JP4458847B2 - インタクトな細胞において受容体の細胞内ドメインへのタンパク質の補充を観察するための方法およびキット - Google Patents
インタクトな細胞において受容体の細胞内ドメインへのタンパク質の補充を観察するための方法およびキット Download PDFInfo
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Description
a)細胞でのシグナロソーム形成の誘導、
b)細胞の溶解、
c)シグナロソーム内に受容体を捕捉できる1次抗体で被覆された固相での細胞溶解物のインキュベーション、
d)細胞溶解物からの固相の分離、および
e)タンパク質を検出できる2次抗体を使用する固相に結合したタンパク質の量の検出および測定
を含む方法に関する。
細胞への個々の分子の接触、受容体の細胞内ドメインへのタンパク質の結合またはシグナロソームの組立ての観察、ついで受容体へのアダプターおよび/もしくはシグナルタンパク質の結合、またはシグナロソームの組立てを阻害できる分子の選択を含む方法に関する。
a)第1のタグまたはポリペプチドに融合された膜タンパク質を過剰発現するための、および第2のタグに融合されたアダプター/シグナルタンパク質を発現するための発現プラスミド、
b)膜タンパク質に融合された第1のタグまたはポリペプチドに結合できる1次抗体で被覆されたELISAマイクロタイタープレート、
c)アダプター/シグナルタンパク質に融合された第2のタグに結合できる2次抗体、
d)HEK293細胞、
e)トランスフェクション試薬、
f)溶解緩衝液、
g)トランスフェクション反応におけるベクターの濃度、ならびにELISAおよび定量手段における抗体の濃度を記載するプロトコール
を含むキットに関する。
a)2つの発現プラスミド(一方は、第1のタグまたはCD40受容体の細胞外ドメインに融合された膜タンパク質を過剰発現するための発現プラスミド、他方は、第2のタグに融合されたアダプター/シグナルタンパク質を発現するための発現プラスミド)、
b)膜タンパク質に融合された第1のタグまたはCD40の細胞外ドメインに結合できる1次抗体で被覆されたELISAマイクロタイタープレート、
c)アダプター/シグナルタンパク質に融合された第2のタグに結合できる2次抗体、
d)トランスフェクション試薬、
e)溶解緩衝液、
f)トランスフェクション反応におけるベクターの濃度、ならびにELISAおよび定量手段における抗体の濃度を記載するプロトコール
を含むキットにも関する。
インタクトな細胞において、CD40受容体へのTNF受容体関連因子1(TRAF1)の補充を観察するために、CD40およびTRAF1をコードするプラスミド(実施例7に記載されるとおり作製)を、ヒト胚性腎臓293T細胞(HEK293、すなわちT抗原を過剰発現するATTC CRL−1573)を同時にトランスフェクションするために使用した(DuBridge et al. 1987)。2×105細胞を、3.5cm皿に播種し、37℃で、約16時間で増殖させ、ついでリン酸カルシウム法(Kingston et al. 1993)により、1μgのCD40発現プラスミド、およびTRAFをコードする2μgの発現プラスミドでトランスフェクションした。2つの発現プラスミド、TRAF1プラスミドとCD40プラスミドを、産生された全てのCD40分子を飽和するために、それぞれ2:1より大きな比率でトランスフェクションするために使用した。約27時間のトランスフェクションののち、細胞を、分離し、氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1回洗浄し、そして180μl溶解緩衝液[プロテアーゼインヒビターカクテル(0.16mM Pefabloc、105IUアプロチニン)、1%トリトンX100および0.1%アジ化Naを含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS)]を用いて界面活性剤抽出した。高レベルで発現される場合、CD40は、リガンドに独立してシグナル伝達する傾向があるので、溶解の前に、CD40リガンドまたは擬態抗CD40抗体で受容体を活性化する必要はない。この特徴は、TRAF遺伝子ファミリーの種々のメンバーに共通している(Boldin et al. 1995、Siegel et al. 2000およびChan et al. 2000)。
