KR20070039128A - 시노비올린 형질전환 파리 - Google Patents

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KR20070039128A
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가부시키가이샤 로코모젠
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Abstract

본 발명은 시노비올린을 인코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환 파리를 제공한다.

Description

시노비올린 형질전환 파리{SYNOVIOLIN TRANSGENIC FLIES}
본 발명은 시노비올린(Synoviolin)을 인코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환 파리에 관한 것이다.
류머티즘성 관절염(RA)은 전세계적으로 약 1%의 유병률을 갖는 가장 통상적인 관절 질환 중의 하나이다 (Harris 1990; Feldmann et al. 1996). 상기 질환의 만성적인 본질은 진행성 관절 파괴로 나타나며, 이는 심각한 운동 장애 및 삶의 질의 악화로 이어진다. 그것의 병인을 밝히는 데 있어서 상당한 진보가 있어온 반면, RA의 정확한 원인은 여전히 잘 이해되지 않고 있다. 최근에, 사회 상에서 근골격 질환의 부담은 세계적으로 인식되고 있으며, RA는 사회에 근골격 장애의 사회적 및 재정적 비용을 감소시키기 위해 2000년에 세계보건기구(WHO)에 의해 시작되었던, 골 및 관절 시대 (Bone and Joint Decade)에서 가장 중요한 질환 중 하나로 정의된다 (http://www.bonejointdecade.org/). 따라서, 현재 증상의 치료뿐만 아니라, 근본적인 치료의 개발이 필요하다.
RA의 임상적 특성은 윤활세포(synovial cell)의 과성장과 연관된 전신 관절의 만성적 염증을 포함하며, 이는 결국 관절에서 연골 및 골 파괴를 야기한다 (Schett et al. 2001; Aarvak and Natvig 2001). 염증은 염증세 포(inflammatory cell)에 의해 조절되는 시토킨(cytokine)의 활성으로부터 야기된다고 생각된다 (Arend 2001). 염증의 경과 동안, 활성화된 포식세포는 종양괴사인자 α (TNFα), 인터루킨 (IL)-1, 및 IL-6 을 생성한다. 상기 시토킨은 번갈아 윤활세포의 과성장을 자극하여, 판누스(pannus)라고 불리는 윤활조직 덩어리를 형성하고, 이는 파골세포(osteoclast) 활성 및 단백질분해효소 생성을 통해 골 및 연골에 침입한다 (Tak and Bresnihan 2000; Hofbauer and Heufelder 2001; Kaneko et al. 2001; Rehman and Lane 2001; Szekanecz and Koch 2001). RA는 자가면역 질환으로 고려되기 때문에, 염증을 표적으로 하는 의학적 치료가 적용되어 왔다. 그러나, TNFα 차단 치료는 상기 질환의 완전한 완화에 이르게 하지 못하며, RA를 갖는 환자의 약 25%가 상기 치료에 반응하지 않는다는 것이 보고되었다 (Green 2000; Clair 2002). 따라서, RA의 발병기전은 염증만에 의해서는 모든 환자를 설명할 수 없다. 즉, 염증이 후속의 윤활 과다증식을 야기하는지 또는 1차적인 자발적 윤활세포 증식이 염증을 유도하는지는 명백하지 않다. 어떤 경우에도, 윤활세포가 RA에서 중요한 역할을 한다는 데에는 통상적으로 의견이 일치한다.
상기 개념에 기초하여, RA에서 윤활세포의 병원성 역할을 명료하게 하기 위하여 우리는 상기 세포에 초점을 맞춘 일련의 실험들을 수행해왔다. 첫째, 우리는 류머티즘 윤활세포들(RSCs)을 클로닝(cloning) 하는 데 성공했으며, 상기 세포가 배양에서 비정상의 시토킨 생성과 함께 "무한증식 전환 세포(immortalized transformed cells)"와 같은 자율 증식 성질을 가질 수 있음을 발견하였다 (Goto et al. 1987; 1990). RSC를 연구하는 동안, 본 발명자들은 유행성 인간 레트로바이러스(retrovirus) 중의 하나인 인간 T 세포 백혈병 바이러스 유형 Ⅰ(HTLV-Ⅰ)이 관절증(arthropathy)을 일으킬 수 있음을 발견하였다. 또한 본 발명자들은 이것이 RA의 원형이라고 제안하였고, 관절증과 연관된 HTLV-Ⅰ(HAAP)이라고 명명하였다 (Kitajima et al. 1991). 또한, 우리는 바이러스 변형 유전자인 tax가 HAAP를 야기하며, 그의 생성물인 pp40Tax는 과발현 쥐에서 뿐만 아니라 환자에서도 윤활세포를 RCS로 변형할 수 있음을 확인하였다 (Iwakura et al. 1991; Nakajima et al. 1993; Aono et al. 1998). 그러나, pp40Tax의 발현은 인간 RSC에서 관찰되지 않는다. 상기 데이터는 HAAP 윤활세포에서의 pp40Tax와 같이, RSC에 있어서 작용적으로 동일한 내인성 유전자 생성물을 결정하도록 우리를 고무시켰다.
RSC에 대해 특이한 분자를 분리하기 위해서, 우리는 항-RSC 항체를 사용함으로써 RSC의 인간 cDNA 라이브러리의 면역선별(immunoscreening)을 실시하였다. 결국, 우리는 E3 유비퀴틴 연결효소(ubiquitin ligase)인 '시노비올린'을 클로닝하였다.
상기 분자의 역할을 조사하기 위하여, 우리는 드로소필라(Drosophila) 시노비올린을 과발현하는 형질전환 파리를 만들어냈다.
