基因的功能来检查脂肪组织中是否会发生这种变化。
在C57BL/6J小鼠中，Ptx4-抑制(Ptx4-i)组中附睾脂肪组织的颜色呈现深红棕色，并且与对照(LacZ-i)组中看到的白色样色调明显不同。(这是通常在附睾脂肪组织中发现的颜色)(图3)。另外，观察到与对照(LacZ-i)组相比，C57BL/6J小鼠的Ptx4-抑制(Ptx4-i)组的体重降低(图4)。此外，发现与对照(LacZ-i)组相比，C57BL/6J小鼠Ptx4-抑制(Ptx4-i)组的附睾脂肪组织(相当于人体内脏脂肪)的重量减少约50％(图4)。当在抑制Ptx4基因功能的C57BL/6J小鼠中通过定量RT-PCR测量脂肪组织的基因表达时，发现已知在米色脂肪细胞中增强的UCP1基因表达显著增加(p＜0.05)。
还证实，在高脂肪饮食诱导的肥胖(饮食诱导的肥胖(DIO))小鼠和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)模型小鼠中，在19℃的繁殖温度下，Ptx4-抑制(Ptx4-i)组中发生米色脂肪形成(图5和6)。
从这些结果可以清楚，通过抑制Ptx4基因在与肝脏组织不同的脂肪组织中的功能来促进脂解，并且将脂肪细胞转化为具有米色脂肪细胞样特性的脂肪细胞，其中甘油三酯易于降解和利用。这一发现似乎是由与下列现象类似的机制引起的：由于去甲肾上腺素通过激活交感神经系统引起的刺激如冷刺激激活p38、MAPK和PGCla的信号传导级联，并导致转化为棕色脂肪细胞或能够激活产热的米色脂肪细胞(Cao，W.et al.Mol.Cell.Biol.24，3057-3067.2004)。因为从脂肪组织释放的脂肪酸和甘油都占约60％，其作为肝脏中甘油三酯生物合成来源的最大贡献(Browning JO et.al.J.Clin.Invest.2004；114(2)：147-52.)，它们是肝脏中甘油三酯代谢调节的重要因素。因此，可以理解，通过抑制Ptx4基因功能而诱导的脂肪组织中脂解的控制对代谢调节系统具有相当大的影响。根据上述发现，预期抑制Ptx4基因的功能对肝细胞中中性脂肪滴的积累具有抑制效果，这是一种增加脂解效果和抗肥胖效果的方法。
实施例C(3)：通过肝转录调节改善碳水化合物/脂质平衡(降低SREBP1和SREBP2表 达，增加Gys2表达或抑制pygl表达)和抗炎症反应。
据报道，在肝脏中糖原含量增加和甘油三酯含量降低后，胰岛素抵抗得到改善(Nakagawa Yet al.Nat Med.2006Jan；12(1)：107-13.)。因此，本发明人检查通过抑制Ptx4基因的功能是否会发生导致肝脏中胰岛素敏感性增强的肝转录调节。
首先，通过抑制Ptx4基因的功能，发现SREBP-1c和SREBP-2基因在从头(de novo)脂肪生成途径(甘油三酯和胆固醇的合成途径)在转录水平在肝脏组织中受到抑制(图7a)。另一方面，还发现通过抑制Ptx4基因的功能，在转录水平在肝脏组织中增强负责糖原合成的Gys2基因表达(图7a)。此外，通过抑制Ptx4基因的功能CPT-1a基因表达在肝脏中增加(图7c)，推测增强的β-氧化。此外，发现炎症诱导的转录因子IKK-β和NFκB以及炎性细胞因子IL-1β的基因表达通过抑制Ptx4基因的功能而降低，表明与上述发现的一致性(图7b)。此外，证实在Ptx4-抑制(Ptx4-i)组中在19℃的繁殖温度下观察到Sod2(氧化应激标记物)的表达降低和肝细胞中氧化应激水平降低(图8)。然而，即使当Ptx4基因的功能受到抑制时，随机葡萄糖、胰岛素、甘油三酯和游离脂肪酸的血浆水平也没有显著变化(图9)。
将Ptx4i腺病毒载体(pAd-Ptx4i)在19℃的繁殖温度下施用野生型小鼠(C57BL/6J)。给药一周后，杀死小鼠，从肝脏中提取蛋白质。通过蛋白质免疫印迹分析胰岛素信号传导相关蛋白的表达。在Ptx4-抑制(Ptx4-i)组中观察到胰岛素信号传导的改善，表明肝脏中的胰岛素敏感性增强。因此，通过施用Ptx4i腺病毒载体(pAd-Ptx4i)证实对胰岛素抵抗(肥胖相关的炎性变化)的改善效果(图10)。
实施例C(4)：在肥胖模型小鼠中由于改善碳水化合物/脂质的扰乱的平衡(碳水化 合物-脂质失衡)引起的脂肪肝改善和炎症的抑制效果
根据上述实施例(1)至(3)在野生型C57BL/6J小鼠中的分析结果，发现Ptx4基因功能的抑制导致1)肝脏脂肪酸在碳水化合物/脂质平衡(促进的β-氧化)中的主要利用，2)从头脂肪生成途径中基因表达水平降低，3)诱导抗炎反应，和4)氧化应激减少。发明人检查在肥胖模型小鼠中是否能够确认与上述类似的治疗效果。作为肥胖模型小鼠，高脂肪饮食诱导的肥胖(饮食诱导的肥胖(DIO))小鼠和瘦素基因缺陷小鼠(Lepob/Lepob)用于以下分析。
首先，在Ptx4i腺病毒载体(pAd-Ptx4i)通过静脉内注射施用瘦素基因缺陷型小鼠模型(Lepob/Lepob)。为了肝脏的组织化学分析进行PAS染色(图11)。在图11中，星号表示肝脏的中央静脉，并且箭头指出脂滴。在瘦素基因缺陷小鼠(Lepob/Lepob)中，证实许多大的脂滴主要积聚在对照(LacZ-i)组的门静脉和中央静脉周围，而在Ptx4抑制(Ptx4-i)组中观察到脂滴明显减少，且脂滴直径较小(图11)。此外，在瘦素基因缺陷小鼠(Lepob/Lepob)中，在PAS染色中证实，具有糖链的多种多糖(包括糖原作为代表性)在对照(LacZ-i)组中增加，但以深蓝紫色染色更强烈的PAS阳性细胞在Ptx4抑制(Ptx4-i)组中增加，(图11)。在量化这些发现后，证实通过抑制Ptx4基因的功能，肝糖原含量增加并且肝甘油三酯含量降低，这与野生型C57BL/6J小鼠的结果相似(图12)。
