CN100381570C - 滑膜细胞蛋白质 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种被称为滑膜蛋白的新蛋白质和编码该蛋白质的基因。该蛋白质由滑膜组织特异性表达，在类风湿性关节炎(RA)患者中还伴随有能识别该蛋白质的自身抗体的存在。本发明的蛋白质及其抗体有望用作RA的特异性诊断标记。另外，本发明的基因或蛋白质可用于筛选治疗RA的药物。另外，本发明提供了滑膜蛋白基因转基因动物。本发明的转基因动物可在开发治疗RA的药物时用作RA模型动物。

Description

滑膜细胞蛋白质
技术领域
本发明涉及一种与类风湿性关节炎(RA)相关的新蛋白质，编码该蛋白质的多核苷酸以及所述蛋白质或多核苷酸的应用。更具体地，本发明涉及一种有望用作RA特异性诊断标记的新蛋白质。另外，本发明还涉及一种新基因，该基因可为开发用于治疗RA的药物提供新的方法。
背景技术
RA是全身性的慢性炎症，其中关节滑膜组织处可见异常增生。滑膜细胞是成纤维样细胞，它形成关节滑膜的1至6层上皮样层，据认为它可为滑液提供蛋白聚糖和透明质酸。在RA患者的关节中，可观察到滑膜组织增生，以及多层结构所致的症状和由此导致的滑膜细胞浸润至其它组织。另外，RA患者的血清含有针对其自身IgG的Fc结构域的自身抗体。因此，人们认为RA是自身免疫病，但仍未阐明其病因。
长期以来，人们将上述识别自身IgG的自身抗体的存在用作RA的特征性诊断指标。最近，已可以买到含有经修饰的人IgG作为主要成分的自身抗体检测试剂盒。该自身抗体也被称为RA因子。基于检测RA因子以诊断RA在诊断疾病的特异性方面存在问题，另一问题是：由于尚未阐明产生抗体所依赖的系统，因此仍不清楚RA因子与病因的关系。
当从体内的多个免疫反应和伴随着骨损坏的关节滑膜增生疾病这两个方面检查RA的病理学时，进行了与所述免疫反应有关的多项研究，其分子机理即将被阐明。然而，尽管与关节滑膜细胞有关的研究是RA研究的主要方面，但目前仍没有阐明其细胞生物学特征。阐明RA与其它慢性和难治疾病之开始和进展背后所隐藏的分子机理是诊断、预防和治愈疾病所必需的。另外，在社会老龄化未显示出停止迹象的现行形势下，从社会学的观点上看，阐明老化疾病RA的病理学也是一个重要问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的蛋白质和编码该蛋白质的新基因，所述蛋白质可为诊断和治疗RA提供新的方法。本发明提供的蛋白质和编码该蛋白质的多核苷酸与RA的成因密切相关，并能为诊断提供有用的信息，还可在开发治疗技术时导致新药的产生。另外，本发明的另一个目的是提供表达了编码所述蛋白质的基因的转基因动物，以及缺损所述基因的敲除动物。这些动物可用于分析本发明基因的功能，还可在开发RA治疗方法和治疗药物中用作模型动物。
本发明人使用得自RA患者的、经培养的人滑膜细胞作为免疫原获得抗-人滑膜细胞抗体，并使用该抗体对RA患者滑膜细胞的cDNA文库进行免疫筛选，从而成功地分离出在RA患者的滑膜组织中表达的新基因。表达该基因的组织是滑膜细胞，因此将该基因编码的蛋白质称为滑膜蛋白(Synoviolin)。
本发明人已证实抗-人滑膜细胞抗体与上述培养滑膜细胞的约80-kDa、140-kDa和220-kDa分子量组分的反应性被上述滑膜蛋白基因的表达产物吸收。另外，本发明人发现：这些带和上述滑膜蛋白基因的表达产物表现出与RA患者血液中存在的抗体的反应性。另外，发明人还证实：抗-人滑膜细胞抗体表现出与RA患者滑膜组织的强反应性。
此外，本发明人使用生物化学连锁实验阐明了滑膜蛋白配体(SL)的存在，所述配体是滑膜蛋白的天然配体。SL是由本发明人首次分离到的身为滑膜蛋白配体的蛋白质。然而，当发明人尝试以编码SL的DNA的核苷酸序列为基础进行检索时，发现被称为S1-5的已知基因的5’末端结构域和3’末端结构域包括共同的核苷酸序列。本发明人分离的SL和S1-5在DNA部分序列以及基因大小、表达产物的分子量等方面几乎相同，因此，它们很有可能是相同的蛋白质。S1-5[也被称为“FBNL”(原纤蛋白-样)或“EFEMP1”(含EGF的原纤蛋白-样胞外基质蛋白1)]作为人二倍体成纤维细胞中过量表达的基因被分离得到(Lecka-Czernik，B等，Molecular and Cellular Biology，15，120-128，1995)。在结构上，它具有能促进DNA合成的表皮生长因子(EGF)-样结构域。已发现S1-5的结构和核酸合成促进活性(细胞增殖活性)。另外，最近的报道表明：S1-5的突变与Malattia Leventinese(ML)和Doyne蜂窝状视网膜营养不良(DHRD)有关(Stone，E.M等，Nature Genetics 22，199-202，1999)，但不知其与RA的关系。另外，不用说，与滑膜蛋白的亲和性是本发明人获得的全新认识。
此外，本发明人通过导入滑膜蛋白基因制备出转基因小鼠，并且制备出缺损滑膜蛋白基因的敲除小鼠，并观察了它们的表型。当在小鼠体内过量表达滑膜蛋白分子时，会发现关节滑膜增生以及骨和软骨的损坏，因此表现出与类风湿性关节炎极其相似的症状。另一方面，当将滑膜蛋白基因完全(纯合地)缺损时，可在小鼠的胎儿期发现不完整的肢芽和骨骼形成。这些表型暗示滑膜蛋白不仅对滑膜组织起作用，对软骨和骨组织的产生、分化、再生和代谢也有作用。另外，在滑膜蛋白过表达小鼠的关节病损害中，滑膜、软骨和骨组织中的代谢和再生被积极诱导。这些结果清楚地表明：滑膜蛋白分子对RA和其它形式的关节病起作用。另外，已证实滑膜蛋白过表达小鼠可用作关节病模型动物。
根据这一新认识，本发明人阐明了滑膜蛋白及其基因、其抗体或配体在医学治疗或诊断中的用途，从而完成本发明。另外，本发明人通过导入滑膜蛋白基因制备出转基因动物，并阐明该动物作为RA疾病模型的用途。另外，本发明人通过用lacZ基因取代滑膜蛋白基因制备出嵌入(knock-in)动物。滑膜蛋白基因敲除和lacZ基因嵌入的动物使分析缺乏滑膜蛋白基因的后果成为可能，并且也能允许通过检测由滑膜蛋白基因内源性启动子表达的LacZ(为β-半乳糖苷酶活性)，容易地检测出滑膜蛋白基因启动子的活性。使用该嵌入动物，能够对调节滑膜蛋白基因表达的化合物进行筛选。据认为通过抑制类风湿性关节炎患者关节中的滑膜蛋白基因过量表达，应该也可以预防滑膜增生和缓解疾病。
本发明人发现的基因与RA疾病的主要病因，即滑膜组织增生密切相关，为RA的诊断提供了极其重要的信息。另外，从对滑膜组织增生(RA的病因)所起的作用上看，可以认为本发明的基因、其表达产物、抗此表达产物的自身抗体，以及该表达产物的配体是解释RA的病理学所必不可少的物质。特别是，在RA患者的血液中发现了能识别滑膜蛋白的自身抗体，该发现为RA的诊断提供了全新的方法。另外，这些物质在开发RA治疗方法时也可导致崭新的方法。
另外，被鉴定为滑膜蛋白配体的S1-5的突变与ML和DHRD有关，因此滑膜蛋白也可能对这些疾病起作用。因此，可以使用滑膜蛋白诊断这些疾病，而能调节滑膜蛋白配体与滑膜蛋白结合的化合物或能用作滑膜蛋白配体的化合物可成为这些疾病的候选药物。
另外，在发育过程中，滑膜蛋白在未分化的间充质细胞中表达。因此，可将滑膜蛋白用作细胞标记，用于在细胞分选仪等中分离未分化的间充质细胞。如此分离的未分化的间充质细胞可用于体外组织再生。如果能够在体外重构关节，那么这将对类风湿性关节炎患者和遭受关节损害的很多患者的再生医疗很有用处。
即，本发明涉及下述滑膜蛋白蛋白质、其抗体、编码该蛋白质的多核苷酸、其用途、滑膜蛋白配体及其用途，以及滑膜蛋白基因的表达被修饰的转基因动物及其用途。
[1]下述(a)至(e)任意一项记载的多核苷酸：
(a)编码由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸，
(b)含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的蛋白质编码结构域的多核苷酸，
(c)编码含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列，但其中的一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加的蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质的功能等同于由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列组成的蛋白质，
(d)在严紧条件下能与由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列组成的多核苷酸杂交的多核苷酸，所述多核苷酸编码蛋白质，该蛋白质功能等同于由SEQ IDNO：2所示氨基酸序列组成的蛋白质，和
(e)含有与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有至少70％或更高同一性的核苷酸序列的多核苷酸，所述多核苷酸编码蛋白质，该蛋白质功能等同于由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列组成的蛋白质。
[2]编码由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列组成的蛋白质的部分肽的多核苷酸。
[3]由根据[1]或[2]的多核苷酸编码的蛋白质或肽。
[4]根据[3]的蛋白质或肽，它具有至少一个选自下述(1)至(3)的活性：
(1)与在类风湿性关节炎患者的血液中发现的抗体结合，
(2)与滑膜蛋白配体S1-5结合，和
(3)促使滑膜增生。
[5]插入根据[1]或[2]的多核苷酸的载体。
[6]携有根据[1]的多核苷酸或根据[5]的载体的转化细胞。
[7]制备根据[3]的蛋白质或肽的方法，所述方法包括下述步骤：培养根据[6]的转化细胞，并从所述转化细胞或培养上清中回收表达的蛋白质或肽。
[8]与根据[3]的蛋白质或肽结合的抗体。
[9]用于分析能识别根据[3]的蛋白质或肽的抗体的免疫分析试剂，所述试剂含有根据[3]的蛋白质或肽。
[10]根据[9]的免疫分析试剂，其中该试剂被用于诊断类风湿性关节炎或判断治疗效果。
[11]用于分析根据[3]的蛋白质的免疫分析试剂，所述试剂含有能与根据[3]的蛋白质或肽反应的抗体。
[12]根据[11]的免疫分析试剂，其中该试剂被用于诊断类风湿性关节炎或判断治疗效果。
[13]根据[12]的免疫分析试剂，其中待分析的根据[3]的蛋白质存在于滑膜细胞中。
[14]测定生物样品中的抗体的方法，其中所述抗体与根据[3]的蛋白质和/或其部分肽结合，所述方法包括下述步骤：
(1)使生物样品与根据[3]的蛋白质和/或其部分肽接触，和
(2)检测与根据[3]的蛋白质和/或其部分肽结合的抗体。
[15]测定生物样品中的根据[3]的蛋白质和/或其部分肽的方法，所述方法包括下述步骤：
(1)使生物样品与根据[8]的抗体接触，和
(2)检测根据[8]的抗体，其中所述抗体与根据[3]的蛋白质和/或其部分肽结合。
[16]含有至少15个核苷酸的多核苷酸，所述多核苷酸与由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列组成的多核苷酸或其互补链互补。
[17]测定生物样品中的根据[1]或[2]的多核苷酸的方法，所述方法包括下述步骤：
(1)使生物样品与根据[16]的多核苷酸接触，和
(2)检测根据[16]的多核苷酸，其中所述多核苷酸与根据[1]或[2]的多核苷酸杂交。
[18]测定根据[1]或[2]的多核苷酸的试剂盒，所述试剂盒含有根据[16]的多核苷酸。
[19]检测或分离表达根据[3]的蛋白质的细胞的方法，所述方法以所述蛋白质或编码所述蛋白质的基因的表达为指标。
[20]根据[19]的方法，其中所述细胞是类风湿的滑膜细胞。
[21]根据[19]的方法，其中所述细胞是未分化的间充质细胞。
[22]检测或分离表达根据[3]的蛋白质的细胞的试剂，所述试剂含有根据[8]的抗体。
[23]检测类风湿性关节炎的方法，其中类风湿性关节炎的标记是选自根据[1]的多核苷酸、根据[3]的蛋白质、根据[3]的肽、与根据[3]的蛋白质结合的抗体和与根据[3]的肽结合的抗体中的至少一种，所述方法包括下述步骤：
i)检测受试者生物样品中存在的类风湿性关节炎标记，和
ii)将步骤i)的检测结果与类风湿性关节炎相联系。
[24]根据[23]的方法，其中生物样品是受试者的血液，类风湿性关节炎的标记是与根据[3]的蛋白质结合的抗体和/或与根据[3]的肽结合的抗体。
[25]根据[23]的方法，其中生物样品是受试者的滑膜组织或滑膜细胞，类风湿性关节炎的标记是根据[1]的多核苷酸和/或根据[3]的蛋白质。
[26]检测受试化合物与根据[3]的蛋白质或肽的结合活性的方法，所述方法包括下述步骤：
a)使受试化合物与根据[3]的蛋白质或肽接触，和
b)观察受试化合物与所述蛋白质或肽的结合。
[27]筛选对根据[3]的蛋白质或肽具有结合活性的化合物的方法，所述方法包括下述步骤：
a)通过根据[26]的方法检测受试化合物与根据[3]的蛋白质或肽的结合活性，和
b)选择所述结合活性高于对照的受试化合物。
[28]检测阻断根据[3]的蛋白质与其配体结合的活性的方法，所述方法包括下述步骤：
a)在受试化合物的存在下使根据[3]的蛋白质或肽与其配体接触，和
b)检测与所述蛋白质或肽结合的配体和/或受试化合物。
[29]根据[28]的方法，其中配体是滑膜蛋白配体S1-5。
[30]筛选对根据[3]的蛋白质与其配体的结合具有阻断活性的化合物的方法，所述方法包括下述步骤：
a)通过根据[28]的方法检测受试化合物阻断根据[3]的蛋白质与其配体的结合的活性，和
b)选择所述阻断活性高于对照的受试化合物。
[31]检测受试化合物调节经由根据[3]的蛋白质的信号转导的活性的方法，所述方法包括下述步骤：
a)在存在或不存在所述蛋白质的配体时，使受试化合物与所述蛋白质接触，和
b)检测经由所述蛋白质的信号转导。
[32]筛选具有调节经由根据[3]的蛋白质的信号转导之活性的化合物的方法，所述方法包括下述步骤：
a)通过根据[31]的方法检测受试化合物调节经由所述蛋白质的信号转导的活性，和
b)选择所述调节活性高于对照的受试化合物。
[33]检测调节根据[1]的多核苷酸表达的活性的方法，所述方法包括下述步骤：
a)在受试化合物的存在下培养表达根据[1]的多核苷酸的细胞，和
b)测定所述多核苷酸的表达水平。
[34]筛选能调节根据[1]的多核苷酸表达的化合物的方法，所述方法包括下述步骤：
a)通过根据[33]的方法检测受试化合物调节根据[1]的多核苷酸表达的活性，和
b)选择所述活性与对照相比有所不同的受试化合物。
[35]滑膜蛋白刺激剂，所述刺激剂含有通过根据[27]的筛选方法获得的化合物作为活性成分。
[36]滑膜蛋白和滑膜蛋白配体之间的结合阻断剂，所述阻断剂含有通过根据[30]的筛选方法获得的化合物作为活性成分。
[37]滑膜增生阻断剂，所述阻断剂含有通过根据[30]或[32]的筛选方法获得的化合物作为活性成分。
[38]药物组合物，其含有选自根据[1]或[2]的多核苷酸，根据[3]的蛋白质或肽和根据[5]的载体的任一组分作为活性成分。
[39]转基因非人脊椎动物，其中根据[1]或[2]的多核苷酸的表达被修饰，或所述修饰是可诱导的。
[40]根据[39]的转基因非人脊椎动物，其中根据[1]或[2]的多核苷酸是经外源导入的。
[41]根据[40]的转基因非人脊椎动物，其中所述脊椎动物是类风湿性关节炎模型动物。
[42]转基因非人脊椎动物，其中根据[1]或[2]的内源性多核苷酸的表达被抑制。
[43]根据[42]的转基因非人脊椎动物，其中嵌入了其它基因。
[44]得自根据[40]或[42]的转基因非人脊椎动物的细胞。
[45]检测调节根据[1]或[2]的多核苷酸的内源性启动子活性的活性的方法，所述方法包括下述步骤：
a)使受试化合物与表达系统接触，所述系统在根据[1]或[2]的多核苷酸的内源性启动子的控制之下能表达报道基因，和
b)测定报道基因的表达水平。
[46]根据[45]的方法，其中所述表达系统是根据[43]的转基因非人脊椎动物或得自所述脊椎动物的细胞。
[47]筛选能调节根据[1]或[2]的多核苷酸的内源性启动子活性的化合物的方法，所述方法包括下述步骤：
a)通过根据[45]的方法测定受试化合物调节根据[1]或[2]的多核苷酸的内源性启动子活性的活性，和
b)选择所述活性与对照相比有所不同的受试化合物。
[48]用于调节根据[1]的多核苷酸表达的药物组合物，所述药物组合物含有通过根据[34]或[47]的筛选方法得到的化合物作为活性成分。
此外，本发明涉及刺激滑膜蛋白的方法，所述方法包括施用通过根据
[27]的筛选方法得到的化合物的步骤。或者，本发明涉及阻断滑膜蛋白与滑膜蛋白配体结合的方法，所述方法包括施用通过根据[30]的筛选方法得到的化合物的步骤。另外，本发明涉及阻断滑膜增生的方法，所述方法包括施用通过根据[30]或[32]的筛选方法得到的化合物的步骤。另外，本发明涉及促进滑膜增生的方法，所述方法包括施用选自根据[1]或[2]的多核苷酸，根据[3]的蛋白质或肽和根据[5]的载体的任一组分的步骤。另外，本发明涉及调节根据[1]的多核苷酸表达的方法，所述方法包括施用通过根据[34]或[47]的筛选方法得到的化合物的步骤。
另外，本发明涉及通过根据[27]的筛选方法得到的化合物用于制备滑膜蛋白刺激剂的用途。或者，本发明涉及通过根据[30]的筛选方法得到的化合物用于制备阻断滑膜蛋白和滑膜蛋白配体之间的结合的结合阻断剂的用途。另外，本发明涉及通过根据[30]或[32]的筛选方法得到的化合物用于制备滑膜增生阻断剂的用途。另外，本发明涉及选自根据[1]或[2]的多核苷酸，根据[3]的蛋白质或肽和根据[5]的载体的任一组分用于制备滑膜增生促进剂的用途。另外，本发明涉及通过根据[34]或[47]的筛选方法得到的化合物用于制备调节根据[1]的多核苷酸表达的药物组合物的用途。
本发明提供了编码滑膜蛋白的多核苷酸，其含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的蛋白质编码结构域。本发明的多核苷酸可以是DNA或RNA。另外，它也可包括经修饰的核苷酸。可通过已知方法(Nucleic Acid Res.16：7583-7600，1988)，从RA患者的滑膜细胞中克隆编码本发明的滑膜蛋白的多核苷酸。具体地说，基于提取自滑膜细胞的mRNA获得cDNA文库，所述细胞得自出现关节炎的组织，其中从RA患者体内回收该组织以作为滑膜组织或经培养的细胞(Nucleic Acid Res.16：7583，1988)。可以使用基于SEQID NO：1所示核苷酸序列设计的探针，通过筛选与探针杂交的克隆从所述文库中分离滑膜蛋白基因。
本发明还包括编码功能等同于上述滑膜蛋白的蛋白质的多核苷酸。在本发明中，编码功能等同于滑膜蛋白的蛋白质的多核苷酸被称为功能等同于滑膜蛋白的多核苷酸。首先，功能等同的蛋白质被定义为在免疫学上等同于滑膜蛋白的蛋白质。即，在本发明中，功能等同于滑膜蛋白的蛋白质可以是滑膜蛋白的结构域，只要它能与RA患者血清中存在的、特异性识别滑膜蛋白的抗体反应即可。或者，它也可以是含有该免疫活性结构域的蛋白质片段。本领域技术人员通过使用RA患者的血清系列和正常人的血清来筛选滑膜蛋白的片段，可以容易地选择其突变体。
基于免疫学特征以及与SL(S1-5)结合的特征来定义功能等同于本发明的滑膜蛋白的蛋白质。即，本发明包括对SL(S1-5)有亲和性的滑膜蛋白片段。本领域技术人员通过使用SL(S1-5)来筛选候选蛋白质可以容易地选择其突变体。例如，如实施例所示，本发明人发现的SL(S1-5)为了与滑膜蛋白结合，需要对应于滑膜蛋白cDNA第1233-1592位的120个氨基酸残基。因此，由构成该结构域的氨基酸序列组成的蛋白质，或包括该氨基酸序列的蛋白质组成了功能等同于本发明的滑膜蛋白的蛋白质。可用作SL的蛋白质可以是由登录号AAA65590(核苷酸登录号U03877)，I38449，NP_061489(核苷酸登录号NM_018894)，NP_004096(核苷酸登录号NM_004105)或Q12805鉴定的S1-5蛋白，或是具有与人滑膜蛋白蛋白(SEQID NO：2)结合的活性的类似蛋白质(Lecka-Czernik，B等，Mol.Cell.Biol.15.120-128，1995；Heon，E等，Arch.Ophthalmol.114，193-198，1996；Ikegawa，S等，Genomics 35，590-592，1996；Katsanis，N等，Hum.Genet.106，66-72，2000；Giltay，R等，Matrix Biol.18，469-480，1999；Stone，E.M等，Nat.Genet.22，199-202，1999)。
另外，功能等同于人滑膜蛋白的蛋白质的例子包括具有促进滑膜增生之活性的蛋白质。已发现导入人滑膜蛋白基因的转基因小鼠表现出脚趾肿胀，并伴随有显著频率的关节炎。从组织学上看，在其脚趾关节中观察到伴随有滑膜增生的骨损坏和异常骨生成。也可以基于促进滑膜增生的活性来定义功能等同于人滑膜蛋白蛋白的蛋白质。通过产生转基因动物，或者通过将基因局部导入关节中，或者通过在体外培养的滑膜细胞中表达蛋白质即可证实对滑膜增生的促进作用。下文将描述使用本发明的多核苷酸获得转基因动物的方法。
功能等同于人滑膜蛋白的蛋白质的例子包括具有对正常骨形成和四肢发育有贡献的活性的蛋白质。在发育过程中，顶骨、四肢、耳等形成骨和软骨的区域大量表达滑膜蛋白，在四肢形成期，在尖端外胚层嵴(AER)以及软骨和骨的原基中观察到强表达。通过击靶敲除了内源性滑膜蛋白基因的敲除小鼠胚胎从顶骨区至臀部的长度短，并且呈现出提前形成头颅和四肢的趋势。纯合子表现出肢芽、上下颌骨和耳的形态异常，很有可能导致胎鼠死亡。滑膜蛋白基因纯合的敲除小鼠在胎儿期表现出肢芽形成的异常；未发现软骨和骨的形成；在肢芽和产生软骨和骨的区域发现了滑膜蛋白的表达，由此阐明滑膜蛋白分子对骨骼形成和四肢发育有贡献。
在使用基于外植块方法的培养系统进行分析时，仅在据认为是软骨、骨和四肢原基的未分化的间充质细胞中发现了滑膜蛋白敲除(lacZ基因嵌入)小鼠胚胎的肢芽细胞中的LacZ表达。另外，经碱性磷酸酶染色，Kossa染色或其它方法证实：在得自纯合敲除小鼠的细胞中，形成骨和软骨的能力被延迟。据认为，通过产生敲除动物，或通过分析体外培养的骨和软骨细胞的标记基因表达以及分析骨形成能力，即可阐明对正常骨形成和四肢发育的贡献。另外，通过施用由本发明的多核苷酸编码的蛋白质，或通过编码所述蛋白质的DNA或RNA的表达可恢复失去的功能这一事实，可在所述多核苷酸的表达受到抑制的敲除动物或经培养的细胞中证实某种蛋白质具有对正常骨形成和四肢发育有贡献的活性的事实。
另外，也可以基于滑膜蛋白的生物化学活性来定义功能等同于本发明的滑膜蛋白的蛋白质。例如，可将滑膜蛋白的生物化学活性定义为酪氨酸激酶或遍在蛋白连接酶活性。通过在滑膜蛋白中发现的多个基元和实施例的结果可以证实这些生物化学活性。即，本发明包括保留了滑膜蛋白所具有的生物化学活性中的至少一个活性的滑膜蛋白片段。下文将具体描述证实滑膜蛋白的生物化学活性的方法和维持各个生物化学活性的结构域。
这些功能等同于滑膜蛋白的蛋白质可与其它蛋白质形成融合蛋白。例如，所述功能等同的蛋白质也包括可添加FLAG标记、HA标记、组氨酸标记等附加氨基酸序列的蛋白质，所述蛋白质保留了上述功能等同于滑膜蛋白的蛋白质的至少一个特性。甚至在添加的蛋白质具有不同于滑膜蛋白的活性的情况下，所述融合蛋白也包括在本发明的功能等同的蛋白质中，只要该融合蛋白保留了滑膜蛋白的至少一个功能即可。
本领域技术人员使用已知方法(Jikken Igaku Bessatsu*Idenshi K*gakuHandobukku[Experi-mental Medicine，Supplement-Genetic EngineeringHandbook]，pp.246-251，Yodosha Co.，Ltd.，1991)也可分离由在上述本发明的多核苷酸中含有突变的核苷酸序列构成的多核苷酸。例如，如果使用SEQ IDNO：1(或其片段)所示的核苷酸序列作为探针，对含有类似基因的文库进行筛选，即可克隆出具有高水平同源性的核苷酸序列的DNA。可以使用某个在SEQ ID NO：1的核苷酸序列中包括随机突变的文库，得自非人动物的滑膜组织的cDNA文库等作为上述文库。
在给定核苷酸序列中随机添加突变的已知方法的例子包括：通过用亚硝酸处理DNA来取代碱基对(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79：7258-7260，1982)。使用该方法可通过用亚硝酸处理导入突变的区段而在特定的区段随机导入碱基对取代。也可以使用带缺口的双链体等方法(Methods in Enzymol.，154：350-367，1987)作为在任意位置导入目的突变的技术。将克隆有待突变基因的环状双链载体制备成单链，并与在靶位置具有突变的合成寡核苷酸杂交。使得自经限制性酶切割的线形化载体的互补单链DNA与上述环状单链载体退火。用DNA聚合酶补平上述合成的核苷酸和互补单链DNA之间的缺口，进行连接以形成完整的双链环状载体。
