JP2002511747A - 耐糖能障害疾患に対する治療および診断ツール - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本明細書において、耐糖能障害疾患を治療するために有用な新規遺伝子および治療物質のスクリーニング法と共に、該疾患を同定または治療するための診断的組成物および治療的組成物を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 耐糖能障害疾患に対する治療および診断ツール 発明の背景 本発明は、耐糖能障害に関連したヒト疾患を遅らせるまたは改善するために有 用な組成物および方法に関する。糖尿病はアメリカ国内のみで1600万人以上が罹 患し、年間費用は920億ドルに及ぶ主要な疾患である。 I型糖尿病またはインスリン依存型糖尿病（IDDD）は自己免疫疾患である。IDD M患者では、免疫系は膵臓のインスリン産生ベータ細胞を攻撃して破壊する。ヒ ト代謝におけるインスリンの中心的な役割は、筋細胞および脂肪細胞へのグルコ ースの輸送を補助することである。生体がインスリンを産生することができなけ れば、低血糖症、ケトアシドーシス、喉の渇き、および体重減少が起こる。さら に、糖尿病患者はしばしば、慢性アテローム性動脈硬化症ならびに腎および視力 不全を起こす。そのためIDDM患者が生存するためには、インスリンを毎日注射す る必要がある。 最も一般的な糖尿病の型はインスリン非依存型糖尿病（NIDDM）またはII型糖 尿病である。II型糖尿病は、グルコースに対するインスリン分泌反応障害および インスリン有効性の低下（すなわちインスリン抵抗性）の結果、高血糖症が起こ る不均一な疾患集団である。体重超過である高齢者は、II型糖尿病に対する特定 のリスクを有する。遺伝子試験から、II型糖尿病は家族において認められること 、そして疾患は多数の遺伝子欠損による可能性があることが示唆された。さらに 、肥満とII型糖尿病との関連性は強い。II型糖尿病患者のおよそ80％が肥満であ る。血中のグルコース濃度を正常に維持し、疾患の長期合併症を減少させるため には、体重減少および運動が有効となりうる。 現在、糖尿病または肥満に関する遺伝的素因の症候前診断に関して信頼できる 方法はほとんどない。糖尿病および肥満に連鎖する遺伝子マーカーの研究は難し く、これはII型糖尿病について特に当てはまる。 糖尿病の治療は、血糖値のモニタリングを通じて血糖値をコントロールするこ とに重点を置く。患者の大多数は適当なコントロールを得るために経口投薬およ び／またはインスリン注射を行っている。糖尿病の治療は一般に慢性的で一生に 及び、しかも治療は長い目で見れば概して満足できるものではない。さらに、イ ンスリン治療は疾患が進行するにつれてますます無効となる可能性がある。イン スリンは何十年も前から知られているが、インスリンに対する受容体およびその シグナル伝達経路に関する局面が特定されたのはこの10年の間であり、これらの シグナル伝達経路からの転写産物は特徴付けされていない。さらに、肥満による インスリン抵抗性の分子的基礎はわかっていない。 発明の概要 本発明者らは、C.エレガンス（C．elegans）の代謝調節遺伝子daf-2およびage -1が哺乳類インスリン受容体／PI 3-キナーゼシグナル伝達経路蛋白質の相同体 をそれぞれコードすることを発見した。また、DAF-16フォーク型蛋白質がこのイ ンスリンシグナル伝達経路の主な転写産物であることも発見した。例えば、イン スリンのシグナル伝達の非存在下においてDAF-16転写因子の調節障害によって代 謝の欠陥が起こることを発見した；DAF-16の不活化により、C.エレガンス（C．e legans）におけるインスリンのシグナル伝達の欠如によって引き起こされる代謝 欠陥は逆転する。最後に、C.エレガンスのdaf-7、daf-1、daf-4、daf-8、daf-14 、およびdaf-3遺伝子が、インスリンシグナル伝達経路と遺伝的に相互作用する 神経内分泌／標的組織TGF-β型のシグナル伝達分子をコードすることを発見した 。同様に本発明者らは、神経内分泌TGF-βシグナルの欠如によって引き起こされ る代謝欠陥はDAF-3転写因子の不活化によって逆転することができることを示し た。 併せてこの証拠は、これらの１点に集中するシグナル伝達経路のDAF-16、DAF- 3、DAF-8、およびDAF-14転写産物が代謝を調節することを示している。さらに、 これらの発見はまた、インスリンおよびTGF-β様シグナルがヒトにおいて代謝を 調節するように取り入れられること、およびその他のDAF蛋白質の相同体が肥満 誘発糖尿病と同様にヒト糖尿病家系において欠損している、またはダウンレギュ レートされている可能性があることも示した。したがって、これらの結果はC.エ レガンスのdaf遺伝子が、耐糖能障害、例えば、糖尿病、肥満、およびアテロー ム性動脈硬化症に関連したヒト疾患に対する優れた候補遺伝子および蛋白質であ ることを示している。本発明者らの知見は、これらのdaf遺伝子および蛋白質の ヒト相同体が健常人ではインスリンのシグナル伝達を媒介し、糖尿病患者では欠 損して いる、または誤調節されている可能性があることを示している。その上、本発明 者らの知見は、II型糖尿病には少なくとも２つのクラス：TGF-βシグナル伝達遺 伝子に欠損を有するクラスおよびインスリンシグナル伝達遺伝子に欠損を有する クラス、があることを示している。以下に、daf遺伝子のヒト相同体の例として の配列および機能的特徴を記述する。 １点に集中するDAF-7およびDAF-2インスリン様シグナル伝達の発見から、肥満 によって誘発されたおよび遺伝的に誘発された糖尿病（および肥満）の多くの症 例を、ヒトDAF-7ポリペプチドの投与によって治療する可能性があることが示さ れる。 TGF-βシグナル伝達経路の欠損はDAF-3経路の活性を減少させることによって 抑制することができる、およびインスリン経路における欠損はDAF-16活性の減少 によって抑制することができる、という発見は、医薬品開発における転写調節DA F蛋白質の利用を強調する；特に、これらの蛋白質の活性を阻害する薬剤はDAF-7 TGF-βタイプまたはインスリンシグナル伝達における、肥満によるまたは遺伝 的に誘発された欠損の作用を逆転させるために有用である。 一つの局面において、本発明は、動物（例えば、ヒトのような哺乳類、または C.エレガンス（C．elegans）のような無脊椎動物）から得ることができるDAF-2 ポリペプチドの実質的に純粋な調製物を特徴とする。好ましい態様において、DA F-2ポリペプチドはインスリン受容体（InR）活性、インスリン受容体関連活性、 インスリン様増殖因子受容体（IGF-1）受容体活性、またはこれらの活性の組合 せを有する。 本発明はまた、DAF-2ポリペプチドをコードする単離されたDNAを特徴とする。 この単離されたDNAは、例えば、図２Bに示すdaf-2遺伝子のヌクレオチド配列を 含む、ヌクレオチド配列を有することができる。好ましい態様において、この単 離されたDNAはまた、C.エレガンスにおけるdaf-2変異、マウスにおけるInR変異 、またはマウスにおけるIGF-1受容体変異を相補することができる。 DAF-2ポリペプチドをコードする単離DNAは、ベクター含有細胞におけるDNAに よってコードされる蛋白質の発現を指向することができるベクターのようなベク ターの中に含むことができる。ベクターに含まれる単離されたDNAは、プロモー ター 、例えばdaf-2、age-1、daf-16、daf-1、daf-4、daf-3、およびaktプロモーター からなる群より選択されるプロモーターに機能的に結合することができる。DAF- 2ポリペプチドをコードする単離されたDNA、またはこのDNAを含むベクターは、 細菌、哺乳類もしくは線虫細胞のような細胞の中に含めることができる。 組換え型DAF-2ポリペプチドを産生する方法およびこの方法によって産生され たDAF-2ポリペプチドもまた本発明に含まれる。本方法は、（a）（i）DAF-2ポリ ペプチドをコードする、および（ii）細胞において発現される位置に存在する、 単離されたDNAによって単離されたDNAを発現するような条件下で形質転換した細 胞を提供する段階、ならびに（b）組換え型DAF-2ポリペプチドを単離する段階を 含む。 モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のような、DAF-2ポリペプチド を特異的に認識してこれに結合する実質的に純粋な抗体もまた、本発明に含まれ る。本発明はまた、ヒト細胞に存在し、図2Bのdaf-2配列との配列同一性を有す る遺伝子または遺伝子の一部を検出する方法を特徴とする。本方法において、DA F-2ポリペプチドをコードする単離されたDNA、長さが約12残基以上であるそのよ うなDNAの一部、または配列番号：33、34、79、80、81、82、83、もしくは84に 対応する縮重オリゴヌクレオチドを、図2Bのdaf-2配列との核酸配列同一性が約7 0％以上であるDNA配列が検出されるようなハイブリダイズ条件下で、ヒト細胞か らのDNA調製物と接触させる。本方法はまた、遺伝子、またはその一部がC.エレ ガンス（C．elegans）のdaf-2変異体を機能的に相補することができるか否かを 調べる段階を含むことができる。 本発明に含まれるもう一つの方法は、ヒト細胞に存在し、配列番号：33、34、 79、80、81、82、83、もしく84をコードする配列との核酸配列同一性が少なくと も90％である遺伝子、または遺伝子の一部を単離する方法である。本方法は、（ a）（i）長さがそれぞれ約12残基以上である、および（ii）図2Bのヌクレオチド 配列の領域に反対のDNA鎖と相補的な領域をそれぞれが有するオリゴヌクレオチ ドプライマーを用いて、ヒト遺伝子またはその一部をPCRによって増幅する段階 、ならびに（b）ヒト遺伝子またはその一部を単離する段階、を含む。本方法は また、遺伝子またはその一部がC.エレガンスのdaf-2変異体を機能的に相補する ことがで きるか否かを調べる段階を含むことができる。 もう一つの局面において、本発明は、動物（例えば、ヒトのような哺乳類また はC.エレガンス（C．elegans）のような無脊椎動物）から得ることができるDAF- 3ポリペプチドの実質的に純粋な調製物を特徴とする。好ましい態様において、 ポリペプチドはSMAD蛋白質である。別の好ましい態様において、ポリペプチドは 線虫のDAF-1、DAF-4、DAF-8、DAF-14、またはDAF-16ポリペプチドと結合して、 相互作用することができる。 本発明はまた、DAF-3ポリペプチドをコードする単離されたDNAを特徴とする。 この単離されたDNAは、例えは、図11A、11B、または11Cに示すdaf-3遺伝予のヌ クレオチド配列を含む配列を有することができる。好ましい態様において、この 単離されたDNAはまた、C.エレガンスにおけるdaf-3変異を相補する、またはdaf- 3ノックアウトマウスを相補することができる。 DAF-3ポリペプチドをコードする単離DNAは、ベクター含有細胞におけるDNAに よってコードされる蛋白質の発現を指向することができるベクターのようなベク ターの中に含めることができる。ベクターに含まれる単離されたDNAは、プロモ ーター、例えばdaf-3、daf-4、daf-16、daf-2、age-1、およびaktプロモーター からなる群より選択されるプロモーターに機能的に結合することができる。DAF- 3ポリペプチドをコードする単離されたDNA、またはこのDNAを含むベクターは、 細菌、哺乳類もしくは線虫細胞のような細胞の中に含めることができる。 組換え型DAF-3ポリペプチドを産生する方法およびこの方法によって産生され たDAF-3ポリペプチドも同様に本発明に含まれる。本方法は、（a）（i）DAF-3ポ リペプチドをコードする、および（ii）細胞において発現される位置に存在する 、単離されたDNAによって単離されたDNAを発現するような条件下で形質転換した 細胞を提供する段階、ならびに（b）組換え型DAF-3ポリペプチドを単離する段階 を含む。 モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のような、DAF-3ポリペプチド を特異的に認識してこれに結合する実質的に純粋な抗体もまた、本発明に含まれ る。 本発明はまた、ヒト細胞において存在し、図11A、11B、もしくは11Cのdaf-3配 列のいずれかと配列同一性を有する遺伝子または遺伝子の一部を検出する方法を 特徴とする。本方法において、DAF-3ポリペプチドをコードする単離されたDNA、 長さが約12残基以上であるそのようなDNAの一部、または配列番号：35、36、も しくは85に対応する縮重オリゴヌクレオチドを、図11A、11B、もしくは11Cのdaf -3配列のいずれかとの核酸配列同一性が約70％以上であるDNA配列が検出される ようなハイブリダイズ条件下で、ヒト細胞からのDNAの調製物と接触させる。本 方法はまた、遺伝子またはその一部がC.エレガンスのdaf-3変異体を機能的に相 補することができるか否かを調べる段階を含むことができる。 本発明に含まれるもう一つの方法は、ヒト細胞に存在し、配列番号：35、36、 もしくは85をコードする配列との核酸配列同一性が少なくとも90％である遺伝子 またはその一部を単離する方法である。本方法は、（a）（i）長さがそれぞれ約 12残基以上である、および（ii）図11A、11B、もしくは11Cのヌクレオチド配列 のいずれかの領域に反対のDNA鎖と相補的な領域をそれぞれが有するオリゴヌク レオチドプライマーを用いて、ヒト遺伝子またはその一部をPCRによって増幅す る段階、ならびに（b）ヒト遺伝子またはその一部を単離する段階を含む。本方 法はまた、遺伝子またはその一部がC.エレガンスのdaf-3変異体を機能的に相補 することができるか否かを調べる段階を含むことができる。 さらにもう一つの局面において、本発明は、動物（例えば、ヒトのような哺乳 類、またはC.エレガンスのような無脊椎動物）から得ることができるDAF-16ポリ ペプチドの実質的に純粋な調製物を特徴とする。好ましい態様において、ポリペ プチドはDNAに結合するフォーク状の転写因子である。その他の好ましい態様に おいて、ポリペプチドは、DAF-3、DAF-8、およびDAF-14からなる群より選択され るポリペプチドと相互作用することができる。 本発明はまた、DAF-16ポリペプチドをコードする単離されたDNAを特徴とする 。この単離されたDNAは、例えは図13A、または13Bに示すdaf-16遺伝子配列を含 む配列を有することができる。好ましい態様において、この単離されたDNAはま た、C.エレガンスにおけるdaf-16変異、または、マウスにおけるFKHRもしくはAF X変異を相補することができる。 DAF-16ポリペプチドをコードする単離DNAは、ベクター含有細胞においてDNAに よってコードされる蛋白質の発現を指向することができるベクターのようなベク ターの中に含むことができる。ベクターに含まれる単離されたDNAは、プロモー ター、例えばdaf-2、age-1、daf-16、daf-3、daf-4、およびaktプロモーターか らなる群より選択されるプロモーターに機能的に結合することができる。DAF-16 ポリペプチドをコードする単離されたDNA、またはこのDNAを含むベクターは、細 菌、哺乳類もしくは線虫細胞のような細胞に含むことができる。 組換え型DAF-16ポリペプチドを産生する方法およびこの方法によって産生され たDAF-16ポリペプチドも同様に本発明に含まれる。本方法は、（a）（i）DAF-16 ポリペプチドをコードする、および（ii）細胞において発現される位置に存在す る、精製したDNAによって単離されたDNAが発現されるような条件下で形質転換し た細胞を提供する段階、ならびに（b）組換え型DAF-16ポリペプチドを単離する 段階を含む。 モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のような、DAF-16ポリペプチド を特異的に認識してこれに結合する実質的に純粋な抗体もまた、本発明に含まれ る。 本発明はまた、ヒト細胞において存在し、図13Aもしくは13Bのdaf-16配列と配 列同一性を有する遺伝子または遺伝子の一部を検出する方法を特徴とする。本方 法において、DAF-16ポリペプチドをコードする単離されたDNA、長さが約12残基 以上であるそのようなDNAの一部、または配列番号：54、55、56、もしくは57に 対応する縮重オリゴヌクレオチドを、図13Aもしくは13Bのdaf-16配列との核酸配 列同一性が約70％以上であるDNA配列が検出されるようなハイブリダイズ条件下 で、ヒト細胞からのDNAの調製物と接触させる。本方法はまた、遺伝子またはそ の一部がC.エレガンスのdaf-16変異体を機能的に相補することができるか否かを 調べる段階を含むことができる。 本発明に含まれるもう一つの方法は、ヒト細胞に存在し、配列番号：54、55、 56、もしくは57をコードする配列との核酸配列同一性が少なくとも90％である遺 伝子またはその一部を単離する方法である。本方法は、（a）（i）長さがそれぞ れ約12残基以上である、および（ii）図13Aもしくは13Bのヌクレオチド配列の領 域に反対のDNA鎖と相補的な領域をそれぞれが有するオリゴヌクレオチドプライ マ ーを用いて、ヒト遺伝子またはその一部をPCRによって増幅する段階、ならびに （b）ヒト遺伝子またはその一部を単離する段階を含む。本方法はまた、遺伝子 またはその一部がC.エレガンスのdaf-16変異体を機能的に相補することができる か否かを調べる段階を含むことができる。 もう一つの局面において、本発明は、ヒト遺伝子が耐糖能障害疾患（例えば、 アテローム性動脈硬化症を含む疾患）または肥満に関与するか否かを決定する方 法を特徴とする。本方法は、（a）dafまたはafe遺伝子の変異を有する線虫を提 供する段階、および（b）線虫の遺伝子プロモーターに機能的に結合するヒト遺 伝子を線虫において発現させる段階、を含む。線虫のdafまたはageの変異を相補 することができれば、ヒト遺伝子が耐糖能障害または肥満に関与することを示す 。好ましい態様において、線虫遺伝子プロモーターは、daf-1、daf-3、daf-4、d af-2、age-1およびakt遺伝子プロモーターからなる群より選択される。その他の 好ましい態様において、daf変異はdaf-2、daf-3、daf-1、daf-4、daf-7、daf-8 、daf-11、daf-12、daf-14、およびdaf-16変異からなる群より選択される。さら にもう一つの好ましい態様において、変異はage-1遺伝子において認めることが できる。 さらなる局面において、本発明は患者における耐糖能障害疾患（例えば、II型 糖尿病またはアテローム性動脈硬化症を含む疾患）、またはそのような疾患に対 する性向を診断する方法を特徴とする。そのような一つの方法は、DNAがdaf遺伝 子の変異を含むか否かを決定するために患者のDNAを分析することを含む。その ような変異が同定されれば、耐糖能障害またはそのような疾患に対する性向を患 者が有することを示している。本方法における分析は、例えばヌクレオチドシー クエンシングまたはRFLP分析によって行うことができる。分析はまた、プライマ ーを用いて遺伝子（例えば、ヒト遺伝子）またはその断片を増幅（例えば、PCR または逆転写PCRによって）する段階、および増幅された遺伝子またはその断片 を変異の有無に関して分析する段階を含むことができる。好ましい態様において 、本方法において分析されるdaf遺伝子は、例えば、daf-1、daf-2、daf-3、daf- 4、daf-7、daf-8、daf-11、daf-12、daf-14、もしくはdaf-16コード配列である 、またはdaf遺伝子はFKHRもしくはAFXである。 II型糖尿病のような耐糖能障害、またはそのような疾患に対する性向を患者に おいて診断するもう一つの方法には、DNAがage遺伝子において変異を含むか否か を決定するために患者のDNAを分析することが含まれる。そのような変異が同定 されれば、患者が耐糖能障害またはそのような疾患に対する性向を有することを 示している。本方法における分析は、例えばヌクレオチドシークエンシングまた はRFLP分析によって行うことができる。分析はまた、プライマーを用いて遺伝子 （例えば、ヒト遺伝子）またはその断片を増幅（例えば、PCRもしくは逆転写PCR によって）する段階、および増幅された遺伝子またはその断片を変異の有無に関 して分析する段階を含むことができる。好ましい態様において、age遺伝子はage -1コード配列である。 II型糖尿病またはアテローム性動脈硬化症を含む疾患のような耐糖能障害、ま たはそのような疾患に対する性向を診断するさらにもう一つの方法は、DNAがakt 遺伝子において変異を含むか否かを決定するために患者のDNAを分析することを 含む。そのような変異が特定されれば、患者が耐糖能障害疾患（例えば、II型糖 尿病）またはそのような疾患に対する性向（例えば、前糖尿病状態）を有するこ とを示している。本方法における分析は、例えば、ヌクレオチドシークエンシン グまたはRFLP分析によって行うことができる。分析はまた、プライマーを用いて 遺伝子（例えば、ヒト遺伝子）またはその断片を増幅（例えば、PCRもしくは逆 転写PCRによって）する段階、および増幅された遺伝子またはその断片を変異の 有無に関して分析する段階を含むことができる。 本発明はまた、患者における耐糖能障害疾患、またはそのような疾患に対する 性向の診断において用いられるキットを含む。そのようなキットの一つはdaf核 酸配列と相補的なPCRプライマーおよび耐糖能障害疾患またはそのような疾患に 対する性向を診断するための説明書が含まれる。もう一つのキットには、age核 酸配列と相補的なPCRプライマーおよび耐糖能障害疾患またはそのような疾患に 対する性向を診断するための説明書が含まれる。さらにもう一つのキットには、 akt核酸配列と相補的なPCRプライマーおよび耐糖能障害またはそのような疾患に 対する性向を診断するための説明書が含まれる。 もう一つの局面において、本発明は、患者における耐糖能障害疾患（例えばII 型糖尿病）の発症を改善する、または遅らせる方法を特徴とする。そのような一 つの方法において、DAFポリペプチド（例えば、ヒトまたは線虫のDAF-7ポリペプ チド）の治療的有効量を患者に投与する。例えば、アテローム性動脈硬化症を含 む疾患の場合に用いることができるもう一つの方法において、DAF-16またはDAF- 3ポリペプチドの活性を阻害することができる化合物の治療的有効量を患者に投 与する。さらにもう一つの方法において、DAF-1、DAF-4、DAF-8、DAF-II、また はDAF-14ポリペプチドを活性化する化合物の治療的有効量を患者に投与する。 本発明のもう一つの局面は、患者における肥満（例えば、II型糖尿病に関連し た肥満）を改善または予防する方法を提供する。そのような一つの方法は、ヒト または線虫のDAF-7ポリペプチドのようなDAFポリペプチドの治療的有効量を患者 に投与することを含む。もう一つのそのような方法は、DAF-16またはDAF-3ポリ ペプチドの活性を阻害することができる化合物の治療的有効量を患者に投与する ことを含む。 本発明のさらにもう一つの局面は、その生殖系列細胞および体細胞が変異体DA Fポリペプチド、例えばヒトに由来する変異体DAFポリペプチドをコードするトラ ンスジーンを含む、マウスまたは線虫のようなヒト以外のトランスジェニック動 物を特徴とする。好ましい態様において、変異体DAFポリペプチドはDAF-1、DAF- 2、DAF-3、DAF-4、DAF-7、DAF-8、DAF-11、DAF-12、DAF-14、またはDAF-16ポリ ペプチドである。もう一つの好ましい態様において、トランスジーンはノックア ウト変異を含む。 関連する局面において、本発明は、その生殖系列細胞および体細胞が変異体AG Eポリペプチド、例えばヒトに由来する変異体AGEポリペプチドをコードするトラ ンスジーンを含む、マウスまたは線虫のようなヒト以外のトランスジェニック動 物を特徴とする。好ましい態様において、変異体AGEポリペプチドはAGE-1ポリペ プチドである。もう一つの好ましい態様において、トランスジーンはノックアウ ト変異を含む。 さらにもう一つの局面において、本発明は、その生殖系列細胞および体細胞が 変異体AKTポリペプチド、例えばヒトに由来する変異体AKTポリペプチドをコード するトランスジーンを含む、マウスまたは線虫のようなヒト以外のトランスジェ ニック動物を特徴とする。好ましい態様において、トランスジーンはノックアウ ト変異を含む。 関連する局面において、本発明は上記のトランスジェニック動物から単離した 細胞（例えば、マウス、ヒトのような哺乳類から単離した細胞、または線虫細胞 ）を特徴とする。 本発明はまた、ヒト以外のトランスジェニック動物を作製する方法を含む。例 えば、本発明は、内因性daf遺伝子を欠損し、ヒトDAFポリペプチドを発現するこ とができる、ヒト以外のトランスジェニック動物を作製する方法を含む。本方法 は、（a）その生殖系列細胞および体細胞がdaf遺伝子に変異を含むヒト以外のト ランスジェニック動物を提供する段階、ならびに（b）（i）ヒトDAFポリペプチ ドをコードする、および（ii）ヒトポリペプチドを発現することができるトラン スジーンを、ヒト以外の動物の胚芽細胞に導入する段階を含む。 本発明に含まれるもう一つの方法は、内因性のage遺伝子を欠損し、ヒトAGEポ リペプチドを発現することができるヒト以外のトランスジェニック動物を作製す るために用いることができる。本方法は、（a）その生殖系列細胞および体細胞 がage遺伝子に変異を含むヒト以外のトランスジェニック動物を提供する段階、 ならびに（b）（i）ヒトAGEポリペプチドをコードする、および（ii）ヒトポリ ペプチドを発現することができるトランスジーンを、ヒト以外の動物の胚芽細胞 に導入する段階を含む。 同様に、本発明は、内因性のakt遺伝子を欠損し、ヒトAKTポリペプチドを発現 することができるヒト以外のトランスジェニック動物を作製する方法を含む。本 方法は、（a）その生殖系列細胞および体細胞がakt遺伝子に変異を含むヒト以外 のトランスジェニック動物を提供する段階、ならびに（b）（i）ヒトAKTポリペ プチドをコードする、および（ii）ヒトポリペプチドを発現することができるト ランスジーンを、ヒト以外の動物の胚芽細胞に導入することを含む。 本発明のもう一つの局面は、DAFポリペプチドの活性を増加させる化合物をス クリーニングする方法を特徴とする。本方法は、（a）その生殖系列細胞および 体細胞が変異DAFポリペプチドをコードするトランスジーンを含むヒト以外のト ランスジェニック動物を、候補化合物に暴露する段階、ならびに（b）トランス ジェニック動物においてDAFポリペプチドの活性を測定する段階を含む。無処置 対照と比較 して、DAFポリペプチド活性が増加すれば、化合物がDAFポリペプチド活性を増加 させることができることを示す。好ましい態様において、化合物は耐糖能障害疾 患または肥満を治療するために用いることができる。 関連する局面において、本発明は、DAFポリペプチドの活性を減少させる化合 物をスクリーニングする方法を特徴とする。本方法は、（a）その生殖系列細胞 および体細胞が変異DAFポリペプチドをコードするトランスジーンを含むヒト以 外のトランスジェニック動物を、候補化合物に暴露する段階、ならびに（b）ト ランスジェニック動物においてDAFポリペプチドの活性を測定する段階を含む。 無処置対照と比較してDAFポリペプチド活性が減少すれば、化合物がDAFポリペプ チド活性を減少させることができることを示す。好ましい態様において、化合物 は耐糖能障害疾患、肥満、またはアテローム性動脈硬化症を治療するために用い ることができる。その他の好ましい態様において、化合物はDAF-3またはDAF-16 の活性を減少させる。 もう一つの局面において、本発明はAGEポリペプチドの活性を増加させる化合 物をスクリーニングする方法を特徴とする。本方法は、（a）その生殖系列細胞 および体細胞が変異AGEポリペプチドをコードするトランスジーンを含むヒト以 外のトランスジェニック動物を、候補化合物に暴露する段階、ならびに（b）ト ランスジェニック動物においてAGEポリペプチドの活性を測定する段階を含む。 無処置対照と比較してAGEポリペプチド活性が増加すれば、化合物がAGEポリペプ チド活性を増加させることができることを示す。好ましい態様において、化合物 は耐糖能障害疾患または肥満を治療するために用いることができる。 関連する局面において、本発明は、AGEポリペプチドの活性を減少させる化合 物をスクリーニングする方法を特徴とする。本方法は、（a）その生殖系列細胞 および体細胞が変異AGEポリペプチドをコードするトランスジーンを含むヒト以 外のトランスジェニック動物を候補化合物に暴露する段階、ならびに（b）トラ ンスジェニック動物においてAGEポリペプチドの活性を測定する段階を含む。無 処置対照と比較してAGEポリペプチド活性が減少すれば、化合物がAGEポリペプチ ド活性を減少させることができることを示す。好ましい態様において、化合物は 耐糖能障害疾患、肥満、またはアテローム性動脈硬化症を治療するために用いる ことができ る。もう一つの好ましい態様において、AGEポリペプチドはAGE-1である。 もう一つの局面において、本発明はAKTポリペプチドの活性を増加する化合物 をスクリーニングする方法を特徴とする。本方法は、（a）その生殖系列細胞お よび体細胞が変異AKTポリペプチドをコードするトランスジーンを含むヒト以外 のトランスジェニック動物を候補化合物に暴露する段階、ならびに（b）トラン スジェニック動物においてAKTポリペプチドの活性を測定する段階を含む。無処 置対照と比較してAKTポリペプチド活性が増加すれば、化合物がAKTポリペプチド 活性を増加させることができることを示す。好ましい態様において、化合物は耐 糖能障害疾患または肥満を治療するために用いることができる。 関連する局面において、本発明は、AKTポリペプチドの活性を減少させる化合 物をスクリーニングする方法を特徴とする。本方法は、（a）その生殖系列細胞 および体細胞が変異AKTポリペプチドをコードするトランスジーンを含むヒト以 外のトランスジェニック動物を候補化合物に暴露する段階、ならびに（b）トラ ンスジェニック動物においてAKTポリペプチドの活性を測定する段階を含む。無 処置対照と比較してAKTポリペプチド活性が減少すれば、化合物がAKTポリペプチ ド活性を減少させることができることを示す。好ましい態様において、化合物は 耐糖能障害疾患、肥満、またはアテローム性動脈硬化症を治療するために用いる ことができる。 耐糖能障害疾患を改善するまたは遅らせることができる化合物のスクリーニン グ法も同様に本発明に含まれる。本方法は、（a）その生殖系列細胞および体細 胞が変異体DAF、AGE、またはAKTポリペプチドをコードするトランスジーンを含 むヒト以外のトランスジェニック動物を候補化合物に暴露する段階、ならびに（ b）動物の血中グルコースをモニターすることを含む。無処置対照と比較して、 動物において血中グルコースの生理的に許容可能なレベルの維持を促進する化合 物は、耐糖能障害を改善するまたは遅らせることができる化合物であることを示 す。好ましい態様において、化合物はII型糖尿病を治療するために用いることが できる。 肥満を改善または遅らせることができる化合物をスクリーニングするもう一つ の方法もまた、本発明に含まれる。本方法は、（a）その生殖系列細胞および体 細 胞が変異体DAF、AGE、またはAKTポリペプチドをコードするトランスジーンを含 むヒト以外のトランスジェニック動物を候補化合物に暴露する段階、ならびに（ b）動物の脂肪組織をモニターする段階を含む。無処置対照と比較して、動物に おける脂肪組織の生理的に許容可能なレベルの維持を促進する化合物は、肥満を 改善するまたは遅らせることができる化合物であることを示す。 本発明の関連する方法は、アテローム性動脈硬化症を改善する、または遅らせ ることができる化合物のスクリーニングに用いることができる。本方法は、（a ）その生殖系列細胞および体細胞が変異体DAF、AGE、またはAKTポリペプチドを コードするトランスジーンを含むヒト以外のトランスジェニック動物を候補化合 物に暴露する段階、ならびに（b）動物の脂肪組織をモニターする段階を含む。 無処置対照と比較して、動物における脂肪組織の生理的に許容可能なレベルの維 持を促進する化合物は、アテローム性動脈硬化症を改善するまたは遅らせること ができる化合物であることを示す。 もう一つの局面において、本発明はdaf遺伝子の発現を減少させることができ る調節化合物を同定する方法を含む。本方法は、（a）daf遺伝子を発現する細胞 を提供する段階、および（b）細胞を候補化合物に接触させる段階、を含む。候 補化合物と接触させた後にdaf発現が減少すれば、調節化合物であることが確認 される。好ましい態様において、化合物は耐糖能障害疾患または肥満を治療する ために用いることができる。その他の好ましい態様において、化合物はDAF-3ま たはDAF-16の発現を減少させることができる。本方法は、線虫のような動物にお いて行うことができる。 関連する局面において、本発明はdaf遺伝子の発現を増加させることができる 調節化合物を同定する方法を含む。本方法は、（a）daf遺伝子を発現する細胞を 提供する段階、および（b）細胞を候補化合物に接触させる段階、を含む。候補 化合物と接触させた後にdaf発現が増加すれば、調節化合物であることが確認さ れる。好ましい態様において、化合物は耐糖能障害疾患または肥満を治療するた めに用いることができる。その他の好ましい態様において、化合物はDAF-1、DAF -2、DAF-4、DAF-7、DAF-8、DAF-11またはDAF-14の発現を増加させることができ る。本方法は、線虫のような動物において行うことができる。 もう一つの局面において、本発明はage-1遺伝子の発現を増加させることがで きる調節化合物を同定する方法を含む。本方法は、（a）age-1遺伝子を発現する 細胞を提供する段階、および（b）細胞を候補化合物に接触させる段階、を含む 。候補化合物と接触させた後にage-1発現が増加すれば、調節化合物であること が確認される。好ましい態様において、化合物は耐糖能障害疾患または肥満を治 療するために用いることができる。本方法は、線虫のような動物において行うこ とができる。 もう一つの局面において、本発明は耐糖能障害疾患を改善または遅らせること ができる化合物の同定法を提供する。本方法は、（a）daf遺伝子に変異を含むダ ウア（dauer）幼虫を提供する段階、および（b）ダウア幼虫を化合物に接触させ る段階を含む。ダウア幼虫状態から解放されれば、化合物が耐糖能障害を改善ま たは遅らせることができることを示す。好ましい態様において、ダウア幼虫はda f-2変異を有する。もう一つの好ましい態様において、ダウア幼虫はC.エレガン ス（C．elegans）の幼虫である。さらにもう一つの態様において、耐糖能障害疾 患は肥満またはアテローム性動脈硬化症を含む。 関連する局面において、本発明は耐糖能障害疾患を改善する、または遅延させ ることができる化合物を同定する方法を提供する。本方法は、（a）age-1遺伝子 に変異を含むダウア幼虫を提供する段階、および（b）ダウア幼虫を化合物と接 触させる段階、を含む。ダウア幼虫状態から解放されれば、化合物が耐糖能障害 疾患を改善または遅らせることができることを示している。好ましい態様におい てダウア幼虫はage-1変異を有する。もう一つの好ましい態様において、ダウア 幼虫はC.エレガンスの幼虫である。さらにもう一つの好ましい態様において、耐 糖能障害疾患は肥満またはアテローム性動脈硬化症を含む。 もう一つの関連する局面において、本発明は耐糖能障害疾患を改善する、また は遅延させることができる化合物を同定する方法を提供する。本方法は、（a）a kt遺伝子に変異を含むダウア幼虫を提供する段階、および（b）ダウア幼虫を化 合物と接触させる段階、を含む。ダウア幼虫状態から解放されれば、化合物が耐 糖能障害疾患を改善または遅らせることができることを示している。好ましい態 様においてダウア幼虫はC.エレガンスの幼虫である。もう一つの好ましい態様に お いて、耐糖能障害疾患は肥満またはアテローム性動脈硬化症を含む。 もう一つの局面において、本発明は耐糖能障害疾患を改善または遅らせる化合 物の同定法を提供する。本方法は、（a）PIP3：AKT複合体が形成される条件下で 、化合物の存在下および非存在下においてPIP3およびAKTポリペプチドを結合さ せる段階、（b）PIP3：AKT複合体の形成を減少させることができる化合物を同定 する段階、および（c）段階（b）において同定された化合物がAKT活性を増加さ せることができるか否かを決定する段階、を含む。AKT活性が増加すれば、化合 物は耐糖能障害疾患を改善または遅らせるために有用であることが示される。 さらにもう一つの局面において、本発明は、耐糖能障害を改善または遅らせる 化合物の同定法を提供する。本発明は（a）daf-7、daf-3変異体線虫を提供する 段階、（b）それによって線虫がダウア幼虫を形成する、線虫の細胞に哺乳類のD AF-3ポリペプチドを発現させる段階、および（c）化合物をダウア幼虫に接触さ せる段階、を含む。ダウア幼虫から解放されれば、化合物が耐糖能障害疾患を改 善するまたは遅らせることができることを示している。 