CD40へのTRAF補充を測定するために、多くの研究は、合成ペプチドまたはCD40シグナルドメインの可溶性フラグメントに対するTRAF結合を探査する実験系に依存していた(Rothe et al. 1994, Hu et al. 1994, Cheng et al. 1995, Mosialos et al. 1995, Ishida et al. 1996, Ishida et al. b 1996, Boucher et al. 1997, Pullen et al. 1998およびPullen et al. 1999)。これらの方法の潜在的な問題は、シグナロソームの組立てが、「膜近傍の」環境で起こらないことである。そこで、細胞溶解物に対するCD40インタクトな細胞によるTRAF1およびTRAF2の補充を比較した。実験では、CD40とTRAF1またはTRAF2を、293T細胞中で同時に発現、または個別に発現させた(以下の実施例7に記載される構築物)。プラスミド濃度および比率は、実施例1に記載される実験と同一であった。27時間後、細胞を、実施例1でと同様に界面活性剤で溶解させた。目的のCD40またはTRAFのみを発現する293T細胞からの抽出物を、1:1の比で混合し、4℃で一晩インキュベーションした。目的のCD40とTRAFの両方を発現する抽出物も、同一条件下で維持した。そののち、サンプルを、実施例1に記載されるとおりCD40の細胞外ドメインに対するmAbで被覆したマイクロタイタープレートでインキュベーションした。洗浄工程ののち、CD40結合TRAFを、抗TRAF抗体で検出した(実施例1)。CD40へ補充されたTRAFの定量を、以下の実施例3に記載されるとおり行なった。図2Bに見られるとおり、CD40細胞溶解物に対するTRAF1またはTRAF2結合が、かろうじて検出できたのに対して、インタクトな細胞中でシグナロソームの組立てが起こった、CD40とTRAF1またはTRAF2のあいだの相互作用は、明らかに改善された感受性で測定できた(図2A)。
CD40へのTRAFの補充は、実施例1に記載されるアッセイを使用して定量的に測定できる。その目的のために、アッセイ条件を、TRAF発現がCD40の発現より明らかに過剰であるような方法に調節した。これは、TRAF発現プラスミドが、CD40発現プラスミドよりも2〜3倍過剰に使用した場合である。CD40結合TRAF濃度を、実施例1で記載されるとおり測定した。CD40/TRAF複合体を含む照準抽出物は、各アッセイで基準としての役割を果たした。この基準抽出物は、CD40/TRAF1、CD40/TRAF2、CD40/TRAF3、CD40/TRAF5およびCD40/TRAF6をコードするプラスミドで同時にトランスフェクションされた細胞からの大量プールの抽出物からなる。抽出物を、CD40/TRAF複合体の存在について試験し、各抽出物中の複合体濃度を、1000U/mlと任意に定義した。抽出物を、少量に等量に分けて凍結し、さらに使用するまで−80℃で維持した。未知のサンプルをこれらの抽出物と比較することによって、任意のユニットでCD40−TRAF複合体の濃度を相対的に決定することができた。CD40発現でのサンプル−対−サンプル偏差に必須の正規化を、以下の式で計算した:
配列比較、突然変異分析および結晶化研究は、コンセンサス配列PxQET254およびQxPxE235x−酸性を示すCD40中の2つのTRAF相互作用部位をマッピングした。CD40中の両方のTRAF結合モチーフは、インビトロでのTRAF1、2、3、5および6の補充を仲介することが示された。アラニンの変異が、対応のTRAF結合を完全に消失させたので、いくつかの結合研究により、TRAF6結合は、235位のグルタミン酸(E235)に基本的に依存し(Pullen et al. 1999, Tsukamoto et al. 1999)、TRAF1、2、3および5は、254位のトレオニン(T254)に依存する(Hu et al. 1994, Cheng et al. 1996, Boucher et al. 1997, Pullen et al. 1999, Hanissian et al. 1997)ことが示された。本明細書に記載されるとおり、CD40へのTRAF補充を測定するために、ほとんどの研究は、合成ペプチドまたはCD40シグナルドメインの可溶性フラグメントに対するTRAF結合を探査する実験系に依存していた。