또한, 시노비올린은 예상외로 배양된 포유류 세포에서 p53의 활성을 억제한다. 집중적인 노력에도 불구하고, 포유류 세포에서의 복합체 p53 네트워크를 전부 이해하기에는 힘들었다. 더욱이, 배양세포로부터 수득한 상기 정보의 다수는 전체 유기체의 맥락에서 p53의 생리학적 작용을 전적으로 반영할 수 없다.
본 발명의 목적은 시노비올린을 인코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환 파리를 제공하는 것이다. 상기 목적의 해결을 향한 광범위하고 집중적인 연구의 결과로써, 본 발명자들은 형질전환 파리를 만들어내는데 성공하였다. 본 발명자들은 파리-유전학적 접근법을 사용하였고, dsyno가 시험관 내에서(in vitro) p53의 드로소필라 동족체(Dmp53)를 유비퀴틴화할 수 있음을 처음으로 확인하였다. 본 발명은 하기에 설명된 바와 같다.
(1) 시노비올린(Synoviolin)을 인코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환 파리.
(2) (1)에 있어서, 파리가 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)인 형질전환 파리.
(3) (1)에 있어서, 파리가 눈에서의 가시성 결손형 및/또는 날개 결손형을 나타내는 형질전환 파리.
(4) (3)에 있어서, 눈에서의 가시성 결손형이 탈색, 거칠음 및 광택있는 눈으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 형질전환 파리.
(5) (3)에 있어서, 날개 결손형이 주름진 날개, 구부러진 날개, 톱니모양 및 주머니모양으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 형질전환 파리.
(6) (1)에 있어서, 파리가 p53의 세포 내 핵으로의 이동 억제를 나타내는 형질전환 파리.
(7) 시노비올린을 인코딩하는 유전자를 파리의 게놈(genome)으로 도입하는 것을 포함하는 파리에서의 시노비올린을 발현하는 방법.
(8) 하기를 포함하는, 시노비올린 발현을 억제하는 활성을 갖는 화합물을 선별하는 방법 :
(a) (1)의 형질전환 파리를 후보 화합물에 접촉시키는 단계 ; 및
(b) 후보 화합물과 접촉하지 않은 (1)의 상기 파리의 표현형과 비교하여, (1)의 상기 파리의 표현형에서의 변화를 검정하는 단계.
(9) 하기를 포함하는, 항종양 약물로써 유용한 화합물을 선별하는 방법 :
(a) (1)의 형질전환 파리를 후보 화합물에 접촉시키는 단계 ; 및
(b) 후보 화합물과 접촉하지 않은 (1)의 상기 파리의 표현형과 비교하여, (1)의 상기 파리의 표현형에서의 변화를 검정하는 단계.
(10) (8) 또는 (9)에 있어서, 파리가 눈에서의 가시성 결손형 및/또는 날개 결손형을 나타내는 방법.
(11) (10)에 있어서, 눈에서의 가시성 결손형이 탈색, 거칠음 및 광택있는 눈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 방법.
(12) (10)에 있어서, 날개 결손형이 주름진 날개, 구부러진 날개, 톱니모양 및 주머니모양의 날개로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 방법.
(13) (8) 또는 (9)에 있어서, 파리가 p53의 세포 내 핵으로의 이동 촉진을 나타내는 방법.
(14) (8) 또는 (9)에 있어서, 표현형이 (1)의 형질전환 파리의 세포 또는 조직에서 p53의 생물학적 및/또는 병리학적 발현 신호인 방법.
(15) 세포에서 시노비올린의 활성을 억제하는 것을 포함하는, p53의 활성을 발현하는 방법.
(16) 하기 단계를 포함하는, 표적 세포 또는 조직에서 p53의 조절 작용을 분석하는 방법 :
(a) (1)의 형질전환 파리로부터 제조된 세포 또는 조직에서 시노비올린 발현을 억제하는 단계 ;
(b) 상기 표적 세포 또는 조직에서 p53의 생물학적 및/또는 병리학적 발현 신호를 검출하여 표적 표현형을 수득하는 단계 ; 및
(c) 시노비올린의 발현이 억제되지 않은 상기 세포 또는 조직의 표현형과 비교하여 상기 세포 또는 조직의 표적 표현형에서의 변화를 검정하는 단계.
(17) (16)에 있어서, p53이 항종양 활성을 유도하는 조절 작용을 갖는 방법.
(18) 하기 단계를 포함하는, 세포 자멸(apoptosis) 또는 세포 증식을 증강시키는 활성을 갖는 화합물을 선별하는 방법 :
(a) (1)의 형질전환 파리를 후보 화합물과 접촉시키는 단계 ; 및
(b) 후보 화합물과 접촉하지 않은 (1)의 상기 파리의 표현형과 비교하여, (1)의 상기 파리의 표현형에서의 변화를 검정하는 단계.
(19) 하기 단계를 포함하는, 세포 자멸 또는 세포 증식을 억제하는 활성을 갖는 화합물을 선별하는 방법 :
(a) (1)의 형질전환 파리의 우성 네거티브 형을 후보 화합물과 접촉시키는 단계 ; 및
(b) 후보 화합물과 접촉하지 않은 (1)의 파리의 상기 우성 네거티브 형의 표현형과 비교하여, (1)의 파리의 상기 우성 네거티브 형의 표현형에서의 변화를 검정하는 단계.
(20) (19)에 있어서, (1)의 형질전환 파리의 우성 네거티브 형이 SEQ ID NO:2에서 보여지듯이 305번째 아미노산 잔기에서 시스테인이 세린으로 치환된 폴리펩티드를 포함하는 방법.
(21) (19)에 있어서, 파리가 눈에서의 가시성 결손형 및/또는 날개 결손형을 나타내는 방법.
(22) (21)에 있어서, 눈에서의 가시성 결손형이 광택있는 눈인 방법.
(23) (21)에 있어서, 날개 결손형이 주름진 날개 및 구부러진 날개로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 방법.
본 발명을 실시하기 위한 최선의 형태
하기에서, 본 발명은 자세히 설명될 것이다.
