KR20060053009A - 활막세포 단백질 - Google Patents

활막세포 단백질 Download PDF

Info

Publication number
KR20060053009A
KR20060053009A KR1020067006403A KR20067006403A KR20060053009A KR 20060053009 A KR20060053009 A KR 20060053009A KR 1020067006403 A KR1020067006403 A KR 1020067006403A KR 20067006403 A KR20067006403 A KR 20067006403A KR 20060053009 A KR20060053009 A KR 20060053009A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
protein
cynoviolin
polynucleotide
activity
ala
Prior art date
Application number
KR1020067006403A
Other languages
English (en)
Inventor
토시히로 나카지마
테쯔야 아마노
Original Assignee
가부시키가이샤 로코모젠
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가부시키가이샤 로코모젠 filed Critical 가부시키가이샤 로코모젠
Publication of KR20060053009A publication Critical patent/KR20060053009A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • A01K67/027—New breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • A01K67/027—New breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knockout animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/104—Aminoacyltransferases (2.3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/02—Aminoacyltransferases (2.3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y603/00—Ligases forming carbon-nitrogen bonds (6.3)
    • C12Y603/02—Acid—amino-acid ligases (peptide synthases)(6.3.2)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • A01K2267/0325—Animal model for autoimmune diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Abstract

본 발명은 신규 단백질 시노비올린(synoviolin)과 이를 코드하는 유전자를 개시한다. 이 단백질은 활막조직에 특이적으로 발현함과 동시에 만성 류마티스 관절염(RA) 환자에 있어서 본 단백질을 인식하는 자기항체의 존재를 수반한다. 본 발명의 단백질 또는 그 항체는 RA의 특이적인 진단 마커로서 기대된다. 또, 본 발명의 유전자 또는 단백질을 이용하여 RA의 치료약 스크리닝의 가능성을 준다. 또, 본 발명은 시노비올린 유전자의 트랜스제닉 동물을 제공한다. 본 발명의 트랜스제닉 동물은 RA의 모델 동물로서 RA 치료약 개발에 이용될 수 있다.
시노비올린, 류마티스 관절염