从这些观察结果还发现，通过抑制瘦素基因缺陷小鼠(Lepob/Lepob)中Ptx4基因的功能，改善了碳水化合物/脂质代谢的扰乱平衡(碳水化合物/脂质失衡)。
接下来，发现在瘦素基因缺陷小鼠(Lepob/Lepob)的脂肪肝组织中，通过抑制Ptx4基因功能，在从头脂肪生成途径中的基因表达(SREBP-lc和SREBP-2)在转录水平被抑制。另一方面，发现通过抑制Ptx4基因的功能，在转录水平上增强脂肪肝组织中用于糖原合成的Gys2基因的表达(图13a)。通过抑制Ptx4基因的功能证实CPT-1α基因表达在脂肪肝组织中增加，推测增强的β-氧化(图13c)。此外，还发现炎症诱导的转录因子IKK-β和NFκB以及炎症细胞因子IL-1β的基因表达通过抑制Ptx4基因的功能而降低(图13b)。另外，证实在Ptx4-抑制(Ptx4-i)组中，在19℃的繁殖温度下，氧化应激标记物Sod2的表达降低，并且肝细胞中的氧化应激也降低(图14)。
在19℃的繁殖温度下，在饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠的肝脏中证实相似的基因表达模式，并因此在多个肥胖模型小鼠中以一致性确认对Ptx4基因的抑制效果(图15)。
将Ptx4i腺病毒载体(pAd-Ptx4i)在19℃的繁殖温度下施用饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠。施用一周后，使用ELISA方法测量血液随机葡萄糖和血浆胰岛素浓度。因此，在Ptx4-抑制(Ptx4-i)组中观察到血糖水平的显著降低和血液胰岛素水平降低的趋势(图16)。
实施例C(5)：用于非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的治疗剂的概念验证
由此预期，通过抑制Ptx4基因的功能，对伴有中性脂肪蓄积的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)发挥预防或治疗作用。在给小鼠喂食胆碱缺乏的甲硫氨酸定义的高脂肪饮食(CDAHFD)三周以产生NASH模型小鼠(CDAHFDNASH模型小鼠)后，施用Ptx4i腺病毒载体(pAd-Ptx4i)。施用载体一周后，测量肝脏中甘油三酯和糖原的含量。所有繁殖温度设定为19℃。因此，在NASH模型小鼠(CDAHFD NASH模型小鼠)的Ptx4-抑制(Ptx4-i)组中观察到糖原含量增加的趋势和甘油三酯含量降低的趋势(图17)。
将Ptx4i腺病毒载体(pAd-Ptx4i)在19℃的繁殖温度下施用上述NASH模型小鼠，并且施用一周后，进行肝脏的组织学检查。结果，在Ptx4-抑制(Ptx4-i)组中观察到门静脉(PV)周围的空隙区域的面积减少(脂滴的数量减少)，表明脂肪肝的改善，这是NASH的病理学指标(图18)。
接下来，研究超氧化物歧化酶2(Sod2)(肝脏中抗氧化应激的指标之一)的mRNA表达水平，以通过抑制每种模型小鼠中Ptx4基因的功能来检查抗氧化反应。结果，在野生型小鼠、饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠和NASH模型小鼠(COAHFD NASH模型小鼠)的Ptx4-抑制(Ptx4-i)组中观察到Sod2mRNA表达显著降低和趋于降低(图8，15和19)。这些结果表明，通过施用Ptx4i腺病毒载体(pAd-Ptx4i)减轻肝脏中的氧化应激，导致NASH模型小鼠中mRNA表达水平降低。
此外，研究Collagen1a和Collagen3a的mRNA表达水平，以确认通过抑制Ptx4基因功能对具有非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的小鼠中的肝纤维化的效果。在NASH的小鼠中，在Ptx4-抑制(Ptx4-i)组中观察到每种肝纤维化标志物的基因表达降低，并且还证实通过施用Ptx4i腺病毒载体(pAd-Ptx4i)改善加剧的肝纤维化(图19)。
上述结果是满足食品和药物管理局(FDA)批准的关于非酒精性脂肪性肝炎(NASH)治疗剂的概念验证中所述的潜在终点的所有标准的治疗结果，如下：(i)肝脏脂肪含量降低，和(ii)细胞损伤标志物(炎症、氧化应激和纤维化)表达水平降低。
肝内脂肪的来源包括以下：i)来自脂肪组织的游离脂肪酸(60％)，ii)从头脂肪生成(26％)，和iii)从摄取的葡萄糖或脂肪的衍生物(14％)(Kerry L.et al.J Clinlnvest.2005；115(5)：1343-1351.doi：10.1172/JCI23621)。因此，本发明人通过抑制瘦素基因缺陷小鼠(Lepob/Lepob)中Ptx4基因的功能来检查摄取的葡萄糖或脂肪的量是否会减少。
因此，通过抑制瘦素基因缺陷小鼠(Lepob/Lepob)中Ptx4基因的功能确认了口服食物消耗和体重的减少(图20)。