여기에서 인용되는 모든 특허출원, 특허, 문헌 및 웹사이트 참조문은 그 전체로써 참조에 의해 본 발명에 포함된다.
본 발명은 드로소필라 시노비올린(dsyno)을 인코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환 파리에 관한 것이다. dsyno의 과발현은 날개 및 눈에서 가시성 표현형을 야기시킨다. 이와 반대로, dsyno(C305S)의 우성 네거티브 형의 과발현은 파리에서 어떤 가시성 표현형도 야기시키지 않는다. 따라서, 본 발명의 형질전환 파리는 dsyno 변경인자(modifier)의 선별을 위한 모델 파리로서 사용될 수 있다.
나아가, dsyno 및 p53의 드로소필라 동족체 (Dmp53)는 서로 상호작용하고, dsyno가 Dmp53에 대한 주된 인자로 작용한다. 그러므로, dsyno를 인코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환 파리는 항암 약물로써 유용한 화합물의 선별을 위한 모델 파리로서 사용될 수 있다.
1. 정의
여기에서 사용되는 "형질전환" 유기체는 그것의 게놈으로 삽입된 여분의 유전 물질을 지녀왔던 유기체를 말한다. 여기에서 사용되듯이, "형질전환 파리"는 그들의 게놈으로 무작위로 삽입된 동일하거나 또는 상이한 유기체로부터의 DNA 서열을 포함하는 드로소필라 멜라노가스터의 배아, 유충 및 성충 형을 포함한다. 드로소필라 멜라노가스터가 바람직하지만, 드로소필라 속(屬)의 임의의 파리라도 본 발명에 사용될 수 있다고 고려된다.
여기에서 사용되듯이, 형질전환 유전자(transgene)의 "이소성(ectopic)" 발현은 정상적으로 발현되는 곳이 아닌 조직 또는 세포 또는 특정 발생 단계에서의 형질전환 유전자의 발현을 말한다.
여기에서 사용되듯이, "표현형"은 유전적 구성 및 환경의 영향 모두에 의해 결정되는 유기체의 관찰가능한 물리적 또는 생화학적 특징을 말한다.
여기에서 사용되듯이, 용어 "발현 조절 서열" 또는 "드라이버"는 프로모터 (promoter) 및 인핸서(enhancer)를 말한다. 용어 "프로모터"는 전사 (transcription)의 개시 동안, 직접적 또는 간접적으로 인식되어지고, DNA-의존 RNA 중합효소(polymerase)에 의해 결합되며, 인핸서 요소를 포함하는 DNA 서열을 말한다. 본 발명에 사용되는 인핸서는 효모 Gal4 전사 조절인자에 의해 활성화되는 UAS 요소를 포함한다. 여기에서 사용되는 "UAS" 요소는 GAL-4 전사 활성화제에 의해 인식되는 업스트림(upstream) 활성화 서열을 말한다.
용어 "전사 인자" 는 진핵생물에서 전사를 개시 또는 조절하기 위해 필요한 임의의 단백질을 말한다.
여기에서 사용되듯이, "조절" 파리는 조절 유충 또는 파리가 표현형의 변경에 대해 시험되어질 돌연변이를 운반하지 않는다거나, 또는 후보 화합물에 주입되지 않는다는 점을 제외하고, 본 발명의 방법에서 사용되는 유충 또는 파리와 같은 인자형(genotype)을 가진 유충 또는 파리를 말한다.
2. 시노비올린
본 발명에 사용되는 시노비올린은 E3 유비퀴틴 결합효소 (E3 ubiquitin ligase)이며, RA 환자 안의 윤활세포에서 발견된다. 본 발명의 시노비올린의 활성은 자동-유비퀴틴화 활성을 의미한다.
시노비올린은 효모로부터 인간까지 매우 보존되어 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 드로소필라 시노비올린(dsyno)이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 드로소필라 멜라노가스터로부터 유도된 dsyno 유전자, CG1937이 사용될 수 있다. 드로소필라 시노비올린(dsyno) 유전자, CG1937은 포유류의 시노비올린과 가장 높은 상동성(63%)을 갖는 포유류 시노비올린의 파리 동족체이다. 이는 드로소필라 유전자 간에 파리 기재 배(blast) 싸이트 (http://flybase.bio.indiana.edu/blast/)에서 블라스트피(blastp)(단백질-단백질 배)를 통해 확인되었다. 또한, 유비퀴틴 결합효소의 활성 중심인 CG1937의 고리 영역(RING domain)은 매우 보존되어 있다 (82%). 따라서, 상기 유전자는 E3 유비퀴틴 결합효소로서 작용할 수 있다. 드로소필라 시노비올린(dsyno) 유전자, CG1937의 뉴클레오티드 서열, 및 상기 유전자에 의해 인코딩된 아미노산의 서열은 각각 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2에서 보여진다.
본 발명에서, dsyno 유전자는 파리의 게놈 라이브러리로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 원하는 클론은 부합법(hybridization method)에 의해 박테리아 인공 염색체(BAC)로부터 수득할 수 있으며, PCR 방법 등에 의해 수득할 수 있다.
드로소필라 시노비올린(dsyno) 유전자는 매우 엄격한 조건 하에서 SEQ ID NO:1에서 보여지는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 DNA에 상보적인 DNA를 혼성시킬 수 있는 임의의 DNA일 수 있으며, 시노비올린의 활성을 갖는다. 부합법은 공지된 방법 또는 상기 방법의 변경에 의해, 예를 들어, Molecular Cloning, 제 2판 (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)에서 설명된 방법에 따라 실시될 수 있다. 여기에서 사용된 매우 엄격한 조건은, 예를 들어, 약 48 내지 68℃의 온도에서 1-2 × SSC 및 O.1-O.5 % SDS의 조건이다.