Description

활막세포 단백질{Synovial Membrane Cell Protein}
도 1은 항활막세포 항혈청에 의한 이뮤노스크리닝에 있어서 양성 콜로니의 사진이고,
도 2는 대장균에서의 시노비올린 재조합 단백질의 발현을 나타내는 사진이고,
도 3은 시험관내에서의 시노비올린 cDNA에서 번역되는 시노비올린 단백질 발현을 나타내는 오토레디오그래프의 사진이고,
도 4는 시노비올린의 cDNA를 프로브로 한 노던블롯법에 의한 시노비올린 유전자 발현의 분석결과를 나타내는 오토레디오그래프의 사진이고.
도 5는 각종 세포파쇄액의 항활막세포 항혈청에 의한 웨스턴블롯법의 결과와 GST-부분 시노비올린에 의한 항체 흡수실험의 결과를 나타내는 사진으로서, 화살표는 흡수된 밴드를 나타내고 각 밴드의 분자량은 위에서 차례로 약 220, 185 및 140 kDa이었고,
도 6은 활막세포 파쇄액에 대한 활막세포 항혈청을 이용한 웨스턴블롯법의 결과를 나타내는 오토레디오그래프의 사진으로서, 왼쪽의 레인(프리이뮨; preimmune)은 활막세포 면역전의 토끼 항혈청, 오른쪽의 레인(면역후;post- immune)은 활막세포 항혈청을 이용하였고,
도 7은 활막세포의 항활막세포 항혈청(A) 및 정제 항활막세포 항체(B)에 의한 형광면역 염색의 결과를 나타내는 형광현미경 사진이고,
도 8은 활막조직의 항활막세포 항혈청에 의한 면역염색과 GST-부분 시노비올린에 의한 항체흡수실험을 나타내는 현미경 사진이고,
도 9는 활막세포의 정제 항활막세포 항체에 의한 면역염색의 결과를 나타내는 현미경 사진으로서, GST 친화성 컬럼에 의해 정제한 항혈청(상 패널) 및 GST-부분 시노비올린 친화성 컬럼에 의해 정제한 항혈청(하 패널)을 이용한 결과이고,
도 10은 각종 인간혈청 중의 항시노비올린 항체의 웨스턴블롯법에 의한 검출결과를 나타내는 시노비올린의 오토레디오그램이고,
도 11은 SL의 cDNA를 프로브로 하는 서던블롯법에 의한 활막세포에 있어서 SL 유전자의 발현을 분석한 결과를 나타내는 오토레디오그래프의 사진이고,
도 12는 [32P] 라벨된 HA-시노비올린-HAHA와 GST-SL 융합단백질과의 결합을 나타내는 오토레디오그래프의 사진이고,
도 13은 활막세포의 증식에 대한 시노비올린의 영향을 MTT 에세이로 분석한 결과를 나타내는 것으로, GST-부분 시노비올린을 이용하였고,
도 14는 시노비올린 유전자 도입용 벡터의 구조를 나타내는 것으로, CMV 인헨서를 지니는 β-액틴 프로모터에 의해 시노비올린은 전신적으로 발현하고, 항 Flag태그(Flga-tag) 항체에 의해 Flag 태그 융합 시노비올린 단백질의 발현이 확인될 수 있고,
도 15는 시노비올린 유전자의 트랜스제닉 마우스의 관절염을 나타내는 지관절을 나타내는 사진으로, 시노비올린 강제 발현 마우스의 지(toe)의 외견 및 연 X선상(soft X-ray image)을 나타내고, 오른쪽단에 정상 마우스의 연 X선상을 비교하여 나타내었고, 시노비올린 강제 발현 마우스는 현저한 지의 팽창을 나타내었고,
도 16은 시노비올린 유전자 트랜스제닉 마우스의 관절염을 보이는 지관절의 조직학적 소견을 나타내는 사진으로, 현저한 팽창을 나타낸 지의 관절부분에 있어서 현저한 활막증식에 수반하는 골파괴와 이상한 골신생이 확인되었고,
도 17은 유전자 도입 마우스의 정상적인 지관절의 조직학적 소견을 나타내는 사진으로, 관절연골의 이상, 골파괴 및 활막의 증식은 확인되지 않고, 오른쪽 아래 패널은 항 Flag 항체에 의한 면역염색의 결과를 나타내고 양성 신호는 관찰되지 않고,
도 18은 시노비올린 유전자 트랜스제닉 마우스의 관절염을 보이는 지관절에 있어서 시노비올린의 발현을 나타내는 사진으로, 항 Flag 항체에 의한 면역염색을 행하였고, 현저한 팽창을 나타낸 지의 관절부위에 있어서 증식한 활막조직 및 연골세포에 시노비올린의 발현이 확인되었고,
도 19는 시노비올린 유전자를 결손시키는 타게팅 벡터의 구조를 나타내는 사진으로, 마우스 시노비올린 유전자 단편의 번역개시점(제1 메티오닌을 번역하는 ATG 코돈; "*"으로 표시)에 lacZ 유전자를 도입하고 파지티브 셀렉션(positive selection) 마커 유전자로서 네오마이신 내성(neo) 유전자를 도입하였고, 또 디프테리아 독소A(DT-A) 유전자도 결합시켜 네가티브 셀렉션(negative selection) 마커 로 하였고, 상동 재조합을 야기한 개체는 시노비올린 유전자의 발현이 결손되는 대신에 β-갈락토시다아제가 발현되고, 그 효소활성을 이용한 LacZ 염색에 의해 시노비올린 유전자의 프로모터에서의 발현을 검출할 수 있고(도 22 참조), 유전자형 확인을 위한 서던블롯 분석(도 20 참조)에 이용한 프로브의 위치도 도시되었고,
도 20은 시노비올린 유전자 결손 마우스의 유전자형의 분석의 결과를 나타내는 사진으로, 생후 약 2주령의 마우스 털(야생형 및 헤테로 결손 마우스) 또는 태생 14.5일 태아(호모 결손 마우스)에서 DNA를 추출하고 PstI로 소화후에 도 19에 나타난 프로브를 이용하여 서던블롯하였고,
도 21은 시노비올린 유전자 결손 마우스이 노던블롯 분석의 결과를 나타내는 사진으로, 야생형 (+/+), 시노비올린 유전자 헤테로 넉아웃 마우스 (+/-) 및 호모 넉아웃 마우스 (-/-)에서 mRNA를 추출하고 시노비올린 유전자 단편을 프로브로 노던블롯을 하고(상 패널) 하 패널에 아가로오즈 겔의 EtBr 염색을 나타내었고,
도 22는 LacZ 염색에 의해 시노비올린 발현 부위를 검토한 결과를 나타내는 사진으로, 태생 12.5일령 또는 태생 13.5일령의 야생형 및 헤테로 결손 마우스를 LacZ에 의해 염색하였고, 시노비올린의 태생기에 있어서 발현은 두정골, 사지, 귀 등의 골 및 연골이 형성되는 부위에서 강하게 확인되었고,
도 23은 사지형성기에 있어서 시노비올린의 발현을 나타내는 사진으로, 사지형성기에 있어서 시노비올린의 발현은 FGF4, BMP2, BMP4의 발현과 마찬가지로 Apical Ectodermal Ridge(AER; 외배엽 정제)에서 강하게 확인되었고,
도 24는 헤테로 결손 마우스의 태생 13일령의 지아(limb bud)의 연결단편의 LacZ 염색을 나타내는 사진으로, 4시간 염색을 행하였고, LacZ의 청색이 미분화 간엽계의 세포(골·연골의 원기)에 염색되어 있고, 오리지날 배율은 ×40이고,
도 25는 헤테로 결손 마우스의 태생 13일령의 지아(limb bud)의 연결단편의 LacZ 염색을 나타내는 사진으로, 4시간 염색을 행하였고, LacZ의 청색이 미분화 간엽계의 세포(골·연골의 원기)에 염색되어 있고, 오리지날 배율은 ×200이며 A, B 및 C는 도 24에 대응하고,
도 26은 태생 12.5일령 및 태생 13일령에 있어서 시노비올린 유전자 호모 결손 마우스의 표현형을 나타내는 사진으로, 태생 12.5일령 및 태생 13일령에 있어서 시노비올린 유전자 호모 결손 마우스는 헤테로 결손 마우스와 비교하여 두정부에서 둔부까지의 길이가 짧아지고 두개나 사지의 형성이 미숙한 경향이 확인되었고, 태생 13일령의 헤테로 결손 마우스와 야생형 마우스의 표현형에서는 현저한 차이가 확인되지 않았고,
도 27은 태생 14.5일령에 있어서 시노비올린 유전자 결손 마우스의 표현형을 나타내는 사진으로, 태생 14.5일령의 시노비올린 유전자 호모 결손 마우스에 지아 이상이 확인되었고,
도 28는 태생 14.5일령의 시노비올린 유전자 호모 결손 마우스의 후지(hind limbs)에 있어서 LacZ의 발현(시노비올린의 발현을 반영)을 나타내는 사진으로, 호모 결손 마우스의 이상한 후지에 있어서 LacZ은 AER 및 미분화 간엽계 세포의 농축부위에 발현이 확인되었고,
도 29는 태생 15.5일령의 시노비올린 유전자 결손 마우스의 표현형을 나타내 는 사진으로, 호모 결손 마우스는 지아 이상, 상악, 하악골의 이상, 귀의 형태 이상이 확인되었고, 심근의 박동은 확인되지 않고 생존하고 있지 않았고,
도 30은 태생 15.5일령에 있어서 시노비올린 유전자 결손 마우스의 골격을 나타내는 사진으로, 알샨블루(Alcian blue), 아리자린레드(Alizarin red) 염색을 나타내고 알샨블루에 의해 염색된 연골 및 아리잘린레드에 의해 염색된 좌회화된 골은 시노비올린 호모 결손 마우스로 확인되었고,
도 31은 시노비올린 넉아웃 마우스에 있어서 항콜라겐 항체 칵테일을 이용한 마우스 관절염 모델을 나타내는 사진으로, 야생형 마우스 [373(+/+)] 또는 시노비올린 헤테로 넉아웃 마우스 [372(-/+)]에 항콜라겐 항체 칵테일을 투여하여 관절염을 야기시켰고(도 중 +), 비투여의 야생형 마우스 (-)도 관찰되었고[371(+/+)], 그 결과, 전지(front limbs) 및 후지(hind limbs) 모두 관절의 팽창 및 발적과 동시에 야생형에 비해 시노비올린 헤테로 넉아웃 마우스에서는 경도였고, 즉, 야생형 마우스로 유발되는 관절염에 비해 시노비올린 헤테로 넉아웃 마우스에서는 관절염의 야기가 강한 것이 확인되었고,
도 32는 시노비올린 유전자 호모 결손 마우스(13 dpc 태아)의 지아에서 얻어진 초대배양세포의 LacZ 염색 및 알샨블루 염색을 나타내는 사진으로, LacZ 양성의 콜로니(즉, 시노비올린 발현 세포)와 알샨블루 염색 양성의 콜로니는 일치하고 있고, 그 결과는 골·연골분화에 시노비올린이 관여하는 것을 시사하고, 계대수 1(p1),
도 33은 13 dpc 마우스 태아의 지아에서 얻어진 초대배양세포의 LacZ 염색을 나타내는 사진으로, 야생형 (+/+), 시노비올린 유전자 헤테로 (+/-) 또는 호모 (-/-) 결손 마우스 유래의 세포가 나타나 있고, 시노비올린 유전자 결손 마우스(lacZ 유전자의 넉인)에서만 LacZ의 발현이 발견되었고, 계대수 1(p1),
도 34는 시노비올린 유전자 헤테로 결손 마우스(13 dpc 태아)의 지아에서 얻어진 초대배양세포의 LacZ 염색 및 알샨블루 염색을 나타내는 사진으로, LacZ 양성의 콜로니(즉, 시노비올린 발현세포)와 알샨블루 염색 양성의 콜로니는 일치하고 있고, 계대수 1(p1),
도 35는 야생형 마우스(13 dpc 태아)의 지아에서 얻어진 초대배양세포의 LacZ 염색 및 알샨블루 염색을 나타내는 사진으로, LacZ에 의한염색은 관찰되지 않고, 계대수 1(p1),
도 36은 시노비올린 유전자 헤테로 결손 마우스(13 dpc 태아)의 지아에서 얻어진 초대배양세포의 LacZ 염색을 나타내는 사진으로, 2핵의 전형적인 연골세포에 있어서도 LacZ 염색(시노비올린의 발현)이 발견되고(200배의 상을 참조),
도 37은 마우스 태아의 지아에서 얻어진 초대배양세포의 von Kossa 염색을 나타내는 사진으로, 야생형(WT), 시노비올린 유전자 헤테로(Hetero) 또는 호모(Homo) 결손 마우스 유래의 세포가 시사되고 있고, 시노비올린 유전자 결손 마우스(Homo)에 있어서 골형성능의 저하가 확인되고, 계대수 1(p1),
도 38은 시노비올린 호모 결손 마우스 태아의 지아에서 얻어진 초대배양세포(계대수 3; p3)의 LacZ 염색을 나타내는 사진으로, 서브컨플루언트(subconfluent)하게 될 때까지 배양하였고, LacZ 염색(overnight)을 한 후, 헤마 톡시린에오신(hematoxylin eosin, HE) 염색을 행하였고,
도 39는 시노비올린 유전자 헤테로 넉아웃 마우스(lacZ 유전자 넉인)의 초대세포의 β-gal 에세이의 결과를 나타내는 것으로, 시료는 각각 3번씩 측정하여 그 평균으로 표준편차를 나타내었고,
도 40은 시노비올린 유전자 헤테로 넉아웃 마우스(lacZ 유전자 넉인)의 초대세포의 β-gal 에세이의 결과에 의해 시노비올린 프로모터 활성에 대한 각종 약제의 영향을 조사한 결과를 나타내는 것으로, 시료는 각각 3번씩 측정하여 그 평균으로 표준편차를 나타내고,
도 41은 Syno-P3을 면역한 마우스 혈청의 ELISA의 결과를 나타내는 것으로, 3개체(No. 1-3)에서 얻은 혈청을 도시한 배율로 희석하고 ELISA를 행하였고, 비면역 마우스의 혈청(도중, 정상)을 대조로 이용하였고,
도 42는 Syno-P2를 면역한 마우스 혈청의 ELISA의 결과를 나타내는 것으로, 3개체(No. 1-3)에서 얻은 혈청을 도시한 배율로 희석하고 ELISA를 행하였고, 비면역 마우스의 혈청(도중, 정상)을 대조로 이용하였고,
도 43은 Syno-P1을 면역한 마우스 혈청의 ELISA의 결과를 나타내는 것으로, 3개체(No. 1-3)에서 얻은 혈청을 도시한 배율로 희석하고 ELISA를 행하였고, 비면역 마우스의 혈청(도중, 정상)을 대조로 이용하였고,
도 44는 항시노비올린 모노클로날 항체에 의해 RA 및 OA 환자 유래 활막세포의 웨스턴블롯(A) 및 형광면역염색(B)의 결과를 나타내는 것이고,
도 45는 항시노비올린 모노클로날 항체에 의한 RA 환자 유래 활막세포의 면 역염색의 결과를 나타내는 것으로, 헤마톡실린·에오신(HE) 염색상도 나타나고,
도 46은 시노비올린의 자기 유비퀴틴화 활성을 나타내는 것으로, FLAG-시노비올린을 GST-HA-유비퀴틴, ATP, E1 및 E2의 존재하에서 반응시켜 항FLAG 항체 및 항HA 항체에 의해 시노비올린의 유비퀴틴화를 검출하였다(CE: 세포추출액, IP: 면역침강물).
본 발명은 만성 류마티스 관절염(이하, RA라고 약칭함)에 관련된 신규 단백질, 상기 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오타이드 및 상기 단백질이나 폴리뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는 RA의 특이적 진단 마커로서 기대되는 신규 단백질에 관한 것이다. 또, RA의 치료약 개발에 새로운 접근을 제공하는 신규 유전자에 관한 것이기도 하다.
RA는 관절의 활막조직에 특이적 증식이 발견되는 전신성의 만성염증성 질환이다. 활막세포(synovial cell)는 관절의 활막에서 1 내지 6층의 상피양 층을 형성하는 섬유아세포양의 세포이며 활액에 프로테오글리칸이나 히알론산을 공급하는 것으로 생각되고 있다. RA 환자의 관절에서는 활막조직의 증식, 그 결과로서 유발되는 다층구조, 활막세포의 다른 조직으로의 침윤과 같은 증상이 관찰된다. 또, RA 환자의 혈청 중에는 자기의 IgG의 Fc 영역에 대한 자기항체가 존재하기 때문에 자기면역질환의 하나로서 생각되고 있지만, 그 병인에 관하여는 아직 해명되지 않았다.
전술한 자기의 IgG를 인식하는 자기항체의 존재는 RA의 특징적인 진단지표로서 예전부터 이용되어 왔다. 최근에는 변성 인간 IgG를 주성분으로 하는 자기항체 검출용 키트가 상업적으로 공급되고 있다. 즉, 이 자기항체는 RA 인자로도 불리워진다. RA 인자의 검출에 기초한 RA의 진단은 질환에 대한 특이성, 항체가 발생하는 시스템의 해명이 되지 않아 병인과의 관련이 분명하지 않다는 문제점이 있다.
RA의 병태는 생체내에 있어서 다양한 면역반응과 골파괴를 수반한 관절 활막의 증식성 질환이라 하는 2개의 측면에서 파악한 경우, 전자의 면역반응에 관하여는 많은 연구가 되었고 그 분자기능이 명확하게 알려져 있다. 그러나, 후자의 관절 활막세포의 연구에 관하여는 그것이 RA의 주요한 측면일지라도 그 세포생물학적인 특징조차 명확하게 알려져 있지 않은 것이 현실이다. RA와 같이 만성·난치성 질환의 발증이나 진전의 배후에 있는 분자기능을 해명하는 것은 질환의 진단, 예방 및 치료에 필요불가결하다. 또한, 고령화의 진행이 멈추는 기미가 없는 현실에서는 가령성 질환인 RA의 병태 해명은 사회적으로 보아도 중요한 과제이다.
본 발명은 RA의 진단이나 치료에 새로운 접근을 가져다 주는 신규 단백질 및 상기 단백질을 코드하는 신규 유전자의 제공을 과제로 한다. 본 발명이 제공하는 단백질과 그것을 코드하는 폴리뉴클레오타이드는 RA의 병인에 의해 밀접하게 관련 되고, 진단에 있어서는 유용한 정보를 제공하며, 치료기술의 개발에 대해서는 신약으로 연결되는 것이다. 또, 본 발명은 상기 단백질을 코드하는 유전자를 발현하는 트랜스제닉 동물 및 상기 유전자를 결손시킨 넉아웃(knock-out) 동물을 제공하는 것을 과제로 한다. 이러한 동물은 본 발명의 유전자의 기능을 분석하고 모델 동물로서 RA의 치료법이나 치료약을 개발하기 위해 유용하다.
본 발명자들은 RA 환자의 배양 인간 활막세포를 면역원으로 얻은 항인간 활막세포 항체를 이용하여 RA 환자의 활막세포의 cDNA 라이브러리를 이미노스크리닝(immunoscreening)함으로써 RA 환자의 활막조직에서 발현하고 있는 신규 유전자의 단리에 성공하였다. 그리고, 이 유전자가 코드하는 단백질을 이 유전자가 발현하고 있는 조직에 존재하는 활막세포(synovial cell)에 연관지어 시노비올린(synoviolin)으로 명명하였다.
본 발명자들은 상기 배양 활막세포의 분자량 약 80kDa, 140kDa 및 220kDa 분획에 대한 항인간 활막세포 항체의 반응성이 상기 시노비올린 유전자의 발현산물에 의해 흡수되는 것을 확인하였다. 또, 이러한 밴드나 상기 시노비올린 유전자의 발현산물이 RA 환자의 혈중에 존재하는 항체와의 반응성을 나타내는 것을 발견하였다. 또, 항인간 활막세포 항체는 RA 환자의 활막조직에 대하여 강한 반응성을 나타내는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 생화학적인 결합실험에 의해 시노비올린의 천연 리간드 인 시노비올린 리간드(이하, SL이라고 약칭함)의 존재를 밝혀내었다. SL은 시노비올린의 리간드로서 본 발명자들이 최초로 단리한 단백질이다. 그러나, SL을 코드하는 DNA의 염기서열에 기초하여 검색을 행한 결과, S1-5라고 불리우는 공지의 유전자가 5' 말단영역과 3' 말단영역에 있어서 공통의 염기서열을 포함하는 것이 밝혀졌다. 본 발명자들이 단리한 SL과 S1-5는 DNA의 부분 서열뿐만 아니라 유전자의 크기, 발현산물의 분자량 등이 거의 동일하여 동일한 단백질인 가능성이 높다. S1-5["FBNL"(fibrillin-like) 또는 "EFEMP1"(EGF-containing fibrillin-like extracellular matrix protein 1)이라 불림]는 인간 2배체 섬유아세포(human diploid fibroblast)에서 과잉발현하고 있는 유전자로서 단리되었다(Lecka-Gzernik, B. et al., Molecular and Cellular Biology, 15, 120-128, 1995). 구조적으로는 DNA 합성을 촉진하는 EGF양 도메인(Epidermal Growth Factor-like domain)을 지닌다. S1-5에 관하여는 구조와 핵산합성의 촉진활성(세포증식활성)은 발견되어 있다. 또한, 최근 S1-5의 변이가 Malattia Leventinese(ML) 및 Doyne honeycomb retinal dystrophy(DHRD)와 관련되어 있는 것이 보고(Stone, E.M. et al., Nature Genetics 22, 199-202, 199)되어 있지만, RA와의 관련에 대해서는 알려져 있지 않다. 또, 시노비올린과의 친화성에 대해서는 본 발명자들에 의한 신규한 발견이라고 말할 수 있다.
또, 본 발명자들은 시노비올린 유전자를 도입한 트랜스제닉 마우스 및 시노비올린 유전자를 결실시킨 넉아웃 마우스를 제작하고 그 표현형을 관찰하였다. 시노비올린 분자를 마우스에서 과잉으로 발현시킨 결과, 관절에서는 활막의 증식, 골, 연골파괴가 확인되었고 만성 류마티스 관절염과 매우 닮은 증상을 나타내었다. 한편, 시노비올린 유전자를 완전(호모)로 결손시킨 경우에는 태생기의 마우스에서 불완전한 지아(limb bud) 발생과 골격형성이 확인되었다. 이러한 표현형에 의하면 활막조직뿐만 아니라, 연골·골조직의 발생·분화·재생, 및 대사에서의 시노비올린의 관여가 시사될 수 있다. 또한, 시노비올린 강발현 마우스의 관절증의 병변화 부위에서는 활막, 연골, 골조직으로의 대사, 재생이 적극적으로 유도되어 왔었다. 이러한 결과는 시노비올린 분자가 RA를 포함하는 관절증에 관여하고 있다는 것을 명확하게 나타내는 것이다. 또, 시노비올린 강발현 마우스 관절증 모델 동물로서 유용한 것이 확인되었다.
본 발명자들은 이러한 신규의 지견에 근거하여 시노비올린과 그 유전자, 그 항체 또는 리간드의 치료나 진료에서의 유용성을 명확하게 함으로써 본 발명을 완성하였다. 또, 본 발명자들은 시노비올린 유전자를 도입한 트랜스제닉 동물을 제작하고 RA의 질환 모델로서의 유용성을 나타내었다. 또, 본 발명자들은 시노비올린 유전자를 lacZ 유전자로 치환한 넉인(knock-in) 동물을 제작하였다. 시노비올린 유전자의 넉인 동물은 시노비올린 유전자의 결손에 의한 영향의 해석이 가능하게 되는 것 이외에, 시노비올린 유전자의 내인성 프로모터에 의해 발현되는 LacZ(β-갈락토시다아제 활성으로서)의 검출에 의해 시노비올린 유전자 프로모터의 활성을 용이하게 검출할 수 있다. 이 넉인 동물을 이용하여 시노비올린 유전자의 발현을 조절하는 화합물을 스크리닝하는 것이 가능하게 된다. 류마티스 환자의 관절에서의 시노비올린 유전자의 발현항진을 억제함으로써 활막증식을 예방하고 질환 을 경감시키는 것도 가능하다고 생각된다.
본 발명자들이 발견한 유전자는 RA의 질환의 주요한 측면인 활막조직의 증식에 밀접하게 관련되어 있고, 진단에 있어서도 매우 중요한 정보를 제공하는 것이다. 또, RA의 병인인 활막조직의 증식에 관여하는 본 발명의 유전자, 그 발현산물, 발현산물에 대한 자기항체, 또 발현삼물의 리간드도 RA의 병태를 설명하는 점에서 불가결한 것으로 생각된다. 특히, 시노비올린을 인식하는 자기항체가 RA 환자의 혈중에 발견되는 것은 RA의 진단상 정말로 새로운 접근을 가져다 준 것이다. 또, 이러한 물질은 RA의 치료방법의 개발에 있어서도 이제까지 없던 새로운 접근을 가져다 주는 것이다.
또한, 시노비올린 리간드로서 동정된 S1-5의 변이가 ML 및 DHRD에 관련되어 있기 때문에 시노비올린도 또는 이러한 질환에 관여하고 있을 가능성이 있다. 따라서, 시노비올린은 이러한 질환의 진단에 이용될 수 있는 것 이외에 시노비올린 리간드와 시노비올린과의 결합을 조절하는 화합물이나 시노비올린의 리간드로서 작용하는 화합물 등은 이러한 질환에 대한 의약의 후보로 된다.
또한, 시노비올린은 발생에 있어서 미분화 간엽계 세포로 발현하고 있다. 따라서, 시노비올린을 세포 마커로서 이용하여 미분화 간엽계 세포를 셀소타(cell sorter) 등에 의해 분리할 수 있다. 분리된 미분화 간엽계 세포는 시험관내에서의 조직재생을 위해 이용될 수 있다. 시험관내에서 관절을 재구축할 수 있다면 만성 류마티스 환자뿐만 아니라, 관절파괴에 고통받는 많은 환자에 대한 재생의료에 유용한 것이다.
즉, 본 발명은 이하의 시노비올린 단백질, 그의 항체, 그것을 코드하는 폴리뉴클레오타이드, 그들의 용도, 시노비올린 리간드와 그의 용도뿐만 아니라, 시노비올린 유전자의 발현이 변화된 트랜스제닉 동물 및 그의 용도에 관한 것이다.
1. 하기 (a) 내지 (e) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드:
(a) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오타이드;
(b) 서열번호 1의 염기서열의 단백질 코드영역을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(c) 서열번호 2의 아미노산 서열에 있어서 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 지니고, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오타이드;
(d) 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드와 긴축상태에서 하이브리다이즈하고, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오타이드;
(e) 서열번호 1의 염기서열과 70% 이상의 상동성을 지니는 염기서열로 이루어지고, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오타이드.
2. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질의 부분 펩타이드를 코 드하는 폴리뉴클레오타이드.
3. 1 또는 2의 폴리뉴클레오타이드에 의해 코드되는 단백질 또는 펩타이드.
4. 3에 있어서, 하기 (1) 내지 (3)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 활성을 지니는 단백질 또는 펩타이드:
(1) 만성 류마티스 관절염 환자의 혈액중에 발견되는 항체와 결합하는 활성;
(2) 시노비올린 리간드 S1-5와 결합하는 활성;
(3) 활막증식을 촉진하는 활성.
5. 1 또는 2의 폴리뉴클레오타이드가 삽입된 벡터.
6. 1의 폴리뉴클레오타이드 또는 5의 벡터를 보유하는 형질전환세포.
7. 6의 형질전환세포를 배양하고, 상기 형질전환세포 또는 그 배양상청으로부터 발현시킨 단백질 또는 펩타이드를 회수하는 공정을 포함하는 3의 단백질 또는 펩타이드의 제조방법.
8. 3의 단백질 또는 펩타이드에 결합하는 항체.
9. 3의 단백질 또는 펩타이드를 포함하며 3의 단백질 또는 펩타이드를 인식하는 항체를 분석하기 위한 면역학적 분석용 시약.
10. 9에 있어서, 만성 류마티스 관절염의 진단 또는 치료효과의 판정을 목적으로 하는 면역학적 분석용 시약.
11. 3의 단백질 또는 펩타이드와 반응하는 항체를 포함하며 3의 단백질을 분석하기 위한 면역학적 분석용 시약.
12. 11에 있어서, 만성 류마티스 관절염의 진단 또는 치료효과의 판정을 목 적으로 하는 면역학적 분석용 시약.
13. 12에 있어서, 분석해야 할 3의 단백질이 활막세포에 존재하는 것을 특징으로 하는 면역학적 분석용 시약.
14. 하기 공정을 포함하는, 생체시료 중의 3의 단백질 및/또는 그 부분 펩타이드에 결합하는 항체의 측정방법:
(1) 생체시료를 3의 단백질 및/또는 그 부분 펩타이드와 접촉시키는 공정; 및
(2) 3의 단백질 및/또는 그 부분 펩타이드에 결합하는 항체를 검출하는 공정.
15. 하기 공정을 포함하는, 생체시료 중의 3의 단백질 및/또는 그 부분 펩타이드의 측정방법:
(1) 생체시료를 8의 항체와 접촉시키는 공정; 및
(2) 3의 단백질 및/또는 그 부분 펩타이드에 결합하는 8의 항체를 검출하는 공정.
16. 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 또는 그 상보사슬에 상보적인 15 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
17. 하기 공정을 포함하는, 생체시료 중의 1 또는 2의 폴리뉴클레오타이드의 측정방법:
(1) 생체시료를 16의 폴리뉴클레오타이드와 접촉시키는 공정; 및
(2) 1 또는 2의 폴리뉴클레오타이드에 하이브리다이즈하는 16의 폴리뉴클레 오타이드를 검출하는 공정.
18. 16의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 1 또는 2의 폴리뉴클레오타이드의 측정용 키트.
19. 3의 단백질 또는 상기 단백질을 코드하는 유전자의 발현을 지표로 상기 단백질을 발현하는 세포를 검출 또는 분리하는 방법.
20. 19에 있어서, 세포가 류마티스 활막세포인 것을 특징으로 하는 방법.
21. 19에 있어서, 세포가 미분화 간엽계 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
22. 8의 항체를 포함하는, 3의 단백질을 발현하는 세포의 검출 또는 분리용 시약.
23. 하기 공정을 포함하는, 만성 류마티스 관절염의 검출방법에 있어서, 만성 류마티스 관절염의 마커가 1의 폴리뉴클레오타이드, 3의 단백질, 3의 펩타이드, 3의 단백질에 결합하는 항체 및 3의 펩타이드에 결합하는 항체로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 마커인 것을 특징으로 하는 방법:
i) 피검자의 생체시료 중에 존재하는 만성 류마티스 관절염의 마커를 검출하는 공정; 및
ii) 공정 i)의 검출결과를 만성 류마티스 관절염와 관련시키는 공정.
24. 23에 있어서, 생체시료가 피검자의 혈액이고, 만성 류마티스 관절염의 마커가 3의 단백질에 결합하는 항체 및/또는 3의 펩타이드에 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
25. 23에 있어서, 생체시료가 피검자의 활막조직 또는 활막세포이고, 만성 류마티스 관절염의 마커가 1의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 3의 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
26. 하기 공정을 포함하는, 피검화합물의 3의 단백질 또는 펩타이드와 결합하는 활성의 검출방법:
a) 피검화합물을 3의 단백질 또는 펩타이드와 접촉시키는 공정; 및
b) 피검화합물과 상기 단백질 또는 펩타이드와의 결합을 관찰하는 공정.
27. 하기 공정을 포함하는, 3의 단백질 또는 펩타이드와 결합하는 활성을 지니는 화합물의 스크리닝 방법:
a) 26의 방법에 의해 피검화합물의 3의 단백질 또는 펩타이드에 대한 결합활성을 검출하는 공정; 및
b) 대조와 비교하여 상기 결합활성이 높은 피검화합물을 선별하는 공정.
28. 하기 공정을 포함하는, 3의 단백질과 그 리간드와의 결합을 저해하는 활성의 검출방법:
a) 피검화합물 존재하에서 3의 단백질 또는 펩타이드와 그 리간드를 접촉시키는 공정; 및
b) 상기 단백질 또는 펩타이드에 결합하는 리간드 및/또는 피검화합물을 검출하는 공정.
29. 28에 있어서, 리간드가 시노비올린 리간드 S1-5인 것을 특징으로 하는 방법.
30. 하기 공정을 포함하는, 3의 단백질과 그 리간드와의 결합을 저해하는 화 합물의 스크리닝 방법:
a) 28의 방법에 의해 피검화합물의 3의 단백질과 그 리간드와의 결합을 저해하는 활성을 검출하는 공정; 및
b) 대조와 비교하여 상기 저해활성이 높은 피검화합물을 선별하는 공정.
31. 하기 공정을 포함하는, 피검화합물의 3의 단백질에 의한 신호 전달을 조절하는 활성을 검출하는 방법:
a) 상기 단백질의 리간드의 존재하 또는 부존재하에서 피검화합물과 상기 단백질을 접촉시키는 공정; 및
b) 상기 단백질을 매개한 신호 전달을 검출하는 공정.
32. 하기 공정을 포함하는, 3의 단백질에 의한 신호 전달을 조절하는 활성을 지니는 화합물의 스크리닝 방법:
a) 31의 방법에 의해 피검화합물의 상기 단백질에 의한 신호 전달을 조절하는 활성을 검출하는 공정; 및
b) 대조와 비교하여 상기 조절의 활성이 높은 피검화합물을 선별하는 공정.
33. 하기 공정을 포함하는, 1의 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하는 활성의 검출방법에 있어서,
a) 피검화합물의 존재하에서 1의 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 세포를 배양하는 공정; 및
b) 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현 레벨을 측정하는 공정.
34. 하기 공정을 포함하는, 1의 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하는 화합 물의 스크리닝 방법:
a) 33의 방법에 의해 피검화합물의 1의 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하는 활성을 검출하는 공정; 및
b) 대조와 비교하여 상기 활성에 차이를 지니는 피검화합물을 선별하는 공정.
35. 27의 스크리닝 방법에 의해 얻어질 수 있는 화합물을 유효성분으로 함유하는 시노비올린 자극제.
36. 30의 스크리닝 방법에 의해 얻어질 수 있는 화합물을 유효성분으로 함유하는 시노비올린과 시노비올린 리간드와의 결합 제해제.
37. 30 또는 32의 스크리닝 방법에 의해 얻어질 수 있는 화합물을 유효성분으로 함유하는 활막증식 저해제.
38. 1 또는 2의 폴리뉴클레오타이드, 3의 단백질 또는 펩타이드 및 5의 벡터로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 성분을 유효성분으로 함유하는 의약조성물.
39. 1 또는 2의 폴리뉴클레오타이드의 발현이 변화되어 있거나 또는 상기 변화를 유도할 수 있는 트랜스제닉 비인간 척추동물.
40. 39에 있어서, 1 또는 2의 폴리뉴클레오타이드가 외래적으로 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 비인간 척추동물.
41. 40에 있어서, 만성 류마티스 관절염 모델 동물인 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 비인간 척추동물.
42. 내인성으로 지니는 1 또는 2 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드의 발현이 억제되어 있는 트랜스제닉 비인간 척추동물.
43. 42에 있어서, 다른 유전자가 넉인(knock-in)되어 있는 트랜스제닉 비인간 척추동물.
44. 40 또는 42의 트랜스제닉 비인간 척추동물에서 유래되는 세포.
45. 하기 공정을 포함하는, 1 또는 2의 폴리뉴클레오타이드의 내인성 프로모터의 활성을 조절하는 활성의 검출방법:
a) 1 또는 2의 폴리뉴클레오타이드의 내인성 프로모터의 제어하에서 리포터 유전자를 발현할 수 있는 발현계에서 피검화합물을 접촉시키는 공정; 및
b) 리포터 유전자의 발현 레벨을 측정하는 공정.
46. 45에 있어서, 상기 발현계가 43의 트랜스제닉 비인간 척추동물 또는 이 동물에서 유래하는 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
47. 하기 공정을 포함하는, 1 또는 2의 폴리뉴클레오타이드의 내인성 프로모터의 활성을 조절하는 화합물의 스크리닝 방법:
a) 45의 방법에 의해 피검화합물의 1 또는 2의 폴리뉴클레오타이드의 내인성 프로모터의 활성을 조절하는 활성을 측정하는 공정; 및
b) 대조와 비교하여 상기 활성에 차이가 있는 피검화합물을 선별하는 공정.
48. 34 또는 47의 스크리닝 방법에 의해 얻어질 수 있는 화합물을 유효성분으로 함유하는 1의 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하기 위한 의약조성물.
또한, 본 발명은 27의 스크리닝 방법에 의해 얻어질 수 있는 화합물을 투여하는 공정을 포함하는, 시노비올린의 자극방법에 관한 것이다. 또, 본 발명은 30의 스크리닝 방법에 의해 얻어질 수 있는 화합물을 투여하는 공정을 포함하는, 시노비올린과 시노비올린 리간드와의 결합저해방법에 관한 것이다. 또, 본 발명은 30 또는 32의 스크리닝 방법에 의해 얻어질 수 있는 화합물을 투여하는 공정을 포함하는, 활막증식 저해방법에 관한 것이다. 또, 본 발명은 1 또는 2의 폴리뉴클레오타이드, 3의 단백질 또는 펩타이드 및 5의 벡터로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 성분을 투여하는 공정을 포함하는, 활막증식 촉진방법에 관한 것이다. 또, 본 발명은 34 또는 47의 스크리닝 방법에 의해 얻어질 수 있는 화합물을 투여하는 공정을 포함하는, 1의 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하기 위한 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 27의 스크리닝 방법에 의해 얻어질 수 있는 화합물의, 시노비올린의 자극제의 제조에 있어서 사용에 관한 것이다. 또는 본 발명은 30의 스크리닝 방법에 의해 얻어질 수 있는 화합물의, 시노비올린과 시노비올린 리간드와의 결합 저해제의 제조에 있어서 사용에 관한 것이다. 또, 본 발명은 30 또는 32의 스크리닝 방법에 의해 얻어질 수 있는 화합물의, 활막증식 저해제의 제조에 있어서 사용에 관한 것이다. 또, 본 발명은 1 또는 2의 폴리뉴클레오타이드, 3의 단백질 또는 펩타이드 및 5의 벡터로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 성분의, 활막증식 촉진제의 제조에 있어서 사용에 관한 것이다. 또, 본 발명은 34 또는 47의 스크리닝 방법에 의해 얻어질 수 있는 화합물의 1의, 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하기 위한 의약품 제제의 제조에 있어서 사용에 관한 것이다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 단백질 코드영역을 포함하는 시노비올린을 코드하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본 발명에 있어서 폴리뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA이면 된다. 또, 수식된 뉴클레오타이드를 포함하는 것이어도 좋다. 본 발명에 의한 시노비올린을 코드하는 폴리뉴클레오타이드는 상기 RA 환자의 활막세포로부터 공지 방법에 의해 클로닝할 수 있다(Nucleic Acid Res. 16: 7583-7600, 1988). 구체적으로는, 활막세포나 배양세포로서 회수한 RA 환자의 관절염을 발증한 조직에서 유래하는 활막세포에서 추출한 mRNA를 기초로 cDNA 라이브러리를 얻는다(Nucleic Acid Research 16: 7583, 1988). 서열번호 1에 표시된 염기서열에 기초하여 설정한 프로브를 이용하고 이 라이브러리에서 하이브리다이즈하는 클론을 스크리닝함으로써 시노비올린 유전자를 단리할 수 있다.
본 발명은 또, 먼저 서술된 시노비올린과 기능적으로 동등한 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명에 있어서 시노비올린과 기능적으로 동등한 단백질을 코드하는 뉴클레오티드를 시노비올린과 기능적으로 동등한 폴리뉴클레오타이드라고 한다. 기능적으로 동등한 단백질이라 함은 먼저, 시노비올린과 면역학적으로 동등한 단백질을 들 수 있다. 즉, 본 발명에 있어서 시노비올린과 기능적으로 동등한 단백질이라 함은 시노비올린을 특이적으로 인식하고 RA 환자의 혈청중에 존재하는 항체와 반응하는 것이라면, 시노비올린의 도메인일 수 있다. 또는 이 면역학적으로 활성인 도메인을 포함하는 단백질의 단편인 것일 수도 있다. 이러한 변이체는 RA 환자 혈청 패널과 정상자의 혈청을 사용하여 시노비올린의 단 편을 스크리닝함으로써 당업자라면 용이하게 선별할 수 있다.
본 발명에 의한 시노비올린과 기능적으로 동등한 단백질은 면역학적인 특성뿐만 아니라 SL(S1-5)와의 결합특성에 기초하여도 정의될 수 있다. 즉, 본 발명은 SL(S1-5)와의 친화성을 구비한 시노비올린의 단편을 포함한다. 이러한 변이체를 SL(S1-5)를 사용하여 후보단백질을 스크리닝함으로써 당업자라면 용이하게 선별할 수 있다. 예를들어, 본 발명자들이 발견한 SL(S1-5)는 실시예에 표시된 것과 같이 시노비올린의 cDNA에서 1233-1592번째에 상당하는 120 아미노산 잔기를 시노비올린과의 결합에 필요한 영역으로서 요구한다. 따라서, 이 영역을 구성하는 아미노산으로 이루어지는 단백질 또는 이 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 본 발명에 의한 시노비올린과 기능적으로 동등한 단백질을 구성한다. SL로서는 accession number AAA65590(nucleotide accession U03877), I38449, NP_061489(nucleotide accession NM_018894), NP_004096(nucleotide accession NM_004105) 또는 Q12805로 특정되는 S1-5 단백질이나 그와 유사한 단백질인 인간 시노비올린 단백질(서열번호 2)에 결합하는 활성을 지니는 단백질을 이용할 수 있다(Lecka-Czernik, B. et al., Mol. Cell. Biol. 15, 120-128, 1995; Heon, E. et al., Arch. Ophthalmol. 114, 193-198, 1996; Ikegawa, S. et al., Genomics 35, 590-592, 1996; Katsanis, N. et al., Hum. Genet. 106, 66-72, 2000; Giltay, R. et al., Matrix Biol. 18, 469-480, 1999; Stone, E. M. et al., Nat. Genet. 22, 199-202, 1999).
또한, 인간 시노비올린과 기능적으로 동등한 단백질로서는 활막증식을 촉진하는 활성을 지니는 단백질을 들 수 있다. 인간 시노비올린 유전자가 도입된 트랜 스제닉 마우스는 유의한 빈도로 관절염을 수반하는 지(toe)의 팽창이 확인되었다. 조직학적으로는 이러한 지관절에서는 활막증식을 수반하는 골파괴와 이상한 골신생이 확인되었다. 인간 시노비올린 단백질과 기능적으로 동등한 단백질은 활막증식을 촉진하는 활성에 기초하여도 정의된다. 활막증식의 촉진은 트랜스제닉 동물의 제작에 의해 검증될 수 있는 것 이외에 관절로의 국소적인 유전자 도입 또는 인비트(in vitro)로 배양 활막세포에서 단백질을 발현시킴으로써 검증될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 이용하여 트랜스제닉 동물을 얻는 방법은 후술한다.
또한, 인간 시노비올린과 기능적으로 동등한 단백질로서는 정상적인 골형성 또는 사지의 발달에 공헌하는 활성을 지니는 단백질을 들 수 있다. 시노비올린은 발생에 있어서 두정골, 사지, 귀 등의 골 및 연골이 형성되는 부위에 강하게 발현되고 사지형성기에 있어서는 Apical Ectodermal Ridge(AER; 외배엽정제) 및 연골·골원기에서 강한 발현이 관찰되었다. 타게팅에 의해 내인성 시노비올린 유전자를 결손시킨 넉아웃 마우스배는 두정부에서 둔부까지의 길이가 짧고 두개나 사지의 형성이 미숙한 경향이 확인되었고, 호모접합체에서는 지엽, 상하악골 및 귀에 형태이상을 나타내어 높은 확율로 태아치사가 되었다. 시노비올린 유전자 호모 넉아웃 마우스는 태생기에 있어서 지아의 발생이상이 확인되고, 또 연골 및 골에서의 형성이 확인되지 않고 지아와 연골, 골의 발생부위에 시노비올린의 발현이 확인되었기 때문에 시노비올린 분자가 골격형성 및 사지의 발달에 관여하고 있는 것이 시사되었다.
explant법에 의한 배양계를 이용한 분석에서는 시노비올린 넉아웃(lacZ 유전 자의 넉인) 마우스 태아의 지아 유래의 세포에 있어서 LacZ의 발현은 연골·골 및 지의 원기로 된다고 생각되는 미분화 간엽계 세포에서만 확인되었다. 또, 알칼리포스파타아제 염색, Kossa의 염색 등에 의해 골·연골 형성능이 호모 넉아웃 유래의 세포에서는 지연되어 있는 것이 확인되었다. 정상적인 골형성 또는 사지의 발달에서의 관여는 넉아웃 동물의 제작에 의해 검증할 수 있는 것 이외에 인비트로 배양에 있어서 골·연골세포의 마커 유전자의 발현의 분석이나 골형성능의 분석 등을 이용하여 수행할 수도 있다도 생각된다. 또 어떤 단백질이 정상적인 골형성 또는 사지의 발달에 공한하는 활성을 지니는 것은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 발현을 억제시킨 넉아웃 동물이나 배양세포에 있어서 상기 폴리뉴클레오타이드가 코드하는 단백질의 투여 또는 상기 단백질을 코드하는 DNA 또는 RNA의 발현에 따라 소실된 기능이 상보되는 것에 의해서도 확인할 수 있다.
또한, 본 발명에 의한 시노비올린과 기능적으로 동등한 단백질은 시노비올린이 지니는 생화학적인 활성에 기초해서도 정의된다. 시노비올린의 생화학적인 활성으로는 예를들어 티로신키나아제(tyrosine kinase)나 유비퀴틴리가아제(ubiquitin ligase) 활성을 나타낼 수 있다. 이러한 생화학적인 활성은 시노비올린에서 발견된 각종의 모티브나 실시예의 결과로 뒷받침되어 있다. 즉, 본 발명은 시노비올린이 지니는 하나 이상의 생화학적인 활성을 유지한 시노비올린의 단편을 포함한다. 시노비올린의 생화학적인 활성의 인식방법이나 각각의 생화학적인 활성을 보유하고 있는 영역에 관하여는 이후에 구체적으로 서술한다.
이러한 시노비올린에 기능적으로 동등한 단백질은 다른 단백질과의 융합 단 백질로 할 수 있다. 예를들어, FLAG 태그, HA 태그 또는 히스티딘 태그 등의 부가적인 아미노산 서열이 부가되고, 상기 시노비올린에 기능적으로 동등한 단백질로서의 하나 이상의 성상을 유지한 단백질은 상기 기능적으로 동등한 단백질에 포함된다. 부가되는 단백질이 시노비올린과는 다른 활성을 지니고 있는 경우라도 시노비올린이 지니는 하나 이상의 기능을 유지하고 있는 경우에는 그 융합 단백질은 본 발명에 속하는 기능적으로 동등한 단백질에 포함된다.