据认为经修饰的氨基酸的数目一般为50个氨基酸或更少，优选为30个氨基酸或更少，甚至更优选为5个氨基酸或更少(例如1个氨基酸)。
据认为，当氨基酸被人工取代时，如果它们被具有类似特性的氨基酸所取代，更容易维持初始蛋白质的活性。本发明的蛋白质包括在上述氨基酸取代中添加保守取代，且功能等同于人滑膜蛋白蛋白(SEQ ID NO：2)的蛋白质。据认为，当在对蛋白质的活性至关重要的结构域等中取代氨基酸时，保守取代十分重要。氨基酸的保守取代是本领域技术人员众所周知的。
保守取代的氨基酸组的例子包括碱性氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)，酸性氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)，不带电的极性氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和半胱氨酸)，非极性氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和色氨酸)，β-分支的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)，芳香族氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸)等。
另外，据认为非-保守取代可增加蛋白质的活性(例如包括组成活性蛋白质等)或降低所述活性(例如包括显性失活蛋白质等)。
具有根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，且功能等同于由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的蛋白质也包括天然蛋白质。从干扰素基因等中发现，真核生物的基因一般具有多态性。因所述多态性引起的核苷酸序列的改变可包括一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加的情况。本发明还包括天然存在的蛋白质，该蛋白质是具有根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，且功能等同于由SEQID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的蛋白质。
实际上，本发明人已从多个个体中克隆出本发明的基因，并通过测定其核苷酸序列，证实了缺失了一个氨基酸的克隆。本发明包括在上述氨基酸序列中包括突变的蛋白质和含有编码该蛋白质的核苷酸序列的多核苷酸。由本发明人证实的缺失一个氨基酸的克隆的核苷酸序列示于SEQ IDNO：6，由该核苷酸序列编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO：7。SEQ ID NO：6的核苷酸序列缺乏对应于SEQ ID NO：1第1293-1295位的gca。结果，根据SEQ ID NO：7的氨基酸序列缺乏SEQ ID NO：2第412位的丙氨酸。
或者，在某些情况下，即使因多态性而使核苷酸序列有变化，但氨基酸序列可能不变。核苷酸序列中的这种突变被称为沉默突变。本发明还包括含有具有沉默突变的核苷酸序列的基因。本文中提及的多态性指的是一组个体中的某个基因具有不同的核苷酸序列。多态性与发现不同基因的比率无关。
另外，获得功能等同于滑膜蛋白的蛋白质的方法可包括例如利用杂交的方法等。即，在该方法中，将编码SEQ ID NO：1所示的本发明滑膜蛋白的多核苷酸或其片段用作探针，分离出能与其杂交的多核苷酸。如果在严紧条件下进行杂交，则可选择出具有高同源性的多核苷酸作为核苷酸序列，因此，在分离出的蛋白质中含有功能等同于滑膜蛋白的蛋白质的可能性变得更大。具有高同源性的核苷酸序列被定义为例如70％或更高的相同性，或优选为90％或更高的相同性。
严紧条件的例子包括例如以下条件：在6×SSC，40％甲酰胺和25℃杂交，并在1×SSC和55℃洗涤。而严紧度受诸如盐浓度、甲酰胺浓度或温度之类的条件的影响，显然，本领域技术人员可以设置这些条件，从而获得所需的严紧度。
通过使用杂交，可以在例如非人动物中分离出编码滑膜蛋白同系物的多核苷酸。由可得自小鼠、大鼠、兔、猪、山羊或其它非人动物的多核苷酸编码的滑膜蛋白同系物组成了本发明的功能等同的蛋白质。
对本发明的多核苷酸的来源没有限制。即，它可得自cDNA，基因组DNA或合成。另外，它可包括基于遗传密码的简并性而具有任意核苷酸序列的多核苷酸，只要它能编码本发明的蛋白质即可。
通过在人滑膜蛋白(SEQ ID NO：2)中导入突变而获得的蛋白质，和由使用上述杂交技术等分离出的多核苷酸编码的蛋白质一般在氨基酸序列水平上与人滑膜蛋白(SEQ ID NO：2)具有高同源性。高同源性指的是序列具有30％或更高的相同性，优选为50％或更高的相同性，或更优选为80％或更高(例如95％或更高)的相同性。使用国际互联网上的同源性检索站点可以测定核苷酸和氨基酸序列的同一性[例如日本的DNA数据库(DDBJ)中，可以使用FASTA，BLAST，PSI-BLAST，SSEARCH等同源性检索[例如日本DNA数据库(DDBJ)网站的同源性检索(Search and Analysis)网页：http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/homology-j.html]和国家生物技术信息中心(NCBI)，可进行使用BLAST的检索(例如NCBI主页网站的BLAST网页：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/；Altschul，S.F等，J.Mol.Biol.，1990，215(3)：403-10；Altschul，S.F. & Gish，W.，Meth.Enzymol.，1996，266：460-480；Altschul，S.F等，Nucleic Acids Res.，1997，25：3389-3402)]。
例如，可在高级BLAST 2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算。然后即可获得同一性的值(％)(Karlin，S和S.F.Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：2264-68；Karlin，S和S.F.Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-7)。
本发明提供了这些多核苷酸除生产蛋白质外的应用。即，本发明包括针对编码由本发明提供的滑膜蛋白的多核苷酸或其部分的反义多核苷酸。反义多核苷酸优选具有的链长度约为15-20个核苷酸，以有效阻断基因转录。如果滑膜蛋白支持滑膜细胞异常增生，那么，滑膜蛋白反义多核苷酸在治疗RA中具有主要作用。从控制基因表达的角度出发，不仅可以设计反义多核苷酸，也可以设计核酶。即，可以设计能识别和切割由SEQ ID NO：1所示DNA的编码区转录的RNA的核酶。
本发明还涉及链长至少为15个核苷酸的多核苷酸，所述多核苷酸与本发明的多核苷酸或其互补链互补。这些多核苷酸是链长优选为20或更多个核苷酸，更优选为25或更多个核苷酸，或甚至更优选为30或更多个核苷酸，且与本发明的多核苷酸或其互补链互补的多核苷酸。“互补链”表示对应于由碱基对A：T(或对RNA而言为U)和G：C组成的双链核酸中的一条链的另一条链。另外，“互补”的定义并不仅限于在至少15个连续核苷酸的结构域内存在完全互补的序列，还包括在核苷酸序列水平上同源性至少为70％，优选为至少80％，更优选为90％，甚至更优选为95％或更高的核苷酸序列。测定同源性所用的算法可以是本文中提及的一种算法。所述多核苷酸包括例如与上述本发明的多核苷酸杂交，且链长至少为15个核苷酸的多核苷酸。
优选杂交特异于本发明的多核苷酸。在本文中，术语“特异于”指的是：在严紧杂交条件下，不会与编码其它蛋白质的多核苷酸发生显著的交叉杂交。
这些多核苷酸可用作探针和引物，用于检测和扩增滑膜蛋白基因。优选本发明的探针和引物的链长至少约为15聚体，并且具有能与SEQ IDNO：1的核苷酸序列中的、特异于滑膜蛋白的序列杂交的多核苷酸序列，使得在给定严紧度下能够发生特异性杂交。本领域技术人员根据给定的核苷酸序列，能够容易地设计出有用的核苷酸序列以用作探针或引物。使用基于本发明提供的滑膜蛋白基因-特异性的探针或引物，可以对滑膜细胞样品进行原位杂交和PCR。由于RA患者的滑膜组织中强表达滑膜蛋白，人们认为掌握细胞中的表达状况可以为了解RA关节炎的症状提供重要的信息。
本发明的新蛋白质滑膜蛋白可得自RA患者的滑膜组织。由于可在体外培养滑膜细胞，因此可从该培养物中回收滑膜蛋白。具体地说，可经滑膜切除术以手术的方式从RA患者体内取出滑膜组织等，并从中分离出滑膜细胞。通过培养分离的细胞，可以象回收粘着细胞一样来回收滑膜细胞(J.Clin.Invest.92：186-193，1993)。通过已知的蛋白质纯化技术的组合，从回收的细胞中提取和纯化滑膜蛋白。
本发明不仅包括提取自滑膜细胞的人滑膜蛋白，还包括功能等同于滑膜蛋白的蛋白质。即，可以人工或天然产生本发明的蛋白质，所述蛋白质包括突变的蛋白质，该突变蛋白具有人滑膜蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNO：2)，但其中的一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，其功能等同于人滑膜蛋白。对这些蛋白质中的氨基酸突变的数目或位置没有限制，只要能保持滑膜蛋白的功能即可。
通过使用蛋白酶消化即可获得滑膜蛋白的片段。另外，通过随机切割编码SEQ ID NO：1所示滑膜蛋白的DNA，并将其插入噬菌体载体以产生呈递结构域肽的噬菌体文库也可以获得滑膜蛋白的片段。如果用识别滑膜蛋白的抗体对该文库进行免疫筛选，就可以测定具有免疫活性的结构域。测定免疫活性结构域的技术无需经过改动，即可用作测定对配体有结合活性的结构域的技术。关于克隆的噬菌体，如果能测定出插入片段的核苷酸序列，那么即可阐明活性结构域的氨基酸序列。
本发明的蛋白质或与其功能等同的蛋白质可以是能添加多种修饰的蛋白质，所述修饰如糖链的生理学修饰，用荧光、放射性或其它物质标记，或与其它蛋白质融合。特别地，在下文所述的重组体中，根据表达宿主的不同而变化的糖链有可能会导致修饰的差异。但是，即使糖链的修饰存在差异，只要它们表现出与本说明书中公开的滑膜蛋白蛋白类似的特性，它们仍都是本发明的滑膜蛋白或与其功能等同的蛋白质。
滑膜蛋白不仅可得自生物材料，也可得自基因重组体，在所述重组体中，编码滑膜蛋白的基因被掺入适当的表达系统。如果上述编码滑膜蛋白的多核苷酸被掺入适当的表达系统并得以表达，即可通过基因工程技术获得滑膜蛋白。本发明可以使用的宿主/载体系统的例子包括表达载体pGEX-5X-3和大肠杆菌。pGEX-5X-3可将外源基因表达成与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白(Gene，67：31-40，1988)。因此，当在热激条件下将含有编码滑膜蛋白的基因的pGEX-5X-3转化至大肠杆菌菌株BL21，并培养适当长的时间，然后加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)时，即可诱导GST-融合滑膜蛋白的表达。通过以滑膜细胞的cDNA文库等作为模板，经PCR等进行扩增，即可获得编码滑膜蛋白的基因。由于本发明的GST吸附于谷胱甘肽Sepharose 4B上，因此，通过亲和层析可以容易地分离和纯化表达产物。
用于获得滑膜蛋白重组体的其它宿主/载体系统的例子如下。首先，当将细菌用作宿主时，使用组氨酸标记、HA标记、Flag标记等的融合蛋白的表达载体可以商购。至于酵母宿主，已知毕赤氏属的酵母能有效表达具有糖链的蛋白质。从添加糖链的目的出发，也可以使用以昆虫细胞为宿主、利用杆状病毒载体的表达系统(Bio/Technology，6：47-55，1988)。另外，利用哺乳动物细胞进行使用CMV、RSV或SV40等启动子的载体的转染，这些宿主/载体系统中的每一个都可用作滑膜蛋白的表达系统。另外，也可以使用逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体或其它病毒载体导入基因。
通过利用其免疫学特性，本发明提供的新蛋白质滑膜蛋白以及免疫学等价的蛋白质可用于诊断RA。在RA患者的血液中，可以高频率地检测到识别滑膜蛋白的抗体，而在健康人的血液中基本上检测不到所述抗体。因此，使用本发明的滑膜蛋白作为抗原对受试者的抗体进行免疫学分析能给出有用的信息用于诊断RA。即，如果在受试者的体液中检测到与滑膜蛋白反应的抗体，那么即可将该受试者诊断为患有RA。
一般可以使用多种对抗体进行免疫学分析的方法。其中最常用的方法是以下方法：即，使抗原致敏平板与样品中的抗体反应，并使用经抗体-特异性标记的抗体检测捕获于平板表面的待测抗体(Immunochemistry，8：871-879，1971)。使用酶作为标记的方法被称为ELISA法，该方法应用广泛。另外，还有一种已知方法被称为免疫凝集反应，即，使样品与粘附有抗原的乳胶颗粒混合，并检测抗体(Am.J.Med.，21：888-892，1956)。免疫凝集反应是能以单个试剂进行快速分析的方法，是一种适用于大规模筛选的优选方法。
另外，免疫层析最近已成为被广泛使用的简单分析方法。为了将该方法应用于抗体的免疫学分析法，构建了一个反应系统，其中通过样品中的抗体来阻断经标记的滑膜蛋白和抗-滑膜蛋白抗体之间的反应。具体地说，例如，经过安排，使得经标记的滑膜蛋白和样品首先相互接触，然后通过层析的展开，使它们与抗-滑膜蛋白抗体试剂组分接触。如果样品中存在滑膜蛋白抗体，那么经标记的滑膜蛋白则已经反应，因此，它不能再与作为试剂组分的抗-滑膜蛋白抗体反应。通过固定抗-滑膜蛋白抗体并观察固定区域中经标记的滑膜蛋白的反应状况，可以仅通过滴样品来进行免疫测定。
在很多免疫测定法中，可以根据抗体的类别来分析抗体。必要时，通过组合可识别不同类免疫球蛋白，如IgG和IgM的抗体，即可获得与特定类别的抗体有关的信息。在传染病中，可观察到这样一种转变，其中在感染的第一阶段，IgM抗体的测定值升高，然后，IgM抗体的测定值降低，而IgG抗体的测定值升高。在本发明中，这种不同类别的抗体测定值也可能与RA的临床症状有关。更具体地，不同类别的抗体测定值可能与判断药效或预测RA发作相关联。
在检测抗体时，经常采用不仅使用抗原分子本身，也使用化学合成的寡肽作为抗原的方法。这是因为使用特异于特别优良的表位或具有一些临床意义的表位的分析系统受非-特异性反应的影响较小。该方法对滑膜蛋白也有效。具体地说，可以根据上述获得免疫活性结构域肽的方法，测定用作表位的结构域。已知表位有时由至少三个氨基酸残基组成。另外，据说至少8个氨基酸残基才可能导致与其它蛋白质的免疫学区别。因此，由选自滑膜蛋白的氨基酸序列的至少8个连续的氨基酸残基，一般为9个氨基酸残基，优选为10个氨基酸残基，更优选为11个氨基酸残基组成的、可与患者血清中的抗体反应的片段被优选用作抗原，用于检测本发明的抗体。另外，本领域技术人员也已知通过在寡肽上添加多种修饰以增加形成表位之寡肽的免疫反应性的方法。例如，添加无活性的蛋白质如人血清白蛋白或无意义的氨基酸序列的修饰有助于改善免疫反应性。
可用于本发明检测RA的方法中的滑膜蛋白，与其功能等同的蛋白质，或其部分肽可用作免疫分析试剂，用于分析能识别这些分子的抗体。本发明的免疫分析试剂可用于诊断RA和判断治疗的效力。
本发明的滑膜蛋白也可以用于开发治疗或预防RA的疫苗。据认为滑膜蛋白可通过与其配体结合来诱使滑膜细胞增殖，因此，通过提供可产生阻断滑膜蛋白与其配体结合的抗体的疫苗，即可治疗和预防RA。由于滑膜蛋白的结构域肽原本就是人类的蛋白质，因此，获得滑膜蛋白疫苗的一般方法是以下配制方法，即将占主要成分的、用作滑膜蛋白表位的结构域肽与佐剂或提供免疫刺激的载体蛋白混合。
另外，本发明提供了能识别滑膜蛋白的抗体。通过已知方法，将本发明的滑膜蛋白，其免疫学等价的蛋白质或其片段用作免疫原，即可获得抗滑膜蛋白的抗体。通过普通的免疫操作可以获得多克隆抗体(Harlow，E. &Lane，D.；Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York，1988)，而通过克隆抗体生产细胞可以获得单克隆抗体(Kohler，G. & Milstein，C.，Nature 256：495-7，1975)。单克隆抗体是使免疫测定法获得高度敏感性和特异性的重要工具。
在免疫时，用本发明的滑膜蛋白(或其免疫学等价的蛋白质或其片段)以及适当的佐剂免疫接种免疫动物。可用作免疫原的滑膜蛋白片段包括含有下列氨基酸序列的肽：
Syno-P3(SLALTGAVVAHAYYC/SEQ ID NO：3)，
Syno-P2(TCRMDVLRASLPAQS/SEQ ID NO：4)，和
Syno-P1(GAATTTAAGTSATAC/SEQ ID NO：5)。
通过使这些肽与载体蛋白连接而制备的免疫原特异于滑膜蛋白，并能给出具有足够结合亲和性的抗体。匙孔戚血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)等可用作载体蛋白，用于获得免疫原。通常使用的免疫动物包括兔、小鼠、大鼠、山羊或绵羊。通常使用的佐剂包括弗氏完全佐剂(FCA)等(Adv.Tubercl.Res.，1：130-148，1956)。以适当的间隔添加免疫力，在证实抗体滴度增加后，可以抽血获得抗血清。另外，通过纯化其抗体组分，可以获得纯化的抗体。
或者，通过收集抗体生产细胞并通过细胞融合或其它方法克隆这些细胞，即可获得单克隆抗体。这些抗体生产细胞包括得自免疫动物的细胞，以及收集自能产生抗滑膜蛋白自身抗体的RA患者的抗体生产细胞。另外，可以根据所获得的、得自免疫动物的单克隆抗体生产细胞的抗体基因，来构建嵌合抗体或人源化抗体。当给人施用抗体时，动物抗体不是优选的，因为它们会作为外来物而被清除。因此，需要嵌合抗体或人源化抗体，在嵌合抗体中，人抗体取代了强抗原性抗体的恒定区，在人源化抗体中，人基因不仅取代了恒定区，还取代了可变区的构架。从这一点上看，通过使用得自RA患者的抗体生产细胞的抗体的可变区，即可重构人型抗体，因此，也可以更容易地构建出高度安全的抗体。
能识别基于本发明提供的滑膜蛋白的嵌合抗体或人源化抗体可用于能靶向RA患者滑膜细胞的药物传递系统(DDS)。在使用能识别本发明的滑膜蛋白的抗体的DDS中，可以证实Fas配体或抗-SL抗体等是有望通过与抗体连接而起作用的物质。
或者，本发明的抗体可用于检测滑膜蛋白。滑膜蛋白在RA患者的滑膜组织中强表达。因此，检测滑膜细胞、滑膜组织或体液中的滑膜蛋白能为RA的诊断提供重要信息。具体地说，当在滑膜组织或血液中检测到滑膜蛋白时，认为RA的病情较重。本发明的抗体可用作免疫检测滑膜蛋白的试剂。使用抗体免疫检测组织或血液中存在的蛋白质的方法是已知的。含有本发明的抗体的免疫分析试剂可用于诊断RA和测定治疗的效力。
另外，本发明的抗体可用于分离或检测表达滑膜蛋白的细胞。在发育中的AER中观察到本发明滑膜蛋白蛋白质的表达，所述蛋白质在成为滑膜、软骨、骨和四肢原基的未分化的间充质细胞中也有强表达。因此，滑膜蛋白可用作AER和未分化的间充质细胞的标记。即，可以使用滑膜蛋白的表达作为指标来检测和分离AER和未分化的间充质细胞。通过荧光等适当标记抗体。例如，可将抗滑膜蛋白的抗体用于细胞分选等以分离表达滑膜蛋白的细胞。分离的未分化的间充质细胞可用于骨和软骨的体外形成，或关节的重构。
在体外或体内由未分化的间充质细胞形成骨、软骨、肌肉、腱、脂肪、骨髓等的基质(S.A.Kuznetsov等，J.Bone Miner.Res.12，1335-47，1997；D.J.Prockop，Science 276，71-4，1997；C.M.Thompson和R.A.Young，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，4587-90，1995；A.I.Caplan，J.Orthop.Res.9，641-50，1991；A.J.Friedenstein，Int.Rev.Cytol.47，327-59，1976；M.Owen和A.J.Friedenstein，in“Cell and Molecular Biology of Vertebrate Hard Tissues，”D.Evered和S.Harnett，Eds.，Wiley，Chichester，UK，1988，pp.42-60；A.J.Friedenstein等，Cell Tissue Kinet.20，263-72，1987；B.A.Ashton等，Clin.Orthop.Relat.Res.151，294-307，1980；I.Bab等，Clin.Orthop.Relat.Res.187，243-54，1984；S.E.Haynesworth等，Bone 13，81-8，1992；A.I.Caplan，Clin.Plast.Surg.21，429-35，1994；也可参见例如Genzyme网站，http://www.genzymebiosurgery.com/)。
例如，可以在体外使未分化的间充质细胞细胞分化，形成脂肪细胞谱系、软骨细胞谱系和骨细胞谱系(M.F.Pittenger等，Science 284，143-7，1999)。
通过例如用1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和吲哚美辛处理，可以诱导分化成脂肪细胞(M.F.Pittenger，美国专利号5,827,740，1998)。通过例如使用离心等使细胞成为小团块，然后在不含血清的培养基中用转化生长因子(TGF)-β3刺激，即可分化成软骨细胞(A.M.Mackay等，TissueEng.4，415-28，1998；J.U.Yoo等，J.Bone Joint Surg.Am.80A，1745-57，1998)。通过例如在10％胎牛血清的存在下，用地塞米松、β-甘油磷酸和抗坏血酸诱导，可以分化成骨细胞(S.A.Kuznetsov等，J.Bone Miner.Res.12，1335-47，1997；D.J.Prockop Science 276，71-4，1997；C.M.Thompson和R.A.Young，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，4587-90，1995；A.I.Caplan，J.Orthop.Res.9，641-50，1991；A.J.Friedenstein，Int.Rev.Cytol.47，327-59，1976；M.Owen和A.J.Friedenstein，in“Cell and Molecular Biology of Vertebrate HardTissues，”D.Evered和S.Harnett，Eds.，Wiley，Chichester，UK，1988，pp.42-60；S.P.Bruder等，J.Cell.Biochem.64，278-94，1997；N.Jaiswal等，J.Cell.Biochem.64，295-312，1997；S.P.Bruder等，J.Bone Miner.Res.13，655-631998)。
另外，关于体内的情况，例如，可将未分化的间充质细胞移植到子宫内，使其分化成软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、心肌细胞、骨髓基质细胞和胸腺基质细胞(K.W.Liechty等，Nature Medicine 6，1282-1286，2000)。通过这些方法，可以在体外或体内由分离的未分化的间充质细胞重构组织。重构的组织或器官有望用于再生医学。
另外，由于滑膜蛋白在类风湿滑膜细胞中强表达，因而可用作类风湿滑膜细胞的细胞标记。如果将本发明的抗体用作分离或检测细胞的试剂，那么所述抗体可与其它溶剂或溶质组合以形成组合物。例如，所述抗体可与蒸馏水、pH缓冲液、盐、蛋白质、表面活性剂等组合。
滑膜蛋白在RA患者的滑膜组织中强表达。另外，在RA患者血液中可以高频率地检测出识别滑膜蛋白的抗体(自身抗体)。另一方面，在健康人的血液中基本上检测不到滑膜蛋白抗体。另外，滑膜蛋白在体外抑制经培养的滑膜细胞生长。据认为，这是因为滑膜蛋白可与促进滑膜细胞生长的配体竞争。根据这一信息，有望得出以下机理。即，滑膜细胞中滑膜蛋白的强表达促使对滑膜细胞具有生长促进作用的滑膜蛋白与配体结合，结果，促进了滑膜细胞的生长。另外，这些滑膜细胞本身的异常增殖仅仅是RA的病理学而已。
根据上述认识，本发明提供了检测或诊断类风湿性关节炎的方法，所述方法包括以下步骤：
i)检测受试者的生物样品中存在的类风湿性关节炎标记，和
ii)将步骤i)的检测结果与类风湿性关节炎相联系。
本发明的检测或诊断类风湿性关节炎的方法中所用的标记可以是下述标记中的任何一种。测定这些标记的方法如前所述。
*滑膜蛋白或功能等同于滑膜蛋白的多核苷酸，
*滑膜蛋白或功能等同于滑膜蛋白的蛋白质，
*滑膜蛋白或功能等同于滑膜蛋白的肽，
