JPWO2005118841A1 - シノビオリンのユビキチン化のアッセイ及びスクリーニングへの利用 - Google Patents

Abstract

本発明は、シノビオリンとユビキチンとを含む反応系で両者を反応させ、得られる反応産物からシノビオリンに結合したユビキチンの量を測定することを特徴とする、シノビオリンの自己ユビキチン化活性を測定するためのアッセイ方法、その活性の調節作用を有する物質をスクリーニングする方法、及びシノビオリンの自己ユビキチン化アッセイを行うためのキットである。

Description

本発明は、シノビオリンのユビキチン化に関する。より詳しくは、関節リウマチに関係するタンパク質であるシノビオリンの自己ユビキチン化の高感度アッセイ方法、ならびに自己ユビキチン化に影響を及ぼす物質の、ハイスループット・スクリーニング方法に関する。

関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ、以下、ＲＡと省略する）は、関節の滑膜組織に異常な増殖が見られる全身性の慢性炎症性疾患である。滑膜細胞（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｃｅｌｌ）は、関節の滑膜で１〜６層の上皮様層を形成する繊維芽細胞様の細胞であり、滑液にプロテオグリカンやヒアルロン酸を供給するものとされている。ＲＡ患者の関節では、滑膜組織の増殖、その結果として引き起こされる多層構造、滑膜細胞の他の組織への浸潤といったような症状が観察される。
ＲＡの発症や進展の背後にある分子レベルの機序を解明する研究の過程で、ＲＡ患者の滑膜組織において強発現している新規な遺伝子が見出され、それがコードするタンパク質は、発現している組織である滑膜細胞（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｃｅｌｌ）にちなみ、シノビオリン（Ｓｙｎｏｖｉｏｌｉｎ）と名づけられた（ＷＯ０２／０５２００７）。当該遺伝子ならびにその発現産物であるシノビオリンは、ＲＡ疾患の主因である滑膜組織の異常増殖に密接に関連している。また、シノビオリンはシグナル伝達に関与することも報告されている。シノビオリンは細胞増殖作用を有することから、細胞内外の情報がシノビオリンを介するタンパク質のリン酸化により伝達されることが考えられる。さらに、シノビオリンはタンパク質のユビキチン化（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ）にも関与しており、これによりタンパク質機能の制御も行なっていると推測される。

上記のように、これまで本発明は、シノビオリンタンパク質による自己ユビキチン化をアッセイする方法、及びそのユビキチン化活性を調節する作用を有する化合物をスクリーニングする方法などの開発が望まれていた。
本発明者らは、シノビオリンによるシグナル伝達に関する鋭意研究を行った結果、シノビオリンが自己ユビキチン化（ｓｅｌｆ−ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ）を起こすユビキチンリガーゼ作用を有することを初めて見出した。これに基づき、シノビオリンの自己ユビキチン化活性を高感度にアッセイする方法、ならびにその酵素活性のアッセイ方法を利用して自己ユビキチン化を調節する化合物を探索するためのハイスループット・スクリーニング方法に関する本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）シノビオリンとユビキチンとを含む反応系で両者を反応させ、得られる反応産物からシノビオリンに結合したユビキチンの量を測定することを特徴とする、シノビオリンのユビキチン化活性を測定するためのアッセイ方法。
上記反応は、シノビオリン又はその活性誘導体、ユビキチン、ユビキチン活性化酵素、ユビキチン結合酵素及びユビキチン化に必要な低分子の反応因子を含む系における自己ユビキチン化反応であってもよく、また上記測定は、シノビオリンに結合したユビキチンの量を測定するものであってもよい。
また、上記シノビオリンの活性誘導体としては、例えばシノビオリンとタグタンパク質との融合タンパク質が挙げられる。
さらに、上記測定は、上記シノビオリンに結合したビオチン化ユビキチンをアビジンと反応させることにより、シノビオリンに結合したユビキチンの量を定量することにより行うことができる。
（２）シノビオリンのユビキチン化に対する調節作用を有する物質をスクリーニングする方法であって、次の工程を含むことを特徴とする方法：
（ｉ）被験物質の存在下又は非存在下に、ユビキチンとシノビオリン又はその活性誘導体とを接触させる工程；
（ｉｉ）シノビオリン又はその活性誘導体によるユビキチン化活性を測定する工程；並びに
（ｉｉｉ）シノビオリンのユビキチン化活性を調節する被験物質の作用を、上記（ｉ）及び（ｉｉ）により得られた結果と、対照の結果とを比較して検出する工程。
（３）シノビオリンのユビキチン化を測定するために少なくとも次のものを含んでなる、シノビオリンのユビキチン化アッセイを行なうためのキット：
（ｉ）シノビオリン又はその活性誘導体及びユビキチン；並びに
（ｉｉ）シノビオリンに結合したユビキチンの量を測定する工程で使用される試薬類。
また、上記キットはユビキチン活性化酵素、ユビキチン結合酵素、ユビキチン化に必要な低分子の反応因子及び緩衝液類をさらに含めることができる。