상기 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 대하여 변이를 포함하는 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오타이드도 당업자에 의해 공지 방법(실험의약별책·유전자공학 핸드북, 246-251, 양토사, 1991년 발행)으로 단리할 수 있다. 예를들어, 유사한 유전자를 포함하는 라이브러리를 대상으로 서열번호 1로 표시되는 염기서열(또는 그의 단편)을 프로브(probe)로 하여 스크리닝하면 상동성이 높은 염기서열을 지닌 DNA를 클로닝할 수 있다. 이러한 라이브러리로서는 서열번호 1의 염기서열에 대하여 랜덤하게 변이를 주입한 것, 인간 이외의 종에서 유래하는 활막조직의 cDNA 라이브러리 등을 들 수 있다.
주어진 염기서열에 대하여 랜덤하게 변이를 가하는 방법으로는 예를들어, DNA의 아질산처리에 의한 염기쌍의 치환이 알려져 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 79: 7258-7260, 1982). 이러한 방법에서는 변이를 도입하고 싶은 절편(segment)을 아질산 처리함으로써 특정의 절편내에 랜덤하게 염기쌍의 치환을 도입할 수 있다. 또한, 목적으로 하는 변이를 임의의 장소에 초래하는 기술로서는 gapped duplex법 등이 있다(Methods in Enzymol., 154: 350-367, 1987). 변이를 도입해야 하는 유전자를 클로닝한 환상 두가닥 벡터를 단일가닥으로 하고, 목적으로 하는 부위에 변이를 갖는 합성 올리고 뉴클레오타이드를 하이브리다이즈시킨다. 제한효소에 의해 절단되어 선상화된 벡터 유래의 상보 단일가닥 DNA를 상기 환상 단일가닥 벡터에 아닐(anneal)되고, 상기 합성 뉴클레오티드와 상보 단일가닥 DNA와의 사이의 갭(gap)을 DNA 폴리머라아제로 충진하고 다시 라이게이션(ligation)함으로써 완전한 두가닥 환상 벡터를 형성하게 된다.
변화되는 아미노산의 수는 전형적으로는 50 아미노산 이내이고, 바람직하게는 30 아미노산 이내이고, 더 바람직하게는 5 아미노산 이내(예를들어, 1 아미노산)인 것으로 판단된다.
아미노산을 인위적으로 치환하는 경우, 성질이 유사한 아미노산으로 치환하면 근본 단백질의 활성이 유지되기 쉽다고 판단된다. 본 발명의 단백질에는 상기 아미노산 치환에 있어서 보존적 치환이 가해진 단백질에 있어서 인간 시노비올린 단백질(서열번호 2)과 기능적으로 동등한 단백질이 포함된다. 보존적 치환은 단백질의 활성에 중요한 도메인의 아미노산을 치환하는 경우 등에 있어서 중요하다고 생각된다. 이러한 아미노산의 보존적 치환은 당업자에게 잘 알려져 있다.
보존적 치환에 상당하는 아미노산의 그룹으로서는 예를들어, 염기성 아미노산(예를들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 아미노산(예를들어, 아스파라긴산, 글루타민산), 비하전 극성 아미노산(예를들어, 글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 스레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 아미노산(예를들어, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), β분기 아미 노산(예를들어, 스레오닌, 발린, 이소루이신) 및 방향족 아미노산(예를들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘) 등을 들 수 있다.
또한, 비보존적 치환에 의해 단백질의 활성 등을 보다 상승(예를들어, 항상적 활성화형 단백질 등을 포함) 또는 하강(예를들어, 도미넌트 네가티브(dominant negative) 등을 포함)시킨 것도 생각된다.
서열번호 2의 아미노산 서열에 있어서, 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 지니고, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질은 천연에 존재하는 단백질을 포함한다. 일반적으로 진핵생물의 유전자는 인터페론 유전자 등에서 알려져 있는 것과 같이, 다형현상(polymorphism)을 지닌다. 이 다형현상에 의해 발생한 염기서열의 변화에 있어서 하나 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가되는 경우가 있다. 이렇게 자연에 존재하는 단백질이고, 동시에 서열번호 2의 아미노산 성열에 있어서 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 지니며, 서열번호 2의 아미노산으로 이루어지는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질은 본 발명에 포함된다.
실제로 본 발명자들은 본 발명의 유전자를 복수의 개체에서 클로닝하고, 그 염기서열을 결정함으로써 1 아미노산을 결실한 클론을 확인하였다. 이러한 아미노산 서열에 변이를 포함하는 단백질 및 그를 코드하는 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드는 본 발명에 포함된다. 본 발명자들이 확인한 1 아미노산을 결실한 클론의 염기서열을 서열번호 6으로, 그리고 이 염기서열에 의해 코드되는 아미 노산 서열을 서열번호 7로 표시하였다. 서열번호 6의 염기서열은 서열번호 1에 있어서 1293-1295에 상당하는 gca를 결손하고 있다. 그 결과, 서열번호 7의 아미노산 서열은 서열번호 2에 있어서 412위치의 Ala를 결손하고 있다.
또, 다형현상에 의해 염기서열에 변화는 있어도 아미노산 서열이 변화되지 않는 경우도 있다. 이러한 염기서열의 변이는 사이런트 변이(silent mutation)라고 불린다. 사이런트 변이를 지니는 염기서열로 이루어지는 유전자도 본 발명에 포함된다. 또, 여기서 말하는 다형현상이라 함은 집단내에 있어서 어떤 유전자가 개체간에서 다른 염기서열을 지니는 것을 말한다. 다형현상은 다른 유전자가 발견되는 부분과는 무관하다.
이밖에, 시노비올린과 기능적으로 동등한 단백질을 얻는 방법으로서, 하이브리다이제이션을 이용하는 방법을 들 수 있다. 즉, 서열번호 1로 표시되는 것과 같이 본 발명에 의한 시노비올린을 코드하는 폴리뉴클레오타이드 또는 그 단편을 프로브로 하고, 이와 하이브리다이즈할 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 단리하는 것이다. 하이브리다이제이션을 긴축상태하에서 실시하면 염기서열로서는 상동성이 높은 폴리뉴클레이타이드가 선별되고, 그 결과로서 단리된 단백질에서는 시노비올린과 기능적으로 동등한 단백질이 포함될 가능성이 높다. 상동성이 높은 염기서열로는 예를들어, 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상의 동일성을 나타낼 수 있다.
또, 긴축상태(stringent condition)라 함은 구체적으로는 예를들어 6×SSC, 40% 포름알데히드, 25℃에서의 하이브리다이제이션과, 1×SSC, 55℃에서의 세척을 한 조건을 나타낼 수 있다. 긴축상태는 염농도, 포름알데히드의 농도 또는 온도라 는 조건에 좌우되지만, 당업자라면 이러한 조건을 필요한 긴축을 얻도록 설정할 수 있다는 것은 자명하다.
하이브리다이제이션을 이용함으로써 예를들어, 인간 이외의 동물종에 있어서 시노비올린의 호모로그(homologue)를 코드하는 폴리뉴클레오타이드의 단리가 가능하다. 인간 이외의 동물종, 즉 마우스, 랫트, 토끼, 돼지 또는 염소 등의 동물종에서 얻을 수 있는 폴리뉴클레오타이드가 코드하는 시노비올린의 호모로그는 본 발명에 있어서 기능적으로 동등한 단백질을 구성한다.
본 발명에 의한 폴리뉴클레오타이드는 그 유래를 문제삼지 않는다. 즉, cDNA, 게놈 DNA 이외에, 합성에 의해서도 얻어질 수 있다. 또, 본 발명의 단백질을 코드하는 한, 유전암호의 축중에 기초한 임의의 염기서열을 지니는 폴리뉴클레오타이드가 포함된다.
인간 시노비올린(서열번호 2)에 변이를 도입하여 얻은 단백질이나 상기와 같은 하이브리다이제이션 기술 등을 이용하여 단리되는 폴리뉴클레오타이드가 코드하는 단백질은 통상, 인간 시노비올린(서열번호 2)와 아미노산 서열에 있어서 높은 상동성을 지닌다. 높은 상동성이라 함은 30% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상(예를들어, 95% 이상)의 서열의 동일성을 지닌다. 염기서열이나 아미노산 서열의 동일성은 인터넷을 이용한 호모로그 검색 사이트를 이용하여 수행할 수 있다[예를들어, 일본 DNA 데이타뱅크(DDBJ)에 있어서, FASTA, BLAST, PSI-BLAST 및 SSEARCH 등의 상동성 검색이 이용될 수 있다[예를들어, 데이타뱅크(DDBJ)의 웹사이트의 상동성 검색(Search and Analysis)의 페이지; http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/homology-j.html]. 또, National Center for Biotechnology Information(NCBI)에서 BLAST를 이용한 검색을 수행할 수 있다(예를들어, NCBI의 홈페이지의 웹사이트의 BLAST의 페이지; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/; Altschul, S.F. et al., J.Mol.Biol., 1990, 215(3): 403-10; Altschul, S.F. & Gish, W., Meth. Enzymol., 1996, 266: 460-480; Altschul, S.F. et al., Nucleic Acids Res., 1997. 25: 3389-3402)].
예를들어, Advanced BLAST 2.1에서 아미노산 서열의 동일성의 산출은 프로그램에 blastp를 이용하고 Expect치를 10, Filter는 모두 off로 하고, Matrix에 BLOSUM62를 이용하며 Gap existence cost, Per residue gap cost 및 Lambda ratio를 각각 11, 1, 0.85(디폴트치)로 설정하여 검색하여 동일성(identity)의 값(%)을 얻을 수 있다(Karlin, S. and S.F. Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2246-68; Karlin, S. and S.F. Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873-7).
본 발명은 이러한 폴리뉴클레오타이드의 단백질 생성 이외의 용도도 제공한다. 즉, 본 발명은 본 발명에 의해 제공되는 시노비올린을 코드하는 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 일부에 대한 안티센스 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 안티센스는 유전자의 전사를 유효하게 저해하기 위해 15-20 뉴클레오타이드 정도의 사슬길이로 하는 것이 바람직하다. 시노비올린이 활막세포의 이상한 증식을 유지한다면 RA의 치료에 있어서 시노비올린의 안티센스가 달성하는 역할을 클 것이다. 유 전자 발현의 억제라고 하는 관점에서 보면 안티센스뿐 아니라 리보자임(ribozyme)의 설계도 가능하다. 즉, 서열번호 1로 표시되는 DNA의 코드 영역에서 전사된 RNA를 인식하고 이것을 절단하는 리보자임을 설계할 수 있다.
본 발명은 또, 이러한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 그 상보사슬과 상보적인 15 뉴클레오타이드 이상의 사슬길이를 지니는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 상기 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 그 상소사슬과 상보적인 20 뉴클레오타이드 이상, 보다 바람직하게는 25 뉴클레오타이드 이상, 더 바람직하게는 30 뉴클레오타이드 이상의 사슬길이를 지니는 폴리뉴클레오타이드이다. 여기서 "상보사슬"이라 함은 A:T(단, RNA의 경우는 U), G:C의 염기쌍으로 이루어지는 두가닥 사슬 핵산의 일방 사슬에 대응하는 타방의 사슬을 가리킨다. 또, "상보적"이라 함은 15개 이상의 연결된 뉴클레오타이드 영역에서 완전하게 상보서열인 경우에 한하지 않고 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상의 염기서열상의 상동성을 지니는 염기서열을 포함한다. 상동성을 결정하기 위한 알고리즘은 본 명세서에 기재된 것을 사용할 수 있다. 이런것에는 예를들어, 상기 본 발명의 폴리뉴클레오타이드와 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오타이드이며 15 뉴클레오타이드 이상의 사슬길이를 지니는 폴리뉴클레오타이드가 포함된다.
하이브리다이제이션은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 대하여 특이적인 것이 바람직하다. "특이적"이라 함은 긴축 하이브리다이제이션의 조건하에서 다른 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오타이드와의 크로스하이브리다이제이션이 유의하게 발생하지 않는 것을 의미한다.
이러한 폴리뉴클레오타이드는 시노비올린 유전자의 검출이나 증폭을 가능하게 하는 프로브나 프라이머로서 이용된다. 본 발명에 의한 프로브나 프라이머는 주어진 스트린젠시(stringency)하에서 특이적인 하이브리다이즈가 가능하게 되도록 15mer 정도 이상의 사슬길이를 구비하고 서열번호 1로 표시된 염기서열 중에서도 시노비올린에 특이적인 서열에 대하여 하이브리다이즈할 수 있는 염기서열을 지니는 것이 바람직하다. 주어진 염기서열에 기초하여 프로브나 프라이머로 유용한 염기서열을 설정하는 것은 당업자로서 자명한 것이다. 본 발명에 기초하여 제공되는 시노비올린 유전자 특이 프로브나 프라이머를 이용하면 활막세포 표본의 인시츄(in situ)에 있어서 하이브리다이제이션이나 PCR이 가능하게 된다. 시노비올린은 RA 환자의 활막조직에 강발현하고 있기 때문에 그 세포내에 있어서 발현상태의 파악은 RA 관절염 증상을 파악하기 위한 중요한 정보를 제공하는 것이라고 생각된다.
본 발명에 의한 신규 단백질인 시노비올린은 RA 환자 활막조직에서 얻어질 수 있다. 활막세포는 인비트로에서 배양할 수 있기 때문에 이 배양물에서 시노비올린을 회수하는 것이 가능하다. 구체적으로는 RA 환자에서 활막절제술(synovectomy)에 의해 외과적으로 절제된 활막조직 등을 기초로 이 조직에서 활막세포를 분리한다. 분리한 세포를 배양하면 활막세포를 부착성세포로서 회수할 수 있다(J. Clin. Invest. 92: 186-193, 1993). 회수한 세포에서는 공지의 단백질 정제기술을 조합하여 시노비올린을 추출·정제한다.
본 발명은 활막세포에서 추출되는 인간·시노비올린뿐만 아니라, 시노비올린 과 기능적으로 동등한 단백질을 포함하는 것이다. 즉, 본 발명의 단백질로서는 인공적이거나 자연에서 생기는 것 등을 문제삼지 않고 인간·시노비올린의 아미노산 서열(서열번호 2)에 있어서 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 등에 의해 변이된 단백질이며, 인간 시노비올린과 기능적으로 동등한 단백질이 포함된다. 이러한 단백질에 있어서 아미노산의 변이수나 변이부위는 시노비올린의 기능이 보유되는 한 제한이 없다.
시노비올린의 단편은 프로테아제를 사용한 소화에 의해 얻어질 수 있다. 또, 서열번호 1로 표시된 시노비올린을 코드하는 DNA를 랜덤하게 절단하고, 그것을 파아지벡터에 삽입하고 도메인 펩타이드를 제시한 파아지 라이브러리를 제작하는 것에 의해서도 얻을 수 있다. 이러한 라이브러리를 시노비올린을 확인하는 항체로 이뮤노스크리닝하면 면역학적으로 활성인 도메인을 결정할 수 있다. 면역학적으로 활성인 도메인을 특정하기 위한 방법은 그대로 리간드와의 결합활성을 지니는 도메인을 특정하기 위한 방법으로서도 이용될 수 있다. 클로닝한 파아지에 대하여 삽입 단편의 염기서열을 결정하면 활성 도메인의 아미노산 서열도 명확하게 할 수 있다.
본 발명에 의한 단백질 또는 그의 기능적으로 동등한 단백질은 당쇄 등의 생리적인 수식, 형광이나 방사성 물질과 같은 표식 또는 다른 단백질과의 융합으로 한 각종의 수식을 가한 단백질일 수 있다. 특히, 후술하는 유전자 재조합체에 있어서는 발현시키는 숙주에 의해 당쇄에 의한 수식에 차이가 발생할 가능성이 있다. 그러나, 예를들어 당쇄의 수식에 상이를 가지고 있어도 본 명세서 중에 개시된 시 노비올린 단백질과 같은 모양의 성상을 나타내는 것이라면 어느 것이라도 본 발명에 의한 시노비올린 또는 기능적으로 동등한 단백질이다.
시노비올린은 생체시료뿐만 아니라 이를 코드하는 유전자를 적당한 발현계에 삽입시켜 유전자 재조합체(recombinant)로서 얻을 수 있다. 시노비올린을 유전자 공학적 방법에 의해 얻기 위해서는 먼저 서술한 시노비올린을 코드하는 폴리뉴클레오타이드를 적당한 발현계에 삽입시켜 발현시키면 된다. 본 발명에 응용가능한 호스트/벡터계로서는 발현벡터 pGEX-5X-3과 대장균을 들 수 있다. pGEX-5X-3은 외래유전자를 글루타치온 S-트랜스퍼라아제(GST)와의 융합단백질로서 발현시킬 수 있기 때문에(Gene, 67: 31-40, 1988) 시노비올린을 코드하는 유전자를 끼워넣은 pGEX-5X-3을 열쇼크(heat shock)에서 BL21과 같은 대장균주에 삽입하고 적당한 배양시간 후에 이소프로필치오-β-D-갈락토사이드(isopropylthio-β-D-galactoside, IPTG)를 첨가하고 GST 융합 시노비올린의 발현을 유도한다. 시노비올린을 코드하는 유전자는 활막세포의 cDNA 라이브러리 등을 주형으로 하여 PCR 등으로 증폭함으로써 얻을 수 있다. 본 발명에 의한 GST는 글루타치 세파로오스(Glutathione Sepharose) 4B에 흡착하기 위해 발현생성물은 친화성크로마토그래피에 의해 용이하게 분리·정제하는 것이 가능하다.
시노비올린의 재조합체를 얻기 위한 호스트/벡터계로서는 이외에도 다음과 같은 것을 응용할 수 있다. 먼저 세균을 호스트로 이용하는 경우에는 히스티딘 태그, HA 태그, Flag 태그 등을 이용한 융합단백질의 발현용 벡터가 시판되어 있다. 효모에서는 Pichia속 효모가 당쇄를 구비한 단백질의 발현에 유효한 것이 공지이 다. 당쇄의 부가라는 점에서는 곤충세포를 호스트로 하는 바큘로바이러스(baculovirus) 벡터를 이용한 발현계도 유용하다(Bio/Technology, 6: 47-55, 1988). 또, 포유동물의 세포를 이용하여 CMV, RSV 또는 SV40 등의 프로모터를 이용한 벡터의 트랜스펙션(transfection)이 행하여 지고, 이러한 호스트/벡터계는 어느 것이라도 시노비올린의 발현계로서 이용할 수 있다. 또, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노수반(adeno-associated) 바이러스 벡터 등의 바이러스 벡터를 이용하여 유전자를 도입할 수도 있다.
본 발명에 의해 제공되는 신규 단백질 시노비올린 또는 그 면역학적으로 동등한 단백질은 그 면역학적인 특성을 이용하여 RA의 진단에서 유용하다. RA 환자의 혈중에는 시노비올린을 인식하는 항체가 높은 빈도로 검출되며, 정상인의 혈중에서는 실질적으로 검출되지 않는다. 따라서, 본 발명에 의한 시노비올린을 항원으로 하고 피검자가 지니는 항체를 면역학적으로 분석하면 RA의 진단에 있어서 유용한 정보를 제공한다. 즉, 피검자의 체액중에 시노비올린에 반응하는 항체가 검출된 경우에는 피검자가 RA라고 진단할 수 있다.
항체의 면역학적 분석방법에는 많은 방법이 일반적으로 보급되어 있다. 항원감작 플레이트를 샘플 중의 항체와 반응시켜 플레이트 표면에 포착되는 검출대상으로 되는 항체를 항체특이적인 표적항체로 검출하는 방법은 항체의 면역학적 분석방법으로서는 가장 인기있는 방법이다(Immunochemistry, 8: 871-879, 1971). 표식에 효소를 이용한 방법은 ELISA법이라고 불리며 광범위하게 보급되어 있다. 또, 항원을 흡착시킨 라텍스(latex) 입자를 샘플과 혼합하여 면역학적인 응집반응으로 서 항체를 검출하는 방법도 공지이다(Am. J. Med., 21: 888-892, 1956). 면역학적 입자응집반응은 하나의 시약으로 신속한 분석이 가능한 방법이고, 대규모의 스크리닝에 적절한 방법이다.
또한, 최근에는 이뮤노크로마토그래피법(immunochromatography)이 간이분석방법으로서 일반화되어 있다. 이 방법을 항체의 면역학적 분석방법에 응용하기 위해서는 표식 시노비올린과 항시노비올린 항체와의 반응을 샘플 중의 항체가 저해하도록 반응계를 구성한다. 구체적으로는 예를들어 표식 시노비올린과 샘플을 최초로 접촉시키고, 크로마토그래피적인 전개에 의해 시약성분인 항시노비올린 항체와 접촉하도록 배치한다. 샘플 중에 시노비올린 항체가 존재하는 경우에는 이미 표식 시노비올린이 반응해 버리기 때문에 시약성분인 항시노비올린 항체와는 이미 반응할 수 없다. 항시노비올린 항체를 고정하여 두고 그 영역에서 표식 시노비올린의 반응상태를 관찰하면 샘플의 적하만으로 이뮤노에세이를 행할 수 있다.
많은 이뮤노에세이에서 항체를 클래스별로 분석할 수 있다. 특정의 클래스의 항체에 관한 정보가 필요한 경우에는 IgG나 IgM이라는 이뮤노글로블린의 클래스를 식별할 수 있는 항체를 조합하면 된다. 감염증에서는 통상, 감염초기의 IgM 항체측정치의 상승, 그후의 계속적인 IgM 항체 측정치의 저하와 IgG 항체 측정치의 상승이라는 천이가 관찰된다. 이러한 클래스별의 항체 측정치가 본 발명에 있어서도 RA의 임상적인 증상과 관련성을 지닐 가능성이 있다. 보다 구체적으로는 항체의 클래스별 측정에 의해 약효의 판정이나 RA 발증의 예지로 연결될 가능성이 있다.
항체의 검출에 있어서는 항원분자 그것뿐만 아니라, 화학적으로 합성한 올리고펩타이드를 항원으로서 이용하는 방법이 채용되는 경우도 많다. 이것은 특히 우수한 에피토프(epitope) 또는 임상적으로 어떠한 의미를 지니는 에피토프에 특이적인 분석계로 하는 것이 비특이적인 반응의 영향을 받기 어렵기 때문이다. 시노비올린에 대해서도 이러한 접근은 유효하다. 구체적으로는, 먼저 서술한 면역학적으로 활성인 도메인 펩타이드를 얻는 방법에 기초하여 에피토프로서 기능하는 도메인을 결정할 수 있다. 에피토프는 3개 이상의 아미노산 잔기로 구성될 수 있다는 것이 알려져 있다. 또, 다른 단백질과의 면역학적인 식별은 8개 이상의 아미노산 잔기로 가능하게 된다고 알려져 있다. 따라서, 시노비올린의 아미노산 서열에서 선택된 연속된 8개 이상의 아미노산 잔기, 통상 9 아미노산 잔기, 바람직하게는 10 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 11 아미노산 잔기로 이루어지고 환자혈청 중의 항체와 반응하는 단편은 본 발명에 있어서 항체검출용의 항원으로서 바람직하다. 또, 에피토프를 구성하는 올리고펩타이드에 대하여 다양한 수식을 가하여 면역학적인 반응성을 향상시키는 방법도 당업자에게는 공지이다. 예를들어, 인간 혈청 알부민과 같은 불활성 단백질 또는 무의미한 아미노산 서열의 부가로 한 수식이 면역학적인 반응성의 향상에 기여한다.
본 발명에 기초하여 RA의 검출방법에 유용한 시노비올린 또는 그 기능적으로 동등한 단백질, 또는 그들의 부분 펩타이드는 그 분자를 인식하는 항체를 분석하기 위한 면역학적 분석용 시약으로 이용할 수 있다. 본 발명에 의한 면역학적 분석용 시약은 RA의 진단이나 치료효과의 판정에 유용하다.
본 발명에 의한 시노비올린은 RA의 치료나 예방을 목적으로 한 백신의 개발도 가능하게 한다. 시노비올린이 그 리간드와의 결합에 의해 활막세포의 증식을 초래한다고 생각되기 때문에 시노비올린 리간드와의 결합을 블록(block)하는 항체를 주는 백신이 제공된다면 RA의 치료나 예방이 실현된다. 시노비올린의 백신을 얻기 위해서는 시노비올린의 에피토프로 되는 도메인 펩타이드를 중심으로 원래 인간의 단백질인 시노비올린의 도메인 펩타이드에 의한 면역자극을 초래하는 아쥬밴트(adjuvant)나 캐리어 단백질과의 조합에 의해 제제화하는 방법이 일반적이다.
또한, 본 발명은 시노비올린을 인식하는 항체를 제공한다. 본 발명에 의한 시노비올린, 면역학적으로 동등한 단백질 또는 그 단편을 면역원으로 하여 공지 방법에 의해 시노비올린의 항체를 얻을 수 있다. 통상의 면역조작에 의해 폴리클로날 항체를 얻을 수 있고(Harlow, E. & Lane, D., Antibodies, A Laboratry manual. Cold Spring Harbor, New York, 1988), 항체 생성세포를 클로닝함으로써 모노클로날 항체를 얻을 수 있다(Kohler, G & Milstein, C., Nature 256: 495-7, 1975). 모노클로날 항체는 이뮤노에세이에 있어서 높은 감도와 특이성을 달성하기 위해 중요한 도구이다.
면역에는 본 발명에 기초하여 시노비올린(또는 그것과 면역학적으로 동등한 단백질, 또는 그것의 단편)을 적당한 아쥬밴트와 함께 면역동물에 면역한다. 면역원으로서 유용한 시노비올린의 단편으로, 이하의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 들 수 있다.
Syno-P3 (SLALTGAVVAHAYYC/ 서열번호 3),
Syno-P2 (TCRMDVLRASLPAQS/ 서열번호 4) 및
Syno-P1 (GAATTTAAGTSATAC/ 서열번호 5)
이러한 펩타이드를 담체 단백질과 결합시켜 조제된 면역원은 시노비올린에 대하여 특이적으로 또, 충분한 결합친화성을 지니는 항체를 제공한다. 면역원을 얻기 위한 담체 단백질에는 스카시가이헤모시아닌(keyhole lympet hemocyanin, KLH) 또는 소혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA) 등을 이용할 수 있다. 면역동물에는 토끼, 마우스, 랫트, 염소 또는 양 등이 일반적으로 이용된다. 아쥬밴트로서는 프로인트의 콘프리트아쥬밴드(Freund's complete adjuvant, FCA) 등이 일반적으로 이용된다(Adv. Tubercl. Res., 1: 130-148, 1956). 적당한 간격으로 면역을 추가하고 항체가의 상승을 확인한 결과, 채혈한 항혈청을 얻을 수 있다. 또, 그 항체분획을 정제하면 정제항체로 할 수 있다.
또한, 항체생성세포를 채취하고 세포융합법 등에 의해 클로닝하면 모노클로날 항체를 얻을 수 있다. 이 경우의 항체생성세포로는 면역동물에서 유래하는 것 이외에, 시노비올린에 대한 자기항체를 생성하는 RA 환자에서 채취한 항체생성세포를 이용할 수 있다. 또, 이렇게 얻어진 면역동물에서 유래한 모노클로날 항체 생성세포의 항체유전자를 기초로 키메라 항체나 인간화 항체의 구축이 가능하다. 항체를 인간에 투여하는 경우, 동물의 항체는 이물로서 배제되기 때문에 바람직하지 않다. 따라서, 항원성이 강한 항체의 정상영역을 인간의 항체로 치환시킨 키메라 항체나 정상영역뿐만 아니라 가변영역의 프레임웍(frame-work)까지 인간의 유전자로 치환한 인간화 항체가 요구된다. 그점, RA 환자의 항체생성세포에서 유래하는 항체의 가변영역을 이용하면 인간형의 항체를 재구성할 수 있기 때문에 보다 용이하게 안전성이 높은 항체의 구축이 가능하다.
본 발명에 기초하여 제공되는 시노비올린을 인식하는 키메라 항체 또는 인간화 항체는 RA 환자의 활막세포를 표적으로 한 약물이송 시스템(Drug Delivery System; DDS)에 유용하다. 본 발명에 의한 시노비올린을 인식하는 항체를 사용한 DDS에 있어서, 항체와 링크시킴으로써 유용성이 기대될 수 있는 물질로서는 Fas 리간드나 항SL항체 등을 들 수 있다.
또, 본 발명의 항체는 시노비올린의 검출에 유용하다. 시노비올린은 RA 환자의 활막조직에 있어서 강발현하고 있다. 따라서, 활막세포, 활막조직 또는 체액중에 있어서 시노비올린의 검출은 RA의 진단에 있어서 유용한 정보를 제공한다. 구체적으로는, 활막조직이나 혈액중에 시노비올린이 검출되는 경우에는 RA가 진행하고 있다고 생각된다. 본 발명의 항체는 시노비올린의 면역학적 검출용 시약으로 이용할 수 있다. 조직이나 혈중에 존재하는 단백질을 항체를 이용하여 면역학적으로 검출하는 방법은 공지이다. 본 발명의 항체를 포함하는 면역학적 분석용 시약은 RA의 진단이나 치료효과의 판정에 유용하다.
또, 본 발명의 항체는 시노비올린을 발현하는 세포의 분리 또는 검출에 이용될 수 있다. 본 발명의 시노비올린 단백질은 발생에 있어서는 AER에서 발현이 관찰되는 것 이외에, 활막, 골·연골 및 지의 원기로 되는 미분화 간엽계 세포에서 강하게 발현되고 있었다. 따라서, 시노비올린은 AER 및 미분화 간엽계 세포의 마커로서 사용될 수 있다. 즉, 시노비올린의 발현을 지표로 AER 및 미분화 간엽계 세포를 검출하거나 분리할 수 있다. 항체는 적절한 형광 등에 의해 표식될 수 있다. 예를들어, 시노비올린에 대한 항체를 이용하여 셀소팅 등에 의해 시노비올린을 발현하는 세포를 분리할 수 있다. 분리된 미분화 간엽계 세포는 시험관내에 있어서 골·연골의 형성 또는 관절의 재구축에 유용하다.
미분화 간엽계 세포에서는 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)에 있어서 골, 연골, 근, 힘줄, 지방 및 골수 등의 간질(stroma)이 형성된다(S.A. Kuznetsov et al., J. Bone Miner. Res. 12, 1335-47, 1997; D.J. Prockop Science 276, 71-4, 1997; C.M. Thompson and R.A. Young, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 4587-90, 1995; A.I. Caplan, J. Orthop. Res. 9, 641-50, 1991; A.J. Friedenstein, Int. Rev. Cytol. 47, 327-59, 1976; M. Owen and A.J. Friedenstein, in "Cell and Molecular Biology of Vertebrate Hard Tissues", D. Evered and S. Harnett, Eds., Wiley, Chichester, UK, 1988, 42-60; A.J. Friedenstein et al., Cell Tissue Kinet. 20, 263-72, 1987; B.A. Ashton et al., Clin. Orthop. Relat. Res. 151, 294-307, 1980; I. Bab et al., Clin. Orthop. Relat. Res. 187, 243-54, 1984; S.E. Haynesworth et al., Bone 13, 81-8, 1992; A.I. Caplan. Clin. Plast. Surg. 21, 429-35, 1994; 예를들어 Genzyme사의 웹사이트 참조, http://www.genzymebiosurgery.com/).
예를들어, 미분화 간엽계 세포를 시험관내에서 분화시켜 지방세포계열(adipocytic lineage), 연골세포(chondrocytic lineage) 및 골세포계열(osteocytic lineage)의 세포를 형성시킬 수 있다(M.F. Pittenger et al., Science 284, 143-7, 1999).
지방세포로의 분화는 예를들어, 1-메틸-3-이소부틸크산틴, 덱사메타손, 인슐린 및 인도메타신 처리에 의해 유도할 수 있다(M.F. Pittenger, 미국특허 제5827740호, 1998). 연골세포로의 분화는 예를들어, 원심 등에 의해 세포를 미소괴로 한 후, 혈청을 포함하지 않는 배지중에서 transforming growth factor(TGF)-β3으로 자극함으로써 분화시킬 수 있다(A.M. Mackay et al., Tissue Eng. 4, 415-28, 1998; J.U. Yoo et al., J. Bone Joint Surg. Am. 80A, 1745-57, 1998). 골세포로의 분화는 예를들어, 10% 소태아혈청의 존재하에서 덱사메타손, β-글리세롤인산 및 아스코르빈산으로 유도할 수 있다(S.A. Kuznetsov et al., J. Bone Miner. Res. 12, 1335-47, 1997; D.J. Prockop Science 276, 71-4, 1997; C.M. Thompson and R.A. Young, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 4587-90, 1995; A.I. Caplan, J. Orthop. Res. 9, 641-50, 1991; A.J. Friedenstein, Int. Rev. Cytol. 47, 327-59, 1976; M. Owen and A.J. Friedenstein, in "Cell and Molecular Biology of Vertebrate Hard Tissues", D. Evered and S. Harnett, Eds., Wiley, Chichester, UK, 1988, 42-60; S.P Bruder et al., J. Cell. Biochem. 64, 278-94, 1997; N. Jaiswal et al., J. Cell. Biochem. 64, 295-312, 1997; S.P. Bruder et al., J. Bone Miner. Res. 13, 655-63, 1998).
또한, 생체내에 있어서도 예를들어 미분화 간엽계 세포의 자궁내(in utero)로의 이식에 의해 연골세포, 지방세포, 근세포, 심근세포, 골수간질세포, 흉선간질세포로 분화될 수 있다(K.W. Liechty et al., Nature Medicine 6, 1282-1286, 2000). 이러한 방법에 의해 분리된 미분화 간엽계 세포에서 시험관내 또는 생체내에 있어서 조직을 재구축시킬 수 있다. 재구축된 조직이나 기관은 재생의학적 응용이 기대된다.
또한, 시노비올린은 류마티스 활막세포에서 강발현되고 있기 때문에 류마티스 활막세포에 대한 세포 마커로서도 이용될 수 있다. 본 발명의 항체를 세포의 분리 또는 검출용 시약으로서 이용하는 경우에는 항체를 다른 용매나 용질과 조합하여 조성물로 할 수 있다. 예를들어, 증류수, pH 완충시약, 염, 단백질, 계면활성제 등을 조합할 수 있다.
시노비올린은 RA 환자의 활막조직에 있어서 강발현되고 있다. 또, RA 환자의 혈중에 있어서도 시노비올린을 인식하는 항체(자기항체)가 높은 빈도로 검출된다. 한편, 건강인의 혈중에서는 시노비올린의 항체는 실질적으로 검출될 수 없다. 또, 시노비올린은 인비트로에 있어서 배양 활막세포의 증식을 억제한다. 이것은 활막세포의 증식을 촉진하는 리간드에 대하여 시노비올린이 경합하기 때문이라고 생각된다. 이러한 정보를 근거로 다음과 같은 기능이 예상될 수 있다. 즉, 시노비올린의 활막세포에 있어서 강발현이 활막세포에 대하여 증식촉진작용을 지니는 시노비올린의 리간드와의 결합을 촉진하고, 결과로서 활막세포의 증식이 촉진된다. 따라서, 이 활막세포의 이상 증식자체가 바로 RA의 병태인 것이다.
이상의 지견에 근거하여 본 발명은 다음과 같은 공정을 포함하는, 만성 류마티스 관절염의 검출방법 또는 진단방법을 제공한다.
i) 피검자의 생체시료 중에 존재하는 RA의 마커를 검출하는 공정 및
ii) 공정 i)의 검출결과를 RA와 관련짓는 공정.
본 발명에 있어서 RA의 검출방법 또는 진단방법에 있어서 마커는 이하에 표시된 어느 하나의 마커를 이용할 수 있다. 이러한 마커의 측정방법은 이미 서술한 바와 같다.
·시노비올린 또는 시노비올린과 기능적으로 동등한 폴리뉴클레오타이드,
·시노비올린 또는 시노비올린과 기능적으로 동등한 단백질,
·시노비올린 또는 시노비올린과 기능적으로 동등한 펩타이드,
·시노비올린 또는 시노비올린과 기능적으로 동등한 단백질에 결합하는 항체 및
·시노비올린 또는 시노비올린과 기능적으로 동등한 펩타이드에 결합하는 항체.
예를들어, 환자에서 채취한 혈액시료 중에 시노비올린 또는 시노비올린과 기능적으로 동등한 단백질 또는 펩타이드와 반응하는 항체가 발견된다면 그 환자는 RA일 가능성이 높다. 또, 환자에서 채취한 활막조직에 있어서 시노비올린 또는 시노비올린과 기능적으로 동등한 단백질의 발현은 RA에 기인하는 활막조직의 증식을 나타내고 있다. 단백질의 발현은 단백질이나 mRNA의 존재를 지표로 하여 검출할 수 있다.
또, 상기와 같은 기능에 근거하여 본 발명의 시노비올린과 그 유전자의 제공에 의해 RA의 치료약 개발에 새로운 접근을 얻을 수 있다. 먼저, 본 발명의 시노비올린에 의해 시노비올린에 대한 결합활성을 지표로 하여 시노비올린의 리간드를 검출할 수 있다. 즉, 본 발명은 이하의 공정을 포함하는 시노비올린에 대한 결합활성의 검출방법에 관한 것이다.
a) 피검화합물을 시노비올린 또는 시노비올린과 기능적으로 동등한 단백질 또는 펩타이드과 접촉시키는 공정 및
b) 피검화합물과 상기 단백질 또는 펩타이드와의 결합을 관찰하는 공정.
또, 상기 검출방법에 근거하여 시노비올린에 대한 리간드의 스크리닝이 가능하게 된다. 본 발명의 스크리닝 방법은, 구체적으로는 다음의 공정을 포함한다.
a) 상기 시노비올린에 대한 결합활성의 검출방법에 의해 피검화합물의 시노비올린 또는 시노비올린과 기능적으로 동등한 단백질에 대한 결합활성을 검출하는 공정 및
b) 대조와 비교하여 상기 결합활성이 높은 피검화합물을 선별하는 공정.
리간드의 후보화합물은 천연의 물질이나 그 변이체 뿐만 아니라, 저분자의 유기화합물이어도 좋다. 상기 단백질과 후보화합물의 결합에 관하여는 후보화합물을 표식하여 두면 직접 검출할 수 있다. 또, 이미 알고있는 SL과의 결합저해를 지표로 하여 확인할 수도 있다. 즉, S1-5와 같이 본 발명의 단백질과의 결합활성을 지니는 것이 확인된 분자의 공존하에서 후보화합물과 본 발명의 단백질을 접촉시키는 것이다. 또, 후보화합물과 본 발명의 단백질의 접촉후에 다시 SL을 접촉시킴으로써 후보화합물의 결합활성을 평가할 수 있다. 결합저해를 지표로 하는 경우에는 표식이 필요한 것이 기지의 SL만으로 되기 때문에 간편한 스크리닝법으로 된다.
대조로서는 피검화합물의 부존재하에서 공정 a)와 동일한 조작을 행하는 것 이 가장 바람직하다. 또, 공정 a)에 비해 피검화합물을 보다 낮은 농도에서 포함하는 경우라도 좋다. 또, 예를들어 피검화합물 대신에 시노비올린에 결합하는 것이 알려져 있는 분자를 이용하여 공정 a)와 동일한 조작을 행하고 그 분자보다 더 높은 결합활성을 지니는 화합물을 선별할 수도 있다.
이외의 실시예에 나타난 유전자에 근거하여 리간드의 스크리닝법이 가능하다. 예를들어, 시판의 Two-hybrid system을 이용하여 후보리간드를 코드하는 유전자를 포함하는 라이브러리에서 시노비올린에 결합하는 단백질을 코드하는 유전자를 스크리닝할 수 있다. 이런 방법은 천연의 리간드를 스크리닝하는 경우에 유용한 방법이다. 또, cDNA를 삽입한 파아지 라이브러리와 표식 시노비올린을 이용한 발현 스크리닝에 의해 리간드를 클로닝할 수도 있다. 본 발명자들은 이 스크리닝 방법에 의해 시노비올린의 천연 리간드인 SL을 발견하였다. SL은 활막세포 표면에 있는 시노비올린에 결합하여 세포증식을 자극하고 있을 가능성이 있기 때문에, SL의 혈중 레벨의 측정이 RA의 병태와 관련있을 가능성이 있다. SL은 시노비올린과의 결합 활성에 근거하여 측정할 수 있다. 물론 항SL항체에 의해 이뮤노에세이를 행하여도 가능하며, 양자를 조합한 샌드위치법에 의해 SL을 측정할 수도 있다.
본 발명자들은 시노비올린을 배양 활막세포에 첨가하면 세포증식에 대하여 억제적으로 작용하는 것을 확인하였다. 이것을 배양 중의 SL의 중화로 설명하면,시노비올린과 그 리간드와의 결합을 저해하는 것은 골막세포의 이상증식 억제로 연결되고 결과로서 RA의 치료효과를 가져다 주는 것이라고 판단된다. 본 발명의 스 크리닝 방법에 의해 얻어질 수 있는 리간드는 시노비올린과 그 천연 리간드와의 결합을 경합적으로 저해하기 때문에 RA의 활막세포의 증식을 효과적으로 억제하는 활성(antagonist, 안타고니스트)을 기대할 수 있다.
또, 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 얻어질 수 있는 시노비올린의 리간드에는 상기 SL과 마찬가지로 시노비올린의 활성을 자극하는 활성(agonist, 아고니스트)이 기대된다. 시노비올린을 자극하는 리간드는 시노비올린 자극제 또는 골형성 촉진제로서 유용하다. 보다 구체적으로는, 시노비올린을 자극하는 리간드는 골다공증, 골절 또는 스포츠 외상 등의 치료약으로서 이용될 수 있다.
이러한 결합활성의 검출방법 및 스크리닝 방법을 발전시켜, 다시 본 발명은 시노비올린 또는 그의 기능적으로 동등한 단백질과 시노비올린 리간드와의 결합을 저해하는 활성의 검출방법 및 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명에 기초하여 시노비올린과 시노비올린 리간드와의 결합을 저해하는 활성의 검출방법은 이하의 공정을 포함한다.
a) 피검화합물 존재하에서 시노비올린 또는 시노비올린과 기능적으로 동등한 단백질 또는 펩타이드와 그 리간드를 접촉시키는 공정 및
b) 상기 단백질 또는 펩타이드에 결합되는 리간드 및/또는 피검화합물을 검출하는 공정.
그리고, 상기 검출방법에 근거하여 시노비올린 또는 그의 기능적으로 동등한 단백질과 시노비올린 리간드와의 결합을 저해하는 화합물의 스크리닝 방법이 제공된다. 즉, 본 발명은 이하의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
a) 상기 검출방법에 근거하여 피검화합물의 시노비올린 또는 시노비올린과 기능적으로 동등한 단백질과 그의 리간드와의 결합을 저해하는 활성을 검출하는 공정 및
b) 대조와 비교하여 상기 저해활성이 높은 피검화합물을 선별하는 공정.
대조로서는 피검화합물의 부존재하에서 공정 a)와 동일한 조작을 행하는 것이 가장 바람직하다. 또, 공정 a)에 비해 피검화합물을 보다 낮은 농도로 포함하는 경우라도 좋다. 또, 예를들어 피검화합물 대신에 시노비올린과 그 리간드와의 결합을 저해하는 것이 알려져 있는 분자를 이용하여 공정 a)와 동일한 조작을 행하고 그 분자보다도 더 높은 결합활성을 지니는 화합물을 선별할 수도 있다.
이 스크리닝에 의해 시노비올린과 그의 기능적으로 동등한 단백질에 대한 안타고니스트로서 작용하는 화합물을 얻을 수 있다. 시노비올린의 리간드로서는 예를들어, 실시예에 기재된 SL(S1-5)를 이용할 수 있다. 구체적으로는 accession number AAA65590, I38449, NP_061489, NP_004096 또는 Q12805로 특정되는 S1-5 단백질이나 시노비올린 단백질에 결합하는 활성을 지니는 한, 그들에 유사한 단백질을 이용할 수 있다(Lecka-Czernik, B. et al., Mol. Cell. Biol. 15, 120-128, 1995; Heon, E. et al., Arch. Ophthalmol. 114, 193-198, 1996; Ikegawa, S. et al., Genomics 35, 590-592, 1996; Katsanis, N. et al., Hum. Genet. 106, 66-72, 2000; Giltay, R. et al., Matrix Biol 18, 469-480, 1999; Stone, E. M. et al., Nat. Genet. 22, 199-202, 1999). 시노비올린과 시노비올린 리간드와의 접촉은 후보화합물을 적용하기 전, 후 또는 동시에 행할 수 있다.
여기서 스크리닝해야 할 화합물로서는 시노비올린측에 결합하고 리간드와의 결합을 블록하는 것과 리간드측을 블록하는 것이 생각된다. 시노비올린측에 결합하는 화합물을 스크리닝하기 위해서는 리간드를 표식하여 둔 후보화합물과 경쟁시키면 된다. 리간드측에 결합하는 화합물이 후보로 되어 있다면 그 역으로 된다. 어떠한 스크리닝에 있어서도 표식에 있어서 방사성 동위원소를 이용하는 것이 활성에 대한 영향이 적기 때문에 바람직하다. 이렇게 얻어질 수 있는 시노비올린의 안타고니스트에 관하여서도 활막세포의 증식을 억제하는 작용을 지니는 것이라고 추측되며 RA의 치료효과를 기대할 수 있다.
또, 시노비올린 리간드인 S1-5는 Malattia Leventinese(ML) 및 Doyne honeycomb retinal dystrophy(DHRD)의 원인 유전자인 것이 시사되어 있다(Stone, E.M. et al., Nature Genetics 22, 199-202, 1999). 이러한 질환은 결정강(drusen)이라 불리우는 침착물을 발생시키고 가령황반변성증(age-related macular degeneration; AMD)과 유사한 증상을 나타낸다. 따라서, 시노비올린도 또한 ML 및 DHRD에 관여하고 있을 가능성이 있다. 시노비올린의 변이나 다형의 검사에 의해 ML 및 DHRD의 진단을 행할 수 있다고 판단된다. 또한, 본 발명의 스크리닝에 의해 얻어지는 시노비올린의 리간드로서 작용하는 화합물이나 시노비올린과 S1-5와의 상호작용을 저해하는 화합물 등은 이러한 질환의 예방이나 치료에 공헌하는 의약으로서의 이용이 기대된다.