*与滑膜蛋白或功能等同于滑膜蛋白的蛋白质结合的抗体，和
*与滑膜蛋白或功能等同于滑膜蛋白的肽结合的抗体。
例如，如果在取自患者的血样中检测到与滑膜蛋白或功能等同于滑膜蛋白的蛋白质或肽反应的抗体，那么患者患有RA的可能性很高。或者，取自患者的滑膜组织中的滑膜蛋白或功能等同于滑膜蛋白的蛋白质的表达显示由RA造成的滑膜组织增生。使用蛋白质或mRNA的存在作为指标，可以检测蛋白质的表达。
另外，基于上述机理，本发明的滑膜蛋白及其基因提供了新的方法以开发治疗RA的药物。首先，使用本发明的滑膜蛋白，以与滑膜蛋白的结合活性为指标，即可检测滑膜蛋白的配体。即，本发明涉及检测与滑膜蛋白的结合活性的方法，所述方法包括下述步骤：
a)使受试化合物与滑膜蛋白或功能等同于滑膜蛋白的蛋白质或肽接触，和
b)观察受试化合物与所述蛋白质或肽的结合。
另外，可以根据上述检测方法对滑膜蛋白的配体进行筛选。本发明的筛选方法具体包括下述步骤：
a)通过上述检测与滑膜蛋白的结合活性的方法，检测受试化合物与滑膜蛋白或功能等同于滑膜蛋白的蛋白质的结合活性，和
b)选择所述结合活性高于对照的受试化合物。
候选的配体化合物不仅包括天然物质及其变体，还包括低分子量的有机化合物。可以通过标记候选化合物，直接检测上述蛋白质和候选化合物之间的结合。或者，以阻断与已知SL的结合为指标，也可以证实这一点。即，在明显表现出与本发明蛋白质的结合活性的分子，如S1-5的存在下，使候选化合物与本发明的蛋白质接触。或者，在候选化合物与本发明的蛋白质接触之后，可以通过进一步与SL接触来评价候选化合物的结合活性。当将阻断结合用作指标时，仅需要对已知的SL进行标记。因此，这不失为一种简单的筛选方法。
作为对照，优选在没有受试化合物时进行与步骤a)相同的操作。或者，当受试化合物以低于步骤a)中的浓度存在时，也可以作为对照。另外，也可以使用已知可与滑膜蛋白结合的分子替代受试化合物，来进行与步骤a)相同的操作，从而选择出结合活性高于该分子的化合物。
另外，也可以使用基于实施例中所示基因的配体筛选方法。例如，可以使用市售的双-杂合系统筛选含有编码候选配体之基因的文库，以获得编码与滑膜蛋白结合的蛋白质的基因。该方法是筛选天然配体的有效方法。或者，通过使用掺入了cDNA的噬菌体文库和经标记的滑膜蛋白进行表达筛选，也可以克隆配体。本发明人使用该筛选方法发现了滑膜蛋白的天然配体，即SL。SL可能会与滑膜细胞表面的滑膜蛋白结合并刺激细胞增殖。因此，测定血液中的SL水平可能与RA的病理学相关。可以根据与滑膜蛋白的结合活性来测定SL。当然，可以用抗-SL抗体进行免疫测定，也可以通过联合使用这两者的夹心法测定SL。
本发明人证实：当将滑膜蛋白加入经培养的滑膜细胞时，它可以起到抑制细胞增殖的作用。就中和培养基中的SL而言的解释如下：阻断滑膜蛋白与其配体的结合和对滑膜细胞异常增殖的抑制作用相关，从而赋予治疗RA的效果。通过本发明的筛选方法可以获得的配体竞争性地阻断滑膜蛋白与其天然配体的结合，因此，它们有望具有有效抑制RA滑膜细胞增殖的活性(作为拮抗剂)。
另外，通过本发明的筛选方法可以获得的滑膜蛋白配体有望具有按照与上述SL相同的方式刺激滑膜蛋白活性的活性(作为激动剂)。刺激滑膜蛋白的配体可用作滑膜蛋白刺激剂或骨形成促进剂。更具体地，刺激滑膜蛋白的配体可用作治疗骨质疏松症、骨折或运动损伤等的药物。
可以扩展这些检测结合活性的方法和筛选方法，从而本发明进一步提供检测阻断滑膜蛋白或功能等同的蛋白质与滑膜蛋白配体结合的活性的方法，以及筛选化合物的方法。基于本发明的检测阻断滑膜蛋白与滑膜蛋白配体结合的活性的方法包括下述步骤：
a)在受试化合物的存在下，使滑膜蛋白或功能等同于滑膜蛋白的蛋白质或肽与其配体接触，和
b)检测与所述蛋白质或肽结合的配体和/或受试化合物。
另外，根据上述检测方法，本发明提供了筛选化合物的方法，所述化合物能阻断滑膜蛋白或其功能等同的蛋白质与滑膜蛋白配体结合。即，本发明涉及下述筛选方法，该方法包括以下步骤：
a)通过上述检测方法检测受试化合物阻断滑膜蛋白或其功能等同的蛋白质与其配体结合的活性，和
b)选择所述阻断活性高于对照的受试化合物。
作为对照，优选在没有受试化合物时进行与步骤a)相同的操作。或者，当受试化合物以低于步骤a)中的浓度存在时，也可以作为对照。另外，例如，也可以使用已知可阻断滑膜蛋白与其配体之间的结合的分子替代受试化合物，来进行与步骤a)相同的操作，从而选择出结合活性高于该分子的化合物。
通过上述筛选，可以获得作为滑膜蛋白或其功能等同的蛋白质的拮抗剂来发挥作用的化合物。滑膜蛋白配体的例子包括实施例中提到的SL(S1-5)。具体地说，可以使用由登录号AAA65590，I38449，NP_061489，NP_004096或Q12805鉴定的S1-5蛋白或类似的蛋白质，只要它们具有与滑膜蛋白蛋白结合的活性即可(Lecka-Czernik，B等，Mol.Cell.Biol.15，120-128，1995；Heon，E等，Arch.Ophthalmol.114，193-198，1996；Ikegawa，S等，Genomics 35，590-592，1996；Katsanis，N等，Hum.Genet.106，66-72，2000；Giltay，R等，Matrix Biol.18，469-480，1999；Stone，E.M等，Nat.Genet.22，199-202，1999)。可以在使用候选化合物之前、之后或同时使滑膜蛋白与滑膜蛋白配体接触。
本文所筛选的化合物是据认为能结合滑膜蛋白并阻断滑膜蛋白与配体结合的化合物，以及能阻断配体的化合物。通过标记配体并使其与候选化合物竞争，可以筛选出与滑膜蛋白结合的化合物。如果与配体结合的化合物是候选化合物，则反其道而行之。在每次筛选中，优选使用放射性同位素进行标记，因为它们对活性的影响小。预计所得的滑膜蛋白拮抗剂也具有抑制滑膜细胞增殖的作用，它们有望具有治疗RA的作用。
另外，有人提出滑膜蛋白配体S1-5是Malattia Leventinese(ML)和Doyne蜂窝状视网膜营养不良(DHRD)的致病基因(Stone，E.M等，Nature Genetics22，199-202，1999)。所述疾病具有类似于与年龄相关的黄斑变性(AMD)的症状，其中出现了称为脉络膜小疣的沉积物。因此，滑膜蛋白可能也会导致ML和DHRD。通过研究滑膜蛋白的突变和多态性，可对ML和DHRD进行诊断。另外，可通过本发明的筛选获得的、作为滑膜蛋白配体起作用的化合物，能阻断滑膜蛋白和S1-5之间的相互作用的化合物等有望用作有助于预防或治疗这些疾病的药物。
另外，可以使用本发明的滑膜蛋白来评价化合物调节经由滑膜蛋白的信号转导的活性，或筛选能调节经由滑膜蛋白的信号转导的化合物。具体地说，本发明提供了检测受试化合物调节经由滑膜蛋白的信号转导的活性的方法，所述方法包括下述步骤：
a)在存在或不存在滑膜蛋白配体时，使受试化合物与滑膜蛋白接触，和
b)检测经由滑膜蛋白的信号转导。
另外，本发明涉及筛选具有调节经由滑膜蛋白的信号转导之活性的化合物的方法，所述方法包括下述步骤：
a)通过上述方法检测受试化合物调节经由滑膜蛋白的信号转导的活性，和
b)选择所述调节活性高于对照的受试化合物。
作为对照，优选在没有受试化合物时进行与步骤a)相同的操作。或者，当受试化合物以低于步骤a)中的浓度存在时，也可以作为对照。另外，例如，也可以使用已知具有促进或阻断经由滑膜蛋白的信号转导之活性的分子替代受试化合物，来进行与步骤a)相同的操作，从而选择出调节活性高于该分子的化合物。
在本发明中，经由滑膜蛋白的信号转导被定义为：施加于滑膜蛋白的刺激被转导至不同的分子。对刺激的类型没有限制。已知体内存在有很多种模式的信号转导。信号转导的代表性例子是通过修饰蛋白质来调节活性。例如，通过磷酸化或乙酰化来调节某些类型蛋白质的活性。另外，已知蛋白质的活性可通过其裂解受到控制。为了以更具特异性的方式裂解蛋白质，遍在蛋白等分子的存在是至关重要的。通过将构成信号转导的分子活性或结构的变化作为指标，即可检测信号转导，其中所述变化是通过信号转导产生的。或者，将信号转导复合物的形成作为指标也可以检测信号转导。
信号转导的例子特别地包括磷酸化或去磷酸化信号。已知大多数细胞增殖信号经由基于蛋白质磷酸化或去磷酸化的蛋白质修饰被转导至下游的信号分子。由于本发明的滑膜蛋白也具有细胞增殖作用，这暗示通过蛋白质的磷酸化也可以转导经由滑膜蛋白的信号转导。实际上，本发明人发现了滑膜蛋白表达的磷酸化作用。因此，通过检测蛋白质的磷酸化，即可测定经由滑膜蛋白的信号转导。
与细胞增殖或分化有关的受体具有下述结构域作为酶活性位点(JikkenIgaku Bessatsu Bioscience Yogo Raiburari，Kaiteiban Saitokain Zoshoku Inshi[Experimental Medicine，Supplement-Bioscience Terminology Library，Revised Version：Cytokines/Growth Factors]，Yodosha Co.，Ltd.，1998)：
酪氨酸激酶结构域(VEGF受体，PDGF受体，HGF受体，EGF受体等)，
酪氨酸磷酸酶结构域(RPTP等)，和
丝氨酸/苏氨酸激酶结构域(TGFβ受体等)。
经推测，滑膜蛋白直接或间接地保持这些酶活性。术语“间接具有酶活性”指的是：滑膜蛋白分子中没有酶活性位点，但与滑膜蛋白结合的分子具有酶活性。所述分子的已知例子包括TNF受体、GM-CSF受体等。因此，通过例如检测对酪氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸的磷酸化活性，即可评价经由滑膜蛋白的信号转导。此时，通过在滑膜蛋白配体的存在下评价受试化合物的作用，即可评价受试化合物对由滑膜蛋白配体引发的滑膜蛋白信号转导的作用。具体地说，可以检测阻断或抑制经由滑膜蛋白配体至滑膜蛋白的信号转导的活性。可将本文描述的滑膜蛋白配体S1-5用作滑膜蛋白配体。或者，通过在没有滑膜蛋白配体时评价受试化合物的作用，可以评价受试化合物对滑膜蛋白的刺激活性。
为了检测蛋白质的磷酸化，例如，在存在和不存在滑膜蛋白配体时，将表达滑膜蛋白的细胞以及受试化合物和[32p]正磷酸一起保温。接着，通过免疫沉淀，从该细胞裂解产物中回收磷酸化的蛋白质。通过SDS-PAGE分级分离后，通过放射自显影检测所回收蛋白质的磷酸化。通过TLC或其它已知的肽分析方法即可鉴定磷酸化的氨基酸。
或者，可以使用磷酸化酪氨酸的抗体等特异于磷酸化蛋白质的抗体来检测特定氨基酸的磷酸化。
通常，细胞中信号转导因子的磷酸化被依次转导至多个分子。即，一系列转导途径构成级联。因此，通过评价细胞中全部蛋白质的磷酸化水平的变化，即可比较细胞中出现的磷酸化信号的大小。评价细胞中总蛋白质磷酸化水平的方法是已知的。例如，用滑膜蛋白配体等刺激细胞之后，通过SDS-PAGE分级分离蛋白质，并印迹到滤膜上，然后使用抗-磷酸化酪氨酸的抗体等进行Western印迹，即可评价全部蛋白质的磷酸化水平。另外，例如，可用[32P]正磷酸标记细胞，并用滑膜蛋白配体等刺激细胞。然后，用二维电泳扩展细胞蛋白质。用考马斯蓝染色蛋白质，进行放射自显影。通过检测磷酸化的点，即可评价磷酸化水平。
或者，可以特异性地测定身为滑膜蛋白的底物的磷酸化蛋白质中磷酸化水平的变化。例如，身为滑膜蛋白的底物的磷酸化蛋白质回收自上述二维电泳中的磷酸化点，并可通过微量测序或质谱分析法鉴定该蛋白质。例如，使用特异于底物蛋白质的抗体，对鉴定出的底物蛋白质的磷酸化水平的变化进行免疫沉淀，通过SDS-PAGE分级分离之后，通过放射自显影可以测定[32p]的摄入，或者，使用抗-磷酸化酪氨酸的抗体，通过Western印迹来评价[32P]的摄入(Baio Manyuaru Shirizu-Bunshi Seibutsugaku Kenkyu noTame no Tampaku Jikken Ho[Bio Manual Series-Protein ExperimentalMethods for Molecular Biology Research]，Tadaomi Takenawa，Masaki Inagakieds.)。
上述方法中使用的细胞例子包括滑膜细胞(例如RTF)和外源性转移了滑膜蛋白基因的细胞。如果某种受试化合物因滑膜蛋白所致的磷酸化或去磷酸化水平有所降低，那么可以判断该化合物是能阻断经由滑膜蛋白的信号转导的化合物。另外，如果某种受试化合物因滑膜蛋白所致的磷酸化或去磷酸化水平有所提高，那么可以判断该化合物是能促进经由滑膜蛋白的信号转导的化合物。
例如，当滑膜蛋白作为受体-型酪氨酸激酶起作用，且下游分子经由酪氨酸的磷酸化被激活以转导信号时，如果受试化合物抑制酪氨酸的磷酸化，那么可以判断该化合物是能阻断经由滑膜蛋白的信号转导的化合物。另外，本发明涉及使用例如酪氨酸激酶、酪氨酸磷酸酶或丝氨酸/苏氨酸激酶或其它蛋白质激酶或磷酸酶阻断剂，阻断经由滑膜蛋白的信号转导的方法。
另外，另一个经由滑膜蛋白的信号转导的较好例子是遍在蛋白化信号。蛋白质结构推测系统(SMART：Simple Modular Architecture Research Tool(也可参见网站http://smart.embl-heidelberg.de/)Schultz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，5857-5864，1998；Schultz等，Nucleic Acids Res.28，231-234，2000)阐明了滑膜蛋白中环指基元的存在(Joazeiro，C.A等，Science 286，309-312，1999)。已知该基元存在于与蛋白质分解有关的E3遍在蛋白-蛋白质连接酶中。另外，据认为环指基元是E2遍在蛋白-缀合酶的结合位点。
因此，通过检测因滑膜蛋白所致的遍在蛋白化信号，就可以评价经由滑膜蛋白的信号转导。例如，可通过使用抗-遍在蛋白的抗体检测底物蛋白质的遍在蛋白化，从而评价遍在蛋白化信号。此外，也可以检测滑膜蛋白与E2遍在蛋白-缀合酶或底物蛋白质的结合，或者含有滑膜蛋白的遍在蛋白连接酶复合物等。具体地说，例如，破碎用表达经标记的滑膜蛋白的载体转染的细胞，加入经[32P]标记的遍在蛋白进行反应。然后，用抗-标记的抗体进行免疫沉淀。通过SDS-PAGE和进行放射自显影，即可检测滑膜蛋白的遍在蛋白连接酶活性(Hashizume，R等，J.Biol.Chem.276，14537-14540，2001)。
可以特异性地测定滑膜蛋白底物蛋白质中的遍在蛋白化水平的变化。通过例如以滑膜蛋白为饵的酵母双-杂合筛选，可以鉴定出滑膜蛋白的底物蛋白质。可按下述评价鉴定出的底物蛋白质的遍在蛋白化水平的变化：纯化经标记的底物，在其中加入经纯化的E1，E2，E3和遍在蛋白。反应之后，用抗-标记抗体进行免疫沉淀，用抗-遍在蛋白抗体进行染色(Yokouchi，M等，J.Biol.Chem.274，31707-31712，1999)。
如果某种受试化合物经由滑膜蛋白的遍在蛋白化信号的激活有所降低，那么可以判断该化合物是能阻断经由滑膜蛋白的信号转导的化合物。另外，如果某种受试化合物经由滑膜蛋白的遍在蛋白化信号的激活有所提高，那么可以判断该化合物是能促进经由滑膜蛋白的信号转导的化合物。例如，能抑制滑膜蛋白和E2遍在蛋白激活酶之间的相互作用的化合物可有效抑制经由滑膜蛋白的遍在蛋白化信号。另外，本发明提供了使用与遍在蛋白化信号有关的酶的抑制剂来阻断经由滑膜蛋白的信号转导的方法。例如，通过给细胞使用E2遍在蛋白缀合酶或E3遍在蛋白连接酶抑制剂，可以阻断经由滑膜蛋白的信号转导。
可以使用上述方法选择具有调节经由滑膜蛋白的信号转导之活性的化合物。能阻断经由滑膜蛋白的信号转导的化合物可用作药物，用于治疗因滑膜蛋白的激活而导致的疾病。例如，能阻断经由滑膜蛋白的信号转导的化合物可用于阻断滑膜增生。通过施用这些化合物，可以抑制滑膜增生，从而可以预防或治疗与滑膜增生有关的疾病，如RA。另外，这些化合物还可用作治疗ML和DHRD的药物。或者，能促进信号转导的化合物可用作滑膜蛋白刺激剂，或用作骨形成促进剂等。例如，它们可用作治疗骨质疏松症、骨折或运动损伤等的药物。
根据对滑膜蛋白基因的发现，使下述与RA和其它涉及滑膜蛋白的疾病有关的新方法成为可能。首先，可以测定控制滑膜蛋白表达的启动子或增强子的结构。即，可以根据SEQ ID NO：1所示的滑膜蛋白基因的核苷酸序列，促进基因组的克隆，并分析表达控制结构域的序列。所得的滑膜蛋白转录调节结构域可用于研究滑膜蛋白的转录调节因子。
另外，在本发明的滑膜蛋白敲除动物中，如果嵌入了标记基因，并在滑膜蛋白基因的内源性启动子的控制之下表达标记基因，则可以使用所述动物或得自该动物的细胞，以标记基因的表达作为指标，对能控制滑膜蛋白基因表达的药物进行筛选。例如，如果转录调节因子的识别序列为双链形式，那么它可作为引诱(decoy)核酸药物起作用。
另外，可以使用本发明的多核苷酸检查本发明的蛋白质在动物中的生物学作用。为了实现此目的，例如，可导入本发明的DNA，过量表达或在不同的位置表达(或在不同的时间表达)本发明的蛋白质，通过证实其效果即可检查其作用。通过制备本发明DNA的转基因动物，可将基因转移至整个身体内。或者，通过基因靶向和施用反义寡核苷酸、核酶等，关于抑制本发明DNA的表达和功能的功能丧失实验也是有效的。即，本发明提供了转基因的非人脊椎动物，其中本发明DNA的表达可被修饰，或所述修饰可被诱导。与野生型相比，表达可被修饰，或者当诱导修饰时，与诱导前相比，表达可被修饰。
本发明的转基因动物包括在基因组中转移了外源性核酸的动物。另外，“DNA的表达”可以是DNA转录水平上的，或是转录物翻译水平上的。另外，“诱导修饰”可包括通过外部刺激物诱导修饰，或对阶段-特异性表达进行修饰，或者因杂交育种而在后代中修饰表达。另外，还包括一些细胞或组织中的表达修饰。本发明的转基因非人脊椎动物的例子优选包括哺乳动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猪、山羊、绵羊、马和牛)，而特别优选使用啮齿类动物，例如小鼠和大鼠等。
本发明的转基因非人脊椎动物包括外源性导入编码本发明的蛋白质的DNA的转基因非人脊椎动物。通过例如在受精卵中注射表达编码本发明蛋白质的DNA的载体，即可产生所述转基因动物。
通过在混合载体与受精卵之后用磷酸钙处理、电穿孔或在倒置显微镜下进行微量注射等，可以进行载体的转移。另外，通过将本发明的载体转移至胚胎干细胞(ES细胞)，并将选定的ES细胞微量注射至受精卵(胚泡)中，也可以进行转移。
通过与结扎输精管的雄性个体交配诱使雌性受体假孕，将所得的受精卵植入受体的输卵管中，从而获得新生动物。由新生动物的尾部等制备DNA，使用PCR证实保留了转移的DNA(Brigid Hogan等编，“Manipulatingthe Mouse Embryo：A Laboratory Manual，”Cold Spring Harbor Laboratory，1994，Gordon，J.W等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：7380-7384，1980；Jaenisch，R.and B.Mintz，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 71：1250-1254，1974)。可从通过与正常动物交配而将基因转移至种系的嵌合动物中获得杂合子。通过使两个杂合子交配可以获得纯合子。本发明的转基因非人脊椎动物包括这些动物和它们的后代。
用于在体内表达本发明DNA的启动子的例子包括整体表达型启动子和组织-特异性和阶段-特异性的启动子。
整体表达型启动子的例子包括β-肌动蛋白启动子等。例如，可以使用pCAGGS中包含的与人巨细胞病毒增强子相连的鸡β-肌动蛋白启动子等。当制备以位点-特异性或阶段-特异性方式表达本发明DNA的转基因动物时，可以使用Cre-loxP系统等。例如，制备在位点-特异性或阶段-特异性启动子的下游具有Cre重组酶基因的转基因动物，并另外制备具有载体的转基因动物，在所述载体中，编码本发明多肽的DNA与常用启动子的下游连接。此时，将处于一对loxP的夹层的转录终止信号等或终止密码子插入启动子和编码本发明多肽的DNA之间。通过使两个个体交配，可以在表达Cre的同时表达本发明的多肽。
另外，本发明的转基因非人脊椎动物包括其中编码本发明内源性蛋白质的DNA的表达受抑制的转基因非人脊椎动物。通过例如基因靶向可以制备这种转基因动物。例如，为了产生这种转基因的非人脊椎动物，将通过取代、缺失、添加和/或插入等使其中含有的本发明DNA中的部分或全部发生缺损的靶向载体插入胚胎干(ES)细胞，选择与染色体DNA发生同源重组的细胞。为了选择同源重组体，可以进行已知的正选择和负选择。正选择使用的标记的例子包括新霉素抗性基因等药物抗性基因，而负选择使用的标记的例子包括白喉毒素(DT)-A基因、HSK-tk基因等。可以使用Southern印迹、PCR等选择正确重组的细胞。将所得细胞注入大致为8-细胞期的受精卵中，或注入胚泡的囊胚腔中，并转移至通过与结扎输精管的雄性个体交配而制备的假孕雌性个体的子宫内。按照与上述相同的方式，对新生动物进行基因组DNA分析，即可获得杂合子或纯合子。不仅可以敲除靶基因，还可以嵌入另一个基因。对嵌入的基因没有特别的限制。例子包括lacZ基因等标记基因。
另外，可以使用反义法或核酶法制备编码本发明内源性蛋白质的DNA表达受抑制的转基因非人脊椎动物。在反义法中，将含有编码RNA的DNA的载体，所述RNA与编码本发明蛋白质的DNA转录产物互补，或在核酶法中，例如，将含有编码RNA的DNA的载体，所述RNA能切割编码本发明蛋白质的DNA的转录产物，以与上述相同的方式插入哺乳动物的胚胎干细胞。将所述细胞注射至哺乳动物的胚胎中，由胚胎获得个体。
由于滑膜蛋白能诱导RA的滑膜细胞增殖症状，转基因动物的下述应用是可信的。即，在将滑膜蛋白基因或SL基因掺入适当动物以形成转基因动物之后，通过诱导强表达可将所述动物用作RA模型。在该转基因动物中，可以进行能控制滑膜增殖机理的药物的筛选。或者，在具有人滑膜蛋白/SL，但不出现RA症状的动物中，通过强表达这些基因，可将这些动物用作提供滑膜蛋白或SL的来源。
表达滑膜蛋白基因的转基因动物表现出与RA共有的症状，如伴随有滑膜增生的关节炎。即，这些动物成为类风湿性关节炎的模型动物。可以使用这些动物在包括药物候选化合物的多种化合物中检验或筛选RA药物。通过给转基因动物施用受试化合物，可以观察症状的减轻或加剧，以证实化合物的效力或进行筛选。使用本发明的转基因动物进行检验或筛选的方法的例子包括下述方法。
检验或筛选导致关节异常减轻或加剧的化合物的方法，所述方法包括下述步骤：(a)给外源性插入本发明DNA的转基因非人脊椎动物施用受试化合物，和(b)评价施用了化合物的动物的关节异常。
另外，滑膜蛋白基因敲除动物可以用于检查通过抑制滑膜蛋白的作用而导致的副作用，或用于筛选可降低这些副作用的药物。另外，通过在敲除动物中局部或瞬时表达滑膜蛋白，可以特异性地证实滑膜蛋白的作用。另外，从SL(S1-5)和ML/DHRD的相关性上看，滑膜蛋白可能对SL的细胞内信号转导起作用，因此，滑膜蛋白敲除动物可成为ML或DHRD的模型。例如，滑膜蛋白基因的组织特异性或阶段特异性(纯合子或杂合子)敲除是可以想到的。
可以使用在敲除滑膜蛋白基因的同时导入标记基因等的嵌入动物来检测化合物增加或降低滑膜蛋白基因表达的活性。即，本发明涉及检测受试化合物调节滑膜蛋白基因表达的活性的方法，所述方法包括下述步骤：
a)将受试化合物应用于上述嵌入动物或嵌入细胞，和
b)测定标记基因的表达水平。
可在筛选调节滑膜蛋白基因表达的化合物时使用该检测方法。该方法是调节滑膜蛋白基因表达的化合物的筛选方法，所述方法包括下述步骤：a)将受试化合物应用于上述嵌入动物或嵌入细胞，b)测定标记基因的表达水平，和c)选择增加或降低嵌入基因的表达的化合物。
即，在使用了受试化合物的动物或细胞中，检测标记基因的表达，并选择增加或降低标记基因的表达的化合物。当将LacZ用作标记时，可通过实施例中提及的方法对标记基因的表达进行检测。通过此方法，除了可使用个体进行检验或筛选外，还可以使用例如分离的器官或组织，或使用得自转基因动物的细胞进行类似的检验或筛选。
在使用个体进行筛选时，经适当途径施用受试化合物。可通过已知给药方法，如静脉注射、皮下注射、肌内注射、腹内注射、口服、直肠给药、鼻腔给药等施用受试化合物。在使用试管培养系统进行筛选时，例如，可在培养基中加入受试化合物。或者，可通过微量注射等方法将受试化合物注射至细胞中。当受试化合物是基因时，可将裸露的DNA与合乎需要的转染试剂混合，或将其掺入已知的表达载体中并将基因导入细胞。包括滑膜蛋白基因启动子结构域序列的核酸有望用作引诱(decoy)核酸，并能抑制滑膜蛋白的表达。
例如，可通过下述步骤检测调节滑膜蛋白基因表达的活性：
a)使受试化合物与表达系统接触，所述表达系统在滑膜蛋白或功能等同于滑膜蛋白的多核苷酸的内源性启动子控制之下表达报道基因，和
b)测定报道基因的表达水平。
此外，基于此检测方法，可以筛选调节滑膜蛋白基因表达的化合物。即，本发明涉及筛选化合物的方法，所述化合物能调节滑膜蛋白或功能等同于滑膜蛋白的多核苷酸的内源性启动子的活性，所述方法包括下述步骤：
a)通过上述检测活性的方法，测定受试化合物调节滑膜蛋白或功能等同于滑膜蛋白的多核苷酸的内源性启动子活性的活性，和