从上述结果可以清楚，通过抑制Ptx4基因的功能减少食物消耗和减轻体重，作为病理状态对肥胖有效。已知PPARγ激动剂和维生素E是用于非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的预先存在的治疗药物的活性成分(Hardy T.et al.Current Opinion inGastroenterology31(3)：175-183.2015)。然而，尚未发现活性成分，其具有对上述涉及肝脏脂肪累积的所有三种脂肪来源的效果。因此，预期本发明具有作为对非酒精性脂肪性肝炎(NASH)发挥新效果的新药的临床效果。
实施例C(6)：通过代谢控制伪休眠状态的器官保护和疾病预防
将Ptx4i腺病毒载体(pAd-Ptx4i)在19℃的繁殖温度下使用野生型小鼠(C57BL/6J)后24小时，使用代谢笼测量氧消耗(oxygen consumption，VO2)和呼吸商(respiratoryquotient，RQ)。从结果创建图表并计算曲线下面积(area under the curve，AUC)。因此，证实在野生型小鼠(C57BL6/J)的Ptx4-抑制(Ptx4-i)组中，氧消耗(VO2)显著降低，表明代谢反应降低，并且呼吸商(RQ)也降低(图21)。
在瘦素基因缺陷型小鼠(Lepob/Lepob)中，发现与对照(LacZ-i)组相比，Ptx4-抑制(Ptx4-i)组中的直肠温度(深部体温)下降约0.9℃。还发现UCP2基因表达在肝脏中降低(图22)。
尽管能够解释这种现象的机制尚未完全阐明，但休眠和麻木具有明显的生理条件，例如生理代谢水平降低和体温下降。据报道，休眠特异性蛋白(hibernation-specificprotein，HP)是一种从肝脏分泌的分子，直接作用于大脑以诱导休眠(Kondo N et.al，Cell.2006年4月7日；125(1)：161-72)。
在休眠引起的生理学发现与在本发明中通过抑制Ptx4基因的功能诱导的生理发现之间看到相似性。它们包括减少基础代谢、降低体温和利用脂肪酸作为主要能源。根据这些一致的发现，推测生物体通过抑制Ptx4基因的功能而转变为伪休眠的代谢状态。因此，这些重要发现提供解释由Ptx4基因编码的穿透素-4蛋白的基本生理作用的观点。
此外，据报道，休眠具有保护器官免受各种不良事件引起的疾病或病症的效果。这些效果包括维持较低的体温(Hochachk et.al，Science，231(1986)，234-241)、保护免受缺血(KU Frerichs et.al，J.Cereb.Blood Flow Metab.，18(1998)，PP.168-175)\保护免受肌萎缩(HJ Harlow et.al，Nature，409(2001)，p.997)、抑制细菌感染(VM Sharapov etal.，Mycopathologia，84(1983)，pp.77-80)和抑制肿瘤发生(GB Kemper etal.Comp.Biochem.Physiol.，73C(1982)，pp.445-450)作为休眠中代谢状态的特征。
因此，预计可能通过抑制Ptx4基因的功能引发的伪休眠中的代谢状态对于器官保护是有效的，例如保护免于肝硬化或由于非酒精性脂肪性肝炎(NASH)引起的恶性疾病或由于糖尿病引起的并发症。此外，由于辐射暴露诱导的基础代谢减少和细胞损伤减轻，本发明有望促进对长期暴露于宇宙射线的防御反应，并应用于太空业务发展(Cerri M et al.，Life Sci Space Res.，90(4)(2016)pp.445-452)。
实施例D(1)：识别穿透素-4蛋白抗体的制备
为制备识别穿透素-4蛋白的抗体，使用由Eurofins Genomics K.K.提供的抗体合同制造服务，用表2中所述的氨基酸序列2(SEQ ID NO 4)的肽制备抗穿透素-4兔IgG多克隆抗体。
实施例D(2)：识别穿透素-4蛋白的抗体对穿透素-4蛋白功能的抑制效果
检查抗穿透素-4兔IgG多克隆抗体对体内(in vivo)穿透素-4蛋白功能的抑制效果。将作为对照的抗穿透素-4兔IgG多克隆抗体(50μg/只)和兔IgG抗体(50μg/只)在19℃的繁殖温度下分别静脉内施用于野生型小鼠(C57BL/6J)。施用后7天内，观察这些抗体对穿透素-4蛋白功能的抑制效果。因此，在接受抗穿透素-4兔IgG多克隆抗体的实验组中施用后，观察到累积食物消耗的减少(图23)。在接受抗穿透素-4兔IgG多克隆抗体的实验组中，与腹股沟脂肪组织相比，观察到附睾脂肪组织重量急剧下降的趋势，表明改善的胰岛素抵抗(图24)。从这些结果证实，观察到食欲减退和附睾脂肪组织重量降低的强烈趋势，并且通过施用该抗体抑制穿透素-4蛋白功能，这与施用Ptx4i腺病毒载体(pAd-Ptx4i)后观察到的结果相似。由上可知，施用识别穿透素-4蛋白的抗体能有效改善肥胖相关疾病的状况。
序列表
<110> 国立大学法人 东京大学
<120> 通过肝分泌代谢调节剂抑制作用的肥胖相关疾病的治疗剂
<130> 218925
<160> 41
<210> 1
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>
<222>
<223> 用于表达RNAi介导物的设计的核苷酸
<400> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<221>
<222>
<223> 用于表达RNAi介导物的设计的核苷酸
<400> 2
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<222>
<223> 作为抗原的设计的多肽
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<221>