3. 형질전환 파리
본 발명은 시노비올린을 인코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환 파리에 관한 것이다. 사용될 수 있는 파리의 예는 드로소필리다(Drosophilidae) 과(科)의 일원, 바람직하게는, 드로소필라 멜라노가스터를 포함한다. 본 발명은 그것의 게놈 안에 시노비올린을 함유하는 폴리펩티드(SEQ ID NO:2)를 인코딩하는 DNA 서열(SEQ ID NO:1)을 포함하는 형질전환 파리를 개시한다. 상기 DNA 서열은 조직-특이 발현 조절 서열, 예를 들어 프로모터 부위 또는 업스트림 활성화 서열(UAS)에 실시가능하도록 연결되어 있으며, 이용되는 발현 시스템에 의존한다. 상기 발현 조절 서열은 눈, 날개, 다리 및 평균체(haltere)와 같은 기관에 특이성이 있는 것들을 포함한다. 상기 조직 특이성 조절 서열의 조절 하에서, 인코딩된 펩티드는 전사되어, 검출할 수 있는 수준의 dsyno 펩티드로 번역되며, 파리에서 변경된 표현형을 야기하는 mRNA를 형성한다. 상기 표현형에서의 변화를 검정함으로써, 상기 파리는 시노비올린의 억제 경로에 영향을 줄 수 있고, p53 및 시노비올린 간의 상호작용의 분자 및 생화학 메카니즘으로의 통찰력을 제공할 수 있는, 유전자 또는 화합물을 식별하기 위해 사용될 수 있다.
형질전환 드로소필라를 포함하는 형질전환 파리를 수득하는 방법은 해당 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 트랜스포메이션을 중재하는 P-요소에 대해 통상적으로 사용되는 참조문헌은 1986년의 Spradling이다. EP 원소 기술은 효모 Gal4 전사 활성화제 및 UAS 서열을 이용하는 이성분 시스템을 말하며, 이는 내인성 드로소필라 유전자의 전사를 이소(異所)적으로 조절하는데 사용된다. 상기 기술은 하기에 설명되어 있다 : Brand and Perrimon, 1993.
본 발명을 실시함에 있어서, 분자 생물학 및 재조합 DNA의 많은 통상의 기술들이 사용된다. 상기 기술은 잘 알려져 있고, 예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology , Volumes I, II , and III , 1997 (F. M. Ausubel ed.); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual , Second Edition , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; DNA Cloning : A Practical Approach , Volumes I and II , 1985 (D. N. Glover ed.); A Practical Guide to Molecular Cloning ; the series , Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); 에 설명되어 있다. 잘 알려진 드로소필라 분자 유전학 기술은, 예를 들어, Robert, D. B., Drosophila , A Practical Approach (IRL Press, Washington, D.C., 1986)에서 발견될 수 있다. 파리군체(flystocks)의 설명은 http://flybase.bio.indiana.edu. 의 파리 기재 데이터베이스에서 발견될 수 있다.
1) 재조합 벡터(recombinant vector)의 제조
통상적인 발현 조절 시스템은 본 발명의 dsyno 펩티드를 포함하는 관심 단백질의 이소 발현을 달성하기 위해 사용될 수 있다. 상기 발현은 생화학 경로의 교란 및 변경된 표현형의 발생으로 도출될 수 있다. 하나의 상기 발현 조절 시스템은 조직-특이적으로 발현된 유전자, 예를 들어 프로모터 또는 인핸서의 발현 조절 서열에 대한 DNA 서열의 직접적인 융합을 포함한다. 사용될 수 있는 다른 발현 조절 시스템은 이성분 Gal4-전사 활성화 시스템이다.
Gal4 시스템은 효모 전사 활성화제 Gal4를 사용하여, 조직 특이 방법으로 관심 유전자의 발현을 유도한다. 상기 Gal4 유전자는 통상적인 트랜스포메이션 시스템을 사용하여 파리 게놈으로 임의로 주입되었고, 따라서 일시적이고 조직-특이적인 방법으로 발현을 유도하는 게놈의 인핸서의 조절 하에 있어왔다. 파리의 개별적인 품종이 생성되었고, 이는 "드라이버"라고 불리며, 그들의 주입물을 운반한다.
Gal4 시스템에서, 관심 유전자는 트랜스포메이션 벡터로 클론되고, 따라서 이의 전사는 UAS 서열 (Upstream Activating Sequence), Gal4-반응 요소의 조절 하에 있다. 관심 서열의 UAS-유전자를 갖는 파리의 품종이 조직 특이 인핸서의 조절 하에 Gal4 유전자를 발현하는 파리의 품종과 교배될 때, 상기 유전자는 조직 특이 패턴으로 발현될 것이다.
성충 조직에서 쉽게 볼 수 있고, 따라서 유전적 선별에 사용될 수 있는 표현형을 생성하기 위해서, 파리의 발생의 더 이후 단계에서 발현을 유도하기 위한 Gal4 "드라이버"가 본 발명에 사용될 수 있다. 상기 드라이버를 사용하면서, 발현은 날개, 눈, 다리, 및 다른 감각기관에서 가능한 결손으로 도출될 것이다. 상기 "드라이버"는 예를 들어, Ser-Gal4(날개), MS1096-Gal4(날개), e16E-Gal4(날개), gmr-Gal4(눈) 및 pGMR-Gal4(눈)을 포함한다.
