KR101649175B1 - 신규 ｓａｍｄｏｒｉ２ 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 chemokine-like Samdori2(Sam2)를 유효성분으로 함유하는 뇌신경계 관련 정신질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 고삐핵에서 발현하는 Sam2 특이적인 녹아웃 제브라피쉬를 제작하였으며, 노벨탱크(novel tank), socototaxis 및 social cohesion 테스트를 통하여 상기 제브라피쉬가 대조군에 비해 상당히 높은 공포 및 불안행동을 나타내는 것을 확인하였으며, Sam2 유전자를 과발현한 신경세포에서 억제성 신경 발현이 약화 되는 것을 확인하였으며, Sam2 유전자 손실로 인한 환자에서 자폐증 및 과불안증상을 나타내는 것을 확인함으로써, 상기 Samdori2를 유효성분으로 함유하는 뇌신경계 관련 정신질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규 ＳＡＭＤＯＲＩ２ 유전자 및 이의 용도{Novel Samdori2 gene and using thereof}
본 발명은 신규 Samdori2(Sam2) 유전자, 상기 유전자를 포함하는 정신질환의 진단, 예방 또는 치료용 조성물, 및 상기 유전자를 이용한 정신질환의 진단, 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
전 세계 인구의 네 명 중 한 명은 일평생 경과 중 정신질환이나 신경학적 질환을 지니는 것으로 알려져 있으며, 우리나라 국민의 정신질환 평생 유병률은 31.4%, 1년간 유병률은 19.3%에 달한다고 보고되고 있다. 모든 연령층에서는 3가지 정신 질환이, 15세에서 44세 사이에는 6가지 정신질환을 지니는 것으로 보고 되었다(WHO, 2001). 우울증은 전체 질병 부담의 네 번째 주원인이며, 2020년에는 허혈성 심장질환 다음으로 두 번째 원인이 되리라고 추정되고 있다.
정신질환의 치료기술은 지난 수십 년간 비약적으로 발전해왔지만, 아직 인류 정신질환의 고통으로부터 벗어나지 못하고 있다. 대표적인 예로, 주요 정신질환인 정신분열병과 우울증의 경우 1/3 이상의 환자들은 현재의 치료에도 호전되지 않는 중한 증상을 지속적으로 지니고 있다. 증상이 호전된 나머지 경우에도 상당 비율의 환자들은 잔류증상과 기능장해로 인한 삶의 질이 저하되고 사회경제적 부담요인으로 남게 되며, 특히 정신분열병의 경우 현재의 일차치료인 약물요법은 양성증상에는 효과적이나 음성 증상이나 인지기능 개선에는 효과가 부족하여 개선된 효능의 치료제 개발이 시급한 실정이다.
우울증, 즉 우울 장애는 의욕 저하와 우울감을 주요 증상으로 하여 다양한 인지 및 정신 신체적 증상을 일으켜 일상 기능의 저하를 가져오는 질환을 의미한다. 우울 장애는 평생 유병율이 15%, 특히 여자에게서는 25% 정도에 이르며, 감정, 생각, 신체 상태, 그리고 행동 등에 변화를 일으키는 심각한 질환이다. 주요우울증은 한 가지의 원인으로 발생하지 않는다. 오히려 다양한 종류의 유전자의 상호작용, 후성학적인 영향, 발생학적 원인, 그리고 환경적 영향 등이 복합적으로 감정을 손상시켜서 정서 장애를 일으키게 된다.
또한, 불안(anxiety)이란, 광범위하게 매우 불쾌한, 그리고 막연히 불안한 느낌으로써, 가슴 두근거림, 진땀 등의 신체 증상과 과민성, 서성댐 등의 행동증상을 동반하는 것으로 우울증 또는 불안증으로 병원에서 전문적인 정신과 상담치료를 받는 환자는 해마다 늘어나고 있으며, 2002년에는 항불안제의 매출도 약 200% 정도 늘어났다. 이처럼 우울증 또는 불안증은 현대인의 정신질환 중 대부분을 차지한다고 해도 과언이 아니며, 많은 사람들이 이로 인해 고통을 받고 있다(Robert. F.Scmidt. Human physiology, p366 ; 민성길. 최신 정신 의학, pp238-240 ; S. V., Pharmacol. Ther ., 88, pp213-227, 2000). 불안이 있을 때는 뇌전체가 각성(arousal) 상태에 들어가서 말초의 행동, 자율신경계, 감각, 지각 등에 장애가 나타난다. 이에 관계된 기관은 대뇌 변연계(특히 해마와 대상회), 대뇌 피질(전두엽, 측두엽), 시상하부, 상행망상체, 뇌하수체 등의 뇌와 갑상선과 부신 피질 등의 말초 기관이 있다. 최근 뇌 영상 연구에 의하면 불안은 오른쪽 반구의 장애와 관련되며 기타 전두엽, 측두엽, 후두엽 장애와 관련되어 있다고 알려져 있다(Robert. F. Scmidt. Human physiology, p366 ; 민성길. 최신 정신 의학, pp238-240).
현대적인 항우울제의 개발은 결핵약으로 개발된 이프로니아지드(iproniazid)가 단가아민효소 억제제(monoamine oxidase inhibitors: MAOIs)로서 항우울효과가 있다는 것이 입증된 이후부터 활발해 졌다. 항정신병약물인 클로르프로마진(chlorpromazine)이 1950초 항히스타민제로 개발되고 정신분열병 치료에 효과가 있음이 증명되고, 이와 유사하게 1955년 스위스의 Geigy Drug Co.에서 항히스타민제로 개발된 이미프라민(imipramine)을 합성되면서부터 활성화되었다. 이 발견을 통하여 삼환계 항우울제(tricyclic antidepressants; TCA)의 발전을 가져왔고, 삼환 구조를 변형한 아미트리프탈린(amitriptyline)이나 데시프라민(desipramine) 외에 노어트립털린(nortriptyline), 독세핀(doxepin), 클로미프라민(clomipramine) 등의 많은 부가적인 TCA들이 사용되기 시작하였다. 이후 2세대와 3세대 항우울제가 개발되었는데, 1980년대 초 구조 및 효능이 비슷한 마프로틸린(maprotiline)과 아목사핀(amoxapine) 같은 사환계 합성물(tetracyclic compounds)이 판매되었고, 헤트로사이클릭(heterocyclics)이라 불리기도 한다. 1980년대 선택적 세로토닌 재흡수 억제제(selective serotonin reuptake inhibitors; SSRIs)인 prozac 이 개발되어 좋은 치료제로 사용되고 있으나, 그 부작용으로 항콜린작용인 구갈, 변비, 배뇨곤란, 시력장애, 발기 부전 등이 나타나고, 심혈관계에 대한 작용으로 혈압, 맥박, 심장전도(cardiac conduction) 등에 상당한 영향을 미치며, 1-아드레날린(1-adrenergic) 수용체의 차단으로 인한 기립성 저혈압이 나타나고, 항히스타민 효과로 진정작용이 나타나고 있는것으로 보고되고 있다. 현재 사용되는 항우울증 치료제로서, 선택적인 세로토닌 재흡수 차단제, 세로토닌 노어에피네프린 재흡수 차단제, 선택적 노어에피네프린 재흡수 차단제, 도파민과 노어에피네프린 재흡수 차단제(DNRI), 노어에피네프린과 세로토닌 수용체 길항제(NaSSA), 세로토닌수용체 길항과 세로토닌 재흡수 차단제(SARI), 선택적 세로토닌 재흡수 촉진제(SSRE) 등이 있다.
이러한 현재 치료에 사용되고 있는 항우울증 치료제는 낮은 관해율 (remisssion rate)을 보이고 있어, 현재의 약물로는 충분한 치료효과를 얻을 수 없을 뿐 아니라, 이로 인하여 향후 항우울제 시장이 축소될 것이 전망되고 있다. 이의 극복을 위해서는 현재의 낮은 관해율을 극복하는 새로운 개념의 치료제 개발이 필요하다. 현재 치료에 사용되고 있는 항우울제는 성기능 장애와 체중 증가 등과 같은 대표적인 부작용들이 있는데, 이러한 부작용을 극복하는 새로운 항우울제의 개발은 새로운 시장을 열 수 있을 것으로 전망된다. 현재 치료에 사용되고 있는 항우울제의 또 다른 큰 문제점 중의 하나는 약물 투여 후 약효가 나타날 때까지 수
주 또는 수개월의 지연시간(lag-time)을 가지고 있는 것이다.
공포, 불안과 같은 감정반응 의사 결정 및 생존에 있어 중요한 요소로 작용한다. 고삐핵(habenula)은 전뇌 상부에 위치하며 진화상 높은 상동성을 유지하고 있는 뇌의 영역이다. 이 뇌 부분은 스트레스, 불안, 공포에 대한 행동반응을 조절한다고 알려져 있으며 특히 인간에서는 고삐핵의 기능손실이 우을증, 외상성스트레스장애, 및 정신분열 등과 관련이 있다고 알려져 있다(Hikosaka, Nat . Rev . Neurosci, 11, p 503-513, 2010; Amo, R. et al, J. Neurosci, 30, 1566-1574, 2010). 또한, 최근 제브라피쉬 및 마우스에서 고삐핵 조직의 제거 실험을 통해 고삐핵이 공포와 불안반응을 조적함을 확인하였다. 하지만 감정조절에 있어, 고삐핵의 분자적 기작에 대한 연구 및 이해는 미미한 상황이다.