さらなる局面において、本発明は、耐糖能障害を改善または遅らせる化合物の 同定法を提供する。本発明は（a）daf-2、daf-16変異体線虫を提供する段階、（ b）それによって線虫がダウア幼虫を形成する、線虫の細胞に哺乳類のDAF-16ポ リペプチドを発現させる段階、および（c）化合物をダウア幼虫に接触させる段 階、を含む。ダウア幼虫状態から解放されれば、化合物が耐糖能障害疾患を改善 するまたは遅らせることができることを示している。 最後の局面において、本発明はインスリン様分子ならびに診断および治療試薬 としてそれらを利用することを特徴とする。 本明細書に用いるように、「DAF」ポリペプチドはC.エレガンス（C．elegans ）のdaf変異を機能的に相補する、および／またはC.エレガンスDAFポリペプチド のアミノ酸領域100個（および好ましくは保存ドメイン）に対するアミノ酸配列 同一性が少なくとも60％、好ましくは75％、およびより好ましくは90％であるポ リペプチドを意味する。相補性は生体（例えは、線虫において）または細胞倍養 系においてアッセイしてもよい。相補性は部分的または完全であってもよいが、 機能を検出可能に増加させなければならない（本明細書に記述のように）。DAF ポリペ プチドは「DAF」遺伝子または核酸配列によってコードされる。 「AGE」ポリペプチドとは、C.エレガンスのage変異を機能的に相補し、および ／またはC.エレガンスAGEポリペプチドのアミノ酸領域100個（および好ましくは 保存ドメイン）に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも60％、好ましくは75％ 、およびより好ましくは90％であるポリペプチドを意味する。相補性は生体（例 えば、線虫において）または細胞倍養系においてアッセイしてもよい。相補性は 部分的または完全であってもよいが、既知のAGE機能を検出可能に増加させなけ ればならない。AGEポリペプチドは「AGE」遺伝子または核酸配列によってコード される。 本明細書において用いられるように、「AKT」ポリペプチドとは、C.エレガン スのakt変異を機能的に相補し、および／または配列番号：60とのアミノ酸配列 同一性が少なくとも64％である、配列番号：61とのアミノ酸配列同一性が少なく とも71％である、配列番号：62とのアミノ酸配列同一性が少なくとも79％である 、配列番号：63とのアミノ酸配列同一性が少なくとも63％である、配列番号：64 とのアミノ酸配列同一性が少なくとも48％である、配列番号：65とのアミノ酸配 列同一性が少なくとも70％である、配列番号：66とのアミノ酸配列同一性が少な くとも64％である、配列番号：67とのアミノ酸配列同一性が少なくとも67％であ る、またはそれらの組合せを有するポリペプチドを意味する。相補性は生体（例 えば、線虫において）または細胞倍養系においてアッセイしてもよい。相補性は 部分的または完全であってもよいが、既知のAKT機能を検出可能に増加させなけ ればならない。AKTポリペプチドは「AKT」遺伝子または核酸配列によってコード される。 「DAF-2」ポリペプチドとは、C.エレガンスのdaf-2変異を相補する（上記のよ うに）および／または配列番号：33とのアミノ酸配列同一性が少なくとも61％で ある、配列番号：34とのアミノ酸配列同一性が少なくとも31％である、配列番号 ：79とのアミノ酸配列同一性が少なくとも43％である、配列番号：80とのアミノ 酸配列同一性が少なくとも35％である、配列番号：81とのアミノ酸配列同一性が 少なくとも35％である、配列番号：82とのアミノ酸配列同一性が少なくとも48％ である、配列番号：83とのアミノ酸配列同一性が少なくとも43％である、配列番 号：84とのアミノ酸配列同一性が少なくとも40％である、またはそれらの組合せ を有するポリペプチドを意味する。好ましくは、DAF-2ポリペプチドは、C.エレ ガンスのDAF-2のアミノ酸1252位、1312位、1343位、347位、451位、458位、458 位、526位、279位および348位にそれぞれ、アスパラギン酸、プロリン、プロリ ン、セリン、アラニン、アスパラギン酸、システイン、もしくはプロリン、また はその組合せを含む。 「DAF-3ポリペプチド」とは、C.エレガンスのdaf-3変異を相補する（上記のよ うに）、および／または配列番号：35とのアミノ酸配列同一性が少なくとも60％ である、配列番号：36とのアミノ酸配列同一性が少なくとも38％である、配列番 号：85とのアミノ酸配列同一性が少なくとも47％である、またはそれらの組合せ を有するポリペプチドを意味する。好ましくは、DAF-3ポリペプチドは、図12Aの C.エレガンスのdaf-3アミノ酸200位（プロリン）および／または620位（グリシ ン）に対応するアミノ酸の位置にそれぞれ、プロリンもしくはグリシン、または その組合せを含む。例えば、ポリペプチドはモチーフGRKGFPHVにおいてプロリン 、またはモチーフRXXIXXG（Xはいかなるアミノ酸であってもよい）においてプロ リンを含んでもよい。 「DAF-16ポリペプチド」とは、C.エレガンスのdaf-16変異を相補する（上記の ように）、および／または配列番号：54とのアミノ酸配列同一性が少なくとも71 ％である、配列番号：55とのアミノ酸配列同一性が少なくとも35％である、配列 番号：56とのアミノ酸配列同一性が少なくとも65％である、配列番号：57とのア ミノ酸配列同一性が少なくとも53％である、またはその組合せを有するポリペプ チドを意味する。さらに、DAF-16ポリペプチドは好ましくは保存モチーフWKNSIR H（配列番号：59）においてセリン残基を含む。 「DAF-7ポリペプチド」とは、C.エレガンスのdaf-7変異を相補する（上記のよ うに）、および／または配列番号：26とのアミノ酸配列同一性が少なくとも29％ である、配列番号：27とのアミノ酸配列同一性が少なくとも66％である、配列番 号：28とのアミノ酸配列同一性が少なくとも45％である、配列番号：29とのアミ ノ酸配列同一性が少なくとも33％である、配列番号：30とのアミノ酸配列同一性 が少なくとも56％である、配列番号：51とのアミノ酸配列同一性が少なくとも75 ％である、またはその組合せを有するポリペプチドを意味する。好ましくは、DA F-7ポリペプチドは、C.エレガンスのdaf-7アミノ酸271位および280位に対応する アミノ酸の位置においてそれぞれ、プロリンもしくはグリシン、またはその組合 せを含む。 「DAF-8ポリペプチド」とは、C.エレガンスのdaf-８変異を相補する（上記の ように）、および／または配列番号：23とのアミノ酸配列同一性が少なくとも46 ％である、配列番号：24とのアミノ酸配列同一性が少なくとも45％である、配列 番号：25とのアミノ酸配列同一性が少なくとも36％である、またはその組合せを 有するポリペプチドを意味する。 「AGE-1ポリペプチド」とは、C.エレガンスのage-1変異（daf-23変異として既 に知られている）を相補する（上記のように）、および／または配列番号：17と のアミノ酸配列同一性が少なくとも40％である、配列番号：18とのアミノ酸配列 同一性が少なくとも45％である、配列番号：19とのアミノ酸配列同一性が少なく とも30％である、配列番号：38とのアミノ酸配列同一性が少なくとも24％である 、またはその組合せを有するポリペプチドを意味する。好ましくは、AGE-1ポリ ペプチドは、C.エレガンスのage-1アミノ酸845位に対応するアミノ酸の位置にお いてアラニンを含む。 「DAF-1ポリペプチド」とは、C.エレガンスのdaf-1変異を相補する（上記のよ うに）、および／または配列番号：13とのアミノ酸配列同一性が少なくとも45％ である、配列番号：14とのアミノ酸配列同一性が少なくとも35％である、配列番 号：15とのアミノ酸配列同一性が少なくとも65％である、配列番号：16とのアミ ノ酸配列同一性が少なくとも25％である、またはその組合せを有するポリペプチ ドを意味する。好ましくは、DAF-1ポリペプチドは、C.エレガンスのDAF-1アミノ 酸546位に対応するアミノ酸の位置においてプロリンを含む。 「DAF-4ポリペプチド」とは、C.エレガンスのdaf-4変異を相補する（上記のよ うに）、および／または配列番号：20とのアミノ酸配列同一性が少なくとも45％ である、配列番号：21とのアミノ酸配列同一性が少なくとも40％である、配列番 号：22とのアミノ酸配列同一性が少なくとも44％である、またはその組合せを有 するポリペプチドを意味する。 「DAF-11ポリペプチド」とは、C.エレガンスのdaf-11変異を相補する（上記の ように）、および／または配列番号：75とのアミノ酸配列同一性が少なくとも40 ％である、配列番号：76とのアミノ酸配列同一性が少なくとも43％である、配列 番号：77とのアミノ酸配列同一性が少なくとも36％である、配列番号；78とのア ミノ酸配列同一性が少なくとも65％である、またはその組合せを有するポリペプ チドを意味する。 「DAF-12ポリペプチド」とは、C.エレガンスのdaf-12変異を相補する（上記の ように）、および／または配列番号：72とのアミノ酸配列同一性が少なくとも42 ％である、配列番号：73とのアミノ酸配列同一性が少なくとも58％である、配列 番号：74とのアミノ酸配列同一性が少なくとも34％である、またはその組合せを 有するポリペプチドを意味する。 「DAF-14ポリペプチド」とは、C.エレガンスのdaf-14変異を相補する（上記の ように）、および／または配列番号：68とのアミノ酸配列同一性が少なくとも48 ％である、配列番号：69とのアミノ酸配列同一性が少なくとも37％である、配列 番号：70とのアミノ酸配列同一性が少なくとも48％である、配列番号：71とのア ミノ酸配列同一性が少なくとも37％である、またはその組合せを有するポリペプ チドを意味する。 「インスリン受容体活性」とは、インスリン受容体によって示される活性であ って、（i）インスリン受容体基質-1（IRS-1）の燐酸化の活性化およびPI-3キナ ーゼの動員、（ii）細胞膜とのグルコース輸送体（Glut 4）融合の活性化および 同時にグルコース取り込みの活性化、または（iii）グリコーゲンおよび／また は脂肪合成を活性化と同時に糖新生、脂質溶解、もしくはその双方の阻害、のい ずれかによって測定される活性を意味する。 「インスリン受容体関連活性」とは、インスリン受容体に直接起因しないが、 IRS-1燐酸化の活性化およびPI3-キナーゼの動員によって測定される活性を意味 する。 「IGF-1受容体活性」とは、インスリン様増殖因子-1受容体によって示される 活性であって、（i）IRS-1燐酸化の活性化およびPI-3キナーゼの動員、（ii）NI H3T3細胞における細胞分裂の活性化（例えば、グロンボルグら（Gronborg）、J ．B iol．Chem．268：23435〜23440、1993）、または（iii）例えば、マウスモデル における骨増殖の活性化、によって測定される活性を意味する。 「SMAD蛋白質」とは、TGF-βタイプのセリン／トレオニン受容体にカップリン グすることができる蛋白質を意味する。Smad蛋白質は典型的に、デリンクら（De rynk、Cell 87：173、1996）によって記述されたsmad保存モチーフを含む。例と してのsmad蛋白質は、DAF-3、MADR-2、MAD、DPC-4、およびSma-2を含むがこれら に限定しない。 「AKT活性」とは、AKTポリペプチドによって示される活性であって、フォスフ ァチジルイノシトールによって調節されたGSK-3のセリン燐酸化の増加、またはC .エレガンスのakt変異体における非ダウア的増殖の活性化によって測定される活 性を意味する。 「耐糖能障害疾患（impaird glucose tolerance condition）」とは、血糖値 が不適当に上昇した、または正常な代謝調節を欠損する疾患を意味する。そのよ うな疾患の例は、I型糖尿病、II型糖尿病、および妊娠性糖尿病を含むがこれら に限定されず、肥満およびアテローム性動脈硬化症に関連するものであってもよ い。 「蛋白質」または「ポリペプチド」とは、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グ リコシル化もしくは燐酸化）によらず、アミノ酸の鎖を意味する。 「実質的に純粋」とは、関係化合物、例えばDAF-2、DAF-3、もしくはDAF-16ポ リペプチドまたはDAF-2、DAF-3、もしくはDAF-16特異的抗体のような本発明のポ リペプチドの重量（乾燥重量）の少なくとも60％である調製物を意味する。好ま しくは、調製物は関係化合物の重量の少なくとも75％、より好ましくは少なくと も90％、および最も好ましくは少なくとも99％である。純度は適当な方法、例え ば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC 分析によって測定することができる。 「単離DNA」とは、それが由来する生物の天然に存在するゲノムにおいて直ち に隣接している（一方は5'末端およびもう一方は3'末端で）コード配列の両側で 直ちに隣接していないDNAを意味する。従ってこの用語は、例えば、ベクター； 自己複製するプラスミドもしくはウイルス；または原核生物もしくは真核生物の ゲノムDNAに組み入れられる、または他の配列とは無関係な独立した分子として 存在す る（例えば、PCRまたは制限エンドヌクレアーゼ処置によって生じたcDNAまたは ゲノムDNA断片）組換え型DNAを含む。同様に、さらなるポリペプチド配列をコー ドするハイブリッド遺伝子の一部である組換え型DNAも含まれる。 「実質的に同一」なポリペプチド配列とは、保存的アミノ酸置換、例えば同じ クラスの別のアミノ酸を１つのアミノ酸に置換（例えば、グリシンをバリンに、 リジンをアルギニンに置換等）、またはポリペプチドの機能を破壊しない（例え ば、本明細書に記述のようにアッセイする）アミノ酸配列の位置に存在する１つ 以上の非保存的置換、欠失、もしくは挿入によって異なるに過ぎないアミノ酸配 列を意味する。 好ましくは、そのような配列は、比較のために用いられる配列とアミノ酸レベ ルで少なくとも75％、より好ましくは85％、および最も好ましくは95％同一であ る。 相同性は典型的に、配列分析ソフトウェア（例えば、ウィスコンシン大学バイ オテクノロジーセンター、遺伝子コンピューターグループの配列分析ソフトウェ アパッケージ、1710 University Avenue，Madison，WI 53705、または国立医学 図書館から入手できるBLASTソフトウェア）を用いて測定する。有用なソフトウ ェアの例には、プログラムパイルアップ＆プリティボックス（Pileup and Prett yBox）が含まれる。そのようなソフトウェアは様々な置換、欠失、置換およびそ の他の修飾に対して相同性の程度を割付することによって類似の配列をマッチさ せる。保存的置換は典型的に、以下のグループ内での置換を含む：グリシン、ア ラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、ア スパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフ ェニルアラニン、チロシン。 「実質的に同一な」核酸とは、保存的アミノ酸置換、例えば同じクラスのもう 一つのアミノ酸を１つのアミノ酸に置換、またはポリペプチドの機能を破壊しな い（例えば、本明細書に記述のようにアッセイする）アミノ酸配列の位置での１ つ以上の非保存的置換、欠失または挿入によって異なるに過ぎないポリペプチド をコードする核酸配列を意味する。好ましくはコードされる配列は、アミノ酸レ ベルで比較配列と少なくとも75％、より好ましくは85％、および最も好ましくは 95％同一である。核酸配列を比較した場合に「実質的に同一な」核酸配列は、比 較配列と少なくとも85％、より好ましくは90％、および最も好ましくは95％同一 である配列である。核酸配列比較の長さは一般に、少なくとも50ヌクレオチド、 好ましくは少なくとも60ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも75ヌクレオチ ド、および最も好ましくは110ヌクレオチドであろう。この場合も、相同性は典 型的に、配列分析ソフトウェア（例えば、ウィスコンシン大学バイオテクノロジ ーセンターの遺伝子コンピューターグループの配列分析ソフトウェアパッケージ 、1710 University Avenue，Madison，WI 53705）を用いて測定される。 「発現する位置に存在する」とは、DNA分子が配列の転写および翻訳を指向す るDNA配列に隣接して位置することを意味する（すなわち、DAF-2、DAF-3、およ びDAF-16およびそのヒト相同体を含むがこれらに限定しない本明細書に開示のポ リペプチドの産生を促進する）。 「精製抗体」とは、それが天然で会合する蛋白質および天然に存在する有機分 子を含まない、重量で少なくとも60％である抗体を意味する。好ましくは調製物 は抗体の重量の少なくとも75％、より好ましくは少なくとも90％、および最も好 ましくは少なくとも99％である。 「特異的に結合する」とは、本発明のポリペプチド（例えば、DAF-2、DFA-3、 およびDAF-16）を認識して結合するが、本発明のポリペプチドを天然に含む試料 中（例えば生体試料）に存在する他の分子を実質的に認識して結合しない抗体を 意味する。そのようなポリペプチドに「特異的に結合する」抗体は、当技術分野 において利用できる標準的な免疫学的技法（例えば、ウェスタンブロットまたは 免疫沈降）の１つ以上を用いて、そのような生体試料に存在する蛋白質産物を十 分検出することができる。 「免疫学的方法」とは、ウェスタンブロット、免疫沈降、ならびに直接および 競合的ELISAおよびRIA技法を含むがこれらに限定しない、抗体に基づく検出技法 を含むアッセイを意味する。 「検出手段」とは、関係する検出事象を十分に示す一つまたは一連の成分を意 味する。そのような手段は、放射活性、蛍光および化学発光標識を含むがこれら に限定しない、アッセイされるまたは観察される少なくとも１つの標識を含む。 「ハイブリダイゼーション技法」とは、DNA-DNA、RNA-RNA、およびDNA-RNA相 互作用を含む、核酸鎖の間の特異的相互作用（相補性に基づく）を含む検出アッ セイを意味する。そのようなハイブリダイゼーション技法は、必要に応じてPCR 増幅段階を含んでもよい。 本明細書において用いられる「調節化合物」とは、DAF-3およびDAF-16発現を 減少させる（すなわち転写、翻訳、もしくは翻訳後のレベルで）、またはDAF-3 およびDAF-16蛋白質レベルもしくは活性を減少させることができる化合物を意味 する。同様にDAF-1、DAF-2、DAF-4、DAF-8、DAF-7、DAF-11、DAF-14、AGE-1およ びAKT発現を増加させる（すなわち、転写、翻訳、もしくは翻訳後のレベルで） 、またはDAF-1、DAF-2、DAF-4、DAF-8、DAF-7、DAF-11、DAF-14、AGE-1、および AKT蛋白質レベルもしくはそれらの対応する活性を増加させることができる化合 物が含まれる。 「相補性」とは、遺伝子欠損または変異の改善を意味する。一つの例において 、daf、age、またはakt遺伝子における遺伝子欠損の相補は、野生型のdaf、age 、またはakt遺伝子をそれぞれ提供することによって行うことができる。相補性 は一般に、変異体または遺伝子の不活化型を有する宿主細胞または動物において 蛋白質の野生型を発現させることによって得られる。 本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および請求の範囲から 明らかとなると思われる。 詳細な説明 まず図面の説明を行う。図 図１は、C.エレガンス（C．elegans）のdaf-2の遺伝子および物理的マップを 示す。上段は、daf-2の遺伝子マップを示す。daf-2は染色体IIIの左のアーム上 で、dpy-1の右から11.4マップ単位およびben-1の左から1.6マップ単位（ACeDB） の位置に存在する。中央のパネルはdaf-2の物理的マップを示す。daf-2は、コス ミドクローンではカバーされないがYAC Y53G8によってカバーされる領域におけ るmgP34およびmgP44の間に位置する。おおよそdaf-2遺伝子の位置をカバーする コスミドは、C.エレガンス株Bristol N2とBergerac RC301の間のRFLPを検出する 。コ スミドT21A6上のmpP31はHind III RFLPである：Bristolでは5.3kb、RC301では4. 5kb。コスミドT02B2上のmgP33はHind III RFLPである：Bristolでは9kb、RC301 では８kb。コスミドR10F2上のmpP34はEco RI RFLPである：Bristolでは4.1およ び2.8kb、RC301では3.6kb。コスミドR07G11上のmgP44は、複雑なEcoRI RFLPであ る：Brisrolでは2.9kb、2.4kb、1.9kb、および1.7kb；RC301では3.6kb、2.5kb、 および1.6kb。コスミドT10D5上のmgP35はStyI RFLPである：Bristolでは5.4kb、 RC301では5.8kb。コスミドC42B8上のmgP32はStyI RFLPである：Bristolでは2.8k b、RC301では2.9kbである。daf-2プローブ（ヌクレオチド1277〜2126および3747 〜4650）によって検出されるmgP48はHind III RFLPである：Brisrolでは4.3kbお よび7kb、およびRC301では4.1kbおよび6.2kb。mgP34のRC301対立遺伝子を有する のはDpy-non-Daf組換え体33個のうち31個であるが、この区間の組換え体33個全 てが、mgP34の右およびmgP44の左のdaf-2 0.69マップ単位に位置するmgP44のRC3 01対立遺伝子を有する。Ben-non-Daf組換え体24個のうち14個はRC301 mgP44対立 遺伝子を有するが、これらの組換え体の全てがmgP44の左daf-2 0.66マップ単位 に位置するmgP34のRC301対立遺伝子を有する。 Y53G8 YAC DNAは、アウスベルら（Ausubel、「分子生物学の現在のプロトコル （Current Protocols in Molecular Biology）」、John Wiley & Sons Inc.,、 ニューヨーク、ニューヨーク州、1990）が記述したようにCHEFゲルから単離して 、標識し、mgP34およびmgP44を有するコスミドからの多数の制限断片とハイブリ ダイズすることが示されている。Y53G8上のインスリン受容体相同体からのプロ ーブはN2とRC301の間のmgP48 RFLPを検出する。上記のDpy-non-Daf 33個全て、 およびBen-non-Daf組換え体24個全てが、mgP48のRC301対立遺伝子を有し、この ことは、13個のマップ単位の範囲におけるこれらの57の組換え事象によってこの インスリン受容体遺伝子からdaf-2を分離できないことを示している。 下のパネルはdaf-2のcDNAの構造を示す。daf-2のcDNAは標準的な方法に従って 構築されたcDNAライブラリからゲノムショットガン配列に由来する内部プライマ ー、ベクター配列プライマー（3'末端用）およびSL1トランススプライシングさ れたリーダーPCRプライマー、を用いたPCRによって増幅する（クラウゼ（M．Kra use）、「細胞生物学の方法（Methods Cell Biology）」、48巻、483〜512頁、 エプ スタイン＆シェークス（H.F．Epstein and D．C．Shakes）編、Academic Press 、サンジエゴ、カリフォルニア州、1995）。cDNAを単離するために、107クロー ン複雑度cDNAライブラリの106クローンからのプールしたプラスミドDNAをPCRの 鋳型として用いた。daf-2 cDNAの3'末端を得るために、キナーゼドメインにおい てdaf-2内部プライマーCGCTACGGCAAAAAAGTGAA（配列番号：1）およびクローニン グベクタープライマーCGATGATGAAGATACCCC（配列番号：2）を、隣接する内部プ ライマーと共にネステッド（nested）PCR反応において用いた。リガンド結合ド メインからキナーゼドメインへのcDNA断片に関しては、TGATGCGAACGGCGATCGAT（ 配列番号：3）およびACGCTGGATCATCTACATTA（配列番号：4）プライマーを用いて PCRを行った。daf-2の5'末端を得るために、SL 1プライマーGGTTTAATTACCCAAGTT TGAG（配列番号：5）および一つの内部daf-2プライマーGCTCACGGGTCACACAACGA（ 配列番号：6）を、隣接する内部プライマーと共にネステッドPCR反応において用 いた。一組のdaf-2変異体20個からのゲノムDNAを増幅するPCRを用いて、本発明 者らは、リガンド結合ドメインの0.8kb領域およびキナーゼドメインの0.9kb領域 におけるdaf-2変異を探索した。リガンド結合ドメインをシークエンシングする ために、PCRプライマーTGATGCGAACGGCGATCGAT（配列番号：7）およびTGAGGGCCAA CTAAAGAAGAC（配列番号：8）を用いた。キナーゼドメインでは、プライマーCGCT ACGGCAAAAAAGTGAA（配列番号：9）およびGACGATCCCGAGGTGAGTAT(配列番号：10) を用いた。SL 1スプライシングされたリーダー配列が存在すれば、これが全長の daf-2cDNAであることを示している。予想されるORFを長い箱の形で示す；5'およ び3’UTRは太い棒で示す。486塩基における予想されるDAF-2イニシエーターであ るメチオニンの63塩基上流にはインフレームの停止コドンが存在する。予想され るDAF-2停止コドンは5658塩基に存在する。コンセンサスポリアデニル化シグナ ルはcDNA、または302bpさらに下流に伸びるゲノムショットガン配列#00678にも 認められなかった。最初のインスリン受容体相同体ショットガン配列を長い箱の 上に細い棒として示す。 イントロンは、インシリコ（in silico）ゲノムおよびcDNA配列比較の組合せ によって、ならびにcDNAおよびゲノムDNA鋳型に由来するPCR産物の比較によって 検出した。垂直な棒の上の白い三角印は、検出されたエキソン／イントロン境界 部 の位置を示す。イントロンドナー部位は全てGTコンセンサスを有し、アクセプタ ー部位はAGコンセンサスを有する（クラウゼ（Krause）、1995、前記）。垂直な 棒のない三角印は、ゲノムDNAまたはcDNAを鋳型として用いたPCR産物の比較によ って決定したおおよそのイントロンの位置を示す。イントロンの長さはcDNAまた はゲノムDNA鋳型を用いてPCR産物の大きさを比較することによって推定した。イ ントロンのいくつかに対応するゲノム領域はPCRによって増幅することができず 、このことはこれらのイントロンが長いことを示唆している。この分析に基づく daf-2遺伝子の最少の大きさは33kbである。 図2Aは、C.エレガンスの予想されるDAF-2アミノ酸配列を示す。予想されるシ ステインリッチ領域（アミノ酸207〜372位）およびチロシンキナーゼドメイン（ アミノ酸1124〜1398位）を四角で囲む。シグナルペプチド（アミノ酸１〜20位） 、蛋白質溶解部位（アミノ酸806〜809位）、膜通過ドメイン（アミノ酸1062〜10 85位）、および膜近傍領域におけるPTB結合モチーフ（NPEY、アミノ酸1103〜110 6位）を下線で示す。インスリン受容体キナーゼY1158〜Y1163活性化ループに対 応する領域における３つのDAF-2チロシン残基、Y1293、Y1296およびY1297は、DA F-2とインスリン受容体燐酸化標的の間の予想される類似性に基づいて、自己燐 酸化される可能性がある（図2B）。同様に可能性があるDAF-2自己燐酸化の標的 は、インスリン受容体膜近傍領域NPEYモチーフ（Y972）に対応する領域に存在す るY1106 NPEYモチーフであり、これはそのPTBドメインを通じてインスリン受容 体とのIRS-1結合を媒介することが示されている（ホワイト＆カーン（White and Kahn）、J．Biol．Chem．269：1〜4、1994）。DAF-2はPI 3キナーゼとのカップ リングに関与するYXXMモチーフを１個有するが、哺乳類のIRS-1およびショウジ ョウバエ（Drosophila）のインスリン受容体（フェルナンデスら（Fernandez） 、EMBO J．14：3373〜3384、1995）は多数のYXXMモチーフを有する。p85様アダ プターサブユニットはC.エレガンスのデータベースにはまだ検出されていないが 、哺乳類のp110に対するAGE-1の相同性から、相同な、または類似のアダプター が存在することが示唆される（モリスら（Morris）、Nature 382：536〜539，19 96）。DAF-2のC-末端ドメインでは、他の２つのチロシン残基が自己燐酸化して 特定のSH2-含有蛋白質に結合する可能性がある：Y1678はPLC-gまたはSHP-2相同 体に結合し、Y1686は おそらくSEM-5に結合する（図2A）（ソンギャングら（Songyang）、Cell 72：76 7〜778、1993）。例えば、rasおよびMAPキナーゼにおける変異はダウアの構成的 変異またはダウアの欠損変異に関するスクリーニングでは同定されていないが、 これらの一般的なシグナル伝達経路蛋白質は、それらが脊椎動物においてインス リンのシグナル伝達にカップリングしているように、DAF-2にカップリングして いる可能性がある（ホワイト＆カーン（White and Kahn）、J．Biol．Chem.269 ：1〜4、1994）。膜近傍領域およびキナーゼドメイン活性化ループにおいて予想 されるホスホチロシン残基を丸で囲む。長いC末端領域において、予想されるホ スホチロシン残基もまた丸で囲み、SH2-結合部位を下線で示す（下記参照）。 図2Bは、C.エレガンスのDAF-2をコードするcDNAを示す。 図2Cは、C.エレガンスのDAF-2と、ヒトインスリン受容体およびヒトIGF-1受容 体（括弧内で示す）ならびにショウジョウバエ（Drosophila）のインスリン受容 体相同体のアミノ酸比較を示し、daf-2およびヒトインスリン受容体変異を強調 して示す。daf-2変異６個はリガンド結合ドメインに存在する：sa187（C347S、T GT〜AGT）、el368（S451L、TCA〜TTA）、el365（A458T、GCT〜ACT）、sa229（D5 26N、GAT〜AAT）、ならびにmg43における２つの変異（C279Y、TGT〜TAT、および P348L、CCC〜CTC）。３つのdaf-2変異により、インスリン受容体キナーゼドメイ ンにおいて保存的アミノ酸残基に置換されている：sa219（D1252N、GAT〜AAT） 、el391（P1312L、CCC〜CTC）、およびel370（P1343S、CCA〜TCA）。暗くした残 基はアミノ酸同一性を示す。網掛けをした残基はアミノ酸類似性を示す。ドメイ ンの下の百分率はDAF-2と各受容体との間に認められた同一性の百分率を表す。D AF-2と各蛋白質とのランダムなマッチングに関して対応するBLAST確率は6.4×10 4^-157（ヒトインスリン受容体）、2.7×104^-156（ヒトIGF-1受容体）、2.1×10^{- 153} （軟体動物のInR相同体）、8.3×10^-153（カのInR相同体）、1.6×10^-138（ ヒトインスリン受容体関連受容体）、1.7×10^-122（ショウジョウバエのInR相同 体）、2.0×10^-108（ヒドラのInR相同体）である。DAF-2は次いで最も近縁のキ ナーゼファミリーよりかけ離れている：8.9×10^-58（v-ros）および3.0×10^-51 （trkCニューロトロピン受容体）。 リガンド結合ドメイン（上）における保存されたシステイン残基を点で印をつ ける。キナーゼドメインでは、インスリン受容体キナーゼの特異性を媒介する活 性部位残基に星で印をつける。これらの残基は全てDAF-2において相同である。 ヒト患者において認められた変異を列の上に示し、daf-2対立遺伝子置換は対立 遺伝子の名前と共に下に示す。配列の配置はGCGプログラム、パイルアップ＆プ リティボックス（Pileup & PrettyBox）を用いて行い、同一性はGCGプログラムG apを用いて計算した。 図３は、C.エレガンスのdaf-2およびdaf-7による代謝コントロールを示す写真 である。上のパネルは、25℃で生育させてスーダン・ブラックで染色した野生型 L3動物には脂肪の蓄積が低レベルであることを示している。絶食していない動物 を１％パラホルムアルデヒドのPBS溶液で固定して、-70℃で凍結し、凍結融解を ３回繰り返した。固定した動物をPBSで３回洗浄した後、標準的な方法に従って １×スーダン・ブラック中で一晩インキュベートした。次のパネルは、非許容温 度25℃で生育させたdaf-2（el370）では脂肪の蓄積がより高いレベルであること を示す。これらの動物は腸および皮下細胞の双方に脂肪を蓄積した。daf-2(el37 0)動物を許容温度である15℃で発育させると、野生型のように低レベルの脂肪を 蓄積する（データは示していない）。次のパネルは25℃で生育させたdaf-7(el37 2)動物の腸および皮下には高レベルの脂肪が存在することを示す。下のパネルは 、L4期になるまで許容温度で生育させ、その後非許容温度にシフトさせたdaf-2 （el370）動物に脂肪が高レベル存在することを示す。これは、daf-2がダウア段 階に入ることなく代謝を調節することを示している。 図４は、C.エレガンスのダウア形成経路におけるインスリンシグナル伝達のモ デルを示す略図である。ダウアフェロモンの非存在下では、インスリン様リガン ドがDAF-2を活性化して、DAF-7 TGF-β様シグナルがDAF-1およびDAF-4受容体を 活性化する。活性化されたDAF-2は特定のチロシン残基を自己燐酸化して、PI 3- キナーゼ相同体（まだ同定されていないp85相同体とPI 3-キナーゼ触媒サブユニ ットAGE-1のヘテロダイマーとして）を含むシグナル伝達分子を動員する。AGE-1 PI 3-キナーゼはPIP3二次伝達物質を産生する。この二次伝達物質はグルコース 輸送（ホワイト＆カーン（White and Kahn）、1994、前記）、AKTおよびGSK-3を 含む代謝キナーゼカスケード（ヘミングス（Hemmings）、Science 226：1344〜1 345、1984；ジョナスら（Jonas）、Nature 385：343〜346、1997）、ならびに代 謝 遺伝子の転写および翻訳（ホワイト＆カーン（White and Kahn）、1994、前記） を調節する可能性がある。DAF-16は、この経路においてDAF-2およびAGE-1の下流 で作用し、それらによって負の調節を受ける（ボーウェルズ＆トーマス（Vowels and Thomas）、Genetics 130：105〜123、1992；ゴットリーブ＆ラブクン（Got tlieb and Luvkun）Genetics 137：107〜110、1994）。DAF-7/TGF-βおよびDAF- 2/インスリンシグナル伝達経路はいずれもダウア形成を制御するように集中する が、DAF-2経路のみが繁殖期の寿命を制御する。これはインスリン受容体シグナ ル伝達の先例から示唆されるようにDAF-2の非転写産物による可能性がある。DAF -7シグナル伝達産物は本明細書において記述するように転写に限られると予想さ れる。 図5Aは、C.エレガンスのdaf-3がX染色体のaex-3とunc-1の間の領域に遺伝的に マッピングされることを示している。この領域からのコスミドおよびプラスミド クローンを形質転換救出に関してアッセイした（メロら（Mello）、EMBO J 10： 3959〜3970、1991）。プラスミドpRF4（rol-6形質転換マーカー、100ng/ml）お よびコスミド（５〜６ng/ml）をdaf-7（el372）；daf-3（el376）動物の生殖腺 に注射した。トランスジェニック動物を25℃でのダウア形成に関して採点した； ダウア（すなわちdaf-7表現型への回帰）はdaf-3の救出を示す；daf-3を救出す るクローンを四角で囲む。B0217は、daf-3表現型を救出する；トランスジェニッ ク株19例中18例が救出された（ダウアの〜80％）。C.エレガンスのシークエンシ ング協会によって提供された配列を調べると、B0217上にSmad相同遺伝子が存在 することが判明した。Smadをまさに含むB0217の13kbのサブクローンもdaf-3を救 出する（図３参照）。領域B0504（７系列を調べて救出は＜１％であった）、お よびC05H10（10系列を調べて救出は＜１％であった）からの他のコスミドを注射 しても救出を認めなかった。mgDf90はdaf-の全てを除去する欠失である。 図5Bは、C.エレガンスのdaf-3コード領域の構造を示す。上はdaf-3のエキソン ／イントロン構造である；コードエキソンは黒い四角、非コード領域は白の四角 、そして線はイントロンである。daf-3 cDNAは定法に従って単離した。cDNA４つ を完全にシークエンシングした；そのN末端を垂直な線で示す。