図１は、ＧＳＴ−ＨＡ−Ｕｂのビオチン化を示す図である。
図２は、ビオチン化ＧＳＴ−ＨＡ−Ｕｂを用いたシノビオリンのインビトロ自己ユビキチン化の結果をウエスタンブロッティング法により示す図である。
図３は、ビオチン化ＧＳＴ−ＨＡ−Ｕｂを用いたシノビオリンのインビトロ自己ユビキチン化の結果をＥＬＩＳＡ法により示す図である。
図４は、Ｐｋ−Ｈｉｓ−ＨＡ−Ｕｂ Ｋ４８Ｒを用いたシノビオリンのインビトロ自己ユビキチン化の結果をウエスタンブロッティング法により示す図である。
図５は、Ｐｋ−Ｈｉｓ−ＨＡ−Ｕｂ Ｋ４８Ｒを用いたシノビオリンのインビトロ自己ユビキチン化の結果をＥＬＩＳＡ法により示す図である。
図６は、小スケールのインビボビオチン化ＢｉｏＥＡＳＥ−Ｕｂ精製を示す図である。
図７は、インビボビオチン化ＢｉｏＥＡＳＥ−Ｕｂ精製を示す図である。
図８は、異なるビオチン化ユビキチンを用いた、シノビオリンのインビトロ自己ユビキチン化を示す図である。
図９は、ＥＬＩＳＡ法を用いたインビトロ自己ユビキチン化反応検出系における、シノビオリン濃度の影響を示す図である。
図１０は、ＥＬＩＳＡ法を用いたインビトロ自己ユビキチン化反応検出系における、ユビキチン濃度の影響を示す図である。
図１１は、ＥＬＩＳＡ法を用いたＭＢＰ−Ｓｙｎｏ ΔＴＭ−Ｈｉｓのインビトロ自己ユビキチン化活性の検出を示す図である。
図１２は、ＥＬＩＳＡを用いたインビトロ自己ユビキチン化反応検出時における、抗体濃度の影響を示す図である。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、ユビキチン化（例えば自己ユビキチン化）されたシノビオリンに結合したユビキチンをＥＬＩＳＡ法等により高感度かつ簡易に測定し得ることを見出し完成されたものである。
ユビキチン化とは、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）及びユビキチンリガーゼ（Ｅ３）などの酵素が協同して、基質となるタンパク質にユビキチンを次々と結合させていく過程である。このユビキチン化の生理的意義は、プロテオソーム系のタンパク質分解機構へ送られるためのタグ修飾として、従来認識されていた。そして、その後の研究により拡大され、現時点でのユビキチン化の意義は、タンパク質機能を制御する可逆的タンパク質修飾システムとして位置づけられている。
本明細書において「自己ユビキチン化（ｓｅｌｆ−ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ，ａｕｔｏ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ）」とは、シノビオリンがユビキチンリガーゼ活性を有することにより、シノビオリン自体がユビキチン化の基質タンパク質となり、他のユビキチンリガーゼによることなく自らユビキチンを結合させるものである。シノビオリンの自己ユビキチン化は、本発明者によりシノビオリンがユビキチンリガーゼ活性を有することが見出されて明らかとなった。しかも、その自己ユビキチン化は、内在性のシノビオリンの完全長の分子で観察されるだけでなく、シノビオリンの細胞質内部分のみとタグタンパク質の融合したシノビオリンにおいても生起することが明らかにされている。本発明者は以上の知見を見出し、当該知見に基づいて鋭意研究を行い、本発明を完成させた。
本発明によるユビキチン化活性のアッセイ方法は、シノビオリンとユビキチンとを含む反応系で両者を反応させ、得られる反応産物からシノビオリンに結合したユビキチンの量を測定することを特徴とする。また、本発明は、以下の工程を含む。
（ｉ）シノビオリン又はその活性誘導体、ユビキチン、ユビキチン活性化酵素、ユビキチン結合酵素、及びユビキチン化に必要な低分子反応因子を含む系でシノビオリンの自己ユビキチン化反応を行なわせる工程、及び
（ｉｉ）上記反応により得られた反応液に含まれる、シノビオリンに結合したユビキチン又は結合しなかったユビキチンの量を測定する工程。
ユビキチン化は、例えば標識ユビキチン又は抗ユビキチン抗体を用いて、シノビオリンに結合したユビキチン又は結合しなかったユビキチンの量を測定することにより、基質タンパク質のユビキチン化を検出するとともに、その程度を評価することができる。この方法は、直接的であり操作も複雑でないため、後述のように自己ユビキチン化に影響を与える低分子物質のスクリーニングに使用するのに適している。
「シノビオリン又はその活性誘導体」には、シノビオリンのほかに、ユビキチン化の酵素活性を有する各種誘導体も含まれる。これにはシノビオリンの塩の形態、修飾を受けたタンパク質分子、さらには融合タンパク質（例えばシノビオリンとＨｉｓタグタンパク質との融合タンパク質）も含まれる。ユビキチン化のアッセイに使用されるシノビオリンは以下のようにして調製される。
１．生体材料からのシノビオリンの調製
シノビオリンは、ＲＡ患者の滑膜組織から得ることができる。滑膜細胞はインビトロで培養することができるため、この培養物からシノビオリンを回収することが可能である。具体的には、ＲＡ患者から滑膜切除術（ｓｙｎｏｖｅｃｔｏｍｙ）により外科的に切除された滑膜組織等をもとにこの組織から滑膜細胞を分離する。分離した細胞を培養すれば、滑膜細胞を付着性細胞として回収することができる（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１８６−１９３，１９９３）。回収した細胞からは、公知のタンパク質精製技術を組み合わせてシノビオリンを抽出し精製する。
２．遺伝子工学手法によるシノビオリンの調製
シノビオリンを簡便にしかも効率よく入手するには、以下の遺伝子工学の手法を利用する方法で得ることが望ましい。さらに、シノビオリンの組換えタンパク質（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）を細菌などの宿主を利用して調製することは、標識として各種のタグタンパク質をシノビオリンに付加したり、また、シノビオリンの変異体を調製したりするのが簡便であるなどの点でより好ましい。
（１）シノビオリンポリペプチド
上記のようにシノビオリンは、生体材料から得ることの他に、これをコードする遺伝子を適当な発現系に組み込んで遺伝子組み換えによる発現産物として入手することもできる。
本発明において使用するシノビオリンの種は、ヒト、マウス、ラットなどであってもよく、特に限定されるものではない。シノビオリンとしては、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを使用することができる。配列番号２で表されるポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示す。本発明で用いられるポリペプチドは、シノビオリンとしての作用を有する限り、変異体でもよく、上記のシノビオリンのアミノ酸配列とホモロジーを有するポリペプチドでもよい。上記シノビオリンポリペプチドのアミノ酸配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
ここで、「シノビオリンとしての作用」を有するとは、ユビキチンリガーゼ活性を持つことを意味する。
さらに、配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１若しくは複数個（例えば１個又は数個）のアミノ酸に欠失、置換又は付加等の変異が生じたアミノ酸配列であって、シノビオリンとしての作用を有するポリペプチドのアミノ酸配列も本発明において使用することができる。例えば、（ｉ）配列番号２に示すアミノ酸配列のうち１若しくは複数個（好ましくは１個又は数個（例えば１個〜１０個、さらに好ましくは１個〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号２に示すアミノ酸配列のうち１若しくは複数個（好ましくは１個又は数個（例えば１個〜１０個、さらに好ましくは１個〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号２に示すアミノ酸配列のうち１若しくは複数個（好ましくは１個又は数個（例えば１個〜１０個、さらに好ましくは１個〜５個））の他のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列、（ｉｖ）上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）を組み合わせたアミノ酸配列からなり、かつ上記シノビオリンと同様の作用を有する変異型のシノビオリンポリペプチドを使用することもできる。
このような配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４８８−９２、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５：２７６３−６等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。
また、ポリヌクレオチドに変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ^ＴＭ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒ^ＴＭ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。
さらに、シノビオリンポリペプチドには、他のペプチド配列により付加された融合タンパク質を含む。本発明のポリペプチドに付加するペプチド配列（タグ）としては、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、多重ヒスチジンタグ（６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ等）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタンパク質の識別を容易にする配列、組換え技術によりタンパク質を発現させる際に安定性を付与する配列、タンパク質の精製過程を容易にする配列等を選択することができる。
シノビオリンは、その細胞質内ドメインだけであっても、自己ユビキチン化されることから、本発明に用いるシノビオリンは、細胞膜貫通部位を除いたシノビオリンｄＴＭであってもよい。例えば、当該ｄＴＭに上記のタグタンパク質を融合させたＭＢＰ−シノビオリンｄＴＭ−Ｈｉｓも本発明において用いることができる。
（２）シノビオリン遺伝子又はポリヌクレオチド
本発明において、シノビオリン遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列のほか、前記本発明のシノビオリンポリペプチドをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドであれば特に限定されない。例えば、配列番号２で表わされるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドのほか、配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列からなる変異ポリペプチドであって、シノビオリンとしての作用が維持されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明において使用することができる。
ここで、「ポリヌクレオチド」とは、複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）等の塩基又は塩基対からなる重合体を指し、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ及びＲＮＡを含むが、ＤＮＡであることが好ましい。また、天然以外の人工塩基を必要に応じて含むポリヌクレオチドも包含する。
本発明のシノビオリン遺伝子は、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。このようなアミノ酸配列をコードする塩基配列は、配列番号１で表される塩基配列に加えて、遺伝子暗号の縮重により配列番号１で表される塩基配列とは異なる塩基配列を含むものである。本発明のポリヌクレオチドを遺伝子工学的な手法によりポリペプチドを発現させるのに用いる場合、使用する細胞のコドン使用頻度を考慮して、発現効率の高いヌクレオチド配列を選択し、設計することができる（Ｇｒａｎｔｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：４３−７４）。シノビオリンをコードするポリヌクレオチドは、また、修飾されたヌクレオチドを含むものであってもよい。
さらに、本発明のシノビオリン遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列を有するポリヌクレオチド、又は該塩基配列に相補的な配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、シノビオリンとしての作用を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。このようなシノビオリン遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。ｃＤＮＡライブラリーの作製方法については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））を参照することができる。また、市販のｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーを用いてもよい。
本発明におけるハイブリダイゼーション条件において、ストリンジェントな条件としては、例えば、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、２５℃」、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、２５℃」、「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６８℃」等の条件を挙げることができる。当業者は、このようなバッファーの塩濃度、温度、プローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、本発明のシノビオリン遺伝子をコードするポリヌクレオチドを得るための条件を設定することができる。
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特にＳｅｃｔｉｏｎ９．４７−９．５８）等を参照することができる。
本発明のポリヌクレオチドには、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチド配列に相補的な配列が含まれる。これらのポリヌクレオチドは、前記の部位特異的変異誘発法等の公知方法に従って調製することができる。また、変異の誘発は、前記の市販のキットを用いることもできる。
本発明のポリヌクレオチドの塩基配列は、慣用の配列決定法により確認することができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：５４６３）等により行うことができる。また、適当なＤＮＡシークエンサー（例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（アプライドバイオシステムズ社））を利用して配列を解析することも可能である。
あるいは、本発明において、シノビオリンをコードする遺伝子又はポリヌクレオチドは、前記ＲＡ患者の滑膜細胞から公知の方法によりクローニングすることができる（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１６：７５８３−７６００，１９８８）。例えば、シノビオリンをコードする遺伝子は、滑膜細胞のｃＤＮＡライブラリー等を鋳型としてＰＣＲなどで増幅することにより得ることができる。具体的には、滑膜組織や培養細胞として回収した、ＲＡ患者の関節炎を発症した組織に由来する滑膜細胞から抽出したｍＲＮＡをもとに、ｃＤＮＡライブラリーを得る（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６，７５８３，１９８８）。続いて、国際公開第０２／０５２００７号公報の配列番号１に示された塩基配列に基づいて設定したプローブを用いて、このライブラリーからハイブリダイズするクローンをスクリーニングすることによってシノビオリンをコードする遺伝子を単離することができる。
（３）シノビオリン発現ベクターと宿主
上記（ｉｉ）に記載のシノビオリンをコードする遺伝子もしくはポリヌクレオチドを適当な発現系に組み込むための好適な宿主／ベクター系として、大腸菌／プラスミドの系を例示することができが、特にこれに限定されるものではない。例えば、発現ベクターであるｐＭＡＬベクターは、外来遺伝子をマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）との融合タンパク質として大腸菌で発現させることができる（Ｇｅｎｅ，６７：３１−４０，１９８８）。シノビオリンをコードする遺伝子を組み込んだプラスミドをヒートショックにより、プロテアーゼ欠損株であるＢＬ２１のような大腸菌株に導入し、適当な培養時間の後にイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（ＩＰＴＧ）を添加してＭＢＰ融合シノビオリン（ＭＢＰ−シノビオリン）の発現を誘導する。このＭＢＰは、タグとして機能するため、発現生成物、すなわちＭＢＰ−シノビオリンはアミロースビーズカラムによって容易に分離・精製することができる。
シノビオリンの遺伝子組換え体を得るための宿主／ベクター系としては、この他にも次のようなものを応用することができる。まず細菌を宿主に利用する場合には、各種タグタンパク質、例えばヒスチジンタグ、ＨＡ、ＦＬＡＧ、ＧＳＴ等を利用した融合タンパク質の発現用ベクターが市販されている。酵母においては、Ｐｉｃｈｉａ属酵母が糖鎖を備えたタンパク質の発現に有効であることが知られている。糖鎖の付加という点では、昆虫細胞を宿主とするバキュロウイルスベクターを利用した発現系も有用である（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：４７−５５，１９８８）。さらに、哺乳動物の細胞を利用して、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＥＦ−１αあるいはＳＶ４０等のプロモーターを利用したベクターのトランスフェクションが行われており、これらの宿主／ベクター系は、いずれもシノビオリンの発現系として利用することができる。また、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等のウイルスベクターを利用してシノビオリンをコードする遺伝子を導入することもできる。
上記のような宿主／ベクター系の発現産物であるシノビオリンは、以下のように用いることができる。例えば、タグを付けたシノビオリンを発現するベクターを細胞にトランスフェクションして、次にシノビオリンを発現させた細胞を破砕し、［^３２Ｐ］標識ユビキチンを添加して反応させた後、抗タグ抗体により免疫沈降する。沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開し、オートラジオグラフィーによりシノビオリンのユビキチンリガーゼ活性を検出することができる（Ｈａｓｈｉｚｕｍｅ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，１４５３７−１４５４０，２００１）。