<222>
<223> 作为抗原的设计的多肽
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1 5 10
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<211> 14
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<213> 人工序列
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<221>
<222>
<223> 作为抗原的设计的多肽
<400> 5
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1 5 10
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<223> 用于定量RT-PCR的设计的引物
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<221>
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<223> 用于定量RT-PCR的设计的引物
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<223> 用于定量RT-PCR的设计的引物
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<223> 用于定量RT-PCR的设计的引物
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<223> 用于定量RT-PCR的设计的引物
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<223> 用于定量RT-PCR的设计的引物
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<223> 用于定量RT-PCR的设计的引物
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<223> 用于定量RT-PCR的设计的引物
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<223> 用于定量RT-PCR的设计的引物
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<223> 用于定量RT-PCR的设计的引物
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<223> 用于定量RT-PCR的设计的引物
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<223> 用于定量RT-PCR的设计的引物
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<223> 用于定量RT-PCR的设计的引物
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<223> 用于定量RT-PCR的设计的引物
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<223> 用于定量RT-PCR的设计的引物
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<223> 用于定量RT-PCR的设计的引物
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<223> 用于定量RT-PCR的设计的引物
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<223> 用于定量RT-PCR的设计的引物
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<223> 用于定量RT-PCR的设计的引物
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<212> DNA
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<223> 用于定量RT-PCR的设计的引物
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<223> 用于定量RT-PCR的设计的引物
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<223> 用于定量RT-PCR的设计的引物
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<223> 用于定量RT-PCR的设计的引物
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<223> 用于定量RT-PCR的设计的引物