b)选择所述活性与对照相比有所不同的受试化合物。
作为对照，可在没有受试化合物时进行与步骤a)相同的操作。或者，当受试化合物以低于步骤a)中的浓度存在时，也可以作为对照。另外，例如，也可以使用不同的化合物，例如，选择作用高于该化合物的化合物来进行与步骤a)相同的操作。基因的表达包括转录水平上的表达或翻译水平上的表达。连接于滑膜蛋白基因内源性启动子下游的基因可以是天然滑膜蛋白基因本身，或是人工连接的报道基因。通过例如使用连接于下游的基因的cDNA片段作为探针而进行的Northern杂交，RT-PCR，使用抗由滑膜蛋白基因编码的蛋白质的抗体进行的Western印迹，免疫沉淀，ELISA等方法检测所述基因的转录产物或翻译产物，即可测定滑膜蛋白基因的内源性启动子活性。
另外，通过产生将报道基因连接于滑膜蛋白基因启动子下游而构建的构建体，并使用通过将所述构建体转染至细胞而获得的转化细胞，可以将报道基因的表达用作指标来进行筛选。通过将所需报道基因连接于含有滑膜蛋白基因启动子的滑膜蛋白基因上游结构域基因组DNA的下游，即可制备构建体。对报道基因没有特别的限制，其例子包括LacZ、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、萤光素酶、GFP(绿色荧光蛋白)等。能降低滑膜蛋白基因表达的化合物是治疗RA的候选药物。
对本发明的检验或筛选中使用的受试化合物没有特别的限制，其例子包括有机化合物、无机化合物、肽、蛋白质、天然或合成的低分子化合物、天然或合成的高分子化合物、组织或细胞提取物、微生物培养上清或得自植物或海洋生物的天然成分等，但并不局限于此。也可以使用基因文库的表达产物或表达cDNA文库等。另外，通过上述筛选与滑膜蛋白结合的化合物的方法，或通过筛选阻断滑膜蛋白与SL结合的化合物的方法获得的化合物也可以作为受试化合物来施用。
对施用化合物的方法没有特别的限制，可在体外通过与细胞接触，包括添加至培养基中，或通过使用微量注射器或转染试剂导入细胞等来施用化合物。通过动脉内注射、静脉内注射、皮下注射、腹内注射、口服、直肠给药、肌内给药、滴眼液、鼻腔给药、局部注射至关节等，或通过本领域技术人员已知的其它方法体内施用受试化合物。可以施用通过与水、生理盐水溶液、缓冲溶液、盐、稳定剂、防腐剂、悬浮剂等混合而获得的适当组合物。
另外，不仅可以使用转基因动物，也可以使用正常动物或得自这些动物的细胞等来进行调节滑膜蛋白基因表达的化合物的筛选。例如，本发明涉及检测调节滑膜蛋白或功能等同于滑膜蛋白的多核苷酸的表达之活性的方法，所述方法包括下述步骤：
a)在受试化合物的存在下培养表达滑膜蛋白或功能等同于滑膜蛋白的多核苷酸的细胞，和
b)测定所述多核苷酸的表达水平。
另外，基于此检测方法，可以筛选调节滑膜蛋白基因表达的化合物。即，本发明涉及筛选化合物的方法，所述化合物能调节滑膜蛋白或功能等同于滑膜蛋白的多核苷酸的表达，所述方法包括下述步骤：
a)根据上述检测活性的方法，检测受试化合物调节滑膜蛋白或功能等同于滑膜蛋白的多核苷酸的表达的活性，和
b)选择所述活性与对照相比有所不同的受试化合物。
通过上述方法可以测定滑膜蛋白或功能等同于滑膜蛋白的多核苷酸的表达水平。另外，所有在上述和其它筛选方法中可用作受试化合物的化合物也可在此筛选方法中用作受试化合物。如上所述，作为对照，可在没有受试化合物时进行与步骤a)相同的操作。
通过本发明的检验或筛选方法鉴定的化合物成为RA或与滑膜蛋白有关的其它疾病的候选药物，因此，它们可用于预防或治疗RA等疾病。这些化合物可与活性成分以外的其它适当溶质或溶剂组合，从而形成药物组合物。当将通过本发明的筛选方法分离的化合物用作药物时，可以直接给患者施用分离的化合物本身，或以通过已知制剂方法制备的药物组合物的形式施用化合物。
例如，可与可药用载体或介质、具体是无菌水、生理盐水溶液、植物油、乳化剂、悬浮剂等适当组合，制成制剂后施用化合物。本发明的药物组合物形式可以是水溶液、片剂、胶囊、锭剂、口腔片、酏剂、悬浮剂、糖浆、滴鼻剂、吸入溶液等。可以适当测定化合物的含量。一般通过动脉内注射、静脉内注射、皮下注射、口服、关节内注射或本领域技术人员已知的其它方法给患者施用化合物。
尽管剂量随着患者的体重和年龄、给药方法、症状等的不同而有所不同，但本领域技术人员能适当选择剂量。典型的剂量会随着有效血药浓度和药物代谢时间的不同而有所不同，但据认为每天的维持剂量约为0.1mg/kg至约1.0g/kg，或优选为约0.1mg/kg至约10mg/kg，更优选为约0.1mg/kg至约1.0mg/kg。可以一次或分成几次来进行给药。另外，只要所述化合物由多核苷酸编码，即可通过将所述多核苷酸掺入基因治疗载体来进行基因治疗。
本文提及的所有现有技术的参考文献都列入本文作为参考。
附图简述
图1为使用抗-滑膜细胞抗血清的免疫筛选中的阳性集落照片。
图2为显示滑膜蛋白重组蛋白质在大肠杆菌中的表达的照片。
图3为放射自显影照片，它显示了翻译自滑膜蛋白cDNA的滑膜蛋白蛋白质的体外表达。
图4为放射自显影照片，它显示了使用滑膜蛋白的cDNA为探针，经Northern印迹分析滑膜蛋白基因表达的结果。
图5的照片显示了使用抗-滑膜细胞抗血清对多种细胞提取物进行Western印迹的结果，以及用GST-部分滑膜蛋白进行抗体吸附实验的结果。箭头表示被吸附的带。各条带的分子量从上至下依次约为220、185和140kDa。
图6为放射自显影照片，它显示了使用抗-滑膜细胞抗血清对滑膜细胞提取物进行Western印迹的结果。左泳道(免疫前)是免疫滑膜细胞之前的兔抗-血清，而右泳道(免疫后)是滑膜细胞抗-血清。
图7为荧光显微照片，它显示了用抗-滑膜细胞抗血清(A)和纯化的抗-滑膜细胞抗体(B)对滑膜细胞进行荧光免疫染色的结果。
图8为显微照片，它显示了使用抗-滑膜细胞抗血清对滑膜组织进行免疫染色的结果，和用GST-部分滑膜蛋白进行抗体吸附实验的结果。
图9为显微照片，它显示了使用纯化的抗-滑膜细胞抗体对滑膜组织进行免疫染色的结果。其中显示了使用通过GST亲和柱纯化的抗血清(上图的实验组)和通过GST-部分滑膜蛋白亲和柱纯化的抗血清(下图的实验组)的结果。
图10为放射自显影照片，它显示了通过Western印迹检测多种类型的人血清中的抗-滑膜蛋白抗体的结果。
图11为放射自显影照片，它显示了使用SL的cDNA为探针，通过Northern印迹分析滑膜细胞中的SL基因表达的结果。
图12为放射自显影照片，它显示了[35S]-标记的HA-滑膜蛋白-HAHA和GST-SL融合蛋白之间的结合。
图13以显示了通过MTT试验分析滑膜蛋白对滑膜细胞增殖的作用的结果。使用了GST-部分滑膜蛋白。
图14以显示了滑膜蛋白基因导入载体的结构。使用具有CMV增强子的β-肌动蛋白启动子全身性表达滑膜蛋白。使用抗-Flag-标记抗体证实Flag标记-融合滑膜蛋白的表达。
图15为显示含有滑膜蛋白基因的转基因小鼠表现出关节炎的脚趾关节的照片。其中显示出被迫表达滑膜蛋白的小鼠的脚趾外形和软性X-射线图像。右图显示出正常小鼠脚趾的软性X-射线图像以供比较。被迫表达滑膜蛋白的小鼠表现出显著的脚趾肿胀。
图16为显示含有滑膜蛋白基因的转基因小鼠表现出关节炎的脚趾关节的组织学观察照片。在表现出显著肿胀的脚趾关节部分，发现了伴随着显著滑膜增生的骨损坏和异常骨形成。
图17为显示基因导入小鼠的正常脚趾关节的组织学观察照片。未发现异常的关节软骨、骨损坏或滑膜增生。右下图的实验组显示了用抗-Flag抗体进行免疫染色的结果。未观察到阳性信号。
图18为显示滑膜蛋白基因转基因小鼠表现出关节炎的脚趾关节中的滑膜蛋白表达的照片。用抗-Flag抗体进行免疫染色。在表现出显著肿胀的脚趾关节区域增生的滑膜组织和软骨细胞中发现了滑膜蛋白表达。
图19图解显示了使滑膜蛋白基因缺损的靶向载体的结构。在小鼠滑膜蛋白基因片段的翻译起始位置(翻译第一个蛋氨酸的ATG密码子；以“*”表示)处导入lacZ基因，导入新霉素抗性(neo)基因作为正选择标记基因。另外，还连接白喉毒素A(DT-A)基因以形成负选择标记。发生同源重组的个体缺乏滑膜蛋白基因的表达，但取而代之的是β-半乳糖苷酶的表达，通过利用其酶活性的LacZ染色即可检测出由滑膜蛋白基因启动子起始的表达(参见图22)。图中还显示了为了证实基因型的Southern印迹分析所用探针的位置(参见图20)。
图20为显示滑膜蛋白基因-缺损小鼠基因型分析结果的照片。DNA提取自约2周龄的小鼠尾(野生型和杂合-缺损的小鼠)和妊娠14.5天后(dpc)的小鼠胎儿(纯合-缺损的小鼠)，用PstI消化之后，使用图19显示的探针进行Southern印迹。
图2 1为显示滑膜蛋白基因-缺损小鼠的Northern印迹分析结果的照片。mRNA提取自野生型(+/+)，滑膜蛋白基因杂合敲除小鼠(+/-)和纯合敲除小鼠(-/-)，使用滑膜蛋白基因片段作为探针进行Northern印迹(上图的实验组)。下图的实验组显示了琼脂糖凝胶的溴化乙锭染色。
图22的照片显示了通过LacZ染色研究滑膜蛋白表达位置的结果。使用LacZ染色妊娠后12.5天和妊娠后13.5天的野生型和杂合-缺损小鼠。发现在胚胎期的顶骨、四肢、耳等形成骨和软骨的位置存在强滑膜蛋白表达。
图23的照片显示了四肢形成期的滑膜蛋白表达。发现与FGF4、BMP2和BMP4的表达方式相同，在四肢形成期的尖端外胚层嵴(AER)中存在强滑膜蛋白表达。
图24的照片显示了杂合-缺损小鼠妊娠后13天肢芽的冻干切片的LacZ染色。染色进行了4小时。LacZ的蓝色深染出未分化的间充质细胞(骨和软骨的原基)。原始放大倍数：×40。
图25的照片显示了杂合-缺损小鼠妊娠后13天肢芽的冻干切片的LacZ染色。染色进行了4小时。LacZ的蓝色深染出未分化的间充质细胞(骨和软骨的原基)。原始放大倍数：×200。A、B和C对应于图24。
图26的照片显示了妊娠后12.5天和13天的滑膜蛋白基因纯合-缺损小鼠的表型。妊娠后12.5天和13天的滑膜蛋白基因纯合-缺损小鼠表现出从顶骨区至臀部的长度短，且提前形成头颅和四肢的趋势。在妊娠后13天的杂合-缺损小鼠和野生型小鼠之间没有显著的表型差异。
图27的照片显示了妊娠后14.5天的滑膜蛋白基因-缺损小鼠的表型。在妊娠后14.5天的滑膜蛋白基因纯合-缺损小鼠中发现了肢芽异常。
图28的照片显示了妊娠后14.5天的滑膜蛋白基因纯合-缺损小鼠的后肢中的LacZ表达(反映了滑膜蛋白表达)。在纯合-缺损小鼠的异常后肢中，在AER和未分化的间充质细胞集中的位点发现了LacZ表达。
图29的照片显示了妊娠后15.5天的滑膜蛋白基因-缺损小鼠的表型。在纯合-缺损小鼠中发现了肢芽异常、上下颌骨异常和耳的形态异常。未发现心跳，小鼠未存活。
图30的照片显示了妊娠后15.5天的滑膜蛋白基因-缺损小鼠的骨骼。其中显示出爱茜蓝和茜素红染色。在滑膜蛋白纯合-缺损小鼠中未发现被爱茜蓝染色的软骨和被茜素红染色的钙化骨。
图31的照片显示了在滑膜蛋白敲除小鼠中使用抗-胶原抗体混合物的小鼠关节炎模型。给野生型小鼠[373(+/+)]和滑膜蛋白杂合敲除小鼠[372(-/+)]施用抗-胶原抗体混合物以引发关节炎(图中的+)。同时观察未给药的野生型小鼠(-)[371(+/+)]。结果，与野生型相比，滑膜蛋白杂合敲除小鼠中前肢和后肢关节的肿胀和发红症状有所减轻。即，与野生型小鼠中引发的关节炎相比，滑膜蛋白杂合敲除小鼠中关节炎的发生较弱。
图32的照片显示了得自滑膜蛋白基因纯合-缺损小鼠(妊娠后13天的胎鼠)肢芽的原代培养细胞的LacZ染色和爱茜蓝染色。LacZ阳性集落(即表达滑膜蛋白的细胞)与爱茜蓝染色阳性集落一致。该结果暗示滑膜蛋白对骨和软骨的分化起作用。传代数为1(p1)。
图33的照片显示了得自妊娠后13天的胎鼠肢芽的原代培养细胞的LacZ染色。其中显示了得自野生型小鼠(+/+)，和滑膜蛋白基因杂合(-/+)和纯合(-/-)缺损小鼠的细胞。仅观察滑膜蛋白基因-缺损小鼠(嵌入了lacZ基因)中的LacZ表达。传代数为1(p1)。
图34的照片显示了得自滑膜蛋白基因杂合-缺损小鼠(妊娠后13天的胎鼠)肢芽的原代培养细胞的LacZ染色和爱茜蓝染色。LacZ阳性集落(即表达滑膜蛋白的细胞)与爱茜蓝染色阳性集落一致。传代数为1(p1)。
图35的照片显示了得自野生型小鼠(妊娠后13天的胎鼠)肢芽的原代培养细胞的LacZ染色和爱茜蓝染色。未观察到LacZ染色。传代数为1(p1)。
图36的照片显示了得自滑膜蛋白基因杂合-缺损小鼠(妊娠后13天的胎鼠)肢芽的原代培养细胞的LacZ染色。甚至在典型的双核软骨细胞中也可确定LacZ染色(滑膜蛋白表达)(参见放大200倍的图像)。
图37的照片显示了得自胎鼠肢芽的原代培养细胞的von Kossa染色。其中显示了得自野生型小鼠(WT)、滑膜蛋白基因杂合(Hetero)和纯合(Homo)缺损小鼠的细胞。在滑膜蛋白基因-缺损小鼠(Homo)中观察到骨形成能力的降低。传代数为1(p1)。
图38的照片显示了得自滑膜蛋白基因纯合-缺损胎鼠肢芽的原代培养细胞(传代数为3；p3)的LacZ染色。持续培养直至细胞变成次铺满。进行LacZ染色(过夜)之后，进行苏木精伊红(HE)染色。
图39图解显示了滑膜蛋白基因杂合敲除小鼠(嵌入了lacZ基因)的原代细胞的β-gal试验结果。平行测定三份样品，显示平均值和标准偏差。
图40图解显示了通过滑膜蛋白基因杂合敲除小鼠(嵌入了lacZ基因)的原代细胞的β-gal试验检查多种药物对滑膜蛋白启动子活性的作用的结果。平行测定三份样品，显示平均值和标准偏差。
图41图解显示了用Syno-P3免疫的小鼠血清的ELISA结果。以所示比率稀释得自三个个体(第1-3号)的血清，然后进行ELISA。将得自未经免疫的小鼠(图中的“正常”)的血清用作对照。
图42图解显示了用Syno-P2免疫的小鼠血清的ELISA结果。以所示比率稀释得自三个个体(第1-3号)的血清，然后进行ELISA。将得自未经免疫的小鼠(图中的“正常”)的血清用作对照。
图43图解显示了用Syno-P1免疫的小鼠血清的ELISA结果。以所示比率稀释得自三个个体(第1-3号)的血清，然后进行ELISA。将得自未经免疫的小鼠(图中的“正常”)的血清用作对照。
图44的照片显示了得自具有抗-滑膜蛋白单克隆抗体的RA和OA患者的滑膜细胞的Western印迹(A)和荧光免疫染色(B)结果。
图45的照片显示了得自具有抗-滑膜蛋白单克隆抗体的RA患者的滑膜组织的免疫染色结果。其中还显示了苏木精伊红(HE)染色图像。
图46的照片显示了滑膜蛋白的自身-遍在蛋白化活性。在GST-HA-遍在蛋白、ATP、E1和E2的存在下反应FLAG-滑膜蛋白，用抗-FLAG抗体和抗-HA抗体检测滑膜蛋白的遍在蛋白化。CE：细胞提取物。IP：免疫沉淀物。
实施本发明的最佳方式
[实施例1]制备抗-滑膜细胞抗-血清
使用通过下述方法制备的滑膜细胞作为免疫原来获得抗-滑膜细胞抗-血清。在无菌状态下，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗经滑膜切除术从10个类风湿性关节炎(RA)患者体内提取的滑膜组织。将经清洗的组织切成大小约为5mm的方块，37℃用0.25％胰蛋白酶/PBS消化20分钟。从经消化的滑膜组织中除去过量的组织块，将所得细胞悬浮于含有10％胎牛血清的Dulbecco改进的Eagle培养基(Virology，8，396，1959)(10％FCS-DMEM)中，于5％CO2，37℃中，在无菌的细胞培养皿中培养24小时。弃去培养上清，使用10％FCS-DMEM进行清洗，除去未贴壁的细胞，以获得粘附于平皿的细胞，即为得自类风湿患者的滑膜细胞(The Journal of ClinicalInvestigation，92，186，1993)。将经培养的细胞用作细胞库，作为下述得自RA患者的滑膜细胞用于实验中。
将得自患者的滑膜细胞(1×105)悬浮于20ml的10％FCS-DMEM中，在76cm2的培养瓶中培养。每3天换一次培养基，两周后，培养物表面长满细胞，此时除去培养基，加入各为7ml的0.05％EDTA/PBS和0.1％胰蛋白酶/PBS以脱附和回收细胞。用PBS清洗回收的细胞以除去培养基组分，悬浮于1ml PBS中以形成免疫原。
在制备后2小时内使用该免疫原，通过静脉注射至耳来免疫一只兔。以一周为间隔，共免疫6次。第6次免疫时，从兔耳抽取的数ml血液检测抗血清，通过荧光抗体法发现抗血清与类风湿患者滑膜细胞的反应。第6次免疫后一周，使用导管从心脏中抽取尽可能多的血液。将血液在4℃放置过夜以使其凝结，分离血清。在血清中加入0.1％叠氮化钠作为防腐剂，将血清储存于4℃作为抗-滑膜细胞抗血清。
[实施例2]抗-滑膜细胞抗血清所识别抗原(滑膜蛋白)的基因克隆
使用酸胍/苯酚氯仿法提取实施例1中获得的10个RA患者滑膜细胞的总RNA，使用poly T珠纯化mRNA(Analytical Biochemistry，162，159，1987)。通过常规方法使用λZAP载体(Stratagene)制备RA患者滑膜细胞的cDNA文库。使用picoBlue免疫筛选试剂盒(Stratagene)，用上述实施例1的抗-滑膜细胞抗血清进行免疫筛选(图1)。用辅助噬菌体将所得阳性克隆(噬菌体)转变为质粒pBluescript II SK(+)。利用M13PrimerM4和M13PrimerRV(Takara)，基于染料终止子法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，74，5463，1977)通过ABI PRISM377DNA测序仪(PERKIN ELMER)测定插入pBluescript II SK(+)的DNA的核苷酸序列。从编码被上述抗-滑膜细胞抗血清识别的抗原的基因(即“滑膜蛋白”)的3’末端测定核苷酸序列，阐明了包括poly(A)+链的2990bp核苷酸序列(SEQ ID NO：1，第42-3031位)。使用该核苷酸序列，通过5′-RACE(cDNA末端快速扩增)法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，85：8998-9002，1988)，从滑膜细胞cDNA文库中测定3031bp的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)，该序列包括全长滑膜蛋白的编码区，5’-非编码区的一部分和poly(A)+链。在GenBank中进行同源性检索，结果发现该核苷酸序列是新基因，尚未报道过类似的序列。
[实施例3]在大肠杆菌中表达部分滑膜蛋白重组蛋白
从通过使用抗-滑膜细胞抗血清进行免疫筛选而获得的cDNA克隆中，用限制性酶EcoRI和XhoI处理编码滑膜蛋白的一部分的cDNA(1799bp；SEQ ID NO：1，第1233-3031位)，并提取所述cDNA。将末端具有能被EcoRI/XhoI识别的序列的cDNA插入谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白表达载体pGEX-5X-3，进行亚克隆。通过以42℃热激45秒，将已插入部分滑膜蛋白cDNA的pGEX-5X-3导入BL21大肠杆菌菌株，获得BL21/滑膜蛋白-GST基因/pGEX-5X-3。在含有0.1mg/ml氨苄青霉素的LB培养基中培养该BL21菌株，加入0.1mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，于37℃再培养2小时以诱导上述融合蛋白的表达。用PBS洗涤通过离心回收的BL21之后，用1mg/ml溶菌酶消化BL21，并用0.1％Triton X-100溶解。将得自BL21、含有溶解的GST融合蛋白的蛋白质悬浮液上样于谷胱甘肽Sepharose4B(GS4B)，然后用PBS洗涤，使用50mM还原型谷胱甘肽/PBS纯化合乎需要的GST-部分滑膜蛋白融合蛋白。
[实施例4]在大肠杆菌中表达全长滑膜蛋白重组蛋白质
将含有编码实施例2所得滑膜蛋白的cDNA(1851bp；SEQ ID NO：1，第60-1910位)，且3’末端添加有两个流感病毒血凝素(HA)-标记分子的滑膜蛋白cDNA(syno-HAHA)插入谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白表达载体pGEX-5X-1，进行亚克隆。通过以42℃热激45秒，将已插入syno-HAHA基因的pGEX-5X-1导入BL21大肠杆菌菌株，获得BL21/syno-HAHA/pGEX-5X-1。在含有0.1mg/ml氨苄青霉素的LB培养基中培养该BL21菌株，加入0.1mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，于30℃再培养3小时以诱导N末端与GST融合、C末端与HA融合的滑膜蛋白蛋白质(GST-滑膜蛋白-HAHA)的表达。用PBS洗涤通过离心回收的BL21之后，用1mg/ml溶菌酶消化BL21，并用0.1％Triton X-100溶解。将得自BL21、含有溶解的GST-滑膜蛋白-HAHA蛋白的蛋白质悬浮液上样于谷胱甘肽Sepharose4B(GS4B)，然后用PBS洗涤，使用50mM还原型谷胱甘肽/Tris-HCl(pH 8.0)纯化合乎需要的GST-滑膜蛋白-HAHA蛋白。
通用PBS过200倍和2000倍地稀释用50mM还原型谷胱甘肽洗脱的级分，用25mM Tris-HCl(pH 6.8)、0.25％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.05％巯基乙醇和0.1％甘油对其进行处理，然后通过将它们上样于8％SDS聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)，即可进一步证实表达。SDS-PAGE之后，通过电印迹将GST-滑膜蛋白-HAHA蛋白转移至尼龙膜上。室温下用含有5％脱脂乳的PBS将所述尼龙膜封闭60分钟，然后在室温下与用含有5％脱脂乳的PBS稀释400倍的抗-HA单克隆抗体(Boehringer Mannheim)进行免疫反应达60分钟。反应之后，用0.1％吐温20/PBS洗涤，室温下与第二抗体，即经辣根过氧化物酶(HRP)标记的小鼠IgG抗体进行免疫反应达60分钟，用0.1％吐温20/PBS洗涤，通过检测HRP活性来检测靶抗原。使用ECL试剂盒(Amersham)进行HRP活性的检测(Clinical Chemistry，25，p1531，1979)。结果示于图2。由上述GST-滑膜蛋白-HAHA融合蛋白的分子量大小估计滑膜蛋白蛋白质的分子量约为80kDa。
[实施例5]体外表达全长滑膜蛋白重组蛋白质
用限制性酶EcoRI修饰滑膜蛋白基因(SEQ ID NO：1)的末端，插入pBluescript II KS载体(syno/pBluescript)。然后，使用syno/pBluescript(1μg)和与TNT-偶联的翻译系统(Promega)进行体外翻译以在体外将滑膜蛋白蛋白质表达成经[35S]-标记的蛋白质。将经[35S]-标记的滑膜蛋白蛋白质上样于10％SDS-PAGE，用图像分析仪(BAS2000，Fujix)检测其放射性。结果示于图3。发现体外翻译自滑膜蛋白基因的滑膜蛋白蛋白质基于SDS-PAGE的分子量约为80kDa。
[实施例6]通过Northern印迹证实滑膜蛋白基因的表达
通过一般方法，从实施例1中获得的得自RA患者的滑膜细胞、A549细胞系、Jurkat细胞系和HeLa细胞系中获得mRNA。通过1％琼脂糖凝胶电泳分离1μg上述mRNA，通过接触印迹将其转移至尼龙膜上。80℃处理尼龙膜2小时，42℃在Denhardt溶液中预杂交2小时。接着，使用经32P放射性标记的滑膜蛋白cDNA(1799bp；SEQ ID NO：1，第1233-3031位)作为探针，42℃杂交12小时。反应之后，用300mM NaCl和30mM柠檬酸钠洗涤尼龙膜，然后于50℃用15mM NaCl和1.5mM柠檬酸钠再次进行洗涤。通过暴露于X-射线胶片来检测所需的mRNA。图4显示了放射自显影的结果。发现得自RA患者的滑膜细胞中强表达滑膜蛋白基因。
[实施例7]通过Western印迹证实多种细胞中的滑膜蛋白表达
使用下述细胞为样品，通过Western印迹进一步证实滑膜蛋白的表达状态。
*实施例1中制备的得自RA患者的滑膜细胞
*人脐带血管内皮细胞(HUVEC)
*HEK(人胚胎肾)-293T
*实施例3中制备的GST-部分滑膜蛋白融合蛋白(阳性对照)
首先，将用作样品的多种细胞溶解于1％NP-40以制备细胞裂解液。用25mM Tris-HCl(pH 6.8)、0.25％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.05％巯基乙醇和0.1％甘油处理每一种细胞裂解液，然后用8％SDS聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)进行分离。SDS-PAGE之后，通过电印迹将得自多种细胞的蛋白质转移至硝酸纤维素(NC)膜上。在此NC膜上，用含有2.0mg/mL GST-部分滑膜蛋白融合蛋白和5％脱脂乳的Tris缓冲盐水(TBS)将抗-滑膜细胞抗血清稀释1000倍，室温下进行免疫反应达60分钟。另外，作为阴性对照，同时需进行相同抗体溶液与NC膜反应的实验，或抗体溶液中的GST-部分滑膜蛋白融合蛋白被GST替代的实验。反应之后，用0.1％吐温20/PBS洗涤NC膜，室温下与第二抗体，即经辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗-兔IgG抗体进行免疫反应达60分钟，用0.1％吐温20/PBS洗涤，通过检测HR活性来检测靶抗原。使用ECL试剂盒(Amersham)进行HRP活性的检测(ClinicalChemistry，25，p1531，1979)。结果示于图5。