３．ＭＢＰ−シノビオリン−Ｈｉｓ融合タンパク質の可溶化及びプレートへの作用
以下、シノビオリンのＭＢＰ及びＨｉｓとの融合タンパク質であるＭＢＰ−シノビオリン−Ｈｉｓを例に挙げて説明する。
トランスフォームされた細胞を含む培養液を遠心分離するといった公知の方法で、細胞もしくは培養菌体を集める。適当な緩衝液に懸濁した菌体ペレットを氷冷下で、超音波処理、リゾチーム及び／又は凍結融解などの処置により、菌体又は細胞を破壊して、ＭＢＰ、Ｈｉｓ融合シノビオリンを溶出する。その際、可溶化を促進するため、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０などの界面活性剤を使用してもよい。通常はこのようにして、溶出された発現産物である融合タンパク質を、例えばアミロースビーズあるいはニッケルアガロースビーズを用いるクロマトグラフィーなどで精製することができる。また、目的に応じて、プロテアーゼで融合タンパク質からタグ部分であるＭＢＰ又はＨｉｓを切り離すことにより、目的のタンパク質を単体としてアッセイに用いることができる。
ＭＢＰ−シノビオリン−Ｈｉｓは、精製時に用いられるアミロースビーズ又はニッケルアガロースビーズから溶出され、さらに透析された後は、会合体を形成しやすいという特徴を有する。そこで、当該シノビオリン−融合タンパク質を含む細菌細胞の可溶化物は、分離精製の操作をすることなく、プレート等の固相支持体に作用させることにより、当該支持体とＭＢＰ−シノビオリン−Ｈｉｓ融合タンパク質との複合体を得て、後の使用に用いる。この方法のほうが、シノビオリンを精製して用いるよりもはるかに簡便であり、しかも会合体形成を防止できる点で好ましい。当該会合は、ＭＢＰ−シノビオリン−Ｈｉｓ融合タンパク質が、シノビオリンの示す自己ユビキチン化活性を有し、固相支持体に固定化しても活性があることに起因する。
固相支持体として、イムノプレート（マルチウェルプレート）を用いることができ、例えば９６ウェル、３８４ウェル等のプレートを挙げることができる。シノビオリン−融合タンパク質を含む細菌細胞の可溶化物を直接当該プレートに作用させると、目的物であるシノビオリン融合タンパク質以外のタンパク質もプレートに固相化されてしまう。そこで、目的物であるＭＢＰ−シノビオリン−Ｈｉｓ融合タンパク質のみをプレートに結合させるために、あらかじめプレートを抗ＭＢＰ抗体で固相化しておくことが好ましい。当該抗ＭＢＰ抗体を固相化したプレートには、ＭＢＰタグを有するタンパク質が特異的に結合するため、細胞の可溶化物をプレートに作用させても、目的物であるＭＢＰ−シノビオリン−Ｈｉｓ融合タンパク質が選択的にプレートに結合することになる。プレートに固相化する抗体は、シノビオリンが融合タンパク質として結合したタグに対する抗体であればいずれであってもよい。例えば、シノビオリンにＧＳＴとの融合タンパク質を用いる場合には、プレートに固相化する抗体は抗ＧＳＴ抗体であればモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体であってもよい。
抗ＭＢＰ抗体のプレートへの固相化は、９６ウェルプレートの場合、ウェルあたり１μｇの抗ＭＢＰ抗体を、ＰＢＳやクエン酸バッファーなどの緩衝液中で終夜４℃でインキュベートすることにより行うことができる。
この抗ＭＢＰ抗体固相化プレートにより、産生されたＭＢＰ−シノビオリン−Ｈｉｓ融合タンパク質を細菌細胞から抽出・精製することなくそのままプレートに結合することができ、後述の自己ユビキチン化反応の後はプレートの洗浄により容易に非結合物の除去や分離を行なうことができる。上記融合タンパク質を含む細菌細胞の可溶化物は、反応を行なう９６ウェルプレートのウェル当たり、０．３〜７μｌ、好ましくは、０．５〜３μｌの使用量が好適である。
４．ユビキチン
本発明において利用するＥＬＩＳＡ法（後述）では、ユビキチンはプレートに結合したＭＢＰ−シノビオリン−Ｈｉｓ融合タンパク質のシノビオリンに、シノビオリン自身のユビキチンリガーゼ作用により結合する。
本発明で用いられるユビキチンは、シノビオリンのユビキチンリガーゼ作用によりシノビオリンに結合する限り、種は問わない。本発明で用いるユビキチンとして、例えば、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを使用することができる。配列番号４で表されるポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号３に示す。本発明で用いられるユビキチンポリペプチドは、（ｉ）のシノビオリンポリペプチドで記載したような配列番号４に対する各変異体を用いることもできる。さらに、本発明でも用いられるユビキチン遺伝子又はポリヌクレオチドには、（ｉｉ）のシノビオリン遺伝子又はポリヌクレオチドで記載したような各変異体を用いることもできる。
ユビキチンをコードする塩基配列を配列番号３に、ユビキチンのアミノ酸配列を配列番号４に示す。
例えば、遺伝子工学手法によりユビキチン（Ｕｂ）を宿主から産生する際には、ＧＳＴ及びＨＡのタグを付加したＧＳＴ−ＨＡ−Ｕｂを用いることができる。タグ等を付加する際にも、本発明のＥＬＩＳＡ法において、シノビオリンのユビキチンリガーゼ作用によりシノビオリンに結合する作用を保持していることが必要である。前記のＧＳＴ−ＨＡ−Ｕｂは、（ｉｉｉ）に記載したような発現ベクター／宿主を用いて発現させ、取得することが可能である。例えば、Ｕｂ遺伝子をＧＳＴ及びＨＡタグ融合タンパク質のベクター（ｐＧＥＸ）に挿入し、大腸菌での融合タンパク質の産生を行い、大腸菌の可溶化上清から得られる各融合タンパク質をグルタチオンセファロース^ＴＭ４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）カラムで精製することによって、上記ＧＳＴ−ＨＡ−Ｕｂを取得することができる。
また、上記したように宿主から産生された融合タンパク質を精製するには、以下のような方法を用いることもできる。すなわち、まず、融合タンパク質を産生する宿主を破壊する。宿主の破壊は、例えば、超音波処理（ソニケーション）、リゾチーム等の酵素による溶菌やフレンチプレスなどの方法を単独又は適宜組み合わせて行うことができる。その後、適当なバッファーを加えて混合した後、遠心分離により上清を得る。得られた上清に含まれるタンパク質を、吸着ビーズ等を用いて吸着させる。例えば、グルタチオンセファロース^ＴＭ４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）などのビーズを用いて適当な時間回転させて産生タンパク質をビーズに吸着させることができる。その後、このビーズから、産生タンパク質を分離すればよい。分離の方法としては、例えば、タンパク質が吸着しているビーズをカラムにつめて、適当なバッファーを用いて溶出することができる。なお、溶出したタンパク質を透析してから回収してもよい。
また本発明で用いられるユビキチンには、Ｐｋ−Ｈｉｓ−ＨＡ−Ｕｂ Ｋ４８Ｒ又はＢｉｏＥａｓｅ−Ｕｂも含まれる。Ｐｋ−Ｈｉｓ−ＨＡ−Ｕｂ Ｋ４８Ｒはユビキチンの４８番目のリジン残基をアルギニンに置換したものであり、４８番目のリジン残基を介したポリユビキチン化が形成されないという特徴を有する。Ｐｋ−Ｈｉｓ−ＨＡ−Ｕｂ Ｋ４８Ｒは、Ｕｂの４８番目のリジンをアルギニンに変異させた変異体に、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ、Ｐｋが結合したタンパク質である。Ｐｋ−Ｈｉｓ−ＨＡ−Ｕｂ Ｋ４８Ｒを本発明の方法に用いることで、バックグラウンドが低減し、よりＳ／Ｎ 比の高いアッセイをすることが可能となる。ＢｉｏＥａｓｅ−Ｕｂは、ユビキチン遺伝子をｐＥＴ１０４−ＰＥＳＴ^ＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、大腸菌内で融合タンパク質産生を行うと同時に、ＢｉｏＥａｓｅ^ＴＭＴａｇ内の特定のリジン残基にビオチンが共有結合で付加され（インビボにてビオチン化される）、その可溶化上清から得られる融合タンパク質をＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ａｇａｒｏｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などのビーズで精製したタンパク質である。
ＢｉｏＥａｓｅ−Ｕｂを本発明の方法に用いることで、バックグラウンドが顕著に低減し、Ｓ／Ｎ比が極めて高いアッセイをすることが可能となる。
本発明では、ユビキチン又はビオチン化ユビキチンを、９６ウェルプレートのウェルあたり、１．７μｇ使用することが好ましい。
また、本発明のユビキチンは、標識して用いることもできる。ユビキチンの標識は、適当な化学的又は物理的検出手段により検出可能な標識であればよい。例えばフルオレスカミン、フルオレッセインイソチオシアネートなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸脱水素酵素などの酵素類、ルシフェリン、ルミノールなどの発光物質などを用いてユビキチンを標識化することができる。また、本発明のユビキチンは、ビオチン化して用いることもできる。ビオチン化の方法は、インビトロビオチン化又はインビボビオチン化の方法がある。インビトロビオチン化の方法としては、例えば、ＮＨＳ（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）−ビオチン（ＢＩＯ ＲＡＤ社）と２時間室温でインキュベートする方法がある。インビボビオチン化の方法としては、ｐＥＴ１０４−ＰＥＳＴ等のベクターにユビキチンをクローニングしたものを形質転換し、得られた形質転換体内でビオチン化タンパク質を産生させる方法がある。標識ユビキチンは、それぞれの標識を検出することが可能な手段で分析され、これによりユビキチンの定量が可能となる。上記のビオチン標識の場合には、アビジン−アルカリフォスファターゼを用いて検出することが可能である。
上記３．で例示したＭＢＰ−シノビオリン−Ｈｉｓを実験に用いる場合、自己ユビキチン化反応の対照として、シノビオリン部分を欠如させたＭＢＰ−Ｈｉｓを用いることができる。
５．シノビオリンのユビキチン化
ユビキチン化は、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）及びユビキチンリガーゼ（Ｅ３）が共同して基質タンパク質にユビキチンを次々と結合させていく過程である。上述のように、シノビオリンの自己ユビキチン化とは、シノビオリンがユビキチンリガーゼ活性を有することにより、シノビオリン自体がユビキチン化の基質タンパク質となり、他のユビキチンリガーゼではなく自らユビキチンを結合させるものである。
上記のユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）などの酵素類は、市販されており、これらを適宜使用することができる。９６マイクロプレートのウェル当たり、Ｅ１は、１０〜５０ｎｇの範囲、好ましくは２０〜４０ｎｇの範囲で、Ｅ２は、０．１〜０．５μｇの範囲、好ましくは０．２〜０．３μｇの範囲で用いられる。
ユビキチン化に必要な低分子反応因子として、ＭｇＣｌ_２、ＭｇＳＯ_４などのＭｇ塩、ＡＴＰ、ＮＡＦ、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、オカダ酸などを適宜選択して使用することができる。これらの化合物も市販されており、入手は容易である。
さらに酵素類又は試薬を溶解する緩衝液、洗浄用緩衝液、測定用緩衝液、反応停止緩衝液などは、酵素を失活させ、あるいは反応を阻害しないものであれば、任意の公知緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）を使用することができる。
シノビオリンの自己ユビキチン化反応は、以下の条件で行うことができる。反応溶媒となる緩衝液（ｐＨ６〜８）の一定量に、シノビオリンの自己ユビキチン化に必要な反応物質（シノビオリン又はその活性誘導体を除く）をそれぞれ上記の所定量加え、室温で５〜３０分間インキュベートする。次いでシノビオリン又はその活性誘導体、あるいは固定化されたシノビオリンの活性誘導体を添加して、シノビオリンの自己ユビキチン化反応を開始する。室温〜３７℃の一定温度のもとで、２０〜１２０分の一定時間のインキュベーションを行い、停止緩衝液（０．２Ｍホウ酸緩衝液、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及びＥＤＴＡを含有する）を一定量加えることにより反応を停止させる。そして、シノビオリンに結合したユビキチン又は結合しなかったユビキチンの量を測定して、自己ユビキチン化の程度を求める。そのためには標識ユビキチンを使用するか、あるいは抗ユビキチン抗体を使用することが好ましい。
６．アッセイ用キット
本発明は、上記アッセイの方法のみならず、そのための手段の組み合わせにも関わる。その組み合わせの具体的な態様であるキットは、少なくとも、
（ｉ）シノビオリンのユビキチン化反応に使用されるシノビオリン又はその活性誘導体、ユビキチン、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）、ユビキチン化に必要な低分子の反応因子及び緩衝液類；並びに
（ｉｉ）上記反応により得られた反応液からシノビオリンに結合したユビキチン又は結合しなかったユビキチンの量を測定する工程で使用される試薬類（例えばＥＬＩＳＡに使用される洗浄液、ユビキチン標識用酵素、ｏ−フェニレンジアミン、硫酸等）を含む。
反応用のマルチウェルプレートは、例えば９６ウェルでも３８４ウェルでもよく、当業者であれば、プレートの種類を容易に選択することができる。また、キットにマルチウェルプレートを含む場合、あらかじめ抗ＭＢＰ抗体を固相化したプレートであってもよい。
シノビオリン、ユビキチン、必要な酵素類及びユビキチン化に必要な低分子の反応因子、及びユビキチンの量を測定する工程で使用される試薬類については上記アッセイの項において説明したものがいずれも好適に用いられる。
キットに含まれる「緩衝液」には、「反応緩衝液」のほかに「洗浄液」も含まれる。「洗浄液」には、「反応緩衝液」と同じ溶媒、又はその他の水溶性溶媒、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液などを例示することができる。両者は同一系の緩衝液であってもよく、緩衝液の液性を変更する、具体的にはイオン強度、ｐＨ、含有する塩類の種類を変化させることにより、洗浄用及び溶離の作用を実現させることができる。
これらのキットを構成する各成分は、別個に用意してもよく、あるいは、支障がない限り共存させていてもよい。キットは溶液を含んでもよく、あるいはそのような溶液を配合するための成分が濃縮形態であってもよい。
さらに必要に応じて、本キットは補助剤、専用容器、その他の必要なアクセサリー、説明書などを含んでもよい。
本発明のキットはＥＬＩＳＡ法に基づくものである。ＥＬＩＳＡ法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）とは、一般には酵素で標識した抗原（又は抗体）を用いて、抗体（又は抗原）と結合する物質又はその量を酵素活性を利用して検出する方法である。本発明のキットは、上記のような抗原−抗体反応ではなく、シノビオリンの自己ユビキチン化反応に基づくものである。すなわち、本発明のキットは、酵素で標識したユビキチンを用いて、シノビオリンと結合するユビキチン又はその量を、酵素活性を利用して検出するものである。本発明において、自己ユビキチン化反応に基づく当該方法もＥＬＩＳＡ法と称することがある。
７．ユビキチン化に対する調節作用を有する物質のスクリーニング
シノビオリンのユビキチン化に対する調節作用を有する物質について、本発明によるスクリーニング方法は、以下の手順に基づく。
シノビオリン又はその活性誘導体を用いて、少なくとも次の工程、
（ｉ）マルチウェルプレート上のウェルで、被験物質の存在下又は非存在下に、ユビキチンとシノビオリン又はその活性誘導体を接触させる工程；
（ｉｉ）上記ウェルで上記のアッセイ操作を行なうことにより、シノビオリン又はその活性誘導体によるユビキチン化活性を測定する工程；
（ｉｉｉ）シノビオリン自己ユビキチン化活性を調節する被験物質の作用を、上記（ｉ）及び（ｉｉ）に基づく結果と、同時に行なった対照の結果とを比較して検出する工程；及び
（ｉｖ）前記調節作用が高い被験物質を選択する工程；
を含んでいる。
この場合、被験物質が存在しない条件下で工程（ｉ）及び（ｉｉ）と同じ操作を行なったものが対照として好適である。あるいは、対照としては、被験物質をより低い濃度で含む場合であってもよい。また、例えば被験物質の代わりに、シノビオリンの自己ユビキチン化を促進又は阻害する活性を有することが分かっている分子を用いて工程（ｉ）及び（ｉｉ）と同じ操作を行い、その分子よりもより高い調節活性を持つ物質を選別することもできる。
このような物質のスクリーニングにおいて、シノビオリンのユビキチン化活性を調節する被験物質の作用として、次のように区分される。被験物質の存在によりシノビオリンに結合するユビキチンの量が上昇すれば、この物質はシノビオリンのユビキチン化を促進する物質と判定される。また被験物質の存在によりシノビオリンに結合するユビキチン量が低下すれば、この物質はシノビオリンのユビキチン化を阻害する物質と判定される。例えば、シノビオリンとユビキチン活性化酵素及び／又はユビキチン結合酵素との相互作用を阻害する物質は、シノビオリンのユビキチン化を有効に阻害することができると判定できる。
シノビオリンのユビキチン化に影響を与える化合物のスクリーニングを行なう場合、大量の低分子化合物ライブラリーに対してハイスループットにスクリーニングする必要から、感度が高く、短時間で済むアッセイ方法を採用することが望ましい。そこで、本発明においては、上記のアッセイ方法のように多数のサンプルを同時に処理できるマルチウェルプレートを使用し、シノビオリン又はその活性誘導体を固相支持体に固定化して反応を行なって反応生成物のみを該プレートのウェルに残し、ユビキチンの結合量をそのままマルチウェルプレート上で測定する。
上記ハイスループット化スクリーニング方法の実現のために、具体的にはシノビオリン又はその活性誘導体として、上述のようなシノビオリン−Ｈｉｓ融合タンパク質を含む細菌細胞の可溶化物を直接、抗ＭＢＰ抗体固相化プレートに作用させて得られる融合タンパク質との複合体を使用するアッセイ方法が好ましい。
検出は、上記反応に使用したプレート上で、そのまま吸光度の測定が行なわれるため、ユビキチンの定量は格段と効率化される。反応物の吸光度測定システムとして、多サンプルを短時間で処理するために従来から用いられているマイクロタイタープレートを使用してもよい。３８４ウェル以上の高密度プレートを用いる場合、ＣＣＤカメラをベースとしたイメージング検出を可能とする機器も使用される。
本発明のスクリーニング方法により、スクリーニングされた物質、低分子化合物、その塩、又はその誘導体であって、シノビオリンのユビキチン化を阻害することが判明したものは、本発明の範囲に含まれる。
以上の方法により、シノビオリンのユビキチン化を調節する作用を有する物質を選択することができる。さらに上記ハイスループット・スクリーニング方法は、シノビオリンのユビキチン化の他に、シノビオリンが関与するシグナル伝達を担う他のタンパク質のユビキチン化に影響を与える化合物の検索にも応用可能である。
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
なお、以下において特にことわらない限り、％は重量％を意味する。