이에, 본 발명자들은 불안증 및 우울증과 같은 정신질환의 예방 및 치료에 있어서 종래 기술상의 문제점을 인식하고 새로운 신경조절물질을 개발하고자 노력한 결과, 고삐핵에서 발현하는 신규한 chemokine-like Samdori2(Sam2) 단백질을 규명하고 상기 Sam2의 기능을 규명하고자, ZFN(zinc finger nuclease)유전자가위기술을 이용하여 제작한 Sam2 특이적인 녹아웃 제브라피쉬를 노벨 탱크(novel tank), socototaxis 및 social cohesion 테스트에 사용하여 대조군에 비해 상당히 높은 불안행동을 나타내는 것을 확인하였고, Sam2 유전자를 과발현한 신경세포에서 억제성 신경 발현이 약화 되는 것을 확인하였으며, Sam2 유전자 손실로 인한 환자에서 자폐증 및 과불안증상을 나타내는 것을 확인함으로써, 상기 Samdori2를 정신질환 특히 우울증 및 자폐증 등의 예방 및 치료용 약학적 조성물개발에 사용될 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 신규 Samdori2 유전자, 상기 유전자를 포함하는 정신질환의 진단, 예방 또는 치료용 조성물, 및 상기 유전자를 이용한 정신질환의 진단, 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 Samdori2(Sam2) 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는Samdori2 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 Samdori2 유전자를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 형질전환시킨 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) Samdori2 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계; 및
2) 상기 발현벡터를 숙주세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는, Samdori2가 발현되는 재조합 형질전환체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 Samdori2 유전자에 의해 암호화되는 Samdori2 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 Samdori2 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 Samdori2 유전자를 포함하는 발현벡터 또는 Samdori2 단백질을 함유하는 정신질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 Samdori2 유전자를 포함하는 발현벡터 또는 Samdori2 단백질을 함유하는 정신질환 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 Samdori2 유전자에 대한 안티센스뉴클레오티드, 프라이머 세트 또는 프로브, 또는 Samdori2 유전자에 의해 암호화되는 Samdori2 단백질에 대한 항체 또는 앱타머를 포함하는 정신질환 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 피검체 유래 고삐핵(havenula nuclear)에서 분리된 세포를 준비하는 단계;
2) 본 발명에 따른 단계 1)의 세포에서 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 Samdori2 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
3) 본 발명에 따른 단계 2)의 Samdori2 유전자가 결실되거나 정상 대조군에 비해 낮은 경우, 정신질환에 걸리거나 위험도가 증가한 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 정신질환 모니터링 또는 진단의 정보를 제공하기 위한 Samdori2 유전자 발현 수준 측정 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 Samdori2 유전자를 발현하는 세포, 또는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 Samdori2 단백질에 피검체를 처리하는 단계;
2) 본 발명에 따른 단계 1)의 Samdori2 유전자 또는 Samdori2 단백질의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및
3) 본 발명에 따른 2)의 Samdori2 유전자 또는 Samdori2 단백질의 발현 또는 활성을 증가시키는 피검시료를 선별하는 단계를 포함하는, 정신질환 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 인간을 제외한 동물의 고삐핵(havenula nuclear)에서 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 Samdori2 유전자가 녹아웃(Knock out)된 정신질환 모델 동물을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 Samdori2 유전자에 특이적인 유전자가위를 발현하는 벡터를 인간을 제외한 동물의 수정란에 미세 주입하는 단계;
2) 본 발명에 따른 단계 1)의 동물을 성체까지 키운 다음, 야생형(wild type) 동물과 교배시키는 단계; 및,
3) 본 발명에 따른 단계 2)의 교배된 동물 중 Samdori2 유전자 녹아웃된 동물을 선별하는 단계를 포함하는 정신질환 모델 동물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 신규한 chemokine-like Samdori2(Sam2) 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 고삐핵에서 발현하는 신규한 Sam2 특이적인 녹아웃 제브라피쉬를 제작하였으며, 노벨탱크(novel tank), socototaxis 및 social cohesion 테스트를 통하여 상기 제브라피쉬는 대조군에 비해 상당히 높은 공포 및 불안행동을 나타내는 것을 확인하였고, Sam2 유전자를 과발현한 신경세포에서 억제성 신경 발현이 약화 되는 것을 확인하였으며, Sam2 유전자 손실로 인한 환자에서 자폐증 및 과불안증상을 나타내는 것을 확인함으로써, 상기 Samdori2를 고삐핵(habenula) 관련 정신질환 특히 우울증 및 자폐증 등의 예방 및 치료용 약학적 조성물 개발에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 척추동물간 보존된 SAM 유전자 아미노산 서열을 나타낸 도이다.
도 2는 제브라피쉬와 인간 SAM 유전자군(gene family)의 염색체상 유전자 구성의 상동성 비교를 나타낸 도이다.
도 3은 제브라피쉬에서 SAM 유전자군(gene family)이 중추신경계에서 특이적으로 발현되는 양상을 나타낸 도이다:
도 3 a-h': 수정 후 3일째 제브라피쉬 뇌에서 samdori 유전자군 발현패턴 확인; 및
도 3 i-j': 수정 후 24시간째 제브라피쉬 척수에서 SAM3a 및 SAM3b 유전자 발현 확인.
도 4는 마커를 사요하여 Sam2 유전자 발현세포의 발현양상을 확인한 도이다.
도 5는 mind bomb(mid)에서 SAM 유전자군의 발현양상을 확인한 도이다.
도 6a 및 도 6b는 Sam2 유전자는 SAM 유전자들 중 초기발생부터 성체시기까지 지속적으로 고삐핵에서 발현하는 것을 나타낸 도이다;
도 6c, 도 6d, 도 6e 및 도 6f는 Et (-1 otpa : mmGFP )hd1으로 형질전환된 Sam2 녹아웃 제브라피쉬에서 원심성축색돌기(efferent axon) 발생을 관찰한 도이다.
도 7은 유전자가위기술인 ZFN을 사용하여 Sam2 유전자 녹아웃 피쉬 제작을 나타낸 도이다:
도 7a는 5개 (Sam2 cnu1 ) 및 17개 (Sam2 cnu2 )의 염기가 소실된 두 가지 대립형질의 돌연변이 획득을 나타낸 도이다;
도 7b-b'는 돌연변이 특이적 제한효소(Sam2 cnu1 ) 및 PCR(Sam2 cnu2 )을 사용한 두 가지 형태의 대립형질의 유전자형 구분을 나타낸 도이다;
도 7c는 인간, 마우스 및 두가지 형태 제브라피쉬 돌연변이의 아미노산 형태 비교를 나타낸 도이다; 및
도 7d-d'는 수정 후 3일째의 대조군과 Sam2 돌연변이의 정상적인 발생배 모습을 나타낸 도이다.
도 8은 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬에서 Sam2 유전자손실이 특정 신경세포발생에 미치는 영향을 나타낸 도이다:
도 8 a-a' 및 도 8 b-b'는 대조군과 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬간의 도파민 신경 마커 발현 양상 비교를 나타낸 도이다;
도 8 c-c', 도 8 f-f' 및 도 8 l-l'는 대조군과 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬간의 세로토닌 신경 마커 발현 양상 비교를 나타낸 도이다;
도 8 d-d'는 대조군과 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬간의 옥시토신 신경 마커 발현 양상 비교를 나타낸 도이다;
도 8 e-e'는 대조군과 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬간의 대뇌각간핵 발현 양상 비교를 나타낸 도이다;
도 8 g-g', 도 8 h-h', 도 8 i-i' 및 도 8 j-j'는 대조군과 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬간의 다양한 신경마커들의 발현 양상 비교를 나타낸 도이다; 및
도 8 m-n'은 시하상부에서 LC가지 축색돌기가 연결된 형질전환체 (Tg[hcrt:EGFP])를 사용한 대조군과 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬간의 신경회를 관찰한 도이다.
도 9는 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬 및 대조군을 사용하여 노벨 탱크(novel tank) 테스트 결과를 나타낸 도이다:
도 9 a는 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬 및 대조군 단일개체의 이동거리를 나타낸 도이다;
도 9 b는 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬 및 대조군의 평균속도를 나타낸 도이다;
도 9 c는 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬 및 대조군의 비정상적인 행동을 나타낸 도이다; 및
도 9 d는 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬 및 대조군의 움직이지 않는(freezing bouts) 현상을 나타낸 도이다.
도 10은 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬를 사용하여 오픈 탱크(open tank) 및 흑/백 선호 테스트(scototaxis test)를 통한 불안 증가를 확인한 도이다:
도 10 a는 대조군과 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬의 thigmotaxis를 측정하고자 open tank에 30분 동안 넣어두고 모서리(corner) 및 중앙(center)에 머무는 시간을 1분 간격으로 측정 후 비교분석을 나타낸 도이다; 및
도 10 b 및 도 10 c는 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬를 사용하여 흑/백 선호 테스트(scototaxis test) 및 대조군과 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬가 백색 부분에서의 움직임을 추적하고 머무는 시간을 비교 분석을 나타낸 도이다.
도 11은 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬의 행동학적 지표 관찰을 통한 공포 및 불안측정을 나타낸 도이다.
도 12는 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬의 사회적 응집성(socialcohesion) 관찰을 통한 단체행동에서의 불안반응 측정을 나타낸 도이다.
도 13은 분자 마커를 사용하여 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬의 불안반응 현상을 나타낸 도이다.
도 14는 랫트 해마(rat hippocampal) 신경세포배양을 통해 인간 Sam2 유전자가 흥분성 및 억제 시냅스에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 15는 Sam2 유전자 과발현을 통한 흥분성 신경 분자 마커의 발현을 확인한 도이다.
도 16은 인간에서 미세결실(microdeletion)에 의한 Sam2 유전자 손실로 인한 자폐증 및 과불안 증상을 확인한 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 Samdori2(Sam2) 유전자를 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 고삐핵(habenula nuclear)에서 Samdori2 유전자 발현 확인을 하기 위하여, 야생형(wild type), mind bomb 돌연변이 및 Et(-1otpa::mmGFP)hd1 형질 전환 제브라피쉬로부터 Samdori2 유전자를 분리하기 위해 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)을 이용하여 수행하였다. 상기 제브라피쉬로부터 분리된 유전자와 인간의 게놈상 진화적 연관성을 확인하기 위하여 Synteny database(http://teleost.cs.uoregon.edu/acos/synteny_db/), NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), Ensembl(http://asia.ensembl.org/), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk/) 데이터베이스를 사용하여 염색체상 유사성을 비교한 결과, 제브라피쉬의 Sam 유전자군(gene family)에서 8개의 유전자를 확인하였으며, 아미노산서열의 종간 높은 상동성이 보이는 것을 확인하였다(도 1 참조 및 도 2 참조).
또한, Sam 유전자군(gene family)은 10개의 규칙적인 시스테인(cysteine) 구조인 CX7CCX13CXCX14CX11CX4CX5CX10C 서열로 구성되며 이러한 서열은 CC-type의 chemokine과 유사한 형태를 보이는 것을 확인하였다. 상기 분리된 Sam2 유전자의 시간적 및 공간적 발현양상을 확인하기 위하여, 홀-마운트 정위치 교잡법(Whole-mount in situ hybridization)을 수행하여 확인한 결과, 모든 Sam 유전자들이 중추신경계에서만 발현하는 것을 확인하였으며(도 3 참조 및 도 4 참조), 발생초기 신경세포가 급격하게 증가하는 mind bomb 돌연변이(mib ta52b )11 에서 Sam 유전자 발현세포들이 증가함을 통해 Sam 유전자들이 발현하는 세포가 신경세포인 것을 확인하였다(도 5 참조).
또한, Sam 유전자들 중 Sam2는 초기발생부터 성체시기까지 지속적으로 고삐핵에서 발현하는 것을 확인하였다(도 4(c-g) 참조 및 도 6(a-b) 참조).
또한, 고삐핵의 발생 및 기능조절에 있어 Sam2 유전자의 역활을 확인하기 위하여, Sam2 유전자 녹아웃(knock out, KO) 제브라피쉬를 제작한 결과, 5개 (Sam2 cnu1 ) 및 17개 (Sam2 cnu2 ) 의 염기가 각각 손실되어 Sam2의 아미노산이 만들어지지 않는 두 가지 형태의 돌연변이를 획득하였으며, Sam2 녹아웃 제브라피쉬는 생존, 번식 및 형태적 결함을 보이지 않는 것을 확인하였다(도 7 참조).
또한, 도파민신경 마커인 tyrosine hydroxylase ( th ), dopamine transporter(dat), nuclear receptor related 1 protein (nurr -1), 세로토닌신경 마커(tryptophan hydroxylase Raphe ( tphR ), 5-hydroxytryptophan(5-HT), 옥시토신신경 마커(oxytosin ( oxt )) 및 대뇌각간핵 마커인 somatostatin1 . 1(sst1.1)를 사용하여 Sam2 유전자 손실이 특정 신경세포발생에 미치는 영향을 확인하기 위하여, Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬와 대조군에서 Sam2 유전자 손실에 대해 비교한 결과, Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬에서 Sam2 유전자 손실이 대조군과 차이가 나지 않는 것을 확인하였다(도 8 참조).