GST-部分滑膜蛋白阻断了抗-滑膜细胞抗血清与220kDa蛋白质的免疫反应，所述蛋白质在对照实验(图5；+GST)中的得自RA患者的滑膜细胞中可以检测到，但在HUVEC和HEK-293细胞中却检测不到，GST-部分滑膜蛋白也部分阻断了所述抗血清与约140kDa蛋白质和约185kDa蛋白质的免疫反应(图5；+GST-部分滑膜蛋白)。
据推测，在除220-kDa带以外的带中观察到的反应性是通过它们与其它抗体的反应性而测定的纤连蛋白(分子量约为240kDa)或层粘连蛋白亚单位(分子量约为200kDa)。根据这些实验的结果，推测滑膜蛋白的分子量为220kDa。然而，实施例5中证实的滑膜蛋白分子量约为80kDa。从这两者的差异上看，可以相信滑膜蛋白具有在SDS中不解离的多聚体结构。
[实施例8]通过Western印迹证实得自RA患者的滑膜细胞中的滑膜蛋白蛋白表达
将实施例1中制备的得自RA患者的滑膜细胞溶解于1％NP-40以制备细胞提取物组分。用25mM Tris-HCl(pH 6.8)、0.25％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.05％巯基乙醇和0.1％甘油处理该滑膜细胞提取物，然后用8％SDS聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)进行分离。SDS-PAGE之后，通过电印迹将得自滑膜细胞的蛋白质转移至硝酸纤维素(NC)膜上。将此NC膜室温下用含有5％脱脂乳的Tris缓冲盐水(TBS)封闭1小时，然后用含有5％脱脂乳的Tris缓冲盐水(TBS)将通过免疫得自RA患者的滑膜细胞而获得的抗-滑膜细胞抗血清(在图中，免疫后)稀释1000倍，室温下进行免疫反应达1小时。同时，将用滑膜细胞免疫兔之前从兔中抽取的血清(免疫前)用作阴性对照。反应之后，用0.1％吐温20/PBS洗涤NC膜，室温下与第二抗体，即经辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗-兔IgG抗体进行免疫反应达1小时，用0.1％吐温20/PBS洗涤，通过检测HRP活性来检测靶抗原。使用ECL试剂盒(Amersham)进行HRP活性的检测(Clinical Chemistry，25，p1531，1979)。结果示于图6。
[实施例9]通过免疫染色证实多种细胞和滑膜组织中的滑膜蛋白表达
通过常规方法将滑膜细胞固定于玻璃载玻片上以进行免疫染色，使用实施例1的纯化抗-滑膜细胞抗血清进行免疫染色。用1％牛血清白蛋白(BSA)将样品封闭30分钟，室温下，使样品与用1％BSA稀释100倍的抗-滑膜细胞抗血清免疫反应60分钟。另外，在用抗血清进行观察的同时，使用纯化自该抗血清的纯化抗-滑膜细胞抗体进行实验。通过使用GST-部分滑膜蛋白融合蛋白作为配体进行免疫亲和纯化来制备纯化的抗-滑膜细胞抗体。所用的配体是将含有1799bp滑膜蛋白基因(SEQ ID NO：1的第1233-3031位)的GST-融合蛋白表达载体pGEX-5X-3转化至BL21之后表达的融合蛋白。通过Pharmacia公司的方法制备谷胱甘肽Sepharose柱，以制备GST-部分syno-GS柱。在使用纯化的抗-滑膜细胞抗体时，作为对照，使用了按照相同的方式，但将GST用作配体，经免疫亲和纯化抗血清所得的抗-GST抗体。
反应之后，用PBS洗涤样品，然后使用经异硫氰酸荧光素标记的抗-兔IgG抗体作为第二抗体进行免疫反应。用聚焦激光显微镜证实与抗-滑膜细胞抗血清进行免疫反应的抗原。结果示于图7。该抗血清表现出与得自RA患者的滑膜细胞的强免疫反应，经证实，实施例3中制备的GST-部分滑膜蛋白融合蛋白可以阻断该免疫反应(图7，上图)。另外，还证实了制备自该抗血清的纯化抗-滑膜细胞抗体的免疫反应甚至更强和更确定(图7，下图)。
通过常规方法将滑膜组织固定于玻璃载玻片上以对得自RA患者的滑膜组织进行染色。用1％BSA将样品封闭30分钟，室温下，使样品与用1％BSA稀释100倍的抗-滑膜细胞抗血清免疫反应60分钟。反应之后，用PBS洗涤样品，然后与第二抗体，即经HRP标记的抗-兔IgG抗体进行免疫反应。通过基于HRP活性的3，3’-二氨基联苯胺四盐酸化物显色来证实与抗-滑膜细胞抗血清发生免疫反应的抗原。按照与上述Western印迹相同的方式，使用GST-部分滑膜蛋白融合蛋白进行与滑膜组织染色有关的抗-滑膜细胞抗血清吸附试验。通过在抗-滑膜细胞抗血清中加入2.0mg/ml GST-部分滑膜蛋白融合蛋白或GST(2.0mg/ml)以进行组织染色。结果示于图8。发现GST-部分滑膜蛋白融合蛋白使对照中出现的抗-滑膜细胞抗血清对滑膜组织的染色变弱(图8)。另外，与得自GST-GS的抗体相比，发现使用上述得自GST-部分Syno-GS的纯化抗体的滑膜组织免疫染色反应呈强阳性(图9)。
根据Western印迹(实施例8)和免疫染色的结果，证实得自RA患者的滑膜细胞和滑膜组织中表达了能被抗-滑膜细胞抗血清识别的滑膜蛋白蛋白质。
[实施例10]RA患者的血清中抗-滑膜蛋白抗体的存在
本发明人尝试使用GST-部分滑膜蛋白融合蛋白作为抗原，通过Western印迹检测RA患者血清中的抗-滑膜蛋白抗体。使用与实施例7中相同的方法，首先，通过SDS-PAGE电泳GST-部分滑膜蛋白融合蛋白(100ng/泳道)，并转移至NC膜上。用Tris缓冲盐水(TBS)将RA患者血清(5例)稀释1000倍以用作第一抗体，室温下，与其上转移有GST-部分滑膜蛋白融合蛋白的NC膜进行免疫反应达60分钟。用0.1％吐温20/TBS洗涤NC膜，室温下与第二抗体，即经HRP标记的抗-人IgG抗体进行免疫反应达60分钟，用0.1％吐温20/TBS洗涤，通过检测HRP活性来检测与靶抗原反应的人IgG。按照与实施例7相同的方法进行HRP活性的检测。结果示于图10。在RA-患者(全部5个)的血清中发现了抗GST-部分滑膜蛋白融合蛋白的抗-IgG抗体(图10)。另一方面，在得自变形性关节病(OA)患者的血清和正常人的血清中未发现能识别GST-部分滑膜蛋白的抗体。
[实施例11]通过筛选表达文库来鉴定滑膜蛋白配体
使用得自实施例2中制备的RA患者滑膜细胞的cDNA表达文库进行滑膜蛋白配体的筛选(Tadaomi Takenawa，Toshiki Watanabe，eds.，Baiomanyuaru UP Shirizu“Tampakushitsu no Bunshikan Sogosayo Jikken Ho”[Bio-Manual UP Series“Protein Intermolecular Interaction ExperimentalMethod”]，pp.66-67，Yodosha Co.，Ltd.；Kaelin，W.G等，Cell 70，351-364，1992；Skolnik，E.Y等，Cell 65，83-90，1991；Sambrook，J等，Molecular Cloning，a laboratory manual second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press 12.16-12.20，1989)。通过于37℃保温20分钟，将文库噬菌体接种于大肠杆菌(XL1-Blue MRF’)，与顶层琼脂糖混合之后铺于平板上。42℃培养3.5小时之后，将硝酸纤维素膜浸泡于10mM IPTG中并干燥，然后将膜放置在平板上，于37℃再培养3.5小时。回收膜之后，在洗涤缓冲液[10mM Tris-HCl(pH8.0)、0.5％脱脂乳、0.1％Triton X-100、150mM NaCl、1mM EDTA、5mMMgCl2、1mM DTT、蛋白酶抑制剂(完全的，Boehringer Mannheim)]中洗涤5次，每次5分钟，在封闭缓冲液[10mM Tris-HCl(pH 8.0)、5％脱脂乳、0.1％Triton X-100、150mM NaCl、1mM EDTA、5mM MgCl2、1mM DTT、5％甘油、蛋白酶抑制剂(完全的，Boehringer Mannheim)]中浸泡1小时。用洗涤缓冲液洗涤5次，每次5分钟，加入用蛋白质激酶A进行32P-标记的GST-滑膜蛋白(实施例3中纯化的GST-部分滑膜蛋白融合蛋白)作为探针(约为106cpm/ml)，然后进行保温。更换洗涤缓冲液重复进行洗涤，直至每个膜的计数约为1kcpm，然后通过放射自显影检测信号。结果，获得与滑膜蛋白结合的克隆。将该克隆称为滑膜蛋白配体(SL)。
关于SL的cDNA，测定其5’末端附近的100bp和3’末端附近的100bp的核苷酸序列。根据所得的核苷酸序列信息进行数据库检索，发现末端100bp部分的序列与已知的被称为S1-5的基因[Lecka-Czernik，B等，Molecular and Cellular Biology，15，120-128，1995；登录号为U03877(cDNA)，AAA65590(蛋白质)，也称为“EFEMPl”：Stone，E.M等，Nature Genetics22，199-202，1999；登录号为Q12805(蛋白质)]相同。这两个基因的大小大致相同，其翻译产物的大小大致相同，这表明它们是相同的蛋白质。
[实施例12]通过Northern印迹表达SL基因
按照与实施例6相同的方法，从多种细胞中提取mRNA，使用实施例11中获得的SL cDNA作为探针进行Northern印迹。所用细胞如下。发现得自RA患者的滑膜细胞表现出SL基因的强表达(图11)。
HEK-293T
实施例1中制备的得自RA患者的滑膜细胞
A549
HeLa
[实施例13]滑膜蛋白与SL的结合
按照与实施例3相同的方法，将SL cDNA插入pGEX载体以制备GST-SL融合蛋白，将GST-SL(500ng)上样于10％SDS-PAGE，以GST(1μg)作为对照。SDS-PAGE之后，通过电印迹将其转移至尼龙膜上。室温下，用含有6M盐酸胍和5mM 2-巯基乙醇的50mM Tris-HCl(pH 8.0)将尼龙膜变性1小时，于4℃，在含有5mM 2-巯基乙醇和0.05％吐温20的50mM Tris-HCl(pH 8.0)中使尼龙膜再生过夜。用封闭缓冲液[10mM Tris-HCl(pH 8.0)，5％脱脂乳，0.1％Triton X-100，150mM NaCl，1mM EDTA，5mM MgCl2，1mM DTT，5％甘油，蛋白酶抑制剂(完全的，Boehringer Mannheim)]处理再生的尼龙膜，并用封闭缓冲液(除了0.5％脱脂乳外，其余与上述相同)洗涤。然后，使用与TNT-偶联的翻译系统(Promega)和pcDNA3-HA-滑膜蛋白-HAHA(SEQ ID NO：1滑膜蛋白cDNA 1851bp；插入表达载体pcDNA3中的、在第60-1910位添加有HA-标记的滑膜蛋白cDNA)进行体外翻译，将经[35S]-标记的HA-滑膜蛋白-HAHA融合蛋白([34S]HA-滑膜蛋白-HAHA)用作探针，室温下使尼龙膜上的GST-SL和GST反应2小时。用10mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.5％脱脂乳，0.1％Triton X-100，150mM NaCl，1mM EDTA，5mMMgCl2，1mM DTT和蛋白酶抑制剂(完全的，Boehringer Mannheim)洗涤所述尼龙膜，用图像分析仪(BAS2000，Fujix)检测其放射性。观察转移至尼龙膜上的GST-SL融合蛋白与[35S]HA-滑膜蛋白-HAHA之间的结合。另外，在GST和[35S]HA-滑膜蛋白-HAHA对照中未观察到结合(图12)。从此结果上看，可推测滑膜蛋白和SL通过蛋白质相互作用结合。
另外，在实施例14中，所得结果表明：通过培养物中基于滑膜蛋白的滑膜蛋白配体中和可阻断滑膜细胞的增殖。根据这些结果，可以认为具有对应于SL的滑膜蛋白结合位点之结构的SL突变体可能具有通过对滑膜蛋白与SL结合的拮抗阻断作用而抑制滑膜细胞增殖的作用。另外，具有对应于滑膜蛋白的SL结合位点之结构的滑膜蛋白突变体也有望具有与SL突变体相同的拮抗阻断作用。
[实施例14]MTT试验
使用实施例1中制备的得自RA患者的滑膜细胞制备96孔培养板，使得每孔有5×103个细胞，在细胞上清中加入GST或GST-部分滑膜蛋白，使得终浓度为0.01至1μM。培养3天后，在细胞上清中加入3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基-2H-溴化四唑(MTT)/PBS，在37℃和5％CO2的条件下培养3小时。培养之后，取出细胞上清，用二甲基亚砜溶解MTT甲臜的晶体，进行吸光度测定(Journal of Immunological Methods，65，55，1983)。在10％-FCS/DMEM，37℃，5％CO2的条件下，GST-部分滑膜蛋白能显著抑制得自RA患者的滑膜细胞增殖(1μM)(图13)。
[实施例15]制备导入了滑膜蛋白基因的小鼠
通过将Flag标记连接至编码滑膜蛋白蛋白质之DNA的N末端，并将poly(A)信号连接至3’方向的下游，构建导入滑膜蛋白基因的载体。根据以β-肌动蛋白启动子作为启动子，以人巨细胞病毒立即早期增强子作为增强子的pCAGGS(Niwa，H等，Gene 108：193-9，1991)来构建载体(图14)。
通过在显微镜下使用与操作器相连的显微玻璃移液管进行微量注射，将导入滑膜蛋白基因的载体注射至小鼠卵细胞中。将DNA注射至受精卵的雄前核中，将经注射操作的卵转移至通过与结扎输精管的雄性小鼠交配而诱导假孕的雌性小鼠(受体小鼠)的输卵管中。转移后19天，通过自然分娩或剖腹产获得幼鼠。进行剖腹产时，让单独制备的雌性小鼠作为养母来照顾幼鼠。从每只新生小鼠的尾部取DNA，使用PCR证实它携有转基因。
结果，在滑膜蛋白强表达的小鼠中，观察到明显的关节肿胀。发现导入滑膜蛋白基因的小鼠中关节病的发病率为33％(30只小鼠中有10只患病)。因此，可以认为关节肿胀不是自然发作的小鼠畸形(C57B6小鼠的脑积水发病率低于1％)，而是滑膜蛋白分子作用的结果。图15显示了滑膜蛋白强表达小鼠左后肢的软性X-射线照片。
[实施例16]关节的组织学研究
本发明人对导入滑膜蛋白基因的小鼠(1只)的脚趾关节进行了组织学研究。对脚趾关节部分的组织切片进行苏木精伊红(HE)染色。根据已知方法进行苏木精伊红染色。
HE染色的结果表明：在表现出关节病的部分出现伴随有显著滑膜增生的骨损坏和异常骨形成(图16)。另一方面，在用作对照的、导入基因的小鼠的正常脚趾关节中未观察到上述现象(图17，上图)。
另外，在脚趾关节中用抗-Flag抗体进行免疫染色，结果发现：导入滑膜蛋白基因的小鼠中表现出增生的滑膜组织和软骨细胞中存在滑膜蛋白表达(图18)，但在导入基因的小鼠的正常脚趾关节中未观察到上述现象(图17，下图)。
[实施例17]制备敲除小鼠
将lacZ基因插入小鼠滑膜蛋白基因片段的翻译起始位置(翻译第一个蛋氨酸的ATG密码子)以构建靶向载体。插入新霉素抗性(neo)基因以作为标记基因，还连接有白喉毒素A(DT-A)基因以排除发生非-同源重组的细胞系(图19)。
通过电穿孔将该靶向载体转移至小鼠ES细胞TT-2，选择发生同源重组的细胞系。将所得细胞注射至小鼠胚泡或8-细胞期胚胎，直接移植到代孕小鼠的输卵管中，或在培养1天以发育成胚泡之后移植到代孕小鼠的子宫内。然后，通过与制备转基因动物相同的方法制备敲除小鼠。使所得的杂合突变小鼠(F1)彼此交配以获得杂合和纯合突变的小鼠。在所得的突变小鼠中，在应该表达滑膜蛋白的组织中表达了LacZ蛋白(β-半乳糖苷酶)而不是骨膜蛋白。
通过Southern印迹分析证实基因型。从出生后约2周的野生型小鼠(14只)和滑膜蛋白杂合敲除小鼠(32只)的距尾端约3mm的点提取DNA。在立体显微镜下，从受孕后14.5天的滑膜蛋白纯合敲除小鼠的尾和前后肢中取样，并提取DNA。用限制性酶PstI消化所得的DNA待用。图20显示了分析结果。在野生型小鼠中检测到6.5kbp的带，在纯合突变的小鼠中检测到8.5kbp的带，而在杂合突变的小鼠中同时检测到这两条带。
通过Northern印迹进一步证实滑膜蛋白基因的表达。从野生型、杂合敲除小鼠和纯合敲除小鼠个体(受孕后12.5天的全胚胎)中提取mRNA，在1.2％琼脂糖凝胶中，每个泳道上样20μg进行电泳。结果，在纯合敲除小鼠(-/-)个体中未检测到滑膜蛋白mRNA，而杂合敲除小鼠(+/-)个体中的mRNA表达弱于野生型(+/+)个体(图21)。
[实施例18]研究滑膜蛋白表达位点
本发明人使用LacZ染色研究实施例17所得突变小鼠个体中的滑膜蛋白表达位点。即，使用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)染色全胚胎，并检查LacZ(作为β-半乳糖苷酶活性)表达的分布。所观察的胚胎数目为32。
结果，在受孕后12.5天的小鼠顶骨和四肢，以及受孕后13.5天的小鼠耳和四肢中发现了LacZ的强表达(图22)。所有这些都是骨或软骨的形成位点。另外，对四肢形成期的四肢组织切片进行LacZ染色和HE染色，结果在尖端外胚层嵴(AER)以及软骨和骨的原基(或软骨和骨)中观察到强表达(图23)。
另外，切下受孕后13天的肢芽，制备冻干切片。然后，进行苏木精伊红(HE)或LacZ染色。具体地说，用PBS(-)洗涤冻干切片三次，每次5分钟，将载有切片的玻璃载玻片浸入X-gal染色溶液[X-gal(20mg/ml)1.25ml，HEPES(1M)2.2ml，氰铁酸钾溶液(100mM)1.5ml，NaCl(5M)150μl，MgCl2(1M)65μl，10×PBS(-)5ml，加入milli-Q水(Millipore)至体积为50ml]，于37℃开始反应。染色之后，用乙醇系列和二甲苯进行脱水，并进行密封。结果，未分化的间充质细胞(骨和软骨原基)被LacZ染成了深蓝色(图24和25)。
[实施例19]研究表型
另外，本发明人还研究了滑膜蛋白基因敲除小鼠的表型。
在受孕后12.5天，与杂合小鼠相比，纯合小鼠表现出从顶骨区至臀部的长度缩短，并且头颅和四肢的形成不成熟，但在受孕后13天，杂合小鼠和野生型的表型没有显著差异(图26)。除此之外，未发现新生的纯合小鼠个体，在受孕后的至少17天之后，未发现活的纯合小鼠胚胎。因此，可以认为它们已胎死腹中(表1)。
表1
Figure C0182276100541
受孕14.5天，杂合小鼠和纯合小鼠从顶骨区至臀部的长度没有显著差异。然而，杂合小鼠中形成了脚趾和关节，但纯合小鼠中却未形成脚趾和关节，并且还出现了肢异常(图27)。
另外，对纯合小鼠表现出异常的后肢进行LacZ和HE染色，结果在AER和未分化的间充质细胞(未来的趾骨形成位置)集中的位点发现了反映滑膜蛋白表达的LacZ表达(图28)。
受孕15.5天，纯合小鼠死亡，表现出肢芽、上下颌和耳的形态学异常(图29)。另外，用爱茜蓝染色软骨组织，用茜素红染色骨(钙化)组织。即，除去小鼠的表皮、真皮和内容物，浸泡于固定液(乙醇∶双氧水＝9∶1)中，用乙醇系列脱水，然后用茜素红和爱茜蓝染色，用碱性溶液使组织变得透明。变得透明之后，将其置于甘油溶液中，观察染色。结果，在纯合小鼠中未发现软骨组织(染成蓝色)或骨(钙化)组织(染成红色)形成(图30)。
从上述结果看，滑膜蛋白基因敲除小鼠表现出胎儿期肢芽发育异常。另外，未发现软骨和骨的形成，在肢芽、软骨和骨的发育位置发现了滑膜蛋白表达。因此，完全可以相信滑膜蛋白分子能对骨骼形成起作用。
[实施例20]给滑膜蛋白基因敲除小鼠施用混合物以治疗关节炎
用胶原诱导的小鼠关节炎(CIA)被广泛用作人类风湿性关节炎的关节炎模型。给实施例17中制备的滑膜蛋白基因敲除小鼠(杂合型)和野生型小鼠施用抗-胶原抗体混合物，观察所引发的关节炎。结果发现：在滑膜蛋白杂合敲除小鼠中对关节炎的引发要弱于野生型小鼠(图31)。这些结果也支持以下事实：滑膜蛋白有助于诱导RA中的关节炎。
[实施例21]分析滑膜蛋白基因敲除小鼠的胎肢芽细胞的原代培养物
在(通过外植块法)得自敲除(KO)小鼠的细胞中，仅在被认为是软骨、骨和四肢原基的未分化的间充质细胞中发现了LacZ染色，即滑膜蛋白表达。另外，在胎肢芽细胞的原代培养物中，LacZ阳性集落(即表达滑膜蛋白的细胞)与爱茜蓝染色-阳性集落一致，另外，还在典型的双核软骨细胞中观察到LacZ(作为β-半乳糖苷酶活性)染色(滑膜蛋白表达)。这一结果支持滑膜蛋白参与骨和软骨分化的事实。另外，通过碱性磷酸酶染色、Kossa染色等方法，可以进一步证实：在得自纯合敲除小鼠的细胞中，形成骨和软骨的能力被延迟(图32-38)。
在Kossa染色中，洗涤细胞之后，溶液用硝酸银溶液(5％w/v)替代。用蒸馏水轻洗细胞之后，用硫代硫酸钠溶液(5％w/v)进行还原和固定。洗涤之后，用Kernechtrot溶液(0.1％w/v Kernechtrot(Nuclear Fast Red)，5％w/v硫酸铝)进行复染(Masaji Seki，Soshiki Kensa Ho-Soshiki Kozo to KyokushoKagaku-[Tissue Test Methods：Tissue Structure and Local Chemistry]，257-258，Kyorin-Shoin，1961；L.Lison，Tadashi Imaizumi，trans.，Histochimie etCytochimie Animales：Principes et Methodes[Animal Histochemistry andCytochemistry：Principles and Methods]，625-636，Hakusuisha Publishing Co.Ltd.，1962；Yutaka Sano，Soshikikagaku Kenkyu Ho-Riron toJutsushiki[Histochemistry Research Methods：Theory and Practice]，616-621，Nanzando Co.，Ltd.，1965)。用碱性磷酸酶组织染色试剂盒(Sigma，DiagnosticKits and Reagents，碱性磷酸酶(AP)，白细胞，目录号为86-R)进行碱性磷酸酶活性的检测。
[实施例22]使用得自滑膜蛋白基因敲除小鼠的细胞进行受试化合物试验
使用滑膜蛋白基因杂合敲除小鼠(嵌入了lacZ基因)的原代培养细胞，通过β-gal试验评价受试样品对滑膜蛋白基因表达的作用。以0,1×103、3×103、1×104、3×104和1×105个细胞/孔的量，将传代3次之后的滑膜蛋白基因杂合敲除小鼠的原代培养细胞接种于24孔培养板中，在含有10％胎牛血清的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)中培养过夜。首先，在没有刺激时，以足以完全覆盖细胞层的量(100μl/孔)在细胞培养物中加入细胞裂解溶液(Promega)。然后，将培养板转移至振荡的机器上，室温下缓慢振荡15分钟，使细胞层总浸泡在裂解溶液中。
按照下述方法测定细胞的β-半乳糖苷酶活性。在20μl所得细胞提取物溶液中加入1μl Mg溶液(0.1M MgCl2，4.5M β-巯基乙醇)、22μl ONPG溶液(邻硝基苯基-β-D-半乳吡喃糖苷)(溶于0.1M磷酸缓冲液(pH 7.5)，浓度为4mg/ml)，和57μl 0.1M磷酸缓冲液(pH 7.5)，使总体积为100μl。37℃保温6小时，同时注意不要使其变干。通过加入150μl 1M碳酸钠溶液(通过将21.2g碳酸钠溶解于水，调整至200ml并用0.45μm的滤器过滤而制备)以终止反应，通过测定420nm的光吸收值来定量β-半乳糖苷酶活性。平行进行3份实验。结果，在lacZ基因嵌入小鼠的细胞中检测到取决于细胞数目的β-半乳糖苷酶活性(图39)。本发明人证实使用β-半乳糖苷酶活性作为指标可以评价启动子活性(β-gal试验)。
接着，按照相同的方法，通过在原代培养细胞中加入多种药物来进行β-gal试验，然后，评价多种药物对滑膜蛋白启动子活性的作用。仅加入培养基进行相同的测定以用作阴性对照。所用试验药物是强的松龙(0.01-1μM)和12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酯(TPA；0.001-0.1μM)。强的松龙是类固醇抗-炎症药物，TPA是蛋白质激酶C激活剂。
在每孔中接种5×104个原代培养细胞，培养过夜之后，以上述浓度加入多种药物。加入药物之后，培养细胞72小时，测定每孔的β-半乳糖苷酶活性以评价启动子活性。结果，发现这些药物以浓度依赖性方式影响滑膜蛋白启动子活性(图40)。即，这证实了用基于本发明的试验系统可以评价药物对滑膜蛋白启动子的活性。从上述结果看，可以使用这种试验来评价多种药物对滑膜蛋白启动子活性的作用，因此，可以筛选出能促进或抑制滑膜蛋白启动子活性的化合物。