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<220>
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<223> 用于定量RT-PCR的设计的引物
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<223> 用于定量RT-PCR的设计的引物
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<221>
<222>
<223> 用于定量RT-PCR的设计的引物
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<223> 用于定量RT-PCR的设计的引物
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<223> 用于定量RT-PCR的设计的引物
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<220>
<221>
<222>
<223> 用于定量RT-PCR的设计的引物
<400> 35
caataaagac tacagcaccc c 21
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>
<222>
<223> 用于定量RT-PCR的设计的引物
<400> 36
taaggatttc ggtggtgaca 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>
<222>
<223> 用于定量RT-PCR的设计的引物
<400> 37
tgtcaccacc gaaatcctta 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>
<222>
<223> 用于定量RT-PCR的设计的引物
<400> 38
gaagacaggg cgacctggaa 20
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>
<222>
<223> 用于定量RT-PCR的设计的引物
<400> 39
ttgtctgctc ccacaatgaa gc 22
<210> 40
<211> 1422
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221> CDS
<222> (1) to (1419)
<223>
<400> 40
atg ggg agt gga aac tgg gag gtc aca ggt cca cct tgt ggc agt cgg 48
Met Gly Ser Gly Asn Trp Glu Val Thr Gly Pro Pro Cys Gly Ser Arg
1 5 10 15
tgt gaa cgg cct ccc gga ctc cca cgc ggg gtc cac gga cag ttc cgg 96
Cys Glu Arg Pro Pro Gly Leu Pro Arg Gly Val His Gly Gln Phe Arg
20 25 30
agt gct gtg ggc ctg tcg ggc ctg cgc tgg ttc cgg aga ttc cag gag 144
Ser Ala Val Gly Leu Ser Gly Leu Arg Trp Phe Arg Arg Phe Gln Glu
35 40 45
gtg acc tgg aca cac ctg cag aac atc gcc agc aac tac aac gtg tcc 192
Val Thr Trp Thr His Leu Gln Asn Ile Ala Ser Asn Tyr Asn Val Ser
50 55 60
tac aac gtt gac gtc cgg ttc cgg agc ctg gcg gaa gag agc cag gct 240
Tyr Asn Val Asp Val Arg Phe Arg Ser Leu Ala Glu Glu Ser Gln Ala
65 70 75 80
gtg gct cag gca gtc aac cgg tca cag gcc tcg gtg cag ggg gag ctg 288
Val Ala Gln Ala Val Asn Arg Ser Gln Ala Ser Val Gln Gly Glu Leu
85 90 95
gcg cag ctc aag gcc tgg gtg agg aag ctg cag cgc cga ggc cgg aaa 336
Ala Gln Leu Lys Ala Trp Val Arg Lys Leu Gln Arg Arg Gly Arg Lys
100 105 110
gta gac acg cgg ctg cgg gcc ttg gac ctc acc ctg ggc gag agg agc 384
Val Asp Thr Arg Leu Arg Ala Leu Asp Leu Thr Leu Gly Glu Arg Ser
115 120 125
cag cag cgg gcc cgg gaa agg aag gca cac aag gcc cag agg gac gcc 432