本実施例は、シノビオリンのインビトロ自己ユビキチン化をＥＬＩＳＡで検出するのに用いるビオチン化ＧＳＴ−ＨＡ−Ｕｂを作製することを目的とした。
まず、ＧＳＴ−ＨＡ−Ｕｂは、ユビキチンの全領域を含むｃＤＮＡを、ＧＳＴ及びＨＡ融合タンパク質のベクター（ｐＧＥＸ）に挿入し、大腸菌で融合タンパク質を産生し、グルタチオンセファロース^ＴＭ４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）カラムで精製することにより調製した。
次に、上記のように得られたＧＳＴ−ＨＡ−ＵｂをＮＨＳ（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）−ビオチンで標識し、ビオチン化した。このビオチン化ＧＳＴ−ＨＡ−ＵｂについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ニトロセルロース膜に転写し、ビオチン−アビジン−アルカリホスファターゼの系を用いて検出した。その結果、反応に用いるＮＨＳ−ビオチンの濃度依存的に、ＧＳＴ−ＨＡ−Ｕｂがビオチン化された（図１）。

本実施例は、ウエスタンブロッティング法を用いたシノビオリンのインビトロ自己ユビキチン化の確認することを目的とした。
（１）インビトロ自己ユビキチン化反応
最終濃度が５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２ｍＭ ＡＴＰ、０．２６７μｇ Ｅ１、０．３３３μｇ Ｅ２、１．７μｇビオチン化ＧＳＴ−ＨＡ−Ｕｂ、１μｇ ＭＢＰ−シノビオリンｄＴＭ Ｈｉｓｘ_１２となるように、上記組成物をチューブ内で調製し、３７℃で２時間恒温槽で反応させた。
反応に用いたＥ１（酵母由来）はＡｆｆｉｎｉｔｉ社より購入した。Ｅ２はＵｂｃＨ５ｃをＨｉｓタグ融合タンパク質のベクター（ｐＥＴ）に挿入し、大腸菌で融合タンパク質を産生し、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（キアゲン社）で精製することより得た。また、ビオチン化ＧＳＴ−ＨＡ−Ｕｂは実施例１で作製したものを用いた。ＭＢＰシノビオリンΔＴＭ−Ｈｉｓｘ_１２は、細胞膜貫通部分（ＴＭ）を欠損させたシノビオリン（Ｓｙｎｏｖｉｏｌｉｎ ΔＴＭ）をＭＢＰと融合させたものである。ＭＢＰシノビオリンｄＴＭ−Ｈｉｓｘ_１２は、大腸菌で融合タンパク質を産生し、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（キアゲン社）で精製することにより調製した。
（２）ウエスタンブロッティング法による自己ユビキチン化反応の検出
（１）のインビトロ自己ユビキチン化反応後にサンプルについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ニトロセルロース膜に転写した。次に、当該ニトロセルロース膜を５％スキムミルクでブロッキングし、その後１／１０００希釈したアビジン−アルカリフォスファターゼを加えて３０分振盪した。その後、ニトロセルロース膜をＴＢＳ−Ｔで洗浄し、Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｓｕｂａｔｒａｔｅ ｋｉｔ（ＢＩＯ ＲＡＤ社）で検出した。結果を図２に示す。図２に示すように、ビオチン化ＧＳＴ−ＨＡ−Ｕｂでシノビオリンがユビキチン化されたバンドが検出された。