これらの３つのc DNAは〜400bpの3’UTRを含むが、ポリAテールは含まない；C.エレガンスのコン センサスポリアデニル化配列はcDNAの3'末端から12bpに認められる。このcDNAの 最も長いものは、それがメチオニンコドンを含み、ゲノム配列はその他のメチオ ニンコドンおよびインフレームの停止コドンの前の上流に推定スプライシング部 位を含まないことから、全長であるように思われる。daf-3の5'末端をさらに特 徴付けするために、ライブラリまたは個々のdaf-3 cDNAからのPCR産物をシーク エンシングした。cDNAライブラリから単離したDNAから、SL1および保存ドメイン Iにおける領域（プライマー1として示す）に対するプライマーによって産物を増 幅した。個々のcDNAに関してはcDNAベクターに対するプライマーおよびプライマ ー1で増幅した。これらのPCR産物をプライマー2から5'末端へとシークエンシン グしたところ、保存ドメインの上流でdaf-3の5'末端に別のスプライシングが存 在することを発見した。２つの別のスプライシング型を示し、個々のcDNAの末端 を垂直な線で示す。２番目は多くのC.エレガンスcDNAの5'末端に認められるトラ ンススプライシングされたリーダーSL1を有することに注目；このように、このc DNAはdaf-3の真の5'末端を示す。 図5Cは、Smad保存ドメインIおよびIIにおける、C.エレガンスのdaf-3および今 日までに発見された最も近縁の相同体であるヒトDPC4の蛋白質配列配置を示す。 点線は配置を最大にするために導入された空白を示す。DAF-3はドメインIにおい てDPC4と55％同一であり、ドメインIIにおいて30％同一である。daf-3（mg125） およびdaf-3（mg 132）変異は、太字および下線で示す。Smad変異のホットスポ ットを下線で示す。mg125およびmg132の他に他の７つのdaf-3対立遺伝子をホッ トスポットにおいてシークエンシングした；それらのいずれも変異を含まない。 シークエンシングした対立遺伝子はmg91、mg93、mg105、mg121、mg126、mg133（ コウィーク＆パターソン（Koweek and Patterson）によって単離された、未発表 ）およびsa205であった。 図6A〜6Gは、C.エレガンスのDAF-3およびDAF-4発現を示す写真のパネルである 。これらの写真は、DAPI蛍光と共に、または表記のようにノマルスキ光学写真と 共にGFP蛍光を示す。DAF-3の写真は全てL1動物の頭部でのDAF-3/GFP発現を示す 図6Aからの第二のプラスミドによる動物を示す。図6Bは、成虫動物の脊椎神経索 におけるDAF-3/GFP発現を示す。L1動物は同様の発現パターンを示した。図6Cは 、L 1動物の腸におけるDAF-3/GFP発現を示す。図6Dは、L4動物の遠位先端細胞におけ るDAF-3/GFP発現を示す。図6Eは、核約200個と共に胚芽におけるDAF-3/GFP発現 を示す。図6Fは、L1動物の頭部におけるDAF-4/GFP発現を図示する。図6Gは、L4 動物の背神経索および脊椎神経索におけるDAP-4/GFP発現を図示する。 図７は、daf-3プラスミドによるC.エレガンスdaf-7の救済能力および抑制を示 す表である。四角はdaf-3のSmad保存ドメインIおよびIIを表す；影付きの四角は 緑色蛍光蛋白質（GFP）を表す。示した全ての実験に関して、daf-3プラスミドを 10ng/mlの濃度で注射し、pRF4注射マーカーを90ng/mlの濃度で注射した。ダウア 形成を採点するために、トランスジェニック成虫動物を室温で数時間プレート上 に産卵させ、その後除去した。プレートを25℃で２日後に採点した。救出実験は 、融合蛋白質のそれぞれによるdaf-7(m62)；daf-3(el376)の救出を示す。回転性 非ダウアでは救出できないが、回転性ダウアではdaf-3の救出を認めた（daf-7表 現型）。pRF4形質転換マーカーおよび非救出コスミドによる列を対照とする。そ れぞれの構築物に関して、異なる２つの実験において４つ以上の株を測定した。 daf-7の発現を測定するために、トランスジェニック列をdaf-7に交差させ（プラ スミド１および３）、またはdaf-7の中に直接注射することによって作製した（ プラスミド２）。トランスジェニック（回転性）動物を、daf-7の抑制（＝非ダ ウア）またはdaf-7を抑制できないこと（＝ダウア）に関して採点した。対照はp RF4マーカーおよび無関係なGFP発現トランスジーンを有する株の２列である。 図8Aは、DAF-3/GFPが分裂中期染色体に関連することを示す写真である。固定 したL1動物を抗GFP抗体および抗α-チューブリン抗体で免疫染色した。DAPI染色 によってDNAを可視化した。 図8Bは、切断されたC.エレガンスのdaf-3/GFP蛋白質が核に多く存在すること を示す写真である。野生型動物に図７に示すような切断した構築物を10ng/mlの 濃度で注射した。pRF4形質転換マーカーを100ng/mlで注射した。写真は後期L1ま たは初期L2動物を示し、daf-3は核に多く存在することを示す。いくつかの核の 中心部にある明確な点は核小体で、これはdaf-3/GFPを有しない。頭頸部神経お よび皮下細胞と共に、脊髄神経索、腸細胞、および遠位末端細胞（全て示す）を 含むこれらの動物における全ての細胞は、核のdaf-3/GFPを多く有する。 図9Aおよび9Bは、ダウア形成におけるC.エレガンスdaf-3/DAF-8/DAF-14 Smad 蛋白質の役割を示すモデルである。図9Aは、ダウアの繁殖的生育誘導を示す。図 9Bは、繁殖的ダウア生育誘導を示す。 図10は、C.エレガンスのダウア形成を調節する遺伝子経路を示す略図である。 図11A〜11Cは、多様にスプライシングされたC.エレガンスdaf-3転写物のcDNA 配列を示す（配列番号：39、52、および53）。 図12A〜12Cは、C.エレガンスDAF-3ポリペプチドイソ型のアミノ酸配列を示す （配列番号：40〜42）。 図13Aおよび13Bは、多様にスプライシングされたC.エレガンスdaf-16転写物の cDNA配列を示す（配列番号：43および44）。 図14Aおよび14Bは、C.エレガンスDAF-16ポリペプチドイソ型のアミノ酸配列を 示す（配列番号：45および46）。 図15は、C.エレガンスage-1遺伝子のcDNA配列を示す（配列番号：47）。 図16は、C.エレガンスAGE-1ポリペプチドのアミノ酸配列を示す（配列番号：4 8）。 図17は、TGF-βおよびインスリンシグナル伝達が１点に集中してグルコースに 基づく代謝遺伝子を活性化することを示す略図である。 図18は、DAF-7およびDAF-2シグナルの非存在下における脂肪に基づく代謝への 切り替えを図示する略図である（フェルモン（phermone）の場合）。 図19は、インスリンシグナル伝達の欠損を改善するために薬剤によるDAF-16経 路の阻害を示す略図である。 図20は、DAF-7シグナル伝達の欠損を改善するために薬剤によるDAF-3の阻害を 示す略図である（例えば、肥満に基づく糖尿病の場合）。 図21Aは、ヒトFKHRおよびAFXがDAF-16に最も近縁であることを示す図である。 多様にスプライシングされたDAF-16フォーク状ドメインは相同性がより低いこと に留意されたい。 図21Bは、DAF-16が他のフォーク状蛋白質よりFKHRおよびAFXにはるかに近縁で あることを示す、フォーク状ファミリーの系図を示す図である。 図22は、daf-3のように、daf-16が標的組織において発現されることを示す写 真 である。これはDAF-3およびDAF-16が相互作用することができるモデルを支持す る。 図23は、DAF-7蛋白質による肥満誘発糖尿病の治療のモデルを示す図である。 図24は、sup(mg144)のAKT遺伝子領域への遺伝子マッピングを示す図である。 図25は、C.エレガンスのAKTと哺乳類AKTとの比較を示す図である。 図26Aは、daf-2ダウアにおけるAKT：GFPの発現を示す写真である。 図26Bは、N2成虫におけるAKT：GFPの発現を示す写真である。 図27は、daf-16の分子マップを示す略図である。 図28は、C.エレガンスのインスリン様分子（配列番号：117〜124）とヒトイン スリン（配列番号：125）およびコンセンサスモチーフとの相同性を示すグラフ である。 図29は、インスリンスーパーファミリーメンバー（配列番号：126〜153）のPR ETTYBOX分析を示すグラフである。 図30は、インスリンスーパーファミリーメンバーのPILEUP分析を示すグラフで ある。 図31は、akt-1領域を示す図である。上段にakt-1の遺伝子および物理的マップ を示す。akt-1は、コスミドC12D8に含まれる。下段にakt-1のエキソン／イント ロン構造を示す。コード領域は黒い四角、非コード領域は白い四角、およびイン トロンは線である。プレックストリン（pleckstrin）相同性ドメインは、斜線を つけた箱で示す（ムサッキオら（Musacchio）、Trends Biochem．Sci．18：343 〜348、1993）。キナーゼドメインを灰色で示す（ハンクス＆ハンター（Hanks a nd Hunter）、「蛋白質キナーゼの実際に関する本蛋白質セリンキナーゼ（The P rotein Kinase Facts Book Protein-Serine Kinases）」、ハーディー＆ハンク ス（Hardie，G．and Hanks，S.）編、Academic Press，Inc.，サンジエゴ、カリ フォルニア州、7〜47頁、1995）。akt-1a遺伝子構造は、cDNAのシークエンシン グによって確認した。akt-1b遺伝子構造は、エキソン５〜７のスプライシングお よび3’UTRのみを確認した部分的cDNA配列に基づいて導出した。 図32は、akt-2領域を示す図である。上にakt-2領域の遺伝子および物理的マッ プを示す。akt-2は、コスミドR03E1上に含まれる。下にakt-2のエキソン／イン ト ロン構造を示す。印は全て図31と同じである。遺伝子構造は、エキソン２〜８お よび3’UTRを確認したcDNAのシークエンシングによって導出した；ジーンファイ ンダー（Genefinder、ワシントン大学）はエキソン１を予測する。 図33は、Akt/PKBおよびPKC蛋白質キナーゼファミリーの系図（dendogram）を 示すグラフである。Pileup（GCG）を用いて表示の蛋白質の全コード配列を配置 した。C.エレガンスの蛋白質を「Ce」で表し、ラットは「r」、ヒトは「h」、マ ウスは「m」、ウシは「b」、およびD.メラノガスター（D．melanogasier）を「D 」で表す。Pileupに用いた蛋白質の寄託番号を括弧内に示す：CePKC2a（U82935 ）、rPKCβ1（M19007）、hAkt/PKBα（M63167）、mAkt/PKB（M94335）、bAkt/PK B（X61036）、hAkt/PKBβ2（M95936）、rAkt/PKBγ（D49836）、Dakt1（Z26242 ）。系図を完成させるために、rPKCβ1（akt-1aおよびhAkt/PKBαの双方に対し て最も近縁の非Akt/PKB相同体）、およびCePKC2a（rPKCβ1に対して最も近縁のC .エレガンス相同体）をPileupに含めた。本報告書において記述したAkt/PKB相同 体を灰色の四角で示す。 図34は、AKT-1a（配列番号：154）、AKT-1b（配列番号：155）、AKT-2（配列 番号：156）、およびヒトAkt/PKBα（M63167）（配列番号：157）のPILEUP（GCG ）分析を示すグラフである。同一残基を点で示し、配列を配置するために導入し た空白をダッシュで示す。プレックストリン相同性ドメイン（ムサッキオら（Mu sacchio）、Trends Biochem．Sci．18：343〜348、1993）をN末端の灰色の領域 で示し、キナーゼドメイン（ハンクス＆ハンター（Hanks and Hunter）、「蛋白 質キナーゼの実際に関する本蛋白質セリンキナーゼ（The Protein Kinase Facts Book Protein-Serine Kinases）」、ハーディー＆ハンクス（Hardie，G．and H anks，S.）編、Academic Press，Inc.，サンジエゴ、カリフォルニア州、7〜47 頁、1995）は、C-末端の灰色の領域によって示す。mg144 Ala183トレオニン置換 を上記のAKT-1a配列の上にTとして示す。hAkt/PKBαThr 308およびSer 473燐酸 化部位に対応するAkt-1およびAKT-2燐酸化部位（アレッシら（Alessi）、EMBO J ．15：6541〜6551、1996）は、燐酸化されているアミノ酸残基の上に点として示 す。 図35Aおよび35Bは、pdk-1のゲノム配列を示す（配列番号：158）。 図36は、pdk-1aのアミノ酸配列を示す（配列番号：159）。 図37は、pdk-1bのアミノ酸配列を示す（配列番号：160）。DAF-2 インスリン受容体ファミリーメンバーはC.エレガンス（C．elegans）の寿 命および休眠を調節する C.エレガンスのダウア（dauer）段階での停止は通常、ダウア誘発フェロモン を知覚神経が検出し、複雑な経路によって生殖系列、腸および外胚葉のような、 再形成されて代謝的にシフトする標的組織にシグナルを伝達することによって誘 発される（リドル（Riddle）、「シーエレガンス（Caenorhabiditis elegans）I I」、リドル、ブルメンタール、メイヤー、プリース（D．Riddle，T．Blumentha l，B．Meyer，J．Priess）編、Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring H arbor、ニューヨーク、1997、739〜768頁、ケニオン（Kenyon）、前掲書中、791 〜813頁）。ダウア段階で停止する、またはフェロモン調節とは無関係に繁殖ラ イフサイクルに入るdaf変異体の遺伝子エピスタシス分析により、ダウア変態の 異なる局面を調節する平行した遺伝子経路が存在することが明らかになった（ボ ーウェルズ＆トーマス（Vowels and Thomas）、Genetics 130：105〜123、1992 ；ゴットリーブ＆ルブクン（Gottlieb and Luvkun）、Genetics 137：107〜120 、1994）。daf-2を含む経路は、それが繁殖的生育および正常な老化の双方を制 御するという点において独自である：daf-2変異体動物は、ダウア幼虫の段階で 生育を停止し、寿命は劇的に増加する（表１）（リドル（Riddle）、「シーエレ ガンス（Caenorhabiditis elegans）II」、リドル、ブルメンタール、メイヤー 、プリース（D．Riddle，T．Blumenthal，B．Meyer，J．Priess）編、Cold Spri ng Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor、ニューヨーク、1997、739〜768頁 、ケニオン（Kenyon）、前掲書中、791〜813頁；ボーウェルズ＆トーマス（Vowe ls and Thomas）、Genetics 130：105〜123、1992；ゴットリーブ＆ルブクン（G ottlieb and Luvkun）、Genetics 137：107〜120、1994；ラーセンら（Larsen） 、Genetics 139：1567〜1583、1995；ケニオンら（Kenyon）、Nature 366：461 〜461、1993；ドーマンら（Dorman）、Genetics 141：1399〜1406、1995）。 表Iはdaf-2対立遺伝子および関連する変異のダウア形成の割合を示す。15℃で 生育させた（０日）動物からの卵を15、20、または25℃でインキュベートした。 括弧内の数値は計数した動物数である。野生型動物およびダウアの数を３日目（ 20℃および25℃）または５日目（15℃）に計数した。星印をつけたほとんどのダ ウアは４日まで（25℃でsa229）、または（sa229）および15℃でのsa219、20℃ でのel368およびsg219、ならびに25℃でのel365およびel368）では８日までに回 復した。mg43は以下のように調べた：dpy1(el)daf-2(mg43)；SDP3動物を、若い 成虫段階になるまで20℃で成育させた。成虫５匹からの卵を15℃または20℃にし て、同じ温度で生育させた。Dpy-Daf動物およびDpy-non-Daf動物の数を３日目（ 20℃）または５日目（15℃）に計数した。Sg187およびsg229も同様に、マロン＆ トーマスの方法によって調べた（Malonc and Thomas、Genetics 136：879〜886 、1994）。 表I daf-2対立遺伝子のダウア形成率 目に見える遺伝子マーカーおよび制限断片長多型（RFLP）の双方を用いた遺伝 子マッピングにより、daf-2はmgP34とmgP44の間に存在する（図１）。この物理 的遺伝子領域をコスミドは完全にカバーしていないが、YAC Y53G8は、daf-2に隣 接するmgP34およびmgP44を含むゲノム領域を有する（図１）。C.エレガンスゲノ ムのシークエンシング作業における１段階として、Y53G8に由来するランダムM13 サブクローンをゲノムシークエンシングセンターによってシークエンシングした 。配列同一性から、DAF-2がインスリン様リガンドに結合してチロシン残基を燐酸 化する可能性があることが示される DAF-2をコードするアミノ酸配列およびヌクレオチド配列をそれぞれ、図2Aお よび2Bに示す。翻訳されたY53G8 M13サブクローン配列570個をゲンバンク蛋白質 デ ータベースと比較するBLASTXを用いて、哺乳類のインスリン受容体ファミリーと 相同な４つの配列を発見した。インスリン受容体は、インスリンが脊椎動物の生 育および代謝を調節すること（ホワイト＆カーン（White and Kahn）、J．Biol ．Chem．269：１〜４、1994）およびフォスファチジルイノシトール（PI）3-キ ナーゼがインスリン受容体およびdaf-2経路の双方において作用することが示さ れていることから（ホワイト＆カーン（White and Kahn）、J．Biol．Chem．269 ：１〜４、1994；モリスら（Morris）、Nature 382：536〜539、1996）、良好な daf-2候補遺伝子であった。遺伝子に多数のdaf-2変異が検出されること（下記参 照）およびこのインスリン受容体相同体の遺伝子の位置がdaf-2と一致すること （図2C）から、このインスリン受容体相同体がdaf-2に対応することが確立され る。 daf-2転写単位および遺伝子構造は、daf-2ゲノムおよびcDNA領域を増幅するた めにdaf-2ゲノムサブクローン配列に由来するPCRプライマーを用いて決定した。 おそらく全長のdaf-2 cDNAは5172塩基のオープンリーディングフレーム、485塩 基の5'UTRおよび159塩基の3’UTR（図１、2A）を有する。予想されるDAF-2蛋白 質はインスリン受容体ファミリーと長い配列同一領域を示す。全蛋白質に対して 、DAF-2はヒトインスリン受容体と35％同一であり（エビナら（Ebina）、Cell 4 0：747〜58、1985；ウルリッチら（Ullrich）、Nature 313：756〜61、1985）、 ヒトIGF-1受容体と34％同一（ウルリッチら（Ullrich）、EMBO J．：5、2503〜1 2、1986）、およびヒトインスリン受容体関連受容体と33％同一である（シアー ＆ワット（Shier and Watt）、J．Biol．Chem．264：14605〜8、1989）。DAF-2 は、90MbのC.エレガンスゲノム配列（約90％完全）または10MbのC.エレガンスの EST配列データベースにおける唯一のインスリン受容体ファミリーメンバーであ る。DAF-2はインスリン、IGF-1およびインスリン受容体関連受容体とは等しくか け離れているため、DAF-2はおそらくこれらの重複して解離した受容体の祖先の 相同体であり、このためこれらの哺乳類受容体の機能の一部または全てに役立つ 可能性がある（下記参照）。これらの受容体のように、DAF-2は、推定のシグナ ルペプチド、推定のリガンド結合ドメインにおけるシステインリッチ領域、推定 の蛋白質溶解部位、膜通過ドメインおよびチロシンキナーゼドメインを有する。 さらに、DAF-2は哺乳類のインスリン受容体基質-1（IRS-1）と類似の機能を有す る可能性が あるC-末端領域を有する（図２；ホワイト＆カ一ン（White and Kahn）、J．Bio l．Chem．269：１〜４、1994）。 インスリン受容体のアミノ酸約500個のリガンド結合ドメインにおいて、DAF-2 はインスリン受容体と36％同一であり、IGF-1受容体と35％同一である。このド メインにおいて系統発生的に保存されたシステイン残基23個中21個はDAF-2にお いて保存されている（図2C）。DAF-2システインリッチ領域はヒトインスリン受 容体と34％同一で、IGF-1受容体と28％同一である。このドメインにはdaf-2変異 が６個存在する（図2C、表I）。mg43およびsal87変異はシステインリッチ領域に おいて保存残基を置換している（図2C）。daf-2(mg43)は保存残基を置換する２ つの変異を有し、これによってこの対立遺伝子の強さが説明されるであろう（条 件付きでない、表I）。非保存残基でのその他の置換はそれほど重度の表現型を 生じない（表I）。ヒトインスリン受容体遺伝子のこのリガンド結合ドメインに 変異を有するインスリン抵抗性の糖尿病患者が確認されている（テイラー（Tayl or）、Diabetes 41：1473〜1490、1992）（下記参照）。これらの変異は細胞表 面への受容体の輸送、インスリン結合親和性、またはその双方を欠損させる。こ のドメインにおけるDAF-2変異は、同様に受容体のシグナル伝達を減少させて、 ダウア段階で停止させる可能性がある。 インスリン受容体は、単一の前駆体蛋白質から蛋白質溶解的にプロセシングさ れたα2、β2４量体である（ホワイト＆カーン（White and Kahn）、J．Biol．C hem．269：１〜４、1994）。DAF-2はインスリン受容体プロセシング部位（RVRR8 06〜809）と類似の位置でおそらくプロテアーゼ認識部位を有する（ヨシマサら （Yoshimasa）、J．Biol．Chem．265：17230〜17237、1990）。 アミノ酸275個のDAF-2チロシンキナーゼドメインは、ヒトインスリン受容体キ ナーゼドメインと70％類似で50％同一である。インスリンが結合すると、インス リン受容体の細胞内チロシンキナーゼドメインが、IRS-1上と共に、細胞内ドメ インにおける特徴的な（signature）アミノ酸残基（上流の酸性アミノ酸および 下流の疎水性アミノ酸）（ソンギャング＆カントレー（Songyang and Cantley） 、Trends Biochem．Sci．20：470〜475、1995）に隣接する特定のチロシン残基 を燐酸化する（ホワイト＆カーン（White and Kahn）、J．Biol．Chem．269：１ 〜４、 1994）。これらの配列では、インスリン受容体活性化ループと類似の領域におけ るチロシン３個および上記のように膜近傍領域における１個を含む、多数のDAF- 2チロシン残基が自己燐酸化標的である可能性が高い（図2C）。その活性化ルー プに結合したインスリン受容体キナーゼドメインの結晶構造に基づいて、８個の キナーゼドメイン残基が標的部位特異性を媒介する（ハバードら（Hubbard）、N ature 372：746〜751、1994）。DAF-2ではこれらの残基は不変であるか（5/8） 、または類似のアミノ酸（3/8、KをRに、EをDに）置換されており（しかしこれ より遠縁の受容体キナーゼではこのようなことは起こらない）、このことはDAF- 2がインスリン受容体キナーゼとして同じ標的チロシンモチーフを燐酸化するこ とを示唆している。 ３つのdaf-2ミスセンス変異はキナーゼドメインにおける保存されたアミノ酸 残基を置換する（図2C、表I）。３つの変異は全て中等度から強いダウア構成的 表現型を引き起こすが、いずれも非条件付き対立遺伝子、例えばmg43ほど強くな い（表I）。ヒトインスリン受容体のキナーゼドメインに変異があれば、キナー ゼ活性は低下し、重度のインスリン抵抗性および関連する欠損を生じる（図2C； テイラー（Taylor）、Diabetes 41：1473〜1490、1992）。特に、ヒト糖尿病性 インスリン抵抗性患者はdaf-2(el391)と同じアミノ酸置換（P1178L）を有する（ キムら（Kim）、Diabetologia 35：261〜266、1992）。この患者はこの置換に関 してヘテロ接合であることが報告された。daf-2(el391)は高浸透度の劣性変異で あるため、優性ではない（表I）。 daf-2（el391）の優性度を調べるため、遺伝的に印をつけた平均体染色体を用 いて、ダウア105匹を劣性変異が予想されるdaf-2/+の親485匹から分離した。こ れらの動物77匹中76匹の遺伝子型はdaf-2（el391）に関してホモ接合であったが 、daf-2（el391）/+であったのはダウア77匹中１匹であり、優性度が１％未満で あることを示している。C.エレガンスとは対照的に、ヒトにおけるP1178L変異は 優性である、または患者はトランスで第二のインスリン受容体変異を有する、も しくはP1178Lの優性度を増強するその他の遺伝子変異（例えば、他の複雑なII型 糖尿病座）を有する可能性がある（ブルニングら（Bruning）、Cell 88：561〜5 72、1997）。AGE-1 PI 3- キナーゼは主要なDAF-2シグナル伝達産物である ショウジョウバエ（Drosophila）のインスリン受容体相同体と同様に、DAF-2 は哺乳類のIRS-1と類似に機能する可能性がある長いC-末端伸長部を有する（フ ェルナンデス（Fernandez）、EMBO J．14：3373〜3384、1995）。哺乳類におい て、IRS-1チロシン残基はインスリン受容体キナーゼによって燐酸化され、これ らのホスホチロシンは、SH2ドメインを有する多様なシグナル伝達蛋白質との結 合を媒介する（ホワイト＆カーン（White and Kahn）、J．Biol．Chem．269：１ 〜４、1994；ソンギャングら（Songyang）、Cell 72：767〜778、1993）。全て ではないが多くのDAF-2 C-末端伸長部チロシンは、それらが自己燐酸化されるこ とを示唆する隣接配列モチーフを有する（図2A；ソンギャング＆カントレー（So ngyang and Cantley）、Trends Biochem．Sci.，20：470〜475、1995）。哺乳類 PI 3-キナーゼのIRS-1相互作用からの先例に基づき（ホワイト＆カーン（White and Kahn）、J．Biol．Chem．269：１〜４、1994）、DAF-2 Y1504でのYXXMモチ ーフはAGE-1 PI 3-キナーゼとの相互作用を媒介する可能性があり、これはdaf-2 と同じ遺伝子経路において作用する（図４）（モリスら（Morris）、Nature 382 ：536〜539、1996）。 インスリン受容体キナーゼのY1158〜Y1163活性化ループに対応する領域におけ るDAF-2チロシン残基３個、Y1293、Y1296およびY1297は、DAF-2とインスリン受 容体燐酸化標的との間の予想される類似性に基づき、自己燐酸化される可能性が ある（図2C）。DAF-2自己燐酸化に関して考えられるもう一つの標的は、インス リン受容体膜近傍領域のNPEYモチーフ（Y972）に対応する領域に存在するY1106 NPEYモチーフであり、これはそのPTBドメインを通じてのインスリン受容体へのI RS-1結合を媒介することが示されている（ホワイト＆カーン（White and Kahn） 、J．Biol．Chem．269：１〜４、1994）。DAF-2はPI 3-キナーゼとのカップリン グに関与するYXXMモチーフを１個有するが、哺乳類のIRS-1およびショウジョウ バエのインスリン受容体（フェルナンデスら（Fernandez）、EMBO J．14：3373 〜3384、1995）は多数のYXXMモチーフを有する。p85様アダプターサブユニット はC.エレガンスデータベースにおいて検出されていないが、哺乳類のp110とのAG E-1の相同性から、相同または類似のアダプターの存在が示唆される（モリスら （Morris）、 Nature 382：536〜539、1996）。DAF-2のC-末端ドメインでは、他の２つのチロ シン残基が自己燐酸化されて特定のSH2-含有蛍白質に結合する可能性がある：Y1 678はPLC-γまたはSHP-2相同体に結合し、Y1686はおそらくSEM-5に結合する（図 2A）（ソンギャングら（Songyang）、Cell 72：767〜778、1993）。例えば、ras およびMAPキナーゼの変異は、ダウアの構成的またはダウアの欠損変異に関する スクリーニングでは同定されていないが、これらの一般的なシグナル伝達経路蛋 白質は、それらが脊椎動物のインスリンシグナル伝達にカップリングしているよ うに、DAF-2にカップリングしている可能性がある（ホワイト＆カーン（White a nd Kahn）、J．Biol．Chem．269：１〜４、1994）。 インスリン受容体はまた、その他のシグナル伝達経路にもカップリングする（ ホワイト＆カーン（White and Kahn）、J．Biol．Chem．269：１〜４、1994）； 類似のDAF-2ホスホチロシン残基はこれらの相互作用を媒介する可能性がある（ 上記のように）。このように本発明者らは、DAF-2細胞質ドメインにおけるチロ シンがリガンドの結合によって自己燐酸化され、AGE-1 PI 3-キナーゼ相同体（ その他の分子と共に）を動員して、繁殖的生育および正常な老化にシグナルを伝 達すると提案する。休眠期および加齢のコントロールにおけるdaf-2による代謝コントロール インスリンおよびその受容体ファミリーは脊椎動物（および無脊椎動物では本 発明者らの証拠から）の代謝および生育コントロールにおいて重要な役割を果た している（カーン＆ワイア（Kahn and Weir）編、「ジョスリンの真性糖尿病（J oslin's Diabetes Mellitus）」、Lea & Febiger、1994）。血糖値の増加および 自律神経刺激によってインスリンが放出されると、インスリン受容体連動体は、 脂肪、肝臓、および筋肉細胞における代謝調節因子の転写および翻訳の変化と共 に、重要な代謝酵素の活性化へのシフトを指向し、その全てがグリコーゲンおよ び脂肪へのグルコースの同化に至る（ホワイト＆カーン（White and Kahn）、J ．Biol．Chem．269：１〜４、1994）。IGF-1は下垂体成長ホルモンに反応して肝 臓から放出され、その内分泌シグナルに対する多くの増殖および発達反応を媒介 する（マシューズら（Mathews）、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．83：9343〜7 、1986）。興味深いことに、成長ホルモンのシグナル伝達を欠損し、おそらくIG F- 1シグナル伝達も同様に減少している矮性マウスでは寿命は劇的に増加する（ブ ラウン・ボルグら（Brown-Borg）、Nature 384：33、1996）。インスリン受容体 関連受容体はNGF受容体と共に発現されるが、その機能はまだ確立されていない （ラインハルトら（Reinhardt）、J．Neurosci．14：4674〜4683、1994）。 一般的な休眠期停止および特にダウア停止は、主な代謝の変化に関連し（タウ バーら（Tauber）、「昆虫の季節への適応（Seasonal Adaptation of Insects） 」、Oxford University Press，ニューヨーク、ニューヨーク州、1986）、daf-2 がインスリンシグナル伝達に関連する代謝調節経路において作用するというモデ ルと一致する。野生型動物では、DAF-2シグナル伝達により非ダウア繁殖的生育 が起こり、これは細胞数、大きさおよび脂肪貯蔵が少ないことから見ても、生育 のための食物利用に関連している（図３）。daf-2変異体動物では、腸および皮 下細胞では脂肪（図３）およびグリコーゲン（データは示していない）を産生す るよう代謝がシフトしている。温度感受性daf-2変異体対立遺伝子がL4または成 虫段階で非許容温度に移行すれば（ダウア形成に関するdaf-2コントロールの重 要な期間後に）、代謝は脂肪を保存する方向にシフトする（図３）。このように 、daf-2も繁殖的生育の際の代謝を調節する。同様の代謝のシフトは野生型のフ ェロモン誘発ダウア（データは示していない）、age-1変異体（データは示して いない）、およびdaf-7変異体（図３）においても認められる。この代謝シフト を支持するために、ダウア幼虫では、糖分解を調節する酵素がダウンレギュレー トされているのに対し、グリコーゲンおよび脂肪合成を調節する酵素はアップレ ギュレートされ、脂質およびグリコーゲンの増加に関する超構造的証拠がある（ オリオルダン＆バーネル（O'Riordan and Burnell）、Comp.Biochem．& Physiol ．92B：233〜238、1989；オリオルダン＆バーネル（O'Riordan and Burnell）、 Comp.Biochem．& Physiol．95B：125〜130、1989；ポファム＆ウェブスター（Po pham and Webster）、Can．J．Zool．57：794〜800、1978；ワズワース＆リドル （Wadsdorth and Riddle）、Develop．Biol．132：167〜173、1989）。ダウアの 代謝シフトは生殖系列増殖の停止、ならびに体細胞分裂および増大の停止に関連 する（リドル（Riddle）、「シーエレガンス（Caenorhabiditis elegans）II」 、リドル、ブルメンタール、メイヤー、プリース編（D．Riddle，T．Blumenthal ，B．Meyer，J．P riess）、Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor）ニューヨーク 、1997、739〜768頁；ケニオン（Kcnyon）、前掲書中、791〜813）。 無脊椎動物の代謝および成長コントロールにおけるインスリン様シグナル伝達 に関しては先例がある：インスリン様増殖因子は軟体類では代謝調節神経節にお いて検出され（ルーバースら（Roovers）、Gene 162：181〜188、1995）、なら びにバッタ（ヘトルら（Hetru）、Eur．J．Biochem．201：495〜499、1991）お よびカイコ（カワカミら（Kawakaml）、Science 247：1333〜1335、1990）では 脱皮を調節する。休眠期のdaf-2調節と一致して、インスリンを休眠期のピエリ ス・ブラシカエ（Pieris brassicae）（昆虫）のサナギに注射すると回復を誘導 する（アルパゴース（Arpagaus）、Roux's Arch．Dev．Biol．196：527〜530、1 987）。 特定の理論に拘束されることなく、本発明者らはインスリン様シグナルが繁殖 的生育時にアップレギュレートされてDAF-2受容体自己燐酸化を刺激し、AGE-1 P I 3-キナーゼを動員して二次伝達物質PIP3を産生するという仮説を立てる。AGE- 1は、age-1とdaf-2変異体表現型との類似性およびエピスタシス経路におけるそ れらの位置が類似していることから、DAF-2の主なシグナル伝達産物である可能 性がある（ボーウェルズ＆トーマス（Vowels and Thomas）、Genetics 130：105 〜123、1992；ゴットリーブ＆ルブクン（Gottlieb and Luvkun）、Genetics 137 ：107〜120、1994）。インスリン受容体シグナル伝達の先例から、代謝のDAF-2/ AGE-1/PIP3調節に関して以下の標的候補が示唆される：（1）増殖および繁殖代 謝に関するグルコース分子の流れを促進するためのグルコース輸送体（カーン＆ ワイア（Kahn and Weir）編、「ジョスリンの真性糖尿病（Joslin's Diabetes M ellitus）」、Lea & Febiger、1994）（またはおそらくトレハロース輸送体（タ ウバーら（Tauber）、「昆虫の季節への適応（Seasonal Adaptation of Insects ）」、Oxford University Press，ニューヨーク、ニューヨーク州、1986））を 有する小胞の膜融合；（2）グリコーゲンならびに脂肪合成および溶解酵素の活 性を調節する可能性があるAKT/GSK-3キナーゼカスケード（ヘミングス（Hemming s、Science 275：628〜630、1997）を活性化するPIP3；（3）PEPCK、GDH、脂肪 合成およびリパーゼのような代謝遺伝子の転写および翻訳（ホワイト＆カーン（ White and Kahn）、J．Biol．Chem．269：１〜４、1994）。遺伝子エピスタシス 分析により、 DAF-2/AGE-1シグナル伝達がdaf-16遺伝子活性を負に調節することが示唆される （ボーウェルズ＆トーマス（Vowels and Thomas）、Genetics 130：105〜123、1 992；ゴットリーブ＆ルブクン（Gottlieb and Luvkun）、Genetics 137：107〜1 20、1994）。