CD40の細胞外ドメイン、および以下の受容体:BCMA(Madry et al. 1998およびHatzoglou et al. 2000)、LTβR受容体(Mosialos et al. 1995, Crowe et al. 1994, Nakano et al. 1996)、TACI(von Bulow et al. 1997, Xia et al. 2000)、p75TNFR(Rothe et al. 1994)およびCD27(Gravestein et al. 1998, Akiba et al. 1998)(構築物の詳細は、実施例7を参照のこと)の内のいずれかの膜貫通および細胞内ドメインを含むハイブリッド受容体をコードする発現プラスミドで細胞を形質転換させることにより、CD40および異なる受容体への種々のTRAFの補充を、実施例1に記載される補充アッセイによって試験した。実施例1に記載されるELISAサンドイッチ、および実施例3に記載される定量を使用して、TRAFをコードするプラスミドとともに前記ハイブリッド受容体のいずれか1つをコードするプラスミドで293T細胞を同時にトランスフェクションし、TRAF/受容体複合体を測定することにより、BCMA、LTβR−受容体、TACI、p75TRAFまたはCD27のシグナルドメインに対するTRAF補充の測定を行なった。ハイブリッド受容体を用いたアッセイは、図4Aに概要的に表される。図4Bに示される結果は、インタクトな細胞での補充を観察するアッセイを使用して、TNF/NGFファミリーの任意のTRAF補充受容体を、実施例1に記載されるのと同じ抗体サンドイッチアッセイで試験でき、TRAF−受容体/CD40ハイブリッド複合体の量を、実施例3に記載されるとおり観察できる。結果は、LTβRおよびp75TNFRへのTRAF1の補充が、CD40へのその補充より25倍高いこと、そしてLTβRおよびp75TNFRへのTRAF2の補充が、CD40へのその補充より約60倍高いことを示す。試験された受容体の全てへのTRAF3の補充は、類似している。TRAF5は、LTβRへ例外的に高く補充され、この受容体への補充は、CD受容体への補充より約152倍高い。TRAF6は、CD40受容体への補充よりも約10倍高くBCMA、TACIおよびp75TNFRに補充される。
実施例1に記載されるアッセイは、アダプタータンパク質(たとえば、TRAF2)を介したサイトカイン受容体(たとえば、CD40)へのシグナルタンパク質(たとえば、NIK(NF−κB経路での下流メディエーター、Malinin et al. 1997))の補充を測定するために使用できる。CD40、TRAF2、NIK(pcDNA3.1中)およびmycタグ付IKKαをコードする発現プラスミドを、293Tに(それぞれ、1:1.75:1.75:1.75の比率で)同時にトランスフェクションした。空のベクターを、トランスフェクションされたDNAと等量使用した。トランスフェクションを、実施例1に記載されるとおり行なった。27時間後、細胞を、実施例1に記載されるとおり抽出した。溶解物を、抗CD40mAbで被覆したELISAプレートでインキュベーションした(R01、Schwabe et al. 1997)。2時間後、プレートを、PBS/Tweenで洗浄し、そして商業的に入手可能なウサギ抗NIK抗体(サンタクルーズ、1:100希釈、SC−6363)およびHRP標識ヤギ抗ウサギIg抗体(ファルミンゲン)で展開した。NIKについての補充アッセイは、図5Aに概要的に表される。図5BおよびCに示されるとおり、CD40へのNIKの補充は、TRAF2依存性であり、IKKが同時に発現されるとき明らかに改善された。
ヒトCD40cDNAを、Hessら(1995)により記載されるとおりクローンニングした。CD40cDNAを、pEF−BOS(プラスミドサイズ6164Bp)に挿入した。
コンビナトリアルケミストリーにより、小型非ペプチド分子のライブラリーを調製した。コンビナトリアルケミストリー技術の設計は、当技術分野に周知であり、たとえば、Hermkensら(1996)に記載されている。CD40およびTRAF2を過剰発現する細胞を、個々の合成有機化合物に接触させ、実施例1に記載されるとおり補充を試験し、実施例3のように定量した。