本実施例は、ビオチン化ＧＳＴ−ＨＡ−Ｕｂを用いたシノビオリンのインビトロ自己ユビキチン化のＥＬＩＳＡ法による検出系を構築することを目的とした。
方法は、９６ウェルプレートにウェルあたり抗ＭＢＰ抗体１μｇを４℃で終夜コーティングし、１％ＢＳＡで４時間、室温でブロッキングした後、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（−）で洗浄し、ウェル内でＭＢＰ−シノビオリンΔＴＭ Ｈｉｓｘ_１２又はＭＢＰ−Ｈｉｓｘ_６を４℃で終夜反応させた。その後、上記の実施例２の方法に準じてビオチン化ＧＳＴ−ＨＡ−Ｕｂを用いたインビトロ自己ユビキチン化反応を行った。３７℃で２時間反応した後、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（−）でプレートを洗浄し、１％ＢＳＡで１時間、室温でブロッキングした後、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（−）で洗浄し、１／１０００希釈したアビジン−アルカリフォスファターゼを加えて３０分静置した。０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（−）で洗浄後、Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｓｕｂａｔｒａｔｅ ｋｉｔ（ＢＩＯ ＲＡＤ社）を加えて５分間静置した後、０．４Ｎの水酸化ナトリウムを加えて反応をとめた。その後、４２０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、ＭＢＰ−Ｈｉｓｘ_６（図３「ＭＢＰ」）と比較して多くのＭＢＰ−シノビオリンΔＴＭ Ｈｉｓｘ_１２（図３「Ｓｙｎｏ」）の自己ユビキチン化が、ＥＬＩＳＡ法で検出された（図３）。