DAF-16は、このシグナル伝達経路においてAGE-1の何らかの下流の 時点で作用しうる。DAF-16がDAF-2/AGE-1 PIP3シグナル伝達の主な転写産物とな るという証拠を本明細書に紹介する。 これらの代謝変化の他に、DAF-2シグナル伝達カスケードはまた、咽頭および 皮下の形態発生局面と共に、生殖系列の繁殖的成熟を制御する（リドル（Riddle ）、「シーエレガンス（Caenorhabiditis elegans）II」、リドル、ブルメンタ ール、メイヤー、プリース（D．Riddle，T．Blumenthal，B．Meyer，J．Priess ）編、Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor）ニューヨーク、1 997、739〜768頁；ケニオン（Kenyon）、前掲書中、791〜813）。DAF-2受容体は 例えば、皮下および腸の標的組織において作用する可能性があり、ここでダウア 調節カスケードによって誘発される代謝の変化を認める（図３）。同様に、DAF- 2が間接的に、例えば他のホルモンの産生を制御することによって、組織の代謝 および再形成を制御する可能性もある（ナガサワら（Nagasawa）、Science 226 ：1344〜1345、1984；ジョナスら（Jonas）、Nature 385：343〜346、1997）。d af-2の発現および遺伝子モザイク分析はこれらのモデルを識別するために必須で ある。 DAF-2および哺乳類のインスリン受容体はいずれも代謝を調節するが、これら の受容体における変異に関連した代謝欠損は異なるように思われる。哺乳類のイ ンスリン受容体活性が完全に喪失すれば、出生児での成長停止（ヒトにおける妖 精症）、ならびにdaf-2変異体において本発明者らが認めた脂肪の蓄積よりむし ろ逃避的な脂質分解およびケトアシドーシスへの代謝シフトが起こる（カーン＆ ワイア（Kahn and Weir）編、「ジョスリンの真性糖尿病（Joslin's Diabetes M ellitus）」、Lea & Febiger、1994）（図３）。インスリン受容体とdaf-2変異 体の間のこの相違はこのシグナル伝達に対する異なる代謝反応、またはインスリ ンのシグナル伝達の完全な喪失と減少の間の差を反映する可能性がある。ヒトで は、インスリンレベルが非常に低い重度の餓えまたは病的状態の際にケトアシド ーシスのみが誘導される（カーン＆ワイア（Kahn and Weir）編、「ジョスリン の真性糖 尿病（Joslin's Diabetes Mellitus）」、Lea & Febiger、1994）。本明細書に 記述したdaf-2変異のいずれも明確なヌル変異ではないため、daf-2のダウア構成 的対立遺伝子は非無効ヒトインスリン受容体変異により類似している可能性があ る。非温度感受性変異を回復させる遺伝子スクリーニングにおいて単離した対立 遺伝子を含む、ほとんどのdaf-2対立遺伝子が温度感受性である（ボーウェルズ ＆トーマス（Vowels and Thomas）、Genetics 130：105〜123、1992；ゴットリ ーブ＆ルブクン（Gottlieb and Luvkun）、Genetics 137：107〜120、1994）。 系統発生を超えて保存されたDAF-2アミノ酸残基が置換されると、非保存残基の 置換に比べて全ての温度に対してより浸透性のダウア停止を引き起こす。生育温 度に関わらずダウア段階で生育を停止するdaf-2変異体は遺伝子（例えばmg43） の活動度が最少である可能性がある。いくつかのdaf-2対立遺伝子はまた、５〜1 0％の胚芽死亡率（未発表結果）を生じ、このことは胚芽発生期にdaf-2が機能す ることを示唆している。これまでに検出されたdaf-2変異のいずれもノンセンス の、フレームシフト、または欠失対立遺伝子ではない。daf-2無効表現型は条件 付きでないダウア段階での停止より強く、例えば胚芽死亡に至る可能性がある。 しかし、ダウア構成的daf-2変異体対立遺伝子はEMS変異誘発から非常に高率（染 色体300個につき約１個）で単離され、このことは存在する対立遺伝子がまれな 生存対立遺伝子ではないことを示唆している。実際に、daf-2(el391)と同じイン スリン受容体変異を有する14歳の患者は病的なほど肥満で（キムら（Kim）、Dia betologia 35：261〜266、1992）、インスリンシグナル伝達の減少が代謝に及ぼ す影響はdaf-2変異体と類似している可能性があることを示唆している。 daf-16に変異を有する動物は、たとえそれらがインスリン様代謝制御シグナル を障害するdaf-2およびage-1変異を有していても、繁殖的に生育することができ ることはヒト糖尿病にとって重要である可能性がある（ボーウェルズ＆トーマス （Vowels and Thomas）、Genetics 130：105〜123、1992；ゴットリーブ＆ルブ クン（Gottlieb and Luvkun）、Genetics 137：107〜120、1994）。これらのデ ータは、これらの代謝シフトを生じるのは調節されないdaf-16遺伝子活性である ことを示唆している。I型およびII型様尿病の双方に関連した類似の代謝欠損は 、ヒトDAF-16相同体の同様の調節されない活性によって引き起こされる可能性が ある。 下記に、本発明者らはdaf-16分子の本体について開示する。その活性を阻害すれ ば、インスリンシグナル伝達の欠損に関連した代謝調節障害が改善すると予想さ れる。DAF-16 はフォーク状転写因子相同体をコードする 遺伝子マッピングおよび5kb領域における多数のdaf-16変異の検出を組み合わ せて用いることによって、daf-16の核酸配列を決定した。daf-16は、染色体Iのl lin-11の左に１マップ単位およびunc-75の右に3.3マップ単位の位置に存在する 。ゲノムのこの領域はコスミドまたはYACによってカバーされない空白が含まれ た。本発明者らは、空白内に歩行するフォスミドライブラリを用いた（ゲノムサ イエンシズ、インク）。４つのフォスミド（H27K20、H01H03、H12I08、およびH3 5K06）の末端の配列分析により、まだマップされていないコンティグ133個がlin -11unc-75空白部に存在することが明らかになった。おおよそのdaf-16遺伝子の 位置からのコスミドを用いてC.エレガンス株Bristol N2とBergarac RC301との間 のRFLPを検出した：mgP45はコスミドC39H11上、mgP46はコスミドF28D9上、mgP49 はコスミドC35E7上、mgP50はコスミドC43H8上に存在する。mgP49およびmgP50のR C301対立遺伝子を有するのはdaf non-Unc組換え体30個中ゼロである。Daf non-U nc組換え体30個中２個がmgP49のRC301対立遺伝子を有する。Daf non-Unc組換え 体30個中10個がmgP46のRC301対立遺伝子を有する。non-Lin Daf組換え体４個中 １個がmgP45のN2対立遺伝子を有する。non-Lin Daf組換え体４個中４個がmgP49 のN2対立遺伝子を有する。これらのデータは、コスミドC43H8とC35E7の間にdaf- 16が存在することをを示している。daf-16遺伝子はコスミドR13H8上のフォーク 状遺伝子内に含まれる欠失（mgDf50）および点突然変異（mg53およびmg54）を同 定することによって同定された（図27）。２つの主要なdaf-16転写物があってそ の配列を図13Aおよび図13B（それぞれ、配列番号：43および44）に示す。DAF-16 イソ型をコードするアミノ酸配列を図14A〜14Cに示す（配列番号：44〜46）。 本発明者らは３つのdaf-16変異を検出した：（1）daf-16無効表現型がdaf-2変 異の抑制であることが証明されるdaf-16における保存領域の大きい欠失（mg△F5 0）；（2）保存されたWKNSIRHモチーフを変化させるdaf-16（mg53）のエキソン ６におけるSからLへの置換；および（3）daf-16(mg 53)の多様なスプライシング イソ 型の１つを切断すると予想されるdaf-16(mg 54)のエキソン３における非センス 変異。興味深いことに、このスプライシングされたイソ型は明確なフォーク状DN A結合ドメインを有し、したがって、異なるプロモーターまたは組合せたパート ナーに結合すると予想される。この変異体はdaf-2の弱い抑制剤であり、このこ とは双方のDAF-16イソ型が代謝の制御に必要であることを示唆している。 配列分析により、DAF-16はフォーク状の（FH）転写因子ファミリーに属するこ とが明らかになった（図21A〜21B）。この強いアミノ酸相同性は、DAF-16が転写 因子であることを示している。本発明者らの遺伝子分析はDAF-16活性がDAF-2/AG E-1インスリンシグナル伝達経路によって調節されることを示している。このモ デルは、もう一つの受容体キナーゼシグナル伝達経路の先例からも支持される： C.エレガンスのLIN-31フォーク状蛋白質は、LET-23 EGF受容体相同体からのチロ シンキナーゼシグナル伝達カスケードによって調節されることが示された（キム （Kim）、Genes Dev.7：933〜947、1993）。DAF-16はインスリンシグナル伝達の 下流で作用するというモデルと一致して、フォーク状の転写因子はまた、代謝調 節に関係している：もう一つのFHファミリーメンバーは哺乳類のHNF-3、すなわ ちHNF-1およびHNF-4と同じ代謝制御蛋白質プロモーターとして作用する外胚葉特 異的転写因子であり、その双方が若年期成人型糖尿病（MODY）における変異体で ある（ヤマガタら（Yamagata）、Nature 384：455〜458、1996；ヤマガタら（Ya magata）、Nature 384：458〜460、1996）。 DAF-16のフォーク状転写因子としての同定はまた、C.エレガンスの複雑なdaf 遺伝学の多くを説明する。DAF- 7TGF-β様シグナル伝達およびDAF-2インスリン 様シグナル伝達が１点に集中することはまた、DAF-16がFH蛋白質であり、DAF-3 がSmad蛋白質であるという本発明者らの発見によっても説明される：Smadとフォ ーク状蛋白質の間の相互作用に関する先例はアフリカツメガエルにおいて発見さ れた。カエルの初期発生におけるTGF-βスーパーファミリー近縁のアクチビンに 対する反応は、FAST-1と呼ばれるDAF-16の遠縁とSmad蛋白質、Smad2との相互作 用によって媒介される（Nature 383：600〜608、1996）。これらの蛋白質は、そ れに対してDAF-3が結合するミオシンIIプロモーターと非常に類似であるエンハ ンサーエレメントに結合する（下記参照）。このように本発明者らの分子および 遺伝子デー タは、DAF Smad蛋白質およびDAF-16 FH蛋白質が代謝的制御プロモーター上で相 互作用することを示している。 興味深いことに、daf-16がdaf-16変異体動物におけるDAF-2インスリン受容体 シグナル伝達を必要としないことと同様に、lin-31変異はC.エレガンスの陰門発 達におけるLET-23 EGFシグナル伝達の必要性を抑制する。これらの知見は、DAF- 2受容体、下流のシグナル伝達分子（AGE-1）、および転写因子標的DAF-16がC.エ レガンス生育におけるインスリン様シグナル伝達に関与することを示している。 特定の理論に制限されることなく、本発明者らは、DAF-2およびAGE-1を通じての C.エレガンスのインスリンシグナル伝達がDAF-16転写活性を活性化し、その結果 daf-2またはage-1変異体、またはダウアフェロモンの場合では、DAF-16は脂肪代 謝への代謝シフトを引き起こすリプレッサー蛋白質として作用するという仮説を 立てた。本発明者らのdaf-16発現の分析は、DAF-3と同様に、それが標的組織に おいて発現されることを示している（図22）。本発明者らの証拠は、Smad蛋白質 転写因子（例えばDAF3、DAF8、DAF14）およびDAF-16が組合せ転写調節因子とし て一般的な組合せのプロモーター上で作用することを示している。このように、 これらの代謝遺伝子では、DAF-7、TGF-β様およびDAF-2インスリン様シグナルが 代謝を制御するように１点に集中する。さらに、本発明者らの証拠は、DAF-2シ グナル伝達の存在下では（高インスリンを模倣する）、DAF-16は転写活性化因子 として作用し、細胞増殖のためのグルコース利用に向けての代謝シフトを引き起 こすことを示している。本明細書に記述の分子分析により、daf-16遺伝子活性が 欠如すれば、DAF-16の抑制から代謝制御を解放することによって、代謝制御にお けるインスリンシグナル伝達の必要が完全になくなることが示唆される。これら のデータは、ヒトDAF-16相同体がヒトにおけるインスリンシグナル伝達の下流で 作用すれば、インスリンシグナル伝達の必要をなくすためにその活性を阻害する 薬剤を開発することができることを示唆している。そのような薬剤が特定されれ ば、I型およびII型糖尿病の双方の治療手段となるはずである。 図21A〜21Bに示すように、インスリンシグナル伝達遺伝子としてではなくて腫 瘍遺伝子の区切り点として同定されたヒトFKHRおよびAFX遺伝子は、ゲンバンク または94％完全なC.エレガンスゲノム配列のいずれかにおける最も近縁のものよ り はるかにDAF-16に近縁である。これらのデータは、FKHRおよびAFXがC.エレガン スのDAF-16と同じ機能：インスリンシグナルの伝達およびDAF-7様Smadシグナル の収束、を果たす際に役立つ優れた候補であることを示している。DAF-2/AGE-1 シグナル伝達の考えられる産物としてのC.エレガンスAKTキナーゼの 証拠 本発明者らは、age-1シグナル伝達の必要性をなくす変異を遺伝的にスクリー ニングした。これは、age-1（mg44）ヌル変異（この変異は株が増殖するために ヘテロ接合である）を有する株を変異させることによって得られる。２世代後、 age-1遺伝子活性がなくとも生存することができ、ダウア段階で生育が停止しな い動物を選択した。予想通りdaf-16変異を同定した。しかし、本発明者らは２つ の新しい機能獲得変異、すなわちsup(mg142)およびsup(mg144)も同定した。 sup(mg144)は３つの異なるage-1対立遺伝子を抑制し、このことはこの変異で はPIP3のAGE-1産生が必要でないことを示している。例えば、sup(mg144)は、生 殖能力を有する成虫が形成されるようにage-1（mg44）、（m333）、（mg199）の ダウア段階での停止を抑制する。sup(mg144)はdaf-2変異体におけるインスリン シグナル伝達の欠如を抑制しない：daf-2(el370)；sup(mg144)は25℃でダウアを 形成する。これは必ずしも全てのDAF-2シグナル伝達産物がAGE-1を経由しないこ とを示唆する。しかし、DAF-2およびAGE-1シグナル伝達の双方が存在しない場合 、sup(mg144)の抑制は弱く、生殖能力を有する成虫の中にはダウア段階で停止し ないものがある。daf-2(el370)：sqt-1 age-1(mg44)；sup(mg144)は、25℃で生 殖能を有する成虫を８％、生殖能力がない成虫を12％、およびダウアを80％形成 する。 興味深いことに、sup(mg144)は、age-1変異の優性サプレッサーである。sqt-1 age-1（mg44）；sup(mg144)/+は生殖能力を有する成虫を100％形成する。sup(m g144)親遺伝子型はこの転帰に影響を及ぼさない。このデータはsup(mg144)が優 性活性化または優性不活化変異であることを示している。 遺伝子マッピングはsup(mg144)がC.エレガンスのAKT相同体における活性化変 異を同定する可能性があることを示している（図25）。多数の印をつけた染色体 に対してsup(mg144)をトランスに置くことによって（RFLPに基づくPCRを用いて ）、sup(mg144)がC.エレガンスのAKTを含む２マップ単位遺伝子間隔にマッピン グされ ることを発見した（図24）。 特に、sup(mg144)/多形Bergarac染色体の親から単離したsup(mg144)ホモ接合 動物39例中２例が、sup(mg144)mg144およびstp6（これらの動物はまたstP18を有 した）の間で組換えた。この実験において、mg144は３世代にわたってRW7000に 対してヘテロ接合であり、このようにsup(mg144)はstP6の左約2.2マップ単位に 存在する。 さらに、sup(mg144)/多形Bergarac染色体親から単離したsup(mg144)ホモ接合 動物39例中１例がsup(mgI44)とbPIの間で組み換えられた。この実験においてmg1 44は２世代にわたってRW7000に対してヘテロ接合であった。従って、この数字は bP1から約1/80または1.2マップ単位である。 本発明者らは、AKTとのGFP融合を作製し、この遺伝子がダウア（幼虫）では高 レベルで発現されるが、野生型動物では発現される細胞がより少ないことを示し た（図26A〜26B）。このように、AKTはDAF-16およびDAF-3転写制御に反応する可 能性があるダウア調節遺伝子となる。myo IIのDAF-3結合部位に関連して多数の 考えられる結合部位が同定されている。sup(mg142) はもう一つの可能性があるage-1シグナル伝達産物を同定する mg142は、３つの異なるage-1対立遺伝子（age-1(mg44)、age-1(m333)、および age-1(mg109)を20℃で抑制する。age-1(mg44)；sup(mg142)は、15および20℃で 生殖能力を有する成虫を形成する。25℃では、それらは生殖能力を有する成虫を 33％および生殖能力を有しない成虫を67％形成する。 sqt-1 age-1(mg44)；mg142/+は、親がmg142に関してホモ接合である場合、生 殖能力を有する成虫を14％形成し、生殖能力を有しない成虫を86％形成する。sq t-1 age-1（mg44）；mg142/+は、親がmg142に関してヘテロ接合である場合、生 殖能力を有する成虫を67％形成し、生殖能力を有しない成虫を33％形成する。da f-2(el370)；mg142は25℃で生殖能力を有しない成虫を形成する；daf-2(el370) ；sqt-1 age-1(mg44)；mg142は25℃で生殖能力を有しない成虫およびダウアを形 成する。予備的なマッピングからmg142はLGX上でunc-1の左約1.6muに存在する。新規C.エレガンスインスリン様ホルモンはおそらくDAF-2リガントである daf-2における変異は代謝のシフトを引き起こすのみならず、C.エレガンスの 寿 命に影響を及ぼす。ほぼ完全なC.エレガンスのゲノム配列によって、インスリン スーパーファミリーメンバーの明確な探索が可能となり、この探索において、本 発明者らはC.エレガンスのゲノムデータベースにおいて多数のインスリン関連蛋 白質を検出した。インスリン、IGF-I、またはIGF-IIを翻訳された虫ゲノム配列 と比較すると、この大きい一組のインスリンスーパーファミリーメンバーは検出 されなかった。しかし、今や定義された下記に示すようなインスリンスーパーフ ァミリーの証明である保存された特徴的な残基（配列番号：115、116）に関して 探索を実行すると、多くの新規インスリン分子を検出した。保存されたインスリンモチーフ および rc.orgのBlocksデータベースからのインスリンスーパーファミリーコンセンサス ；配列番号：116)。 インスリンスーパーファミリーの特徴的な残基は、カイコガのボンビキシン（イ ンスリンの遠縁）およびリムラスインスリンスーパーファミリーメンバーと共に 、一組の脊椎動物インスリンならびにIGF-IおよびII蛋白質を用いて形成された 。データベースにおいて遠縁を検出するためにスーパーファミリーの特徴的なア ミノ酸位置を用いることは、単一のファミリーメンバーを用いた単純な探索より 遺伝子スーパーファミリーメンバーを把握する明確なアプローチである。 これらのモチーフを用いて新規C.エレガンスのインスリンスーパーファミリー メンバー８個を同定し（配列番号：117〜124）、そのコード配列を図28に示す。 この図において、ファミリーメンバーをそれらが検出されたコスミドゲノムDNA 配列から名付けた。これらのインスリンは全てンスリンスーパーファミリーとA およびBぺプチド相同性を有し、そのいくつかは介在する非保存Cペプチドのプロ セシングを媒介する保存された二塩基性のプロセシング部位を有する。これらの 遺伝子のいくつかは集合して存在するが（例えば、ZK75.1、ZK75.2、ZK75.3およ びZK84.6）、C.エレガンスのゲノムに広く分布する。より遠縁のインスリン類似 体も存在するが、これらはDAF-2以外の受容体に関係する可能性がある。 単離されたインスリンスーパーファミリーメンバーの中で、F13B12はヒトイン スリンおよびIGF-I、IIに最も近縁であった。これは蛋白質スーパーファミリー メンバーの系統発生系図を構築するPILEUP分析を行うと特に明らかであった（図 29および30）。F13B12のインスリン産物は、リラキシンのような他の遠縁蛋白質 より哺乳類のインスリンおよびIGF-I、II蛋白質に近縁に集中発生した。リラキ シンは分析において最も遠縁のインスリンスーパーファミリーメンバーであると 定義され、これはインスリン受容体とは異なるチロシンキナーゼ受容体に関係す るように思われた。 これらのインスリン様ホルモンは、寿命、ダウア停止、および／またはDAF-2 シグナル伝達の代謝作用に役立つと予想される。例えば、これらのインスリンス ーパーファミリーメンバーのそれぞれはDAF-2受容体に関係すると予想され、daf -2における変異がこれらの８個以上のインスリン様シグナルの機能を「合計する 」結果に至る。 F13B12インスリン様ホルモンの分析はこの見解と一致する（表II-VI）。まず 、下記に示すように、F13B12インスリン様ホルモンの用量を増加させると、弱い daf-2またはdaf-7変異を有する動物のいずれにおいても、およびC.エレガンスに おいてインスリンの放出を媒介する可能性があるシナプス成分に欠損を有する動 物（unc-64）においてもダウア停止を強く調節する。 表II 高コピーF13B12(ins)は20℃において daf-2(el365)のDaf-c表現型を増強する表III 高コピーF13B12(ins)は25℃において daf-7(el372)のDaf-c表現型を母系的に抑制する 表IV 高コピーF13B12(ins)は15℃において daf-7(el372)のDaf-c表現型を母系的に抑制する 表V 高コピーF13B12(ins)は27℃において unc-64(e246)のダウアの回復を促進する 表VI 高コピーF13B12(ins)は15℃において unc-64（e246）のDaf-c表現型を増強する 遺伝子分析から、高F13B12インスリン様ホルモンシグナル伝達がdaf-7変異によ って誘導されるダウア停止を抑制するまたはシナプスシグナル伝達を減少させる ことができるが、daf-2シグナル伝達の減少によって引き起こされたダウアの停 止を増強することができることが示された。このように、F13B12インスリン様ホ ルモンはDAF-2受容体と同様にDAF-7シグナルと相乗的に作用する可能性があるが 、別のDAF-2リガンドの分泌または活性を妨害する可能性がある。これらの遺伝 子データは、DAF-2シグナル伝達におけるF13B12インスリン様ホルモンの関与を 強く示している。 さらに、F13B12インスリン様ホルモンのGFPに対するプロモーター融合の発現 パターンもまた、遺伝子の結果と一致する。これらの実験において、GFPは、最 もN SMに似ているプロセスによって、ASJおよびASHを含むいくつかの頭部神経、一対 の咽頭神経ならびに３つの尾神経において発現された。全長のGFPは類似に見え るが非常にかすかである。全長のGFPを発現する虫は野生型より長く生存した。 興味深いことに、NSM神経はEM分析によって密度の濃い中心部小胞を有し、これ も膵臓のβ細胞に当てはまる。膵臓β細胞はまたその特徴が神経的で、それらは インスリン小胞の放出のためにシナプス成分を利用し、自律神経系にシナプスで 結合され、電気的に活性である。インスリンの放出を増加させるために用いられ るスルホニル尿素は、β細胞におけるKチャンネルの活性を調節することによっ て作用するが、Kチャンネルは他の神経の興奮性も調節する。最後にNSM神経は哺 乳類における膵臓のようにC.エレガンスの腸神経系の一部である。したがって、 F13B12インスリン様ホルモンの発現および機能的分析は、虫の代謝および加齢の インスリン様制御におけるその役割を高く支持する。 F13B12インスリン様ホルモンはインスリンに対する最も近縁のC.エレガンス相 同体であるが、これらのインスリンスーパーファミリーメンバーの多くまたは全 てはその活性を調節するためにDAF-2受容体に関係している可能性がある。例え ば、それらは虫のゲノムに存在するその他の増殖因子受容体のリガンドよりイン スリンに近縁である。これらの明確なインスリンスーパーファミリーリガンドは 異なる回数または場所でDAF-2を調節することができる、またはF13B12インスリ ン様ホルモンと拮抗的にまたは相乗的に作用することができる。これらのインス リン様ホルモンのいくつかはインスリンのように代謝を調節するが、その他はダ ウア段階での停止または寿命を調節する可能性がある。このように、これらの多 くのホルモンの受容体の喪失に起因するdaf-2変異体表現型は、多くのホルモン 性シグナルが複合的に失なわれる可能性がある。そのようなモデルと一致して、 daf-2ヌル変異体におけるDAF-2受容体の神経発現はdaf-2変異体のダウア段階停 止表現型を相補するが、代謝または加齢欠損は相補しなかったことが判明した。 したがって、１つのDAF-2リガンドがダウア段階停止を制御するために脳におい てまたは脳の近傍で発現されるが、その他のリガンドは代謝および加齢を制御す るために、例えば神経以外の細胞においてDAF-2に影響を及ぼす可能性がある。 このことから見て、インスリン様ホルモンの一つのみが失われると、daf-2変 異 体表現型のサブセットのみを生じ、例えば寿命の増加のみまたは代謝調節障害の みを引き起こす可能性がある。これらのC.エレガンスインスリンスーパーファミ リーメンバーは、例えば寿命を促進させる、またはDAF-2受容体シグナル伝達の 機能を老化させる可能性があり、人生の後期にそのようなホルモン活性が増加す れば、老化を引き起こすDAF-2活性の増加を実際に媒介する可能性がある。逆に 、これらのインスリン様蛋白質の何らかがDAF-2に対してアンタゴニスト的作用 を有する場合、人生の後期でその活性が減少すれば老化を媒介するであろう。し たがって、注射または生殖細胞療法によってホルモン一つのみを適用すれば、例 えば代謝に影響を及ぼすことなく加齢を標的にするために用いることができる。 さらに、F13B12インスリン様ホルモンはインスリンの検出可能な虫の相同体で あるため、その他の虫インスリン７個もまたそれらが互いに関連するよりも線虫 の相手に密接に関連するヒト相同体を有する可能性がある。実際に、F13B12イン スリン様ホルモンがインスリンならびにIGF-IおよびIGF-IIとは解離しているこ とは、他のインスリンスーパーファミリーメンバーの哺乳類相同体についてもど れほどの解離が予想されるかを知る手段を与える。F13B12インスリン様ホルモン はインスリンまたはIGF-IよりIGF-IIに近縁であるが、これらの３つの遺伝子は おそらくC.エレガンスとホモサピエンスの共通の祖先においてF13B12相同体のお そらく重複および解離した相同体である。実際に、哺乳類における多くの遺伝子 ファミリーはC.エレガンスの４倍のメンバーを有することは現在の経験則である 。例えば、哺乳類には４個のHoxクラスターが存在するが、C.エレガンスには１ つに過ぎない。同様に、哺乳類における既知の３個のDAF-2受容体相同体および 哺乳類におけるDAF-16転写因子相同体が存在する（完全な哺乳類のゲノム配列が 終了すればこれらの遺伝子ファミリーの第４の哺乳類メンバーが既知となるであ ろう）。このように、C.エレガンスにおけるあらゆるインスリン様蛋白質に関し て、哺乳類には４個、または上記に示す８のファミリーに関して延べ24個存在す る可能性があると予測することは妥当である。さらに、F13B12インスリン様ホル モンはごく一部の神経に発現されているに過ぎないため、その他のインスリンス ーパーファミリーメンバーは同様に少数の一連の神経において発現される可能性 があり、ヒト相同体はごくまれに調節細胞型に発現される可能性がある。 本明細書に記述のインスリン様ホルモンは、そのヒト相同体と共に、老化に関 する貴重な調節剤候補となる。例えば、ヒトの老化がインスリン様寿命ホルモン の減少によって誘発されるならば、思春期が性的成熟ホルモンの時期を合わせた 変化によってどのように誘発されるかを類推して、性的成熟をホルモン治療によ って調節できるのと同じ方法で、加齢過程を調節することが可能となる可能性が ある。さらに、C.エレガンス加齢ホルモンはヒト遺伝子がそのような機能を有す ることを明らかにするかも知れない。daf-2変異は哺乳類におけるカロリー制限 と類似の方法で寿命を増加させるため、哺乳類におけるカロリー制限がインスリ ン様ホルモンレベルを調節し、これがインスリンまたはIGF-I、II受容体に関係 する可能性がある。そのようなホルモンはそのレベルが非常に低けれは、または それが短い範囲でシグナルを発すれば検出されない可能性がある。しかし、ヒト ゲノム配列が完全となれば、上記のC.エレガンススーパーファミリーメンバーに 対するヒト相同体の検出はデータベース検索のありふれた事象となる。このよう にして、寿命もしくは生育の停止、または代謝制御における虫の相同機能の機能 の決定は、ヒト相同体の活性に関する貴重な機能的情報を提供するであろう。 C.エレガンスインスリン様蛋白質の寿命、代謝または生育停止に及ぼす作用は 、F13B12インスリン様ホルモンに関して上記のように、RNA阻害およびこれらの 遺伝子の活性を阻害するノックアウト戦略を用いることによると共に、高コピー 試験の組合せによって容易に決定されるであろう。次に、C.エレガンス株を例え ば上記のF13B12インスリン様ホルモンについて示したように、daf経路変異体と の相互作用に関して、および標準的な技法による寿命作用に関して調べる。 寿命を調節するヒト蛋白質はデータベース探索の組合せおよび虫のRNAiまたは 遺伝子ノックアウト変異体の遺伝子相補（例えば、本明細書に記述のように）と 共に、虫の寿命および代謝制御に及ぼすヒト遺伝子の高コピー作用によって検出 される可能性がある。 これらのヒト蛋白質はホルモンであるため、それらは例えば血流に注射するこ とによってヒト寿命を直接調節するために用いてもよい。特定のホルモンおよび その作用に応じて、ホルモンそのものが寿命を増加させてもよく、または優性な 干渉ホルモン（例えばインスリンスーパーファミリーメンバー間のキメラを操作 することによって）を産生するようにそれらを改変してもよい。血流に注射した 場合のこれらの蛋白質の機能は、例えばトランスジェニック分析から確認される ように、C.エレガンスの機能から予測してもよい。その寿命に及ぼす作用のため に、これらのC.エレガンスインスリン様内分泌シグナルのヒト相同体は、加齢プ ロセスの防止または遅延において重要な適応を有する。C. エレガンスAkt/PKBはAGE-1ホスホイノシチド-3-OHキナーゼからDAF-16転写因 子にインスリン受容体様シグナルを伝達する インスリン受容体様シグナル伝達経路はC.エレガンスの代謝、発育、および寿 命を調節する（キムラら（Kimura）、Science 277：942〜946、1997）。分泌さ れるフェロモンに反応して、野生型動物はダウア段階で生育を停止すると共に、 腸および皮下における脂肪保存代謝へと切り替えて、寿命が増加して多くの組織 を再形成する（キムラら（Kimura）、Science 277：942〜946、1997；リドル＆ アルバート（Riddle and Albert）、「シーエレガンス（C．elegans）II」、リ ドル、ブルメンタール、メイヤー、プリース編（Riddle,D．L.，Blumenthal T. ，Meyer，B．J．& Priess，J．R.）、Cold Spring Harbor Laboratory Press，C old Spring Harbor、ニューヨーク739〜768頁、1997）。インスリン/IGF-I受容 体相同体daf-2（キムラら（Kimura）、Science 277：942〜946、1997）、または ホスホイノシチド-3-OHキナーゼ（PI3K）相同体age-1（モリスら（Morris）、Na ture 382：536〜539、1996）に変異が存在すれは、ダウア段階での構成的停止を 引き起こす；遺伝子分析はAGE-1がDAF-2の下流で機能することと一致する（ゴッ トリーブ＆ルブクン（Gottlieb and Ruvkun）、Genetics 137：107〜120、1994 ；ラーセンら（Larsen）、Genetics 139：1567〜1583、1995）。フォーク状転写 因子DAF-16に変異が存在すれば、daf-2およびage-1変異体のダウア段階での停止 、代謝シフト、および長命表現型を完全に抑制し（ゴットリーブ＆ルブクン（Go ttlieb and Ruvkun）、Genetics 137：107〜120、1994；ラーセンら（Larsen） 、Genetics 139：1567〜1583、1995；ケニオンら（Kenyon）、Nature 366：461 〜464、1993；オッグら（Ogg）、Nature 389：994〜999、1997；リンら（Lin） 、Science 278：1319〜1322、1997）、このことはDAF-16がC.エレガンスのイン スリン受容体シグナル伝達の負に調節された下流の標的であることを示している 。DAF-2インス リン受容体蛋白質およびAGE-1 PI3KをDAF-16転写因子とカップリングさせる分子 は、これまでの広範な遺伝子スクリーニングを行ったにもかかわらず同定されて いない。生化学研究は、哺乳類のAkt/PKB（RACとしても知られる）セリン／トレ オニンキナーゼが、インスリン受容体が下流のイフェクターに及ぼすように、受 容体チロシンキナーゼに関連したPI3Kからのシグナルを伝達する可能性があるこ とを示唆しているが（フランケら（Franke）、Cell 81：727〜736、1995；バー ゲリング＆コファー（Bergering and Coffer）、Nature 376：599〜602、1995； クロスら（Cross）、Nature 378：785〜589、1995）、これは生体全体における シグナル伝達経路の遺伝子分析によって証明されていない。本発明者らは、Akt/ PKBの活性化変異の遺伝子同定によって、ならびにAkt/PKB不活化および過剰発現 の遺伝子分析によって、DAF-2インスリン受容体様シグナル伝達経路におけるC. エレガンスのAkt/PKBの作用を確立した。 ２つのC.エレガンスAkt/PKB相同体の一つであるakt-1における活性化変異（mg 144）は、age-1(mg44)ヌル変異体のダウア停止表現型を抑制する変異を調べる遺 伝子スクリーニングにおいて同定された（モリスら（Morris）、Nature 382：53 6〜539、1996）。このスクリーニングは、PI3Kシグナル伝達によって負に調節さ れる分子における機能減少変異を単離するために、またはPI3Kシグナル伝達によ って正に調節される分子における機能増加変異を単離するためにデザインした。 活性化akt-1変異の他に、半数体ゲノム3800個のスクリーニングにおいて単離さ れた異なるサプレッサー変異10個の中で、本発明者らはまた、これまで既知の負 に調節された標的であるdaf-16の多数の対立遺伝子を単離し（ゴットリーブ＆ル ブクン（Gottlieb and Ruvkun）、Genetics 137：107〜120、1994；ラーセンら （Larsen）、Genetics 139：1567〜1583、1995）、このスクリーニングによって このインスリン様シグナル伝達経路において作用する遺伝子が明らかになること を示唆している。 mg144変異は、ノンセンス対立遺伝子の２つのクラスおよびPI3Kの保存領域に おける１つのミスセンス置換（Ala845Thr）を含む、調べた３つのage-1対立遺伝 子を抑制する（モリスら（Morris）、Nature 382：536〜539、1996）。mg144は 、age-1(mg44)のダウア構成的表現型の抑制に関して完全に優性である(age-1(mg 44 )；mg144/+動物の子孫の75.1％が非ダウアとして生育し、24.9％がダウア段階で 停止した、N＝774）。mg144はそれ自身明白な表現型を有しない；これは正常に 運動して、正常な陰門および同時期産子数を有し、ならびに餓えたプレート上お よびフェロモン処置したプレート上でダウアを形成する。このように、mg144は 、AGE-1 PI3Kシグナル伝達経路を正常なダウア段階停止に影響を及ぼす点までは 活性化しないものの、AGE-1 PI3K産物の必要性を軽減するために十分なほど経路 を活性化する。 