또한, 다양한 분자마커를 사용하여 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬의 신경호르몬 관련 유전자의 발현양상 확인하기 위하여, Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬와 대조군에서 신경호르몬 관련 유전자의 발현양상을 비교한 결과, Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬에서 신경호르몬 관련 유전자의 발현양상이 대조군과 비슷한 것을 확인하였다(도 8(g-l') 참조).
또한, Tg ( hcrt : mEGFP)으로 형질전환된 Sam2 돌연변이 수정란을 사용하여 시상하부 청반 돌기(hypothalamus locus coeruleus projection)를 관찰한 결과, Tg ( hcrt : mEGFP)으로 형질전환된 Sam2 돌연변이 수정란을 사용하여 시상하부 청반 돌기(hypothalamus locus coeruleus projection)가 정상인 것을 확인하였다(도 8(m-n') 참조).
또한, Et(-1otpa:mmGFP)hd1으로 형질전환된 Sam2 녹아웃 제브라피쉬에서 원심성축색돌기(efferent axon) 발생을 관찰한 결과, Et (-1 otpa : mmGFP )hd1으로 형질전환된 Sam2 녹아웃 제브라피쉬에서 고삐핵에서 대뇌각간핵까지 뻗어나가는 원심성축색돌기(efferent axon)의 발생이 정상적으로 나타나는 것을 확인하였다(도 6(c-f) 참조). 따라서, 신경세포의 발생, 이동 및 축색돌기 성장에 있어 Sam2 유전자가 직접적으로 관여하지 않는 것을 확인하였다.
또한, 제브라피쉬에서 Sam2 유전자 손실이 공포 및 불안관련에 미치는 영향을 확인하기 위하여, Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬를 노벨 탱크(novel tank)에 넣어 새로운 장소에 대한 적응능력을 확인한 결과, Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬 단일개체의 이동거리(도 9a 참조) 및 평균속도(도 9b 참조)의 운동능력(locomotor activity)이 대조군과 비교하였을 때 큰 차이는 확인 되지 않았지만 탱크 바닥으로 머리를 박는것과 같은 비정상적인 행동(도 9c 참조) 및 움직이지 않는 행동(freezing bouts)(도 9d 참조)등 불안관련 실험은 대조군에 비해 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬에서 상당히 증가하는 것을 확인하였다.
또한, thigmotaxis 실험 결과, Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬는 중앙(center)보다 모서리(corner)를 선호하는 것을 확인하였고(도 10 참조), 이러한 결과를 통해 대조군에 비해 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬의 불안증상이 더 높게 관찰됨을 확인하였다. 아울러, socototaxis 실험 결과 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬가 대조군에 비해 불안정도가 심화됨을 확인하였다(도 9 참조 및 도 10 참조).
또한, 제브라피쉬에서 Sam2 유전자 손실이 공포 및 불안관련에 미치는 영향을 확인하기 위하여, Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬를 사용하여 사회적 행동(social behavior)을 통해 척추동물의 공포 및 불안현상을 분석한 결과, 적응 전 시기에는 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬 및 대조군 모두 불안한 반응을 보였지만 적응 후, 대조군은 환경에 적응하여 자유 유영성(free swimming) 현상이 관찰되었지만 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬는 환경에 적응하지 못하고 지속적인 불안반응을 나타내는 것을 확인하였다(도 11 참조).
또한, Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬의 사회적 응집성(social cohesion) 관찰을 통한 단체행동에서의 불안반응 측정한 결과, 대조군의 경우, 적응 전보다 적응 후의 그룹 내 물고기 서로 간의 거리(inter-individual gap)가 증가한 것에 비해 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬의 물고기 서로간의 거리가 변하지 않는 것을 확인하였다(도 11 참조 및 도 12 참조).
또한, Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬에서 확인된 불안반응현상이 신경전달물질인 세로토닌 시스템 혹은 스트레스 관련 반응에 의해 나타나는 현상인지 확인 하기 위하여 각각의 분자 마커를 사용하여 분석한 결과, 대조군과 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬에서 불안반응현상 차이점을 관찰할 수 없었다(도 13 참조). 따라서, 공포, 불안 및 그룹 내 행동 조절 있어 Sam2 유전자가 관여하는 것을 확인하였다. 고삐핵에 의한 행동조절에 Sam2 유전자가 신경물질로써 미치는 영향을 확인하기 위하여, 랫트 해마(rat hippocampal) 신경세포배양을 통해 인간 Sam2 유전자가 흥분성 및 억제 시냅스에 미치는 영향을 면역염색법을 수행하였으며, Sam2 유전자의 과발현 후 억제성 시냅스 마커인 vesicular GABA transporter(vGAT), gephyrin, 및 GABAA receptor a2 subunit(GABAAR a2)를 사용하여 확인한 결과, 억제성 시냅스의 수와 발현 정도가 대조군에 비해 현저히 감소되는 것을 확인하였다.
또한, Sam2 유전자를 과발현하였을 때, miniature inhibitory postsynaptic current(mIPSC)의 amplitude와 frequency도 현저히 감소하는 것을 확인하였다. 특히 Sam2 유전자에 의한 억제성 시냅스의 영향은 Sam2를 처리한 신경뿐만 아니라 주변에 존재하는 신경세포에도 같은 영향을 미치는 것을 확인하였으며, 이를 통해 Sam2 유전자가 분비 단백질임을 확인하였다(도 14 참조).
또한, Sam2 유전자 과발현을 통한 흥분성 신경 분자 마커의 발현을 확인하기 위하여 면역염색법을 수행한 결과, Sam2 유전자가 신경조절물질로 작용하여 전시냅스(presynapse) 억제성 기능 약화 및 흥분성 신경 시냅스 강화와 같은 신경계 활성을 증가시키는 것을 확인하였다(도 15 참조).
아울러, 인간에서 Sam2 유전자 손실로 인한 자폐증 및 과불안 증상 확인을 하기 위하여 환자를 모집하였으며, 상기 모집된 환자를 대상으로 microdeletion에 의한 Sam2 유전자 손실로 인한 자폐증 및 과불안 증상을 확인한 결과, 인간에서 microdeletion에 의한 Sam2 유전자 소실로 자폐증(autism)과 과불안증상(excessive fear)을 보이는 환자를 확인함으로써, 인간에서도 Sam2 유전자가 불안반응을 조절할 수 있는 중요한 인자임을 확인하였다(도 16 참조).
따라서, 본 발명의 신규한 Sam2 유전자는 Sam2 유전자 특이적인 녹아웃 제브라피쉬를 사용하여 노벨탱크(novel tank), socototaxis 및 social cohesion 테스트를 수행하였으며, 상기 제브라피쉬는 대조군에 비해 상당히 높은 공포 및 불안행동을 나타내는 것을 확인하였고, Sam2 유전자를 과발현한 신경세포에서 억제성 신경 발현이 약화 되는 것을 확인하였으며, Sam2 유전자 손실로 인한 환자에서 자폐증 및 과불안증상을 나타내는 것을 확인함으로써, 상기 신규한 Samdori2 유전자를 관련 정신질환 특히 우울증 및 자폐증 등의 예방 및 치료용 약학적 조성물 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 Samdori2 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
상기 Samdori2 유전자는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 신규한 Sam2 유전자는 Sam2 유전자 특이적인 녹아웃 제브라피쉬를 사용하여 노벨탱크(novel tank), socototaxis 및 social cohesion 테스트를 수행하였으며, 상기 제브라피쉬는 대조군에 비해 상당히 높은 공포 및 불안행동을 나타내는 것을 확인하였고, Sam2 유전자를 과발현한 신경세포에서 억제성 신경 발현이 약화 되는 것을 확인하였으며, Sam2 유전자 손실로 인한 환자에서 자폐증 및 과불안증상을 나타내는 것을 확인함으로써, 상기 신규한 Samdori2 유전자를 포함하는 발현 벡터로서 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 발현벡터를 숙주세포에 형질전환시킨 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) Samdori2 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계; 및
2) 본 발명에 따른 단계 1)의 발현벡터를 숙주세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는, Samdori2가 발현되는 재조합 형질전환체의 제조방법을 제공한다.
상기 단계 1)의 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 신규한 Sam2 유전자는 Sam2 유전자 특이적인 녹아웃 제브라피쉬를 사용하여 노벨탱크(novel tank), socototaxis 및 social cohesion 테스트를 수행하였으며, 상기 제브라피쉬는 대조군에 비해 상당히 높은 공포 및 불안행동을 나타내는 것을 확인하였고, Sam2 유전자를 과발현한 신경세포에서 억제성 신경 발현이 약화 되는 것을 확인하였으며, Sam2 유전자 손실로 인한 환자에서 자폐증 및 과불안증상을 나타내는 것을 확인함으로써, 상기 신규한 Samdori2 유전자를 포함하는 발현 벡터로를 숙주세포에 형질전환시킨 형질전화체로서 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 Samdori2 유전자에 의해 암호화되는 Samdori2 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 Samdori2 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 Samdori2 유전자를 포함하는 발현벡터 또는 Samdori2 단백질을 함유하는 정신질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 정신질환은 불안증, 우울중, 자폐증, 조울증, 정신분열증, 기분장애, 수면장애 및 주의력결핍과다행동장애(ADHD)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 신규한 Sam2 유전자는 Sam2 유전자 특이적인 녹아웃 제브라피쉬를 사용하여 노벨탱크(novel tank), socototaxis 및 social cohesion 테스트를 수행하였으며, 상기 제브라피쉬는 대조군에 비해 상당히 높은 공포 및 불안행동을 나타내는 것을 확인하였고, Sam2 유전자를 과발현한 신경세포에서 억제성 신경 발현이 약화 되는 것을 확인하였으며, Sam2 유전자 손실로 인한 환자에서 자폐증 및 과불안증상을 나타내는 것을 확인함으로써, 상기 신규한 Samdori2 유전자를 관련 정신질환 특히 우울증 및 자폐증 등의 예방 및 치료용 약학적 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 Sam2 유전자를 함유하는 조성물은 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
즉, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 담배풀 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 화합물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.1 mg 내지 100 mg, 바람직하게는 0.5 mg 내지 10 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 Samdori2 유전자를 포함하는 발현벡터 또는 Samdori2 단백질을 함유하는 정신질환 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.
상기 정신질환은 불안증, 우울중, 자폐증, 조울증, 정신분열증, 기분장애, 수면장애 및 주의력결핍과다행동장애(ADHD)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 신규한 Sam2 유전자는 Sam2 유전자 특이적인 녹아웃 제브라피쉬를 사용하여 노벨탱크(novel tank), socototaxis 및 social cohesion 테스트를 수행하였으며, 상기 제브라피쉬는 대조군에 비해 상당히 높은 공포 및 불안행동을 나타내는 것을 확인하였고, Sam2 유전자를 과발현한 신경세포에서 억제성 신경 발현이 약화 되는 것을 확인하였으며, Sam2 유전자 손실로 인한 환자에서 자폐증 및 과불안증상을 나타내는 것을 확인함으로써, 상기 신규한 Samdori2 유전자를 관련 정신질환 특히 우울증 및 자폐증 등의 예방 및 개선용 건강식품으로 유용하게 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 과자류, 빵류, 면류 등과 같은 각종 식품류, 물, 청량음료, 과실음료 등의 드링크류, 껌, 차, 비타민 복합제, 조미료류, 건강기능 식품류 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 Samdori2 유전자는 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 5 중량%로 가할 수 있으며 건강음료 조성물에는 100 을 기준으로 0.01 내지 5.0 g, 바람직하게는 0.01 내지 1.0 g의 비율로 첨가할 수 있다. 그러나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어, 말토스, 수크로즈 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어, 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리스리톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마킨, 스테비아 추출물 등), 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탄 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 당 일반적으로 약 0.1 내지 2.0 g, 바람직하게는 약 0.1 내지 1.0 g이다.