또, 본 발명의 시노비올린을 이용하여 화합물의 시노비올린에 의한 신호 전달을 조절하는 활성을 평가하거나 시노비올린에 의한 신호전달을 조절하는 화합물 을 스크리닝할 수 있다. 구체적으로는 본 발명은 다음의 공정을 포함하는 피검화합물의 시노비올린에 의해 신호전달을 조절하는 활성을 검출하는 방법을 제공한다.
a) 시노비올린 리간드의 존재하 또는 부존재하에서 피검화합물과 시노비올린을 접촉시키는 공정 및
b) 시노비올린을 매개로 하는 신호전달을 검출하는 공정.
또, 본 발명은 다음의 공정을 포함하는 시노비올린에 의한 신호전달을 조절하는 활성을 지니는 화합물의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
a) 상기 방법에 의해 피검화합물의 시노비올린에 의한 신호전달을 조절하는 활성을 검출하는 공정 및
b) 대조와 비교하여 상기 조절의 활성이 높은 피검화합물을 선별하는 공정.
대조로서는 피검화합물의 부존재하에서 공정 a)와 동일한 조작을 행하는 것이 가장 바람직하다. 또, 공정 a)에 비해 피검화합물을 보다 낮은 농도로 포함하는 경우라도 좋다. 또, 예를들어 피검화합물 대신에 시노비올린에 의한 신호전달을 촉진 또는 저해하는 활성을 지니는 것이 알려져 있는 분자를 이용하여 공정 a)와 동일한 조작을 행하여 그 분자보다도 더 높은 결합활성을 지니는 화합물을 선별할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 시노비올린에 의한 신호전달로는 시노비올린으로 주어진 자극이 다른 분자에 전달된 것을 의미한다. 자극의 종류는 한정되지 않는다. 생체에 있어서 신호전달에는 많은 양식이 존재하는 것이 알려져 있다. 대표적인 신호전달은 단백질의 수식에 의한 활성의 조절이다. 예를들어, 어떤 종의 단백질은 인산화나 아세틸화에 의해 그 단백질의 활성이 조절되고 있다. 또, 단백질의 절편에 의해 그 활성이 억제되는 것도 알려져 있다. 단백질의 절단을 보다 특이적으로 행하기 위해서 유비퀴틴(ubiquitin)과 같은 분자의 존재가 중요하다. 신호전달은 신호의 전달에 의해 발생하는 신호전달을 구성하는 분자의 활성이나 구조의 변화를 지표로 하여 검출할 수 있다. 또, 신호전달을 위한 복합체의 형성을 지표로 하고 신호전달을 검출할 수도 있다.
신호전달로서는 특히, 인산화 또는 탈인산화 신호를 들 수 있다. 세포증식 신호의 대부분은 단백질 인산화 또는 탈인산화에 의한 단백질 수식을 매개로 하여 하류의 신호 분자에 전달되는 것이 알려져 있다. 본 발명의 시노비올린도 세포증식작용을 지니는 것이기 때문에 시노비올린을 매개로 한 신호전달도 또한 단백질의 인산화에 의해 전달되는 것이 시사된다. 실제, 본 발명자들은 시노비올린 발현에 의한 인산화 작용을 발견하였다. 따라서, 시노비올린을 매개로 한 신호전달을 단백질의 인산화의 검출에 의해 측정할 수 있다.
세포증식 또는 분화에 관여하는 수용체는 그 효소활성 부위로서 다음과 같은 도메인을 지니고 있다(실험의약별책, Bioscience 용어 라이브러리, 개정판 사이토카인·증식인자, 양토사, 1998년 발행).
티로신키나아제 도메인(VEGF 수용체, PDGF 수용체, HGF 수용체, EGF 수용체 등),
티로신포스파타아제 도메인(RPTP 등) 또는
세린/스레오닌키나아제 도메인(TGF β수용체 등)
시노비올린도 이러한 효소활성을 직접 또는 간접적으로 보유하고 있다고 예상된다. 효소활성을 간접적으로 지닌다는 것은 시노비올린 분자내에 효소활성 부위는 유지되지만 시노비올린에 회합하는 분자가 효소활성을 지니는 것을 말한다. 이러한 분자로서는 예를들어, TNF 수용체나 GM-CSF 수용체 등이 알려져 있다. 따라서, 예를들어, 티로신, 세린 및/또는 스레오닌의 인산화 활성을 검출함으로써 시노비올린에 의한 신호전달을 평가할 수 있다. 이때, 시노비올린 리간드의 존재하에서 피검화합물의 작용을 평가함으로써 시노비올린 리간드에 의해 유인되는 시노비올린의 신호전달에 주어진 피검화합물의 영향을 평가할 수 있다. 구체적으로는 시노비올린 리간드에 의한 시노비올린에 대한 신호전달을 저해 또는 억제하는 활성을 검출할 수 있다. 시노비올린 리간드로서는 본 명세서에 있어서 서술된 시노비올린 리간드 S1-5를 이용할 수 있다. 또한, 시노비올린 리간드의 부존재하에서 피검화합물의 작용을 평가함으로써 피검화합물에 의한 시노비올린에 대한 자극활성을 평가할 수도 있다.
단백질의 인산화를 검출하기 위해서는 시노비올린 리간드의 존재하 또는 부존재하에서 예를들어, 피검화합물 및 [32P] 오르토인산과 함께 시노비올린 발현세포를 인큐베이션한다. 다음으로 이 세포의 용해물에서 면역침강에 의해 인산화된 단백질을 회수한다. 회수된 단백질은 SDS-PAGE로 전개 후, 오토레디오그라피(autoradiography)에 의해 인산화를 검출할 수 있다. 인산화 아미노산은 TLC나 그 밖의 공지의 펩타이드 분석에 의해 동정할 수 있다.
또, 인산화 티로신 항체 등, 인산화 단백질에 대한 특이적 항체를 이용하여 특정의 아미노산의 인산화를 검출할 수도 있다.
일반적으로, 세포내에 있어서 신호전달 인자의 인산화는 다음에 복수의 분자에 전달된다. 즉, 일련의 전달경로는 케스케이드(cascade)를 구성하고 있다. 따라서, 세포내의 단백질 전체의 인산화 레벨의 변화를 평가함으로써 그 세포에서 일어난 인산화 신호의 크기를 비교할 수 있다. 세포내의 모든 단백질을 대상으로 인산화 레벨을 평가하는 방법은 공지이다. 예를들어, 세포를 시노비올린 리간드 등으로 자극 후, 단백질을 SDS-PAGE로 전개하고 필터로 블롯한 후, 항인산화 티로신 항체 등을 이용한 웨스턴블롯에 의해 단백질 전체의 인산화 레벨을 평가할 수 있다. 또, 예를들어, [32P] 오르토인산으로 세포를 표식하고 세포를 시노비올린 리간드 등으로 자극 후, 세포 단백질을 이차원 전기영동으로 전개한다. 단백질을 쿠마시블루(coomassie blue)로 염색하고, 오토레디오그라피를 행한다. 인산화된 스팟(spot)을 검출함으로써 인산화 레벨을 평가할 수 있다.
또한, 시노비올린의 기질로 되는 인산화 단백질에 있어서 인산화의 레벨의 변화를 특이적으로 측정할 수도 있다. 시노비올린의 기질로 되는 인산화 단백질은 예를들어, 상기의 이차원 전기영동에 있어서 인산화된 스팟을 회수하고, 마이크로시퀀싱(microsequencing)이나 메스스펙트로메트리(mass spectrometry)에 의해 동정할 수 있다. 동정된 기질 단백질의 인산화 레벨의 변화는 예를들어, 기질 단백질에 대한 특이항체를 이용하고 면역침강을 행하고, SDS-PAGE로 전개 후, [32P]의 수 확을 오토레디오그라피로 측정하거나, 항인산화 티로신 항체를 이용한 웨스턴 블롯 등에 의해 평가할 수 있다(바이오매뉴얼시리즈 분자생물학연구를 위한 단백실험법 죽승충신 도원창수 편).
상기 방법에 이용되는 세포로서는 활막세포(예를들어, RTF)나 외래적으로 시노비올린 유전자를 도입한 세포 등을 들 수 있다. 피검화합물에 의해 시노비올린에 의한 인산화 또는 탈인산화의 레벨이 저하되면 이 화합물은 시노비올린에 의한 신호전달을 저해하는 화합물로 판단된다. 또, 피검화합물에 의해 시노비올린에 의한 인산화 또는 탈인산화의 레벨이 상승하면 이 화합물은 시노비올린에 의한 신호전달을 촉진하는 화합물로 판단된다.
예를들어, 시노비올린이 수용체형 티로시나아제로서 기능하고, 티로신 인산화를 매개하여 하류의 분자를 활성화한 신호를 전달하는 경우, 피검화합물에 의해 티로신 인산화가 억제되면 이 화합물은 시노비올린에 의한 신호전달을 저해하는 화합물로 판단된다. 또, 본 발명은 예를들어 티로신나아제, 티로신포스파타아제 또는 세린/스레오닌키아나제(serine/threonine kinase) 등의 단백질키아나제 또는 포스파타아제의 저해제를 이용하여 시노비올린에 의한 신호전달을 저해하는 방법에도 관여한다.
또, 시노비올린에 의한 신호전달의 가장 바람직한 다른 일례로서는 유비퀴틴화(ubiquitination) 신호를 들 수 있다. 단백질 구조예측 시스템(SMART: Simple Modular Architecture Research Tool(웹사이트도 참조 http://smart.embl-heidelberg.de/) Schultz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864, 1998; Schultz et al., Nucleic Acids Res. 28, 231-234, 2000)에 의해 시노비올린에 Ring finger 모티브(Joazeiro, C.A. et al., Science 286, 309-312, 1999)의 존재가 시사되었다. 이 모티브는 단백질의 분해에 관련되는 E3 유비퀴틴 단백질 리가아제에 존재하는 것이 알려져 있다. 또, Ring finger 모티브는 E2 유비퀴틴 결합효소의 결합부위라고 생각되고 있다.
따라서, 시노비올린에 의한 유비퀴틴화 신호를 검출함으로써 시노비올린에 의한 신호전달을 평가할 수 있다. 유비퀴틴화 신호는 예를들어, 항유비퀴틴 항체를 이용하여 기질단백질의 유비퀴틴화를 검색함으로써 평가된다. 또, 시노비올린과 E2 유비퀴틴 결합효소 또는 기질단백질과의 결합 또는 시노비올린을 포함하는 유비퀴틴 리가아제 복합체 등을 검출하여도 좋다. 구체적으로는 예를들어 태그를 부친 시노비올린을 발현하는 벡터를 트랜스펙션한 세포를 파쇄하고 [32P] 표식 유비퀴틴을 첨가한 반응 후, 항태그 항체에 의해 면역침강한다. SDS-PAGE에 의해 전개하고 오토레디오그래피를 행함으로써 시노비올린의 유비퀴틴 리가아제 활성을 검출할 수 있다(Hashizume, R. et al., J. Biol. Chem. 276, 14537-14540, 2001).
시노비올린의 기질단백질에 있어서 유비퀴틴화의 레벨의 변화를 특이적으로 측정할 수도 있다. 시노비올린의 기질단백질은 예를들어 시노비올린을 베이트(bait)로 한 효모 two-hybrid 스크리닝 등에 의해 동정할 수 있다. 동정된 기질단백질의 유비퀴틴화 레벨의 변화는 태그마다 기질을 정제하고 여기에 정제한 E1, E2, E3 및 유비퀴틴을 첨가하고 반응후, 항태그 항체로 면역침강하고 항유비퀴틴 항체에 의한 염색에 의해 평가할 수 있다(Yokouchi, M. et al., J. Biol. Chem. 274, 31707-31712, 1999).
피검화합물에 의해 시노비올린에 의한 유비퀴틴화 신호의 활성화가 저하되면 그 화합물은 시노비올린에 의한 신호전달을 저해하는 화합물로 판정된다. 또, 피검화합물에 의해 시노비올린에 의한 유비퀴틴화 신호의 활성화가 상승되면 이 화합물은 시노비올린에 의한 신호전달을 촉진하는 화합물이라고 판정된다. 예를들어, 시노비올린과 E2 유비퀴틴 활성화 효소와의 상호작용을 저해하는 화합물은 시노비올린에 의한 유비퀴틴화 신호를 유효하게 저해할 수 있다. 또, 본 발명은 유비퀴틴화 신호에 관여하는 효소의 저해제를 이용하여 시노비올린에 의한 신호전달을 차단하는 방법을 제공한다. 예를들어, E2 유비퀴틴 결합효소 또는 E3 유비퀴틴 리가아제의 저해제를 세포에 적용함으로써 시노비올린에 의한 신호전달을 저해할 수도 있다.
이상과 같은 방법에 의해 시노비올린을 매개하는 신호전달을 조절하는 활성을 지니는 화합물을 선별할 수 있다. 시노비올린에 의한 신호전달을 저해하는 화합물은 시노비올린의 활성화에 기인하는 질환의 치료제로서 유용하다. 예를들어, 시노비올린에 의한 신호전달을 저해하는 화합물은 활막증식저해로서 유용하다. 이 화합물을 투여함으로써 활막증식을 억제할 수 있고, 이렇게 RA 등의 활막증식을 수반하는 질환의 예방 및 치료를 행할 수 있다. 또, 이러한 화합물은 ML 및 DHRD에 대한 의약으로서도 이용될 수 있다. 또는 이 신호전달을 촉진하는 화합물은 시노비올린 자극제 또는 골형성 촉진제 등에 이용될 수 있다. 예를들어, 골다공증, 골 절 또는 스포츠 외상 등의 치료약으로서 이용될 수 있다.
시노비올린 유전자의 발견에 기초하여 예를들어 다음과 같이 RA 및 시노비올린이 관여하는 그 이외의 질환에 관하여 새로운 연구가 가능하게 된다. 먼저, 시노비올린의 발현을 제어하고 있는 프로모터나 인핸서(enhancer)의 구조결정이 가능하게 된다. 즉, 서열번호 1로 표시된 시노비올린 유전자의 염기서열을 근거로 게놈의 클로닝을 진행하고 발현제어영역의 서열을 분석할 수 있다. 그 결과 얻어진 시노비올린의 전사조절영역은 시노비올린의 전사조절인자의 탐색에 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 시노비올린 넉아웃 동물에 있어서, 마커 유전자를 넉인하고 시노비올린 유전자의 내인성 프로모터의 제어하에서 마커 유전자를 발현시키면 이 동물 또는 이 동물 유래의 세포를 이용하여 마커 유전자의 발현을 지표로 시노비올린 유전자의 발현을 제어하는 약제를 스크리닝할 수 있다. 예를들어, 전자조절인자의 인식서열을 두가닥 사슬로 하여 주면 데코인(decoy) 핵산의약으로서 기능한다.
또한, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 이용하여 동물에 있어서 본 발명의 단백질의 생물학적인 역할을 조사할 수 있다. 이를 위해서는 예를들어, 본 발명의 DNA를 도입하고 본 발명의 단백질을 과잉발현 또는 이소발현(또는 이시발현)시켜 그 효과를 검증함으로써 그 역할을 조사할 수 있다. 유전자를 전신에 도입하기 위해서는 본 발명의 DNA의 트랜스제닉 동물을 제작하면 된다. 또, 유전자 타게팅이나 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 리보자임 등의 투여에 의해 본 발명의 DNA의 발현이나 기능을 억제하는 loss-of-function(기능상실) 실험도 유효하다. 즉, 본 발명은 본 발명의 DNA의 발현이 변화되어 있거나 또는 상기 변화를 유도할 수 있는 트랜스제닉 비인간 척추동물을 제공한다. 발현의 변화는 야생형과 비교하여 변화되어 있어도 좋고 변화를 유도하는 경우에 있어서도 유도전과 비교하여 변화하고 있어도 좋다.
본 발명에 있어서 트랜스제닉 동물로는 외래적으로 핵산이 게놈에 도입된 동물이 포함된다. 또, "DNA의 발현"이라 함은 DNA의 전사레벨이어도 좋고 그 전사산물의 번역레벨이어도 좋다. 또, "변화를 유도한다"라 함은 예를들어, 외래적인 자극이나 시기 특이적으로 발현의 변화가 유도되고, 교배에 의해 후대에 있어서 발현이 변화되는 것을 포함한다. 또, 일부의 세포 또는 조직에 있어서 발현의 변화도 포함한다. 본 발명의 트랜스제닉 비인간 척추동물로서는 포유동물(예를들어 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼, 돼지, 염소, 양, 말 및 소 등)이 바람직하고 특히 설치류 예를들어 마우스 또는 랫트 등을 이용하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 트랜스제닉 비인간 척추동물에는 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA가 외래적으로 도입되어 있는 트랜스제닉 비인간 척추동물이 포함된다. 이러한 트랜스제닉 동물은 예를들어 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA를 발현하는 벡터를 수정난에 도입함으로써 제조할 수 있다.
벡터의 도입은 벡터와 난을 혼합 후 인산칼슘에 의한 처리, 일렉트로포레이션(electroporation) 또는 도립현미경하에 있어서 마이크로인젝션법(microinjection) 등에 의해 행할 수 있다. 또한, 배성 간세포(ES 세포)에 본 발명의 벡터를 도입하고 선별된 ES 세포를 수정난(폐 반포)에 마이크로인젝션에 의해 도입하여도 좋다.
얻어진 수정난은 수정관 결찰(vasectomized) 수컷개체와의 교배에 의해 위임신시킨 레시피언트(recipient)의 난관내로 이식하여 자손을 얻을 수 있다. 자손의 꼬리 등에서 DNA를 조제하고 PCR에 의해 도입 DNA의 보유를 확인한다(Brigid Hogan et al. eds., "Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1994, Gordon, J.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7380-7384, 1980; Jaenisch, R. and B. Mintz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71: 1250-1254, 1974). 생식계열에 유전자가 도입된 키메라 동물에서는 정상동물과 교배함으로써 헤테로 접합체가 얻어진다. 헤테로 접합체간의 교배에 의해 호모접합체를 얻을 수 있다. 본 발명의 트랜스제닉 비인간 척추동물에는 이러한 자손도 포함된다.
본 발명의 DNA를 생체내에서 발현시키기 위해서 이용하는 프로모터로서는 예를들어, 전신발현성의 프로모터나 그 외의 조직특이적, 시기특이적 프로모터를 이용할 수 있다.
전신성 프로모터로서는 예를들어, β액틴 프로모터 등을 들 수 있다. 예를들어, pCAGGS 등에 포함되어 있는 인간 사이토메갈로바이러스(cytomegalocvirus) 인핸서가 연결된 닭 β액틴 프로모터를 이용할 수 있다. 부위특이적 또는 시기특이적으로 본 발명의 DNA를 발현하는 트랜스제닉 동물을 제작하는 경우, Cre-loxP의 계 등을 이용할 수 있다. 예를들어, 부위특이적 또는 시기특이적 프로모터의 하류 에 Cre 리콘비나아제(recombinase) 유전자를 지니는 트랜스제닉 동물을 제작하고 별도로 일반용 프로모터의 하류에 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 코드하는 DNA를 연결시킨 벡터를 보유하는 트랜스제닉 동물을 제작한다. 이때, 프로모터와 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 코드하는 DNA와의 사이에 한쌍의 loxP로 끼운 정지코돈(stop codon) 또는 전사종결 신호 등을 삽입해 둔다. 2개의 개체를 교배함으로써 Cre의 발현에 수반하여 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 발현시킬 수 있다.
또, 본 발명의 트랜스제닉 비인간 척추동물에는 내인성의 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA의 발현이 억제되어 있는 트랜스제닉 비인간 척추동물이 포함된다. 이러한 트랜스제닉 동물은 예를들어, 유전자 타게팅에 의해 제조할 수 있다. 이러한 트랜스제닉 비인간 척추동물을 제조하기 위해서는 예를들어 본 발명의 DNA의 일부 또는 전부를 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 등에 의해 결손시킨 타게팅 벡터를 배성간(ES) 세포에 도입하고 염색체 DNA와 상동재조합을 일으킨 세포를 선별한다. 상동재조합체의 선별을 위해서는 공지의 파지티브(positive)·네가티브(negative) 선별을 행할 수 있다. 파지티브 선별용 마커로서는 네오마이신 내성 유전자 드으이 약제내성 유전자, 네가티브 선별용 마커로서는 디프테리아 독소(DT)-A 유전자나 HSV-tk 유전자 등을 들 수 있다. 서던블롯이나 PCR 등에 의해 확실히 재조합된 세포를 선별할 수 있다. 얻어진 세포는 8세포기 정도의 수정난 또는 배반포의 배반포강 등에 주입하고 수정관 결찰 수컷과 교배시켜 제작한 위임신 암컷개체의 자궁에 이식한다. 자손의 게놈 DNA 분석은 상기와 마찬가지로 행하고 헤테로 접합체 및 호모개체를 얻을 수 있다. 목적의 유전자를 넉아웃할 뿐만 아니라, 다른 유전 자를 넉인할 수도 있다. 넉인한 유전자에 특별히 제한은 없다. 예를들어, lacZ 유전자 등의 마커 유전자를 들 수 있다.
또한, 내인성의 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA의 발현이 억제되어 있는 트랜스제닉 비인간 척추동물은 안티센스법 또는 리보자임법을 이용하여 제작할 수도 있다. 안티센스법에 있어서는 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA의 전사산물에 상보적인 RNA를 코드하는 DNA를 포함하는 벡터를 또, 리보자임법에 있어서는 예를들어 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA의 전사산물을 절단하는 RNA를 코드하는 DNA를 포함하는 벡터를 상기와 마찬가지로 포유동물의 배성 간세포에 도입하고 이것을 포유동물의 배에 주입하여 상기 배에서 개체를 얻으면 된다.
시노비올린이 RA의 활막세포 증식증상을 야기하고 있기 때문에 트랜스제닉 동물에는 다음과 같은 용도가 고려된다. 즉, 시노비올린 유전자 또는 SL의 유전자를 적당한 동물에 삽입하여 트랜스제닉 동물로 하고 이를 강발현시키면 RA의 모델로 될 수 있다. 이 트랜스제닉 동물에 있어서 활막증식 기구를 제어하는 약제의 스크리닝을 진행하는 것이 가능하게 된다. 또, 인간의 시노비올린/SL로 RA 증상을 일으키지 않는 동물에 있어서는 이러한 유전자를 강발현시켜 시노비올린이나 SL의 공급원으로 하여 활용할 수도 있다.
시노비올린 유전자를 발현하는 트랜스제닉 동물은 활막증식을 수반하는 관절염 등, RA와 공통하는 증상을 일으킨다. 즉, 이 동물은 만성 류마티스 관절염 모델 동물로 된다. 이 동물을 이용하여 RA에 대한 의약 후보화합물을 포함하는 각종 의 화합물의 시험 또는 스크리닝을 행할 수 있다. 피검화합물을 트랜스제닉 동물에 투여하고 증상의 경감 또는 악화를 관찰하여 화합물의 효과를 검증하거나 또는 스크리닝을 행할 수 있다. 본 발명의 트랜스제닉 동물을 이용한 시험 또는 스크리닝의 방법으로서는 이하의 방법을 들 수 있다.
관절이상을 경감 또는 악화시키는 화합물을 시험 또는 스크리닝하는 방법에 있어서, (a) 본 발명의 DNA가 외래적으로 도입되어 있는 트랜스제닉 비인간 척추동물에 피검화합물을 투여하는 공정 및 (b) 투여된 동물의 관절이상을 평가하는 공정을 포함하는 방법.
또, 시노비올린 유전자의 넉아웃 동물은 시노비올린의 작용의 억제에 의한 부작용을 조사하거나 그 부작용을 저감하는 약제의 에세이나 스크리닝에 이용할 수 있다. 또, 넉아웃 동물에 국소적 또는 일시적으로 시노비올린을 발현시켜 시노비올린의 효과를 특이적으로 검증할 수도 있다. 또, SL(S1-5)와 ML/DHRD와의 관련에서 시노비올린이 SL의 세포내 신호전달에 관여할 가능성이 있기 때문에 시노비올린 넉아웃 동물은 ML 및 DHRD의 모델로 될 수 있다. 예를들어, 조직특이적, 시기특이적으로 시노비올린 유전자를 (호모 또는 헤테로로) 넉아웃하는 것이 고려된다.
시노비올린 유전자의 넉아웃시에 마커 유전자 등을 도입한 넉인 동물을 이용하여 화합물의 시노비올린 유전자의 발현을 상승 또는 하강시키는 활성을 검출할 수 있다. 즉, 본 발명은 이하의 공정을 포함하는 피검화합물의 시노비올린 유전자의 발현을 조절하는 활성의 검출방법에 관한 것이다.
a) 피검화합물을 상기 넉인 동물 또는 넉인 세포에 적용하는 공정 및
b) 마커 유전자의 발현 레벨을 측정하는 공정.
이 검출방법은 시노비올린 유전자의 발현을 조절하는 화합물의 스크리닝에 이용할 수 있다. 이 방법은 시노비올린 유전자의 발현을 조절하는 화합물의 스크리닝 방법이고, a) 상기 넉인 동물 또는 넉인 세포에 피검화합물을 적용하는 공정, b) 마커 유전자의 발현 레벨을 측정하는 공정 및 c) 넉인된 유전자의 발현을 상승 또는 저하시키는 화합물을 선별하는 공정을 포함하는 방법이다.
즉, 피검화합물을 적용한 동물 또는 세포에 있어서 마커 유전자의 발현을 검출하고 마커 유전자의 발현을 상승 또는 저하시키는 화합물을 선별한다. LacZ을 마커로 이용한 경우의 마커 유전자의 발현의 검출은 실시예에 기재된 방법에 의해 행할 수 있다. 이 방법에 의해 개체를 이용한 시험이나 스크리닝에 더해, 예를들어 기관이나 조직을 단리하여 이용하거나 트랜스제닉 동물에서 얻어진 세포를 이용하여 비슷한 시험이나 스크리닝을 행하는 것도 가능하다.
개체를 이용한 스크리닝에 있어서는 피검화합물은 적당한 루트를 매개로 하여 투여된다. 피검화합물은 예를들어 정맥주사, 피하주사, 근육내주사, 복강내주입, 경구투여, 경장투여, 경비투여 등의 공지 투여방법에 의해 투여될 수 있다. 시험관 배양계를 이용하여 스크리닝을 행하는 경우는 피검화합물은 예를들어 배지중에 첨가된다. 또한, 마이크로인젝션 등에 의해 세포내에 주입되어도 좋다. 피검화합물이 유전자인 경우는 naked DNA로서 희망하는 트랜스펙션 시약과 조합하거나 공지의 발현 벡터에 삽입하여 세포로 유전자를 도입할 수 있다. 시노비올린 유전자의 프로모터 영역의 서열을 포함하는 핵산은 데코이(decoy)로서 작용하고 시노 비올린의 발현을 억제하는 것이 기대된다.
시노비올린 유전자의 발현을 조절하는 활성은 예를들어, 이하의 공정에 의해 검출할 수 있다.
a) 시노비올린 또는 시노비올린과 기능적으로 동등한 폴리뉴클레오타이드의 내인성 프로모터의 제어하에 리포터 유전자(reporter gene)를 발현할 수 있는 발현계에 피검화합물을 접촉시키는 공정 및
b) 리포터 유전자의 발현 레벨을 측정하는 공정.
그리고, 이 검출방법에 기초하여 시노비올린 유전자의 발현을 조절하는 화합물을 스크리닝할 수 있다. 즉, 본 발명은 이하의 공정을 포함하는 시노비올린 또는 시노비올린과 기능적으로 동등한 폴리뉴클레오타이드의 내인성 프로모터의 활성을 조절하는 화합물의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
a) 상기 활성의 검출방법에 기초하여 피검화합물의 시노비올린 또는 시노비올린과 기능적으로 동등한 폴리뉴클레오타이드의 내인성 프로모터의 활성을 조절하는 활성을 측정하는 공정 및
b) 대조와 비교하여 상기 활성에 차이가 있는 피검화합물을 선별하는 공정.
대조로서는 피검화합물의 부존재하에서 공정 a)와 동일한 조작을 행한 경우 또는 공정 a)에 비해 피검화합물을 보다 낮은 농도로 포함하는 경우 등을 들 수 있다. 또, 예를들어 다른 화합물을 이용하여 공정 a)와 동일한 조작을 행하여 그 화합물에서도 높은 작용을 지니는 화합물을 선별할 수도 있다. 유전자의 발현에는 전사 레벨의 발현 및 번역 레벨의 발현이 포함된다. 시노비올린 유전자의 내인성 프로모터의 하류에 결합되어 있는 유전자는 천연의 시노비올린 유전자 자체이라도 좋고 인공적으로 연결된 리포터 유전자이어도 좋다. 시노비올린 유전자의 내인성 프로모터 활성은 예를들어 하류에 연결되어 있는 유전자의 cDNA 단편을 프로브로 한 노던하이브리다이제이션(northern hybridization), RT-PCR, 상기 유전자가 코드하는 단백질에 대한 항체를 이용한 웨스턴블롯, 면역침강, ELISA 등에 의해 상기 유전자의 전사산물 또는 번역잔물을 검출함으로써 행할 수 있다.
또, 시노비올린 유전자의 프로모터의 하류에 리포터 유전자를 결합한 구축물을 제작하면 이것을 세포에 트랜스펙션하여 얻어진 형질전환 세포를 이용하여 리포터 유전자의 발현을 지표로 스크리닝을 할 수도 있다. 이러한 구축물은 시노비올린 유전자의 프로모터를 포함하는 시노비올린 유전자의 상류 영역의 게놈 DNA의 하류에 원하는 리포터 유전자를 연결시킴으로써 제작할 수 있다. 리포터 유전자에 특별히 제한은 없고, LacZ, 클로람페니콜 아세틸 트랜스페라아제(CAT), 루시페라아제, GFP(green fluorescent protein) 등을 들 수 있다. 시노비올린 유전자의 발현을 저하시키는 화합물은 RA의 치료약의 후보로 된다.
본 발명의 시험 또는 스크리닝에 이용한 피검화합물로서는 특히, 제한은 없고 무기화합물, 유기화합물, 펩타이드, 단백질, 천연 또는 합성 저분자 화합물, 천연 또는 합성 고분자 화합물, 조직 또는 세포추출액, 미생물의 배양상청이나 식물, 해양 생물 유래의 천연성분 등을 들 수 있지만, 여기에 제한되지 않는다. 유전자 라이브러리의 발현산물 또는 발현 cDNA 라이브러리 등을 이용할 수도 있다. 또, 상술한 시노비올린에 결합되는 화합물의 스크리닝이나 시노비올린과 SL과의 결합을 저해하는 화합물의 스크리닝에 의해 얻어진 화합물을 피검화합물로서 투여할 수도 있다.
화합물의 투여방법은 특히 제한이 없고, in vitro에서라면 배양액으로의 첨가를 포함하는 세포로의 접촉, 마이크로인젝션이나 트랜스펙션 시약을 이용한 세포로의 도입 등에 의해 실시할 수 있다. in vivo에서라면 동맥내주사, 정맥내주사, 피하주사, 복강내투여, 경구투여, 경장투여, 근육내투여, 점안, 경비투여, 관절 등에의 국소주입 등이 당업자에게 공지 방법에 의해 행할 수 있다. 화합물은 적절한 조성물로서 투여된다. 예를들어, 물, 생리식염수, 완충액, 염, 안정제, 보존제, 현탁제 등과 혼합될 수 있다.
또, 시노비올린 유전자의 발현을 조절하는 화합물의 스크리닝은 트랜즈제닉 동물이 아닌 통상의 동물 또는 그 동물에서 유래하는 세포 등을 이용하여 행하여도 가능하다. 예를들어, 본 발명은 이하의 공정을 포함하는 시노비올린 또는 시노비올린과 기능적으로 동등한 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하는 활성의 검출방법에 관한 것이다.
a) 피검화합물의 존재하에서 시노비올린 또는 시노비올린과 기능적으로 동등한 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 세포를 배양하는 공정 및
b) 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현 레벨을 측정하는 공정.
그리고, 이 검색방법을 근거로 시노비올린 유전자의 발현을 조절하는 화합물을 스크리닝할 수 있다. 즉, 본 발명은 이하의 공정을 포함하는 시노비올린 또는 시노비올린과 기능적으로 동등한 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하는 화합물의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
a) 상기 활성의 검출방법에 근거하여 피검화합물의 시노비올린 또는 시노비올린과 기능적으로 동등한 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하는 활성을 검출하는 공정 및
b) 대조와 비교하여 상기 활성에 차이를 지니는 피검화합물을 선별하는 공정.
시노비올린 또는 시노비올린과 기능적으로 동등한 폴리뉴클레오타이드의 발현 레벨은 전술한 바와 같은 방법에 의해 측정할 수 있다. 또, 이 스크리닝 방법에는 전술한 바와 같이 그외의 스크리닝 방법에 있어서 피검화합물로서 이용할 수 있는 어떠한 화합물을 피검화합물로 할 수 있다. 대조로서는 상기와 마찬가지로 피검화합물의 부존재하에서 공정 a)와 동일한 조작을 행한 경우 등을 들 수 있다.
본 발명의 시험 또는 스크리닝 방법에 의해 동정된 화합물은 RA나 시노비올린이 관여하는 것 이외의 질환에 대한 의약의 후보로 되고, RA 등의 질환의 예방 또는 치료에 이용할 수 있다. 이러한 화합물은 유효성분 이외에 적당한 다른 용질이나 용매와 조합하여 의약조성물로 할 수 있다. 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 단리되는 화합물을 의약품으로서 이용하는 경우에는 단리된 화합물 자체를 직접 환자에게 투여하는 것 이외에 공지의 제제학적 방법에 의해 제제화한 의약조성물로서 투여를 행할 수도 있다.
예를들어, 약리학상 허용되는 담체 또는 용매, 구체적으로는 멸균수나 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제 등과 적절하게 조합하여 제제화하여 투여할 수 있 다고 생각된다. 본 발명의 의약조성물은 수용액, 정제, 캡슐, 트로키, 박칼정, 에릭실, 현탁액, 시럽, 점비액 또는 흡입액 등의 형태일 수 있다. 화합물의 함유율은 적절하게 결정하면 된다. 환자로의 투여는 일반적으로는 예를들어, 동맥내주사, 정맥내주사, 피하주사, 경구투여, 관절내주입, 그외의 당업자에게 공지 방법에 의해 행할 수 있다.
투여량은 환자의 체중이나 연령, 투여방법, 증상 등에 의해 변동하지만, 당업자라면 적절하게 투여량을 적절선택할 수 있다. 일반적인 투여량은 약제의 유효혈중농도나 대사시간에 따라 상이하지만, 1일의 유지량으로서 약 0.1 mg/kg∼ 약 1.0 g/kg, 바람직하게는 약 0.1 mg/kg∼ 약 10 mg/kg, 보다 바람직하게는 약 0.1 mg/kg∼ 약 1.0 mg/kg이라고 생각된다. 투여는 1회에서 수회로 나누어 할 수 있다. 또, 상기 화합물이 폴리뉴클레오타이드에 의해 코드될 수 있는 것이라면 상기 폴리뉴클레오타이드를 유전자 치료용 벡터에 삽입하여 유전자 치료를 행할 수도 있다고 생각된다.
또, 본 명세서에 있어서 인용된 전체 선행문헌은 참조로서 본 명세서에 삽입될 수 있다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
[ 실시예1 ] 항활막세포 항혈청 (Anti-Serum) 의 제작
항활막세포 항혈청은, 아래와 같은 절차로 제조한 활막세포를 면역원으로 이용하여 얻었다. 10인의 만성 류마티스관절염 (RA) 환자의 활막제거 수술에 의하여 적출된 관절 활막조직을, 무균 상태로 PBS (phophate buffered saline) 로 세정하였다. 세정한 조직을 약 5mm 입방 크기로 가늘게 잘라서, 37℃, 20분 0.25% 트립신/PBS 소화를 행하였다. 소화된 활막조직으로부터 여분의 조직편을 제거하고, 얻어진 세포를 10% 우태아혈청을 포함한 둘벡코 변형 이글 (Dulbecco's modified Eagle's) 배지 (virology, 8, 396, 1959) (10% FCS-DMEM)를 이용하여 현탁하고, 세포배양용 멸균 페트리 디쉬에서, 5% CO2, 37℃, 24시간 배양하였다. 배양 상청액을 버리고, 10% FCS-DMEM을 이용 세정하여 비접착세포를 제거하고, 페트리 디쉬에 부착한 세포로서의 류마티스 환자 유래 활막세포를 얻었다 (The Journal of Clinical Investigation, 92, 186, 1993). 배양된 세포를 풀 (pool) 로 하여, RA환자 유래의, 이하 활막세포로서 실험에 이용하였다.
1 ×105 개의 환자 유래 활막세포를, 10% FCS-DMEM 20 ml에 현탁하여 76cm2 의 배양 플라스크 내에서 배양하였다. 3일 마다 배지를 교환하고, 2주 후에 배양면을 세포가 가득 채운 상태로 된 때 배지를 제거하고, 0.05% EDTA/PBS와 0.1% 트립신/PBS을 7ml씩 첨가하여 세포를 떼어 회수하였다. 회수된 세포를 PBS로 세정하여 배지성분을 제거하고, 1ml의 PBS에 현탁하여 면역원으로 하였다.
이 면역원을, 제조후 2시간 이내에 토끼 (1마리) 의 귀에 정맥주사함으로써 면역하였다. 면역은 1주일 간격으로 총 6회 행하였다. 6회째 면역 시점에, 토끼 귀에서 수 ml 채혈하여 항혈청을 시험했던 바, 형광 항체법에 의해 류마티스 환자의 활막세포와 반응하는 것을 확인할 수 있었다. 6회째의 면역조작에서 다시 1주 일 후에 카테터(catheter)를 사용하여 심장으로부터 가능한 많은 혈액을 채취하였다. 이 혈액을 4℃에서 밤새 (overnight) 방치하여 응고시킨 혈청을 분리하였다. 혈청에는 보존제로서 0.1% 소듐 아지드 (sodium azide) 를 가하여, 항활막세포 항혈청 (anti-synovial cell anti-serum) 으로 하여 4℃에서 보존하였다.
[ 실시예2 ] 항활막세포 항혈청이 인식하는 항원(시노비올린)의 유전자 클로닝
실시예1에서 얻은 RA환자 10명 분의 활막세포로부터 산 구아니딘/페놀 클로로포름법 (acid guanidine/phenol chloroform method) 으로 총 RNA를 추출하여, 폴리T 비드를 이용하여 mRNA를 정제하였다 (Analytical Biochemistry, 162, 159, 1987). λZAP 벡터 (STRATAGENE사) 를 이용하여 RA환자 활막세포의 cDNA 라이브러리를 통상의 방법으로 제조하였다. 피코블루 임뮤노스크리닝 키트 (picoBlue immunoscreening kit (Stratagene사)) 에 의해, 상기 실시예1의 항활막세포 항혈청에 의한 임뮤노스크리닝을 행하였다 (도1). 얻어진 양성 클론 (파아지) 을 헬퍼 파아지에 의해 플라스미드 pBluescript Ⅱ SK(+)로 전환하였다. pBluescript Ⅱ SK(+)에 삽입된 DNA의 염기서열은, M13PrimerM4 및 M13PrimerRV (Takara) 를 이용하여 염색 터미네이터법 (dye terminator method; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 74, 5463, 1977) 에 기초하여 ABI PRISM 377 DNA Sequencer (PERKIN ELMER) 에 의해 결정하였다. 전술한 항활막세포 항혈청이 인식하는 항원을 코드하는 유전자 ('시노비올린'이라고 칭함) 의 3' 말단으로부터 염기서열을 결정하여, 폴리(A)+ 사슬 을 포함하는 2990bp 염기서열을 밝혔다 (서열 번호:1의 No. 42-3031). 이 염기서열을 이용하여, 활막세포 cDNA 라이브러리로부터 5'-RACE법 (Rapid Amplification of cDNA Ends; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85:8998-9002, 1988) 에 의해 전장 시노비올린의 번역영역과 5'-비번역영역의 일부 및 poly(A)+사슬을 포함하는 3031bp의 염기서열을 결정하였다 (서열번호:1). 이 염기서열을 GenBank에 의해 상동성 검색한 결과, 유사한 서열은 보고되지 않은 신규한 유전자이었다.
[ 실시예3 ] 대장균에서의 부분 시노비올린 재조합 단백질의 발현
항활막세포 항혈청을 이용한 임뮤노스크리닝으로 얻어진 cDNA 클론으로부터, 시노비올린의 일부를 코드하는 cDNA (1799 bp; 서열 번호: 1의 No. 1233-3031) 를 제한효소 EcoRI 및 XhoI을 처리하여 추출하였다. EcoRI / XhoI의 인식서열을 말단에 가지고 있는 cDNA를, 글루타치온S-트랜스퍼라제 (GST) 융합단백질 발현벡터-pGEX-5X-3에 삽입하여 서브클로닝하였다. 시노비올린 cDNA의 일부를 삽입한 pGEX-5X-3을 BL21 대장균주에 42℃, 45초 열충격에 의해 도입하고, BL21/synoviolin-GST gene/pGEX-5X-3을 얻었다. 이 BL21을, 0.1 mg/mL 암피실린을 함유한 LB 배지에서 배양하여, 0.1 mM IPTG (isopropylthio-b-D-galactoside) 을 첨가하고, 37℃에서 다시 2시간 동안 배양하여 상기 융합단백질의 발현을 유도하였다. 원심분리법으로 회수한 BL21을 PBS로 세정한 후, 0.1 mg/mL 리소자임으로 소화하고, 0.1% 트리톤X-100으로 가용화 하였다. 가용화된 GST융합 단백질을 포함하는 BL21 유래 단백질 현탁액을 GS4B (Glutathione Sepharose 4B) 에 적용후 PBS로 세정하고, 50mM 환원형 글루타치온/PBS로 목적하는 GST-부분 시노비올린 융합단백질을 정제하였다.
[ 실시예4 ] 대장균에서의 전장 시노비올린 재조합 단백질의 발현
실시예2에서 얻어진 시노비올린을 코드하는 cDNA (1851 bp; SEQ ID NO: 1, No. 60-1910)의 3'-말단에, 2분자의 인플루엔자 적혈구응집소 (hemagglutinin; HA)-택을 부가한 시노비올린 cDNA (syno-HAHA)를, GST 융합단백질 발현벡터 pGEX-5X-1에 삽입하여 서브클로닝하였다. syno-HAHA 유전자를 삽입한 pGEX-5X-1을 BL21 대장균주에 42℃, 45초 열충격에 의해 도입하고, BL21/syno-HAHA/pGEX-5X-1을 얻었다. 이 BL21을, 0.1 mg/mL 암피실린을 함유한 LB 배지에서 배양하여, 0.1 mM IPTG (isopropylthio-b-D-galactoside) 을 첨가하고, 30℃에서 다시 3시간 배양하여 N-말단에 GST, C-말단에 HA를 융합한 시노비올린 (GST-시노비올린-HAHA) 단백질의 발현을 유도하였다. 원심분리법으로 회수한 BL21을 PBS로 세정한 후, 1 mg/mL 리소자임으로 소화하고, 0.1% 트리톤X-100으로 가용화 하였다. 가용화된 GST-시노비올린-HAHA 단백질을 포함하는 BL21 유래 단백질 현탁액을 GS4B (Glutathione Sepharose 4B) 에 적용후 PBS로 세정하고, 50mM 환원형 글루타치온/Tris-HCL (pH 8.0)로 목적하는 GST-시노비올린-HAHA 단백질을 정제하였다.
발현의 확인은, 50mM 환원형 글루타치온 용출분획을 PBS로 200배, 2000배 희석하여, 25mM Tris-HCl (pH6.8), 0.25% SDS (sodium dodecyl sulfate), 0.05% 머캅토에탄올, 0.1% 글리세롤로 처리한 후, 8% SDS 폴리아크릴아미드 전기영동 (SDS- PAGE) 에 적용하였다. SDS-PAGE후, GST-시노비올린-HAHA 단백질은, 일렉트로블롯팅 (electroblotting) 법에 의해 나일론막에 전달되었다. 이 나일론막은, 5% 스킴 밀크를 포함하는 PBS로 실온에서, 60분 블롯팅을 행하고, 0.5% 스킴 밀크를 포함하는 PBS로 400배 희석한 항HA 모노클로날 항체 (Boehringer Mannheim사) 로 실온에서, 60분 면역반응 시켰다. 반응후, 0.1% Tween20/PBS로 세정하고, HRP (horseradish peroxidase) 표지-마우스IgG 항체를 2차 항체로 하여 실온에서 60분 면역반응 시켜, 0.1% Tween20/PBS로 세정하고, HRP활성을 검출하는 것에 의해 목적항원을 검출하였다. HRP활성의 검출에는 ECL키트 (Amersham사) 를 사용하였다 (Clinical Chemistry, 25, p. 1531, 1979). 결과를 도2에 표시하였다. 상기 GST-시노비올린-HAHA 융합단백질의 분자량 사이즈로부터, 시노비올린 단백질의 분자량은 약 80kDa으로 추측되었다.
[ 실시예5 ] in vitro 에서 전장 시노비올린 융합단백질의 발현
시노비올린 유전자 (서열번호:1) 의 말단을 제한효소 EcoRI으로 수식하고 (modify), pBluescript II KS 벡터에 삽입하였다 (syno/pBluescript). 그후, syno/pBluescript (1 mg) 와 TNT-coupled Translation System (Promega사)을 이용하여 in vitro translation법에 의해, 시노비올린 단백질을 시험관내에서 [35S]-표지체로 하여 발현시켰다. [35S]-표지된 시노비올린 단백질은, 10% SDS-PAGE에 적용하여 이미지 어낼라이저 (BAS2000, Fujix) 에 의해 방사활성 (radioactivity) 을 검출하였다. 결과를 도3에 표시하였다. 시노비올린 유전자로부터 시험관내에서 번역된 시노비올린 단백질의 SDS-PAGE에 의한 분자량은, 약 80 kDa이라는 것이 확인되었다.
[ 실시예6 ] 노던 블롯팅법에 의한 시노비올린 유전자의 발현 확인
실시예1에서 얻어진 RA환자 유래의 활막세포, A549세포주, Jurkat세포주 그리고 HeLa세포주로부터 통상의 방법에 따라 mRNA를 채취하였다. 이 mRNA 1㎍을 1% 아가로스젤 전기영동으로 분리하고, 나일론막에 콘택트 블롯팅법으로 옮겼다. 나일론막을 80℃, 2시간 처리하고, 덴하르트액 (Denhardt's solution) 내에서 42℃, 2시간 프리하이브리다이제이션을 행하였다. 다음으로 32P-방사표지된 시노비올린의 cDNA (1799 bp; SEQ ID NO: 1, No. 1233-3031) 를 프로브로 하여, 42℃, 12시간 하이브리다이즈 시켰다. 반응후의 나일론막을 300 mM NaCl, 30 mM sodium citrate로 세정한 후, 15 mM NaCl, 1.5 mM sodium citrate를 사용하여 50℃에서 재차 세정하였다. 목적 mRNA는 X선 필름을 감광시키는 것에 의해 검출되었다. 이 결과 얻어진 오토라디오그래프 (autoradiograph) 를 도4에 표시하였다.
[ 실시예7 ] 웨스턴 블롯팅법에 의한 각종 세포에 있어서의 시노비올린의 발현 확인
이하의 세포를 시료로 하여, 시노비올린 발현상태를 웨스턴 블롯팅법으로 확인하였다.
·실시예1에서 제조한 RA환자 유래의 활막세포
·사람 제대혈관 내피세포 (HUVEC)
·HEK (human embryonic kidney) -293T