本実施例では、ウエスタンブロッティング法（ＷＢ）を用いたシノビオリンのインビトロ自己ユビキチン化の確認における、インビトロ自己ユビキチン化の検出時のバックグラウンドを低減させることを目的に、反応に用いるユビキチンにＧＳＴ−ＨＡ−Ｕｂ又はＰｋ−Ｈｉｓ−ＨＡ−Ｕｂ Ｋ４８Ｒを用いたときのバックグラウンドの程度の比較を行った。
Ｐｋ−Ｈｉｓ−ＨＡ−Ｕｂ Ｋ４８Ｒは、Ｕｂの４８番目のリジンをアルギニンに変異させた変異体に、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ、Ｐｋサイトが結合したタンパク質である。Ｐｋ−Ｈｉｓ−ＨＡ−Ｕｂ Ｋ４８Ｒの作製は、Ｐｋサイトを挿入したＨｉｓ−ＨＡ−ユビキチン（Ｋ４８Ｒ）遺伝子をｐＥＴベクターに挿入し、大腸菌で融合タンパク質を産生し、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（キアゲン社）で精製することにより行なった。
方法は、実施例２で示すような通常のインビトロ自己ユビキチン化反応において、ＧＳＴ−ＨＡ−Ｕｂ、又はＰｋ−Ｈｉｓ−ＨＡ−Ｕｂ Ｋ４８Ｒを用いた。３７℃で２時間反応させた後、反応液についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ニトロセルロース膜に転写した。ニトロセルロース膜を５％スキムミルクでブロッキングし、次に１／２５００希釈（０．５％スキムミルクを含む）したα−ＨＡ（３Ｆ１０）（Ｒｏｃｈｅ社）を加えて１時間振盪した後、ＴＢＳ−Ｔで洗浄した。続いてα−ラットＩｇ ＨＲＰを加えて振盪した後、ＴＢＳ−Ｔで洗浄し、実験室で作製したＥＣＬで検出した。その結果、Ｐｋ−Ｈｉｓ−ＨＡ−Ｕｂ Ｋ４８Ｒを用いることにより、バックグラウンドが低下することが確認された（図４）。