본 발명의 건강기능식품은 기재로 되는 식품의 제조공정 중에 상술한 본 발명의 추출물 또는 화합물을 첨가하는 공정을 가함으로써 또는 기재로 되는 식품의 제조 후에 상술한 본 발명의 추출물 또는 화합물을 첨가하는 공정을 가함으로써 용이하게 얻을 수 있다. 이때 필요에 따라 맛과 냄새 교정제를 첨가하여도 좋다.
상기 외에 본 발명의 Samdori2 유전자는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 중점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 Samdori2 유전자는 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 Samdori2 유전자는 100 중량부 당 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 Samdori2 유전자에 대한 안티센스뉴클레오티드, 프라이머 세트 또는 프로브, 또는 Samdori2 유전자에 의해 암호화되는 Samdori2 단백질에 대한 항체 또는 앱타머를 포함하는 정신질환 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 신규한 Sam2 유전자는 상기 유전자를 녹아웃 시킨 제브라피쉬를 사용하여 노벨탱크(novel tank), socototaxis 및 social cohesion 테스트를 수행하였으며, 상기 제브라피쉬는 대조군에 비해 상당히 높은 공포 및 불안행동을 나타내는 것을 확인하였고, Sam2 유전자를 과발현한 신경세포에서 억제성 신경 발현이 약화 되는 것을 확인하였으며, Sam2 유전자 손실로 인한 환자에서 자폐증 및 과불안증상을 나타내는 것을 확인함으로써, 정신질환 진단용 키트로서 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 피검체 유래 고삐핵(havenula nuclear)에서 분리된 세포를 준비하는 단계;
2) 본 발명에 따른 단계 1)의 세포에서 제 1항의 Samdori2 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
3) 본 발명에 따른 단계 2)의 Samdori2 유전자가 결실되거나 정상 대조군에 비해 낮은 경우, 정신질환에 걸리거나 위험도가 증가한 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 정신질환 모니터링 또는 진단의 정보를 제공하기 위한 Samdori2 유전자 발현 수준 측정 방법을 제공한다.
상기 단계 2)의 발현 수준은 RT-PCR, ELISA, 웨스턴블랏 및 면역조직화학법으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 신규한 Sam2 유전자는 상기 유전자를 녹아웃 시킨 제브라피쉬를 사용하여 노벨탱크(novel tank), socototaxis 및 social cohesion 테스트를 수행하였으며, 상기 제브라피쉬는 대조군에 비해 상당히 높은 공포 및 불안행동을 나타내는 것을 확인하였고, Sam2 유전자를 과발현한 신경세포에서 억제성 신경 발현이 약화 되는 것을 확인하였으며, Sam2 유전자 손실로 인한 환자에서 자폐증 및 과불안증상을 나타내는 것을 확인함으로써, 정신질환 모니터링 또는 진단의 정보를 제공하기 위한 Samdori2 유전자 발현 수준 측정 방법에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 Samdori2 유전자를 발현하는 세포, 또는 Samdori2 유전자에 의해 암호화되는 Samdori2 단백질에 피검체를 처리하는 단계;
2) 본 발명에 따른 단계 1)의 Samdori2 유전자 또는 Samdori2 단백질의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및
3) 본 발명에 따른 단계 2)의 Samdori2 유전자 또는 Samdori2 단백질의 발현 또는 활성을 증가시키는 피검시료를 선별하는 단계를 포함하는, 정신질환 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 신규한 Sam2 유전자는 상기 유전자를 녹아웃 시킨 제브라피쉬를 사용하여 노벨탱크(novel tank), socototaxis 및 social cohesion 테스트를 수행하였으며, 상기 제브라피쉬는 대조군에 비해 상당히 높은 공포 및 불안행동을 나타내는 것을 확인하였고, Sam2 유전자를 과발현한 신경세포에서 억제성 신경 발현이 약화 되는 것을 확인하였으며, Sam2 유전자 손실로 인한 환자에서 자폐증 및 과불안증상을 나타내는 것을 확인함으로써, 정신질환 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 인간을 제외한 동물의 고삐핵(havenula nuclear)에서 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 Samdori2 유전자가 녹아웃(Knock out)된 정신질환 모델 동물을 제공한다.
상기 동물은 마우스, 랫트 및 제브라피쉬인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 정신질환은 불안증, 우울중, 자폐증, 조울증, 정신분열증, 기분장애, 수면장애 및 주의력결핍과다행동장애(ADHD)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 신규한 Sam2 유전자는 상기 유전자를 녹아웃 시킨 제브라피쉬를 사용하여 노벨탱크(novel tank), socototaxis 및 social cohesion 테스트를 수행하였으며, 상기 제브라피쉬는 대조군에 비해 상당히 높은 공포 및 불안행동을 나타내는 것을 확인하였고, Sam2 유전자를 과발현한 신경세포에서 억제성 신경 발현이 약화 되는 것을 확인하였으며, Sam2 유전자 손실로 인한 환자에서 자폐증 및 과불안증상을 나타내는 것을 확인함으로써, 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 Samdori2 유전자가 녹아웃(Knock out)된 정신질환 모델 동물을 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 Samdori2 유전자에 특이적인 유전자가위를 발현하는 벡터를 인간을 제외한 동물의 수정란에 미세 주입하는 단계;
2) 본 발명에 따른 단계 1)의 동물을 성체까지 키운 다음, 야생형(wild type) 동물과 교배시키는 단계; 및,
3) 본 발명에 따른 단계 2)의 교배된 동물 중 Samdori2 유전자 녹아웃된 동물을 선별하는 단계를 포함하는 정신질환 모델 동물의 제조 방법을 제공한다.
상기 정신 질환은 불안증, 우울중, 자폐증, 조울증, 정신분열증, 기분장애, 수면장애 및 주의력결핍과다행동장애(ADHD)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 신규한 Sam2 유전자는 상기 유전자를 녹아웃 시킨 제브라피쉬를 사용하여 노벨탱크(novel tank), socototaxis 및 social cohesion 테스트를 수행하였으며, 상기 제브라피쉬는 대조군에 비해 상당히 높은 공포 및 불안행동을 나타내는 것을 확인하였고, Sam2 유전자를 과발현한 신경세포에서 억제성 신경 발현이 약화 되는 것을 확인하였으며, Sam2 유전자 손실로 인한 환자에서 자폐증 및 과불안증상을 나타내는 것을 확인함으로써, 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 Samdori2 유전자가 녹아웃(Knock out)된 정신질환 모델 동물 제조 방법을 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명은 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 제브라피쉬 ( zebrafish )의 사육 및 발생배의 준비
야생형(wild type), mind bomb 돌연변이(mibta52b) 및 Et (-1 otpa :: mmGFP )hd1 형질 전환 제브라피쉬는 수족관(서울아쿠아룸, 대전)에서 구입하였다. mind bomb(mibta52b)은 ENU 돌연변이 유발(mutagenesis)을 통해 획득한 돌연변이체로 링(RING) 도메인 부분이 M1013R 치환되어 점돌연변이(point mutation)개체로 mind bomb 이형접합체 물고기를 동족번식하여 실험에 사용하였다(Itoh, et al., 2003., 미국국립보건원 (NIH), 미국). Et (-1 otpa :: mmGFP )hd1 제브라피쉬는 새로운 enhacer trap 제브라피쉬로 독일의 Matthias Carl로부터 공급받아 사용하였다(Beretta CA. et al., 2012., Heidelberg University Mannheim, 독일). 준비한 제브라피시는 온도 28.5℃, 명암: am 9:00 ~ pm 10:00 점등 그 외 시간 소등 조건에서 사육하였다. 상기 제브라피시에서 수득된 수정란은 에그 워터(egg water, Sea Salts, 280g)를 사용하여 세척하였고 페트리 디쉬(petri dish)에서 발생시켰다. 그런 다음, 발생과정은 해부현미경을 통하여 관찰하였으며, 발생배를 시간별, 형태학적변화들에 따라 선별하여 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)/PBSw로 고정하였다.
< 실시예 2> 고삐핵에서 Sam2 유전자 발현 확인
<2-1> 제브라피쉬로부터 Samdori 유전자 분리
상기 <실시예 1>에 기재된 방법으로 사육한 야생형(wild type), mind bomb 돌연변이 및 Et(-1otpa::mmGFP)hd1 형질 전환 제브라피쉬로부터 Samdori 유전자를 분리하기 위하여, 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)을 이용하여 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1>에 기재된 방법으로 사육한 야생형(wild type)을 이용하여 mRNA를 분리하였다. 상기 분리된 2 ug mRNA로부터 RT transcript(엔지노믹스 사, 대한민국)를 이용하여 상보적 DNA를 합성하였다. 상기 상보적 DNA로부터 합성된 하기 [표 1]에 기재된 Samdori 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다(표 1). 또한, 대조군 유전자로는 GAPDH 프라이머 서열번호 9 및 서열번호 10을 사용하였다(표 1). PCR이 끝난 후, 상기 샘플을 에티듐 브로마이드(etidium bromide)가 포함된 1.0% 아가로즈 젤에 전기영동하고 UV를 조사하여 밴드를 확인하였다. 694 bp의 sam2밴드를 잘라 아가로즈로부터 DNA를 분리하였다(엘피스, 대한민국). 상기 분리된 sam2 DNA를 T-vector(프로메가, 미국)에 클로닝 한 후, 클로닝된 sam2 DNA의 유전자 분석을 하기 위하여 miniprep DNA purification system kit(인트론, 대한민국)를 사용하여 플라스미드(plasmid)를 분리 및 정제하고 자동 유전자서열 분석기(Automated DNA Sequence)로 분석하였다.
서열번호 서열
sam2, forward(서열번호7 ) 5'-ACGCCGCTGAATGAACCGATTACCGG-3'
sam2 ,reverse(서열번호8 ) 5'-GAGCGAACGCACTGCTTTACACAC-3'
beta - actin , forward(서열번호 9) 5-GAGGAGCACCCCGTCCTGCTCAC-3’
beta - actin , reverse(서열번호 10) 5-GATGGCTGGAACAGGGCCTCTGG-3’
<2-2> 염색체상 유사성 비교
인간과 제브라피쉬간의 게놈상 진화적 연관성을 확인하기 위하여, 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <2-1>에 기재된 방법으로 제브라피쉬로부터 분리된 유전자와 인간의 게놈상 진화적 연관성을 확인하기 위하여 Synteny database(http://teleost.cs.uoregon.edu/acos/synteny_db/), NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), Ensembl(http://asia.ensembl.org/),
VEGA (http://vega.sanger.ac.uk/) 데이터베이스를 사용하여 인간의 Sam2 유전자 및 제브라피쉬 Sam2의 유전자 아미노산 서열을 검색한 뒤 염색체상의 위치를 비교하여 게놈상의 진화적 연관성을 확인하였다.