Gln Gln Arg Ala Arg Glu Arg Lys Ala His Lys Ala Gln Arg Asp Ala
130 135 140
ctg cag gac tca ctg gca cgc ctg gag ggc ctc gtc cac agc cag ggc 480
Leu Gln Asp Ser Leu Ala Arg Leu Glu Gly Leu Val His Ser Gln Gly
145 150 155 160
gcc agg ctg gct gct ctg gag ggg cgg ctg ccc gtg gcc cac cct ggc 528
Ala Arg Leu Ala Ala Leu Glu Gly Arg Leu Pro Val Ala His Pro Gly
165 170 175
act gca gcc ctc ggg ccg gcc ctg gtc cca acc cca acc cag cct gag 576
Thr Ala Ala Leu Gly Pro Ala Leu Val Pro Thr Pro Thr Gln Pro Glu
180 185 190
gag ctg ggc ccg acc tcc ctg aag ctt cag agg gac agg cag gag ctc 624
Glu Leu Gly Pro Thr Ser Leu Lys Leu Gln Arg Asp Arg Gln Glu Leu
195 200 205
cga gct gcc tct gag cac agg ggc ccc cca cag gac tcc tcg gcc cct 672
Arg Ala Ala Ser Glu His Arg Gly Pro Pro Gln Asp Ser Ser Ala Pro
210 215 220
ctc caa ggg agg cgg gag cct cca gcc tca ggc agc cat cgg gta ctc 720
Leu Gln Gly Arg Arg Glu Pro Pro Ala Ser Gly Ser His Arg Val Leu
225 230 235 240
agt ggg act gcc cca aaa gac cct cgg cag cag gca tgg tcc ccc cag 768
Ser Gly Thr Ala Pro Lys Asp Pro Arg Gln Gln Ala Trp Ser Pro Gln
245 250 255
gtg cca gga gag att tgc ggc gtg ggc ccc acc ctc gtt ttc cca aac 816
Val Pro Gly Glu Ile Cys Gly Val Gly Pro Thr Leu Val Phe Pro Asn
260 265 270
gcc tcc acc agg aac gtg gtc ttc ctc agc cct ggt ttc gtc act gcc 864
Ala Ser Thr Arg Asn Val Val Phe Leu Ser Pro Gly Phe Val Thr Ala
275 280 285
ctg cga gcc ctg tcc ttc tgc agc tgg gtc cgc acg gcc tcc ggc cgc 912
Leu Arg Ala Leu Ser Phe Cys Ser Trp Val Arg Thr Ala Ser Gly Arg
290 295 300
ctg ggc acc ctc ctg tcc tac gcc acc gag gac aat gac aac aag ctg 960
Leu Gly Thr Leu Leu Ser Tyr Ala Thr Glu Asp Asn Asp Asn Lys Leu
305 310 315 320
gtg ctg cac ggc cga gac tcc ctg ctg ccc gga tcc atc cac ttc gtg 1008
Val Leu His Gly Arg Asp Ser Leu Leu Pro Gly Ser Ile His Phe Val
325 330 335
atc ggg gac ccg gcc ttc agg gag ctg ccc ttg cag ctg ctg ctg gac 1056
Ile Gly Asp Pro Ala Phe Arg Glu Leu Pro Leu Gln Leu Leu Leu Asp
340 345 350
ggc cag tgg cac cac atc tgt gtc atc tgg acg tcc acc cag ggc agg 1104
Gly Gln Trp His His Ile Cys Val Ile Trp Thr Ser Thr Gln Gly Arg
355 360 365
tac tgg ctc cac gtg gat cgc agg ctg gtg gcc acc ggc tcc cgc ttc 1152
Tyr Trp Leu His Val Asp Arg Arg Leu Val Ala Thr Gly Ser Arg Phe
370 375 380
agg gag ggc tat gag atc ccc ccc gga ggg tcc ctc gtg ctg ggc cag 1200