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Claims (42)
- 細胞における受容体の細胞内ドメインへのタンパク質の結合を観察する方法であって、
a)受容体の過剰発現または受容体の活性化による、細胞でのシグナロソーム形成の誘導、
b)細胞の溶解、
c)シグナロソーム内の受容体を捕捉できる1次抗体で被覆された固相での細胞溶解物のインキュベーション、
d)固相からの細胞溶解物の分離、および
e)形成されたシグナロソーム内のタンパク質を検出できる2次抗体を使用する、固相に受容体およびその1次抗体を介して結合した該タンパク質の量の検出および測定
を含む方法。 - 受容体の活性化が、受容体に対するリガンドで細胞を処置することによって誘導される請求項1記載の方法。
- 受容体の活性化が、受容体のクロスリンクによって誘導される請求項2記載の方法。
- クロスリンクが、受容体特異的抗体によって誘導される請求項3記載の方法。
- 前記受容体が、CD40、BCMA、LTβR受容体、TACI、p75TNFRおよびCD27から選択される請求項1、2、3または4記載の方法。
- 受容体およびその1次抗体を介して固相に結合した前記タンパク質が、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5およびTRAF6から選択されるアダプタータンパク質である請求項1、2、3、4または5記載の方法。
- 受容体およびその1次抗体を介して固相に結合した前記タンパク質が、酵素である請求項1、2、3、4または5記載の方法。
- 前記酵素が、キナーゼである請求項7記載の方法。
- 前記キナーゼが、NIKである請求項8記載の方法。
- 受容体およびその1次抗体を介して固相に結合した前記タンパク質が、IKKである請求項1、2、3、4、5、6、7または8記載の方法。
- 前記受容体が、その細胞外ドメインでポリペプチドまたはペプチドに融合され、1次抗体が、該融合ポリペプチドまたはペプチドに特異的である請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9または10記載の方法。
- 前記融合ペプチドが、特異的タグであり、1次抗体が該タグに特異的である請求項11記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、受容体の細胞外ドメインであり、1次抗体が該細胞外ドメインに特異的である請求項11記載の方法。
- 前記融合ポリペプチドが、CD40の細胞外ドメインである請求項13記載の方法。
- 受容体およびその1次抗体を介して固相に結合した前記タンパク質が、タグに融合され、2次抗体が該タグに特異的である請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13または14記載の方法。
- 前記タグが、ヒスチジン、FLAG(商標)、VSV−G、プロテイン−Cおよびc−mycタグから選択される請求項15記載の方法。
- 細胞において受容体の細胞内ドメインへのアダプタータンパク質および/またはシグナルタンパク質の結合を阻害する分子のスクリーニング方法であって、
細胞への個々の分子の接触、請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15または16記載の方法による、受容体の細胞内ドメインへのタンパク質の結合の観察、および受容体へのアダプターおよび/またはシグナルタンパク質の結合を阻害できる分子の選択を含む方法。 - スクリーニングされる分子が、合成有機化合物である請求項17記載の方法。
- 細胞においてシグナロソームの組立てを阻害する分子のスクリーニング方法であって、
a)細胞でのシグナロソーム形成の誘導、
b)細胞への個々の生成分子の接触、
c)細胞の溶解、
d)シグナロソーム内の受容体を捕捉できる1次抗体で被覆された固相での細胞溶解物のインキュベーション、
e)固相からの細胞溶解物の分離、
f)受容体以外のシグナロソーム構成要素のいずれかを検出できる2次抗体を使用する、形成されたシグナロソームの量の検出および測定、および
g)シグナロソーム形成を阻害できる分子の選択