·실시예3에서 제조된 GST-부분 시노비올린 융합단백질 (양성 콘트롤)
우선 시료로 하는 각종 세포로부터, 1% NP-40으로 가용화한 세포용해액을 준비하였다. 각종 세포용해액은 25 mM Tris-HCl (pH 6.8), 0.25% SDS (sodium dodecyl sulfate), 0.05% 머캅토에탄올, 0.1% 글리세롤로 처리하고, 8% SDS-PAGE에 의해 분리하였다. SDS-PAGE후 각종 세포 유래 단백질은, 일렉트로블롯팅법에 의해 니트로셀룰로스 (NC) 막에 옮겼다. 이 NC막에 대해서, 항활막세포 항혈청을, 2.0 mg/mL GST-부분 시노비올린 융합단백질과 5% 스킴 밀크를 가한 TBS (Tris buffered saline)로 1000배 희석하여 실온에서 60분 면역반응시켰다. 또, 음성 콘트롤로서 동일한 항체용액을 NC막과 반응시킨 실험, 또는 항체용액 중의 GST-부분 시노비올린 융합단백질을 GST로만 치환한 실험을 동시에 행하였다. 반응후의 NC막을 0.1% Tween 20/TBS으로 세정하고, HRP표지 항토끼 IgG항체를 2차 항체로 하여 실온에서 60분 면역반응 시키고, 0.1% Tween 20/TBS로 세정하고, HRP활성을 검출하는 것에 의해 목적 항원을 검출하였다. HRP활성의 검출에는 ECL키트 (Amersham사) 를 이용하였다 (Clinical Chemistry, 25, p. 1531, 1979). 결과를 도5에 표시하였다.
콘트롤 실험 (도5; +GST) 에 있어서 RA환자 유래 활막세포에서 검출되고, HUVEC 및 HEK-293T세포에서 검출되지 않은 220kDa 단백질에 대한 항활막세포 항혈청의 면역반응을 GST-부분 시노비올린은 저해하고, 약 140kDa 단백질, 및 185kDa 단백질에 대한 면역반응도 일부 저해하였다 (FIG. 5; +GST-부분시노비올린). 220kDa 이외의 밴드에서 관찰된 반응성은, 다른 항체와의 반응성을 기초로 피브로넥틴(분자량 약 240kDa), 또는 라미닌의 서브유닛 (분자량 약 200kDa) 등으로 추측되고, 이 실험 결과에 의거하면 시노비올린의 분자량은 약 220kDa인 것이 추측되었다. 그렇지만, 실시예5에서 확인한 시노비올린의 분자량은 약 80kDa이다. 양자의 차이로부터, 시노비올린은 SDS에서는 해리되지 않은 다량체 (multimer) 구조를 취하고 있을 가능성이 사료되었다.
[ 실시예8 ] 웨스턴 블롯팅법에 의한 RA환자 유래 활막세포에 있어서의 시노비올린 단백질의 발현확인
실시예1에서 제조된 RA환자 유래 활막세포를 1% NP-40에서 가용화한 세포파쇄 분획을 제조하였다. 이 활막세포 파쇄액은, 25 mM Tris-HCl (pH 6.8), 0.25% SDS, 0.05% 머캅토에탄올, 0.1% 글리세롤로 처리하고, 8% SDS-PAGE에 의해 분리하였다. SDS-PAGE 후, 활막세포 유래 단백질은, 일렉트로블롯팅법에 의해 니트로셀룰로스 (NC) 막에 옮겨졌다. 이 NC막에 대해서, 5% 스킴 밀크를 가한 TBS (Tris buffered saline)로 실온에서 1시간 블롯팅한 후, RA환자 유래 활막세포를 면역하여 얻어진 항활막세포 항혈청 (도면 중 면역후) 을 5% 스킴 밀크를 가한 TBS로 1000배 희석하여 실온, 1시간 면역반응시켰다. 동시에, 토끼에 활막세포를 면역하기 전에 채취된 혈청 (프리 임뮨) 을 음성 콘트롤로 사용하였다. 반응후의 NC막을 0.1% Tween 20/TBS로 세정하고, HRP표지 항토끼 IgG 항체를 2차 항체로 하여 실온 에서 1시간 면역반응 시키고, 0.1% Tween 20/TBS로 세정하고, HRP활성을 검출하는 것에 의해 목적 항원을 검출하였다. HRP활성의 검출에는 ECL키트 (Amersham사) 를 이용하였다 (Clinical Chemistry, 25, p. 1531, 1979). 결과를 도6에 표시하였다.
[ 실시예9 ] 면역염색법에 의한 각종 세포나 활막조직에 있어서의 시노비올린의 발현 확인
면역염색법은, 활막세포를 통상의 방법에 따라 슬라이드 글래스 위에 고정하고, 실시예1의 항활막세포 항혈청을 사용하여 면역염색을 행하였다. 1% 우혈청 알부민 (BSA) 으로 30분 블록킹 (blocking) 한 표본에, 1% BSA로 100배 희석한 항활막세포 항혈청을 실온에서 60분 면역반응 시켰다. 또 항혈청에 의한 관찰과 동시에, 이 항혈청으로부터 정제한 정제 항활막세포 항체를 사용한 실험도 하였다. 정제 항활막세포 항체는, GST-부분 시노비올린 융합 단백질을 리간드로 하여 임뮤노어피너티 (immunoaffinity) 정제함으로써 제조하였다. 리간드에는, 서열번호 : 1의 1233-3031번 까지의 시노비올린 유전자 1799bp를 삽입한 GST-융합단백질 발현벡터 pGEX-5X-3을 BL21에 도입후 발현시킨 융합단백질을 사용하고, 글루타치온 세파로스 칼럼을 파마시아사의 방법에 따라 제작한 GST-부분syno-GS칼럼으로 하였다. 정제 항활막세포 항체를 이용하는 경우의 콘트롤에는, GST를 리간드로 하여 동일하게 항혈청을 임뮤노어피너티 정제하여 얻어진 항 GST항체를 사용하였다. 반응후의 표본을 PBS로 세정후, 플루오레신 이소티오시아네이트 (fluorescein isothiocyanate)-표지 항토끼 IgG항체를 2차 항체로 하여 면역반응 시켰다. 항활 막세포 항혈청에 면역반응하는 항원의 확인은, 공초점(confocal) 레이저 현미경으로 하였다. 결과를 도7에 표시하였다. 본 항혈청은 RA 환자 유래 활막세포에 강하게 면역반응 하는 것이 확인되었고, 이 면역반응은 실시예3에서 제작한 GST-부분시노비올린 융합단백질에 의해 저해되는 것이 확인되었다 (도7 상단). 더욱, 이 항혈청으로부터 정제된 정제 항활막세포 항체에서는, 면역반응이 더욱 강해져 강양성으로 되는 것도 확인되었다 (도7 하).
RA환자 유래 활막조직의 염색은, 통상의 방법에 따라 활막조직을 슬라이드 글라스 위에 고정하여 행하였다. 1% BSA로 30분 블록킹한 표본에 대해서, 1% BSA로 100배 희석한 항활막세포 항혈청을 실온에서 60분간 면역반응 시켰다. 반응후의 표본을 PBS로 세정하고, HRP표지 항토끼 IgG항체를 2차 항체로 하여 면역반응 시켰다. 항활막세포 항혈청에 면역반응하는 항원은, HRP활성에 기초하여 3,3'-디아미노벤지딘 사염산염 (3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride) 의 발색에 의해 확인하였다. 전술한 웨스턴 블롯팅법과 동일한 방법으로, GST-부분 시노비올린 융합단백질을 이용한 항활막세포 항혈청 흡수시험을, 활막조직 염색에 대하여 행하였다. GST-부분 시노비올린 융합단백질을 2.0 mg/mL 또는 GST (2.0 mg/mL) 를 항활막세포 항혈청에 가하여 조직염색을 하였다. 결과는 도8에 표시하였다. 콘트롤에서 보여진 항활막세포 항혈청의 활막조직에 대한 염색성은, GST-부분 시노비올린 융합단백질에 의해 약해지는 것이 확인되었다 (도8). 또한 상기 GST-부분 Syno-GS로부터의 정제된 항체를 사용한 활막조직에 대한 면역염색은, GST-GS로부터 얻어진 항체와 비교시, 강양성으로 반응하는 것이 확인되었다 (도9).
웨스턴 블롯팅법 (실시예 8) 및 면역염색법의 결과에 의해, 항활막세포 항혈청이 인식하는 시노비올린 단백질은 RA환자 유래 활막세포 및 활막조직에서 발현되고 있는 것이 확인되었다.
[ 실시예10 ] RA환자 혈청중 시노비올린 항체의 존재
GST-부분 시노비올린 융합단백질을 항원으로 하여, 웨스턴 블롯팅법에 의한 RA환자 혈청중의 항시노비올린 항체의 검출을 시험해 보았다. 실시예7과 동일한 절차에 의해, 우선 GST-부분 시노비올린 융합단백질 (100 ng/lane) 을 SDS-PAGE에 의해 영동시키고, NC막에 옮겼다. 1차 항체로서 RA환자 혈청 (5 cases) 을 TBS (Tris buffered saline) 로 1000배 희석하고, GST-부분 시노비올린 융합단백질을 옮긴 NC막에 대하여 실온에서 60분 면역반응 시켰다. 0.1% Tween 20/TBS로 NC막을 세정한 후 HRP표지 항인간 IgG항체를 2차 항체로 하여 실온에서 60분 면역반응 시키고, 0.1% Tween 20/TBS로 세정하고, HRP활성을 검출함으로써 목적 항원과 반응했던 인간 IgG를 검출하였다. HRP활성의 검출은 실시예7과 동일하게 행하였다. 결과를 도10에 표시하였다. RA환자의 혈청 내 (5중에서 5) 에는 GST-부분 시노비올린 융합단백질에 대한 항 IgG항체가 존재하는 것이 확인되었다 (도10). 반면에, 퇴행성 관절염 (변형성 관절증; OA) 환자 유래 혈청 및 정상 인간 혈청 중에는 GST-시노비올린을 인식하는 항체는 확인되지 않았다.
[ 실시예11 ] 발현 라이브러리의 스크리닝에 의한 시노비올린 리간드의 동정
실시예2에서 제조한 RA환자 활막세포 유래의 cDNA 발현 라이브러리를 이용하여, 시노비올린 리간드의 스크리닝을 행하였다(Tadaomi Takenawa, Toshiki Watanabe, eds., Bio-Manual UP Series "Protein Intermolecular Interaction Experimental Method, pp. 66-67, Yodosha Co., Ltd.; Kaelin, W. G. et al., Cell 70, 351-364, 1992; Skolnik, E. Y. et al., Cell 65, 83-90, 1991; Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, a laboratory manual second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 12.16-12.20, 1989). 라이브러리 파지를 대장균 (XL1-Blue MRF')에 37℃, 20분간 인규베이트시켜 감염시키고, 탑 (Top) 아가로스와 혼화후 플레이트에 펼쳤다. 42℃에서 3.5시간 배양후, 10mM IPTG에 적신 후 건조된 니트로셀룰로스 멤브레인을 플레이트에 적재하고, 다시 37℃에서 3.5시간 배양하였다. 멤브레인을 회수후, 세정 버퍼 [10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5% skim milk, 0.1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, protease inhibitor (complete, Boehringer Mannheim)] 에서 5분간 세정을 5회 행한 후, 블록킹 버퍼 [10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5% skim milk, 0.1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 5% glycerol, protease inhibitor (complete, Boehringer Mannheim)]에서 1시간 담구었다. 세정버퍼에서 5분간의 세정을 5회 행한 후, 프로틴 키나제 A로 32P 라벨된 GST-시노비올린 (실시예3에서 정제한 GST-부분 시노비올린 융합 단백질) 을 프로브로서 첨가하고 (약 106 cpm/ml), 인큐베이트 하였다. 멤브레인 1장의 카운트 (count per membrane) 가 약 1kcpm이 될 때까지 세정 버퍼를 변화하면서 세정을 반복하고, 오토라디오그래프에 의해 시그날을 검출하였다. 그 결과, 시노비올린에 결합하는 클론이 얻어졌다. 그 클론을 시노비올린 리간드 (SL) 로 명명하였다.
SL cDNA에 대하여, 그 5'-말단 부근의 100 bp, 및 3'-말단 부근의 100 bp에 대하여 염기서열을 결정하였다. 얻어진 염기서열 정보를 기초로 데이터베이스 검색을 하였는 바, 말단 부분의 100 bp에 있어서는 S1-5 [Lecka-Czernik, B. et al., Molecular and Cellular Biology, 15, 120-128, 1995; accession number U03877 (cDNA), AAA65590 (protein), 또한 "EFEMP1"로 불리움: Stone, E. M. et al., Nature Genetics 22, 199-202, 1999; accession number Q12805 (protein)]로 불리우는 공지의 유전자와 공통의 서열임이 밝혀졌다. 양자의 유전자와 그 번역산물의 크기는 거의 동일하여, 동일 단백질이라는 것이 시사되었다.
[ 실시예12 ] 노던 블롯팅법에 의한 SL 유전자의 발현
실시예6과 동일하게 각종 세포로부터 mRNA를 채취하여, 실시예11에서 얻어진 SL cDNA를 프로브로하여 노던 블롯팅법을 행하였다. 사용한 세포는 다음과 같다. RA환자 유래의 활막세포는, SL유전자를 과발현하고 있는 것이 확인되었다 (도11).
HEK-293T
실시예1에서 제조된 RA환자 유래의 활막세포
A549
HeLa
[ 실시예13 ] 시노비올린과 SL 의 결합
SL cDNA를 실시예3과 동일하게 pGEX벡터에 삽입하여, GST-SL융합단백질을 제조하고, 10% SDS-PAGE에 GST-SL (500 ng), 콘트롤로 GST (1 ㎍)을 적용하였다. SDS-PAGE후, 일렉트로블롯팅법에 의해 나이론막에 옮겼다. 이 나일론막을, 6M guanidine hydrochloride, 5 mM 2-mercaptoethanol을 포함하는 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) 로 1시간, 실온에서 변성시키고, 5 mM 2-mercaptoethanol, 0.05% Tween 20을 포함하는 50mM Tris-HCl (pH 8.0) 로 4℃, 밤새 (o/n) 재생시켰다 (regenerate). 재생된 나일론막은, 블로킹 버퍼 [10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5% skim milk, 0.1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 5% glycerol, protease inhibitor (complete, Boehringer Mannheim)] 로 처리하고, 블로킹 버퍼 (0.5% skim milk 이외는 상기와 동일한 조성) 로 세정하였다. 그 후, TNT-coupled Translation System (Promega사) 및 pcDNA3-HA-시노비올린-HAHA (SEQ ID NO: 1의 시노비올린 cDNA 1851 bp; 60-1910에 HA-tag을 부가한 시노비올린 cDNA를 발현 벡터 pcDNA3에 삽입하였다) 를 이용하여, in vitro translation을 행하고, [35S]-라벨된 HA-시노비올린-HAHA 융합 단백질 ([35S]HA-Synoviolin-HAHA) 을 프로브로 사용하여 나일론막 위의 GST-SL 및 GST와 실온에서 2시간 반응시켰다. 그 나일론막은, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5% skim milk, 0.1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, protease inhibitor (complete, Boehringer Mannheim) 으로 세정하고, 이미지 어낼라이저 (BAS2000, Fujix) 로 방사활성을 검출하였다. 나일론막에 옮겨진 GST-SL융합단백질과 [35S]HA-시노비올린-HAHA는, 양자의 결합이 관찰되었다. 또한 콘트롤인, GST와 [35S]HA-시노비올린-HAHA와의 결합은 확인되지 않았다 (도12). 이 결과로부터, 시노비올린과 SL은, 단백질의 상호작용에 의해 결합한 것으로 추측되었다.
또한 실시예14에서는, 시노비올린에 의한, 배양물 중의 시노비올린 리간드의 중화를 통하여, 활막세포의 증식이 저해되는 것을 시사하는 결과가 얻어졌다. 이들의 결과에 기초하여, SL의 시노비올린 결합부위에 상당하는 구조를 가진 SL 변이체는, 시노비올린-SL간의 결합에 대하여 길항저해작용 (antagonistic blocking action)에 의하여 활막세포의 증식을 억제하는 작용을 가질 가능성이 사료된다. 더욱이, 시노비올린의 SL결합부위에 상당하는 구조를 가진 시노비올린 변이체에 대해서도, SL변이체와 동일한 길항저해작용을 기대할 수 있는 가능성이 있다.
[실시예 14] MTT 에세이 ( MTT Assay)
실시예1에서 제조한 RA환자 유래 활막세포를 5x103 cells/well이 되도록 96 웰 플레이트를 이용하여 준비하고, GST 또는 GST-부분 시노비올린을 최종 농도 0.01 ∼ 1μM이 되도록 세포 상청 (supernatant) 에 첨가하였다. 배양 3일후 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT)/PBS 를 세포 상청에 첨가하고, 37℃, 5% CO2 의 조건에서 3시간 배양하였다. 배양후 세포 상청을 제거하고, dimethyl sulfoxide로 MTT formazan의 결정을 용해하고 흡광도를 측정하였다 (Journal of Immunological Methods, 65, 55, 1983). 10%-FCS/DMEM, 37℃, 5% CO2의 조건하에서의 RA환자 유래 활막세포 증식은 GST-부분 시노비올린 (1μM) 에 의해 유의적으로 억제되었다 (도13).
[ 실시예15 ] 시노비올린 유전자 도입 마우스의 제작
시노비올린 단백질을 코드하는 DNA의 N-말단에 Flag택을 연결시키고, 3'측 하류 (downstream) 에 폴리A 시그널을 결합시킨 시노비올린 유전자 도입용 벡터를 구축하였다. 벡터는 pCAGGS (Niwa, H. et al., Gene 108: 193-9, 1991) 를 기초로 하여 구축하고, 프로모터는 β-액틴 프로모터, 인핸서는 인간 사이토메갈로바이러스 전기 인핸서 (human cytomegalovirus immediate early enhancer) 를 이용하였다 (도14).
시노비올린 유전자 도입용 벡터는, 현미경하에서 매뉴플레이터 (manipulator) 에 접속된 (connected) 극소 유리 피펫을 이용하여 마이크로인젝션법에 의해 마우스의 난세포에 도입시켰다. 수정란의 웅성 전핵 (male pronucleus)에 DNA를 주입하고, 주입된 조작란은, 정관절제된 (vasectomized) 수컷 마우스와의 교배에 의해 위임신 (false pregnancy) 이 유도된 암컷 마우스 (recipient mouse) 의 난관내에 이식하였다. 이식 19일후에 자연분만 또는 제왕절개에 의해 새끼 마우스를 얻었다. 제왕절개의 경우는, 별도로 준비해둔 암컷 마우스를 수양모 (foster mother)로 하여 새끼 마우스를 보육시켰다. 각 출산한 새끼의 꼬리에서 DNA를 채취하고, PCR법을 이용하여 도입 유전자를 보유하고 있는가를 확인하였다.
그 결과, 시노비올린 과발현 마우스에는 현저한 관절의 종창 (swelling) 이 확인되었다. 시노비올린 유전자 도입 마우스에 있어서 관절증 발증률 (rate of onset of arthropathy) 은 33% (10마리 / 30마리) 이었던 것으로부터, 관절의 종창은 자연 발증적인 마우스의 기형 (C57B6 마우스의 수두증 발증률은 1% 미만) 이 아니고, 시노비올린 분자가 관여한 것에 의한 것으로 사료된다. 시노비올린 과발현 마우스의 좌후지 (left hind limb) 를 연 X선 촬영한 사진을 표시하였다 (도15).
[ 실시예16 ] 관절의 조직학적 검토
시노비올린 유전자 도입 마우스 (1마리) 지관절의 조직학적인 검토를 행하였다. 지관절 부분의 조직절편을 헤마톡실린 에오신 (Hematoxylin eosin ; HE) 염색하였다. 헤마톡실린 에오신 염색은, 공지의 방법에 따라 실시하였다.
HE 염색의 결과, 관절증을 보였던 부분에 있어서는 뚜렷한 활막증생과 동반하여 골파괴 및 이상 골신생이 확인되었다 (도16). 반면, 대조(콘트롤)로 한 유전자 도입 마우스의 정상 지관절에 있어서는, 상기 소견은 관찰되지 않았다 (도17 상).
또한, 지관절에서의 항 Flag항체에 의한 면역염색을 행한 결과, 시노비올린 유전자 도입 마우스에 있어서는, 증생을 나타낸 활막조직 및 연골세포에서 시노비올린의 발현이 확인되었지만 (도18), 유전자 도입 마우스의 정상 지관절에 있어서는 상기 소견은 관찰되지 않았다 (도17 하).
[ 실시예17 ] 넉아웃 마우스의 제조
마우스 시노비올린 유전자 절편의 번역개시점 (첫번째 메티오닌을 번역하는 ATG 코돈) 에 lacZ 유전자를 도입하여, 타게팅 벡터 (targeting vector) 를 구축하였다. 마커 유전자로서 네오마이신 내성 (neo) 유전자를 도입하고, 또한 디프테리아 독소 A (DT-A) 유전자도 결합시켜 비상동적 재조합 (non-homologous recombination) 을 일으킨 세포주를 배제할 수 있도록 하였다 (도19).
이 타게팅 벡터를 마우스의 ES세포 TT-2에 일렉트로포레이션에 의해 도입하여 상동 재조합을 일으킨 세포주를 선별하였다. 얻어진 세포를 마우스 배태반포 (blastocyst) 또는 8세포기 배에 주입하고 직접 대리모 (surrogate mother) 의 난관에 이식하거나, 1일 배양하여 배반포까지 발생한 것을 대리모의 자궁에 이식하였다. 그 후에는, 트랜스제닉 동물의 제조와 동일한 방법에 의해, 넉아웃 마우스를 제조하였다. 얻어진 헤테로 변이 마우스 (F1) 끼리 교배시켜, 헤테로 및 호모 변이 마우스를 얻었다. 이렇게 얻어진 변이 마우스에 있어서는, 본래 시노비올린이 발현되어야 할 조직에서, 시노비올린 대신에 LacZ 단백질 (β-갈락토시다제) 이 발현된다.
유전자형은 서던 블롯 해석에 의해 확인되었다. 야생형 마우스 (14마리) 및 시노비올린 헤테로 넉아웃 마우스 (32마리) 에 대해서는, 생후 2주령 정도의 마우스 꼬리 선단 3mm 정도에서 DNA를 추출하였다. 시노비올린 호모 넉아웃 마우스에서는, 태생 14.5일의 태아로부터 실체현미경 (stereomicroscope) 하에서 꼬리부 또는 상, 하지의 일부를 채취하여, DNA를 추출하였다. 얻어진 DNA를 제한효소 PstI으로 DNA 소화시킨 것을 이용하였다. 해석 결과를 도20에 표시하였다. 야생형에서는 6.5 kbp, 호모 변이 마우스에서는 8.5 kbp, 헤테로 변이 마우스에서는 양쪽의 위치에서 밴드가 검출되었다.
시노비올린 유전자의 발현을 노던 블롯팅에 의해 확인하였다. 야생형, 헤테로 넉아웃 마우스, 및 호모 넉아웃 마우스 (태생 12.5일의 배 전체) 로부터 mRNA를 추출하여, 1.2% 아가로스젤의 각 레인에 20㎍씩 전기영동 하였다. 그 결과, 호모 넉아웃 마우스 (-/-) 에서는 시노비올린 mRNA는 검출되지 않고, 헤테로 넉아웃 마우스 (+/-) 에서는, 야생형 (+/+) 에 비하여 약한 mRNA 발현이 관찰되었다 (도21).
[ 실시예18 ] 시노비올린 발현 부위의 검토
실시예17에서 얻은 변이 마우스에 있어서 시노비올린 발현 부위를 LacZ 염색에 의해 검토하였다. 즉, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside (X-Gal) 을 이용하여 배 전체를 발색시켜, LacZ (β-galactosidase activity) 의 발현분포를 조사하였다. 관찰된 배의 수는, 32개 였다.
그 결과, 태생 12.5일령에서는, 두정골 및 사지에, 13.5일령에서는 귀 및 사지에 LacZ의 강한 발현이 확인되었다 (도22). 모두 골 및 연골이 형성되는 부위였 다. 더욱이 사지 형성기에 있어서 사지 조직절편의 LacZ 염색 및 HE 염색을 행한 결과, Apical Ectodermal Ridge (AER; 외배엽정제) 및 연골·골 원기 (anlage) (또는 연골·골) 에서 강한 발현이 관찰되었다 (도23).
더욱이, 태생 13일령의 지아 (limb buds) 를 꺼내어, 동결절편을 제조후, HE 염색 또는 LacZ 염색을 행하였다. 구체적으로는, 동결절편을 PBS(-)로 5분, 3회 세정하고, X-gal 염색액 [X-gal (20 mg/ml) 1.25 ml, HEPES (1M) 2.2 ml, potassium ferricyanide solution (100 mM) 1.5 ml, NaCl (5M) 150 ㎕, MgCl2 (1M) 65 ㎕, 10XPBS(-) 5 ml을 milli-Q water (Millipore)로 50 ml이 되도록 한 것] 에 절편을 얹은 슬라이드 글래스를 적시고, 37℃에서 반응을 개시시켰다. 염색후, 에탄올 시리즈 (ethanol series) 및 크실렌 (xylene) 으로 탈수하고, 봉입하였다. 그 결과, LacZ의 청색 염색이, 미분화 간엽계 (mesenchymal) 세포 (골·연골의 원기) 에 농축되어 있었다 (도24 및 25).
[ 실시예19 ] 표현형의 검토
더욱이, 시노비올린 유전자 넉아웃 마우스의 표현형에 있어서 검토를 행하였다. 태생 12.5일령에서는, 호모는 헤테로와 비교하여, 두정부에서 둔부 (buttocks) 까지의 길이가 짧고, 두개 (skull) 또는 사지의 형성이 미숙한 경향이 확인되었지만, 태생 13일령에서는 헤테로와 야생형의 표현형 사이에 현저한 차이가 확인되지 않았다 (도26). 더구나, 호모 마우스에서는 출생이 확인되지 않았고, 더 욱이 적어도 태생 17일 이후의 호모 태아의 생존이 확인될 수 없었던 점에 의해, 태생 치사 (fetal deaths) 로 사료되었다 (표1).
표1
일령/주령 해석 수 야생형 헤테로형 호모형(생사)
태생 12.5 일 10 0 8 2(생)
태생 13 일 10 2 7 1(생)
태생 14.5 일 6 2 3 1(?)
태생 15.5 일 6 0 5 1(사)
생후 4주령 46 14 32 0
태생 14.5일령에서는, 헤테로와 호모의 사이에 있어서, 두정부에서 둔부까지의 길이에 현저한 차이가 확인되지 않았다. 그러나, 헤테로에서는 발가락 (toes) 및 관절이 형성되어 있었던 것에 비하여, 호모에서는 형성되지 않았고, 지아 이상 (limb abnormalities)이 확인되었다 (도27).
더욱이, 호모에서는 이상을 나타낸 후지에 대해서 LacZ 및 HE 염색을 행한 결과, AER 및 미분화 간엽계 세포의 농축 부위 (장래 지골을 형성하는 부위) 에 시노비올린의 발현을 반영하는 LacZ의 발현이 확인되었다 (도28).
태생 15.5일령에서는, 호모는 지아 (limb buds), 상하 턱 및 귀에서 형태 이상을 나타내고, 사망하여 있었다 (도29). 더욱이 알시안 블루 (Alcian blue) 에 의해 연골조직, 알리자린 레드 (Alizarin red) 에 의해 골 (석회화) 조직을 염색하였다. 즉, 마우스의 표피·진피·내용물을 제거하고, 고정액 (에탄올:과산화수소수 = 9:1) 에 담그고, 그 후 알코올 시리즈에서 탈수후, 알리자린 레드 및 알시안 블루에 의해 염색하고, 알카리 용액에 의해 조직을 투명화 하였다. 투명화 종료후, 글리세린 용액 내에 보존하고 염색을 관찰하였다. 결과, 호모에서는 연골조직 (파랗게 염색) 및 골 (석회화) 조직 (붉게 염색) 중 어느 하나도 형성이 확인되지 않았다 (도30).
이상의 결과에 의해, 시노비올린 유전자 호모 넉아웃 마우스는, 태생기에 있어서는 지아의 발생 이상이 확인되고, 또한 연골 및 골의 형성이 확인되지 않았고, 지아와 연골, 골의 발생 부위에 시노비올린의 발현이 확인되었다는 것으로부터, 시노비올린 분자의 골격형성에의 관여가 강하게 사료되었다.
[ 실시예20 ] 시노비올린 유전자 넉아웃 마우스에 있어서 관절염용 칵테일 (cocktail) 투여
마우스에 있어서 콜라겐 유도 관절염 (Collagen-induced arthritis ; CIA) 은, 사람의 만성 관절 류마티스의 관절염 모델로 널리 이용되고 있다. 실시예 17에서 제조된 시노비올린 유전자 넉아웃 마우스 (헤테로 접합체) 또는 야생형 마우스에 항 콜라겐 항체 칵테일을 투여하고, 야기된 관절염을 관찰하였다. 그 결과, 시노비올린의 헤테로 넉아웃 마우스에서는, 야생형에 비하여 관절염의 야기가 약한 것이 판명되었다 (도31). 이 결과로부터도, 시노비올린이 RA에 있어서 관절염 유발에 공헌하고 있다는 것이 지지되었다.
[ 실시예21 ] 시노비올린 유전자 넉아웃 마우스의 태아 지아세포 (fetal limb bud cells) 의 초대 배양 (primary culture) 의 해석
넉아웃 (KO) 마우스로부터 얻어진 (explant법) 세포 중에서, 연골·골 및 사 지의 원기가 될 것으로 사료되는 미분화 간엽계 세포에서만 LacZ 염색, 즉 시노비올린의 발현이 확인되었다. 또한, 태아 지아세포의 초대 배양에 있어서, LacZ 양성의 콜로니 (즉, 시노비올린 발현 세포) 와 알시안 블루 염색 양성의 콜로니는 일치하고, 더욱 전형적인 쌍핵 연골세포 (binucleate cartilaginous cells) 에 있어서도 LacZ (β-갈락토시다제 활성에 의해) 의 염색이 관찰되는 것으로부터, 골·연골 분화에 시노비올린이 관여하고 있다는 사실이 지지되었다. 더욱이 알칼리 포스파타제 (alkaline phosphatase) 염색, Kossa 염색 등으로부터, 골·연골 형성능이 호모 넉아웃 유래의 세포에서는 지연되고 있는 것이 확인되었다 (도32 - 38).
Kossa 염색은 세포를 세정후, 질산은 용액 (5% w/v) 으로 치환하고, 증류수로 가볍게 세정한 후, 티오황산나트륨 (sodium thiosulfate solution) (5% w/v) 으로 환원·고정 (fixing) 하고, 세정 후, Kernechtrot 액 (0.1% w/v Kernechtrot (Nuclear Fast Red), 5% w/v aluminum sulfate) 으로 대비 염색을 하였다 (Masaji Seki, [Tissue Test Methods: Tissue Structure and Local Chemistry], 257-258, Kyorin-Shoin, 1961; L. Lison, Tadashi Imaizumi, trans., Histochimie et Cytochimie Animales : Principes et Methodes [Animal Histochemistry and Cytochemistry: Principles and Methods], 625-636, Hakusuisha Publishing Co. Ltd., 1962; Yutaka Sano, Soshikikagaku Kenkyu Ho- Riron to Jutsushiki [Histochemistry Research Methods: Theory and Practice], 616-621, Nanzando Co., Ltd., 1965). 알카리 포스파타제 활성의 검출은, 알카리 포스파타제 조직염색 키트 (Sigma, Diagnostic Kits and Reagents, alkaline phosphatase (AP), leukocyte, Cat. No. 86-R) 에 의해 행하였다.
[ 실시예22 ] 시노비올린 유전자 넉아웃 마우스 유래의 세포를 이용한 시험 화합물의 엣세이 (Test Compound Assay)
시노비올린 유전자 헤테로 넉아웃 마우스 (lacZ 유전자 knock-in) 의 초대 배양 세포를 이용하여, 시험 시료가 시노비올린 유전자의 발현에 미치는 효과를 β-gal 엣세이에 의해 평가하였다. 3회 계대한 시노비올린 유전자 헤테로 넉아웃 마우스의 초대 배양세포를 24웰 플레이트에 1웰 당 0, 1x103, 3x103, 1x104, 3x104 및 1x105 세포로 분주하고 (seed) , 10% 소태아혈청 (fetal calf serum) 을 포함하는 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium; DMEM) 내에서 밤새 배양하였다. 우선, 무자극 조건의 세포배양에서 세포 용해액 (프로메가 사) 을 세포층이 완전히 덮히도록 충분한 양 (100㎕/웰) 을 가하고, 배양 플레이트를 진탕기 (shaking machine) 에 옮기고, 세포층이 용해액에 항상 잠기도록 실온에서 15분 천천히 진탕하였다.
세포의 β-갈락토시다제 활성은, 다음과 같이 측정하였다. 얻어진 세포 추출액 20㎕에, Mg용액 (0.1M MgCl2, 4.5M β-mercaptoethanol) 을 1㎕, ONPG 용액 (o-nitrophenyl-b-D-galactopyranoside) (0.1M phosphate buffer(pH 7.5)에 4 mg/ml의 농도) 을 22㎕, 그리고 0.1M 포스페이트 버퍼 (pH 7.5) 57㎕를 가하여, 전량이 100㎕로 하였다. 건조하지 않도록 주의하며, 37℃에서 6시간 인큐베이트 하 였다. 150㎕의 1M 인산나트륨 (Na2CO3 21.2g을 H2O에 녹여, 200 ml로 메스업 하고, 0.45 ㎛ 필터로 여과한 것) 을 가하여 반응을 정지시키고, 420 nm의 흡광도를 측정하여 β-갈락토시다제 활성을 정량하였다. 실험은 3번 연속으로 행하였다. 그 결과, lacZ 유전자 녹인 (knock-in) 마우스 세포에 있어서 세포수에 따른 β-갈락토시다제 활성이 검출되었다 (도39). β-갈락토시다제 활성을 지표로 하여 프로모터 활성을 평가 (β-gal assay) 할 수 있다는 것이 확인되었다.
다음으로 초대 배양 세포에 각종 약제를 첨가하여 동일한 β-gal 엣세이를 행하고, 시노비올린 프로모터 활성에 대하여 각종 약제의 영향을 평가하였다. 음성 대조로서, 배지만을 첨가하여 동일한 측정을 행하였다. 시험 약제로서는, 프레드니솔론 (prednisolone) (0.01-1 μM) 및 12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate (TPA; 0.001-0.1 μM) 를 사용하였다. 프레드니솔론은 스테로이드성 항염증제, TPA는 프로틴 키나제C의 활성화제 (activator) 이다.
웰 당 5x104의 초대 배양세포를 분주하고, 밤새 배양후에 상기 농도의 각 약제를 첨가하였다. 약제 첨가후에 72시간 배양하고, 각 웰의 β-갈락토시다제 활성을 측정하여 프로모터 활성을 평가하였다. 그 결과, 이들 약제에 의해, 농도 의존적으로 시노비올린 프로모터의 활성이 영향을 받는다는 것이 판명되었다 (도40). 즉, 본 발명에 기초한 엣세이 시스템에 의하여, 약제가 시노비올린 프로모터에 주는 활성을 평가할 수 있다는 것이 뒷받침 되었다. 이상의 결과로부터, 이러한 엣세이에 의해, 각종의 약제가 시노비올린 프로모터 활성에 미치는 효과를 평가하는 것이 가능하게 되어, 시노비올린 프로모터 활성을 촉진 또는 억제하는 화합물을 스크리닝하는 것이 가능하다.
[ 실시예23 ] 항시노비올린 모노클로날 항체의 제작
시노비올린에 대한 모노클로날 항체를 다음과 같이 제조하였다. 면역용 펩티드로서, 이하에 나타낸 인간 시노비올린 부분 아미노산 서열을 포함하는 3종류의 펩티드를 합성하였다. 이들 아미노산 서열은, 항원성을 가진다고 추측되는 영역으로부터 선발하였다.
Syno-P3 (SLALTGAVVAHAYYC/서열 번호: 3),
Syno-P2 (TCRMDVLRASLPAQS/서열 번호: 4), 및
Syno-P1 (GAATTTAAGTSATAC/서열 번호: 5).
각 합성 펩티드에, 아미노산 서열 내의 Cys을 통하여, 스카시가이 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin; KLH) 을 결합시켰다. KLH를 결합시킨 각 합성 펩티드 50㎍을 0.1㎖ 생리식염수에 용해하고, 프로인트 완전 에주번트 (Freund's complete adjuvant ; FCA) 0.1㎖을 가하여 면역원을 제작하였다. 각 면역원을 각각 8마리의 마우스 (BALB/c 암컷, 5주령) 등부 (back) 피하에 0.2㎖을 주사하여 면역하였다. 면역은 2주일 마다 총 4회 행하고, 그 1주일 후에 다시 1회 면역하였다. 최종면역후 8일에, 심장으로부터 채혈하여 혈청 200㎕ 이상을 얻었다. ELISA에 의하여 항체가의 상승이 확인된 개체로부터 비장 세포를 채취하고, 세포융합을 행하였다.
각 면역원당 3개체의 마우스 혈청에 대하여, ELISA에 의한 항체가 (antibody titer) 의 측정 결과를 도41 내지 도43에 나타내었다. 각 혈청시료는 3번 연속으로 엣세이를 행하여, 그 평균값을 그래프에 나타내었다. 어느 면역원을 이용한 경우에도, 항체가가 상승한 개체가 확인되었다. 이들 면역원이 어느것이라도 시노비올린의 면역원으로서 유용하다는 것이 확인되었다.
미엘로마 (myeloma) 세포주 (P3U1) 와 마우스 비장세포를 1:10으로 혼합하여, 50% PEG (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 화광순약사 PEG1540) 존재하에서 세포융합 시켰다. 융합후, 비장세포수가 5x105 개/ml 이 되도록 96웰 플레이트에 분주하였다. HAT배지 내에서 10-14일 배양한 후, 세포의 증식을 확인하고, 배양 상청을 검정하였다. 배양 상청의 검정에는, 각 합성 펩티드를 고정화한 ELISA 플레이트를 이용하였다. 검정의 절차는 다음과 같다. ELISA 플레이트에 배양 상청을 반응시킨 후, 항마우스 IgG염소-pox를 이용하여 양성 웰을 선별하였다. 클로닝에 제공된 웰을 선별하고, 다른 양성 웰의 세포에 대해서는 동결 보존하였다.
수일 후, 1주당 96웰 플레이트 1매, 100 세포/플레이트 (20세포/ml) 가 되도록 분주하고, 10-14일간 배양하였다. 콜로니를 판정하고, 배양 상청의 검정을 행하였다. 배양 상청의 검정은, 상청 50㎕를 상기 스크리닝용 항원 고정화 ELISA 플레이트에 적용하여 행하였다. 제2항체는, 항마우스 IgG염소-pox를 이용하였다. 선별한 콜로니는, 배양후, 다시 클로닝 하고, 10-14일간 배앙하여 콜로니 판정 및 배양 상청의 검정을 상기와 동일하게 실시하였다. 친주 (mother strain) 별로 웰을 선택하고, 24웰 플레이트에서 배양하고, 상청을 회수하여 클로닝 체크를 행하고, 항체의 서브클래스 및 항체 생산을 검정하였다. 클로닝의 결과, 시노비올린에 대하여 높은 친화성을 가지는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마로서, Syno-P2 (서열 번호: 4) 를 면역원으로 하여 얻어진 2개의 클론 10Db 및 7Bc가 선별되었다.
[ 실시예24 ] 항시노비올린 모노클로낭 항체를 이용한 환자 시료의 시노비올린 검출
<1> 항시노비올린 모노클로날 항체에 의한 환자 유래 활막세포의 웨스턴 블롯팅
실시예23에서 얻은 Syno-P2를 인식하는 2종의 항시노비올린 모노클로날 항체 (10Db 및 7Bc) 를 이용하여, 만성 류마티스 관절염 환자 (RA) 유래 활막세포의 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고, 웨스턴 블롯팅법을 행하였다. 웨스턴 블롯팅법의 절차는, 항체로는 실시예23의 모노클로날 항체 10Db 및 7Bc를, 그리고 표지 항체로는 항마우스 IgG양-HRP를 이용한 것 외에는 실시예 8에서 기재한 것과 같다. 대조군으로, 변형성 관절증 환자 (OA) 유래의 활막세포도 해석하였다. 그 결과, RA 환자 유래의 활막세포에서 특이적인 시그널이 검출되었다 (도44A). 실시예23에서 얻은 모노클로날 항체는, RA 환자의 활막세포를 특이적으로 인식하는 것이 확인되었다. 이들 모노클로날 항체는, RA 검출에 유용하다.
<2> 항시노비올린 모노클로날 항체에 의한 RA 환자 유래 활막세포의 형광 면역 염 색
모노클로날 항체 10Db를 이용하여, RA 환자 유래 활막세포의 형광 면역 세포화학 분석을 행하였다. 면역 염색의 절차는, 항체로는 실시예 23의 모노클로날 항체 10Db를, 그리고 표지 항체로는 항마우스 IgG 양-FITC를 이용한 것 외에는 실시예 9에서 기재한 것과 같다. 시노비올린 단백질의 시그날은, RA 환자 유래의 활막세포에서 강하게 검출되었지만, 2차 항체만을 반응시킨 대조군에서는 검출되지 않았다 (도44B).
<3> 항시노비올린 모노클로날 항체에 의한 RA 환자 유래 활막조직의 면역 염색
모노클로날 항체 10Db 및 7Bc를 이용하여, RA 환자로부터 채취한 활막조직 절편의 면역 염색을 행하였다. 면역 염색의 절차는, 항체로는 실시예 23의 모노클로날 항체 10Db 및 7Bc를, 그리고 표지 항체로는 항마우스 IgG 양-HRP를 이용한 것 외에는 실시예 9에서 기재한 것과 같다. 시노비올린 단백질의 시그날은, RA 환자 유래의 활막세포에서 강하게 검출되었다 (도45). 동시에 행한 HE 염색에 의해, 활막세포의 증식층이 관찰되고, 그 부분이 모노클로날 항체로 염색되어 있는 것이 확인되었다. 이들 결과로부터, 본발명의 모노클로날 항체는, RA 환자의 활막조직을 특이적으로 인식하는 것이 확인되었다. 이상과 같이, 시노비올린 항체를 이용하여 환자 시료 내의 시노비올린을 검출하는 것에 의해, RA의 검사 및 진단을 실시하는 것이 가능하다.
[ 실시예25 ] 시노비올린의 유비퀴틴 리가제 ( Ubiquitin Ligase ) 활성의 검출
E3 유비퀴틴-단백질 리가제는, 자기-유비퀴틴화 (auto-ubiquitination) 를 하는 것이 알려져 있다 (Hashizume R. et al., J. Biol. Chem. 276, 14537-14540, 2001). 그래서, 시노비올린에 대해서 자기-유비퀴틴화 활성이 있는지 여부를 검토하였다. pCAGGS 벡터에 FLAG-시노비올린 유전자를 삽입한 플라스미드를, HEK-293 세포에 트랜스펙션 하고, 36시간후 세포를 회수하였다. Buffer A [15 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.5 M NaCl, 0.35% NP-40, 1 mM PMSF, 2 ㎍/ml aprotinin, 2 ㎍/ml leupeptin] 로 세포 파쇄액 (cell extract) 을 얻었다. 세포 파쇄액을 고속 원심분리기로 원심분리하고, 그 상청 0.6ml에, 3㎍의 항FLAG 항체 및 7.5㎕ 프로틴 A 비드 (beads) 를 첨가하고, 밤새 면역침강을 행하였다.
Buffer A 또는 0.1% SDS를 첨가한 Buffer A로 3회, Buffer B [25 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM NaCl, 0.01% Nonidet P-40, 10% glycerol, 1 mM EDTA]로 2회 비드를 세정하고, 30㎕의 유비퀴틴 리가제 반응액 [50 mM Tris-HCl pH 7.4, 5 mM MgCl2, 2 mM NaF, 10 nM okadaic acid, 2 mM ATP, 0.6 mM DTT, 1.5 ㎍ GST-HA-ubiquitin, 40 ng 효소-유래 E1, 0.3 ㎍ UbcH5c(E2)] 을 첨가하고, 37℃에서 30분 반응시켰다. 0.1M DDT를 포함하는 2 X Laemmli SDS-loading buffer를 30㎕ 가하고, 끓인 후, SDS-PAGE로 전개하고, 니트로셀룰로스 막에 트랜스퍼하였다. 1차 항체에는 항FLAG 항체 (SIGMA) 및 항HA 항체 (Roche Diagnostics 사) 를 사용하였다. HRP활성의 검출은 실시예7과 동일하게 행하였다. 더욱, 콘트롤로 FLAG-시노비올린 유전자를 트렌스펙션한 세포의 파쇄액만 (면역침강 전), 또는 세포 파쇄액을 면역침강 하여 얻은 용액 (즉 FLAG-시노비올린 단백질과 그 면역복합체만) 을 사용하였다. 더욱이, GST-HA-유비퀴틴, ATP, E1 또는 E2 중 어느 하나를 첨가하지 않은 반응도 행하였다 (GST-HA-유비퀴틴 비첨가의 경우는 GST를 사용하여 반응을 행하였다). 0.1% SDS 첨가 Buffer A 세정에 의한 임뮤노퓨리퍼케이션한 시노비올린을 사용한 결과를 도46에 표시하였다. 항HA 항체에 의한 블롯팅에 있어서는, 시노비올린의 분자량 (도46 *표) 보다 약 35kDa 큰 사이즈의 밴드가 검출되었다 (도46 화살표). 이 밴드는 항FLAG 항체에 의한 블롯팅에서도 관찰되었고, GST-HA-유비퀴틴이 시노비올린에 부가된 것으로 사료되었다. 더욱이, ATP, E1 또는 E2 중 어느 하나를 결손한 반응계에서는, 시노비올린의 자기-유비퀴틴화가 발생하지 않은 것으로 표시되었다. Buffer A만으로 비드를 세정한 경우에도 동일한 결과가 되었다. 이들 결과로 부터, 1) 시노비올린을 포함하는 면역복합체에서 E1- 및 E2-의존적 유비퀴틴 리가제 활성이 존재하고, 또한, immunopurification의 결과로부터, 2) 시노비올린은 E3 유비퀴틴-단백질 리가제 활성을 가지고 있다는 것이 밝혀졌다.
본 발명은, 활막의 발달과 골·연골 및 사지의 발달에 관여하는 신규한 단백질을 코드하는 유전자「시노비올린」을 제공한다. 본 발명의 유전자는 RA에 관여하고 있고, RA환자에서는, 이 유전자 산물에 대한 항체가 생산되고 있다. 본 발명의 유전자 및 단백질은, RA의 진단에 유용한 신규한 마커 (marker) 가 된다. 본 발명의 「시노비올린」은, RA환자의 관절 활막세포에서 과발현 하고 있어, in situ 하이브리다이제이션 (hybridization) 이나 in situ PCR에 의해, RA질환의 진단이나 치료효과의 판정에 공헌한다. 더구나, RA환자의 혈중에서는 시노비올린에 대한 항체를 높은 빈도로 발견할 수 있다. 이것을 마커로 함으로써 RA의 특이적인 진단을 가능하게 한다. 본 발명에 의하여 제공되는 시노비올린 단백질 또는 그 부분 펩티드는 환자 혈청 내의 시노비올린에 대한 항체의 검출에 유용하다.