age-1(mg44)のダウア構成的表現型の抑制を用いて、mg144を、染色体Vの多形S TSマーカーbP1の1.3mu以内の領域にマッピングした（図31）。この1.3mu領域に おけるC.エレガンスのゲノム配列から、本発明者らは、akt-１と名付けるC.エレ ガンスAkt/PKB相同体を同定した（図31）。Akt/PKBにおける活性化変異はage-1 PI3Kヌル変異体の遺伝的に優勢なサプレッサーとなる良好な候補物質であるため 、本発明者らはPCR増幅および直接シークエンシングを用いてmg144株におけるak t-1 DNA配列を決定した。mg144変異体株におけるakt-1遺伝子はAla183Thr置換を 有することが示された（図34）。akt-1は保存されたキナーゼドメイン内で異な るようにスプライシングされて、明確なキナーゼドメインサブ領域IV、V、およ びVI（13）を有するakt-1aおよびakt-1bイソ型（92％同一、全キナーゼドメイン に対してアミノ酸258個中238個；69％同一、異なるようにスプライシングされた 領域のアミノ酸64個中44個）を産生する。akt-1aはヒトAkt/PKBaと58％同一であ る（図33および34）。akt-1は、プレックストリン相同性ドメイン、キナーゼド メイン、およびAkt/PKBファミリーの証明であるAkt/PKB活性化に必要な２つの燐 酸化部位を有する（アレッシら（Alessi）、EMBO J．15：6541〜6551、1996）（ 図34）。次いで最も近縁の非Akt/PKB哺乳類キナーゼはラットのPKCb1で、これは akt-1aと38％同一である。akt-1(mg144)変異はakt-1の両スプライシング型に存 在し、N-末端プレックストリン相同性領域をC-末端キナーゼドメインと結合させ る蛋白質の領域に存在する。この変異はC.エレガンスと哺乳類のAkt/PKBの間で 保存されていない領域に存在する。mg144対立遺伝子が活性化変異であるため、 この変異によってakt-1上の負の調節領域が判明する可能性がある（下記参照） 。 遺伝的にakt-1に連鎖しているage-1のmg144抑制はakt-1における変異が原因で あることを確認するため、age-1(mg44)；akt-1(mg144)株におけるakt-1遺伝子活 性を減少させるためにRNA妨害（interference）（RNAi）と呼ばれる逆遺伝子ア ッセイを用いた（ファイアら（Fire）、Nature 391：806〜811、1998；ロッケリ ューら（Rocheleau）、Cell 90：707〜716、1997；ツァンら（Zhang）、Nature 390：477〜484、1997）。akt-1における変異がこの株に認められたage-1の抑制 の原因であるならば、この株におけるakt-1のRNAiは抑制表現型を逆転させ、ダ ウア構成的表現型を生じるはずである。この実験は、シス作用機能喪失変異が同 じ遺伝子における機能獲得変異を復帰させることができることを示す古典的な遺 伝子論争に、概念的には類似している。age-1(mg44)；akt-1(mg144)株においてa kt-1活性を阻害すればakt-1(mg144)抑制表現型を復帰させることは、mg144活性 化変異がakt-1座における病巣部であることを示した。 本発明者らはほぼ完全なC.エレガンスゲノム配列においてもう一つのAkt/PKB 相同体を同定し（ウィルソンら（Wilson）、Nature 368：32〜38、1994）、これ をakt-2と名付けた（図32）。akt-1およびakt-2は、互いにその他のAkt/PKB相同 体よりより近縁である（全体でakt-1aおよびakt-2の間の同一性66％）（図33） 。akt-2はヒトAkt/PKBaと全体で55％同一であり、ラットPKCb1と全体で35％同一 である。興味深いことに、akt-2はPDK1によるAkt/PKB活性化に必要なThr308燐酸 化部位を有するに過ぎず（アレッシら（Alessi）、Current Biology 7：261〜26 9、1997；ストコウら（Stokoe）、Science 277：567〜570、1997）、Ser473燐酸 化部位は有しないが（アレッシら（Alessi）、EMBO J．15：6541〜6551、1996） （図34）、なおもインスリン様シグナル伝達経路において明確に機能する（下記 参照）。 akt-1およびakt-2の双方の活性の低下により、それらがAGE-1 PI3Kからのイン スリン様シグナルをDAF-16フォーク状転写因子に伝達することが明らかとなった 。RNAiによるakt-1またはakt-2活性のいずれかを阻害してもダウア段階での停止 を引き起こさなかった。しかし、akt-1およびakt-2活性の双方を同時に阻害すれ ばダウア段階でのほぼ100％停止を引き起こした。本発明者らは、繁殖的生育を 行うにはakt-1またはakt-2のいずれかからのAkt/PKBシグナル伝達があれば十分 であるという結論に達した。この結果はakt-1およびakt-2がC.エレガンスにおけ るダ ウア形成に関して余剰に機能することができることを示し、様々な哺乳類のAkt/ PKBイソ型も同様に余剰に機能することができる可能性を提起している。重要な ことは、akt-1およびakt-2の双方による阻害によって誘導された構成的ダウア停 止は、daf-16のヌル変異によって十分に抑制される（オッグら（Ogg）、Nature 389：994〜999、1997）が、Smad相同体であるdaf-3のヌル変異（パターソンら（ Patterson）、Genes & Development 11：2679〜2690、1997）によっては抑制さ れないことであり、このことはDAF-2/AGE-1/DAF-16シグナル伝達経路に存在する ことを確認する。daf-16におけるヌル変異によってC.エレガンスのAkt/PKBシグ ナル伝達への必要性が軽減されるため、AKT-1およびAKT-2の主な機能はDAF-16に 拮抗することである。興味深いことに、DAF-16は、Akt/PKBによって燐酸化され る４つのコンセンサス部位を含み（アレッシら（Alessi）、FEBS Letters 399： 333〜338、1996）、これらの部位の３つはヒトDAF-16相同体AFX、FKHR、およびF KHRL1において保存されている。AKT-1およびAKT-2は、DAF-16を直接燐酸化する ことによってその負の調節作用を発揮する可能性がある。下記にAFX、FKHR、お よびDAF-16の比較を示し、コンセンサス燐酸化部位が保存されていることを示す 。表示のAKT部位はフォーク状ドメインのそれぞれ下流および上流に存在する（ 配列番号：161〜169）。 スコア＝151（68.4ビット）、予測＝1.9e-140、和P(8)＝1.9c-140 同一性＝28/54（51％）、陽性＝38/54（70％） スコア＝132（59.8ビット）、予測＝19e-140、和P(8)＝1.9e-140 同一性＝22/42（52％）、陽性＝28/42（66％） 本発明者らはヒトAKTがC.エレガンスのDAF-16を燐酸化し、この燐酸化がこれ らの部位に依存することを示した。これらの部位のセリンまたはトレオニンをア ラ ニンに置換すると、DAF-16（またはDAF-16の断片）のインビトロ燐酸化は消失す る。これらの変異体線虫においてDAF-16へのakt刺激がなければ、akt-1/akt-2遺 伝子活性を欠損する動物のように、ダウア段階での停止が起こるであろうと予想 される。 上記遺伝学の結果はAkt/PKBがPI3Kシグナル伝達の主な産物であることを示し 、Akt/PKBキナーゼの転写因子下流の標的であることを意味している。daf-16に おける変異は、akt-1およびakt-2機能低下を抑制するため、DAF-16はC.エレガン スのインスリン様シグナル伝達におけるAkt/PKBの主な産物となる可能性がある 。Akt/PKBは、細胞膜へグルコース輸送体を移動させる哺乳類のインスリン受容 体シグナル伝達に関係しており（コーンら（Kohn）、J．BIol．Chem．271：3137 2〜31378、1996）、およびGSK-3の直接燐酸化を通じてのグリコーゲン合成を調 節することが示されているが（クロスら（Cross）、Nature 378：785〜589、199 5）、２つの事象は転写的に調節されていない。また、C.エレガンスにおいても そのようなAkt/PKB産物が存在する可能性があるが、DAF-16フォーク状転写因子 はDAF-2/AGE-1/AKT-1/AKT-2インスリン受容体様シグナル伝達の主な産物となる （オッグら（Ogg）、Nature 389：994〜999、1997）。同様に、インスリン/IGF- 1抗アポトーシス経路におけるAkt/PKB作用（デュデタら（Dudek）、Science 275 ：661〜665、1997；カウフマン・ゼーら（Kauffmann-Zeh）、Nature 385：544〜 548、1997；クリクら（Kulik）、Mol.Cell．Biol．17：1595〜1606、199724〜26 ）もまた、DAF-16に関連する転写因子に収束する可能性がある。 繁殖的生育には通常age-1活性を必要とするが、これは野生型のakt-1の遺伝子 量を増加させればその必要性はなくなる。7.3kbのakt-1(+)ゲノム領域を有する トランスジェニックage-1(mg44)動物は、ダウア段階で停止せずに繁殖的に生育 することができる。高コピー数のakt-1(+)遺伝子を含むage-1(mg44)動物の75％ 以上がダウア段階で停止しないが、非トランスジェニックage-1(mg44)動物は必 ずダウア段階で停止する。akt-1(mg144)の高コピー数から増幅した同じゲノム領 域を有するage-1(mg44)動物を用いた同様の実験において、トランスジェニック 動物は同様の発生率でダウア段階で停止しなかった。低コピー数のakt-1(mg144 トランスジーンを有するage-1(mg44)動物は、低コピー数のakt-1(+)トランスジ ーンを有する age-1(mg44)動物より頻繁にダウア段階で停止しない(akt-1(mg144)トランスジー ンを有するage-1(mg44)動物では約85％がダウア段階を回避するのに対し、akt-1 (+)トランスジーンを有するage-1(mg44)動物では38％)。これらの結果は、akt-1 (mg144)株から増幅した同じ7.3kbのゲノム領域がakt-1(+)トランスジーンよりak t-1(mg44)のより強力な抑制物質であることを示している。これらのデータから 、mg144はAKT-1においてAka183Thr置換を含むakt-1の7.3kb領域にマッピングさ れる。これらのデータはまた、この変異がAKT-1の量または安定性を増加させ、 こうしてage-1シグナル伝達の非存在下での生育能を付与することによって、作 用する可能性があることを示唆しており。 age-1におけるヌル変異はRNA1によるakt-1およびakt-2の不活化と同じように ダウア段階での生育停止を引き起こす。これはakt-1(+)、akt-2(+)およびage-1( +)が繁殖的生育に必要であることを示している。優勢な対立遺伝子akt-1(mg144) はまた、age-1ヌル変異体のダウア構成的表現型の抑制能によって繁殖的生育を 促進するため、それはakt-1(+)およびakt-2(+)と同様に機能する。このようにak t-1における機能喪失またはドミナントネガティブ変異に対し、akt-1(mg144)は 活性化変異である。さらに、akt-1(mg144)およびakt-1(+)遺伝子のさらなるコピ ーを提供することはいずれも、age-1ヌル変異体を抑制するという事実は、akt-1 (mg144)が活性化変異であることと一致する。 akt-1(mg144)は、３つのage-1対立遺伝子のダウア構成的表現型を抑制する。a ge-1(mg44)はヌル変異体であるため、これらのデータはakt-1がage-1の下流で作 用することを示唆し、Akt/PKBキナーゼのPI3K上流の生化学的順序もまた、無傷 の生体に当てはまることを示している。AGE-1はチロシンキナーゼ受容体によっ て調節されるタイブのC.エレガンスにおける唯一のPI3K相同体である。重要なこ とは、本発明者らの結果は、akt-1(+)過剰発現のみならずakt-1(mg144)がAGE-1 PI3Kにおけるヌル変異を抑制するため、Akt/PKB活性が増加する場合には、C.エ レガンスのAkt/PKB遺伝子活性は上流のage-1活性に厳密には依存しないことを証 明している。これは、機能低下対立遺伝子であるdaf-16(m27)（リンら（Lin）、 Science 278：1319〜1322、1997）およびdaf-16無効対立遺伝子（オッグら（Ogg ）、Nature 389：994〜999、1997）による抑制と同等である。 daf-2における変異は、daf-16における機能低下変異の場合ほどakt-1(mg144) によっては抑制されない。akt-1(mg144)によって抑制されたage-1対立遺伝子は 無効であるが（モリスら（Morris）、Nature 382：536〜539、1996）、daf-2(el 370)はキナーゼドメインにおける温度感受性変異である（キムラら（Kimura）、 Science 277：942〜946、1997）。このdaf-2対立遺伝子は、無効対立遺伝子（ゴ ットリーブ＆ルブクン（Gottlieb and Ruvkun）、Genetics 137：107〜120、199 4；ラーセンら（Larsen）、Genetics 139：1567〜1583、1995；オッグら（Ogg） 、Nature 389：994〜999、1997）を含む多くのdaf-16対立遺伝子によって完全に 抑制される。akt-1(mg144)はAGE-1 PI3Kシグナル伝達を必要としないがDAF-2イ ンスリン受容体様シグナル伝達は必要とするため、akt-1(mg144)はdaf-2の下流 のシグナル伝達経路に分岐が存在することを示している。age-1およびakt-1はDA F-2からの一つの主なシグナル伝達経路を構成し、まだ他の同定されていない遺 伝子が１つ以上の平行した経路を構成する可能性がある。これらの経路はAGE-1 の下流で収束し、DAF-16フォーク状転写因子のところで、またはその上流で収束 し、そしてdaf-16における機能喪失変異はdaf-2およびage-1変異の双方を完全に 抑制することから、その活性を負に調節する（ゴットリーブ＆ルブタン（Gottli eb and Ruvkun）、Genetics 137：107〜120、1994）。この平行する経路からの シグナル伝達が存在する場合に、AGE-1 PI3KまたはAKT-1/AKT-2シグナル伝達が 減少すればダウア段階での停止を誘導するため、両者は繁殖的生育にとって必要 である。多数のDAF-2インスリン受容体様産物の遺伝的証拠から、平行なPI3K、r as、SHP2、およびその他のシグナル伝達産物が哺乳類においてインスリン受容体 によって活性化されることを示す（カーン（Kahn）、Diabetes 43：1066〜1084 、1994）生化学試験は、無傷の生体におけるインスリン受容体様シグナル伝達に とって適切であるこが示される。 接合子のage-1活性が低下すればC.エレガンスの寿命は２倍以上増加する（モ リスら（Morris）、Nature 382：536〜539、1996；ラーセンら（Larsen）、Gene tics 139：1567〜1583、1995；クラス（Klass）、Mech．Ageing Dev．22：279〜 286、1983）。daf-16における変異はこの寿命の増加を抑制する（ラーセンら（L arsen）、Genetics 139：1567〜1583、1995；ドーマンら（Dorman）、Genetics 14 1：1399〜1406、1995）。akt-1(mg144)はage-1(mg44)による寿命の増加を抑制し ない（以下の株に関して、平均寿命、最大寿命を示す：N2 12日、16日、N=28；s qt-1(sc13)age-1(mg44)18日、36日、N=20；sqt-1(sc13)age-1(mg44);akt-1(mg14 4)22日、38日、N=36；daf-16(m27);sqt-1(sc13)age-1(mg44)14日、16日、N=32） 。このようにakt-1(mg144)は、繁殖的生育においてAGE-1シグナル伝達を必要と しないが、正常な加齢経路を活性化しない。age-1(mg144)は野生型akt-1またはa kt-2の全ての機能に役立たない可能性がある。akt-2、または他のまだ同定され ていないage-1の下流のイフェクターは、寿命の調節に関して直接関係があるシ グナル伝達分子であるかも知れない。 akt-1およびakt-2の双方の発現パターンを、それぞれのゲノム座の緑色蛍光蛋 白質（GFP）との翻訳融合物を含むトランスジェニック動物において調べた（シ ャルフィーら（Chalfie）、Science 263：802〜805、1994）。GFP融合蛋白質は 、C-末端でGFPとインフレームで融合させた、5'上流調節配列を含むakt-1または akt-2いずれかからの全ゲノムコード領域を含む。AKT-I/GFP発現は後期胚におい てまず認められ、その動物の一生の間維持される。胚以降の動物では、AKT-1/GF Pは知覚神経を含む頭部神経の大部分に発現されている。発現はまた、腹側およ び背側神経索の運動神経、全身の神経交連部および突起、ならびに尾神経にも認 められる。融合蛋白質は細胞体全体ならびに神経の軸索および樹状突起に局在し ているが、通常核には存在しない。一貫してAKT-1/GFPを発現しているさらなる 組織には、咽頭の神経および筋肉、直腸腺細胞、ならびに受精嚢が含まれる。AK T-1/GFP発現は、皮下、腸、筋肉を含む多様な細胞タイプ、陰門を形成するP細胞 子孫のいくつか、および分泌管であると考えられる構造においてより多様に認め られた。akt-1およびakt-2の余剰的役割と一致して、AKT-2/GFPの全長の蛋白質 融合遺伝子は、AKT-1/GFPと同じ回数発現され、そしてAKT-2/GFPはより少ないよ うに思われるもののAKT-1/GFPを発現する同じ組織において発現される。混雑し たプレート上での飢餓によって誘発されたダウアではAKT-1/GFPおよびAKT-2/GFP 発現は繁殖的生育の際の発現と劇的な差はない。これらの発現パターンは、ダウ ア段階での停止および代謝シフトを調節するために分泌神経において、またはダ ウア形成の際に再形成される標的組織のいずれかにおいて、AKT-1およびAKT-2が 機能することと 一致する。 代謝シフトおよびダウア形成に関連した生育停止を調節するAKT-1およびAKT-2 の役割は、以下のモデルを示唆する。正常な生育条件下では、インスリン様分子 がDAF-2インスリン受容体キナーゼに結合して自己燐酸化およびAGE-1 PI3Kの動 員を誘導する。本明細書において考察するように、PI3KはAkt/PKBを通じてシグ ナルを伝達する。その他の系における生化学実験からの先例（フランケら（Fran ke）、Cell 81：727〜736、1995；フランケら（Franke）、Science 275：665〜6 68、1997；クリッペルら（Klippel）、Mol．Cell Biol．17：338〜344、1997） は、AGE-1活性化が、活性化にとって必要な燐酸化事象を起こしやすくするよう に蛋白質の構造変化を誘導することによって、AKT-1およびAKT-2に結合してこれ を活性化する燐脂質を産生することを示唆している（アレッシら（Alessi）、Cu rrent Biology 7：261〜269、1997；ストコウら（Stokoe）、Science 277：567 〜570、1997）。平行な経路またはDAF-2インスリン受容体様受容体からの経路も 同様に活性化される。AKT-1およびAKT-2キナーゼは、平行な経路からの分子と共 に、おそらく燐酸化によってDAF-16活性を負に調節する。燐酸化されたDAF-16は 不活性となる、繁殖的生育および代謝にとって必要な遺伝子を活性化するように 機能する、またはダウア段階での停止およびエネルギー保存に必要な遺伝子を抑 制するであろう。DAF-2によって活性化されるその他のシグナル伝達分子もまた 、代謝および寿命に関する適切な調節を行うためには、AGE-1（例えば、DAF-16 またはAKT-1/AKT-2）の下流で収束しなければならない；AGE-1 PI3KまたはAKT-1 /AKT-1活性の喪失によって誘発されたダウア段階での停止は、ダウア段階での停 止を引き起こすためにはこれらのDAF-16への刺激の一つが喪失すれば十分である ことを意味している。ダウア誘発条件下では、DAF-2、AGE-1、AKT-1/AKT-2およ びDAF-2からのその他のシグナル伝達経路は不活性で、したがってDAF-16はおそ らく燐酸化されないために活性である。活性なDAF-16は繁殖的生育および代謝に 必要な遺伝子を抑制するか、またはダウア段階での停止およびエネルギー保存に とって必要な遺伝子を活性化するかのいずれかである。 DAF-16フォーク状蛋白質は、DAF-3、DAF-8、またはDAF-14 Smad蛋白質と相互 作用してTGF-β様神経内分泌シグナルをインスリン様シグナルと収束統合させる こ とが示唆されている（オッグら（Ogg）、Nature 389：994〜999、1997；パター ソンら（Patterson）、Genes & Development 11：2679〜2690、1997）。DAF-16 はダウア誘導条件下ではこれらの下流の遺伝子を調節するためにDAF-3 Smad蛋白 質と複合体を形成する可能性がある（オッグら（Ogg）、Nature 389：994〜999 、1997）が、AKT-1がDAF-16を燐酸化すれば、繁殖的生育の際のSmad/フォーク状 蛋白質複合体の形成が阻害される可能性がある。 このモデルは、Akt/PKBが、インスリン受容体様シグナル伝達をC．エレガンス におけるDAF-16フォーク状転写因子による転写産物とカップリングさせるという 遺伝子からの証拠に基づいており、Akt/PKBが系統発生を超えてインスリン様シ グナル伝達の転写産物を有することを予測する。DAF-16転写因子のヒト相同体（ AFX、FKHR、FKHRL1およびAF6q21）は、ヒトにおけるインスリンシグナル伝達に 直接関係する下流のイフェクターである可能性があることは以前に示唆されてい た（オッグら（Ogg）、Nature 389：994〜999、1997）。最近の報告書はAkt/PKB が保存されたインスリン反応配列（CAAAAC/TAA）を通じてHepG2細胞においてイ ンスリン様増殖因子結合蛋白質-1（IGFBP-1）遺伝子のインスリン依存的抑制を 媒介することを示している(チチーら（Cichy）、J．Biol．Chem．273：6482〜64 87、1998)。興味深いことに、本発明者らはDAF-16がインビトロで同じインスリ ン反応配列に結合することを発見した。本発明者らは、Akt/PKBがDAF-16のヒト 相同体：AFX、FKHR、FKHRL1またはAF6q21を通じてIGFBP-1のようなインスリン反 応性遺伝子に及ぼすその転写作用を媒介すると提唱する。PDK 遺伝子学 akt-1(mg144f)対立遺伝子を作製した同じ遺伝子スクリーニングから、本発明 者らはもう一つのage-1抑制物質であるmg142を同定した。この変異もまた上流の age-1シグナル伝達の必要がなく、遺伝的に優性である。遺伝子マップではC.エ レガンスの相同体が存在する領域にこの変異が存在する。開始コドンの60bp上流 から開始して停止コドンの60bp下流で終了するpdk-1のゲノム配列を図35に示す （配列番号：158）。図36および37は２つのC.エレガンスpdk-1スプライシング型 であるpdk-1a（図36；配列番号：159）およびpdk-1b（図37：配列番号：160）を 示す。pdk-1(mg142)機能獲得変異はAka303Val（スプライシング１）である。こ の蛋 白質は、下記の配列番号：170〜199に示すように、プレックストリン相同性ドメ インにおいて哺乳類のPDKと58％同一であり、キナーゼドメインと39％同一であ る。 mg142変異をこのオープンリーディングフレームにマッピングすると、この蛋 白質の機能が確立される。これは他の既知のキナーゼよりPDKに対してはるかに 近縁である。PDKはAKT上で必須セリン残基を燐酸化して、その活性化に寄与する 哺乳類のキナーゼである。このセリンは、akt-1およびakt-2において保存されて いる。このようにPDKはmg142変異の優れた候補遺伝子である。pdk-1を有する遺 伝子領域をmg142株から増幅し、PDKキナーゼドメインの保存領域におけるアミノ 酸置換を検出した。pdkにおける機能獲得変異は、PDKがAKTの上流で作用してこ れを活性化することを示す生化学研究と一致するが、この遺伝子研究は、PDKが 活性化されれば（例えばmg142変異によって）、mg142はage-1無効対立遺伝子を 抑制するため、AGE-1 PIP3からのPI3Kシグナル伝達は必要でないことを示唆して いる。この置換がage-1によるダウア段階での停止の抑制を引き起こすことを確 立するために、akt-1(mg144gf)変異を分析するために用いる戦略と類似の戦略を 利用してもよい。 本発明者らは、C.エレガンスのインスリンシグナル伝達経路におけるPDKの関 与を示唆したため、ヒトPDK1は糖尿病の変化に対する候補遺伝子となる。ヒトPD K1における変異は、いくつかの家系に糖尿病を引き起こす遺伝子変化の基礎とな る可能性がある（フィンチ(Finch)、前記）。同様に、PDKを活性化する薬剤は、 C.エレガンスのpdk-1を活性化するmg142変異と同様に、そのような上流の欠損を 有する何人かの糖尿病患者において上流のシグナル伝達の必要をなくす可能性が ある。アラニン303位でC.エレガンスのpdk-1と相同なヒトPDK1の領域は、結合し てシグナル伝達を活性化する薬剤をスクリーニングするための良好な候補となる 。同様に、C.エレガンスのakt-1機能獲得変異がマッピングされるキナーゼドメ インとPHドメインの間のヒトAKT領域は、AKTを活性化する薬剤のデザインのよい 候補となる。C.エレガンスにおけるそのような活性化されたAKTは、AGE-1 PI3K からの上流のシグナル伝達の必要性をなくし、同様にインスリンとAKTの間のイ ンスリンシグナル伝達に欠損を有する糖尿病患者を治療する可能性がある。休眠および寿命 弱いdaf-2およびage-1変異体はダウア段階で停止しないにもかかわらず、野生 型よりはるかに長く生きる（ラーセンら（Larsen）、Genetics 139：1567〜1583 、1995；ケニオンら（Kenyon）、Nature 366：461〜464、1993；ドーマンら（Do rman）、Genetics 141：1399〜1406、1995）。寿命と休眠制御のこのような関係 はC.エレガンスに独自のものではない可能性がある。休眠期停止は、特に季節毎 の温度および湿度が極端になる地域では、多くの脊椎動物および無脊椎動物のラ イフサイクルに不可欠な特徴である（タウバーら（Tauber）、「昆虫の季節への 順応（Seasonal Adaplation of Insecis）」、Oxford University Press）ニュ ーヨーク、ニューヨーク州、1986）。休眠期で停止する動物はその代謝および加 齢速度を遅らせ、繁殖的寿命よりはるかに長い期間生存することができる（タウ バーら（Tauber）、前記）。 インスリン様DAF-2/AGE-1シグナル伝達はC．エレガンスの休眠期寿命制御を媒 介するため、哺乳類のインスリンシグナル伝達経路も同様に寿命を制御する可能 性がある。実際に、DAF-2シグナル伝達の減少に関連した寿命の増加はカロリー 制限に関連した哺乳類の寿命の増加に類似している（フィンチ（Finch）、「寿 命、老化、そしてゲノム（Longevity，Senescence and the Genome）」、The Un iversity of Chicago Press、シカゴ、1990）。カロリー制限によってインスリ ンシグナル伝達が減少し、弱いdaf-2およびage-1変異体において誘導されるよう な部分的休眠状態が誘導される可能性はある。休眠様状態の誘導は、C.エレガン スのように繁殖後の寿命に影響を及ぼす可能性がある。または、寿命の増加を引 き起こすのは休眠そのものよりもむしろ代謝そのものの様式および速度の変化で ある。もう一つの長命なC.エレガンス変異体であるclk-1もまた、そのような代 謝作用によって寿命を調節する可能性がある（エウバンタら（Ewbank）、Scienc e 275：980〜983、1997）。代謝速度と寿命との関連はまた、フリーラジカル産 生と加齢との関連とも一致する（フィンチ（Finch）、前記）。インスリンおよびTGF-βシグナル伝達経路による代謝および休眠の相乗的制御 DAF-2シグナル伝達の他に、DAF-7 TGF-β神経内分泌シグナルもまたC.エレガ ンスの繁殖的生育にとって必要である（レンら（Ren）、Science 274：1389〜13 91、1996；シャックウィッツら（Schackwitz）、Neuron 17：719〜728、1996） 。これらの２つの経路におけるシグナルは余剰ではない：daf-2シグナル伝達ま たはdaf-7シグナル伝達のいずれかを喪失した動物（図３）は、その代謝をシフ トさせ 、ダウア段階で停止する（表VII）。さらに、いずれかの経路における変異によ って引き起こされた表現型は強く相乗作用を示し、このことは２つの経路が統合 されることを示唆している。上記のように同期させた卵を生育させて計数した。 daf-1(m40)およびdaf-2(el370)は、25℃で100％ダウアを形成する。表VIIに示す 数値はダウア形成の割合および計数した動物数（括弧内）を示す。示したデータ は個々の３つの試験の合計である。 表VII．daf-1およびdaf-2の相乗作用 ％ダウア形成率 このデータは、DAF-7 TGF-βシグナルおよびDAF-2リガンドインスリン様シグナ ルが統合されることを示す。このモデルの根拠として、daf-2インスリンシグナ ル伝達経路およびdaf-7 TGF-βシグナル伝達経路における弱い変異は、非常に相 乗的である（表VII）。遺伝子エピスタシス分析はDAF-7およびDAF-2経路が連続 しているというよりむしろ平行であることを示している（ボウウェルズ＆トーマ ス（Vowels and Thomas）、Genetics 130：105〜123、1992；ゴットリーブ＆ル ブタン（Gottlieb and Ruvkun）、Genetics 137：107〜120、1994）。すなわち 、daf-16変異はdaf-2変異を強く抑制するがdaf-7、daf-1、またはdaf-4変異は抑 制しないのに対し、daf-3変異はdaf-7、daf-1、またはdaf-4変異を強く抑制する が、daf-2変異を抑制しない。アフリカツメガエルの中胚葉誘導におけるアクチ ビンとFGFチロシンキナーゼ経路の間でも類似の相乗作用が認められている（グ リーンら（Green）、Cell 71：731〜739、1992）。 ダウア誘導フェロモンはASI知覚神経によるDAF-7の産生を調節する（レンら（ Ren）、Science 274：1389〜1391、1996；シャックウィッツら（Schackwitz）、 Neuron 17：719〜728、1996）。daf-7ノンセンスまたは切断変異を有する動物は フェロモンに反応するため（ゴールデン＆リドル（Golden and Riddle）、Proc. Nall．Acad．Sci．U.S.A．81：819〜823、1984）、本発明者らはDAF-2のインス リン様リガンドの産生もフェロモンによって調節されることをさらに示唆する。 これらのDAF-7およびDAF-2シグナルが標的組織またはその他の調節（すなわちホ ルモン様）細胞に収束するか否かはまだ明確でない；しかし、本質的に全ての標 的組織（下記）においてDAF-7受容体経路遺伝子が発現されていることから、収 束がそこで起こっていることが示唆される。DAF-7 と糖尿病 本明細書のデータに基づき、本発明者らは、C.エレガンスの場合と同様に、ヒ トにおいてもDAF-7様神経内分泌シグナルおよびインスリンの双方がインスリン による代謝制御に必要であることを提唱する。このモデルによれば、II型糖尿病 患者において標的組織がインスリンシグナルに反応することができなければ、そ れはインスリンまたはTGF-β様制御経路のいずれかにおける欠損が原因であろう 。系統分析によって、II型糖尿病に強い遺伝子成分が存在することが示された（ カーンら（Kahn）、Annu．Rev．Med．47：509〜531、1996）。さらに、肥満もま たII型糖尿病の主要な危険因子である（カーンら（Kahn）、Annu．Rev．Med．47 ：509〜531、1996）。遺伝子または肥満によるDAF-7様シグナル伝達経路の減少 （ホタミスリグリら（Hotamisligli）、Science 259：87〜91、1993；ロンクビ ストら（Lonnqvist）、Nat Med．1：950〜953、1995）は、C.エレガンスのdaf-7 変異体がdaf-2変異体と非常に類似した代謝欠損を引き起こすように、II型糖尿 病におけるインスリンに対する反応の欠如の基礎となり得る。DAF-7およびDAF-2 経路が収束するという発見はDAF-7ホルモンシグナルが糖尿病状態（例えばII型 糖尿病）では欠損していること、およびヒトDAF-7を投与すれば耐糖能障害、ケ トアシドーシス、および糖尿病に関連したアテローム性動脈硬化症の改善に有用 であることを示している。これは図17、18および23に略図として示す。 DAF-7 TGF-β様およびDAF-2インスリン様シグナル伝達経路は収束して休眠お よび代謝を制御するが、ダウア形成の非存在下では、再生的成虫段階での寿命の 制御に関係するのはDAF-2/AGE-1経路に限られる（ラーセンら（Larsen）、Genet ics 139：1567〜1583、1995；ケニオンら（Kenyon）、Nature 366：461〜464、1 99 3；ドーマンら（Dorman）、Genetics 141：1399〜1406、1995；モリスら（Morri s）、Nature 382：536〜539、1996）。ダウア幼虫は繁殖的C.エレガンスよりは るかに長命であるため、双方の経路はダウア段階での停止に関連した寿命の増加 を制御する（リドル（Riddle）、「シーエレガンス（Caenorhabiditis elegans ）II」、リドル、ブルメンタール、メイヤー、プリース（D．Riddle，T．Blumen thal，B．Meyer，J．Priess）編、Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spri ng Harbor、ニューヨーク、1997、739〜768頁、ケニオン（Kenyon）、前掲書中 、791〜813頁；チャイエン＆ビテンスキー（Chayen and Bitensky）、「実践的 組織化学（Practical Histochemistry）」、Chichester、ニューヨーク：ウイレ イ、1991）。寿命に関するDAF-7とDAF-2の調節の違いはまた、DAF-2経路による 代謝の調節がDAF-7経路より深遠であることの表れであろう（図４）。例えば、 他のシステムにおけるTGF-βシグナル伝達からの先例およびC.エレガンスにおけ るこの経路の分析に基づいて、DAF-7 TGF-β経路の既知のシグナル伝達産物は全 て下流のSmad転写調節を通じて行われる（下記）。インスリンのシグナル伝達お よびこれを拡張したDAF-2シグナル伝達はさらに枝分かれする：この受容体から の産物は糖輸送、代謝酵素活性、これらおよびその他の酵素をコードするmRNAの 翻訳と共に転写を調節する（ホワイト＆カーン（White and Kahn）、J．Biol．C hem．269：1〜4、1994）。本発明者らは寿命を制御するのは、DAF-2経路とは異 なる調節産物であることを示唆している。またはTGF-βおよびインスリン様シグ ナルは、休眠が調節されるL1段階に限って収束する可能性があり、この段階以降 では正常な代謝制御に必要であるのはDAF-2シグナル伝達に限られる。 C.エレガンスの休眠制御にインスリンおよびTGF-βシグナル伝達が関係してい ることは、相同なヒト経路も同様に飢餓に対する反応を媒介する可能性があるこ とを示唆している。環境の極端な変化に合わせてC.エレガンスのダウア形成を調 節する遺伝子経路の変化を選択することができるように、ヒトの歴史における飢 餓および渇水によってdaf遺伝子のヒト相同体において類似の変種が選択された 可能性がある。実際に、dbまたはob劣性糖尿病遺伝子のいずれかを有するヘテロ 接合マウスは、絶食の中でも野生型対照より約20％長く生存する（コールマン（ Coleman）、Science 203：663〜665、1979）。多くのヒト集団においてII型糖尿 病 の発生率が高いことは、そのような選択の遺産であるかも知れない。DAF-3 Smad 蛋白質はC.エレガンスのダウア調節経路においてDAF-7 TGF-β受容体 シグナル伝達に拮抗する 環境シグナルに反応して、C.