を含む方法。 - シグナロソーム形成が、いくつかまたは全てのシグナロソーム構成要素の過剰発現によって誘導される請求項19記載の方法。
- シグナロソーム形成が、受容体の活性化によって誘導される請求項19記載の方法。
- 受容体の活性化が、受容体に対するリガンドで細胞を処置することによって誘導される請求項21記載の方法。
- 受容体の活性化が、受容体のクロスリンクによって誘導される請求項21記載の方法。
- クロスリンクが、受容体特異的抗体によって誘導される請求項23記載の方法。
- シグナロソーム内の受容体が、CD40、BCMA、LTβR受容体、TACI、p75TNFRおよびCD27から選択される請求項19、20、21、22、23または24記載の方法。
- 測定される受容体とは異なるシグナロソーム構成要素が、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6から選択されるアダプタータンパク質である請求項19、20、21、22、23、24または25記載の方法。
- 受容体とは異なるシグナロソームで観察される構成要素が、酵素である請求項19、20、21、22、23、24、25または26記載の方法。
- 前記酵素が、キナーゼである請求項27記載の方法。
- 前記キナーゼが、NIKである請求項28記載の方法。
- 測定される受容体とは異なるシグナロソーム構成要素が、IKKである請求項19、20、21、22、23、24、25、26、27または28記載の方法。
- シグナロソーム内の受容体が、その細胞外ドメインでペプチドまたはポリペプチドに融合され、1次抗体が、該融合ペプチドまたはポリペプチドに特異的である請求項19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、特異的タグである請求項31記載の方法。
- 前記融合ポリペプチドが、受容体の細胞外ドメインである請求項31記載の方法。
- 前記融合ポリペプチドが、CD40の細胞外ドメインである請求項33記載の方法。
- 測定される受容体とは異なるシグナロソーム構成要素が、タグに融合され、2次抗体が、該タグに特異的である請求項19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33または34記載の方法。
- 前記タグが、ヒスチジン、FLAG(商標)、VSV−G、プロテイン−Cおよびc−mycタグから選択される請求項35記載の方法。
- スクリーニングされる分子が、合成有機化合物である請求項19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35または36記載の方法。
- 細胞における特異的な膜タンパク質へのアダプターおよび/またはシグナルタンパク質の結合を測定および定量するためのキットであって、
a)第1のタグまたはポリペプチドに融合された膜タンパク質を過剰発現するための発現プラスミド、および第2のタグに融合されたアダプター/シグナルタンパク質を発現するための発現プラスミド、
b)膜タンパク質に融合された第1のタグまたはポリペプチドに結合できる1次抗体で被覆されたELISAマイクロタイタープレート、
c)アダプター/シグナルタンパク質に融合された第2のタグに結合できる2次抗体、
d)トランスフェクション試薬、
e)溶解緩衝液、
f)トランスフェクション反応におけるベクターの濃度、ならびにELISAおよび定量手段における抗体の濃度を記載するプロトコール
を含むキット。 - 前記タグが、ヒスチジン、FLAG(商標)、VSV−G、プロテイン−Cおよびc−mycタグから選択される請求項38記載のキット。
- 前記融合ポリペプチドが、CD40受容体の細胞外ドメインである請求項38記載のキット。
- 細胞において受容体の細胞内ドメインへのアダプタータンパク質および/またはシグナルタンパク質の結合を阻害する分子のスクリーニング方法であって、
個々の分子が接触されたトランスフェクション細胞での、請求項38または39記載のキットを使用する、受容体の細胞内ドメインへのタンパク質の結合の観察、および受容体へのアダプターおよび/またはシグナルタンパク質の結合を阻害できる分子の選択を含む方法。 - スクリーニングされる分子が、合成有機化合物である請求項41記載の方法。
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