[实施例23]制备抗-滑膜蛋白单克隆抗体
按下述方法制备抗滑膜蛋白的单克隆抗体。合成下列三种含有人滑膜蛋白的部分氨基酸序列的肽作为免疫用的肽。这些氨基酸序列选自据推测具有抗原性的结构域。
Syno-P3(SLALTGAVVAHAYYC/SEQ ID NO：3)，
Syno-P2(TCRMDVLRASLPAQS/SEQ ID NO：4)，和
Syno-P1(GAATTTAAGTSATAC/SEQ ID NO：5)。
经由氨基酸序列内的Cys使匙孔戚血蓝蛋白(KLH)与每一种合成肽缀合。将50μg每种与KLH缀合的合成肽溶解于0.1ml生理盐水溶液中，加入0.1ml弗氏完全佐剂(FCA)以制备免疫原。将每种免疫原(0.2ml)皮下注射至8只小鼠(BALB/c雌性小鼠，5周龄)的后背，从而对其进行免疫。每两周进行一次免疫，总共进行4次，1周后再进行一次免疫。最后一次免疫后8天，从心脏取血以获得200μl或更多的血清。从经ELISA证实抗体滴度有所增加的个体中取脾细胞，然后进行细胞融合。
图41-43显示了通过ELISA测定三个个体的小鼠血清中与每种免疫原有关的抗体滴度的结果。对每种血清样品平行进行三份试验，图中显示的是平均值。当使用任一种免疫原时，都证实了抗体滴度有所增加的个体。因此，进一步证实了这些免疫原中的每一种都可以用作滑膜蛋白的免疫原。
以1∶10的比率混合骨髓瘤细胞系(P3U1)细胞和小鼠脾细胞，在50％PEG(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.的PEG1540)的存在下进行细胞融合。融合之后，接种96孔培养板，以使脾细胞计数为5×105/ml。将细胞在HAT培养基中培养10-14天之后，证实细胞生长并检测培养上清。使用固定有多种合成肽的ELISA板检测培养上清。检测方法如下。将培养上清与ELISA板反应之后，使用抗-小鼠IgG山羊-痘来选择阳性孔。选择用于克隆的孔，冻干和储存其它阳性孔的细胞。
几天后，以100个细胞/板的量将每个细胞株(20个细胞/ml)接种于一个96孔板中，培养10-14天。测定集落，对培养上清进行检测。通过将50μl上清液上样于上述固定有抗原的筛选用ELISA板，对培养上清进行检测。将抗-小鼠IgG山羊-痘用作第二抗体。培养之后，重新克隆选定的集落，培养10-14天。然后，按照与上述相同的方法进行集落测定和培养上清的检测。根据亲代细胞株选择孔，在24孔板中培养选定的克隆。回收上清液，检查克隆。然后，检测抗体亚类和抗体的产生。克隆的结果，使用Syno-P2(SEQ ID NO：4)作为免疫原，将两个克隆10Db和7Bc选择为能产生单克隆抗体的杂交瘤，所述抗体对滑膜蛋白具有高亲和性。
[实施例24]使用抗-滑膜蛋白单克隆抗体检测患者样品中的滑膜蛋白
<1>用抗-滑膜蛋白单克隆抗体对得自患者的滑膜细胞进行Western印迹
使用两种能识别实施例23中获得的Syno-P2的抗-滑膜蛋白单克隆抗体(10Db和7Bc)，通过SDS-PAGE分离得自类风湿性关节炎(RA)患者的滑膜细胞的蛋白质，并进行Western印迹。Western印迹的方法如实施例8所述，不同的是将实施例23中的单克隆抗体10Db和7Bc用作抗体，将抗-小鼠IgG绵羊-HRP用作标记抗体。同时分析得自变形性关节病(OA)患者的滑膜细胞以用作对照。结果，检测到特异于得自RA患者的滑膜细胞的信号(图44A)。证实实施例23中获得的单克隆抗体能特异性地识别RA患者的滑膜细胞。这些单克隆抗体可用于检测RA。
<2>用抗-滑膜蛋白单克隆抗体对得自RA患者的滑膜细胞进行荧光免疫染色
使用单克隆抗体10Db对得自RA患者的滑膜细胞进行荧光免疫细胞化学分析。免疫染色的方法如实施例9中所述，不同的是将实施例23中的单克隆抗体10Db用作抗体，将抗-小鼠IgG绵羊-FITC用作标记抗体。在得自RA患者的滑膜细胞中检测到强烈的滑膜蛋白蛋白信号，但在仅与第二抗体反应的对照中未检测到信号(图44B)。
<3>用抗-滑膜蛋白单克隆抗体对得自RA患者的滑膜组织进行免疫染色
使用单克隆抗体10Db和7Bc对取自RA患者的滑膜组织切片进行免疫染色。免疫染色的方法如实施例9中所述，不同的是将实施例23中的单克隆抗体10Db和7Bc用作抗体，将抗-小鼠IgG绵羊-HRP用作标记抗体。在得自RA患者的滑膜组织中检测到强烈的滑膜蛋白蛋白信号(图45)。通过同时进行的HE染色观察到滑膜细胞的增殖层，经证实该部分被单克隆抗体染色。根据这些结果，可以证实本发明的单克隆抗体特异性地识别RA患者的滑膜组织。如上所述，通过使用滑膜蛋白抗体检测患者样品中的滑膜蛋白，即可进行RA检验和诊断。
[实施例25]检测滑膜蛋白的遍在蛋白连接酶活性
已知E3遍在蛋白-蛋白质连接酶会遭受自身-遍在蛋白化(Hashizume R等，J.Biol.Chem.276，14537-14540，2001)。因此，本发明人研究了滑膜蛋白是否具有自身-遍在蛋白化活性。将FLAG-滑膜蛋白基因插入pCAGGS载体，将所得质粒转染至HEK-293细胞，36小时之后回收细胞。用缓冲液A[15mM Tris-HCl pH 7.5，0.5M NaCl，0.35％NP-40，1mM PMSF，2μg/m1抑蛋白酶肽，2μg/ml亮抑蛋白酶肽]获得细胞提取物。用高速离心机离心细胞提取物。在0.6ml上清液中加入3μg抗-FLAG抗体和7.5μl A蛋白珠，进行免疫沉淀过夜。用缓冲液A或加入了0.1％SDS的缓冲液A将珠洗涤3次，然后用缓冲液B[25mM Tris-HCl pH 7.5，50mM NaCl，0.01％Nonidet P-40，10％甘油，1mM EDTA]洗涤2次。然后，加入30μl遍在蛋白连接酶反应溶液[50mM Tris-HCl pH 7.4，5mM MgCl2，2mM NaF，10nM冈田酸，2mM ATP，0.6mM DTT，1.5μg GST-HA-遍在蛋白，40ng得自酵母的E1，0.3μgUbcH5c(E2)]，37℃反应30分钟。加入30μl含有0.1M DTT的2×Laemmli SDS-上样缓冲液并煮沸。然后，通过SDS-PAGE进行分级分离并转移至硝酸纤维素膜。将抗-FLAG抗体(SIGMA)和抗-HA抗体(Roche Diagnostics)用作第一抗体。按照与实施例7相同的方法进行HRP活性检测。作为对照，使用了仅被FLAG-滑膜蛋白基因转染的细胞的提取物(在免疫沉淀之前)，以及通过对细胞提取物(即仅为FLAG-滑膜蛋白蛋白及其免疫复合物)进行免疫沉淀而获得的溶液。另外，不加GST-HA-遍在蛋白、ATP、E1和E2中的任何一种以进行反应(当不加GST-HA-遍在蛋白时，使用GST进行反应)。图46显示了使用滑膜蛋白的结果，所述滑膜蛋白通过用含有0.1％SDS的缓冲液A洗涤而被免疫纯化。在用抗-HA抗体进行印迹时，检测到大于滑膜蛋白分子量(图46中的*)的大小约为35kDa的带(图46中的箭头)。在用抗-FLAG抗体进行印迹时，也观察到该带，可以认为该蛋白质带是与滑膜蛋白融合的GST-HA-遍在蛋白。另外，缺失ATP、E1和E2中的任一种的反应系统表明：未发生滑膜蛋白的自身-遍在蛋白化。当仅用缓冲液A洗涤珠时获得了相同的结果。从这些结果可以明显地看出1)E1-和E2-依赖型遍在蛋白连接酶活性存在于含有滑膜蛋白的免疫复合物中，并且，从免疫纯化的结果看，2)滑膜蛋白具有E3遍在蛋白-蛋白质连接酶活性。
工业实用性
本发明提供了编码新蛋白质的基因“滑膜蛋白”，所述蛋白质对滑膜的发育和骨、软骨和四肢的发育起作用。本发明的基因与RA有关，RA患者体内产生了抗该基因产物的抗体。本发明的基因和蛋白质成为可用于诊断RA的新标记。RA患者的关节滑膜细胞中强表达本发明的“滑膜蛋白”，所述滑膜蛋白可用于通过原位杂交和原位PCR诊断RA和判断疗效。另外，在RA患者的血液中可以高频率地检测到抗滑膜蛋白抗体。使用该抗体作为标记可以特异性诊断RA。本发明提供的滑膜蛋白蛋白质或其部分肽可用于检测患者血清中的抗滑膜蛋白抗体。
另外，未分化的间充质细胞中也表达滑膜蛋白。如果将滑膜蛋白用作细胞标记，则可以从胎细胞等中回收未分化的间充质细胞。未分化的间充质细胞是分化成骨和软骨的细胞，它有望用于再生医学。即，如果使用滑膜蛋白作为细胞标记而回收的未分化的间充质细胞是在体外或体内分化的，即可进行骨或软骨的形成或关节的重构，这样就可以使受损的骨、软骨组织或关节重新再生。
已证实本发明的滑膜蛋白及其配体与RA的主要病理学，即关节滑膜细胞增殖有密切的关系。因此，本发明提供的滑膜蛋白或其配体为开发RA治疗方法提供了重要的信息。更具体地，通过筛选参与滑膜蛋白与其配体之间的结合的化合物，可以采取与以前完全不同的方法来进行RA治疗技术的开发。另外，在滑膜蛋白转基因小鼠中，高频率出现关节滑膜增生和伴随有关节炎的脚趾关节肿胀。本发明提供的滑膜蛋白转基因动物作为开发治疗技术和药物的RA模型十分有用。
序列表
<110>罗克莫基因株式会社(Locomogene，Inc.)
<120>滑膜细胞蛋白
<130>BHP-A0001Y1P
<140>
<141>
<150>JP 2000-405082
<151>2000-12-22
<150>JP 2001-266492
<151>2001-06-27
<160>7
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>3374
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(403)..(2256)
<400>1
gccctttctt atgagcatgc ctgtgttggg ttgacagtga gggtaataat gacttgttgg  60
ttgattgtag atatagggct ctcccttgca aggtaattag gctccttaaa ttacctgtaa 120
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                                               Met Phe Arg Thr
                                                 1
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Ala Val Met Met Ala Ala Ser Leu Ala Leu Thr Gly Ala Val Val Ala
  5                  10                  15                  20
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His Ala Tyr Tyr Leu Lys His Gln Phe Tyr Pro Thr Val Val Tyr Leu
                 25                  30                  35
acc aag tcc agc ccc agc atg gca gtc ctg tac atc cag gcc ttt gtc   558
Thr Lys Ser Ser Pro Ser Met Ala Val Leu Tyr Ile Gln Ala Phe Val
             40                  45                  50
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Leu Val Phe Leu Leu Gly Lys Val Met Gly Lys Val Phe Phe Gly Gln
        55                   60                  65
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Leu Arg Ala Ala Glu Met Glu His Leu Leu Glu Arg Ser Trp Tyr Ala
     70                  75                  80
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 85                  90                  95                 100
ccc cgc ttt gtt gca ctc ttc act ctt ctt ctc ttc ctc aaa tgt ttc   750
Pro Arg Phe Val Ala Leu Phe Thr Leu Leu Leu Phe Leu Lys Cys Phe
                105                 110                 115
cac tgg ctg gct gag gac cgt gtg gac ttt atg gaa cgc agc ccc aac   798
His Trp Leu Ala Glu Asp Arg Val Asp Phe Met Glu Arg Ser Pro Asn
            120                 125                 130
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        135                 140                 145
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Val Asp Leu Gln Ser Glu Asn Pro Trp Asp Asn Lys Ala Val Tyr Met
            200                 205                 210
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Leu Tyr Thr Glu Leu Phe Thr Gly Phe Ile Lys Val Leu Leu Tyr Met
        215                 220                 225
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Ala Phe Met Thr Ile Met Ile Lys Val His Thr Phe Pro Leu Phe Ala
    230                 235                 240
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Ile Arg Pro Met Tyr Leu Ala Met Arg Gln Phe Lys Lys Ala Val Thr
245                 250                 255                 260
gat gcc atc atg tct cgc cga gcc atc cgc aac atg aac acc ctg tat   1230
Asp Ala Ile Met Ser Arg Arg Ala Ile Arg Asn Met Asn Thr Leu Tyr
                265                 270                 275
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Pro Asp Ala Thr Pro Glu Glu Leu Gln Ala Met Asp Asn Val Cys Ile
            280                 285                 290
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Ile Cys Arg Glu Glu Met Val Thr Gly Ala Lys Arg Leu Pro Cys Asn
        295                 300                 305
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His Ile Phe His Thr Ser Cys Leu Arg Ser Trp Phe Gln Arg Gln Gln
    310                 315                 320
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Thr Cys Pro Thr Cys Arg Met Asp Val Leu Arg Ala Ser Leu Pro Ala
325                 330                 335                 340
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Gln Ser Pro Pro Pro Pro Glu Pro Ala Asp Gln Gly Pro Pro Pro Ala
                345                 350                 355
ccc cac ccc cca cca ctc ttg cct cag ccc ccc aac ttc ccc cag ggc   1518
Pro His Pro Pro Pro Leu Leu Pro Gln Pro Pro Asn Phe Pro Gln Gly
            360                 365                 370
ctc ctg cct cct ttt cct cca ggc atg ttc cca ctg tgg ccc ccc atg   1566
Leu Leu Pro Pro Phe Pro Pro Gly Met Phe Pro Leu Trp Pro Pro Met
        375                 380                 385
ggc ccc ttt cca cct gtc ccg cct ccc ccc agc tca gga gag gct gtg   1614
Gly Pro Phe Pro Pro Val Pro Pro Pro Pro Ser Ser Gly Glu Ala Val
    390                 395                 400
gct cct cca tcc acc agt gca gca gcc ctt tct cgg ccc agt gga gca   1662
Ala Pro Pro Ser Thr Ser Ala Ala Ala Leu Ser Arg Pro Ser Gly Ala
405                 410                 415                 420
gct aca acc aca gct gct ggc acc agt gct act gct gct tct gcc aca   1710
Ala Thr Thr Thr Ala Ala Gly Thr Ser Ala Thr Ala Ala Ser Ala Thr
                425                 430                 435
gca tct ggc cca ggc tct ggc tct gcc cca gag gct ggc cct gcc cct   1758
Ala Ser Gly Pro Gly Ser Gly Ser Ala Pro Glu Ala Gly Pro Ala Pro
            440                 445                 450
ggt ttc ccc ttc cct cct ccc tgg atg ggt atg ccc ctg cct cca ccc   1806
Gly Phe Pro Phe Pro Pro Pro Trp Met Gly Met Pro Leu Pro Pro Pro
        455                 460                 465
ttt gcc ttc ccc cca atg cct gtg ccc cct gcg ggc ttt gct ggg ctg   1854
Phe Ala Phe Pro Pro Met Pro Val Pro Pro Ala Gly Phe Ala Gly Leu
    470                 475                 480
acc cca gag gag cta cga gct ctg gag ggc cat gag cgg cag cac ctg   1902
Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Leu Glu Gly His Glu Arg Gln His Leu
485                 490                 495                 500
gag gcc cgg ctg cag agc ctg cgt aac atc cac aca ctg ctg gac gcc   1950
Glu Ala Arg Leu Gln Ser Leu Arg Asn Ile His Thr Leu Leu Asp Ala
                505                 510                 515
gcc atg ctg cag atc aac cag tac ctc acc gtg ctg gcc tcc ttg ggg   1998
Ala Met Leu Gln Ile Asn Gln Tyr Leu Thr Val Leu Ala Ser Leu Gly
            520                 525                 530
ccc ccc cgg cct gcc act tca gtc aac tcc act gag ggg act gcc act   2046
Pro Pro Arg Pro Ala Thr Ser Val Asn Ser Thr Glu Gly Thr Ala Thr
        535                 540                 545
aca gtt gtt gct gct gcc tcc tcc acc agc atc cct agc tca gag gcc   2094
Thr Val Val Ala Ala Ala Ser Ser Thr Ser Ile Pro Ser Ser Glu Ala
    550                 555                 560
acg acc cca acc cca gga gcc tcc cca cca gcc cct gaa atg gaa agg   2142
Thr Thr Pro Thr Pro Gly Ala Ser Pro Pro Ala Pro Glu Met Glu Arg
565                 570                 575                 580
cct cca gct cct gag tca gtg ggc aca gag gag atg cct gag gat gga   2190
Pro Pro Ala Pro Glu Ser Val Gly Thr Glu Glu Met Pro Glu Asp Gly
                585                 590                 595
gag ccc gat gca gca gag ctc cgc cgg cgc cgc ctg cag aag ctg gag   2238
Glu Pro Asp Ala Ala Glu Leu Arg Arg Arg Arg Leu Gln Lys Leu Glu
            600                 605                 610
tct cct gtt gcc cac tga cactgcccca gcccagcccc agcctctgct          2286
Ser Pro Val Ala His
        615
cttttgagca gccctcgctg gaacatgtcc tgccaccaag tgccagctcc ctctctgtct 2346