다양한 DNA의 구조는 본 발명의 형질전환 드로소필라 멜라노가스터를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 구조는 시노비올린 유전자를 포함할 수 있으며, 조직-특이 프로모터에 실시가능하도록 연결되어 있다. 상기 구조의 파리 게놈으로의 삽입은 P-요소 재조합, 상동성 재조합 또는 해당 분야의 당업자에게 알려진 다른 표준 기술을 통해 일어날 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 본 발명의 형질전환 파리는 재조합 벡터를 배아로 도입함으로써 제조된다. 재조합 벡터는 원하는 DNA를 발현 벡터로 서브 클로닝(sub-cloning)함으로써 제조된다. 재조합 벡터는 통상적인 유전 공학 기술에 의해 수득할 수 있다. 시노비올린 유전자는 적합한 프라이머를 사용하여 RT-PCR 및/또는 DNA-PCR을 실시함으로서 증폭시킬 수 있다. 필요하다면, 그들의 서열은 TA 클로닝과 같은 공지된 방법을 사용하여 확인된다. 이어서, 시노비올린 DNA 절편은 공지된 제한 효소를 사용하여 잘라낼 수 있다. 다음으로, 상기 시노비올린 절편은 공지된 벡터로 삽입될 수 있으며, 이후 제한 효소로 잘려내진 적합한 프로모터 서열은 시노비올린의 업스트림에 삽입될 수 있다.
시노비올린에 대한 발현 벡터로서, 드로소필라-유래 플라스미드, 대장균-유래 플라스미드, 고초균-유래 플라스미드, 효모-유래 플라스미드 등이 사용될 수 있다. 드로소필라-유래 플라스미드가 바람직하게 사용될 수 있다. 드로소필라-파생 플라스미드의 예는 pUAST, pUAS, pChs 및 pPTGAL을 포함한다.
2) 배아의 트랜스포메이션
본 발명의 시노비올린 DNA를 포함하는 형질전환 파리(이후에, 본 발명의 DNA 형질전환 파리로서 간략히 언급함)는 임의의 통상적인 프로토콜(protocol)을 사용하여 제조할 수 있다. 필요한 발현 패턴을 갖는 시노비올린 DNA(형질전환 유전자)의 통합(integration)을 수득하기 위해, 많은 다른 전략들이 이용될 수 있다. 통상적으로, 대상 형질전환 파리의 제조방법은 플라스미드와 같은 적합한 벡터 상에 존재하는 형질전환 유전자를 파리의 세포 또는 세포들, 예를 들어 배아의 생식세포로의 안정된 통합을 포함한다. 형질전환 유전자의 도입은 임의의 통상적인 프로토콜을 사용하여 달성할 수 있다. 미세주입법(microinjection)과 같은 적합한 프로토콜은 해당 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다 (Spradling, A.C.(1986)). 세포 내로 형질전환 유전자를 도입한 후에, 상기 형질전환 유전자는 재조합에 의해 세포의 게놈으로 안정적으로 통합된다. UAS-dsyno 형질전환 (TG) 파리는 CG1937의 EST 클론인 GH11117을 pUAST 벡터로 서브-클로닝함으로써 제조할 수 있다. GH11117은 구입할 수 있다 (Open Biosystems). 다음으로, 생성 UAS-dsyno 벡터는 미세주입법을 통해 w1118 파리의 배아로 도입될 수 있다. UAS-dsyno의 우성 네거티브 형 (dsynoDN ) 파리 (UAS-dsynoDN 파리)는 통상적인 방법에 의해 준비될 수 있다. CG1937 cDNA는 dsyno 단백질의 우성 네거티브 형을 생성할 수 있는 CG1937(C305S)로 변경될 수 있고, 상기 변경된 cDNA는 pUAS 벡터로 서브클로닝될 수 있다. C305S는 CG1937 폴리펩티드(SEQ ID NO:2)의 305번째 아미노산 잔기에서 시스테인이 세린으로 치환된 변경된 아미노산 서열을 의미한다. pUAS-dsynoDN 벡터도 또한 w1118 파리 배아로 주입될 수 있다.
3)dsyno 또는 dsynoDN 의 과발현
dsyno 또는 dsynoDN 의 발현은 적합한 시스템, 예를 들어 다양한 조직-특이 프로모터 및 인핸서를 포함하는 Gal4 드라이버를 사용하는 Gal4-UAS 시스템을 통하여 다양한 조직에서 유도될 수 있다. Gal4 드라이버 중에서, gmr - Gal4 , Ser -Gal4, MS1096 - Gal4 , 및 e16E - Gal4가 바람직하게 사용될 수 있다.
dsyno 또는 dsynoDN 의 발현은 면역염색에 의해 확인될 수 있다. dsyno의 발현은 또한 제자리부합법에 의해 확인되었다.
배아는 Ponzielli et al.(2002)에 의해 설명되었듯이 고정될 수 있다. 해부된 3번째 영 유충은 Solano et al.(2003)에 의해 설명되었듯이 고정될 수 있다. 제자리부합법은 Ponzielli et al.(2002)에 의해 설명되었듯이 실시될 수 있으며, 예를 들어, 적합한 2 세트의 프라이머를 사용하여, RNA 프로브의 합성을 위한 선형화된 DNA 주형이 성충 파리의 모든 RNA로부터 RT-PCR에 의해 제조된다는 점을 제외하고는, CG1937에 대해 특이한 딕옥시게닌(Dig)-표지된 센스(sense) 또는 안티센스(antisense) RNA 프로브(probe)를 사용한다. 제자리부합법에 의해, 예를 들어, dsyno는 드로소필라 배아의 다른 단계에서 발현된다는 것은 명백하다. 또한, dsyno의 전사체는 배아발생의 매우 이른 단계에서 또는 파리의 3번째 영 유충 단계에서 성충반에서 검출된다. 상기 신호는 편재하는 패턴으로 배아발생 동안 계속적으로 발현된다.