本実施例では、実施例４においてインビトロ自己ユビキチン化のウエスタンブロッティング法による検出に有効であることが示されたＰｋ−Ｈｉｓ−ＨＡ−Ｕｂ Ｋ４８Ｒを、ＥＬＩＳＡ法による検出においても有用であるかを検討することを目的とした。
方法は、９６ウェルプレートにウェルあたり抗ＭＢＰ抗体１μｇを４℃で終夜コーティングし、１％ＢＳＡで４時間、室温でブロッキングした後、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（−）で洗浄し、ウェル内で１μｇのＭＢＰ−シノビオリンΔＴＭ Ｈｉｓｘ_１２又はＭＢＰ−Ｈｉｓｘ_６を４℃で終夜反応させた。その後、ＧＳＴ−ＨＡ−Ｕｂ（図５「ｗｔ」）又はＰｋ−Ｈｉｓ−ＨＡ−Ｕｂ Ｋ４８Ｒ（図５「Ｋ４８Ｒ」）を用いたインビトロ自己ユビキチン化反応を行った。３７℃で２時間反応した後、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（−）で洗浄した。その後、ブロックエースで１時間、室温でブロッキングした後、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（−）で洗浄し、１／２５００希釈（１／１０量のブロックエースを含む）したα−ＨＡ（３Ｆ１０）（Ｒｏｃｈｅ社）を加えて６０分静置した。０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（−）でプレートを洗浄した後、α−ｒａｔ ＩｇＧ ＨＲＰを加えて３０分静置した。０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（−）で洗浄後、ｏ−フェニレンジアミンを１００μｌ／ウェル加えて１５分静置し、２Ｎの硫酸を加えて反応を停止させ、４９２ｎｍの吸光度を測定した。
その結果、Ｐｋ−Ｈｉｓ−ＨＡ−Ｕｂを用いることにより、実施例３のＷＢの結果と同様にバックグラウンドの低下が示され、ＭＢＰ−シノビオリンΔＴＭ Ｈｉｓｘ_１２とＭＢＰ−Ｈｉｓｘ_６を用いたときの差が顕著に確認できた（図５）。

本実施例では、ビオチン化ユビキチンを用いたシノビオリンのインビトロ自己ユビキチン化のＥＬＩＳＡ法による検出系の構築を行うことを目的とした。
（１）クローニング
ｐＥＴ１０４．１−ＤＥＳＴにユビキチン又はＫＲ変異体（５種）をＧａｔｅｗａｙシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてクローニングした（ｐＥＴ１０４．１−ＤＥＳＴ／Ｕｂ）。
（２）インビボビオチン化タンパク質の精製
ＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）をｐＥＴ１０４．１−ＤＥＳＴ／Ｕｂで形質転換し、アンピシリンを含むＬ−ブロス１０ｍｌに加え、３７℃で終夜振盪培養した。この予備培養液１０ｍｌを、アンピシリンを含むＬ−ブロス５００ｍｌに加え、３７℃で振盪培養した。吸光度６００ｎｍを測定し、０．４を超えたのを確認後、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるように加え、３７℃で４時間、振盪培養した。集菌後、ＰＢＳ（−）に懸濁して、リゾチームを加え氷中に１０分静置したのち、ソニケーションした。洗浄バッファーを、終濃度が［１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ２−ＭＥ、１μｇ／ｍｌアプロチニン］となるように加えた。２１Ｇのシリンジを２度とおした後に、７，０００ｒｐｍで３０分間４℃で遠心分離し、上清を得た。ビーズはＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ａｇａｒｏｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた。Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ａｇａｒｏｓｅを５ｂｅｄ ｖｏｌ．の洗浄バッファーで３回洗浄した。上清に洗浄したビーズを加えて、４℃で終夜ローテートした。ビーズを５ｂｅｄ ｖｏｌ．の洗浄バッファーで３回洗浄後、１ｂｅｄ ｖｏｌ．の１ｘ ＰＢＳ（−）に懸濁しカラムにつめた。０．５ｂｅｄ ｖｏｌ．の溶出バッファー（５ｍＭビオチン、１ｘ ＰＢＳ）で１０回に分けて溶出した。溶出したタンパク質を１ｘ ＰＢＳ（−）で終夜透析後、回収した。その後にＣｅｎｔｒｉｃｉｎ ＹＭ−１０（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）を用いて濃縮した。その結果、インビボビオチン化ＢｉｏＥａｓｅ−Ｕｂが得られた（図６及び７）。
（３）ウエスタンブロッティング（ＷＢ）法を用いたシノビオリンのインビトロ自己ユビキチン化の確認
通常のインビトロ自己ユビキチン化反応で、インビボビオチン化ＢｉｏＥａｓｅ−Ｕｂ又はインビトロビオチン化Ｐｋ−Ｈｉｓ−ＨＡ−Ｕｂ ＷＴ又はインビトロビオチン化ＧＳＴ−ＨＡ−Ｕｂを用いた。終濃度が５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２ｍＭ ＡＴＰ、０．１２５μｇ Ｅ１、０．１６６μｇ Ｅ２、０．８５μｇ Ｕｂ、０．５μｇ ＭＢＰ−シノビオリンｄＴＭ Ｈｉｓｘ_１２となるように、チューブに入れ、３７℃で２時間、恒温槽で反応させた。その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ニトロセルロース膜に転写した。５％スキムミルクでブロッキング後に、１／１０００希釈したアビジン−アルカリフォスファターゼを加えて３０分間振盪した。その後、ＴＢＳ−Ｔで洗浄し、Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｋｉｔ（ＢＩＯ ＲＡＤ社）で検出した。インビトロビオチン化Ｐｋ−Ｈｉｓ−ＨＡ−Ｕｂ ＷＴ、インビボビオチン化ＢｉｏＥａｓｅ−Ｕｂ、インビトロビオチン化ＧＳＴ−ＨＡ−Ｕｂを用いてインビトロ自己ユビキチン反応を行った。
その結果、インビトロビオチン化Ｐｋ−Ｈｉｓ−ＨＡ−Ｕｂ ＷＴ、インビボビオチン化ＢｉｏＥａｓｅ−Ｕｂ、インビトロビオチン化ＧＳＴ−ＨＡ−Ｕｂで、シノビオリンのモノユビキチン化、ポリユビキチン化が確認できた（図８）。特にインビボビオチン化ＢｉｏＥａｓｅ−Ｕｂでは、バックグラウンドの低下が顕著に見られた。