エレガンスは、解剖学的および代謝的に明確な第 ３幼虫ダウア段階で生育を停止する（リドル（Riddle）、「シーエレガンス（C. elegans）N」、リドル、ブルメンタール、メイヤー、プリース（D.L．Riddle，T ．Blumenthal,B.J．Meyer，J．R．Priess）編、Cold Spring Harbor Press、ニ ューヨーク、1997、739〜768頁）。フェロモンシグナルは、ダウア幼虫において 再形成される多くの組織の生育における変化を誘発する（リドル（Riddle）、上 記）インスリン関連シグナル伝達経路（下記に記述のように）と共に、TGF-βシ グナル伝達経路にカップリングする（レンら（Ren）、Science 274：1389、1996 ；シャックウィッツら（Schackwitz）、Neuron 17：719〜728、1996）化学知覚 神経（バーグマン＆ホルビッツ（Bargmann and Horvitz）、Science 251：1243 、1991）によって伝達される。daf-7（TGF-β相同体（エステルベスら（Esterve z）、Nature 365：644、1993）、daf-4（II型TGF-β受容体（エステルベスら（E stervez）、Nature 365：644、1993））、daf-1（I型TGF-β受容体）、daf-8、 およびdaf-14（Smad相同体）における変異は、フェロモンの非存在下においても ダウア段階での構成的停止を引き起こす。これらの遺伝子は非ダウア生育の際に 活性である神経内分泌シグナル伝達経路を構成する：DAF-7 TGF-βシグナルは非 ダウア生育の際に知覚神経ASIによって産生されるが、この神経におけるdaf-7発 現は、ダウア誘発条件では阻害される（レン（Ren）、前記）。 daf-7およびその受容体ならびにSmad蛋白質はdaf-3の拮抗剤である。daf-7シ グナル伝達経路遺伝子の変異におけるダウア構成的表現型（推定のヌル変異を含 む）は、daf-3における変異によって完全に抑制される。これらの遺伝子データ はdaf-7シグナル伝達の非存在下ではdaf-3がダウア段階での停止を誘導するよう に作用することを示している。 この経路におけるDAF-3機能の分子的根拠を識別するために、本発明者らはdaf -3の配列および発現パターンを決定した。daf-3遺伝子領域におけるコスミドの 遺伝子活性の有無を形質転換によってアッセイした。コスミドB0217は部分的にd af -3変異を相補したが、その領域からの他のコスミドは相補しなかった（図5A）。 Smad相同体のみを含むがその他のコード領域を含まないB0217のサブクローンも またdaf-3を救出した。Smad相同体における変異（下記参照）を検出したことに より、daf-3に対するその割当が確認された。daf-3 cDNAの分析により、遺伝子 がエキソン15個から転写されたこと、そしてSmad蛋白質において保存された領域 の上流で異なるようにスプライシングされたことが判明した（図5B）。これらの 異なるようにスプライシングされたイソ型の生物活性は不明である。DAF-3のヌ クレオチド（配列番号：11）およびアミノ酸配列（配列番号：12）をそれぞれ、 図11および12に示す。 ここまでは、C.エレガンスのDAF-3 Smad蛋白質は、配列においてSmad1、Smad2 およびSmad3の推定の共因子であるDPC4と最も近縁である（ツァングら（Zhang） 、Nature 383：168、1996；ラグナら（Lagna）、Nature 383：832、1996；サベ ジら（Savage）、Proc．Natl．Acad．Sci．93：790、1996；ハーンら（Hahn）、 Science 271：350、1996）。Smadは２つの保存されたドメインを有する（ラナら （Wrana）、Trends Genet．12：493、1996）。DAF-3はこれらの２つのドメイン を有する；その最も近縁であることがわかっているDPC-4と比較して、daf-3はド メインIとのアミノ酸同一性が55％、およびドメインIIと30％である（図5C）。 しかし、DPC-4は哺乳類DAF-3相同体ではない；C.エレガンスのSma-4は例えばDAF -3よりDPC-4に近縁である。 本発明者らはdaf-3における３つの変異を同定し、その全てがdaf-7(el372)の 抑制物質として単離された。mgDf90は、全Smad遺伝子を除去する15〜90kbのホモ 接合生存欠失である（図5A）。mgDf90は、株GR1300においてdaf-7を抑制した自 然発生変異として同定された（daf-7(el372)111；mu1-6(st 702)unc-22(S1192)I V）。このようにdaf-3のdaf-7ダウア構成的表現型の抑制がdaf-3無効表現型であ り、このことは野生型のDAF-3がDAF-7 TGF-β経路のシグナル伝達に対して拮抗 的に作用することを示している。daf-3(mg125)およびdaf-3(mg132)は、ドメイン 1および2において保存残基をそれぞれ変化させるミスセンス変異である（図5C） 。その他のSmadsにおいて検出された変異のほとんどはドメインIIのアミノ酸45 個の部分に局在する（ラナら（Wrana）、Trends in Genet．12：493、1996）。 変異の集団発 生はDPC4においても認められ、それに関してホモ接合であるヌル変異が確認され ており（ハーンら（Hahn）、Science 271：350、1996）、そのため集団発生は非 ヌル変異の選択が原因である可能性は低い。このホットスポット領域を９個のda f-3対立遺伝子においてシークエンシングしたが、変異は検出されなかった。変 異の位置のこのような差は単純な統計上の異常、またはDAF-3とその他のSmad蛋 白質の機能的な差を示す可能性があり、DAF-3が上流のTGF-βによって活性化さ れると言うよりはむしろ拮抗されるという事実と一致する。 DAF-3がダウア形成の制御において機能する可能性があるか否かを調べるため に、本発明者らは機能的daf-3/緑色蛍光蛋白質（GFP）融合遺伝子の発現パター ンを調べた。これはpGP8からのAvrII/SacI断片を、いくつかの制限部位を停止コ ドンの前のdaf-3の最後のコドンの後に挿入したPCR産物と置換することによって 得られた。pPD95.81からのGFP/unc-54の3'末端PCR産物は3'制限部位にクローニ ングしてpGP19を産生した。このDAF-3/GFP融合は部分的にdaf-3変異体を救出す る（図７）。したがって、GFP蛍光はDAF-3の機能的位置を示している。ASI神経 からのDAF-7シグナル伝達はL1段階に始まり、様々な環境条件下での神経の切断 およびダウア形成アッセイから、ダウア形成に対するシグナルも最初の２つの幼 虫段階の間に伝達されることを示している（レンら（Ren）、Science 274：1389 、1996；シャックウィッツら（Schackwitz）、Neuron 17：71９、1996；バーグ マン＆ホルビッツ（Bargmann and Horvitz）、Science 251：1243、1991；ゴー ルデン＆リドル（Golden and Riddlc）、Developmental Biology 102：368、198 4；スワンソン＆リドル（Swanson and Riddle）、Developmental Biology 84：2 7、1981）。したがって、本発明者らはL1幼虫を最も重点的に調べた。 ほとんどあらゆるトランスジェニック動物が頭部神経（図6A）、腹部神経索（ いずれも細胞体および突起、図6B参照）、腸細胞（図6C）、特に腸管に隣接する 膜、尾の皮下、および尾神経において強いdaf-3/AFP発現を示した。全てのGFPス コアに関して、動物は25〜26℃で生育させた。野生型およびダウアの構成的変異 体のバックグラウンドでのDAF-3/GFPのスコアに関して、それぞれの場合におい て３つ以上の株を採点した。発現パターンを決定するために多数の動物を調べ、 動物少なくとも30匹を頭から尾まで採点し、発現をそれぞれの組織に関して記録 し た。トランスジェニック動物の約半数がV芽球、P芽球、hyp 7皮下細胞および咽 頭に弱い発現を有する。弱い発現では細胞は同定できないが、咽頭の主部分は強 く、咽頭筋に発現されていることを意味している（図6A）。背側の体壁筋では発 現の検出はまれである。老齢の幼虫および成虫における発現パターンはL1動物と 同じである。さらに、DAF-3/GFPは遠位先端細胞およびその前駆体Zl.aおよびZ4. pでは生育の間中発現される（図6D、図８）。DAF-3/GFPはまた同定してない陰門 細胞においても強く発現される。細胞200〜400個の野生型の胚では、DAF-3/GFP は胚全体に均一に発現される（図6E）。繁殖的生育を促進する実験条件下では、 DAF-3/GFP蛋白質の細胞下局在部位は主に細胞質（図6B〜E、下記参照）である。 DAF-3活性はDAF-1およびDAF-4 TGF-β受容体によって調節される可能性がある ため、本発明者らは野生型におけるDAF-4/GFP融合体の発現を調べた（図6A〜6G ）。この構築物はdaf-4変異体を相補する。コスミドCO5D2からの10kbのSalI断片 は、daf-4転写開始部位の上流の配列３kbおよびdaf-4の最後の残基14個に関する コドンを除くdaf-4コード領域の全てを含む。この断片をGFPプラスミドTU#61のS alI部位にサブクローニングした（シャルフィーら（Chalfie）、Science 263：8 02〜805、1994）。このプラスミドをdaf-4(m72)株に注射して融合体のDAF-4活性 を試験した。トランスジェニック動物の95％以上がdaf-4(m72)のダウア構成的お よび小さい表現型に関して救出され、このことは融合体が強いDAF-4活性を有す ることを示している。DAF-4/GFP発現パターンは、DAF-4/GFPが膜に局在すること を除いてはdaf-3/GFPと類似しており、受容体としてのその役割と一致している 。DAF-4/GFPは咽頭（図6F〜G）においてより強く発現され、腹側神経索細胞体お よび皮下体（body hypodermis）ではより弱い。野生型動物におけるDAF-4/GFPの 発現はDAF-3/GFPより遅れて検出される。DAF-4/GFPは胚がL1幼虫に類似してくる 後期胚形成期に初めて検出される。DAF-4/GFP構築物はDAF-3/GFPの場合よりも古 い型のGFPを含む；より古い型では発色団の成熟に時間を要する。DAF-4/GFPおよ びDAF-3/GFPの胚発現における差が、daf-4株では成熟までの時間がより遅いこと に関する人為的誤差ではないことを確認するために、本発明者らは抗GFP抗体を 用いてGFPをアッセイした。これらの抗体はGFPの２つの型を等しく認識するはず である。本発明者らは抗体が直接的なGFP蛍光を用いた場合の結果を再現するこ とを発見し た。すなわちDAF-3/GFPは初期胚において発現されるが、DAF-4/GFPはそうではな い。DAF-4/GFPはまたDAF-3/GFPとは異なり、腸管周囲の膜には発現されない。 DAF-3とDAF-4発現パターンを組み合わせると、これらの遺伝子が標的組織にお いてフェロモンによって調節されるDAF-7神経内分泌シグナルを伝達するように 作用することが示唆される。胚にDAF-3が初期発現されることはまた、胚の発生 においてDAF-3が、例えばL1段階においてDAF-7 TGF-βシグナル伝達に拮抗する 神経内分泌シグナルを発する神経経路の発達を媒介するように作用するモデルと 一致する。しかし、本発明者らのデータはDAF-3がL1およびL2段階での環境的シ グナルの伝達において機能することを示している。これは以下の知見から支持さ れる。（1）ASI神経からのDAF-7 TGF-βシグナルはL1およびL2段階において起こ り、ダウア誘導環境条件によって抑制される。（2）DAF-4 II型受容体の発現は 胚発生の非常に初期に始まる。（3）DAF-3およびDAF-4の発現パターンはダウア 形成の際に再形成される組織のほとんどにおいて一致する。例えば、皮下によっ て分泌されるクチクラは改変され、咽頭は細くなり、腸管は回旋状の度合いが減 少する。さらに体性腺発育はダウアで停止し、DAF-3が発現される遠位末端細胞 はその発育の重要な調節物質である（キンブル（Kimble）、Developmental Biol ogy 87：286、1981）。さらに、ダウア幼虫の腸および皮下は脂肪の貯蔵が大き く、これは代謝が脂肪保存へシフトしたことを示す。これらの標的組織において DAF-4 TGF-βファミリー受容体キナーゼおよびDAF-3 Smad蛋白質がいずれも発現 されることは、ASI神経からのDAF-7神経内分泌シグナルが非ダウア形成時にこれ らの組織によって直接受領されるというモデルと一致する。さらに、DAF-4およ びDAF-3が同じ細胞の多くにおいて発現されるという知見は、下流のSmads（DAF- 8およびDAF-14は有望な候補体である）へのDAF-4シグナル伝達がDAF-3遺伝子活 性を直接調節するというモデルと一致する。いくつかのSmad蛋白質のTGF-βによ って調節された核への移動および転写活性化は、DAF-3がダウア形成に必要な遺 伝子の標的組織における転写を活性化することによってダウア特異的変化を誘導 する、または非ダウア生育に必要な遺伝子の転写を抑制することを示唆している 。 Smad1およびSmad2は、上流のTGF-βシグナル伝達経路が活性化されると再移動 して核に多くが存在する（ベーカー＆ハーランド（Baker and Harland）、Genes and Development 10：1880、1996；フードレスら（Hoodless）、Cell 85：489、 1996；リウら（Liu）、Nature 381：620、1996；マシアス・シルバら（Macias-S ilva）、Cell 87：1215、1996）。野生型では、DAF-3/GFPは、それ以外には存在 しないわけではないが主に細胞質に存在する。ASI付近の頭部神経（DAF-7シグナ ルを産生する細胞）のみならず、腸細胞におけるDAF-3/GFP細胞下分布を調べた 。DAF-3/GFPは全ての動物において細胞質に多く存在した。しかし、全ての動物 において、明るい蛍光を有するいくつかの細胞の核にかすかなGFP蛍光を認め、 動物の約25％において、核と細胞質に同等のDAF-3/GFPレベルを示す細胞を１つ 以上認めた。 DAF-3はDAF-7 TGF-β経路の他のメンバーによって拮抗されるため、本発明者 らはこれらの遺伝子が不活化であればDAF-3が活性である（そしておそらく核に 移動する）と予想する。したがって、全長のDAF-3/GFP融合蛋白質の細胞下局在 を、DAF-3遺伝子活性が最高であると予想されるダウア構成的変異体L1虫の頭部 神経、尾神経、および腸において観察した。DAF-1(m402)、daf-4(m72)、daf-7(m 62)、daf-8(sa233)、およびdaf-14(m77)変異体では、DAF-3/GFPは細胞質に多く 存在するが、野生型では核に何らかのGFPを有する細胞を認めた。daf-4(m72)の ３つの変異体株では、DAF-3/GFPは野生型株の場合より核に多く局在した。これ らの株を野生型と交配すると、daf-4および野生型分離系の双方において核局在 の増加を認めた。このように、核GFPの増加はdaf-4よりはむしろ配置の特性であ った。DAF-7シグナルが最も強いASIに最も近い神経においても、DAF-3/GFP細胞 下局在に変化を検出しなかった。DAF-3/GFP融合蛋白質はL1およびL2段階の幼虫 では細胞質に多く存在し、環境条件によって、またはDAF-7シグナル伝達経路変 異体における変異よりもむしろ（データは示していない）インスリン受容体経路 遺伝子daf-2における変異によって、ダウアを形成するよう誘導する。DAF-3/GFP の組織特異的発現パターンはこれらの変異体のバックグラウンドでは変化しなか った（データは示していない）。 DAF-3/GFP細胞下局在がDAF-7シグナル伝達欠損またはダウア誘導環境条件に強 く反応しないという知見から、ダウア形成において核におけるDAF-3の役割は否 定できない。DAF-3/GFP細胞下局在に変化を認めなくとも、本発明者らは何らか のD AF-3/GFPを核において検出し、および燐酸化状態により核局在の小さい変化また は活性の変化が認められることから、DAF-3はDAF-7シグナル伝達とカップリング している可能性がある。実際に、ショウジョウバエ（Drosophila）のMAD蛋白質 の細胞下局在は、MADへの受容体シグナル伝達が起こる場合に、野生型では検出 できるほど変化しない；再移動はDPPリガンドが劇的に過剰発現された場合に限 って認められる。一連の発見されていないTGF-β受容体がDAF-3を調節する可能 性は低い。C.エレガンスのゲノム配列は90％完全であり、daf-1およびdaf-4以外 にTGF-β受容体遺伝子の唯一の候補が存在する。この受容体がDAF-3の正の調節 物質であれば、変異体はdaf-3変異体のようにdaf-7変異体を抑制すると予想され るであろう。しかしこの受容体はDAF-3とは異なるシグナル伝達経路において作 用し、daf-7の抑制物質ではない。 DAF-3が核において活性であるというSmad相同性からの関係は２つのさらなる 知見によって支持される。第一にDAF-3/GFPは分裂の際に腸細胞の染色体に関連 する。これらの細胞はL1段階の最後に分裂し、抗GFP抗体および抗αチューブリ ン抗体による抗体染色を行ったところ、DAF-3/GFPが分裂の際の紡錘糸の間のDNA に会合して発見されることが判明した（図8A）。本発明者らはDAF-3 GFPが、核 分裂の前期から後期にかけてDAPIと共に存在することを認めた。DAF-3/GFPは以 下の基準によって核分裂前期の核に会合した。すなわち、紡錘糸は核のいずれか の側に存在するが、核は完全には破壊しない。特に不明瞭な核が存在した。DAF- 3/GFPは、染色体が、それによって核が腸において離れて存在する正常な距離に 分離するまでDAPIと共に存在し続け、終期まで会合し続けることを意味している 。分裂のこの時点において、DAF-3/GFPは徐々に見えなくなり、核が核膜および 核小体を再形成する前に検出不可能となる。このように、DAF-3は、間接的また は直接的にDNAに結合することができ、これはDAF-3が核において作用する転写活 性化因子であるという仮説と一致する。DAF-3はその変異体表現型からは分裂に おいて作用を有すると予想されない。分裂染色体上ではより明るいGFPを認める ことは、核膜の破壊によるDNAへのアクセスの増加による可能性がある。DAF-3が 核において機能することを示す第二の証拠は、保存されたドメインIIのほとんど を欠損する切断されたDAF-3/GFP融合に関する本発明者らの実験である。切断さ れた構築物pGP7はGFPと 融合したdaf-3の８kbを含む。B0217からの８kb EcoRI断片をpBluescript SK(-) のEcoRI部位にクローニングした。このサブクローンのPvu/SalI断片をGFPベクタ ーpPD95.81からのPvuI/SalI断片にライゲーションした。得られたプラスミドはd af-3の5'に最も近いエキソンの上流の配列〜2.5kbおよびドメインIIの最初のア ミノ酸残基58個に及ぶコード領域を含む。daf-3の残りのアミノ酸175個および3' 非コード領域をGFPおよびunc-54の3'末端に置換した。３つのトランスジェニッ ク株を単離し、全てが類似の表現型を示した。この融合蛋白質はダウア誘導を妨 害する；daf-3の機能喪失変異体のように、これはdaf-7における変異を抑制する （図７）。この切断された蛋白質は核に多く存在し、これが核において作用する ことによってダウア形成を抑制することを示唆している（図8B）。この結果は、 野生型のDAF-3も同様に、核において機能を有することを意味する。全長のDAF-3 /GFP構築物もGFPを有しない全長のDAF-3構築物と同様に、daf-7の変異を抑制す る（図７）。この抑制は、細胞質におけるDAF-3の過剰発現がドミナントネガテ ィブ活性を有することを示しており、おそらくその原因は、受容体または他のSm adsのような共因子とのDAF-3相互作用の妨害である。 ドメインIIの一部を欠損する切断されたDAF-3/GFP融合遺伝子が構成的に核に 局在することは、Smad局在の制御が複雑であることを示唆している。蛋白質の保 存されたドメインIIのみを含むSmad2構築物は構成的に核に存在し、C-末端がイ フェクタードメインであり、およびN-末端が細胞質中の蛋白質と結合することが 示唆される（ベーカー＆ハーランド（Baker and Harland）、Genes and Develop ment 10：1880、1996；フードレスら（Hoodless）、Cell 85：489、1996；リウ ら（Liu）、Nature 381：620、1996；マシアス・シルバら（Macias-Silva）、Ce ll 87：1215、1996）。N末端が無傷である本発明者らの構築物は核に存在する。 おそらく双方のドメインは細胞質において結合部分となり、破壊されれば核の中 に入る。または核の中に入ることはDAF-3とSmad2では異なるように調節される可 能性がある。重要なことは、Smad1およびSmad3のようにSmad2はC末端においてSS XSモチーフを有する（ツァングら（Zhang）、Nature 383：168、1996；ラグナら （Lagna）、Nature 383：832、1996；サベジら（Savage）、PNAS 93：790；ベー カー＆ハーランド（Baker and Harland）、Genes and Development 10：1880、1 996；フ ードレスら（Hoodless）、Cell 85：489、1996；リウら（Liu）、Nature 381：6 20、1996；マシアス・シルバら（Macias-Silva）、Cell 87：1215、1996；およ びグラフら（Graf）、Cell 85：479、1996）；このモチーフは燐酸化の基質であ りSmad2が核へ移動する際に必要である（ベーカー＆ハーランド（Baker and Har land）、Genes and Development 10：1880、1996；フードレスら（Hoodless）、 Cell 85：489、1996；リウら（Liu）、Nature 381：620，1996；マシアス・シル バら（Macias-Silva）、Cell 87：1215、1996）。DAF-3はC末端領域において単 一のセリンを有するが、DPC4はこの位置でセリンを有しない。 本発明者らはダウア形成においてTGF-β経路に関するモテルを提唱する（図9A 〜9B）。生殖器官を誘導する条件下でASI知覚神経によって産生されるDAF-7 TGF -βリガンドは（レンら（Ren）、Science 274：1389、1996；シャクウィッツら （Schakwitz）、Neuron 17：719、1996）、標的組織上のDAF-1/DAF-4受容体キナ ーゼに結合する。次にこれらの受容体キナーゼはSmad1、Smad2、およびSmad3の 燐酸化および活性化に類似の方法で、Smads DAF-8および／またはDAF-14を燐酸 化する（ツァングら（Zhang）、Nature 383：168、1996；ラグナら（Lagna）、N ature 383：832、1996；サベジら（Savage）、PNAS 93：790）。本発明者らは、 DAF-3が検出可能なDPC4燐酸化が起こらないような条件下においても、燐酸化さ れたSmad1およびSmad2と共に二量体を形成する、その最も近縁の相同体であるDP C4のように機能すると提唱する（ツァングら（Zhang）、Nature 383：168、1996 ；ラグナら（Lagna）、Nature 383：832、1996；サベジら（Savage）、PNAS 93 ：790）。本発明者らは、DAF-3が燐酸化されたDAF-8および／またはDAF-14とヘ テロダイマーを形成する場合（図9B）に乱されるDAF-7シグナル伝達の非存在下 （図9A〜B）では、DAF-3がダウア誘導ホモダイマーを形成することを示唆する。 daf-8およびdaf-14は部分的に余剰であるに過ぎないため（リドルら（Riddle） 、Nature 290：668、1981；ボウウェルズ＆トーマス（Vowels and Thomas）、Ge netics 130：105、1992；およびトーマスら（Thomas）、Genetics 134：1105、1 993）、それぞれはダウア形成において独自の機能を発揮する可能性がある。こ のように、DAF-3/DAF-8ダイマーはDAF-3/DAF-14とは異なる活性を有すると提唱 されている。おそらく個々がダウア形成に必要な遺伝子のサブセットを活性化す る。DAF-8/DAF-3お よび／またはDAF-14/DAF-3ヘテロダイマーの形成は、DAF-3/DAF-3ホモダイマー によるダウア誘導に拮抗する。daf-8(sa233);daf-14(m77);daf-3(mgDf90)三変異 体は、ダウア誘導条件下でいくつかのダウアを形成することができる（データは 示していない）；本発明者らは、Daf-2経路の活性がこの変異体のバックグラウ ンドにおいてダウアを誘導する可能性があることを示唆する。 ダウアの遺伝的経路は、休眠期停止およびその関連する代謝のシフト、ならび に老化速度を制御する神経内分泌経路を表す（レンら（Ren）、Science 274：13 89、1996；シャクウィッツら（Schakwitz）、Neuron 17：719、1996；ジョージ ら（Georgi）、Cell 61：635、1990）。同様に、TGF-βファミリーのメンバーで あるアクチビンは当初、例えばゴナドトロピンシグナル伝達の調節におけるその 神経内分泌調節活性に基づいて同定された（ベールら（Vale）、「ペプチド増殖 因子とその受容体（Peptide Growth Factors and Their Receptors）」、スポー ン＆ロバーツ（Sporn and Roberts）編、Springer-Verlag、ハイデルベルク、19 90）。DAF-7シグナルは繁殖的生育に必要な唯一のシグナルではない。DAF-7 TGF -β経路およびDAF-2インスリン様シグナル伝達経路における変異は、同じダウア 停止表現型を引き起こすために、本発明者らはDAF-7 TGF-βシグナルおよびDAF- 2インスリン様シグナルの双方が繁殖的生育にとって必要であることを提案する 。その関連する代謝シフトを伴う休眠に対するインスリン様シグナル伝達経路の 関与は、脊椎動物におけるインスリンによる代謝調節と一致する。遺伝子実験か ら、これらの経路は平行に作用することが示されている（リドルら（Riddle）、 Nature 290：668、1981；ボウウェルズ＆トーマス（Vowels and Thomas）、Gene tics 130：105、1992；およびトーマスら（Thomas）、Genetics 134：1105、199 3）。特に、daf-3変異体は有効にdaf-7変異体を抑制するが、daf-2変異体は抑制 しない、そしてdaf-16変異体はdaf-2変異体を有効に抑制するが、daf-7変異体の 抑制は少ない。これらの２つのシグナル伝達経路が標的組織上またはその他の調 節（例えば、ホルモン分泌）細胞内でカバレッジ（coverage）するか否かはまだ わかっていない。しかし、本質的に全ての標的組織にDAF-7受容体経路遺伝子お よびDAF-16遺伝子が発現されていることは、TGF-βおよびインスリン経路がそこ で作用すること、したがって統合がそこで起こるに違いないことを示唆している 。このよう に、本発明者らは図9Aおよび9BにおいてDAF-2経路がDAF-3/DAF-8DAF-1 Smadシグ ナル伝達に収束して標的組織における代謝的遺伝子発現を調節することを示唆す る。 インスリン様およびTGF-βシグナルの代謝制御における統合は、糖尿病の分子 的基礎に関する重要な意味を有する。例えば、ダウアの制御に関してこれらの経 路が収束していることは、ヒトの代謝制御において完全な代謝制御を得るために はDAF-7様シグナルとインスリンの双方が必要である可能性があることを示唆し ている。このように、DAF-7のヒト相同体からのシグナル伝達の減少はII型糖尿 病に関連したインスリン抵抗性の基礎となりうる。実際にダウアフェロモンは脂 肪酸であって、DAF-7発現をダウン・レギュレーションすることが報告されてい る（レンら（Ren）、上記）。このように代謝のフェロモン調節は、哺乳類の肥 満誘発糖尿病に関連する可能性があり、ヒトにおいてDAF-7またはその受容体に 変異が起これば、インスリン受容体における変異のように糖尿病状態に関与する と予想される。さらに、肥満もしくは加齢またはその両者が、例えば高レプチン 条件下でヒトDAF-7の減少を引き起こせば、そのような結果は遅発型／肥満関連 糖尿病の説明となるであろう。哺乳類DAFのクローニング 新規線虫DAF cDNAの単離に基づいて、本明細書に記述の配列および標準的な技 法を用いてヒトDAF配列を含む哺乳類のDAF核酸配列の単離が可能となる。特に、 線虫のDAF配列の全てまたは一部を用いて、縮重オリゴヌクレオチドプローブ（ すなわち所定のアミノ酸配列に対して考えられる全てのコード配列の混合物）を 含むオリゴヌクレオチドプローブを容易にデザインしてもよい。これらのオリゴ ヌクレオチドはDNAのいずれかの鎖の配列に基づいてもよい。 哺乳類のDAF配列を単離するための一例としてのプローブまたはプライマーは 、好ましくは保存された一塊りのアミノ酸、例えば保存されたDAFモチーフに対 応する。一例としてのモチーフは以下の通りである： そのようなモチーフを用いて、哺乳類のDAF-2、DAF-3、およびDAF-16遺伝子を配 列データベースから単離してもよい（例えば、パイルアップのような標準的なプ ログラムを用いて）。またはそのような配列を用いて、大きいゲノムまたはcDNA ライブラリを直接プローブで調べるために、縮重オリゴヌクレオチドプローブを デザインしてもよい。そのようなプローブをデザインおよび調製するための一般 的な方法は、例えば、アウスユベールら（Ausubel）の「分子生物学の最新プロ トコル（Current Protocols in Molecular Biology）」、1996、ウィリー＆サン ズ，ニューヨーク、ニューヨーク州；および「分子生物学技法の手引き（Guide to Molecular Cloning Techniqucs）」、1987、バーガー＆キンメル（S．L．Ber ger &A．R．Kimmel）編、アカデミック・プレス、ニューヨーク、に提供される 。これらのオリゴヌクレオチドは、DAF相補的配列とハイブリダイズするプロー ブとして、または様々なポリメラーゼ連鎖反応（PCR）クローニング戦略に関す るプライマーとして用いることによって、DAF遺伝子の単離に有用である。PCRア プローチを用いる場合、増幅された産物が適したベクターにクローニングされる ようにプライマーを選択的にデザインする。PCRはまれな組織型のcDNAライブラ リをスクリーニングするために特に有用である。 ハイブリダイゼーション技術および技法は当業者には周知であり、例えば上記 のアウスユベールら（Ausubel）および上記の「分子生物学技法の手引き（Guide to Molecular Cloning Techniques）」に記述されている。必要に応じて、異な るオリゴヌクレオチドプローブの組合せを組換え型DNAライブラリのスクリーニ ングに用いてもよい。オリゴヌクレオチドは、当技術分野で既知の方法を用いて 例えば³²Pで標識し、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを用いて組み換 えDNAライブラリから濾紙複製体をプローブによって調べる。組換え型DNAライブ ラリ（例えば、視床下部、または膵臓由来cDNAライブラリのような、特にDAF-2 およびDAF-7 cDNAのようなヒトcDNAライブラリ）は当技術分野で周知の方法に従 って、例えば上記のアウスユベールら（Ausubel）が記述するように調製しても よく、または購入してもよい。 近縁のDNA配列を検出または単離するために、ハイブリダイセーションの高ス トリンジェンシー条件を用いてもよい；そのような条件には、約42℃でのハイブ リダイゼーションおよび約50％ホルムアミド；約65℃、約２×SSCおよび１％SDS での１回目の洗浄；２回目の洗浄を約65℃および約0.1％SDS、１×SSCで行うこ とが含まれる。本明細書に記述の線虫DAF遺伝子との配列同一性がより低いDAF遺 伝子を検出する、より低いストリンジェンシー条件には、ホルムアミドの非存在 下での約42℃でのハイブリダイセーション；約42℃、約６×SSCおよび約１％SDS での１回目の洗浄；ならびに約50℃、約６×SSC、および約１％SDSでの２回目の 洗浄が含まれる。 上記のように、DAF特異的オリゴヌクレオチドはまた、PCRクローニング戦略に おけるプライマーとして用いてもよい。そのようなPCR法は当技術分野で周知で あり、例えば「PCR技術（PCR Technology）」、エールリッヒ（H．A．Erlich編 、ストックトン・プレス、ロンドン、1989；「PCRプロトコル：方法と応用の手 引き（PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications）」、イニス、ゲ ルファンド、スニンスキー、およびホワイト（M．A．Innis、D．H．Gelfand、J ．J．Sninsky、およびT．J．White）編、アカデミック・プレス・インタ、ニュ ーヨーク、1990；ならびに上記のアウスユベールら（Ausubel）、に記述されて いる。ここでも、哺乳類のDAF配列を単離するためには、DAF配列の保存された領 域に対応する配列（例えば上記の領域）を用いることが好ましい。そのようなプ ローブは、ゲノムDNAライブラリと共にcDNAをスクリーニングするために用いて もよい。 次に得られた配列を調べて（例えばパイルアッププログラムを用いて）、特に 保存されたDAFドメインにおける、またはその間の（例えは上記のドメイン）C. エレガンス配列に対する最高のアミノ酸配列同一性を有する配列を同定する。一 つの特定の例において、ヒトFKHRおよびAFX遺伝子はDAF-16フォーク状ドメイン に対して次いで近縁なフォーク状ドメイン蛋白質より10³³倍近縁であり、このた めにFKHRおよびAFXは哺乳類のDAF-16遺伝子の候補となる。 そのような候補遺伝子を配列の相同性によって単離後、次に遺伝子がdaf変異 を機能的に相補することができるか否かを調べる。これは適当な変異体バックグ ラウンドを有するC.エレガンス株への配列の形質転換によって最も容易にアッセ イされる。一例としてのC.エレガンス形質転換技法は、例えばメロら（Mello） 、EMBO J．10：3959〜3970、1991に記述されており、DAF-2、DAF-3およびDAF-16 ポリペプチド機能に関するアッセイは本明細書に記述されている。本発明におい て有用であると見なされるためには、哺乳類の配列はC.エレガンスの欠損を完全 に相補する必要はないが、機能的相補の検出可能なレベルを提供しなければなら ない。 上記のように同定されたDAF、AGE、またはAKT遺伝子相同体はまた、哺乳類の 細胞株の代謝表現型を相補または変化させる可能性がある。 例えは、DAF-7、TGF-β増殖因子をインスリン反応性細胞株（例えば、3T3-L1 細胞株）に加えると、インスリン反応性が増大する可能性がある。同様にそのよ うな細胞株を野生型またはDAF、AGE、もしくはAKT遺伝子の優性に活性化された 型によって遺伝子形質転換すると、代謝が変化する可能性がある。そのような代 謝制御の乱れに関して、DAF、AGE、またはAKT相同体のような候補遺伝子をスト リンジェントに調べる。 さらに、哺乳類の候補相同体が代謝制御経路において作用すれば、および類似 の代謝制御組織（肝臓、脂肪細胞）において発現されれば、それはC.エレガンス からのDAF蛋白質と同じように機能する可能性がある。野生型または活性化DAF、 AKT、またはAGE蛋白質（例えばDAF-3またはDAF-16転写因子のVP16活性化によっ て）を加えれば、細胞株に代謝表現型の変化を与えることができる。このように 、daf、age、またはakt遺伝子活性をそのような細胞株に供給すればその代謝を 変化させることができる。これは代謝の制御における相同なDAF機能を調べる試 験例で ある。DAF ポリペプチドの発現 一般に、本発明のDAFポリペプチドは、適当な発現媒体においてDAFがコードす るcDNA断片の全てまたは一部によって（例えば、本明細書に記述された、または 本明細書に記述のように単離されたcDNAの一つ）適した宿主細胞を形質転換する ことによって産生してもよい。 分子生物学の当業者は、組換え型蛋白質を得るために多様な発現系を用いても よいことを理解するであろう。用いられる正確な宿主細胞は本発明にとって重要 ではない。DAFポリペプチドは原核宿主（例えば大腸菌）または真核宿主（例え ば、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces Cerevisiae）、昆虫細胞、例 えばSf9もしくはSf21細胞、または哺乳類細胞、例えばCOS1、NIH3T3もしくはHel a細胞）において産生してもよい。