또한, 시노비올린은 미분화 간엽계 세포에 있어서 발현되고 있다. 시노비올린을 세포 마커로 이용한다면, 배의 세포 등으로부터 미분화 간엽계 세포를 회수할 수 있다. 미분화 간엽계 세포는, 골, 연골로 분화하는 세포이고, 따라서 재생 의학적 응용이 기대되고 있다. 즉, 시노비올린을 세포 마커로 하여 회수한 미분화 간엽계 세포를 시험관내 또는 생체내에서 분화시켜, 골·연골의 형성이나 관절의 재구축을 행한다면, 상해를 입은 골·연골 조직이나 관절을 새롭게 재생시키는 것도 가능하게 된다.
본 발명의 시노비올린, 및 그 리간드는, RA의 주요한 증상 (pathology) 인 관절 활막세포의 증식에 밀접하게 관련되어 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명에 의해 제공되는 시노비올린, 또는 그 리간드는, RA의 치료방법의 개발에 있어서 중요한 식견을 준다. 보다 구체적으로는, 시노비올린과 그 리간드의 결합에 관여하는 화합물을 스크리닝하는 것에 의해, 지금까지와는 전혀 다른 접근 (approach) 으로 RA 치료기술의 개발을 진행하는 것이 가능한 것이다. 더욱이 시노비올린의 트랜스제닉 마우스는, 높은 빈도로 관절의 활막이 증식하고, 관절염을 동반한 지관절의 팽창을 일으켰다. 본 발명에 의하여 제공되는 시노비올린의 트랜스제닉 동물은, RA의 모델로서, 그 치료기술이나 의약품의 개발에 매우 유용하다.
<110> Locomogene, Inc. <120> Synovial cell protein <130> 6fpi-03-16 <150> JP 2000-405082 <151> 2000-12-22 <150> JP 2001-266492 <151> 2001-06-27 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 3374 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (403)..(2253) <400> 1 gccctttctt atgagcatgc ctgtgttggg ttgacagtga gggtaataat gacttgttgg 60 ttgattgtag atatagggct ctcccttgca aggtaattag gctccttaaa ttacctgtaa 120 gattttcttg ccacagcatc cattctggtt aggctggtga tcttctgagt agtgatagat 180 tggttggtgg tgaggtttac aggtgttccc ttctcttact cctggtgttg gctacaatca 240 ggtggcgtct agagcagcat gggacaggtg ggtaagggga gtcttctcat tatgcagaag 300 tgatcaactt aaatctctgt cagatctacc tttatgtagc ccggcagtcg cgcggattga 360 gcgggctcgc ggcgctgggt tcctggtctc cgggccaggg ca atg ttc cgc 411 Met Phe Arg 1 acg gca gtg atg atg gcg gcc agc ctg gcg ctg acc ggg gct gtg gtg 459 Thr Ala Val Met Met Ala Ala Ser Leu Ala Leu Thr Gly Ala Val Val 5 10 15 gct cac gcc tac tac ctc aaa cac cag ttc tac ccc act gtg gtg tac 507 Ala His Ala Tyr Tyr Leu Lys His Gln Phe Tyr Pro Thr Val Val Tyr 20 25 30 35 ctg acc aag tcc agc ccc agc atg gca gtc ctg tac atc cag gcc ttt 555 Leu Thr Lys Ser Ser Pro Ser Met Ala Val Leu Tyr Ile Gln Ala Phe 40 45 50 gtc ctt gtc ttc ctt ctg ggc aag gtg atg ggc aag gtg ttc ttt ggg 603 Val Leu Val Phe Leu Leu Gly Lys Val Met Gly Lys Val Phe Phe Gly 55 60 65 caa ctg agg gca gca gag atg gag cac ctt ctg gaa cgt tcc tgg tac 651 Gln Leu Arg Ala Ala Glu Met Glu His Leu Leu Glu Arg Ser Trp Tyr 70 75 80 gcc gtc aca gag act tgt ctg gcc ttc acc gtt ttt cgg gat gac ttc 699 Ala Val Thr Glu Thr Cys Leu Ala Phe Thr Val Phe Arg Asp Asp Phe 85 90 95 agc ccc cgc ttt gtt gca ctc ttc act ctt ctt ctc ttc ctc aaa tgt 747 Ser Pro Arg Phe Val Ala Leu Phe Thr Leu Leu Leu Phe Leu Lys Cys 100 105 110 115 ttc cac tgg ctg gct gag gac cgt gtg gac ttt atg gaa cgc agc ccc 795 Phe His Trp Leu Ala Glu Asp Arg Val Asp Phe Met Glu Arg Ser Pro 120 125 130 aac atc tcc tgg ctc ttt cac tgc cgc att gtc tct ctt atg ttc ctc 843 Asn Ile Ser Trp Leu Phe His Cys Arg Ile Val Ser Leu Met Phe Leu 135 140 145 ctg ggc atc ctg gac ttc ctc ttc gtc agc cac gcc tat cac agc atc 891 Leu Gly Ile Leu Asp Phe Leu Phe Val Ser His Ala Tyr His Ser Ile 150 155 160 ctg acc cgt ggg gcc tct gtg cag ctg gtg ttt ggc ttt gag tat gcc 939 Leu Thr Arg Gly Ala Ser Val Gln Leu Val Phe Gly Phe Glu Tyr Ala 165 170 175 atc ctg atg acg atg gtg ctc acc atc ttc atc aag tat gtg ctg cac 987 Ile Leu Met Thr Met Val Leu Thr Ile Phe Ile Lys Tyr Val Leu His 180 185 190 195 tcc gtg gac ctc cag agt gag aac ccc tgg gac aac aag gct gtg tac 1035 Ser Val Asp Leu Gln Ser Glu Asn Pro Trp Asp Asn Lys Ala Val Tyr 200 205 210 atg ctc tac aca gag ctg ttt aca ggc ttc atc aag gtt ctg ctg tac 1083 Met Leu Tyr Thr Glu Leu Phe Thr Gly Phe Ile Lys Val Leu Leu Tyr 215 220 225 atg gcc ttc atg acc atc atg atc aag gtg cac acc ttc cca ctc ttt 1131 Met Ala Phe Met Thr Ile Met Ile Lys Val His Thr Phe Pro Leu Phe 230 235 240 gcc atc cgg ccc atg tac ctg gcc atg aga cag ttc aag aaa gct gtg 1179 Ala Ile Arg Pro Met Tyr Leu Ala Met Arg Gln Phe Lys Lys Ala Val 245 250 255 aca gat gcc atc atg tct cgc cga gcc atc cgc aac atg aac acc ctg 1227 Thr Asp Ala Ile Met Ser Arg Arg Ala Ile Arg Asn Met Asn Thr Leu 260 265 270 275 tat cca gat gcc acc cca gag gag ctc cag gca atg gac aat gtc tgc 1275 Tyr Pro Asp Ala Thr Pro Glu Glu Leu Gln Ala Met Asp Asn Val Cys 280 285 290 atc atc tgc cga gaa gag atg gtg act ggt gcc aag aga ctg ccc tgc 1323 Ile Ile Cys Arg Glu Glu Met Val Thr Gly Ala Lys Arg Leu Pro Cys 295 300 305 aac cac att ttc cat acc agc tgc ctg cgc tcc tgg ttc cag cgg cag 1371 Asn His Ile Phe His Thr Ser Cys Leu Arg Ser Trp Phe Gln Arg Gln 310 315 320 cag acc tgc ccc acc tgc cgt atg gat gtc ctt cgt gca tcg ctg cca 1419 Gln Thr Cys Pro Thr Cys Arg Met Asp Val Leu Arg Ala Ser Leu Pro 325 330 335 gcg cag tca cca cca ccc ccg gag cct gcg gat cag ggg cca ccc cct 1467 Ala Gln Ser Pro Pro Pro Pro Glu Pro Ala Asp Gln Gly Pro Pro Pro 340 345 350 355 gcc ccc cac ccc cca cca ctc ttg cct cag ccc ccc aac ttc ccc cag 1515 Ala Pro His Pro Pro Pro Leu Leu Pro Gln Pro Pro Asn Phe Pro Gln 360 365 370 ggc ctc ctg cct cct ttt cct cca ggc atg ttc cca ctg tgg ccc ccc 1563 Gly Leu Leu Pro Pro Phe Pro Pro Gly Met Phe Pro Leu Trp Pro Pro 375 380 385 atg ggc ccc ttt cca cct gtc ccg cct ccc ccc agc tca gga gag gct 1611 Met Gly Pro Phe Pro Pro Val Pro Pro Pro Pro Ser Ser Gly Glu Ala 390 395 400 gtg gct cct cca tcc acc agt gca gca gcc ctt tct cgg ccc agt gga 1659 Val Ala Pro Pro Ser Thr Ser Ala Ala Ala Leu Ser Arg Pro Ser Gly 405 410 415 gca gct aca acc aca gct gct ggc acc agt gct act gct gct tct gcc 1707 Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Gly Thr Ser Ala Thr Ala Ala Ser Ala 420 425 430 435 aca gca tct ggc cca ggc tct ggc tct gcc cca gag gct ggc cct gcc 1755 Thr Ala Ser Gly Pro Gly Ser Gly Ser Ala Pro Glu Ala Gly Pro Ala 440 445 450 cct ggt ttc ccc ttc cct cct ccc tgg atg ggt atg ccc ctg cct cca 1803 Pro Gly Phe Pro Phe Pro Pro Pro Trp Met Gly Met Pro Leu Pro Pro 455 460 465 ccc ttt gcc ttc ccc cca atg cct gtg ccc cct gcg ggc ttt gct ggg 1851 Pro Phe Ala Phe Pro Pro Met Pro Val Pro Pro Ala Gly Phe Ala Gly 470 475 480 ctg acc cca gag gag cta cga gct ctg gag ggc cat gag cgg cag cac 1899 Leu Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Leu Glu Gly His Glu Arg Gln His 485 490 495 ctg gag gcc cgg ctg cag agc ctg cgt aac atc cac aca ctg ctg gac 1947 Leu Glu Ala Arg Leu Gln Ser Leu Arg Asn Ile His Thr Leu Leu Asp 500 505 510 515 gcc gcc atg ctg cag atc aac cag tac ctc acc gtg ctg gcc tcc ttg 1995 Ala Ala Met Leu Gln Ile Asn Gln Tyr Leu Thr Val Leu Ala Ser Leu 520 525 530 ggg ccc ccc cgg cct gcc act tca gtc aac tcc act gag ggg act gcc 2043 Gly Pro Pro Arg Pro Ala Thr Ser Val Asn Ser Thr Glu Gly Thr Ala 535 540 545 act aca gtt gtt gct gct gcc tcc tcc acc agc atc cct agc tca gag 2091 Thr Thr Val Val Ala Ala Ala Ser Ser Thr Ser Ile Pro Ser Ser Glu 550 555 560 gcc acg acc cca acc cca gga gcc tcc cca cca gcc cct gaa atg gaa 2139 Ala Thr Thr Pro Thr Pro Gly Ala Ser Pro Pro Ala Pro Glu Met Glu 565 570 575 agg cct cca gct cct gag tca gtg ggc aca gag gag atg cct gag gat 2187 Arg Pro Pro Ala Pro Glu Ser Val Gly Thr Glu Glu Met Pro Glu Asp 580 585 590 595 gga gag ccc gat gca gca gag ctc cgc cgg cgc cgc ctg cag aag ctg 2235 Gly Glu Pro Asp Ala Ala Glu Leu Arg Arg Arg Arg Leu Gln Lys Leu 600 605 610 gag tct cct gtt gcc cac tgacact gccccagccc agccccagcc tctgctcttt 2290 Glu Ser Pro Val Ala His 615 tgagcagccc tcgctggaac atgtcctgcc accaagtgcc agctccctct ctgtctgcac 2350 cagggagtag tacccccagc tctgagaaag aggcggcatc ccctaggcca agtggaaaga 2410 ggctggggtt cccatttgac tccagtccca ggcagccatg gggatctcgg gtcagttcca 2470 gccttcctct ccaactcttc agccctgtgt tctgctgggg ccatgaaggc agaaggttta 2530 gcctctgaga agccctcttc ttcccccacc cctttccagg agaaggggct gcccctccaa 2590 gccctacttg tatgtgcgga gtcacactgc agtgccgaac agtattagct cccgttccca 2650 agtgtggact ccagaggggc tggaggcaag ctatgaactt gctcgctggc ccacccctaa 2710 gactggtacc catttccttt tcttaccctg atctccccag aagcctcttg tggtggtggc 2770 tgtgccccct atgccctgtg gcatttctgc gtcttactgg caaccacaca actcagggaa 2830 aggaatgcct gggagtgggg gtgcaggcgg gcagcactga gggaccctgc cccgcccctc 2890 cccccaggcc cctttcccct gcagcttctc aagtgagact gacctgtctc acccagcagc 2950 cactgcccag ccgcactcca ggcaagggcc agtgcgcctg ctcctgacca ctgcaatccc 3010 agcgcccaag gaaggccact tctcaactgg cagaacttct gaagtttaga attggaatta 3070 cttccttact agtgtctttt ggcttaaatt ttgtcttttg aagttgaatg cttaatcccg 3130 ggaaagagga acaggagtgc cagactcctg gtctttccag tttagaaaag gctctgtgcc 3190 aaggagggac cacaggagct gggacctgcc tgcccctgtc ctttcccctt ggttttgtgt 3250 tacaagagtt gttggagaca gtttcagatg attatttaat ttgtaaatat tgtacaaatt 3310 ttaatagctt aaattgtata tacagccaaa taaaaacttg cattaacaaa aaaaaaaaaa 3370 aaaa 3374 <210> 2 <211> 617 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Phe Arg Thr Ala Val Met Met Ala Ala Ser Leu Ala Leu Thr Gly 1 5 10 15 Ala Val Val Ala His Ala Tyr Tyr Leu Lys His Gln Phe Tyr Pro Thr 20 25 30 Val Val Tyr Leu Thr Lys Ser Ser Pro Ser Met Ala Val Leu Tyr Ile 35 40 45 Gln Ala Phe Val Leu Val Phe Leu Leu Gly Lys Val Met Gly Lys Val 50 55 60 Phe Phe Gly Gln Leu Arg Ala Ala Glu Met Glu His Leu Leu Glu Arg 65 70 75 80 Ser Trp Tyr Ala Val Thr Glu Thr Cys Leu Ala Phe Thr Val Phe Arg 85 90 95 Asp Asp Phe Ser Pro Arg Phe Val Ala Leu Phe Thr Leu Leu Leu Phe 100 105 110 Leu Lys Cys Phe His Trp Leu Ala Glu Asp Arg Val Asp Phe Met Glu 115 120 125 Arg Ser Pro Asn Ile Ser Trp Leu Phe His Cys Arg Ile Val Ser Leu 130 135 140 Met Phe Leu Leu Gly Ile Leu Asp Phe Leu Phe Val Ser His Ala Tyr 145 150 155 160 His Ser Ile Leu Thr Arg Gly Ala Ser Val Gln Leu Val Phe Gly Phe 165 170 175 Glu Tyr Ala Ile Leu Met Thr Met Val Leu Thr Ile Phe Ile Lys Tyr 180 185 190 Val Leu His Ser Val Asp Leu Gln Ser Glu Asn Pro Trp Asp Asn Lys 195 200 205 Ala Val Tyr Met Leu Tyr Thr Glu Leu Phe Thr Gly Phe Ile Lys Val 210 215 220 Leu Leu Tyr Met Ala Phe Met Thr Ile Met Ile Lys Val His Thr Phe 225 230 235 240 Pro Leu Phe Ala Ile Arg Pro Met Tyr Leu Ala Met Arg Gln Phe Lys 245 250 255 Lys Ala Val Thr Asp Ala Ile Met Ser Arg Arg Ala Ile Arg Asn Met 260 265 270 Asn Thr Leu Tyr Pro Asp Ala Thr Pro Glu Glu Leu Gln Ala Met Asp 275 280 285 Asn Val Cys Ile Ile Cys Arg Glu Glu Met Val Thr Gly Ala Lys Arg 290 295 300 Leu Pro Cys Asn His Ile Phe His Thr Ser Cys Leu Arg Ser Trp Phe 305 310 315 320 Gln Arg Gln Gln Thr Cys Pro Thr Cys Arg Met Asp Val Leu Arg Ala 325 330 335 Ser Leu Pro Ala Gln Ser Pro Pro Pro Pro Glu Pro Ala Asp Gln Gly 340 345 350 Pro Pro Pro Ala Pro His Pro Pro Pro Leu Leu Pro Gln Pro Pro Asn 355 360 365 Phe Pro Gln Gly Leu Leu Pro Pro Phe Pro Pro Gly Met Phe Pro Leu 370 375 380 Trp Pro Pro Met Gly Pro Phe Pro Pro Val Pro Pro Pro Pro Ser Ser 385 390 395 400 Gly Glu Ala Val Ala Pro Pro Ser Thr Ser Ala Ala Ala Leu Ser Arg 405 410 415 Pro Ser Gly Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Gly Thr Ser Ala Thr Ala 420 425 430 Ala Ser Ala Thr Ala Ser Gly Pro Gly Ser Gly Ser Ala Pro Glu Ala 435 440 445 Gly Pro Ala Pro Gly Phe Pro Phe Pro Pro Pro Trp Met Gly Met Pro 450 455 460 Leu Pro Pro Pro Phe Ala Phe Pro Pro Met Pro Val Pro Pro Ala Gly 465 470 475 480 Phe Ala Gly Leu Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Leu Glu Gly His Glu 485 490 495 Arg Gln His Leu Glu Ala Arg Leu Gln Ser Leu Arg Asn Ile His Thr 500 505 510 Leu Leu Asp Ala Ala Met Leu Gln Ile Asn Gln Tyr Leu Thr Val Leu 515 520 525 Ala Ser Leu Gly Pro Pro Arg Pro Ala Thr Ser Val Asn Ser Thr Glu 530 535 540 Gly Thr Ala Thr Thr Val Val Ala Ala Ala Ser Ser Thr Ser Ile Pro 545 550 555 560 Ser Ser Glu Ala Thr Thr Pro Thr Pro Gly Ala Ser Pro Pro Ala Pro 565 570 575 Glu Met Glu Arg Pro Pro Ala Pro Glu Ser Val Gly Thr Glu Glu Met 580 585 590 Pro Glu Asp Gly Glu Pro Asp Ala Ala Glu Leu Arg Arg Arg Arg Leu 595 600 605 Gln Lys Leu Glu Ser Pro Val Ala His 610 615 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 3 Ser Leu Ala Leu Thr Gly Ala Val Val Ala His Ala Tyr Tyr Cys 1 5 10 15 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 4 Thr Cys Arg Met Asp Val Leu Arg Ala Ser Leu Pro Ala Gln Ser 1 5 10 15 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized sequence <400> 5 Gly Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Gly Thr Ser Ala Thr Ala Cys 1 5 10 15 <210> 6 <211> 3028 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (60)..(1907) <400> 6 gcagtcgcgc ggattgagcg ggctcgcggc gctgggttcc tggtctccgg gccagggca 59 atg ttc cgc acg gca gtg atg atg gcg gcc agc ctg gcg ctg acc ggg 107 Met Phe Arg Thr Ala Val Met Met Ala Ala Ser Leu Ala Leu Thr Gly 1 5 10 15 gct gtg gtg gct cac gcc tac tac ctc aaa cac cag ttc tac ccc act 155 Ala Val Val Ala His Ala Tyr Tyr Leu Lys His Gln Phe Tyr Pro Thr 20 25 30 gtg gtg tac ctg acc aag tcc agc ccc agc atg gca gtc ctg tac atc 203 Val Val Tyr Leu Thr Lys Ser Ser Pro Ser Met Ala Val Leu Tyr Ile 35 40 45 cag gcc ttt gtc ctt gtc ttc ctt ctg ggc aag gtg atg ggc aag gtg 251 Gln Ala Phe Val Leu Val Phe Leu Leu Gly Lys Val Met Gly Lys Val 50 55 60 ttc ttt ggg caa ctg agg gca gca gag atg gag cac ctt ctg gaa cgt 299 Phe Phe Gly Gln Leu Arg Ala Ala Glu Met Glu His Leu Leu Glu Arg 65 70 75 80 tcc tgg tac gcc gtc aca gag act tgt ctg gcc ttc acc gtt ttt cgg 347 Ser Trp Tyr Ala Val Thr Glu Thr Cys Leu Ala Phe Thr Val Phe Arg 85 90 95 gat gac ttc agc ccc cgc ttt gtt gca ctc ttc act ctt ctt ctc ttc 395 Asp Asp Phe Ser Pro Arg Phe Val Ala Leu Phe Thr Leu Leu Leu Phe 100 105 110 ctc aaa tgt ttc cac tgg ctg gct gag gac cgt gtg gac ttt atg gaa 443 Leu Lys Cys Phe His Trp Leu Ala Glu Asp Arg Val Asp Phe Met Glu 115 120 125 cgc agc ccc aac atc tcc tgg ctc ttt cac tgc cgc att gtc tct ctt 491 Arg Ser Pro Asn Ile Ser Trp Leu Phe His Cys Arg Ile Val Ser Leu 130 135 140 atg ttc ctc ctg ggc atc ctg gac ttc ctc ttc gtc agc cac gcc tat 539 Met Phe Leu Leu Gly Ile Leu Asp Phe Leu Phe Val Ser His Ala Tyr 145 150 155 160 cac agc atc ctg acc cgt ggg gcc tct gtg cag ctg gtg ttt ggc ttt 587 His Ser Ile Leu Thr Arg Gly Ala Ser Val Gln Leu Val Phe Gly Phe 165 170 175 gag tat gcc atc ctg atg acg atg gtg ctc acc atc ttc atc aag tat 635 Glu Tyr Ala Ile Leu Met Thr Met Val Leu Thr Ile Phe Ile Lys Tyr 180 185 190 gtg ctg cac tcc gtg gac ctc cag agt gag aac ccc tgg gac aac aag 683 Val Leu His Ser Val Asp Leu Gln Ser Glu Asn Pro Trp Asp Asn Lys 195 200 205 gct gtg tac atg ctc tac aca gag ctg ttt aca ggc ttc atc aag gtt 731 Ala Val Tyr Met Leu Tyr Thr Glu Leu Phe Thr Gly Phe Ile Lys Val 210 215 220 ctg ctg tac atg gcc ttc atg acc atc atg atc aag gtg cac acc ttc 779 Leu Leu Tyr Met Ala Phe Met Thr Ile Met Ile Lys Val His Thr Phe 225 230 235 240 cca ctc ttt gcc atc cgg ccc atg tac ctg gcc atg aga cag ttc aag 827 Pro Leu Phe Ala Ile Arg Pro Met Tyr Leu Ala Met Arg Gln Phe Lys 245 250 255 aaa gct gtg aca gat gcc atc atg tct cgc cga gcc atc cgc aac atg 875 Lys Ala Val Thr Asp Ala Ile Met Ser Arg Arg Ala Ile Arg Asn Met 260 265 270 aac acc ctg tat cca gat gcc acc cca gag gag ctc cag gca atg gac 923 Asn Thr Leu Tyr Pro Asp Ala Thr Pro Glu Glu Leu Gln Ala Met Asp 275 280 285 aat gtc tgc atc atc tgc cga gaa gag atg gtg act ggt gcc aag aga 971 Asn Val Cys Ile Ile Cys Arg Glu Glu Met Val Thr Gly Ala Lys Arg 290 295 300 ctg ccc tgc aac cac att ttc cat acc agc tgc ctg cgc tcc tgg ttc 1019 Leu Pro Cys Asn His Ile Phe His Thr Ser Cys Leu Arg Ser Trp Phe 305 310 315 320 cag cgg cag cag acc tgc ccc acc tgc cgt atg gat gtc ctt cgt gca 1067 Gln Arg Gln Gln Thr Cys Pro Thr Cys Arg Met Asp Val Leu Arg Ala 325 330 335 tcg ctg cca gcg cag tca cca cca ccc ccg gag cct gcg gat cag ggg 1115 Ser Leu Pro Ala Gln Ser Pro Pro Pro Pro Glu Pro Ala Asp Gln Gly 340 345 350 cca ccc cct gcc ccc cac ccc cca cca ctc ttg cct cag ccc ccc aac 1163 Pro Pro Pro Ala Pro His Pro Pro Pro Leu Leu Pro Gln Pro Pro Asn 355 360 365 ttc ccc cag ggc ctc ctg cct cct ttt cct cca ggc atg ttc cca ctg 1211 Phe Pro Gln Gly Leu Leu Pro Pro Phe Pro Pro Gly Met Phe Pro Leu 370 375 380 tgg ccc ccc atg ggc ccc ttt cca cct gtc ccg cct ccc ccc agc tca 1259 Trp Pro Pro Met Gly Pro Phe Pro Pro Val Pro Pro Pro Pro Ser Ser 385 390 395 400 gga gag gct gtg gct cct cca tcc acc agt gca gcc ctt tct cgg ccc 1307 Gly Glu Ala Val Ala Pro Pro Ser Thr Ser Ala Ala Leu Ser Arg Pro 405 410 415 agt gga gca gct aca acc aca gct gct ggc acc agt gct act gct gct 1355 Ser Gly Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Gly Thr Ser Ala Thr Ala Ala 420 425 430 tct gcc aca gca tct ggc cca ggc tct ggc tct gcc cca gag gct ggc 1403 Ser Ala Thr Ala Ser Gly Pro Gly Ser Gly Ser Ala Pro Glu Ala Gly 435 440 445 cct gcc cct ggt ttc ccc ttc cct cct ccc tgg atg ggt atg ccc ctg 1451 Pro Ala Pro Gly Phe Pro Phe Pro Pro Pro Trp Met Gly Met Pro Leu 450 455 460 cct cca ccc ttt gcc ttc ccc cca atg cct gtg ccc cct gcg ggc ttt 1499 Pro Pro Pro Phe Ala Phe Pro Pro Met Pro Val Pro Pro Ala Gly Phe 465 470 475 480 gct ggg ctg acc cca gag gag cta cga gct ctg gag ggc cat gag cgg 1547 Ala Gly Leu Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Leu Glu Gly His Glu Arg 485 490 495 cag cac ctg gag gcc cgg ctg cag agc ctg cgt aac atc cac aca ctg 1595 Gln His Leu Glu Ala Arg Leu Gln Ser Leu Arg Asn Ile His Thr Leu 500 505 510 ctg gac gcc gcc atg ctg cag atc aac cag tac ctc acc gtg ctg gcc 1643 Leu Asp Ala Ala Met Leu Gln Ile Asn Gln Tyr Leu Thr Val Leu Ala 515 520 525 tcc ttg ggg ccc ccc cgg cct gcc act tca gtc aac tcc act gag ggg 1691 Ser Leu Gly Pro Pro Arg Pro Ala Thr Ser Val Asn Ser Thr Glu Gly 530 535 540 act gcc act aca gtt gtt gct gct gcc tcc tcc acc agc atc cct agc 1739 Thr Ala Thr Thr Val Val Ala Ala Ala Ser Ser Thr Ser Ile Pro Ser 545 550 555 560 tca gag gcc acg acc cca acc cca gga gcc tcc cca cca gcc cct gaa 1787 Ser Glu Ala Thr Thr Pro Thr Pro Gly Ala Ser Pro Pro Ala Pro Glu 565 570 575 atg gaa agg cct cca gct cct gag tca gtg ggc aca gag gag atg cct 1835 Met Glu Arg Pro Pro Ala Pro Glu Ser Val Gly Thr Glu Glu Met Pro 580 585 590 gag gat gga gag ccc gat gca gca gag ctc cgc cgg cgc cgc ctg cag 1883 Glu Asp Gly Glu Pro Asp Ala Ala Glu Leu Arg Arg Arg Arg Leu Gln 595 600 605 aag ctg gag tct cct gtt gcc cac tga cactgcccca gcccagcccc 1930 Lys Leu Glu Ser Pro Val Ala His 610 615 agcctctgct cttttgagca gccctcgctg gaacatgtcc tgccaccaag tgccagctcc 1990 ctctctgtct gcaccaggga gtagtacccc cagctctgag aaagaggcgg catcccctag 2050 gccaagtgga aagaggctgg ggttcccatt tgactccagt cccaggcagc catggggatc 2110 tcgggtcagt tccagccttc ctctccaact cttcagccct gtgttctgct ggggccatga 2170 aggcagaagg tttagcctct gagaagccct cttcttcccc cacccctttc caggagaagg 2230 ggctgcccct ccaagcccta cttgtatgtg cggagtcaca ctgcagtgcc gaacagtatt 2290 agctcccgtt cccaagtgtg gactccagag gggctggagg caagctatga acttgctcgc 2350 tggcccaccc ctaagactgg tacccatttc cttttcttac cctgatctcc ccagaagcct 2410 cttgtggtgg tggctgtgcc ccctatgccc tgtggcattt ctgcgtctta ctggcaacca 2470 cacaactcag ggaaaggaat gcctgggagt gggggtgcag gcgggcagca ctgagggacc 2530 ctgccccgcc cctcccccca ggcccctttc ccctgcagct tctcaagtga gactgacctg 2590 tctcacccag cagccactgc ccagccgcac tccaggcaag ggccagtgcg cctgctcctg 2650 accactgcaa tcccagcgcc caaggaaggc cacttctcaa ctggcagaac ttctgaagtt 2710 tagaattgga attacttcct tactagtgtc ttttggctta aattttgtct tttgaagttg 2770 aatgcttaat cccgggaaag aggaacagga gtgccagact cctggtcttt ccagtttaga 2830 aaaggctctg tgccaaggag ggaccacagg agctgggacc tgcctgcccc tgtcctttcc 2890 ccttggtttt gtgttacaag agttgttgga gacagtttca gatgattatt taatttgtaa 2950 atattgtaca aattttaata gcttaaattg tatatacagc caaataaaaa cttgcattaa 3010 caaaaaaaaa aaaaaaaa 3028 <210> 7 <211> 616 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Phe Arg Thr Ala Val Met Met Ala Ala Ser Leu Ala Leu Thr Gly 1 5 10 15 Ala Val Val Ala His Ala Tyr Tyr Leu Lys His Gln Phe Tyr Pro Thr 20 25 30 Val Val Tyr Leu Thr Lys Ser Ser Pro Ser Met Ala Val Leu Tyr Ile 35 40 45 Gln Ala Phe Val Leu Val Phe Leu Leu Gly Lys Val Met Gly Lys Val 50 55 60 Phe Phe Gly Gln Leu Arg Ala Ala Glu Met Glu His Leu Leu Glu Arg 65 70 75 80 Ser Trp Tyr Ala Val Thr Glu Thr Cys Leu Ala Phe Thr Val Phe Arg 85 90 95 Asp Asp Phe Ser Pro Arg Phe Val Ala Leu Phe Thr Leu Leu Leu Phe 100 105 110 Leu Lys Cys Phe His Trp Leu Ala Glu Asp Arg Val Asp Phe Met Glu 115 120 125 Arg Ser Pro Asn Ile Ser Trp Leu Phe His Cys Arg Ile Val Ser Leu 130 135 140 Met Phe Leu Leu Gly Ile Leu Asp Phe Leu Phe Val Ser His Ala Tyr 145 150 155 160 His Ser Ile Leu Thr Arg Gly Ala Ser Val Gln Leu Val Phe Gly Phe 165 170 175 Glu Tyr Ala Ile Leu Met Thr Met Val Leu Thr Ile Phe Ile Lys Tyr 180 185 190 Val Leu His Ser Val Asp Leu Gln Ser Glu Asn Pro Trp Asp Asn Lys 195 200 205 Ala Val Tyr Met Leu Tyr Thr Glu Leu Phe Thr Gly Phe Ile Lys Val 210 215 220 Leu Leu Tyr Met Ala Phe Met Thr Ile Met Ile Lys Val His Thr Phe 225 230 235 240 Pro Leu Phe Ala Ile Arg Pro Met Tyr Leu Ala Met Arg Gln Phe Lys 245 250 255 Lys Ala Val Thr Asp Ala Ile Met Ser Arg Arg Ala Ile Arg Asn Met 260 265 270 Asn Thr Leu Tyr Pro Asp Ala Thr Pro Glu Glu Leu Gln Ala Met Asp 275 280 285 Asn Val Cys Ile Ile Cys Arg Glu Glu Met Val Thr Gly Ala Lys Arg 290 295 300 Leu Pro Cys Asn His Ile Phe His Thr Ser Cys Leu Arg Ser Trp Phe 305 310 315 320 Gln Arg Gln Gln Thr Cys Pro Thr Cys Arg Met Asp Val Leu Arg Ala 325 330 335 Ser Leu Pro Ala Gln Ser Pro Pro Pro Pro Glu Pro Ala Asp Gln Gly 340 345 350 Pro Pro Pro Ala Pro His Pro Pro Pro Leu Leu Pro Gln Pro Pro Asn 355 360 365 Phe Pro Gln Gly Leu Leu Pro Pro Phe Pro Pro Gly Met Phe Pro Leu 370 375 380 Trp Pro Pro Met Gly Pro Phe Pro Pro Val Pro Pro Pro Pro Ser Ser 385 390 395 400 Gly Glu Ala Val Ala Pro Pro Ser Thr Ser Ala Ala Leu Ser Arg Pro 405 410 415 Ser Gly Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Gly Thr Ser Ala Thr Ala Ala 420 425 430 Ser Ala Thr Ala Ser Gly Pro Gly Ser Gly Ser Ala Pro Glu Ala Gly 435 440 445 Pro Ala Pro Gly Phe Pro Phe Pro Pro Pro Trp Met Gly Met Pro Leu 450 455 460 Pro Pro Pro Phe Ala Phe Pro Pro Met Pro Val Pro Pro Ala Gly Phe 465 470 475 480 Ala Gly Leu Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Leu Glu Gly His Glu Arg 485 490 495 Gln His Leu Glu Ala Arg Leu Gln Ser Leu Arg Asn Ile His Thr Leu 500 505 510 Leu Asp Ala Ala Met Leu Gln Ile Asn Gln Tyr Leu Thr Val Leu Ala 515 520 525 Ser Leu Gly Pro Pro Arg Pro Ala Thr Ser Val Asn Ser Thr Glu Gly 530 535 540 Thr Ala Thr Thr Val Val Ala Ala Ala Ser Ser Thr Ser Ile Pro Ser 545 550 555 560 Ser Glu Ala Thr Thr Pro Thr Pro Gly Ala Ser Pro Pro Ala Pro Glu 565 570 575 Met Glu Arg Pro Pro Ala Pro Glu Ser Val Gly Thr Glu Glu Met Pro 580 585 590 Glu Asp Gly Glu Pro Asp Ala Ala Glu Leu Arg Arg Arg Arg Leu Gln 595 600 605 Lys Leu Glu Ser Pro Val Ala His 610 615