드로소필라의 발생 단계에서 dsyno의 발현은 RT-PCR에 의해 dsyno mRNA의 발현을 조사함으로써 확인될 수 있다. 형질전환 파리는 적합한 계까지 교배될 수 있다. 자손은 3번째 영 유충 단계에서 적합한 조건 하에 배양된다. 모든 RNA는 예를 들어, 제조업자의 지시에 따라 easy- Blue Total RNA Extraction kit (iNtRON)를 사용하여, 유충으로부터 추출된다. 이는 역전사 시스템(Promega)과 함께 실시되는 cDNA 합성 반응에서 사용된다. dsyno 및 편재되어 발현되는 드로소필라 리보좀의 단백질 유전자 rp49 mRNA의 양은 적합한 프라이머와 함께 PCR 및 겔 전기영동 분석(gel electrophoresis analysis)에 의해 검출될 수 있다. dsyno 신호는 배아로부터 성충에 이르기까지 파리의 각각 다른 발생 단계에서 측정될 수 있다. dsyno(CG1937)가 드로소필라 멜라노가스터의 모든 발생 단계 동안 편재되어 발현되었다는 것이 보여진다.
dsyno 또는 dsynoDN 형질전환 파리의 과발현은 다양한 조직, 특히, 눈 및 날개에서 가시적인 결손형을 야기시킨다. 예를 들어, 눈에서 dsyno의 발현은 탈색 또는 눈의 거칠음, 또는 광택있는 눈을 야기시킬 수 있다. 눈에서 dsynoDN 의 발현은 어떤 가시적인 표현형도 야기시킬 수 없다.
여기에서 사용되듯이, 용어 "탈색" 표현형은 홑눈 및 내부-홑눈 털의 분열로 특징지워지고, 색소 세포의 변성에 의해 야기될 수 있다.
여기에서 사용되듯이, 용어 "거칠은 눈" 표현형은 홑눈 및 내부-홑눈 털의 분열로 특징지워지고, 신경 세포의 변성에 의해 야기될 수 있다.
여기에서 사용되듯이, 용어 "광택있는 눈" 표현형은 눈의 표면이 마치 왁스로 광택낸 것처럼 반짝이고 부드럽다는 점에 의해 특징지워지고, 홑눈의 비정상적인 발달에 의해 야기될 수 있다. 상기 표현형은 해부 입체-현미경을 통해 볼 수 있다.
본 발명의 추가의 구현예에서, 날개 블레이드에서 dsyno의 발현은 날개 결손형, 예를 들어, 주름진 날개, 구부러진 날개, 주머니 모양 및 톱니 모양의 날개를 나타낸다.
여기에서 사용되듯이, 용어 "주름진 날개" 표현형은 날개가 위축되는 것과 같이 파리 날개의 비정상적인 접힘에 의해 특징지워진다.
여기에서 사용되듯이, 용어 "구부러진 날개" 표현형은 날개가 그것의 긴 모서리를 따라 위 또는 아래로 구부러진 것과 같이 파리 날개의 비정상적인 접힘에 의해 특징지워진다.
여기에서 사용되듯이, 용어 "톱니" 표현형은 날개가 그것의 모서리를 따라 톱니 모양인 것과 같이 파리 날개 모서리의 비정상적인 절단에 의해 특징지워진다.
여기에서 사용되듯이, 용어 "주머니" 표현형은 기포가 날개 내에 생성된 것과 같이 파리 날개의 비정상적인 형태에 의해 특징지워진다.
4) 세포 사멸 경로(apoptotic pathway)에 의존하는 드로소필라 시노비올린 조절 p53
dsyno가 p53의 드로소필라 상동기관(Dmp53)에 편재하고 생리학적으로 Dmp53을 물질대사 시키기 때문에, dsyno가 Dmp53에 대한 주요한 인자임이 확인되었다. Dmp53을 과발현하는 형질전환 파리는 e16E-Gal4 드라이버를 사용함으로서 생성될 수 있다. UAS-dsyno 및 UAS-Dmp53을 포함하는 형질전환 파리는 표준 공정(Spradling, 1986)에 따라 드로소필라 멜라노가스터의 배아로 재조합 DNA를 주입시켜 생성할 수 있다. dsyno 및 Dmp53의 발현은 조직-특이 프로모터 및 인핸서를 포함하는 e16E-Gal4 드라이버를 사용하여 날개 후단의 반에서 유도될 수 있다. e16E-Gal4/UAS-Dmp53; UAS-dsyno/+ 파리는 e16E-Gal4/UAS-Dmp53 암컷 및 e16E-Gal4/CyO; UAS-dsyno/TM2 수컷 사이의 교배로부터 생성할 수 있다. 또한, 각 형질전환 계가 교배될 수 있다. 그 결과, UAS-Dmp53 파리의 기포가 있는 날개 표현형만이 파리에서 dsyno의 과발현에 의해 억제된다 (도 28).
또한, Dmp53은 dsyno의 과발현에 의해 상당히 감소된다 (도 29). e16E-Gal4/UAS-Dmp53; UAS-dsyno/+ 파리의 날개반에서 Dmp53의 발현 수준이 분석되어, 하기에 설명된 것처럼 면역염색에 의해 생체내에서 Dmp53을 물질대사시키는 dsyno를 증명할 수 있다. 날개반은 PBS에서 해부되고, 적합한 완충제에 고정되며, 그리고 적합한 차단 완충제와 함께 차단될 수 있다. 고정된 날개반은 토끼 항-Dmp53 항체에서 적합한 조건 하에서 배양될 수 있다. 적합한 세척 완충제에서 세척 후에, 그것은 당나귀 항-토끼 FITC에서 적합한 조건 하에서 배양되고, 세척 완충제로 세척되며, 이어서 적합한 표본제작 용액에서 표본이 될 수 있다.
시노비올린은 파리 및 포유류 모두에서 p53의 생리학적인 조절에 영향을 미친다. p53의 조절은 아크리딘 오렌지 염색에 의해 확인될 수 있다.
p53 네트워크의 기본 성분 및 그들의 작용을 더 명확히 하기 위해 드로소필라와 같은 더 단순한 유기체에서 p53을 연구하는 것은 매우 유용하다 (Brodsky et al, 2000; Jin et al, 2000; Ollmann et al, 2000). 더욱이 상기 시스템은 또한 유기체의 맥락에서 p53 네트워크 내에 유전자-유전자 상호작용을 연구하기 위해 편리한 유전 도구를 제공한다.