그 결과, 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 제브라피쉬의 Sam 유전자군(gene family)에서 8개의 유전자를 확인하였으며, 아미노산서열의 종간 높은 상동성이 보이는 것을 확인하였다(도 1 및 도 2). 또한, Sam 유전자군(gene family)은 10개의 규칙적인 시스테인(cysteine) 구조인 CX7CCX13CXCX14CX11CX4CX5CX10C 서열로 구성되며 이러한 서열은 CC-type의 chemokine과 유사한 형태를 보이는 것을 확인하였다.
<2-3> Sam2 유전자의 시간적 및 공간적 발현양상 확인
Sam2 유전자의 시간적 및 공간적 발현양상을 확인하기 위하여, 홀-마운트 정위치 교잡법(whole-mount in situ hybridization)을 수행하여 확인하였다.
구체적으로, Sam2 유전자의 시간적 및 공간적 발현양상을 확인하기 위하여, agrp, cxcr4b, dat, hcrt,lov, mch, npy, otx5, oxt(itnp), pet-1, sst1,th, tphR, 및 Sam 유전자들을 제한효소로 절단하여 SP6, T7 또는 T3 중합효소(polymerase) (퍼멘터스, 미국)와 Digoxigenin-labelled UTP(로슈, 독일)를 사용하여 항-센스RNA 프로브(anti-sense RNA probe)를 합성하였다. 광학현미경을 통해 수정 후 단계별로 적절한 시기의 수정란을 4% 파라포름알데하이드/PBT(paraformaldehyde/PBT)에 첨가하여 4℃에서 12시간 이상 고정시켰다. 수정한 후, 20시간 이상이 지난 수정란은 핀셋으로 융막 (chorion)을 제거 한 후 꼬리가 휘지 않도록 고정시켰고, 그 이전의 수정란은 고정을 미리 한 후 융막을 제거하였다. 또한, 꼬리 싹(tail bud, 수정 후 10시간)시기부터 0.2 mM PTU(phenylthiourea)/embryonic water를 넣어 피부색소 형성(pigmentation formation)을 억제시켰다. 융막이 제거되고 고정된 수정란은 PBTw(1X phosphate buffered saline, 0.1% Tween-20)로 5분 동안 3회 수세한 후 100% 메탄올(MeOH)을 사용하여 3 내지 4번 정도 교체해 주었고, 메탄올 상태로 -20℃에서 보관하였다. 메탄올로 보관된 상기 발생배들을 75%, 50% 및 25% MeOH/PBSw로 5분씩 단계별로 세척 한 뒤 PBTw를 사용하여 5분 간격으로 5번 세척하였다. 발생단계에 따라 10 ㎍/㎖ 프로테이나아제 K(proteinase K)를 포함하는 PBTw를 상기 발생배에 처리 한 뒤 PBTw를 사용하여 3 내지 4회, 5분 간격으로 세척하였고, 4% 파라포름알데하이드/PBT로 30분 이상 상온에서 고정시켰다. 발생배가 상하지 않도록 조심하여 PBTw로 5분 간격으로 5회 세척한 뒤, 300 ㎕ HYB(50% 포름아미드, 5X SSC, 0.1 % Tween-20)를 첨가하고 68℃에서 15분 동안 방치하였다. 그런 다음, 50% HYB(50% 포름아미드, 5X SSC, 5 ㎎/㎖ 토룰라(torula) RNA, 50 ㎍/㎖ 헤파린(heparin), 구연산(Citric acid), pH6, 0.1% Tween-20)을 300 ㎕씩 첨가하고 68℃에서 1 내지 2시간 이상 prehybridization시킨 후 프로브(probe)를 30 내지 100 ng정도 첨가하여 68℃에서 12시간 동안 교배(hybridization)시켰다. 68℃를 유지한 상태에서 프로브(probe)를 제거하고 100%, 75%, 50% 및 25%의 HYB*/0.2X SSCTw를 순차적으로 15분마다 세척하였다. 상기와 동일한 온도에서 2 X SSCTw로 교체하여 20분 동안 세척하였으며, 0.2X SSCT에서 30분마다 5회 수세하여 하이브리드(hybrid)를 하지 못한 프로브(probe)를 제거하였다. 그런 다음 상온에서 75%, 50% 및 25%의 0.2X SSCT/PBTw를 사용하여 5분 간격으로 순차적으로 교체하고 PBTw로 5분마다 5회 수세 하였다. 발색 및 발현부위를 확인하기 위하여, 5% 양혈청(sheep serum)/PBTw를 300 ㎕ 첨가하여 상온에서 1시간 동안 방치하고, 프로브(probe)가 붙지 않은 곳에 혈청(serum)이 붙어 항체반응 시 발색 및 발현이 되지 않게 차단하였다. 그런 다음, 5% 양 혈청/PBTw에 1/4000배로 희석시킨 항-DIG-AP Fab(anti-DIG-AP Fab)(150 u/200 ㎕; 로슈, 독일)을 300 ㎕ 첨가하고 상온에서 4시간 또는 4℃에서 12 내지 16시간 동안 반응시켰다. PBTw로 10분간 6번, 20분간 6번, 30분간 8번 이상 세척한 다음 염색 버퍼(staining buffer)(0.1 M Tris-Cl pH 9.5, 0.1 M NaCl, 50 mM MgCl2, 0.1% Tween-20)를 사용하여 5분간 3번 세척하였다. 발색기질인 NBT/BCIP(Nitro Blue Tetrazolium/5-Bromo 4-Chloro 3- Indolyl Phosphate)의 저장액(stock)을 염색 버퍼에 각각 4.5 ㎕/㎖(저장액: 디메틸포름아미드 50 ㎎/㎖ NBT를 포함하는 디메틸포름아미드)과 3.5 ㎕/㎖(저장액: 50 ㎎/㎖ BCIP를 포함하는 디메틸포름아미드)를 첨가하여 빛을 차단한 상온에서 반응시킨 후 현미경으로 관찰하여 염색부위를 확인하였다. 염색이 끝난 수정란들은 정지 용액(stop solution)(1X PBS pH 5.5, 1mM EDTA, 0.1% Tween-20)을 이용하여 5분씩 4번 세척한 다음 100% 메탄올로 10분 동안 4 내지 5번 정도 씻어주어 탈수(dehydration) 시킨 후 -20℃에서 보관하였다. 사진 작업은 75% 글리세롤(glycerol) 또는 Benzyl Benzoate : Benzyl Alcohol(2:1) 용액에서 MZ-16 현미경(라이카, 미국)을 이용하여 수행하였다.
그 결과, 도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 모든 sam 유전자들이 중추신경계에서만 발현하는 것을 확인하였다(도 3 및 도 4).
또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, 발생초기 신경세포가 급격하게 증가하는 mind bomb 돌연변이(mib ta52b )에서 sam 유전자 발현세포들이 증가함을 통해 sam 유전자들이 발현하는 세포가 신경세포인 것을 확인하였다(도 5).
또한, 도 4(c-g) 및 도 6(a-b)에 나타낸 바와 같이, sam 유전자들 중 Sam2는 초기발생부터 성체시기까지 지속적으로 고삐핵에서 발현하는 것을 확인하였다(도 4(c-g) 및 도 6(a-b)).
< 실시예 3> Sam2 유전자 손실이 제브라피쉬의 특정 신경세포발생에 미치는 영향 확인
<3-1> Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬 제작
고삐핵의 발생 및 기능조절에 있어 Sam2의 역활을 확인하고자 유전자가위 기술인 ZFN을 사용하여 Sam2 녹아웃 제브라피쉬(KO zebrafish)를 제작하였다.
구체적으로, Sam2 특이적인 유전자가위인 ZFN(zinc-finger nuclease) 벡터를 제작하기 위하여, Sam2의 세 번째 엑손을 목표로 하여 왼쪽 ZFN(left ZFN, TGCTCCTGCTTC, 서열번호 13)과 오른쪽 ZFN(right ZFN, CAGGTGGCAGGA, 서열번호 14) 서열에 해당되는 각각의 아연 집게(Zinc finger)(왼쪽, QSSR1-mQTHR1-QSSR1-mQSNR1; 오른쪽, RDHT-DGHR-mWSNR-SADR)를 사용하여 모듈러 어셈블리(modular assembly)방법으로 조합한 뒤, 벡터를 제작하였다. 상기 제작된 벡터를 PvuII 제한 효소로 자르고 T7 RNA polymerase를 사용하여 ZFN mRNA를 합성하였다. 상기 방법으로 제작된 ZFN mRNA를 제브라피쉬제 1 세포기 수정란에 2 내지 3 ng 정도 미세주입하였다. 미세주입한 제브라피쉬(F0)를 성체까지 키워 야생형(wild type) 제브라피쉬와교배시켰다. 상기 교배된 제브라피쉬를 T7 endonuclease 1 방법을 사용하여 Sam2 유전자 녹아웃을 선별하였다. Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬는 하기 [표 2]에 기재되어 있는 프라이머를 사용하여 유전자형을 선별하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 5개 (Sam2 cnu1 ) 및 17개 (Sam2 cnu2 ) 의 염기가 각각 손실되어 Sam2의 아미노산이 만들어지지 않는 두 가지 형태의 돌연변이를 획득하였으며, Sam2 녹아웃 제브라피쉬는 생존, 번식 및 형태적 결함을 보이지 않는 것을 확인하였다(도 7).
서열 번호 서열
Sam2 cnu1 정방향(서열번호 11) 5'-TCTACTGAGGAGTGGTGTGA-3'
Sam2 cnu1 역방향(서열번호 12) 5'-GGTCAGTTTCAGAGAGCTGG-3'
left ZFN(서열번호 13) TGCTCCTGCTTC
right ZFN(서열번호 14) CAGGTGGCAGGA
<3-2> Sam2 유전자 손실이 특정 신경세포발생에 미치는 영향 확인
상기 실시예 <3-1>에 기재된 방법으로 제조된 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬를 사용하여 Sam2 유전자 손실이 특정 신경세포발생에 미치는 영향을 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 도파민신경 마커인 tyrosine hydroxylase ( th ), dopamine transporter(dat), nuclear receptor related 1 protein (nurr -1), 세로토닌신경 마커(tryptophan hydroxylase Raphe ( tphR ), 5-hydroxytryptophan(5-HT), 옥시토신신경 마커(oxytosin ( oxt )) 및 대뇌각간핵 마커인 somatostatin1 . 1(sst1.1)를 사용하여 Sam2 유전자 손실이 특정 신경세포발생에 미치는 영향을 확인하였다. 도파민신경세포에서 발현하는 th 및 dat DNA를 제한효소로 자른 후 RNA 중합효소(polymerase)를 사용하여 생체외(in vitro) 전사(transcription)를 진행하여 mRNA 프로브(probe)를 제작하였다. 상기 제작된 mRNA 프로브(probe)를 사용하여 홀-마운트 정위치 교잡법(whole-mount in situ hybridization)을 수행하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬와 대조군에서 Sam2 유전자 손실을 비교하였을 때, Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬에서 Sam2 유전자 손실이 대조군과 차이가 나지 않는 것을 확인하였다(도 8).