ＥＬＩＳＡによるシノビオリンの自己ユビキチン化反応系の構築及び化合物の阻害活性の評価
本実施例は、ＥＬＩＳＡによる簡便な自己ユビキチン化反応のアッセイ系を構築し、自己ユビキチン化反応を阻害する化合物を評価することを目的とする。
（１）ＥＬＩＳＡによるシノビオリンの自己ユビキチン化反応系の検討
ＡＴＰ存在下あるいは非存在下で、ＭＢＰ−Ｓｙｎｏ ΔＴＭ−Ｈｉｓの濃度（図９）あるいはＰＫ−Ｈｉｓ−ＨＡ−Ｕｂの濃度（図１０）を変化させてインビトロ自己ユビキチン化反応（３０μｌ）を行った。反応液３０μｌに３０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを添加し、抗ＭＢＰ抗体をコートしたＥＬＩＳＡ用プレートにＭＢＰ−Ｓｙｎｏ ΔＴＭ−Ｈｉｓを結合させ、洗浄後に、抗ＨＡ抗体で検出した。
その結果、ＡＴＰ存在下の場合に、ＭＢＰ−Ｓｙｎｏ ΔＴＭ−Ｈｉｓの濃度（図９）及びＰＫ−Ｈｉｓ−ＨＡ−Ｕｂの濃度（図１０）に依存してシグナルの増強が認められた。
（２）ＡＴＰ，ＰＫ−Ｈｉｓ−ＨＡ−Ｕｂ，Ｅ１，Ｅ２及びＭＢＰ−Ｓｙｎｏ ΔＴＭ−Ｈｉｓの要求性ＡＴＰ，ＰＫ−Ｈｉｓ−ＨＡ−Ｕｂ，Ｅ１，Ｅ２及びＭＢＰ−Ｓｙｎｏ ΔＴＭ−Ｈｉｓを組み合わせてインビトロ自己ユビキチン化反応（３０μｌ）を行い、上記と同様の方法で検出した。
その結果、ＡＴＰ，ＰＫ−Ｈｉｓ−ＨＡ−Ｕｂ，Ｅ１，Ｅ２及びＭＢＰ−Ｓｙｎｏ ΔＴＭ−Ｈｉｓを全て組み合わせた場合にのみシグナルが検出された（図１１）。
（３）検出時の一次抗体（ウサギ抗ＨＡ抗体）及び二次抗体（抗ウサギＩｇＧ／ＨＲＰ）濃度の検討
ＡＴＰ存在下あるいは非存在下で、インビトロ自己ユビキチン化反応（３０μｌ）を行い、ウサギ抗ＨＡ抗体（１／１０００、１／２０００、１／４０００）及び二次抗体（１／２５００、１／５０００、１／１００００）の希釈倍率を変化させて検出した。
その結果、ＡＴＰ存在下の場合に、抗ＨＡ抗体濃度及び二次抗体濃度に依存してシグナルの増強が認められた（図１２）。

本発明のアッセイ方法によれば、シノビオリンのユビキチン化を高感度で、かつ短時間でアッセイすることができ、さらに、用いる試料が少量であるために低コストでアッセイすることができる。
上記アッセイ方法を利用した本発明のスクリーニング方法によれば、シノビオリンのユビキチン化に影響を与える物質のスクリーニングを行なう際、極めて多数の低分子化合物ライブラリーからハイスループットにスクリーニングすることができる。

Claims (8)

1. シノビオリンとユビキチンとを含む反応系で両者を反応させ、得られる反応産物からシノビオリンに結合したユビキチンの量を測定することを特徴とする、シノビオリンのユビキチン化活性を測定するためのアッセイ方法。
2. 上記反応が、シノビオリン又はその活性誘導体、ユビキチン、ユビキチン活性化酵素、ユビキチン結合酵素及びユビキチン化に必要な低分子の反応因子を含む系におけるユビキチン化反応である、請求項１記載の方法。
3. 上記測定が、シノビオリンに結合したユビキチンの量を測定するものである、請求項１又は２記載の方法。
4. 上記シノビオリンの活性誘導体が、シノビオリンとタグタンパク質との融合タンパク質である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 上記測定が、上記シノビオリンに結合したビオチン化ユビキチンをアビジンと反応させることにより、シノビオリンに結合したユビキチンの量を定量することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. シノビオリンのユビキチン化に対する調節作用を有する物質をスクリーニングする方法であって、次の工程を含むことを特徴とする方法：
   （ｉ）被験物質の存在下又は非存在下に、ユビキチンとシノビオリン又はその活性誘導体とを接触させる工程；
   （ｉｉ）シノビオリン又はその活性誘導体によるユビキチン化活性を測定する工程；並びに
   （ｉｉｉ）シノビオリンのユビキチン化活性を調節する被験物質の作用を、上記（ｉ）及び（ｉｉ）により得られた結果と、対照の結果とを比較して検出する工程。
7. シノビオリンのユビキチン化を測定するために少なくとも次のものを含んでなる、シノビオリンのユビキチン化アッセイを行なうためのキット：
   （ｉ）シノビオリン又はその活性誘導体及びユビキチン；並びに
   （ｉｉ）シノビオリンに結合したユビキチンの量を測定する工程で使用される試薬類。
8. ユビキチン活性化酵素、ユビキチン結合酵素、ユビキチン化に必要な低分子の反応因子及び緩衝液類をさらに含む請求項７記載のキット。

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