4. 시노비올린의 활성 또는 항암 활성을 갖는 화합물의 선별
상기에서 논의하였듯이, 이소적으로 발현된 유전자는 dsyno 경로의 파괴에 의해 변경된 표현형을 도출할 수 있다. 동일한 dsyno 경로에서 행동하는 유전자의 돌연변이는 변경된 표현형의 변형을 야기할 것으로 예상된다. 따라서, 상기 시스템은 직접 또는 간접적으로 그것과 상호작용하는 다른 유전자의 동정(identification)뿐만 아니라, 처리된 dsyno 유전자 생성물의 작용의 명료화를 위해 매우 유용하다. dsyno 경로에 수반되는 유전자는 상기 방법으로 동정될 수 있고, 이어서 상기 유전자는 시노비올린 경로에서 비정상과 연관되고, 암을 포함하지만 여기에 국한되는 것은 아닌 질환을 유도하는 증상을 치료하기 위한 치료법의 개발을 목표로서 주어질 수 있다고 생각된다.
상기 방법은 본 발명의 형질전환 파리에 후보 화합물을 접촉시키고, 그리고나서 상기 화합물에 접촉되지 않은 조절 형질전환 파리의 표현형과 비교하여 형질전환 파리의 표현형에서의 변화를 검정하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 통상적인 방법을 사용하면서, 후보 화합물은 dsyno를 발현하는 유충에 급식될 수 있다. 그리고나서 유충은 성충 단계로 성장하고 dsyno-유도 표현형의 변화가 검정될 수 있다. 후보 화합물도 또한 성충 파리에 급식되고 표현형의 변화가 검정될 수 있다. 파리를 시험 화합물에 접촉시키기 위하여, 예를 들어, 구강 주입, 미세주사 등이 적용되고, 필요한 처리가 시험 파리의 상태, 시험 화합물의 성질 등에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 또한, 주입되는 시험 화합물의 양은 주입 경로, 시험 화합물의 성질 등에 따라 적절하게 선택될 수 있다.
따라서 동정된 화합물의 행동 메카니즘은 관심 화합물의 주입에 의해 유도된 것들과 유전적 조작에 의해 생성된 표현형을 비교함으로써 조사될 수 있다. 상기 화합물은 형질전환 파리에서 생겨난 변경된 표현형을 개량하거나 또는 악화시킬 수 있는 것을 포함한다. 알려진 유전적 변경과 연관된 것과 유사한 화합물-유도된 표현형의 발현은 유전적 변경이 영향을 미치는 동일 경로 상에서 상기 화합물이 효과가 있다는 것을 시사한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 시험 화합물이 시험 파리에 주입되고, 상기 언급된 표현형 중의 하나가 조절 파리와 비교되는 시험 파리에서 나타나게 될 때, 시험 화합물은 시노비올린의 활성을 갖는 화합물로서 선택될 수 있다.
매우 다양한 저분자량의 화합물이 선별에서 사용될 수 있다. 상기 화합물은 납 약물의 발견 또는 개발을 위해 시험되고 있는 임의의 성분을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 화합물은 수용성 또는 지용성일 수 있다. 화합물은 용액 내에 용해 또는 현탁될 수 있다. 드로소필라 내로 미세주입되는 적량 및 부피는 다양할 수 있어서, 추가의 연구를 위한 적량을 최적화하거나 또는 그의 독성 및/또는 효능에 대해 화합물을 분류시킬 수 있다.
후보 화합물의 예는 유전자, 펩티드, 단백질, 비펩티드 화합물, 합성 화합물, 발효 화합물, 세포 추출물, 식물 추출물, 동물 조직 추출물, 혈장(blood plasma) 등을 포함한다. 상기 화합물은 신규 화합물 또는 공지된 화합물일 수 있다.
상기의 선별 방법에 의해 수득되는 화합물은 염을 형성할 수 있고, 생리학적으로 수용가능한 산(예를 들어, 무기산, 유기산 등) 또는 염기(예를 들어 염기성 금속염)와 함께 염의 형태로, 바람직하게는 생리학적으로 수용가능한 산 부가 염의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 형질전환 파리에서 화합물을 선별하는 것 외에도, 상기의 화합물은 또한 질환의 시험관 내 및 다른 생체 내 모델을 이용함으로써 추가로 검정될 수 있다. 예를 들어, 수많은 세포 계들이 암의 시험관 내 모델로써 사용될 수 있고, 예를 들어, 세포 계 CCL-116을 포함하는 것이 해당 분야의 당업자에게 익숙하다. 생체내 모델도 또한 존재하며, 예를 들어, 질환의 포유류(예로서, 인간, 생쥐 또는 쥐) 모델을 포함한다.
상기 질환의 예는 류머티즘성 관절염, 암, 섬유증, 동맥경화증, 캐슬만씨 병, 다발 골수종, 크론병, 청소년성 특발성 전신 관절염, 농포 종양, 설암, 인두암, 폐암종, 유암종, 식도암, 위암, 췌장암, 담도암, 쓸개암, 십이지장암, 결장암, 간암종, 자궁암, 난소암, 고환암, 전립샘암, 신장암, 방광암, 횡문근육종, 골육종, 연골육종, 피부암, 비장암, 갑상샘암, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 성인 T-세포 백혈병 또는 악성림프종을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
p53의 드로소필라 상동기관(Dmp53)에 의해 인코딩된 단백질의 작용 또는 발현에 영향(예로서, 억제 또는 촉진)을 미칠 수 있는 화합물은 종양 또는 p53 경로의 조절에서 결손과 연관된 기타 증상을 치료하는 데에 유용할 수 있다.