<3-2> Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬의 신경호르몬 관련 유전자의 발현양상 확인
상기 실시예 <3-1>에 기재된 방법으로 제조된 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬를 사용하여 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬의 신경호르몬 관련 유전자의 발현양상을 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, hypocretin/orexin ( hcrt ), melanin concentrating hormome(mch), agouti related protein homolog(agrp), neuropeptide Y(npy), 및 fev(ETS oncogene family ; pet -1)의 DNA를 제한효소로 자른 후, RNA 중합효소(polymerase)를 사용하여 생체외(in vitro) 전사(transcription)를 진행하여 mRNA 프로브(probe)를 제작하였다. 상기 제작된 mRNA 프로브(probe)를 사용하여 홀-마운트 정위치 교잡법(whole-mount in situ hybridization)을 수행하였다.
그 결과, 도 8(g-l')에 나타낸 바와 같이, Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬와 대조군에서 신경호르몬 관련 유전자의 발현양상을 비교하였을 때, Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬에서 신경호르몬 관련 유전자의 발현양상이 대조군과 비슷한 것을 확인하였다(도 8(g-l')).
<3-3> Tg ( hcrt : mEGFP )으로 형질전환된 Sam2 돌연변이 수정란을 사용하여 시상하부 청반 돌기( hypothalamus locus coeruleus projection ) 관찰
Tg ( hcrt : mEGFP)으로 형질전환된 Sam2 돌연변이 수정란을 사용하여 시상하부 청반 돌기(hypothalamus locus coeruleus projection)를 관찰하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 시상하부 청반돌기에서 형광단백질이 발현하는 형질전환체인 Tg(hcrt:mEGFP)의 F1성체 제브라피쉬와 Sam2 유전자가 손실된 동형접합체(homozygote) 성체 제브라피쉬를 교배시켰다. 그런 다음, 교배를 통해 획득한 48시간째의 발생배를 형광현미경을 이용하여 형광이 발현하는 개체를 선별한 뒤, 성체 때까지 키웠다. 형광을 발현하는 Sam2 유전자 손실 이형접합체(heterozygote) 제브라피쉬를 동종교배하여 형광을 발현하는 Sam2 유전자 손실 동형접합체 발생배를 획득하였다. Sam2 유전자가 손실된 동형접합체의 발생배를 수정한 후, 83 시간 때 형광현미경을 통해 시상하부 청반돌기를 관찰하였다.
그 결과, 도 8(m-n')에 나타낸 바와 같이, Tg ( hcrt : mEGFP)으로 형질전환된 Sam2 돌연변이 수정란을 사용하여 시상하부 청반 돌기(hypothalamus locus coeruleus projection)가 정상인 것을 확인하였다(도 8(m-n')).
<3-4> Et (-1 otpa : mmGFP )hd1 으로 형질전환된 Sam2 녹아웃 제브라피쉬에서 원심성축색돌기( efferent axon) 발생 관찰
Et (-1 otpa : mmGFP )hd1으로 형질전환된 Sam2 녹아웃 제브라피쉬에서 원심성축색돌기(efferent axon) 발생을 관찰하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 하베눌러와 연결된 신경에서 형광단백질이 발현하는 형질전환체인 Et(-1 otpa : mmGFP )hd1의 성체 제브라피쉬와 Sam2 유전자가 손실된 동형접합체(homozygote) 성체 제브라피쉬를 교배시켰다. 상기 교배를 통해 획득한 48시간째의 발생배를 형광현미경을 이용하여 형광이 발현하는 개체를 선별 한 후, 성체 때까지 키웠다. 형광을 발현하는 Sam2 유전자 손실 이형접합체(heterozygote) 제브라피쉬를 동종교배를 통해 형광을 발현하는 Sam2 유전자가 손실된 동형접합체 발생배를 획득하였다. 상기 방법을 통해 획득한 Sam2 유전자 손실 동형접합체 발생배를 수정한 후, 4.5일째 되는 날 형광현미경을 통해 하베눌라 신경을 관찰하였다.
그 결과, 도 6(c-f)에 나타낸 바와 같이, Et (-1 otpa : mmGFP )hd1으로 형질전환된 Sam2 녹아웃 제브라피쉬에서 고삐핵에서 대뇌각간핵까지 뻗어나가는 원심성축색돌기(efferent axon)의 발생이 정상적으로 나타나는 것을 확인하였다(도 6(c-f)).
따라서, 상기 실시예 <3-4>의 결과를 통해 신경세포의 발생, 이동 및 축색돌기 성장에 있어 Sam2 유전자가 직접적으로 관여하지 않는 것을 확인하였다.
< 실시예 4> 제브라피쉬에서 Sam2 유전자 손실이 공포 및 불안관련에 미치는 영향 확인
제브라피쉬에서 Sam2 유전자 손실이 공포 및 불안관련에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 <3-1>에 기재된 방법으로 제조된 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬를 오픈 탱크(open tank), 노벨 탱크(novel tank) 및 흑/백 선호도(dark/light preference, scototaxis) 테스트를 수행하여 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <3-1>에 기재된 방법으로 제조된 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬 숫컷을 사용하여 공포 반응을 확인하기 위하여 노벨 탱크(15 cm ＞15 cm ＞ 25 cm; 높이 ＞ 세로 ＞ 가로)에 10분 동안 넣어둔 뒤 비디오 촬영을 통해 행동 분석을 하였다. 흑/백 선호도(scototaxis test) 테스트를 통한 공포반응 분석을 수행하고자 흑과백의 공간으로 이루어진 상자에 제브라피쉬를 넣고 5분 동안 적응시킨 뒤 그 후, 15분 동안 비디오 촬영을 통하여 행동을 분석하였다. 상기 제브라피쉬에 대한 공포반응을 비교하기 위하여 Sam2 유전자가 손실된 이형접합체 성체 제브라피쉬를 동종교배를 시킨 뒤 획득한 자손들 중 Sam2 유전자가 손실되지 않은 이형접합체 성체 제브라피쉬를 대조군으로 사용하였다. 상기 행동 분석은 EthoVision XT7를 사용하였으며, Student's t-테스트를 통해 통계학적 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 새로운 장소에 대한 적응능력을 알아보는 노벨 탱크(novel tank) 실험결과 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬 단일개체의 이동거리 (도 9a) 및 평균속도(도 9b)의 운동능력(locomotor activity)이 대조군과 비교하였을 때 큰 차이는 확인 되지 않았지만 탱크 바닥으로 머리를 박는것과 같은 비정상적인 행동(도 9c) 및 움직이지 않는 행동(freezing bouts)(도 9d)등 불안관련 실험은 대조군에 비해 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬에서 상당히 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 도 9 및 도 10에 나타낸 바와 같이, thigmotaxis 실험 결과 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬는 중앙(center)보다 모서리(corner)를 선호하는 것을 확인하였고(도 10), 이러한 결과를 통해 대조군에 비해 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬의 불안증상이 더 높게 관찰됨을 확인하였다. 아울러, socototaxis 실험 결과 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬가 대조군에 비해 불안정도가 심화됨을 확인하였다(도 9 및 도 10).
< 실시예 5> 제브라피쉬에서 Sam2 유전자 손실이 공포 및 불안관련에 미치는 영향 확인
<5-1> Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬의 행동학적 지표 관찰을 통한 공포 및 불안 측정
상기 실시예 <3-1>에 기재된 방법으로 제조된 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬를 사용하여 사회적 행동(social behavior)을 통해 척추동물의 공포 및 불안현상을 분석하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 물고기는 포식자에 대응하는 선천적인 대응반응으로 shoaling이라는 그룹을 형성하는데 이러한 행동은 공포 및 불안을 측정하는 행동학적 지표로 사용된다고 보고되고 있다(Gerlai. R, Behav Brain Res, 2010, 207, 223-231). 따라서, Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬 단체에서 사회적 행동(social behavior)을 통해 척추동물의 공포 및 불안현상을 분석하였다. 상기 <실시예 4>에 기재된 방법으로 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬 및 대조군 각각 5마리를 노벨 탱크(novel tank)에 넣어두고 그룹 내 제브라피쉬의 동선 및 위치를 통한 불안 반응을 30분 동안 비디오 촬영을 한 후 분석하였다(도 11 및 도 12). 제브라피쉬가 새로운 환경에 적응하기 전(before habituation) 5분 내지 8분과 적응한 후(after habituation) 13분 내지 16분간의 행동을 20초 간격으로 분석하여 물고기간의 거리(individual gap) 위치는 하기 [수학식 1]을 이용하여 계산하였다. 아울러, SigmaPlot 소프트웨어를 사용하여 통계학적 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 적응 전 시기에는 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬 및 대조군 모두 불안한 반응을 나타내었으며 적응 후, 대조군은 환경에 적응하여 자유 유영성(free swimming) 현상이 관찰되었지만 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬는 환경에 적응하지 못하고 지속적인 불안반응을 나타내는 것을 확인하였다(도 11).
Figure 112014025818687-pat00001
x0, y0 및 z0는 물고기 집단에서 가운데 위치한 물고기를 가리킴; 및
xα, yα 및 zα는 떼를 지어다니는(shoaling) 물고기를 가리킴.
<5-2> Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬의 사회적 응집성 ( social cohesion ) 관찰을 통한 단체행동에서의 불안반응 측정
상기 실시예 <3-1>에 기재된 방법으로 제조된 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬를 사용하여 사회적 응집성(social cohesion) 관찰을 통한 단체행동에서의 불안반응 측정을 하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 그룹 내 물고기 서로 간의 거리(inter-individual gap)를 측정하는 social cohesion도 단체행동에서의 불안반응에 대한 지표이며, 상기 실시예 <5-1>에 기재된 방법을 통하여 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬의 불안반응현상에 대해 분석하였으며, 물고기간의 거리(individual gap) 위치는 상기 [수학식 1]을 이용하여 계산하였다. 아울러, SigmaPlot 소프트웨어를 사용하여 통계학적 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 11 및 도 12에 나타낸 바와 같이, 대조군의 경우, 적응 전보다 적응 후의 그룹 내 물고기 서로 간의 거리(inter-individual gap)가 증가한 것에 비해 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬의 물고기 서로간의 거리가 변하지 않는 것을 확인하였다(도 11 및 도 12).
<5-3> 분자 마커를 사용하여 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬의 불안반응현상 확인
상기 실시예 <3-1>에 기재된 방법으로 제조된 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬에서 확인된 불안반응현상이 신경전달물질인 세로토닌 시스템 혹은 스트레스 관련 반응에 의해 나타나는 현상인지 확인하기 위하여 각각의 분자 마커를 사용하였다.
구체적으로, 1개월 및 3개월이 된 Sam2 유전자가 손실된 이형접합체와 동형접합체의 뇌를 분리하기 위하여, 각각의 물고기를 15 ml 튜브에 넣고 4% 파라포름알데하이드/PBTw(paraformaldehyde/PBTw)에 고정하였다. 12시간이 지난 후, 상기 물고기의 뇌를 분리하여 메탄올로 탈수시키고, 홀-마운트 정위치 교잡법(whole-mount in situ hybridization)을 수행하였다. tphR , slc6a4a 및 pomca의 DNA를 제한효소로 자른 후 RNA 중합효소(polymerase)를 사용하여 생체외 전사(in vitro transcription)를 통해 mRNA 프로브(probe)를 제작하였다. 상기 제작된 mRNA 프로브(probe)를 사용하여 홀-마운트 정위치 교잡법(whole-mount in situ hybridization)을 수행하였다.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 대조군과 Sam2 유전자 녹아웃 제브라피쉬에서 불안반응현상 차이점을 관찰할 수 없었다(도 13).