gcaccaggga gtagtacccc cagctctgag aaagaggcgg catcccctag gccaagtgga 2406
aagaggctgg ggttcccatt tgactccagt cccaggcagc catggggatc tcgggtcagt 2466
tccagccttc ctctccaact cttcagccct gtgttctgct ggggccatga aggcagaagg 2526
tttagcctct gagaagccct cttcttcccc cacccctttc caggagaagg ggctgcccct 2586
ccaagcccta cttgtatgtg cggagtcaca ctgcagtgcc gaacagtatt agctcccgtt 2646
cccaagtgtg gactccagag gggctggagg caagctatga acttgctcgc tggcccaccc 2706
ctaagactgg tacccatttc cttttcttac cctgatctcc ccagaagcct cttgtggtgg 2766
tggctgtgcc ccctatgccc tgtggcattt ctgcgtctta ctggcaacca cacaactcag 2826
ggaaaggaat gcctgggagt gggggtgcag gcgggcagca ctgagggacc ctgccccgcc 2886
cctcccccca ggcccctttc ccctgcagct tctcaagtga gactgacctg tctcacccag 2946
cagccactgc ccagccgcac tccaggcaag ggccagtgcg cctgctcctg accactgcaa 3006
tcccagcgcc caaggaaggc cacttctcaa ctggcagaac ttctgaagtt tagaattgga 3066
attacttcct tactagtgtc ttttggctta aattttgtct tttgaagttg aatgcttaat 3126
cccgggaaag aggaacagga gtgccagact cctggtcttt ccagtttaga aaaggctctg 3186
tgccaaggag ggaccacagg agctgggacc tgcctgcccc tgtcctttcc ccttggtttt 3246
gtgttacaag agttgttgga gacagtttca gatgattatt taatttgtaa atattgtaca 3306
aattttaata gcttaaattg tatatacagc caaataaaaa cttgcattaa caaaaaaaaa 3366
aaaaaaaa                                                          3374
<210>2
<211>617
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
Met Phe Arg Thr Ala Val Met Met Ala Ala Ser Leu Ala Leu Thr Gly
  1               5              10                      15
Ala Val Val Ala His Ala Tyr Tyr Leu Lys His Gln Phe Tyr Pro Thr
             20              25                      30
Val Val Tyr Leu Thr Lys Ser Ser Pro Ser Met Ala Val Leu Tyr Ile
         35              40                      45
Gln Ala Phe Val Leu Val Phe Leu Leu Gly Lys Val Met Gly Lys Val
     50              55                      60
Phe Phe Gly Gln Leu Arg Ala Ala Glu Met Glu His Leu Leu Glu Arg
 65              70                      75                  80
Ser Trp Tyr Ala Val Thr Glu Thr Cys Leu Ala Phe Thr Val Phe Arg
                 85                  90                  95
Asp Asp Phe Ser Pro Arg Phe Val Ala Leu Phe Thr Leu Leu Leu Phe
            100                 105                 110
Leu Lys Cys Phe His Trp Leu Ala Glu Asp Arg Val Asp Phe Met Glu
        115                 120                 125
Arg Ser Pro Asn Ile Ser Trp Leu Phe His Cys Arg Ile Val Ser Leu
    130                 135                 140
Met Phe Leu Leu Gly Ile Leu Asp Phe Leu Phe Val Ser His Ala Tyr
145                 150                 155                 160
His Ser Ile Leu Thr Arg Gly Ala Ser Val Gln Leu Val Phe Gly Phe
                165                 170                 175
Glu Tyr Ala Ile Leu Met Thr Met Val Leu Thr Ile Phe Ile Lys Tyr
            180                 185                 190
Val Leu His Ser Val Asp Leu Gln Ser Glu Asn Pro Trp Asp Asn Lys
        195                 200                 205
Ala Val Tyr Met Leu Tyr Thr Glu Leu Phe Thr Gly Phe Ile Lys Val
    210                 215                 220
Leu Leu Tyr Met Ala Phe Met Thr Ile Met Ile Lys Val His Thr Phe
225                 230                 235                 240
Pro Leu Phe Ala Ile Arg Pro Met Tyr Leu Ala Met Arg Gln Phe Lys
                245                 250                 255
Lys Ala Val Thr Asp Ala Ile Met Ser Arg Arg Ala Ile Arg Asn Met
            260                 265                 270
Asn Thr Leu Tyr Pro Asp Ala Thr Pro Glu Glu Leu Gln Ala Met Asp
        275                 280                 285
Asn Val Cys Ile Ile Cys Arg Glu Glu Met Val Thr Gly Ala Lys Arg
    290                 295                 300
Leu Pro Cys Asn His Ile Phe His Thr Ser Cys Leu Arg Ser Trp Phe
305                 310                 315                 320
Gln Arg Gln Gln Thr Cys Pro Thr Cys Arg Met Asp Val Leu Arg Ala
                325                 330                 335
Ser Leu Pro Ala Gln Ser Pro Pro Pro Pro Glu Pro Ala Asp Gln Gly
            340                 345                 350
Pro Pro Pro Ala Pro His Pro Pro Pro Leu Leu Pro Gln Pro Pro Asn
        355                 360                 365
Phe Pro Gln Gly Leu Leu Pro Pro Phe Pro Pro Gly Met Phe Pro Leu
    370                 375                 380
Trp Pro Pro Met Gly Pro Phe Pro Pro Val Pro Pro Pro Pro Ser Ser
385                 390                 395                 400
Gly Glu Ala Val Ala Pro Pro Ser Thr Ser Ala Ala Ala Leu Ser Arg
                405                 410                 415
Pro Ser Gly Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Gly Thr Ser Ala Thr Ala
            420                 425                 430
Ala Ser Ala Thr Ala Ser Gly Pro Gly Ser Gly Ser Ala Pro Glu Ala
        435                 440                 445
Gly Pro Ala Pro Gly Phe Pro Phe Pro Pro Pro Trp Met Gly Met Pro
    450                 455                 460
Leu Pro Pro Pro Phe Ala Phe Pro Pro Met Pro Val Pro Pro Ala Gly
465                 470                 475                 480
Phe Ala Gly Leu Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Leu Glu Gly His Glu
                485                 490                 495
Arg Gln His Leu Glu Ala Arg Leu Gln Ser Leu Arg Asn Ile His Thr
            500                 505                 510
Leu Leu Asp Ala Ala Met Leu Gln Ile Asn Gln Tyr Leu Thr Val Leu
        515                 520                 525
Ala Ser Leu Gly Pro Pro Arg Pro Ala Thr Ser Val Asn Ser Thr Glu
    530                 535                 540
Gly Thr Ala Thr Thr Val Val Ala Ala Ala Ser Ser Thr Ser Ile Pro
545                 550                 555                 560
Ser Ser Glu Ala Thr Thr Pro Thr Pro Gly Ala Ser Pro Pro Ala Pro
                565                 570                 575
Glu Met Glu Arg Pro Pro Ala Pro Glu Ser Val Gly Thr Glu Glu Met
            580                 585                 590
Pro Glu Asp Gly Glu Pro Asp Ala Ala Glu Leu Arg Arg Arg Arg Leu
        595                 600                 605
Gln Lys Leu Glu Ser Pro Val Ala His
    610                 615
<210>3
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：人工合成的序列
<400>3
Ser Leu Ala Leu Thr Gly Ala Val Val Ala His Ala Tyr Tyr Cys
  1               5                  10                  15
<210>4
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：人工合成的序列
<400>4
Thr Cys Arg Met Asp Val Leu Arg Ala Ser Leu Pro Ala Gln Ser
  1               5                  10                  15
<210>5
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的说明：人工合成的序列
<400>5
Gly Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Gly Thr Ser Ala Thr Ala Cys
  1               5                  10                  15
<210>6
<211>3028
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(60)..(1910)
<400>6
gcagtcgcgc ggattgagcg ggctcgcggc gctgggttcc tggtctccgg gccagggca   59
atg ttc cgc acg gca gtg atg atg gcg gcc agc ctg gcg ctg acc ggg   107
Met Phe Arg Thr Ala Val Met Met Ala Ala Ser Leu Ala Leu Thr Gly
  1               5                  10                  15
gct gtg gtg gct cac gcc tac tac ctc aaa cac cag ttc tac ccc act   155
Ala Val Val Ala His Ala Tyr Tyr Leu Lys His Gln Phe Tyr Pro Thr
             20                  25                  30
gtg gtg tac ctg acc aag tcc agc ccc agc atg gca gtc ctg tac atc   203
Val Val Tyr Leu Thr Lys Ser Ser Pro Ser Met Ala Val Leu Tyr Ile
         35                  40                  45
cag gcc ttt gtc ctt gtc ttc ctt ctg ggc aag gtg atg ggc aag gtg   251
Gln Ala Phe Val Leu Val Phe Leu Leu Gly Lys Val Met Gly Lys Val
     50                  55                  60
ttc ttt ggg caa ctg agg gca gca gag atg gag cac ctt ctg gaa cgt   299
Phe Phe Gly Gln Leu Arg Ala Ala Glu Met Glu His Leu Leu Glu Arg
 65                  70                   75                 80
tcc tgg tac gcc gtc aca gag act tgt ctg gcc ttc acc gtt ttt cgg    347
Ser Trp Tyr Ala Val Thr Glu Thr Cys Leu Ala Phe Thr Val Phe Arg
                 85                  90                  95
gat gac ttc agc ccc cgc ttt gtt gca ctc ttc act ctt ctt ctc ttc   395
Asp Asp Phe Ser Pro Arg Phe Val Ala Leu Phe Thr Leu Leu Leu Phe
            100                 105                 110
ctc aaa tgt ttc cac tgg ctg gct gag gac cgt gtg gac ttt atg gaa   443
Leu Lys Cys Phe His Trp Leu Ala Glu Asp Arg Val Asp Phe Met Glu
        115                 120                 125
cgc agc ccc aac atc tcc tgg ctc ttt cac tgc cgc att gtc tct ctt   491
Arg Ser Pro Asn Ile Ser Trp Leu Phe His Cys Arg Ile Val Ser Leu
    130                 135                 140
atg ttc ctc ctg ggc atc ctg gac ttc ctc ttc gtc agc cac gcc tat   539
Met Phe Leu Leu Gly Ile Leu Asp Phe Leu Phe Val Ser His Ala Tyr
145                 150                 155                 160
cac agc atc ctg acc cgt ggg gcc tct gtg cag ctg gtg ttt ggc ttt   587
His Ser Ile Leu Thr Arg Gly Ala Ser Val Gln Leu Val Phe Gly Phe
                165                 170                 175
gag tat gcc atc ctg atg acg atg gtg ctc acc atc ttc atc aag tat   635
Glu Tyr Ala Ile Leu Met Thr Met Val Leu Thr Ile Phe Ile Lys Tyr
            180                 185                 190
gtg ctg cac tcc gtg gac ctc cag agt gag aac ccc tgg gac aac aag   683
Val Leu His Ser Val Asp Leu Gln Ser Glu Asn Pro Trp Asp Asn Lys
        195                 200                 205
gct gtg tac atg ctc tac aca gag ctg ttt aca ggc ttc atc aag gtt   731
Ala Val Tyr Met Leu Tyr Thr Glu Leu Phe Thr Gly Phe Ile Lys Val
    210                 215                 220
ctg ctg tac atg gcc ttc atg acc atc atg atc aag gtg cac acc ttc   779
Leu Leu Tyr Met Ala Phe Met Thr Ile Met Ile Lys Val His Thr Phe
225                 230                 235                 240
cca ctc ttt gcc atc cgg ccc atg tac ctg gcc atg aga cag ttc aag   827
Pro Leu Phe Ala Ile Arg Pro Met Tyr Leu Ala Met Arg Gln Phe Lys
                245                 250                 255
aaa gct gtg aca gat gcc atc atg tct cgc cga gcc atc cgc aac atg    875
Lys Ala Val Thr Asp Ala Ile Met Ser Arg Arg Ala Ile Arg Asn Met
            260                 265                 270
aac acc ctg tat cca gat gcc acc cca gag gag ctc cag gca atg gac    923
Asn Thr Leu Tyr Pro Asp Ala Thr Pro Glu Glu Leu Gln Ala Met Asp
        275                 280                 285
aat gtc tgc atc atc tgc cga gaa gag atg gtg act ggt gcc aag aga    971
Ash Val Cys Ile Ile Cys Arg Glu Glu Met Val Thr Gly Ala Lys Arg
    290                 295                 300
ctg ccc tgc aac cac att ttc cat acc agc tgc ctg cgc tcc tgg ttc   1019
Leu Pro Cys Asn His Ile Phe His Thr Ser Cys Leu Arg Ser Trp Phe
305                 310                 315                 320
cag cgg cag cag acc tgc ccc acc tgc cgt atg gat gtc ctt cgt gca   1067
Gln Arg Gln Gln Thr Cys Pro Thr Cys Arg Met Asp Val Leu Arg Ala
                325                 330                 335