Arg Glu Gly Tyr Glu Ile Pro Pro Gly Gly Ser Leu Val Leu Gly Gln
385 390 395 400
gaa caa gac agc gtg ggg ggc gga ttc gac agc tcc gag gcc ttc gtg 1248
Glu Gln Asp Ser Val Gly Gly Gly Phe Asp Ser Ser Glu Ala Phe Val
405 410 415
ggg agc atg tct ggc ttg gct atc tgg gat cgg gcg ctg gtt ccc ggg 1296
Gly Ser Met Ser Gly Leu Ala Ile Trp Asp Arg Ala Leu Val Pro Gly
420 425 430
gaa gtt gca aac ctt gcc atc ggg aaa gag ttc ccg aca ggt gcc atc 1344
Glu Val Ala Asn Leu Ala Ile Gly Lys Glu Phe Pro Thr Gly Ala Ile
435 440 445
ctg acg ctg gcc aat gct gca cta gca ggc gga ttt gtg cag ggg gcc 1392
Leu Thr Leu Ala Asn Ala Ala Leu Ala Gly Gly Phe Val Gln Gly Ala
450 455 460
aac tgc acc tgc ctg gaa cgc tgt ccc tga 1422
Asn Cys Thr Cys Leu Glu Arg Cys Pro
465 470
<210> 41
<211> 473
<212> PRT
<213> 人类
<400> 41
Met Gly Ser Gly Asn Trp Glu Val Thr Gly Pro Pro Cys Gly Ser Arg
1 5 10 15
Cys Glu Arg Pro Pro Gly Leu Pro Arg Gly Val His Gly Gln Phe Arg
20 25 30
Ser Ala Val Gly Leu Ser Gly Leu Arg Trp Phe Arg Arg Phe Gln Glu
35 40 45
Val Thr Trp Thr His Leu Gln Asn Ile Ala Ser Asn Tyr Asn Val Ser
50 55 60
Tyr Asn Val Asp Val Arg Phe Arg Ser Leu Ala Glu Glu Ser Gln Ala
65 70 75 80
Val Ala Gln Ala Val Asn Arg Ser Gln Ala Ser Val Gln Gly Glu Leu
85 90 95
Ala Gln Leu Lys Ala Trp Val Arg Lys Leu Gln Arg Arg Gly Arg Lys
100 105 110
Val Asp Thr Arg Leu Arg Ala Leu Asp Leu Thr Leu Gly Glu Arg Ser
115 120 125
Gln Gln Arg Ala Arg Glu Arg Lys Ala His Lys Ala Gln Arg Asp Ala
130 135 140
Leu Gln Asp Ser Leu Ala Arg Leu Glu Gly Leu Val His Ser Gln Gly
145 150 155 160
Ala Arg Leu Ala Ala Leu Glu Gly Arg Leu Pro Val Ala His Pro Gly
165 170 175
Thr Ala Ala Leu Gly Pro Ala Leu Val Pro Thr Pro Thr Gln Pro Glu
180 185 190
Glu Leu Gly Pro Thr Ser Leu Lys Leu Gln Arg Asp Arg Gln Glu Leu
195 200 205
Arg Ala Ala Ser Glu His Arg Gly Pro Pro Gln Asp Ser Ser Ala Pro
210 215 220
Leu Gln Gly Arg Arg Glu Pro Pro Ala Ser Gly Ser His Arg Val Leu
225 230 235 240
Ser Gly Thr Ala Pro Lys Asp Pro Arg Gln Gln Ala Trp Ser Pro Gln
245 250 255
Val Pro Gly Glu Ile Cys Gly Val Gly Pro Thr Leu Val Phe Pro Asn
260 265 270
Ala Ser Thr Arg Asn Val Val Phe Leu Ser Pro Gly Phe Val Thr Ala
275 280 285
Leu Arg Ala Leu Ser Phe Cys Ser Trp Val Arg Thr Ala Ser Gly Arg
290 295 300
Leu Gly Thr Leu Leu Ser Tyr Ala Thr Glu Asp Asn Asp Asn Lys Leu
305 310 315 320