そのような細胞は多様な供給源から入手する ことができる（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション、ロックラン ド、メリーランド州；同様に、例えばアウスユベールら（Ausubel）、上記を参 照のこと）。形質転換またはトランスフェクション法および発現媒体の選択は、 選択する宿主系に依存するであろう。形質転換およびトランスフェクション法は 例えば、アウスユベールら（Ausubel）、上記に記載されており、発現媒体は「 ベクターのクローニング：実験マニュアル（Cloning Vectors：A Laboratory Ma nual）」、（パウウェルズ（P．H．Pouwels）、1985、補則1987）に記述されて いる中から選択してもよい。 一つの好ましい発現系はバキュロウイルス系（例えば、Sf9細胞および上記の アウスユベール（Ausubel）の方法を用いる）である。もう一つのバキュロウイ ルス系はベクターpBacPAK9を利用し、クロンテック社（パロアルト、カリフォル ニア州）から入手できる。 または、DAFポリペプチドは、例えば安定にトランスフェクトした哺乳類細胞 株によって哺乳類の系において産生する。哺乳類細胞の安定なトランスフェクシ ョンに適したベクターの多くは一般に利用でき、例えばパウウェルズら（P．H． Pouwels）（上記）を参照のこと；そのような細胞株を構築する方法もまた、例 えばアウスユベールら（Ausubel、前記）の刊行物に記載されているように一般 的に入 手できる。一つの例において、DAF蛋白質をコードするcDNAはジヒドロ葉酸レダ クターゼ（DHFR）遺伝子を含む発現ベクターの中にクローニングする。プラスミ ドの組み込み、したがってDAF-蛋白質コード遺伝子の宿主染色体への組み込みは 、細胞培養培地に0.01〜300μMのメソトレキセートを加えることによって（アウ スユベールら（Ausubel、上記）が記述したように）選択される。この優勢な選 択はほとんどの細胞タイプにおいて行ってもよい。組換え型蛋白質発現は、トラ ンスフェクトした遺伝子のDHFR媒介増幅によって増加させてもよい。遺伝子増幅 を有する細胞株を選択する方法は、アウスユベールら（Ausubel、上記）に記述 されている；そのような方法は一般に、漸増させたメソトレキセートの濃度を含 む培地における長期培養を含む。この目的のために一般的に用いられるDHFR含有 発現ベクターには、pCVSEII-DHFRおよびpAdD26SV（A）が含まれる（アウスユベ ールら（Ausubel、上記）に記述されている）。上記の宿主細胞のいずれか、ま たは好ましくはDHFR欠損CHO細胞株（例えばCHO DHFR^-細胞、ATCC寄託番号CRL 90 96）は、安定にトランスフェクトさせた細胞株またはDHFR媒介遺伝子増幅のDHFR 選択にとって好ましい宿主細胞である。 さらにその他の代用アプローチにおいて、DAFポリペプチドをインビボにおい て、好ましくはインビトロにおいてT7系を用いて産生する（例えば、アウスユベ ールら（Ausubel、上記）、または他の標準的な技法を参照のこと）。 組換え型DAF蛍白質が発現されれば、例えばアフィニティクロマトグラフィー を用いてそれを単離する。一つの例において、抗DAF蛋白質抗体（例えば本明細 書に記述の産物）をカラムに結合させて、これを用いてDAF蛋白質を単離しても よい。アフィニティクロマトグラフィーの前に、DAF蛋白質含有細胞の溶解およ び分画を、定法（例えば、アウスユベールら（Ausubel、上記）を参照のこと） によって行ってもよい。 単離されれば、必要に応じて、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって 組換え型蛋白質をさらに精製することができる（例えば、フィッシャー（Fisher ）、「生化学と分子生物学の実験技術（Laboratory Techniques In Biochemistr y and Molecular Biology）」、ワーク＆バードン（Work and Burdon）、Elsevi er、1980を参照のこと）。 本発明のポリペプチド、特に短いDAFポリペプチド断片はまた、化学合成によ って生成してもよい（例えば、「固相ペプチド合成（Solid Phase Peptide Synt hesis）」、第二版、1984、The Pierce Chemical Co.、ロックフォード、イリノ イ州、に記述の方法によって）。 これらの一般的なポリペプチド発現および精製技法はまた、有用なDAF断片ま たは類似体（本明細書に記述の）を産生および単離するために用いてもよい。抗DAF抗体 本明細書において記述されたまたは上記のように単離されたDAFポリペプチド を用いて、抗DAF抗体を標準的な技法によって産生してもよい。一つの特定の例 において、保存されたDAFドメインをコードするDAF cDNAまたはcDNA断片をGSTに 融合させ、融合蛋白質を大腸菌において標準的な技法によって産生する。次に、 融合蛋白質を同様に標準的な技法によってグルタチオンカラム上で精製して、こ れを用いてウサギを免疫する。次に、得られた抗血清をGST-DAFアフィニティカ ラム上で、例えばフィネイ＆ルブタン（Finney and Ruvkun、Cell 63：895〜905 、1990）の方法によって精製すると、例えばウェスタン・ブロッティングによっ てGST-DAFを特異的に同定することが示される。 抗体産生のためのポリペプチドは、組換え型またはペプチド合成技法（例えば 、上記の「固相ペプチド合成（Solid Phase Peptide Synthesis）」；上記のア ウスユベールら（Ausubel）を参照のこと）によって産生してもよい。 ポリクローナル抗血清に関しては、ペプチドは必要に応じて、上記のアウスユ ベールら（Ausubel）に記述のKLHのような担体蛋白質にカップリングさせてもよ い。KLHペプチドはフロイントのアジュバントと混合してモルモット、ラットま たは好ましくはウサギに注射する。抗体はペプチド抗原アフィニティクロマトグ ラフィーのいかなる方法によって精製してもよい。 または、DAFポリペプチド（または免疫原断片もしくは類似体）および標準的 なハイブリドーマ技術（例えば、コーラーら（Kohler）、Nature 256：495、197 5；コーラーら（Kohler）、Eur．J．Immunol．6：511、1976；コーラーら（Kohl er）、Eur．J．Immunol．6：292、1976；ハンマーリングら（Hammerling）、「 モノクローナル抗体とT細胞ハイブリドーマ（Monoclonal Antibodies and T Cel l Hybr idomas）」、Elsevier、ニューヨーク、1981；アウスユベールら（Ausubel）、 上記）を用いてモノクローナル抗体を調製してもよい。 産生されたら、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の特異的DAF認 識をウェスタンブロットまたは免疫沈降分析によって試験する（例えば、上記の アウスユベールら（Ausubel）に記述の方法によって）。本明細書に記載のDAFポ リペプチドを特異的に認識する抗体は、本発明において有用であると見なされる 。上記のように単離された抗DAF抗体は、例えば哺乳類によって産生されたDAFポ リペプチドのレベルを測定もしくはモニターするイムノアッセイにおいて、また はDAPポリペプチド産生を調節する化合物をスクリーニングするために（例えば 、本明細書におけるスクリーニングにおいて）用いてもよい。一つの特定の例に おいて、ヒトDAF-7ポリペプチドに対する抗体は、患者のDAF-7ポリペプチドレベ ルが低下しているか否かを決定するために、患者からの血液試料をスクリーニン グするために有用である。そのような抗体は免疫学的アッセイ、例えば、ELISA アッセイにおいて用いてもよく、DAF-7が減少すれば糖尿病状態、例えば肥満誘 発型II型糖尿病であることが示される。もう一つの特定の例において、抗DAF抗 体は系統分析を行う際に有用である。例えば、糖尿病疾患に対する素因を有する 家族のメンバーを検出するために、個人からの血液試料を抗DAF-7抗体に関して スクリーニングしてもよい。抗DAF抗体はまた、DAF遺伝子を発現する細胞の同定 に用いてもよい。肥満誘発II型糖尿病に対するDAF-7療法 本発明者らのデータはDAF-7がインスリンと相乗的に作用する代謝制御のため の内分泌ホルモンであることを示す。DAF-7の減少は、肥満によって誘発される 可能性があり、これは脂肪酸であるダウアフェロモンがC．エレガンスのDAF-7産 生を減少させることに似ている。 したがって、肥満誘発型のII型糖尿病、耐糖能障害、および関連するアテロー ム性動脈硬化症は、DAF-7ホルモンを筋肉内または静脈内に注射すれば治療され る可能性がある（図23）。 さらに、ヒトDAF-7に対する抗体は糖尿病前段階の耐糖能障害、または肥満誘 発糖尿病におけるDAF-7の減少を検出するはずである。そのような抗体は代謝疾 患に おいてインスリンレベルを検出するように、血液中のDAF-7レベルを検出するで あろう。 DAF-7の治療有効性および用量は肥満誘発糖尿病のマウスモデル、例えばdbお よびobマウスにおいて開発することができる。 DAF-7は、インスリン注射と類似の静脈内または筋肉内のいずれかに注射して もよい。 どのクラスの糖尿病をDAF-7によって治療するかの決定は、DAF-7レベルに関す る血液検査と遺伝子検査を組み合わせて、特定の糖尿病または糖尿病前段階の患 者がどのdaf、age、またはakt変異を有するかを調べることによって得られるで あろう。治療を特定するためのスクリーニング系 本発明者らは実験結果に基づき、ヒト患者において用いることができる治療化 合物（例えば、抗糖尿病薬および抗肥満薬またはその両者）を特定する多くのス クリーニング技法を開発した。特定の例において、daf-3もしくはdaf-16または そのヒト相同体をダウン・レギュレートする化合物は本発明において有用である と見なされる。同様に、daf-1、daf-2、daf-4、daf-7、daf-8、daf-11、daf-14 、age-1およびakt（または対応するヒト相同体のそれぞれ）をアップレギュレー トまたは活性化する化合物もまた、本明細書において糖尿病および肥満のような 耐糖能障害疾患の治療薬として有用であると思われる。一般に、いかなる数のイ ンビトロまたはインビボ実験系も用いることによって、本発明のスクリーニング 法は治療的に活性剤であるか否かに関して多くの化合物をスクリーニングするこ とを含む。そのような化合物の同定に有用な一例としての方法を下記に記述する 。 本発明の方法によって、糖尿病および肥満のような耐糖能障害疾患を治療およ び予防する活性物質の評価、同定、および開発は単純となる。一般に、本スクリ ーニング法は、大規模集団から関係する天然物抽出物または化合物を選択して、 これをさらに評価していくつかの活性のある選択された物質へと絞り込む容易な 手段を提供する。次に、抗糖尿病もしくは抗肥満活性またはその両者を明らかに するために、このプールの構成成分を精製して、本発明の方法において評価する 。 下記に本発明者らは、抗糖尿病もしくは抗肥満剤またはその双方としての化合 物の有効性を評価するスクリーニング法を記述する。これらの例は説明のためで あって本発明の請求の範囲を制限すると解釈してはならない。抽出物および化合物の試験 一般に、耐糖能障害疾患の治療に対する新規薬剤は、当技術分野で既知の方法 に従って天然物または合成（または半合成）抽出物に関する大きいライブラリ、 または化学ライブラリから同定される。医薬品探索開発の分野における当業者は 、試験抽出物または化合物の正確な由来は本発明のスクリーニング技法にとって 重要ではないことを理解するであろう。したがって、本明細書に記述の一例とし ての方法を用いて、実質的にいかなる数の化学抽出物または化合物をスクリーニ ングすることも可能である。そのような抽出物または化合物の例には、植物、真 菌、原核生物、または動物に基づく抽出物、発酵プロス、および合成化合物、と 共に既存の化合物の改変が含まれるが、これらに限定しない。糖質、脂質、ペプ チド、および核酸に基づく化合物を含むがこれらに限定しない多くの化学化合物 のランダム合成または指向合成（例えば半合成または全合成）を行うために、多 くの方法が利用できる。合成化合物ライブラリはブランドン・アソシエーツ（メ リマック、ニューハンプシャー州）およびアルドリッチケミカル（ミルウォーキ ー、ウィスコンシン州）から販売されている。または細菌、真菌、植物、および 動物抽出物の形での天然の化合物のライブラリは、バイオティクス（サセックス 、イギリス）、ゼノバ（スロー、イギリス）、ハーバーブランチ・オーシャング ラフィックスインスチチュート（Ft.ピアス、フロリダ州）、およびファーママ ー、アメリカ（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）を含む多くの販売元から販 売されている。さらに、もし望ましければ、天然および合成的に産生されたライ ブラリは、当技術分野で既知の方法に従って、例えば標準的な抽出および分画法 によって産生する。さらに、必要に応じてライブラリまたは化合物は標準的な化 学、物理、および生化学法を用いて容易に改変される。 さらに、医薬品探索開発の当業者は、デレプリケーション（dereplication） 法（例えば、分類学的デレプリケーション、生物学的デレプリケーション、およ び化学的デレプリケーション、もしくはその組合せ）またはその抗糖尿病活性お よ び抗肥満活性関して既に既知の材料の複製もしくは繰り返しの削除は、可能であ れば常に用いるべきであることを容易に理解するであろう。 粗抽出物が抗糖尿病または抗肥満活性またはその双方を有することが判明した 場合には、認められた作用の原因となる化学構成物を単離するために陽性のリー ド抽出物のさらなる分画が必要である。このように、抽出、分画、および精製プ ロセスの目標は抗糖尿病または抗肥満活性を有する粗抽出物に含まれる化学物質 を注意深く特徴付けおよび同定することである。化合物の混合物における活性を 検出するために本明細書に記述の同じインビボおよびインビトロアッセイを用い て、活性成分を精製して、その誘導体を試験することができる。そのような不均 一な抽出物の分画および精製法は当技術分野で既知である。必要に応じて、病原 疾患の治療に有用な薬剤であることが示された化合物を当技術分野で既知の方法 に従って化学的に修飾する。治療的価値を有することが確認された化合物は、当 技術分野で既知の、糖尿病または肥満に関する標準的な動物モデルを用いてさら に分析する。 耐糖能障害疾患の治療（または予防）における分子または化合物の有効性を評 価するために有用な高処理システムの例を次に示す。線虫のダウア停止解放バイオアッセイ 天然物、抽出物または試験化合物の効率的および系統的な大量のマススクリー ニングを可能にするために、C.エレガンス変異体ダウア幼虫（例えば、本明細書 に記述の変異を含む、C.エレガンスdaf-2変異体ダウア幼虫のようなC．エレガン ス）を、操作の半自動化およびテータ収集の完全自動化を促進するマイクロタイ タープレートのウェルにおいて培養する。上記のように、DAF-3またはDAF-16活 性をダウン・レギュレートする、またはDAF-1、DAF-2、DAF-4、DAF-7、DAF-8、D AF-11、DAF-14、AGE-1またはAKT活性をアップ・レギュレートする化合物は本発 明において有用であると見なされる。そのような化合物を、これらの遺伝子に変 異を有するC．エレガンス株（上記のように）のダウア形成に及ぼすその作用に よって同定する。 特定の例において、DAF-2ポリペプチドに変異を有する線虫はダウア幼虫とし て停止し、子孫を残すことはない。daf-2の欠損によって引き起こされる代謝お よび 生育停止表現型は全て、daf-16の変異によって抑制される。PI 3Kキナーゼにお ける変異であるAGE-1はdaf-2の欠損と同じ表現型を有し、そのような変異もまた daf-16変異によって抑制される。哺乳類におけるインスリンシグナル伝達の生化 学分析は、AGE-1がPIP3シグナルを産生することによってDAF-2受容体からのシグ ナルを伝達するという考え方を支持する。daf-16変異はdaf-2またはage-1遺伝子 活性の欠損を抑制するため、PIP3がdaf-16遺伝子活性をダウン・レギュレートす るまたは改変すると考えられている。DAF-2/AGE-1とインスリン受容体/PI 3Kキ ナーゼが生化学的にオーバーラップすることは、C．エレガンスのdaf-16遺伝子 のヒト相同体も同様にインスリン経路において作用することを示している。この ように、C．エレガンスのインスリンシグナル伝達経路により、この動物がdaf-1 6の変異体であれば、インスリンシグナル伝達がなくとも生存できるという驚く べき結果が得られる。したがって、この分析は、DAF-16活性を阻害する化合物が 例えば、インスリンの産生または分泌における、または標的組織によるインスリ ンシグナルの受領における糖尿病病変の作用を逆転させることを示している。そ のような薬剤はI型糖尿病における膵臓のβ細胞破壊によるインスリン不全と共 に、インスリンシグナル伝達の欠損によるII型糖尿病の治療において有効となる ことが予想される。 試験化合物または抽出物がdaf-16遺伝子活性を減少させることができるか否か を評価するために、組み込まれたヒトDAF-16遺伝子を有する変異体daf-2(el370) ；daf-16(mgDf50)動物を試験化合物の存在下でマイクロタイター皿においてイン キュベートする。このヒトDAF-16遺伝子は、C．エレガンス株における全てのDAF -16活性を供給し、このように候補試験化合物によってその活性が低下しなけれ ばdaf-2によるダウア段階での停止を生じる。必要に応じて、試験化合物または 抽出物の様々な濃度を接種して用量作用を調べる。対照ウェルは試験化合物また は抽出物の非存在下でインキュベートする。次にプレートを25℃でインキュベー トする。適当な期間、例えば２〜５日の後、ウェル中の子孫の有無を調べる。子 孫が存在すれば、試験化合物または抽出物がdaf-3またはdaf-16活性の阻害に対 して有効であることを示し、したがって本発明において有用であると見なされる 。DAF-16遺伝子活性を阻害する（または受容体機能の非存在下での上流のシグナ ル伝達 を活性化する）化合物はいかなるものも、線虫を繁殖させる。これを図19に略図 として示す。 または、糖尿病疾患はDAF-7 TGF-βシグナル伝達経路における欠損から生じる 可能性がある。DAF-3活性が低下すればC．エレガンスの代謝制御におけるDAF-7 活性が必要でなくなるため、DAF-3活性をダウン・レギュレートする薬剤は、糖 尿病に関連する代謝欠損を改善するために有用である。そのような薬剤をスクリ ーニングするため、ヒトDAF-3を発現するdaf-7(el372)；daf-3(mg90)線虫を上記 のように化学物質に暴露する。この株において、ヒトDAF-3は全てのDAF-3活性を 供給して、その活性が阻害されなければdaf-7によるダウア段階での停止を引き 起こす（図20）。この活性を阻害することができる化合物は本発明において有用 な治療薬であると見なされる。 最後に、C．エレガンスのdaf-3またはdaf-16を阻害する薬剤のより複雑でない スクリーニングにおいて、C．エレガンスのdaf-3またはdaf-16遺伝子活性を低下 させる化合物に関してdaf-7またはdaf-2変異体を直接スクリーニングする。 さらに、その他のdaf変異を有するC．エレガンス虫は、インスリンまたはTGF- βシグナル伝達経路における試験化合物の作用機序に関するさらなる情報を得る アッセイにおいて利用してもよい。例えば、PIP3アゴニスト活性を有する薬剤は age-1およびdaf-2変異体をダウア段階で停止させない（しかし、aktまたはdaf-7 変異体は停止させる）と予想されるであろう。同様にdaf-3を阻害する薬剤はdaf -7変異体を抑制すると予想されるが、daf-2またはage-1変異体を抑制しないと思 われる。その他のスクリーニングアッセイ その他の薬剤スクリーニングアッセイはまた、C．エレガンス虫または哺乳類 の細胞培養のいずれかを用いて行ってもよい。必要に応じて、そのようなアッセ イにはリポーター遺伝子構築物を使用することを含んでもよい。 例えば、daf、age、またはakt遺伝子の特にヒト相同体を発現する変異体C．エ レガンス株（すなわち、ヒト化したC．エレガンス）において、ダウア形成また はリポーター遺伝子に及ぼす試験化合物の作用を調べることは有用なスクリーニ ング法となる。C．エレガンスにおけるヒト相同体の発現は定法に従って得られ るが 、必要に応じて、そのような遺伝子はC．エレガンスから得られた遺伝子プロモ ーターに機能的に結合していてもよい。そのようなプロモーターには、C．エレ ガンスのdaf-16、age-1、daf-3、daf-4、およびakt遺伝子プロモーターが含まれ るがこれらに限定しない。例えば、2.5kbのage-1プロモーターは、以下のプライ マーを用いた標準的なPCR法を用いることによって作製および単離することがで きる： さらに、C．エレガンスのdaf、age-1、またはakt相同体を発現する哺乳類の組 織培養細胞を用いて、試験化合物または抽出物がインスリンまたはTGF-βシグナ ル伝達経路を調節することができるか否かを評価してもよい。リガンド、受容体 、キナーゼカスケード、および下流の転写因子からのシグナル伝達経路はヒトか ら虫まで保存されているため、虫のシグナル伝達蛋白質を阻害または活性化する 試験化合物または抽出物はまた、それそれのヒト相同体を阻害または活性化する はずである。例えば、DAF-16がC．エレガンスにおけるインスリン様シグナル伝 達の下流で作用する転写因子であるという本発明者らの発見により、ヒトDAF-16 転写リポーター遺伝子もまた、インスリンシグナル伝達の下流のシグナル伝達経 路におけるキナーゼのいずれかを阻害する薬剤を同定するために用いることがで きることが示される。例えば、リポーター遺伝子構築物におけるDAF-16およびDA F-3蛋白質結合部位を、インスリンのシグナル伝達をモニターするために用いて もよい。インスリンのシグナル伝達を模倣する候補化合物（例えばPIP3アゴニス ト）は、リポーター遺伝子発現を増加させると予想され、本発明において有用で あると見なされる。リポーター遺伝子構築物 一つの特定の例において、本発明はC．エレガンスの遺伝子プロモーター、例 えはTCTCGTTGTTTGCCGTCGGATGTCTGCC（配列番号：51）エンハンサーエレメントを 含むプロモーター、例としてC．エレガンスの咽頭ミオシンプロモーターのよう なエンハンサーエレメント（オッケマ＆ファイア（Okkema and Fire）、Develop ment 120：2175〜2186、1994）の制御下において発現されるリポーター遺伝子の 使用を含む。このエンハンサーエレメントはDAF-3調節に反応することが知られ ている （すなわち、daf-7変異体において、daf-3が活性であれば、エレメントはリポー ター遺伝子に低レベル発現を付与する；daf-7;daf-3変異体（例えば、daf-7(el3 72);daf-3）では、エレメントはリポーター遺伝子に低レベル発現を付与する。 その他の同等のエンハンサーエレメント、例えばアフリカツメガエルのSmad Iお よびFast Iフォーク状蛋白質が結合するエンハンサーエレメント（Nature 383： 600〜608、1996）もまた、本発明において用いてもよい。エンハンサーエレメン トは標準的なリポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼまたは緑色蛍光蛋白質（ GFP）リポーター遺伝子の上流にクローニングされる。好ましい態様において、C .エレガンスにおいてGFPリポーター遺伝子を用いる。その他の好ましい態様にお いて、GFPまたはルシフェラーゼリポーター遺伝子は、哺乳類の細胞に基づくア ッセイにおいて用いてもよい。次にリポーター遺伝子構築物は当技術分野で既知 の定法に従って適当な宿主（例えばC．エレガンスまたは哺乳類細胞）に導入さ れる。宿主生物または細胞におけるリポーター遺伝子活性の分析は、定法、例え ば本明細書に記述の方法に従って決定する。そのようなリポーター遺伝子（およ び宿主細胞系）は、インスリンまたはDAF-7代謝制御シグナル伝達を調節する薬 剤のスクリーニングに有用である。C ．エレガンス 一つの試験例において、上記リポーター遺伝子構築物を、当技術分野で既知の 定法に従って野生型C．エレガンスの中に導入する。エンハンサーエレメントが 機能的であれば、リポーター遺伝子発現が起こると予想される。または上記リポ ーター遺伝子構築物を有するdaf変異体（例えば、daf-7またはインスリンシグナ ル伝達が欠損している場合にはdaf-2変異体）では、リポーター遺伝子活性はオ フにされる。 このオン／オフ識別を用いて、試験化合物または抽出物を、本明細書に記述の シグナル伝達経路を乱すことができるか否かを評価する。一つの作業例において 、リポーター遺伝子構築物を有するdaf-2変異体虫は、リポーター遺伝子発現を アッセイするために用いられる。リポーター遺伝子を発現する虫のほとんどは、 daf-2表現型のためにダウア段階で停止するであろう。しかし、試験化合物また は抽出物がDAF-16活性を阻害すれば、虫はdaf-2;daf-16表現型（すなわち停止し ない ）を示し、産卵へと生育するであろう。漂白処置を用いてそのような卵を選択し 、試験化合物または抽出物におけるリポーター遺伝子発現を定法に従ってアッセ イする、例えばリポーター遺伝子発現、例えばGFPが存在することを明らかにす るために自動蛍光測定計によって虫を調べる。daf-2表現型を抑制する、または リポーター遺伝子発現をオンにする、すなわちDAF-2受容体の非存在下でシグナ ルを活性化する（例えばPIP3模倣体）またはDAF-16を不活化する候補化合物は、 本発明において有用であると見なされる。 DAF-3のような他のdaf-遺伝子を不活化する薬剤、またはDAF-1/DAF-4受容体を 活性化する化合物を同定する手段として、daf-7変異体を用いて類似のスクリー ニングを行ってもよい。そのようなスクリーニングは、例えばその発現がDAF-3 転写制御下にある（例えば、myoIIエレメント）GFPリポーター遺伝子を用いてリ ポーターのスクリーニングとカップリングさせてもよい。そのようなスクリーニ ングにおいて同定された薬剤はDAF-7模倣体として有用である。DAF-7発現は肥満 においてダウン・レギュレートされている可能性があるため、そのような薬剤は 肥満によるII型糖尿病の治療に有用である。 さらにもう一つの試験例において、C.エレガンスのDAF-3およびDAF-16遺伝子 はヒト相同体（例えば、DAF-16の代わりにFKHR）と置換することができ、線虫系 において実施される上記と同様の方法でスクリーニングすることができる。薬剤 は転写因子の上流で作用するため、DAF-1、DAF-II、DAF-8、DAF-11、DAF-2、DAF -3、DAF-16またはAGE-1を適当なヒト相同体に置換し、ヒト化したC．エレガンス 動物をスクリーニングすることは有用である。そのようなスクリーニングはヒト において活性を有する化合物を同定するために有用である。哺乳類細胞 哺乳類のインスリン反応性細胞株はまた、本発明の方法のスクリーニングに有 用である。ここに、リポーター遺伝子構築物（例えば、上記のような）を細胞株 に導入して、C.エレガンスのdaf、age、またはakt遺伝子または対応するヒト相 同体を発現する第二の構築物を用いて、試験化合物または抽出物がインスリンお よびTGF-βシグナル伝達経路を調節することができるか否かを評価する。例とし ての細胞には、マウス3T3、L6およびL1細胞を含むがこれらに限定しない（マク ドガ ルドら（MacDougald）、Ann．Rev．Biochem．64：345〜373、1995）。構築物を そのような細胞株に導入することは、当技術分野で周知の標準的な方法を用いて 実施する。 化合物または抽出物を試験するため、これを細胞株に加え、リポーター遺伝子 の発現をモニターする。インスリンまたはDAF-7シグナル伝達の非存在下におい てリポーター遺伝子発現を誘導する化合物は、本発明において有用であると思わ れる。そのような化合物はまた、インスリンのように細胞を脂肪細胞へと変化さ せる可能性がある。 哺乳類細胞において同定された化合物は本明細書に記述の他のスクリーニング アッセイにおいて試験してもよく、一般に試験化合物はインスリンまたはDAF-7 シグナル伝達における関与を確認するために多数のスクリーニングにおいてアッ セイしてもよい。 DAF-7蛋白質による代謝制御は既知の細胞株、例えば、本明細書に記述の細胞 株を用いて試験してもよい。インビトロスクリーニング法 インビトロアッセイにおいて有用な化合物を同定するために多様な方法を利用 できる。一つの特定の例において、試験化合物は、インビトロにおいてDAF-1ま たはDAF-4による、Smad蛋白質、DAF-8、DAF-14またはDAF-3の燐酸化を活性化す ることができるか否かをスクリーニングする。これらのアッセイにおいて、DAF- 8、DAF-14、またはDAF-3は、好ましくは異種の蛋白質ドメイン、例えばアウスユ ベールら（Ausubel）の方法によってmycエピトープタグドメインによってタグを つけ、DAF-1またはDAF-4のC-末端キナーゼドメインと共にインキュベートする。 Smad蛋白質の燐酸化は好ましくは、タグに対して特異的な抗体を用いて免疫沈降 を行い、その後シンチレーション計数を行うことによって検出する。試験化合物 は高処理能のマイクロタイター・プレートアッセイにおいてスクリーニングして もよい。DAF-8、DAF-14、またはDAF-3の燐酸化を有効に刺激する試験化合物は本 発明において有用であると思われる。これらの同じ一般的なアッセイを用いて、 AKTまたはGSK-3によるDAF-16の燐酸化を活性化する化合物を同定してもよい。 もう一つの試験例において、試験化合物が、DAF-16およびSmad蛋白質DAF-3の イ ンビトロでの会合を阻害する、好ましくはDAF-16とDAF-8およびDAF14、DAF-8、 またはDAF-14の会合を活性化する、またはインビトロでDAF-3およびDAF-16とDNA との会合を阻害することができるか否かをスクリーニングする。これらのアッセ イは蛋白質・蛋白質結合または蛋白質・DNA結合を調べる標準的な生化学法によ って実施される。一つの特定の例において、蛋白質間の相互作用を調べるために 、各蛋白質に異なる異種の蛋白質ドメインでタグをつける（上記のように）。免 疫沈降は一つのタグに対する抗体を用いて実施し、ELISAアッセイを免疫沈降複 合体上で行って第二のタグの有無を調べる。さらに、相互作用能がDAFまたはAKT キナーゼによって増強すれば、この蛋白質はまた、好ましくは反応混合物におい て含まれる。同様に、これらの蛋白質とDNAとの相互作用を調べるために、タグ に対する抗体を免疫沈降に利用して、DNAの有無を免疫沈降複合体におけるDNA標 識の有無によって検出する。これらの蛋白質間、またはDAF-3およびDAF-16とDNA もしくは双方の間の会合を有効に阻害する試験化合物は、本発明において有用で あると思われる。 さらにもう一つの試験例において、PIP3の試験誘導体がインビトロでAKT活性 を増加することができるか否かをスクリーニングする。これは一般に、PIP3：AK Tがインビトロで結合するような条件下で、試験化合物の存在下または非存在下 において標識したPIP3およびAKTポリペプチドを混合することによって行われる 。次にPIP3：AKT複合体の形成を妨害する化合物を同定する。この最初のスクリ ーニングに合格した試験化合物を次に、GSK3標的を用いてインビトロでAKT活性 化の増加に関して試験するか、または線虫もしくは哺乳類細胞において試験して もよい（上記のように）。AKTキナーゼ活性が増加すれば、この化合物は耐糖能 障害疾患を改善する、または遅らせるために有用な化合物であることが示される 。 さらにもう一つの試験例において、DAF-3またはDAF-16は、転写活性化を調べ るために酵母の１ハイブリッドアッセイにおいて発現してもよい。そのようなア ッセイを行う方法は、プレント＆プタシュネ（Brent and Ptashne、Cell 43：72 9〜736、1985）に記述されている。DAF-3またはDAF-16またはその双方のこの系 における転写を活性化能（または抑制能）を阻害する試験化合物は、本発明にお いて有用であると思われる。 最後の試験例において、化合物はDAF-3、DAF-8、およびDAF-14の間またはDAF- 3とDAF-16の間の相互作用の阻害能力に関してスクリーニングしてもよい。これ らのインビボアッセイは、「２ハイブリッド」または「相互作用捕獲」法によっ て行ってもよい（例えば、ビヤイチャンダーら（Vijaychander、Biotechniques 20：564〜568）が記述した方法を用いて）。調節化合物 本発明者らの実験結果は、C．エレガンスにおいて同定されたおよび上記のイ ンスリンまたはTGF-βシグナル伝達経路のアンタゴニストまたはアゴニストであ る、耐糖能障害疾患の治療において有用な化合物の単離を促進する。そのような 化合物を単離する一例としての方法を次に示す。 アンタゴニスト 上記のように、有用な治療化合物はDAF-3またはDAF-16の発現または活性をダ ウン・レギュレートする化合物を含む。そのような化合物を単離するため、候補 となるアンタゴニスト分子をDAF-3、またはDAF-16発現細胞の培養培地に加えた 後にDAF-3またはDAF-16発現を測定する。または、候補となるアンタゴニストを 直接動物に投与して（例えば、線虫またはマウス）DAF-3またはDAF-16発現に及 ぼすそれらの作用をスクリーニングするために用いてもよい。 DAF-3またはDAF-16発現は、例えばDAF-3またはDAF-16核酸配列（またはその断 片）をハイブリダイセーションプローブとして用いた標準的なノザンブロット分 析（アウスユベールら（Ausubel）、上記）によって測定する。候補分子の存在 下でのDAF-3またはDAF-16発現レベルを、候補分子の非存在下での同じ培養培地 において、または試験動物の平行した組の同じ細胞において測定したレベルと比 較する。抗糖尿病または抗肥満目的のための好ましい調節物質は、DAF-3またはD AF-16発現の減少を引き起こす物質である。 または発現もしくは活性に及ぼす候補調節物質の作用は、DAF-3もしくはDAF-1 6特異的抗体（例えば本明細書に記載のDAF-3もしくはDAF-16抗体）とのウェスタ ン・ブロッティングまたは免疫沈降のような標準的な免疫検出技法と併用した同 じ一般的なアプローチを用いて、DAF-3またはDAF-16蛋白質産生のレベルで測定 してもよい。この場合も、有用な抗糖尿病または抗肥満治療調節物質は、DAF-3 また はDAF-16ポリペプチド産生の減少を生じる物質として同定される。アンタゴニス トはまた、発現レベルにいかなる影響も及ぼすことなくDAF-3またはDAF-16活性 に影響を及ぼす可能性がある。例えば、DAF-3およびDAF-16の上流にキナーゼカ スケード（本明細書に記述のように）が存在することは、これらのポリペプチド の燐酸化状態が活性と相関することを示唆している。燐酸化状態は燐酸化された アミノ酸に特異的な抗体を用いる標準的なウェスタンブロッティングを用いてモ ニターしてもよい。さらに、DAF-3およびDAF-16は転写因子であるため、機能的 に結合したDAF-3またはDAF-16結合部位を有するリポーター遺伝子（例えば、myo IIエンハンサーエレメント）を用いてDAF-3またはDAF-16遺伝子活性に及ぼすア ンタゴニストの作用を直接モニターしてもよい。 候補となる調節物質は精製（または実質的に精製）された分子であってもよく 、または化合物の混合物の一成分であってもよい（例えば、細胞から得られた抽 出物または上清）。混合した化合物アッセイにおいて、単一の化合物または最少 の化合物混合物がDAF-3またはDAF-16発現を調節することが示されるまで、候補 となる化合物プールの漸減的サブセット（例えば、標準的な精製技法、例えばHP LCまたはFPLCによって産生する；アウスユベールら（Ausubel）、上記）に対し て、DAF-3またはDAF-16発現を調べる。 候補DAF-3またはDAF-16アンタゴニストは、非ペプチド性の分子（例えば、例 えば細胞抽出物、哺乳類の血清もしくは哺乳類の細胞を培養する増殖培地中に認 められるペプチドまたは非ペプチド分子）と共にペプチドを含む。 細胞DAF-3もしくはDAF-16発現または活性のレベルで有効であることが判明し たアンタゴニストは、動物モデル（例えは、線虫もしくはマウス）において有用 であることが確認される可能性がある。例えば、化合物はII型糖尿病のマウスモ デル（例えば、dbマウスモデル）、I型糖尿病マウスモデル、またはストレプト ゾシン誘発β細胞破壊モデルの耐糖能障害および糖尿病症状を改善する可能性が ある。 