Claims (48)

  1. 하기 (a) 내지 (e) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드:
    (a) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오타이드;
    (b) 서열번호 1의 염기서열의 단백질 코드영역을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (c) 서열번호 2의 아미노산 서열에 있어서 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 지니고, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오타이드;
    (d) 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드와 긴축상태에서 하이브리다이즈하고, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오타이드;
    (e) 서열번호 1의 염기서열과 70% 이상의 상동성을 지니는 염기서열로 이루어지고, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오타이드.
  2. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질의 부분 펩타이드를 코드하 는 폴리뉴클레오타이드.
  3. 제 1항 또는 제 2항의 폴리뉴클레오타이드에 의해 코드되는 단백질 또는 펩타이드.
  4. 제 3항에 있어서, 하기 (1) 내지 (3)으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 활성을 지니는 단백질 또는 펩타이드:
    (1) 만성 류마티스 관절염 환자의 혈액중에 발견되는 항체와 결합하는 활성;
    (2) 시노비올린 리간드 S1-5와 결합하는 활성;
    (3) 활막증식을 촉진하는 활성.
  5. 제 1항 또는 제 2항의 폴리뉴클레오타이드가 삽입된 벡터.
  6. 제 1항의 폴리뉴클레오타이드 또는 제 5항의 벡터를 보유하는 형질전환세포.
  7. 제 6항의 형질전환세포를 배양하고, 상기 형질전환세포 또는 그 배양상청으로부터 발현시킨 단백질 또는 펩타이드를 회수하는 공정을 포함하는 제 3항의 단백질 또는 펩타이드의 제조방법.
  8. 제 3항의 단백질 또는 펩타이드에 결합하는 항체.
  9. 제 3항의 단백질 또는 펩타이드를 포함하는, 제 3항의 단백질 또는 펩타이드를 인식하는 항체를 분석하기 위한 면역학적 분석용 시약.
  10. 제 9항에 있어서, 만성 류마티스 관절염의 진단 또는 치료효과의 판정을 목적으로 하는 것을 특징으로 하는 면역학적 분석용 시약.
  11. 제 3항의 단백질 또는 펩타이드와 반응하는 항체를 포함하는, 제 3항의 단백질을 분석하기 위한 면역학적 분석용 시약.
  12. 제 11항에 있어서, 만성 류마티스 관절염의 진단 또는 치료효과의 판정을 목적으로 하는 것을 특징으로 하는 면역학적 분석용 시약.
  13. 제 12항에 있어서, 분석해야 할 제 3항의 단백질이 활막세포에 존재하는 것을 특징으로 하는 면역학적 분석용 시약.
  14. 하기 공정을 포함하는, 생체시료 중의 제 3항의 단백질 및/또는 그 부분 펩타이드에 결합하는 항체의 측정방법:
    (1) 생체시료를 제 3항의 단백질 및/또는 그 부분 펩타이드와 접촉시키는 공정; 및
    (2) 제 3항의 단백질 및/또는 그 부분 펩타이드에 결합하는 항체를 검출하는 공정.
  15. 하기 공정을 포함하는, 생체시료 중의 제 3항의 단백질 및/또는 그 부분 펩타이드의 측정방법:
    (1) 생체시료를 제 8항의 항체와 접촉시키는 공정; 및
    (2) 제 3항의 단백질 및/또는 그 부분 펩타이드에 결합하는 제 8항의 항체를 검출하는 공정.
  16. 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 또는 그 상보사슬에 상보적인 15 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  17. 하기 공정을 포함하는, 생체시료 중의 제 1항 또는 제 2항의 폴리뉴클레오타이드의 측정방법:
    (1) 생체시료를 제 16항의 폴리뉴클레오타이드와 접촉시키는 공정; 및
    (2) 제 1항 또는 제 2항의 폴리뉴클레오타이드에 하이브리다이즈하는 제 16항의 폴리뉴클레오타이드를 검출하는 공정.
  18. 제 16항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 제 1항 또는 제 2항의 폴리뉴클레오타이드의 측정용 키트.
  19. 제 3항의 단백질 또는 상기 단백질을 코드하는 유전자의 발현을 지표로 상기 단백질을 발현하는 세포를 검출 또는 분리하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 세포가 류마티스 활막세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 19항에 있어서, 세포가 미분화 간엽계 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 8항의 항체를 포함하는, 제 3항의 단백질을 발현하는 세포의 검출 또는 분리용 시약.
  23. 하기 공정을 포함하는, 만성 류마티스 관절염의 검출방법에 있어서, 만성 류마티스 관절염의 마커가 제 1항의 폴리뉴클레오타이드, 제 3항의 단백질, 제 3항의 펩타이드, 제 3항의 단백질에 결합하는 항체 및 제 3항의 펩타이드에 결합하는 항체로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 마커인 것을 특징으로 하는 방법:
    i) 피검자의 생체시료 중에 존재하는 만성 류마티스 관절염의 마커를 검출하는 공정; 및
    ii) 공정 i)의 검출결과를 만성 류마티스 관절염와 관련시키는 공정.
  24. 제 23항에 있어서, 생체시료가 피검자의 혈액이고, 만성 류마티스 관절염의 마커가 제 3항의 단백질에 결합하는 항체 및/또는 제 3항의 펩타이드에 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 23항에 있어서, 생체시료가 피검자의 활막조직 또는 활막세포이고, 만성 류마티스 관절염의 마커가 제 1항의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 제 3항의 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 하기 공정을 포함하는, 피검화합물의 제 3항의 단백질 또는 펩타이드와 결합하는 활성의 검출방법:
    a) 피검화합물을 제 3항의 단백질 또는 펩타이드와 접촉시키는 공정; 및
    b) 피검화합물과 상기 단백질 또는 펩타이드와의 결합을 관찰하는 공정.
  27. 하기 공정을 포함하는, 제 3항의 단백질 또는 펩타이드와 결합하는 활성을 지니는 화합물의 스크리닝 방법:
    a) 제 26항의 방법에 의해 피검화합물의 제 3항의 단백질 또는 펩타이드에 대한 결합활성을 검출하는 공정; 및
    b) 대조와 비교하여 상기 결합활성이 높은 피검화합물을 선별하는 공정.
  28. 하기 공정을 포함하는, 제 3항의 단백질과 그 리간드와의 결합을 저해하는 활성의 검출방법:
    a) 피검화합물 존재하에서 제 3항의 단백질 또는 펩타이드와 그 리간드를 접촉시키는 공정; 및
    b) 상기 단백질 또는 펩타이드에 결합하는 리간드 및/또는 피검화합물을 검출하는 공정.
  29. 제 28항에 있어서, 리간드가 시노비올린 리간드 S1-5인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 하기 공정을 포함하는, 제 3항의 단백질과 그 리간드와의 결합을 저해하는 화합물의 스크리닝 방법:
    a) 제 28항의 방법에 의해 피검화합물의 제 3항의 단백질과 그 리간드와의 결합을 저해하는 활성을 검출하는 공정; 및
    b) 대조와 비교하여 상기 저해활성이 높은 피검화합물을 선별하는 공정.
  31. 하기 공정을 포함하는, 피검화합물의 제 3항의 단백질에 의한 신호 전달을 조절하는 활성을 검출하는 방법:
    a) 상기 단백질의 리간드의 존재하 또는 부존재하에서 피검화합물과 상기 단백질을 접촉시키는 공정; 및
    b) 상기 단백질을 매개한 신호 전달을 검출하는 공정.
  32. 하기 공정을 포함하는, 제 3항의 단백질에 의한 신호 전달을 조절하는 활성을 지니는 화합물의 스크리닝 방법:
    a) 제 31항의 방법에 의해 피검화합물의 상기 단백질에 의한 신호 전달을 조절하는 활성을 검출하는 공정; 및
    b) 대조와 비교하여 상기 조절의 활성이 높은 피검화합물을 선별하는 공정.
  33. 하기 공정을 포함하는, 제 1항의 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하는 활성의 검출방법에 있어서,
    a) 피검화합물의 존재하에서 제 1항의 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 세포 를 배양하는 공정; 및
    b) 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현 레벨을 측정하는 공정.
  34. 하기 공정을 포함하는, 제 1항의 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하는 화합물의 스크리닝 방법:
    a) 제 33항의 방법에 의해 피검화합물의 제 1항의 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하는 활성을 검출하는 공정; 및
    b) 대조와 비교하여 상기 활성에 차이를 지니는 피검화합물을 선별하는 공정.
  35. 제 27항의 스크리닝 방법에 의해 얻어질 수 있는 화합물을 유효성분으로 함유하는 시노비올린 자극제.
  36. 제 30항의 스크리닝 방법에 의해 얻어질 수 있는 화합물을 유효성분으로 함유하는 시노비올린과 시노비올린 리간드와의 결합 제해제.
  37. 제 30항 또는 제 32항의 스크리닝 방법에 의해 얻어질 수 있는 화합물을 유효성분으로 함유하는 활막증식 자극제.
  38. 제 1항 또는 제 2항의 폴리뉴클레오타이드, 제 3항의 단백질 또는 펩타이드 및 제 5항의 벡터로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 성분을 유효성분으로 함유하는 의약조성물.
  39. 제 1항 또는 제 2항의 폴리뉴클레오타이드의 발현이 변화되어 있거나 또는 상기 변화를 유도할 수 있는 트랜스제닉 비인간 척추동물.
  40. 제 39항에 있어서, 제 1항 또는 제 2항의 폴리뉴클레오타이드가 외래적으로 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 비인간 척추동물.
  41. 제 40항에 있어서, 만성 류마티스 관절염 모델 동물인 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 비인간 척추동물.
  42. 내인성으로 지니는 제 1항 또는 제 2항 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드의 발현이 억제되어 있는 트랜스제닉 비인간 척추동물.
  43. 제 42항에 있어서, 다른 유전자가 넉인(knock-in)되어 있는 트랜스제닉 비인간 척추동물.
  44. 제 40항 또는 제 42항의 트랜스제닉 비인간 척추동물에서 유래되는 세포.
  45. 하기 공정을 포함하는, 제 1항 또는 제 2항의 폴리뉴클레오타이드의 내인성 프로모터의 활성을 조절하는 활성의 검출방법:
    a) 제 1항 또는 제 2항의 폴리뉴클레오타이드의 내인성 프로모터의 제어하에서 리포터 유전자를 발현할 수 있는 발현계에서 피검화합물을 접촉시키는 공정; 및
    b) 리포터 유전자의 발현 레벨을 측정하는 공정.
  46. 제 45항에 있어서, 상기 발현계가 제 43항의 트랜스제닉 비인간 척추동물 또 는 이 동물에서 유래하는 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 하기 공정을 포함하는, 제 1항 또는 제 2항의 폴리뉴클레오타이드의 내인성 프로모터의 활성을 조절하는 화합물의 스크리닝 방법:
    a) 제 45항의 방법에 의해 피검화합물의 제 1항 또는 제 2항의 폴리뉴클레오타이드의 내인성 프로모터의 활성을 조절하는 활성을 측정하는 공정; 및
    b) 대조와 비교하여 상기 활성에 차이가 있는 피검화합물을 선별하는 공정.
  48. 제 34항 또는 제 47항의 스크리닝 방법에 의해 얻어질 수 있는 화합물을 유효성분으로 함유하는 제 1항의 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하기 위한 의약조성물.
KR1020067006403A 2000-12-22 2001-12-21 활막세포 단백질 KR20060053009A (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2000405082 2000-12-22
JPJP-P-2000-00405082 2000-12-22
JPJP-P-2001-00266492 2001-06-27
JP2001266492 2001-06-27