따라서, 상기 실시예 <5-3>의 결과를 통해 공포, 불안 및 그룹 내 행동 조절 있어 Sam2 유전자가 관여하는 것을 확인하였다.
< 실시예 6> 고삐핵에 의한 행동조절에 Sam2 유전자가 신경물질로써 미치는 영향 확인
<6-1> 랫트 해마( rat hippocampal ) 신경세포배양을 통해 인간 Sam2 유전자가 흥분성 및 억제 시냅스에 미치는 영향 확인
고삐핵에 의한 행동조절에 Sam2 유전자가 신경물질로써 관여하는지 확인하기 위하여 면역염색법을 수행하였다.
구체적으로, BALB/c 마우스 발생배 18일째의 해마(hippocampal) 신경세포를 B27 세포 배양액에서 배양시켰다(위스콘신 의과대학 동물실험 관련 위원회, IACUC). 시험관 배양 후 14일째, 신경세포에 리포펙타민 2000 시약 (lipofectamine 2000 reagent)을 사용하여 Sam2 유전자를 삽입하였고, 시험관 배양후 17 내지 18일째 신경세포를 사용하여 면역염색 및 전기 생리 실험을 수행하였다. 신경세포를 2분 동안 2% 포름알데히드(formaldehyde), 4% 자당(sucrose) 및 1 × PBS가 포함된 고정액에 담가 놓은 뒤, 10분 동안 차가운 메탄올을 처리하여 전처리를 하였다. 전처리가 끝난 시료를 1차 항체(rat anti-HA(Roche; 1:250), mouse mouse anti-vGAT(Synaptic systems;1:250), mouse anti-vGLUT(Millipore; 1:250), rabbit anti-GABAAR 2(Synaptic systems;1:500), mouse anti-PSD-95 (NeuroMab; 1:400), mouse anti-gephyrin(Synaptic systems;1:1,000), mouse anti-Gal(Promega;1:1,000), alc rabbit anti-Gal(Abcam;1:5,000))와 2차항체(Alexa Fluor488(LifeTechnologies), Cy-3 and Cy5-conjugated(Jackson ImmunoResearch Laboratories))에 하루 동안 반응시켰다. 그런 다음, Sam2 유전자 과발현 후whole-cell patch recordings을 통해 미소시냅스후전류(mIPSC, miniature inhibitory postsynaptic current)를 측정하여 전기 생리학 실험을 수행하였다. 또한, 미니 분석(Mini Analysis) 소프트웨어를 사용하여 미소 시냅스 후 전류를 분석하였다.
그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, Sam2 유전자의 과발현 후 억제성 시냅스 마커인 vesicular GABA transporter(vGAT), gephyrin, 및 GABAA receptor a2 subunit(GABAAR a2)를 사용하여 확인한 결과, 억제성 시냅스의 수와 발현 정도가 대조군에 비해 현저히 감소되는 것을 확인하였다. 또한, Sam2 유전자를 과발현하였을 때, miniature inhibitory postsynaptic current(mIPSC)의 amplitude와 frequency도 현저히 감소하는 것을 확인하였다. 특히 Sam2 유전자에 의한 억제성 시냅스의 영향은 Sam2를 처리한 신경뿐만 아니라 주변에 존재하는 신경세포에도 같은 영향을 미치는 것을 확인하였으며, 이를 통해 Sam2 유전자가 분비 단백질임을 확인하였다(도 14).
<6-2> Sam2 유전자 과발현을 통한 흥분성 신경 분자 마커 확인
Sam2 유전자 과발현을 통한 흥분성 신경 분자 마커의 발현을 확인하기 위하여, 면역염색법을 수행하여 확인하였다.
구체적으로, Sam2 유전자 과발현을 통한 흥분성 신경 분자 마커의 발현을 확인하기 위하여, 흥분성 신경 분자 마커 인 소포 글루타메이트 수송체(vesicular glutamate transporter, vGLUT) 및 PSD-95를 분석하였다. 신경 세포를 2% 포름 알데히드(formaldehyde), 4% 수크로스(sucrose) 및 1 x PBS가 포함된 고정 용액에 2분 동안 고정하고, -20℃에서 보관하던 메탄올을 사용하여 10분 동안 탈수 시켰다. 그런 다음, 75%, 50%, 및 25% 메탄올/PBS용액을 사용하여 순차적으로 세척하였다. 상기 세척된 신경세포에 1차 항체 (억제성시냅스마커: 마우스 항-vGAT(시냅스 시스템, 1:250),토끼 항-GABAARα2(시냅스 시스템, 1:500), 마우스 항-β-Gal(Promega, 1:1,000); 흥분성시냅스마커는 마우스 항-PSD-95(NeuroMab, 1:400), 마우스 항-vGLUT(Millipore, 1:250)를 첨가하여 반응시킨 뒤 1 X PBS를 사용하여 세척한 후, 2차 항체(Alexa Fluor488(LifeTechnologies), Cy3- 및 Cy5-결합된(Jackson ImmunoResearch Laboratories))를 첨가하고 반응시켰다. 그런 다음, 억제성 및 흥분성시냅스마커로 염색이 된 신경세포를 형광현미경 하에서 관찰하였다.
그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이, Sam2 유전자가 신경조절물질로 작용하여 전시냅스(presynapse) 억제성 기능 약화 및 흥분성 신경 시냅스 강화와 같은 신경계 활성을 증가시키는 것을 확인하였다(도 15).
< 실시예 7> 인간에서 Sam2 유전자 손실로 인한 자폐증 및 과불안 증상 확인
<7-1> 환자 대상 모집
35,000명의 환자를 대상으로 aCGH(array comparative genome hybridization)를 수행하여 복제수 변이(copy number variation)을 확인하였다.
<7-2> 인간에서 microdeletion 에 의한 Sam2 유전자 손실로 인한 자폐증 및 과불안 증상 확인
상기 실시예 <7-1>에 기재된 방법으로 모집된 환자를 대상으로 microdeletion에 의한 Sam2 유전자 손실로 인한 자폐증 및 과불안 증상을 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <7-1>에 기재된 방법으로 모집된 환자들과 의사의 상담을 통해 Sam2 유전자 손실로 인한 자폐증 및 과불안 증상을 진단하였다.
그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, 인간에서 microdeletion에 의한 Sam2 유전자 소실로 자폐증(autism)과 과불안증상(excessive fear)을 보이는 환자를 확인함으로써, 인간에서도 Sam2 유전자가 불안반응을 조절할 수 있는 중요한 인자임을 확인하였다(도 16).
<110> Foundation of Research & Business Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Novel Samdori2 gene and using thereof <130> 13P-10-46 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1937 <212> DNA <213> sam1_cDNA <400> 1 cccgaatgca ctggagtggg gatggtccat cggcaactat aaactgattc tcatcaggaa 60 actgcacatt atctccccat cacttcaaag gtctcgtcag gcagaggtga cgccaggaga 120 tgatttaaag gtgaaaatga caaggtttcc acccctcaaa ccttggctcc ttttctgaca 180 atacagtctg aatgaacccg atgtcttttt ttttactgtg gaaataggat cggaagagag 240 taacattttt ttttttttaa tcctgataaa gaagattgtt gggaagctct ttgaaaaaaa 300 attttaaatt gtggcacaga tggattttaa aaagtgttag atctttccaa tgaacactaa 360 tagagtactc tgctcttggc tggatttttc agagaatggc aatggtctct gcgatgtcct 420 gggtcctgta tttgtggata agtgcttgtg caatgctact ctgccatgga tcccttcagc 480 acactttcca gcagcatcac ctgcacagac cagaaggagg gacgtgtgaa gtgatagcag 540 cacaccgatg ttgtaacaag aatcgcattg aggagcggtc acaaacagta aagtgttcct 600 gtctacctgg aaaagtggct ggaacaacaa gaaaccggcc ttcttgcgtc gatgcctcca 660 tagtgattgg gaaatggtgg tgtgagatgg agccttgcct agaaggagaa gaatgtaaga 720 cactccctga caattctgga tggatgtgcg caacaggcaa caaaattaag accacgagaa 780 ttcacccaag aacctaacag aagcatttgt ggtagtaaag gaaaaccaac cctctggaaa 840 atacattttg agaatctcaa acatctcaca tatatacaag ccaaatggat ttcttacttg 900 cactttgact ggctaccaga taatcacagt gcgtttactg tgtgtaacga aatatcctac 960 agtgagaaga cacagcgttt tggcaacacc atggaaagtg ggcttaaaaa agggttttct 1020 cagtgaaatt tttgggcatc atgaagaacg atcaactatc ttctaatttg aatctatagt 1080 tactttgtac catttgaaat atatgtatat atatatatat aatattttga aatattatct 1140 attctcttca agaaatgaac agtaccacag tttgagacgg ctggtgtacc cctttgagtt 1200 ttggatgttt tgtctgtttt gctttgtttt gttagtcatt tctttttcta acggcaagga 1260 agatatgtgc ccttttgaga attcaagatg gcactgacac gggaaggcca gctacaggtg 1320 gactcctgga atttgaggca tcataatgat actgaatcaa gaacttcctt ctgcttctac 1380 cagatggccc aaggaagcac atcgtcctgt tttattgctt tctaccctgt gcaatattag 1440 catgcaagct tggcttacat agtcatactt tatattcaat tgatatataa taaccgttct 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atcaggctca ccttcacccg cttcaggggg attccagctt ggatgtcaga 1260 ttcctgaacc gtctttgcca tcggaggagg aaacacatcc acacacgcgc gcgcacactc 1320 gcacgctcag ggccacactc acacgccgcc ctccacgatc acacagcacc agacttcggt 1380 tccctatgcc cctggatggt gacggcggat tggcatcttg gaagcgatgc gagagcgata 1440 aggctggcgc cggcccgcaa aagctgcagg agcatcgcta ggtgttgccg ccaccgggaa 1500 gcggggctgc aggatgagta agagatactt acagaaagca acaaaaggaa aactgctaat 1560 aataatattt attgtaacct tgtgggggaa agttgtatcc agtgcaaacc atcataaagc 1620 tcaccatgtt aaaacgggaa cttgtgaggt ggtggcactc cacagatgct gtaataagaa 1680 caagatagaa gaacggtcac aaacagtcaa gtgctcctgc ttccctgggc aggtggcagg 1740 caccacgcga gctgctccat catgtgtgga tgcttcaata gtggaacaga aatggtggtg 1800 ccatatgcag ccatgtctag agggagaaga atgtaaagtt cttccggatc ggaaaggatg 1860 gagctgttcc tctgggaata aagtcaaaac aactagggta acccattaac ccaggagaaa 1920 tcaagtgatc ctcaaggctg atgacattga acatgcgcat agaaacttaa ctcaactcct 1980 gaggtgatct tgaagatttt tataccactt gaaagaggcg ctcaatagtc tatttccaag 2040 ggatttcatg gcctcttctt gaaatcaaga ctttttaaaa gtcagacatg aacttgcatg 2100 tcatgaagat ttcagcagat ttgaactgtg ttcaacttgt aaattgttaa aagaatttga 2160 agtcactgtc tgaggagctg gtgaagagtt gtttttttca gggtgatgtt agagacagtc 2220 accttttgag ttattggctc cagatgtgac tacttttctt gtttctgcaa gctgtatccc 2280 aagtgcactg tccttctgtc ctggatgtgt tcctgggtcc tatgttcatt tgctagtggg 2340 actacacatg gctttaatga catttccttt gagaactttt cctctggcat ggtgtagact 2400 gagacaattt tatttatatc ctaatcttgg agctcagaaa gcctacatgt tttaacatct 2460 taaagttgct tttgttaaag gaatggaaat atatatccat tggtaataat gttggcaagt 2520 aatagttatc tgaataaatc aatcatataa gaatgtatag acaagctgac atatttccct 2580 aaggctaaca acaccctgct gaagctcttt gtcaaatagg tagtagttag aactggattg 2640 ccattttcat tatataatac tttgtacctc tagagcactc tccctttctg ttttttttta 2700 agtgagcttt tctttaattt tttatgttta cttattccct tcacagaaat cagcagtgag 2760 cagtcaagtt aatgggtagc cttcagtttc aaaaaaattg acagggatgc atgtgagttt 2820 ctgatttctt agcttgaaca ttattcactt agatttcttc cagtattttt taaaaaactg 2880 tcctatctca ttttaaaaga ctttcttttg cttgatccca atgactgttt