Val Leu His Gly Arg Asp Ser Leu Leu Pro Gly Ser Ile His Phe Val
325 330 335
Ile Gly Asp Pro Ala Phe Arg Glu Leu Pro Leu Gln Leu Leu Leu Asp
340 345 350
Gly Gln Trp His His Ile Cys Val Ile Trp Thr Ser Thr Gln Gly Arg
355 360 365
Tyr Trp Leu His Val Asp Arg Arg Leu Val Ala Thr Gly Ser Arg Phe
370 375 380
Arg Glu Gly Tyr Glu Ile Pro Pro Gly Gly Ser Leu Val Leu Gly Gln
385 390 395 400
Glu Gln Asp Ser Val Gly Gly Gly Phe Asp Ser Ser Glu Ala Phe Val
405 410 415
Gly Ser Met Ser Gly Leu Ala Ile Trp Asp Arg Ala Leu Val Pro Gly
420 425 430
Glu Val Ala Asn Leu Ala Ile Gly Lys Glu Phe Pro Thr Gly Ala Ile
435 440 445
Leu Thr Leu Ala Asn Ala Ala Leu Ala Gly Gly Phe Val Gln Gly Ala
450 455 460
Asn Cys Thr Cys Leu Glu Arg Cys Pro
465 470

Claims (21)

1.筛选用于治疗肥胖相关疾病的药物的方法，其特征在于使用候选药物抑制穿透素-4(pentraxin-4)作用的能力作为指标，并在于鉴定具有作为治疗肥胖相关疾病的药物的能力的候选药物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述指标是抑制穿透素-4基因表达的能力。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述指标是抑制从穿透素-4基因到mRNA的转录的起始的能力，降解来自穿透素-4基因的mRNA的能力，或抑制从穿透素-4 mRNA翻译成蛋白质的能力。
4.根据权利要求2或3的方法，其特征在于使用核酸分子，在所述核酸分子中包含穿透素-4基因的转录调节区的DNA片段和包含报告基因的DNA片段可操作地连接。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述指标是抑制穿透素-4蛋白功能的能力。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述指标是抑制所述穿透素-4蛋白的胞外分泌的能力，抑制穿透素-4蛋白向神经元中转移的能力，或抑制从穿透素-4蛋白信号转导的能力。
7.根据权利要求5或6的方法，包括选择特异性结合穿透素-4蛋白的物质作为初级候选物的步骤。
8.根据权利要求1至7中任一项的方法，其中待筛选的药物是用于由脂解增强引起的肥胖改善、胰岛素抵抗的改善、由米色脂肪生成引起的抗肥胖、肝脏脂肪积累减少、肝脏炎症减少、抗氧化应激或肝脏抗纤维化反应的药物。
9.根据权利要求1至8中任一项的方法，其中所述肥胖相关疾病是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或糖尿病。
10.一种包含穿透素-4抑制剂的药物组合物，其用于治疗肥胖相关疾病。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述穿透素-4抑制剂是特异性抑制穿透素-4基因的表达的RNAi介导物。
12.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述穿透素-4抑制剂是表达RNAi介导物的载体，所述RNAi介导物特异性抑制穿透素-4基因的表达。
13.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述穿透素-4抑制剂是特异性结合穿透素-4蛋白的抗体。
14.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述穿透素-4抑制剂是识别SEQ ID NO 4所示氨基酸序列的肽的抗体。
15.根据权利要求13或14所述的药物组合物，其中所述抗体是单克隆抗体。
16.根据权利要求10至15中任一项所述的药物组合物，其用于由脂解增强引起的肥胖改善、胰岛素抵抗的改善、由米色脂肪生成引起的抗肥胖、肝脏脂肪积累减少、肝脏炎症减少、抗氧化应激或肝脏抗纤维化反应。
17.根据权利要求10-16中任一项所述的药物组合物，其中所述肥胖相关疾病是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或糖尿病。
18.一种用于治疗的穿透素-4抑制剂。
19.一种用于治疗肥胖相关疾病的穿透素-4抑制剂。
20.穿透素-4抑制剂在制备用于治疗肥胖相关疾病的药物中的用途。
21.一种治疗肥胖相关疾病的方法，包括给有需要的对象施用治疗有效剂量的穿透素-4。
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