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020037008101A Division KR100603683B1 (ko) 2000-12-22 2001-12-21 활막세포 단백질

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20060053009A true KR20060053009A (ko) 2006-05-19

Family

ID=26607318

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020067006403A KR20060053009A (ko) 2000-12-22 2001-12-21 활막세포 단백질
KR1020037008101A KR100603683B1 (ko) 2000-12-22 2001-12-21 활막세포 단백질

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020037008101A KR100603683B1 (ko) 2000-12-22 2001-12-21 활막세포 단백질

Country Status (8)

Country Link
US (1) US7632507B2 (ko)
EP (1) EP1352961B1 (ko)
JP (1) JPWO2002052007A1 (ko)
KR (2) KR20060053009A (ko)
CN (1) CN100381570C (ko)
AU (1) AU2002216399B9 (ko)
CA (1) CA2431478A1 (ko)
WO (1) WO2002052007A1 (ko)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1403639A1 (en) * 2002-09-30 2004-03-31 G2M Cancer Drugs AG Antibody tools for the diagnostic use in the medical therapy with inhibitors of histone deacetylases
WO2005016367A1 (ja) * 2003-08-13 2005-02-24 Locomogene, Inc. 造血系疾患の治療用製剤
KR20070092767A (ko) * 2003-08-20 2007-09-13 가부시키가이샤 로코모젠 시노비올린 활성 조절 작용의 검출 방법
WO2005019456A1 (ja) * 2003-08-21 2005-03-03 Locomogene, Inc. シノビオリン遺伝子のプロモーター
WO2005018675A1 (ja) * 2003-08-21 2005-03-03 Locomogene, Inc. 自己免疫疾患治療剤
AU2004281142A1 (en) * 2003-10-20 2005-04-28 Locomogene, Inc. Method of inhibiting secretase activity
WO2005061007A1 (ja) * 2003-12-24 2005-07-07 St. Marianna University School Of Medicine 癌の抑制方法
US20080039409A1 (en) * 2003-12-24 2008-02-14 Locomogene, Inc. Method of Suppressing Cancer
JP2007104901A (ja) * 2004-01-16 2007-04-26 Astellas Pharma Inc 関節リウマチ治療薬のスクリーニング法
US20070219150A1 (en) * 2004-02-06 2007-09-20 Locomogene, Inc. Nerve Cell Differentiation Inducer
US20070238677A1 (en) * 2004-03-17 2007-10-11 Locomogene, Inc. Pharmaceutical Composition Containing Hshrd3
CN1934256A (zh) * 2004-03-26 2007-03-21 株式会社洛科摩基因 针对滑膜蛋白基因启动子的诱杀核酸
JPWO2005118841A1 (ja) * 2004-06-02 2008-04-03 株式会社ロコモジェン シノビオリンのユビキチン化のアッセイ及びスクリーニングへの利用
EP1780221A4 (en) * 2004-07-02 2007-10-03 Locomogene Inc ANTI-SYNOVIOLIN ANTIBODY
US20090276863A1 (en) * 2004-07-02 2009-11-05 Toshihiro Nakajima Protein formulations comprising s1-5
WO2006004066A1 (ja) * 2004-07-02 2006-01-12 Locomogene, Inc. S1-5を含有するタンパク質製剤
WO2006022457A1 (en) * 2004-08-26 2006-03-02 Locomogene, Inc. Synoviolin transgenic flies
FR2882763B1 (fr) * 2005-03-01 2007-05-18 Biomerieux Sa Procede pour le pronostic d'une reponse a un traitement
WO2006135109A1 (ja) * 2005-06-16 2006-12-21 Locomogene, Inc. シノビオリンのホモオリゴマー形成阻害を利用した増殖性疾患治療法
JPWO2006137515A1 (ja) * 2005-06-23 2009-01-22 株式会社ロコモジェン シノビオリンの機能阻害ポリペプチドを有効成分とする癌治療剤
JPWO2006137514A1 (ja) * 2005-06-23 2009-01-22 学校法人 聖マリアンナ医科大学 シノビオリンの発現もしくは機能阻害物質を有効成分とする癌治療剤、および癌治療剤のスクリーニング方法
JP2009155204A (ja) * 2005-12-20 2009-07-16 Locomogene Inc アレルギー性疾患用医薬組成物
JP4934397B2 (ja) * 2006-10-19 2012-05-16 学校法人順天堂 トランスジェニック非ヒト動物
US20090136465A1 (en) 2007-09-28 2009-05-28 Intrexon Corporation Therapeutic Gene-Switch Constructs and Bioreactors for the Expression of Biotherapeutic Molecules, and Uses Thereof
WO2010029435A1 (en) 2008-09-12 2010-03-18 Isis Innovation Limited Pd-1 specific antibodies and uses thereof
WO2012176860A1 (ja) 2011-06-22 2012-12-27 Nakajima Toshihiro 体重調節作用を有する物質をスクリーニングするための方法
JP2014039516A (ja) * 2012-08-23 2014-03-06 Kagoshima Univ シノビオリンプロモーターを含む増殖制御型ウイルスベクター
JP6230546B2 (ja) * 2012-12-26 2017-11-15 中島　利博 肥満症の予防及び治療作用を有する化合物のスクリーニング方法
CN104422761A (zh) * 2013-09-09 2015-03-18 李立 成纤维样滑膜细胞在制备类风湿关节炎诊断试剂中的应用
JP2017112836A (ja) * 2014-04-22 2017-06-29 中島　利博 骨粗鬆症モデル動物の作成方法
CN107271656B (zh) * 2016-04-08 2018-06-01 北京爱普拜生物技术有限公司 一种蛋白质免疫印迹膜再生液
US20190255117A1 (en) 2016-10-31 2019-08-22 Biomimetics Sympathies Inc. Synoviolin expression inhibitor containing mesenchymal stem cell or culture supernatant thereof

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998045436A2 (en) 1997-04-10 1998-10-15 Genetics Institute, Inc. SECRETED EXPRESSED SEQUENCE TAGS (sESTs)
JP2001518793A (ja) * 1997-04-10 2001-10-16 ジェネティックス・インスチチュート・インコーポレーテッド 分泌発現配列タグ（ｓＥＳＴｓ）
US6262333B1 (en) 1998-06-10 2001-07-17 Bayer Corporation Human genes and gene expression products
AU3395900A (en) 1999-03-12 2000-10-04 Human Genome Sciences, Inc. Human lung cancer associated gene sequences and polypeptides
EP1244683A4 (en) * 1999-11-12 2005-01-12 Human Genome Sciences Inc 21 HUMAN SECRETED PROTEINS
WO2005016367A1 (ja) 2003-08-13 2005-02-24 Locomogene, Inc. 造血系疾患の治療用製剤
KR20070092767A (ko) 2003-08-20 2007-09-13 가부시키가이샤 로코모젠 시노비올린 활성 조절 작용의 검출 방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR20030074664A (ko) 2003-09-19
CN1491280A (zh) 2004-04-21
EP1352961A4 (en) 2004-06-16
CA2431478A1 (en) 2002-07-04
EP1352961A1 (en) 2003-10-15
US20040152871A1 (en) 2004-08-05
JPWO2002052007A1 (ja) 2004-04-30
KR100603683B1 (ko) 2006-07-20
AU2002216399B9 (en) 2005-12-01
EP1352961B1 (en) 2018-06-27
CN100381570C (zh) 2008-04-16
WO2002052007A1 (fr) 2002-07-04
AU2002216399B2 (en) 2005-11-24
US7632507B2 (en) 2009-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100603683B1 (ko) 활막세포 단백질
US7803920B2 (en) ECAT16 gene expressed specifically in ES cells and utilization of the same
ES2361639T3 (es) Proteína específica de células pancreáticas beta de los islotes de langerhans y sus aplicaciones.
Adell et al. Isolation and characterization of two T-box genes from sponges, the phylogenetically oldest metazoan taxon
JP4035151B2 (ja) 滑膜細胞タンパク質
US20100015654A1 (en) Negative regulation of NK cell functions by EAT-2, a sap-related adaptor expressed in innate immune cells
JP4035152B2 (ja) 滑膜細胞タンパク質
JP2007325595A (ja) 滑膜細胞タンパク質
WO2004048565A1 (ja) アポトーシス関連蛋白質およびその用途
JP4488720B2 (ja) アポトーシス関連蛋白質およびその用途
EP1228209B1 (en) &#34;insulin-responsive sequence dna binding protein-1&#34; (irsdbp-1), gene encoding it and uses thereof
US20070298026A1 (en) Methods for Identifying Treatment and Inducing Infertility Using Smc1-Beta
US20090210954A1 (en) Genes
JP4302167B2 (ja) 細菌ｄｎａを特異的に認識する受容体タンパク質
US20100034788A1 (en) Method for diagnosing and treating bone-related diseases
JP2004075569A (ja) Ｉｌ２０受容体およびｉｌ２０の新規用途
US20090233986A1 (en) Methods and compositions for using sax2
US20050130887A1 (en) Genetic sequence related to bone diseases
JP2004203868A (ja) Ｅｄｇ受容体の新規用途
JPWO2005016367A1 (ja) 造血系疾患の治療用製剤
JP2003219880A (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
JP2001048803A (ja) 医 薬
JP2003219890A (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
WO2002101034A1 (en) Leptin-induced gene
JP2001050951A (ja) Ｃｄ１００を用いるスクリーニング方法

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E601 Decision to refuse application