gaatgcttat 2940 atatttgttc aatctgttga tagaaaaaat tgttcatttt cctcagtctc aaatttataa 3000 atatttgctt acagttttcc tattcaaaca atttgttagg ccaatatttt gtgacatttt 3060 tgtagcgatt ttaacgttta tggttttggt tctacaggaa agtcataaat atttaaaggc 3120 cttaaacatg tatgtacttt ttttttctaa gttatagaat gtataatttt gtactacatt 3180 tattttgttt catttgtgat atgaagggag agaagaaaga aaagtgcata gccattctgt 3240 aacaatattg tgtaaaccta tagtttgaag gaatgcaagg agaaggattt ctgtgtttta 3300 ctcattttag gctgttcaga agatgcttca aaaattgtcc tgttagaatt tccatcatgg 3360 aaggtggtat ggaagaaggt atggaaatac tttgtattct aaaaactcac tgacgtggtc 3420 agttagacat acgttggttt ccaggataga ggcccatata tcctggggag ctttggtcta 3480 ttagtttgtg acaatattca aaggccaaaa cactactcag acactttcct gggaagagca 3540 actaaaaatg taaaattggt taaaaataaa atctgaaaag tatgtatctc acattgaact 3600 aaaatccact gtctcataag ttcatggaat gaaatggctt tctgcctcca ttttaatcat 3660 gcataaaatg aattagatgg ctttgagtgg attttcacaa tggctcaaga ctatatgaaa 3720 ttataaaaaa 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gctcttgggg 480 gtcacggcct ggacaagaaa ggcttgactg agccgtgaac tgaagaatgg tatccagtca 540 tcagccagga aagatgggga ttcacttaca tgcctcatgt caaatgcagc atcagtcttt 600 ccggggcatt tcagttaagc tgctcagcag atatggatgg atctgcaatc acatacctaa 660 tgtggagctg ggcttttctg gagacacgaa ggtcaacaca caattcctgc ccttaaggaa 720 tgtccagttg aattggagag ttgatgacag acaatttaga taatttaggt taaagtactt 780 gataccagac tgcggcttct gggccacatg ctatggcatg atgggggttt gggaatgaga 840 ttcccacagt tcttcagata ccctgtggcc acagggcata gaaacaagag gtcacattca 900 gcacccacca cctccctctt tcgcatcagt tctgaatccc cagcaagctg ttaacatgtt 960 gcaggaaaac actctcccct tatgccagac cagcagtatc tcatttggat gggattggat 1020 tgacttgcgg aaggaaagta aaaataaagc caaataactt cccaaaaaaa aaaaaaa 1077 <210> 4 <211> 133 <212> PRT <213> sam1_protein <400> 4 Met Ala Met Val Ser Ala Met Ser Trp Val Leu Tyr Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Ala Cys Ala Met Leu Leu Cys His Gly Ser Leu Gln His Thr Phe Gln 20 25 30 Gln His His Leu His Arg Pro Glu Gly Gly Thr Cys Glu Val Ile Ala 35 40 45 Ala His Arg Cys Cys Asn Lys Asn Arg Ile Glu Glu Arg Ser Gln Thr 50 55 60 Val Lys Cys Ser Cys Leu Pro Gly Lys Val Ala Gly Thr Thr Arg Asn 65 70 75 80 Arg Pro Ser Cys Val Asp Ala Ser Ile Val Ile Gly Lys Trp Trp Cys 85 90 95 Glu Met Glu Pro Cys Leu Glu Gly Glu Glu Cys Lys Thr Leu Pro Asp 100 105 110 Asn Ser Gly Trp Met Cys Ala Thr Gly Asn Lys Ile Lys Thr Thr Arg 115 120 125 Ile His Pro Arg Thr 130 <210> 5 <211> 131 <212> PRT <213> sam2_protein <400> 5 Met Ser Lys Arg Tyr Leu Gln Lys Ala Thr Lys Gly Lys Leu Leu Ile 1 5 10 15 Ile Ile Phe Ile Val Thr Leu Trp Gly Lys Val Val Ser Ser Ala Asn 20 25 30 His His Lys Ala His His Val Lys Thr Gly Thr Cys Glu Val Val Ala 35 40 45 Leu His Arg Cys Cys Asn Lys Asn Lys Ile Glu Glu Arg Ser Gln Thr 50 55 60 Val Lys Cys Ser Cys Phe Pro Gly Gln Val Ala Gly Thr Thr Arg Ala 65 70 75 80 Ala Pro Ser Cys Val Asp Ala Ser Ile Val Glu Gln Lys Trp Trp Cys 85 90 95 His Met Gln Pro Cys Leu Glu Gly Glu Glu Cys Lys Val Leu Pro Asp 100 105 110 Arg Lys Gly Trp Ser Cys Ser Ser Gly Asn Lys Val Lys Thr Thr Arg 115 120 125 Val Thr His 130 <210> 6 <211> 133 <212> PRT <213> sam3_protein <400> 6 Met Ser Glu Arg Val Glu Arg Asn Trp Ser Thr Gly Gly Trp Leu Leu 1 5 10 15 Ala Leu Cys Leu Ala Trp Leu Trp Thr His Leu Thr Leu Ala Ala Leu 20 25 30 Gln Pro Pro Thr Ala Thr Val Leu Val Gln Gln Gly Thr Cys Glu Val 35 40 45 Ile Ala Ala His Arg Cys Cys Asn Arg Asn Arg Ile Glu Glu Arg Ser 50 55 60 Gln Thr Val Lys Cys Ser Cys Phe Ser Gly Gln Val Ala Gly Thr Thr 65 70 75 80 Arg Ala Lys Pro Ser Cys Val Asp Ala Ser Ile Val Leu Gln Arg Trp 85 90 95 Trp Cys Gln Met Glu Pro Cys Leu Pro Gly Glu Glu Cys Lys Val Leu 100 105 110 Pro Asp Leu Ser Gly Trp Ser Cys Ser Ser Gly His Lys Val Lys Thr 115 120 125 Thr Lys Val Thr Arg 130 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> sam2_Forward <400> 7 acgccgctga atgaaccgat taccgg 26 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> sam2_reverse <400> 8 gagcgaacgc actgctttac acac 24 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> beta-actin_forward <400> 9 gaggagcacc ccgtcctgct cac 23 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> beta-actin_reverse <400> 10 gatggctgga acagggcctc tgg 23 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Sam2cnu1_forward <400> 11 tctactgagg agtggtgtga 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Sam2cnu1_reverse <400> 12 ggtcagtttc agagagctgg 20 <210> 13 <211> 12 <212> DNA <213> left ZFN <400> 13 tgctcctgct tc 12 <210> 14 <211> 12 <212> DNA <213> right ZFN <400> 14 caggtggcag ga 12

Claims (19)

  1. 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 Samdori2(Sam2) 유전자를 포함하는 발현벡터를 함유하는, 불안증, 우울증 및 자폐증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정신질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성되는 Samdori2 단백질을 함유하는, 불안증, 우울증 및 자폐증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정신질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 Samdori2(Sam2) 유전자를 포함하는 발현벡터, 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성되는 Samdori2 단백질을 함유하는, 불안증, 우울증 및 자폐증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정신질환의 예방 및 개선용 건강식품.
  10. 삭제
  11. 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 Samdori2 유전자에 대한 안티센스뉴클레오티드, 프라이머 세트 또는 프로브, 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성되는 Samdori2 단백질에 대한 항체 또는 앱타머를 포함하는 불안증, 우울증 및 자폐증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정신질환 진단용 키트.
  12. 1) 피검체 유래 고삐핵(havenula nuclear)에서 분리된 세포를 준비하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 세포에서 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 Samdori2 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    3) 상기 단계 2)의 Samdori2 유전자가 결실되거나 정상 대조군에 비해 낮은 경우, 불안증, 우울증 및 자폐증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정신질환에 걸리거나 위험도가 증가한 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 불안증, 우울증 및 자폐증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정신질환 모니터링 또는 진단의 정보를 제공하기 위한 Samdori2 유전자 발현 수준 측정 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 단계 2)의 발현 수준은 RT-PCR, ELISA, 웨스턴블랏 및 면역 조직 화학 법으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 측정하는 것을 특징으로 하는 Samdori2 유전자 발현 수준 측정 방법.
  14. 1) 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 Samdori2 유전자를 발현하는 세포, 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성되는 Samdori2 단백질에 피검체를 처리하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 Samdori2 유전자 또는 Samdori2 단백질의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및
    3) 상기 단계 2)의 Samdori2 유전자 또는 Samdori2 단백질의 발현 또는 활성을 증가시키는 피검시료를 선별하는 단계를 포함하는, 불안증, 우울증 및 자폐증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정신질환 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법.
  15. 인간을 제외한 동물의 고삐핵(havenula nuclear)에서 제 1항의 Samdori2 유전자가 녹아웃(Knock out)된 불안증, 우울증 및 자폐증으로 이루어진 군으로부터 정신질환 모델 동물.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 동물은 마우스, 랫트 및 제브라피쉬로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 정신질환 모델 동물.
  17. 삭제
  18. 1) 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 Samdori2 유전자에 특이적인 징크핑거 뉴클레이즈(zinc finger nuclease)를 발현하는 벡터를 인간을 제외한 동물의 수정란에 미세 주입하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 동물을 성체까지 키운 다음, 야생형(wild type) 동물과 교배시키는 단계; 및,
    3) 상기 단계 2)의 교배된 동물 중 Samdori2 유전자 녹아웃된 동물을 선별하는 단계를 포함하는 불안증, 우울증 및 자폐증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정신질환 모델 동물의 제조 방법.
  19. 삭제
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