tcg ctg cca gcg cag tca cca cca ccc ccg gag cct gcg gat cag ggg   1115
Ser Leu Pro Ala Gln Ser Pro Pro Pro Pro Glu Pro Ala Asp Gln Gly
            340                 345                 350
cca ccc cct gcc ccc cac ccc cca cca ctc ttg cct cag ccc ccc aac   1163
Pro Pro Pro Ala Pro His Pro Pro Pro Leu Leu Pro Gln Pro Pro Asn
        355                 360                 365
ttc ccc cag ggc ctc ctg cct cct ttt cct cca ggc atg ttc cca ctg   1211
Phe Pro Gln Gly Leu Leu Pro Pro Phe Pro Pro Gly Met Phe Pro Leu
    370                 375                 380
tgg ccc ccc atg ggc ccc ttt cca cct gtc ccg cct ccc ccc agc tca   1259
Trp Pro Pro Met Gly Pro Phe Pro Pro Val Pro Pro Pro Pro Ser Ser
385                 390                 395                 400
gga gag gct gtg gct cct cca tcc acc agt gca gcc ctt tct cgg ccc   1307
Gly Glu Ala Val Ala Pro Pro Ser Thr Ser Ala Ala Leu Ser Arg Pro
                405                 410                 415
agt gga gca gct aca acc aca gct gct ggc acc agt gct act gct gct   1355
Ser Gly Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Gly Thr Ser Ala Thr Ala Ala
            420                 425                 430
tct gcc aca gca tct ggc cca ggc tct ggc tct gcc cca gag gct ggc   1403
Ser Ala Thr Ala Ser Gly Pro Gly Ser Gly Ser Ala Pro Glu Ala Gly
        435                 440                 445
cct gcc cct ggt ttc ccc ttc cct cct ccc tgg atg ggt atg ccc ctg   1451
Pro Ala Pro Gly Phe Pro Phe Pro Pro Pro Trp Met Gly Met Pro Leu
    450                 455                 460
cct cca ccc ttt gcc ttc ccc cca atg cct gtg ccc cct gcg ggc ttt   1499
Pro Pro Pro Phe Ala Phe Pro Pro Met Pro Val Pro Pro Ala Gly Phe
465                 470                 475                 480
gct ggg ctg acc cca gag gag cta cga gct ctg gag ggc cat gag cgg   1547
Ala Gly Leu Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Leu Glu Gly His Glu Arg
                485                 490                 495
cag cac ctg gag gcc cgg ctg cag agc ctg cgt aac atc cac aca ctg   1595
Gln His Leu Glu Ala Arg Leu Gln Ser Leu Arg Asn Ile His Thr Leu
            500                 505                 510
ctg gac gcc gcc atg ctg cag atc aac cag tac ctc acc gtg ctg gcc   1643
Leu Asp Ala Ala Met Leu Gln Ile Asn Gln Tyr Leu Thr Val Leu Ala
        515                 520                 525
tcc ttg ggg ccc ccc cgg cct gcc act tca gtc aac tcc act gag ggg   1691
Ser Leu Gly Pro Pro Arg Pro Ala Thr Ser Val Asn Ser Thr Glu Gly
    530                 535                 540
act gcc act aca gtt gtt gct gct gcc tcc tcc acc agc atc cct agc   1739
Thr Ala Thr Thr Val Val Ala Ala Ala Ser Ser Thr Ser Ile Pro Ser
545                 550                 555                 560
tca gag gcc acg acc cca acc cca gga gcc tcc cca cca gcc cct gaa   1787
Ser Glu Ala Thr Thr Pro Thr Pro Gly Ala Ser Pro Pro Ala Pro Glu
                565                 570                 575
atg gaa agg cct cca gct cct gag tca gtg ggc aca gag gag atg cct   1835
Met Glu Arg Pro Pro Ala Pro Glu Ser Val Gly Thr Glu Glu Met Pro
            580                 585                 590
gag gat gga gag ccc gat gca gca gag ctc cgc cgg cgc cgc ctg cag   1883
Glu Asp Gly Glu Pro Asp Ala Ala Glu Leu Arg Arg Arg Arg Leu Gln
        595                 600                 605
aag ctg gag tct cct gtt gcc cac tga cactgcccca gcccagcccc         1930
Lys Leu Glu Ser Pro Val Ala His
    610                 615
agcctctgct cttttgagca gccctcgctg gaacatgtcc tgccaccaag tgccagctcc 1990
ctctctgtct gcaccaggga gtagtacccc cagctctgag aaagaggcgg catcccctag 2050
gccaagtgga aagaggctgg ggttcccatt tgactccagt cccaggcagc catggggatc 2110
tcgggtcagt tccagccttc ctctccaact cttcagccct gtgttctgct ggggccatga 2170
aggcagaagg tttagcctct gagaagccct cttcttcccc cacccctttc caggagaagg 2230
ggctgcccct ccaagcccta cttgtatgtg cggagtcaca ctgcagtgcc gaacagtatt 2290
agctcccgtt cccaagtgtg gactccagag gggctggagg caagctatga acttgctcgc 2350
tggcccaccc ctaagactgg tacccatttc cttttcttac cctgatctcc ccagaagcct 2410
cttgtggtgg tggctgtgcc ccctatgccc tgtggcattt ctgcgtctta ctggcaacca 2470
cacaactcag ggaaaggaat gcctgggagt gggggtgcag gcgggcagca ctgagggacc 2530
ctgccccgcc cctcccccca ggcccctttc ccctgcagct tctcaagtga gactgacctg 2590
tctcacccag cagccactgc ccagccgcac tccaggcaag ggccagtgcg cctgctcctg 2650
accactgcaa tcccagcgcc caaggaaggc cacttctcaa ctggcagaac ttctgaagtt 2710
tagaattgga attacttcct tactagtgtc ttttggctta aattttgtct tttgaagttg 2770
aatgcttaat cccgggaaag aggaacagga gtgccagact cctggtcttt ccagtttaga 2830
aaaggctctg tgccaaggag ggaccacagg agctgggacc tgcctgcccc tgtcctttcc 2890
ccttggtttt gtgttacaag agttgttgga gacagtttca gatgattatt taatttgtaa 2950
atattgtaca aattttaata gcttaaattg tatatacagc caaataaaaa cttgcattaa 3010
caaaaaaaaa aaaaaaaa                                               3028
<210>7
<211>616
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>7
Met Phe Arg Thr Ala Val Met Met Ala Ala Ser Leu Ala Leu Thr Gly
  1               5                  10                  15
Ala Val Val Ala His Ala Tyr Tyr Leu Lys His Gln Phe Tyr Pro Thr
             20                  25                  30
Val Val Tyr Leu Thr Lys Ser Ser Pro Ser Met Ala Val Leu Tyr Ile
         35                  40                  45
Gln Ala Phe Val Leu Val Phe Leu Leu Gly Lys Val Met Gly Lys Val
     50                  55                  60
Phe Phe Gly Gln Leu Arg Ala Ala Glu Met Glu His Leu Leu Glu Arg
 65                  70                  75                  80
Ser Trp Tyr Ala Val Thr Glu Thr Cys Leu Ala Phe Thr Val Phe Arg
                 85                  90                  95
Asp Asp Phe Ser Pro Arg Phe Val Ala Leu Phe Thr Leu Leu Leu Phe
            100                 105                 110
Leu Lys Cys Phe His Trp Leu Ala Glu Asp Arg Val Asp Phe Met Glu
        115                 120                 125
Arg Ser Pro Asn Ile Ser Trp Leu Phe His Cys Arg Ile Val Ser Leu
    130                 135                 140
Met Phe Leu Leu Gly Ile Leu Asp Phe Leu Phe Val Ser His Ala Tyr
145                 150                 155                 160
His Ser Ile Leu Thr Arg Gly Ala Ser Val Gln Leu Val Phe Gly Phe
                165                 170                 175
Glu Tyr Ala Ile Leu Met Thr Met Val Leu Thr Ile Phe Ile Lys Tyr
            180                 185                 190
Val Leu His Ser Val Asp Leu Gln Ser Glu Asn Pro Trp Asp Asn Lys
        195                 200                 205
Ala Val Tyr Met Leu Tyr Thr Glu Leu Phe Thr Gly Phe Ile Lys Val
    210                 215                 220
Leu Leu Tyr Met Ala Phe Met Thr Ile Met Ile Lys Val His Thr Phe
225                 230                 235                 240
Pro Leu Phe Ala Ile Arg Pro Met Tyr Leu Ala Met Arg Gln Phe Lys
                245                 250                 255
Lys Ala Val Thr Asp Ala Ile Met Ser Arg Arg Ala Ile Arg Asn Met
            260                 265                 270
Asn Thr Leu Tyr Pro Asp Ala Thr Pro Glu Glu Leu Gln Ala Met Asp
        275                 280                 285
Asn Val Cys Ile Ile Cys Arg Glu Glu Met Val Thr Gly Ala Lys Arg
    290                 295                 300
Leu Pro Cys Asn His Ile Phe His Thr Ser Cys Leu Arg Ser Trp Phe
305                 310                 315                 320
Gln Arg Gln Gln Thr Cys Pro Thr Cys Arg Met Asp Val Leu Arg Ala
                325                 330                 335
Ser Leu Pro Ala Gln Ser Pro Pro Pro Pro Glu Pro Ala Asp Gln Gly
            340                 345                 350
Pro Pro Pro Ala Pro His Pro Pro Pro Leu Leu Pro Gln Pro Pro Asn
        355                 360                 365
Phe Pro Gln Gly Leu Leu Pro Pro Phe Pro Pro Gly Met Phe Pro Leu
    370                 375                 380
Trp Pro Pro Met Gly Pro Phe Pro Pro Val Pro Pro Pro Pro Ser Ser
385                 390                 395                 400
Gly Glu Ala Val Ala Pro Pro Ser Thr Ser Ala Ala Leu Ser Arg Pro
                405                 410                 415
Ser Gly Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Gly Thr Ser Ala Thr Ala Ala
            420                 425                 430
Ser Ala Thr Ala Ser Gly Pro Gly Ser Gly Ser Ala Pro Glu Ala Gly
        435                 440                 445
Pro Ala Pro Gly Phe Pro Phe Pro Pro Pro Trp Met Gly Met Pro Leu
    450                 455                 460
Pro Pro Pro Phe Ala Phe Pro Pro Met Pro Val Pro Pro Ala Gly Phe
465                 470                 475                 480
Ala Gly Leu Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Leu Glu Gly His Glu Arg
                485                 490                 495
Gln His Leu Glu Ala Arg Leu Gln Ser Leu Arg Asn Ile His Thr Leu
            500                 505                 510
Leu Asp Ala Ala Met Leu Gln Ile Asn Gln Tyr Leu Thr Val Leu Ala
        515                 520                 525
Ser Leu Gly Pro Pro Arg Pro Ala Thr Ser Val Asn Ser Thr Glu Gly
    530                 535                 540
Thr Ala Thr Thr Val Val Ala Ala Ala Ser Ser Thr Ser Ile Pro Ser
545                 550                 555                 560
Ser Glu Ala Thr Thr Pro Thr Pro Gly Ala Ser Pro Pro Ala Pro Glu
                565                 570                 575
Met Glu Arg Pro Pro Ala Pro Glu Ser Val Gly Thr Glu Glu Met Pro
            580                 585                 590
Glu Asp Gly Glu Pro Asp Ala Ala Glu Leu Arg Arg Arg Arg Leu Gln
        595                 600                 605
Lys Leu Glu Ser Pro Val Ala His
    610                 615

Claims (20)

1.下述(a)或(b)记载的多核苷酸：
(a)编码含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸，
(b)含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的蛋白质编码结构域的多核苷酸，其中所述蛋白质编码结构域被定义为SEQ ID NO：1中位置403-2253的核苷酸序列。
2.由根据权利要求1的多核苷酸编码的蛋白质。
3.载体，其中插入了权利要求1的多核苷酸。
4.携有根据权利要求1的多核苷酸的转化细胞。
5.权利要求4的转化细胞，其携带权利要求3的载体。
6.制备根据权利要求2的蛋白质的方法，所述方法包括下述步骤：培养根据权利要求4或5的转化细胞，并从所述转化细胞或培养上清中回收表达的蛋白质。
7.与权利要求2的蛋白质特异性结合的抗体。
8.用于分析能特异性结合权利要求2的蛋白质的抗体的免疫分析试剂，所述试剂含有根据权利要求2的蛋白质。
9.根据权利要求8的免疫分析试剂，其中该试剂被用于诊断类风湿性关节炎或判断对类风湿性关节炎进行的治疗的效果。
10.具有以下(a)-(c)所列任一用途的试剂，所述试剂含有能与权利要求2的蛋白质特异性结合的抗体：
(a)分析根据权利要求2的蛋白质，
(b)检测表达权利要求2所述蛋白质的细胞，
(c)分离表达权利要求2所述蛋白质的细胞。
11.根据权利要求10的试剂，其中该试剂被用于诊断类风湿性关节炎或判断对类风湿性关节炎进行的治疗的效果。
12.根据权利要求11的试剂，其中权利要求2的蛋白质存在于滑膜细胞中。
13.测定生物样品中的抗体的方法，其中所述抗体与根据权利要求2的蛋白质特异性结合，所述方法包括下述步骤：
(1)使生物样品与根据权利要求2的蛋白质接触，和
(2)检测与根据权利要求2的蛋白质结合的抗体。
14.测定生物样品中的根据权利要求2的蛋白质的方法，所述方法包括下述步骤：
(1)使生物样品与根据权利要求7的抗体接触，和
(2)检测根据权利要求7的抗体，其中所述抗体与根据权利要求2的蛋白质结合。
15.检测或分离表达权利要求2所述蛋白质的细胞的方法，所述方法包括使细胞与特异性结合权利要求2所述蛋白质的抗体相接触，并检测或分离与所述抗体相结合的细胞的步骤。
16.根据权利要求15的方法，其中所述细胞是类风湿的滑膜细胞。
17.根据权利要求15的方法，其中所述细胞是未分化的间充质细胞。
18.检测受试化合物与权利要求2的蛋白质的结合活性的方法，所述方法包括下述步骤：
a)使受试化合物与根据权利要求2的蛋白质接触，和
b)观察受试化合物与所述蛋白质的结合。
19.筛选对权利要求2的蛋白质具有结合活性的化合物的方法，所述方法包括下述步骤：
a)通过根据权利要求18的方法检测受试化合物与根据权利要求2的蛋白质的结合活性，和
b)选择所述结合活性高于对照的受试化合物。
20.药物组合物，其含有选自根据权利要求1的多核苷酸、根据权利要求2的蛋白质，和根据权利要求3的载体组成的组中的组分作为活性成分。
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