DAF-3もしくはDAF-16発現またはDAF-3もしくはDAF-16活性の低下を促進する分 子は、本発明において特に有用であると思われる；そのような分子は例えば、本 来の細胞のDAF-3またはDAF-16のレベルまたは活性を低下させ、それによって動 物 （例えば、ヒト）における耐糖能障害疾患を治療する治療剤として用いてもよい 。 必要に応じて、本発明のアンタゴニストによる治療をその他の抗糖尿病または 抗肥満治療と組み合わせてもよい。 アゴニスト 同様に上記のように、有用な治療化合物はDAF-1、DAF-2、DAF-4、DAF-7、DAF- 8、DAF-11、DAF-14、AGE-1もしくはAKTの発現または活性をアップレギュレート する化合物である。そのような化合物を単離するために、候補となるアゴニスト 分子をDAF-1、DAF-2、DAF-4、DAF-7、DAF-8、DAF-11、DAF-14、AGE-1またはAKT 発現細胞の培養培地に加えた後にこれらの遺伝子の発現を測定する。または、候 補となるアゴニストを動物（例えば、線虫またはマウス）に直接投与して、DAF- 1、DAF-2、DAF-4、DAF-7、DAF-8、DAF-11、DAF-14、AGE-1またはAKT発現に及ぼ すそれらの作用をスクリーニングするために用いてもよい。 DAF-1、DAF-2、DAF-4、DAF-7、DAF-8、DAF-11、DAF-14、AGE-1またはAKT発現 は、これらの遺伝子のうち一つの全体もしくは一部をハイブリダイゼーションプ ローブとして用いた標準的なノザンプロット分析（アウスユベールら（Ausubel ）、上記）によって測定する。候補分子の存在下でのDAF-1、DAF-2、DAF-4、DAF -7、DAF-8、DAF-11、DAF-14、AGE-1またはAKT発現レベルを、候補分子の非存在 下での同じ培養培地において、または試験動物の平行した組の同じ細胞において 測定したレベルと比較する。抗糖尿病または抗肥満目的のための好ましい調節物 質は、DAF-1、DAF-2、DAF-4、DAF-7、DAF-8、DAF-11、DAF-14、AGE-1またはAKT 発現を増加させる物質である。 または発現に及ぼす候補調節物質の作用は、適当な抗体とのウェスタン・ブロ ッティングまたは免疫沈降のような標準的な免疫検出技法と併用した同じ一般的 なアプローチを用いて、DAF-1、DAF-2、DAF-4、DAF-7、DAF-8、DAF-11、DAF-14 、AGE-1もしくはAKT蛋白質の産生レベルで測定してもよい。この場合も、これら のポリペプチドが燐酸化状態であれば、DAF活性があることを示し、これをウェ スタン・ブロット上で測定してもよい。有用な抗糖尿病または抗肥満調節物質は 、DAF-1、DAF-2、DAF-4、DAF-7、DAF-8、DAF-11、DAF-14、AGE-1またはAKTポリ ペプチ ド産生を増加させる物質として同定される。 候補となる調節物質は精製（または実質的に精製）された分子であってもよく 、または化合物の混合物（例えば、細胞から得られた抽出物もしくは上清）の一 成分であってもよい。混合した化合物アッセイにおいて、単一の化合物または最 少の化合物混合物がDAF-1、DAF-2、DAF-4、DAF-7、DAF-8、DAF-11、DAF-14、AGE -1またはAKT発現を調節することが示されるまで、候補となる化合物プールの漸 減的サブセット（例えば、標準的な精製技法、例えばHPLCまたはFPLCによって産 生する；アウスユベールら（Ausubel）、上記）に対して、DAF-1、DAF-2、DAF-4 、DAF-7、DAF-8、DAF-11、DAF-14、AGE-1またはAKT発現を調べる。 または、もしくはさらに、候補となる化合物は、天然または組換え型DAF-1、D AF-2、DAF-4、DAF-7、DAF-8、DAF-11、DAF-14、AGE-1もしくはAKT活性に拮抗す るか否かをスクリーニングしてもよい。一つの特定の例において、DAF-8およびD AF-14のDAF-1およびDAF-4燐酸化、またはDAF-16のAKT燐酸化は、アゴニストによ って活性化される可能性がある。 候補となるDAF-1、DAF-2、DAF-4、DAF-7、DAF-8、DAF-11、DAF-14、AGE-1また はAKTアゴニストには、非ペプチド性の分子（例えば細胞抽出物、哺乳類の血清 、もしくは哺乳類の細胞を培養する増殖培地中に存在するペプチドまたは非ペプ チド分子）と共にペプチドが含まれる。 細胞のDAF-1、DAF-2、DAF-4、DAF-7、DAF-8、DAF-11、DAF-14、AGE-1もしくは AKT発現または活性のレベルで有効であることが判明したアゴニストは、動物モ デル（例えば、線虫、またはマウス）において有用であることが確認される可能 性がある。 DAF-1、DAF-2、DAF-4、DAF-7、DAF-8、DAF-11、DAF-14、AGE-1もしくはAKT発 現またはDAF-1、DAF-2、DAF-4、DAF-7、DAF-8、DAF-11、DAF-14、AGE-1もしくは AKＴ活性の増加を促進する分子は、本発明において特に有用であると思われる； そのような分子は例えば、これらの本来の細胞の遺伝子レベルまたは活性を増加 させ、それによって動物（例えば、ヒト）における耐糖能障害疾患を治療する治 療剤として用いてもよい。 必要に応じて、DAF-1、DAF-2、DAF-4、DAF-7、DAF-8、DAF-11、DAF-14、AGE-1 もしくはAKTアゴニストによる治療を、その他の抗糖尿病または抗肥満治療と組 み合わせてもよい。動物モデル系 次に、上記アッセイのいずれかにおいて活性を有することが確認された化合物 は、ob（コールマン、Dibetologia 14：141〜148、1978；チュアら（Chua）、Sc ience 271：994〜996、1996；バイセら（Vaisse）、Nature Genet．14：95〜100 、1996）、db（チェンら（Chen）、Cell 84：491〜495、1996）、アグーチマウ ス、または太ったラット（タカガら（Takaga）、Biochem．Biophys．Res．Commu n．225：75〜83、1996）を含むがこれらに限定しない、利用できる多くの糖尿病 または肥満動物モデル系においてスクリーニングする。試験化合物は定法に従っ てこれらの動物に投与する。さらに、試験化合物はインスリン受容体、IGF-1受 容体（例えば、リウら（Liu）、Cell 75：59〜72、1993）、IR-関連受容体、DAF -7相同体または本明細書に記述のdaf（FKHR、AFX）遺伝子のノックアウト変異を 有するマウスにおいて調べてもよい。化合物はまた、標準的なI型糖尿病のマウ スまたはラットモデル、例えばストレプトゾシン除去膵臓モデルを用いて調べる ことができる。 一つの特定の例において、本発明はDAF-7またはその相同体を糖尿病または肥 満を治療する方法として投与することを含む。そのような化合物の有効性の評価 は標準的な動物モデル、例えば上記の動物糖尿病モデル系を用いて行われる。こ れらのマウス糖尿病モデルは肥満にも関連しているため、それらはヒトの肥満に 関連したII型糖尿病にとっても好ましいモデルとなる。そのような糖尿病または 肥満マウスに、当技術分野で周知の標準的な方法に従って、C.エレガンスまたは ヒトのDAF-7を投与する。例えば、処置および無処置対照動物の血中グルコース 、ケトアシドーシス、およびアテローム性動脈硬化症をモニターすることによっ て、化合物が疾患の症状を改善することができるか否かをモニターする。血中グ ルコースおよびインスリンレベルが正常化すれば、その化合物は耐糖能障害疾患 の治療に有用であることが示される。治療 本明細書に開示の方法を用いて同定されたDAF-7およびその相同体、ならびに ア ンタゴニストもしくはアゴニスト治療剤を含むがこれらに限定しない本発明の化 合物は、薬学的に許容される希釈剤、担体、もしくは賦形剤と共に単位投与剤形 で投与してもよい。従来の薬学的方法を用いて、そのような組成物を患者に投与 するために適した製剤または組成物を提供してもよい。静脈内投与が好ましいが 、適当な投与経路、例えば、非経口、皮下、筋肉内、頭蓋内、眼内、脳室内、嚢 内、脊髄内、大槽内、腹腔内、鼻腔内、エアロゾル、または経口投与を用いても よい。治療製剤は液体の溶液または懸濁液の形であってもよく、経口投与の場合 は、製剤は錠剤またはカプセル剤の形であってもよく、および鼻腔内製剤の場合 は粉剤、点鼻液またはエアロゾルであってもよい。 当技術分野で周知の製剤の調製法は、例えば、「レミントンの製薬科学（Remi ngton's Pharmaceutical Sciences）」に認められる。非経口投与のための剤形 は、例えば、賦形剤、滅菌水、もしくは生理食塩液、ポリエチレングリコールの ようなポリアルキレングリコール、植物油、または水素添加ナフタレンを含んで もよい。生体適合性の生体崩壊性のラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコ ポリマー、またはポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンコポリマーを用い て、化合物の放出を制御してもよい。本発明のアンタゴニストまたはアゴニスト に関して他に考えられる有用な非経口輸送系には、エチレン・酢酸ビニルコポリ マー粒子、浸透圧ポンプ、植え込み型注入システム、およびリポソームが含まれ る。吸入のための剤形は、賦形剤、例えば乳糖を含んでもよく、例えば、ポリオ キシエチレン-9-ラウリルエーテル、グリココール酸およびデオキシコール酸を 含む水溶液であってもよく、点鼻ドロップまたはゲルとして投与される油状溶液 であってもよい。 DAFポリペプチドは適当な濃度で、例えばDAF-7に関しては約10nMの濃度で投与 する。系統分祈と遺伝子試験 本明細書において記述した、DAFポリペプチドはグルコース代謝に関係してい るという発見により、C．エレガンスのdaf-1、daf-2、daf-3、daf-4、daf-7、da f-8、daf-11、daf-14、daf-16、age-1、またはakt遺伝子のいずれかに対して同 一性を有するヒト遺伝子に存在する変異の有無を調べることによって、糖尿病ま たは 肥満のような耐糖能障害疾患の発症に対する素因を有する個人を特定する遺伝子 試験に関するアッセイが可能となる。一つの態様において、この試験法を開発す るためには、個々の人が、上記遺伝子のリストから１つの変異を有する多数の罹 患したおよび罹患していない家族構成員を有する家系の一員であることが必要で ある。当業者は糖尿病または肥満表現型は、異なる染色体に存在するdaf、age、 もしくはakt変異によって生じる可能性があること、そして単一の家系における 糖尿病状態の低解像度の遺伝子マップがあれば、特定の家系における耐糖能障害 疾患を引き起こす原因として、他の遺伝子よりもdaf、age、またはakt遺伝子に とって都合のよい結果を生じるために十分であることを理解するであろう。一つ の特定の例において、耐糖能障害に関連した変異は、例えば、各家系においてDA F-7シグナル伝達経路における異なる遺伝子に認められる可能性がある。さらに 、共通の経路における変異は複雑な遺伝子相互作用を示しうるため、単一の家系 において多数のDAF変異が分離する可能性がある。これらの変異は何らかの遺伝 的背景では劣性の挙動を示し、その他では優性となりうる。 当業者はさらに、染色体マーカーとの疾患の連鎖を調べるために、家系の構成 員および発病した個人のゲノムDNAにおけるいくつかの異なる染色体マーカー（ 例えば、非常に構造多形のマッピングされたDNA対立遺伝子変種のコレクション から）の遺伝パターンの関連を調べることが必要であるかも知れないことを理解 している。ヒト遺伝子疾患の分離パターンを決定するために一般的に用いられる 方法は当技術分野で周知である。さらに、家系における個々の人が、耐糖能障害 素因を有する対立遺伝子の共分離を調べるための情報提供に役立つか否かを決定 する方法は当技術分野で既知である。 ここに、ゲノムDNAの断片（例えば、RFLP断片）を入手可能な家系の構成員の それぞれから調製し、家系内の多形染色体マーカーのそれぞれの明確なDNA対立 遺伝子変種を評価して、どの多形（すなわち染色体領域）が特定の家系において 耐糖能障害表現型に連鎖しているかを決定する。マーカーとなる人の親は、マー カーにおける糖尿病または肥満表現型に連鎖したDNA対立遺伝子変種の分離パタ ーンが認識できるように、DNA対立遺伝子変種に関してヘテロ接合であることが 好ましい。糖尿病表現型の遺伝は、遺伝パターンに応じて優性または劣性と判断 すること ができる。ほとんどの糖尿病は優性遺伝であり、したがって一般に糖尿病疾患の 疫学においては近交系は必要がない。 II型糖尿病に関して、世界でこの種の糖尿病の最高発生率は、ピマ族のアメリ カインディアンにおいて認められた。そのような家系は糖尿病の一つの特定原因 をマッピングするために有用であるが、一般に糖尿病はdaf遺伝子を含む多様な 遺伝子の変異によって引き起こされる。このように、候補となるdaf、age、また はakt変異との低解像度連鎖に関して調べることによって、そして次に罹患した および罹患していない個人における特定の連鎖daf遺伝子をシークエンシングす ることによって、特定のdaf変異を特定の糖尿病家系に関連させることができる 。 ヒトDAF相同体は標準的な方法を用いて染色体領域にマッピングする。例えば 、DAF-16相同体と思われるFKHRは第13染色体上に存在し、AFXはX染色体上に存在 する。糖尿病または耐糖能障害に関連した適当な染色体領域へのいかなるdaf、a kt、またはage遺伝子のマッピングも、罹患者および非罹患者からシークエンシ ングする。好ましくは、５〜20人が罹患している（および罹患していない対照） １家系あたり少なくとも２つの遺伝子をシークエンシングする。dafゲノム領域 をPCR増幅し、罹患者および非罹患者のDNA試料を比較した。罹患者において検出 された変異は、DAF遺伝子の保存ドメインにマッピングされる（必ずしもその必 要はない）と予想される。既知の糖尿病誘発変異を有する全てのキャリアが代謝 欠損を示さないことは知られているため、何人かの非糖尿病性の非耐糖能障害の 家系構成員が、罹患者と同じdaf変異を有すると予想される。こうした理由から 、罹患した家系構成員とdaf変との相関は、非罹患者と変異がないこととの相関 より重要である。当業者は、罹患者および非罹患者の表現型分類を行えばこの遺 伝子分析力を大きく増強させることができる（Nature Genet．11：241〜247、19 95）ことを知っているであろう。さらに、同じdaf遺伝子における他の変異は、 全てではないがいくつかの糖尿病家系において起こると予想される。優勢な糖尿 病遺伝に関しては、罹患者は、正常な対立遺伝子と共にdaf、age、またはakt変 異を有する。劣性糖尿病遺伝に関しては、その人は同じ遺伝子において同一であ るか、または２つの独立した変異である可能性がある２つのdaf変異を有する。 さらに、糖尿病患者の中には、一つ以上のdaf、age、またはakt遺伝子に変異を 有する可能性がある （いわゆる非対立遺伝子非相補）。 個人のゲノムDNAにおいて密接に関連した分子遺伝的マーカーが存在すれば、 および家系の個々の人の血統から得られたさらなる理解と合わせると、危険因子 を決定することは、遺伝子カウンセリングの分野においてルーチンである。例え ば、危険因子は、例えばハンチントン病および嚢胞性繊維症のように、家系にお いて存在することが知られている他の一般的な既知の遺伝子疾患のリスクを評価 するために記述された方法と同様の方法によって、age、akt、またはdaf染色体 ファミリーにおいて個人について計算してもよい。 daf、aktまたはage遺伝子における変異が系統分析において糖尿病に関連して いたら、耐糖能障害、前糖尿病段階、糖尿病、肥満、およびアテローム性動脈硬 化症状態を診断するために用いることができる。好ましくは、患者からのdaf、a kt、またはage遺伝子領域をPCR増幅して、標準的なDNAシークエンシングまたは オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション技法を用いてdaf遺伝子における変 異を検出する。そのような遺伝子配列または特異的抗体プローブをこれらの配列 の産物に用いることは、特にII型糖尿病には２つのクラス、すなわちTGF-βシグ ナル伝達遺伝子に欠損を有する患者、およびインスリンシグナル伝達遺伝子に欠 損を有する患者、が存在する可能性があることを考慮すると貴重な診断法となる 。そのような遺伝子試験は、DAF-7 TGF-βまたはDAF-2インスリン様シグナルに 影響を及ぼす薬剤のいずれを処方するか否かに影響を及ぼすであろう。 上記の分析を行うために（本明細書に記述の他のスクリーニング、診断、およ び治療法と共に）、C．エレガンスのdaf-1、age-1、daf-4、daf-8、およびdaf-7 遺伝子に対応する哺乳類の相同体をdaf-2、daf-3、およびdaf-16に関して先に記 述したように単離する。この場合も、好ましくはプローブをデザインするために 保存されたDAF、AGE、またはAKTモチーフを利用し、その後これらのモチーフに 隣接するあまり保存されていない配列と比較することによって、標準的なハイブ リダイゼーションまたはPCRクローニング戦略を用いる。これらの遺伝子の一例 としてのモチーフは以下の通りである： 一つの特定の実施例において、哺乳類のDAF-7はサブドメインアミノ酸314〜32 3を用いて同定してもよい。このドメインのPCR増幅またはハイブリダイズを行う ためにデザインされる例としての縮重オリゴヌクレオチドは（例えばバーグリン ら（Burglin、Nature 341：239〜243、1989）に記述のように）、以下の通りで ある： オリゴヌクレオチドプローブ間のDNA配列を決定し、相同性の最高程度を有す る配列を選択する。単離した後、C．エレガンスdaf-7変異体または上記のような マウスモデルにおいて、これらの配列が変異を機能的に相補することができるか 否か、または耐糖能障害表現型を改善することができるか否かを調べる。 その他の態様 他の態様において、本発明は、DAF-2、DAF-3またはDAF-16配列とのアミノ酸配 列同一性の必須のレベル（本明細書に定義するように）を有するいかなる蛋白質 も含む；そのような相同体は、他の実質的に純粋な天然に存在する哺乳類のDAF ポリペプチド（例えば、ヒトDAFポリペプチド）と共に対立遺伝子変種；天然の 変種；誘導した変種；DAF DNA配列とハイブリダイズするDNAによってコードされ る蛋白質または高ストリンジェンシー条件下でDAF蛋白質（例えば、本明細書に 記述の）の縮重した保存ドメイン；およびDAF-2、DAF-3、またはDAF-16ポリペプ チドに 対して作成された抗血清によって特異的に結合する蛋白質を含む。 本発明はさらに、天然に存在するDAF-2、DAF-3、またはDAF-16ポリペプチドの 類似体を含む。類似体は、機能を破壊しないアミノ酸配列の差によって、または 翻訳後修飾によって、もしくはその双方によって、天然に存在する蛋白質とは異 なることができる。修飾にはポリペプチドのインビボおよびインビトロ化学誘導 化、例えばアセチル化、カルボキシル化、燐酸化、またはグリコシル化が含まれ る。そのような修飾はポリペプチド合成またはプロセシングの際に、または単離 された修飾酵素による処置後に起こってもよい。類似体はまた、主な配列におけ る変化によって天然に存在するDAFポリペプチドとは異なることができる。これ らの中には、天然および誘導された遺伝子変種（例えば、サムブルック、フリッ チュおよびマニアティス（Sambrook、Fritsch and Maniatis）、「分子のクロー ニング：実験マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）」、第２ 版、CSHプレス、1989、またはアウスユベールら（Ausubel）、上記）に記述のよ うに、放射線照射またはエタンメチルスルフェートの暴露によるランダム変異誘 発、または部位特異的変異誘発の結果生じた変種）が含まれる。環状ペプチド、 分子、およびLアミノ酸以外の残基を含む類似体、例えばD-アミノ酸、または天 然に存在しないもしくは合成アミノ酸、例えはβもしくはγアミノ酸もまた含ま れる。 全長のポリペプチドの他に、本発明はまた、DAF-2、DAF-3およびDAF-16ポリペ プチド断片を含む。本明細書に用いるように、「断片」という用語は少なくとも 20個の連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも30個の連続するアミノ酸、より 好ましくは少なくとも50個の連続するアミノ酸、および最も好ましくは少なくと も60〜80個以上の連続するアミノ酸を意味する。そのようなDAFポリペプチドの 断片は一般に当業者に既知の方法によって作成することができ、通常の蛋白プロ セシング（例えば、生物活性に必要でない新生ポリペプチドからアミノ酸を除去 する、または異なるmRNAスプライシングまたは異なる蛋白質プロセシング事象に よるアミノ酸の除去）の結果であってもよい。 特定の目的に関して、DAF-2、DAF-3、またはDAF-16ポリペプチド配列の全体ま たは一部をもう一つの蛋白質に融合させてもよい（例えば、組み換え手段によっ て）。一つの例において、DAFポリペプチドは緑色蛍光蛋白質であるGFPに融合し てもよい（シャルフィーら（Chalfie）、Science 263：802〜805、1994）。その ような融合蛋白質は、例えば候補となるまたは既知のDAFアゴニストまたはアン タゴニストによる処置後のインビボでのDAFポリペプチドの発現レベルをモニタ ーするために有用である（例えば、蛍光顕微鏡によって）。 本発明の方法は、哺乳類、例えばヒト、ペット、もしくは家畜における耐糖能 障害または肥満に関連した疾患を診断または治療するために用いてもよい。ヒト 以外の哺乳類を診断または治療する場合、用いるDAFポリペプチド、核酸、また は抗体は、好ましくはその種に特異的である。 本明細書において言及した全ての刊行物および特許出願は、本明細書において それぞれの独立した刊行物または特許出願が特におよび個々に参照として組み入 れられることを示す程度に参照として組み入れられる。 その他の態様は以下の請求の範囲に含まれる。

【手続補正書】 【提出日】平成１２年８月２４日（２０００．８．２４） 【補正内容】 （１） 明細書第７頁第１９行の 「配列番号：54、55、56、もしくは57に対応」を 「配列番号：54、55、56、もしくは58に対応」と補正する。 （２）明細書第７頁第２６行の 「もしくは57をコードする配列」を 「もしくは58をコードする配列」と補正する。 （３）明細書第１８頁第１４行の 「ポリペプチドはモチーフGRKGFPHVにおいて」を 「ポリペプチドはモチーフGRKGFPHV（配列番号：57）において」と補正す る。 （４）明細書第１８頁第１５行の 「またはモチーフRXXIXXG」を 「またはモチーフRXXIXXG（配列番号：197）」と補正する。 （５）明細書第１８頁第２０行の 「配列番号：57」を 「配列番号：58」と補正する。 （６）明細書第２７頁第９行の 「C.エレガンスの予想されるDAP-2アミノ酸配列を示す」を 「C.エレガンスの予想されるDAF-2アミノ酸配列（配列番号：12）を示す 」と補正する。 （７）明細書第２７頁第２２行の 「YXXMモチーフを１個有するが」を 「YXXMモチーフ（配列番号：159）を１個有するが」と補正する。 （８）明細書第２８頁第１０行の 「C.エレガンスのDAF-2をコードするcDNAを示す」を 「C.エレガンスのDAF-2をコードするcDNA（配列番号：11）を示す」と 補正する。 （９）明細書第２８頁第１３〜１４行の 「daf-2およびヒトインスリン受容体変異を強調して示す」を 「daf-2およびヒトインスリン受容体変異を強調して示す（配列番号：160 〜167） 」と補正する。 （１０）明細書第３１頁第１６行の 「ヒトDPC4の蛋白質配列配置を示す」を 「ヒトDPC4の蛋白質配列配置を示す（配列番号：168〜171）」と補正する 。 （１１）明細書第３３頁第２４行の 「最も近縁であることを示す図である」を 「最も近縁であることを示す図である（配列番号：172〜178）」と補正す る。 （１２）明細書第３４頁第５行の 「比較を示す図である」を 「比較を示す図である（配列番号：179〜196）」と補正する。 （１３）明細書第３４頁第９行の 「（配列番号：117〜124）」を 「（配列番号：87 〜94）」と補正する。 （１４）明細書第３４頁第１０行の 「（配列番号：125）およびコンセンサスモチーフとの相同性」を 「（配列番号：95）およびコンセンサスモチーフ（配列番号：86）相同性 」と補正する。 （１５）明細書第３４頁第１２行の 「（配列番号：126〜153）」を 「（配列番号：96 〜123）」と補正する。 （１６）明細書第３５頁第１５〜１６行の 「AKT-1a（配列番号：154）、AKT-1b（配列番号：155）、AKT-2（配列番 号：156）、およびヒトAkL/PKBα（M63167）（配列番号：157)のPILEUP（GCG） 」を 「AKT−1a（配列番号：124）、AKT-1b（配列番号：125）、AKT-2（配列番 号：126）、およびヒトAkt/PKBα（M63167）（配列番号：127）のPILEUP（GCG） 」と補正する。 （１７）明細書第３５頁第２８行の 「（配列番号：158）」を 「（配列番号：128 〜129）」と補正する。 （１８）明細書第３５頁第２９行の 「（配列番号：159）」を 「（配列番号：130）」と補正する。 （１９）明細書第３６頁第１行の 「（配列番号：160）」を 「（配列番号：131）」と補正する。 （２０）明細書第４１頁第２１行の 「NPEYモチーフ（Y972）に対応する」を 「NPEYモチーフ（Y972）（配列番号：198）に対応する」と補正する。 （２１）明細書第４７頁第２５行の 「アミノ酸配列を図14A〜14Cに示す（配列番号：44〜46）」を 「アミノ酸配列を図14A〜14Bに示す（配列番号：45 〜46）」と補正する。 （２２）明細書第５２頁第７行の 「（配列番号：115、116）」を 「（配列番号：199 〜200）」と補正する。 （２３）明細書第５２頁第１０行の 「（配列番号：115）」を 「（配列番号：199）」と補正する。 （２４）明細書第５２頁第１４行の 「配列番号：116」を 「配列番号：200」と補正する。 （２５）明細書第５２頁第２２行の 「（配列番号：117〜124）」を 「（配列番号：87 〜94）」と補正する。 （２６）明細書第６３頁第１６〜１７行の 「（配列番号：161〜169）」を 「（配列番号：132 〜140）」と補正する。 （２７）明細書第６９頁第１４行の 「インスリン反応配列（CAAAAC/TAA）を通じて」を 「インスリン反応配列（CAAAAC/TAA）（配列番号：201）を通じて」と補 正する。 （２８）明細書第７０頁第１行の 「下記の配列番号：170〜199に示すように」を 「下記の配列番号：141 〜158に示すように」と補正する。 （２９）明細書第７７頁第８行の 「（配列番号：11）およびアミノ酸配列（配列番号：12）」を 「（配列番号：39 、52および53）およびアミノ酸配列（配列番号：40 〜42 ）」と補正する。 （３０）明細書第１２１頁第１９行の 「54、55、56もしくは57に相当する」を 「54、55、56もしくは58に相当する」と補正する。 （３１）明細書第１２１頁第２４行の 「54、55、56、または57をコードする」を 「54、55、56、または58をコードする」と補正する。 【手続補正書】 【提出日】平成１２年１０月１９日（２０００．１０．１９） 【補正内容】 （１） 明細書第１００頁第２５行の 「（配列番号：51）エンハンサーエレメント」を 「（配列番号：202）エンハンサーエレメント」と補正する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/53 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 パターソン ガース アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 チ ャールスタウン 106−13ス ストリート ＃321 (72)発明者 オッジ スコット アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ニ ュートン フィリップス レーン 19 (72)発明者 パラディス スザンヌ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ソ マービル ジェイムス アベニュー 21 ストリート (72)発明者 ティッセンバウム ヘイジ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ベ ルモント チャンドラー ストリート 43 (72)発明者 モリス ジェイソン アメリカ合衆国 ニューヨーク州 ニュー ヨーク ファースト アベニュー ＃17キ ュー 564 (72)発明者 コウィーク アリソン アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ソ マービル ベルクナップ ストリート ＃３ ９ (72)発明者 ピアース サラ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ケ ンブリッジ ブルックリン ストリート ＃１ 260

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．以下の段階を含む、DAFポリペプチドの活性を減少させる化合物のスクリ ーニング法： （a）細胞に哺乳類のDAFポリペプチドをコードするトランスジーンを含む、ヒト 以外のトランスジェニック動物を該化合物に暴露する段階；および （b）該トランスジェニック動物における該DAFポリペプチドの活性を測定する段 階であって、無処置対照と比較して該DAFポリペプチドの活性が低下すれば、該 化合物がDAFポリペプチド活性を低下させることができることが示される測定段 階。 ２．動物が線虫である、請求項１記載の方法。 ３．線虫が対応する内因性daf遺伝子に変異を有し、変異が該内因性の線虫のd af遺伝子産物の活性を減少または消失させる、請求項１記載の方法。 ４．以下の段階を含む、daf遺伝子の発現または活性を低下させることができ る調節化合物を同定する方法： （a）daf遺伝子を発現する細胞を提供する段階；および （b）該細胞を候補化合物に接触させる段階であって、該候補化合物を接触させ た後にdaf発現または活性が低下すれば調節化合物であることが示される接触段 階。 ５．化合物が耐糖能障害疾患または肥満を治療することができる、請求項１ま たは４記載の方法。 ６．化合物がDAF-3またはDAF-16の発現または活性を減少させることができる 、請求項１または４記載の方法。 ７．以下の段階を含む、耐糖能障害疾患または肥満を改善または遅らせること ができる化合物を同定する方法： （a）daf遺伝子の変異を含むダウア幼虫を提供する段階；および （b）該ダウア幼虫を化合物と接触させる段階であって、ダウア幼虫状態から解 放されれば化合物が耐糖能障害疾患または肥満を改善または遅らせることができ ることが示される接触段階。 ８．以下の段階を含む、耐糖能障害疾患または肥満を改善または遅らせること ができる化合物を同定する方法： （a）daf-2、daf-16変異体線虫を提供する段階； （b）該線虫の細胞中で哺乳類のDAF-16ポリペプチドを発現させる段階であって 、それにより該線虫がダウア幼虫を形成する段階；および （c）該ダウア幼虫を化合物に接触させる段階であって、ダウア幼虫段階から解 放されれば該化合物が該耐糖能障害疾患または肥満を改善または遅らせることが できることが示される接触段階。 ９．以下の段階を含む、ヒト遺伝子が耐糖能障害疾患または肥満に関係するか 否かを決定する方法： （a）dafまたはage遺伝子に変異を有する線虫を提供する段階；および （b）線虫の遺伝子プロモーターに機能的に結合された該ヒト遺伝子を該線虫に おいて発現させる段階であって、該線虫において該dafまたはage変異が相補され れば、該ヒト遺伝子が耐糖能障害疾患または肥満に関係することが示される段階 。 10．DNAがC．エレガンスにおいてDAF-16変異を相補する、DAF-16ポリペプチド をコードする単離DNA。 11．DNAが、マウスにおけるFKHRまたはAFX変異を相補するポリペプチドをコー ドする、請求項10記載のDNA。 12．以下の段階を含む、図13Aまたは13Bのdaf-16配列との配列同一性を有する 、ヒト細胞において認められる遺伝子またはその一部を検出する方法： （a）長さが約12残基以上の線虫のDAF-16ポリペプチドもしくはその一部をコー ドするDNA、または配列番号：54、55、56もしくは57に相当する縮重オリゴヌク レオチドを、図13もしくは13Bのdaf-16配列と約70％以上の核酸配列同一性を有 するDNA配列が検出されるようなハイブリダイゼーション条件下で、ヒト細胞由 来のDNA調製物と接触させる段階；および （b）該ヒト遺伝子またはその一部を単離する段階。 13．以下の段階を含む、配列番号：54、55、56、または57をコードする配列と 90%の核酸配列同一性を有する、ヒト細胞において認められる遺伝子またはその 一部を単離する方法： （a）オリゴヌクレオチドプライマーを用いて該ヒト遺伝子またはその一部をPCR によって増幅する段階であって、該プライマーが （i）長さがそれぞれ約12残基以上であり； （ii）図13Aまたは13Bのヌクレオチド配列の領域においてもう一方のDNA鎖 と相補的な領域をそれぞれが有する、増幅段階；および （b）該ヒト遺伝子またはその一部を単離する段階。 14．方法が、遺伝子またはその一部がC．エレガンスのdaf-16変異体を機能的 に相補することができるか否かを調べることをさらに含む、請求項12または13記 載の方法。 15．患者における耐糖能障害疾患または肥満を改善またはその発症を遅らせる 方法であって、DAF-16またはDAF-3ポリペプチドの活性を阻害することができる 化合物の治療的有効量を該患者に投与することを含む方法。 16．患者における耐糖能障害疾患または肥満を改善またはその発症を遅らせる 方法であって、DAFポリペプチドの治療的有効量を該患者に投与することを含む 方法。 17．DAFポリペプチドが線虫またはヒトDAF-7ポリペプチドである、請求項16記 載の方法。 18．以下の段階を含む、耐糖能障害疾患または肥満を改善または遅らせる化合 物を同定する方法： （a）daf-7、daf-3変異体線虫を提供する段階； （b）該線虫の細胞中で哺乳類のDAF-3ポリペプチドを発現させる段階であって、 それにより該線虫がダウア幼虫を形成する段階；および （c）該ダウア幼虫を化合物に接触させる段階であって、ダウア幼虫段階から解 放されれば該化合物が該耐糖能障害疾患または肥満を改善または遅らせることが できることが示される段階。 19．以下の段階を含む、図11A、11B、または11Cのdaf-3配列のいずれかと配列 同一性を有する、ヒト細胞において認められる遺伝子またはその一部を検出する 方法： （a）長さが約12残基以上の線虫のDAF3ポリペプチドもしくはその一部をコード するDNAまたは配列番号：35、36、もしくは85に相当する縮重オリゴヌクレオチ ドを、図11A、11Bまたは11Cのdaf-3配列のいずれかと約70％以上の核酸配列同一 性を有するDNA配列が検出されるようなハイブリダイゼーション条件下で、該ヒ ト細胞 からのDNA調製物と接触させる段階；および （b）該ヒト遺伝子またはその一部を単離する段階。 20．以下の段階を含む、配列番号：35、36、または85をコードする配列と90% 核酸配列同一性を有する、ヒト細胞において認められる遺伝子またはその一部を 単離する方法： （a）オリゴヌクレオチドプライマーを用いて該ヒト遺伝子またはその一部をPCR によって増幅する段階であって、該プライマーが （i）長さがそれぞれ約12残基以上であり； （ii）図11A、11Bまたは11Cのヌクレオチド配列の領域においてもう一方のD NA鎖と相補的な領域をそれぞれが有する、増幅段階；および （b）該ヒト遺伝子またはその一部を単離する段階。 21．方法が、遺伝子またはその一部がC．エレガンスのdaf-3変異体を機能的に 相補することができるか否かを調べる段階をさらに含む、請求項19または20記載 の方法。 22．動物が内因性のdaf遺伝子を欠損しヒトDAFポリペプチドを発現することが できる、以下の段階を含む、ヒト以外のトランスジェニック動物を作製する方法 ： （a）その生殖細胞および体細胞がdaf遺伝子に変異を含む、ヒト以外のトランス ジェニック動物を提供する段階；および （b）トランスジーンが該ヒトポリペプチドを発現することができる、ヒトDAFポ リペプチドをコードするトランスジーンを該ヒト以外の動物の胚細胞に導入する 段階。 23．DNAがDAF遺伝子に変異を含むか否かを決定するために該哺乳類のDNAを分 析する段階を含む、哺乳類において耐糖能障害疾患もしくは肥満、またはその性 向を診断する方法であって、該変異が同定されれば該哺乳類が耐糖能障害疾患も しくは肥満、またはその性向を有することが示される方法。