본 발명의 추가의 구현예에서, dsyno는 p53의 드로소필라 상동기관(Dmp53)에 편재되어 있고, 생리학적으로 Dmp53을 물질대사 시키기 때문에, dsyno는 Dmp53에 대한 주요한 인자이다. 또한, Dmp53은 dsyno의 과발현에 의해 상당히 감소된다. 더욱이, Dmp53이 과발현되는 곳에서 발견되는 세포 사멸 세포는 dsyno의 과발현에 의해 상당히 감소된다. 따라서, 시노비올린은 파리 및 포유류 모두에서 p53의 생리학적 조절에 관계된다. 상기에서 설명하였듯이, 드로소필라와 같은 더 단순한 유기체에서 세포 사멸과 관련된 p53을 연구하여, p53 네트워크의 기본 구성 및 그의 작용을 더 명료하게 하는 것은 매우 유용하다 (Brodsky et al.,2000; Jin et al.,2000; Ollmann et al.,2000). 더욱이 상기 시스템은 또한 유기체의 맥락에서 세포 사멸과 관련된 p53 네트워크 내에 유전자-유전자 상호작용을 연구하기 위해 편리한 유전 도구를 제공한다. 또한, 세포 사멸이 세포 증식과 밀접하게 관련되기 때문에, p53 네트워크는 세포 증식과 관련된다는 것이 명백하다 (Ko et al.1996; Levin et al.1997; el-Deiry et al.1993).
따라서, 본 발명은 표적 세포 또는 조직에서 p53의 조절 작용을 분석하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다 :
(a) 본 발명의 형질전환 파리로부터 제조된 세포 또는 조직에서 시노비올린의 발현을 억제하는 단계 ;
(b) 상기 표적 세포 또는 조직에서 p53의 생물학적 및/또는 병리학적 발현 신호를 검출하여 표적 표현형을 수득하는 단계 ; 및
(c) 시노비올린의 발현이 억제되지 않은 상기 세포 또는 조직의 표현형과 비교하여 상기 세포 또는 조직의 표적 표현형에서의 변화를 검정하는 단계.
p53의 생물학적 및/또는 병리학적 신호의 각각 다른 종류를 검정함으로써, 종양 세포의 증식과 관련되는 것과 같은 p53의 작용면을 평가할 수 있다. 어떤 생물학적 및/또는 병리학적 시스템은 상기 접근을 활용하기에 특히 잘 적용되어 있다. 예를 들어, 드로소필라의 발생 생물학은 잘 특징지워져 있고, 쉽게 재생되며, 그리고 대규모 선별 방법에 적합하다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 생물학적 시스템의 예는 세포 사멸 및 세포 증식을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
유전자 발현 관찰은 예를 들어, 분화 조직의, 배아의, 또는 유충의 발생 단계를 생성하는데 사용될 수 있다. 유전자 발현의 특별한 패턴은 가까이 및/또는 멀리 관계된 단계와의 비교에 의하여 특정 단계를 위해 생성될 수 있다. 상기 패턴은 세포 또는 조직의 발생 시기결정에 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 목적, 특성, 장점 및 양상은 하기의 설명으로부터 당업자에게 명백하게 될 것이다. 그러나, 하기의 설명 및 특정 예들은 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내는 반면, 오로지 예시로써만 주어지는 것이라는 점이 이해되어야 한다. 개시된 본 발명의 의도 및 범위 내에서 다양한 변화 및 변경은 하기의 설명을 읽는 것으로부터 및 본 개시의 다른 부분을 읽는 것으로부터 해당 분야의 당업자에게 쉽게 명백하게 될 것이다.
도 1은 시험관내 자동-유비퀴틴화(auto-ubiquitination) 검정의 결과를 보여준다.
도 2는 조직-특이 Gal4 드라이버(driver)를 갖는 UAS-dsyno(GH11117) 형질전환 파리에서의 CG1937 과발현의 효과를 보여준다.
도 3은 항-Syno 항체를 갖는 드로소필라 성충반(Drosophila imaginal disc) 의 면역염색(immunostaining)의 결과를 보여준다.
도 4는 드로소필라 배아의 각각 다른 단계들에서 CG1937의 제자리부합법(in situ hybridization)의 결과를 보여준다.
도 5는 3번째 영(instar) 유충 단계에서 성충반에서의 CG1937의 제자리부합법의 결과를 보여준다.
도 6은 드로소필라의 각각 다른 발생 단계에서 CG1937의 발현의 결과를 보여준다 (RT-PCR).
도 7은 CG1937의 UTR 부위에서 2 개의 EP 선을 보여준다.
도 8은 dsyno 결실 돌연변이 제조를 위한 도식을 보여준다.
도 9는 GE27750 및 GE27750(R)에서 CG1937(dsyno)의 발현의 결과를 보여준다.
도 10은 조직-특이 Gal4 드라이버를 갖는 GE27750에서 CG1937의 과발현의 효과를 보여준다.
도 11은 gmr-Gal4; UAS-dsyno 형질전환 계(25℃)의 눈 표현형을 보여준다.
도 12는 Ser-Gal4; UAS-dsyno 형질전환 파리의 날개 표현형을 보여준다.
도 13은 gmr-Gal4; UAS-dsyno 형질전환 계(29℃)의 눈 표현형을 보여준다.
도 14는 MS1096-Gal4; UAS-dsyno 형질전환 파리의 날개 표현형을 보여준다.
도 15는 e16E-Gal4; UAS-dsyno 형질전환 파리의 날개 표현형을 보여준다.
도 16은 e16E-Gal4 드라이버를 갖는 UAS-dsyno 형질전환 파리에서 CG1937 과발현의 효과를 보여준다.
도 17은 UAS-dsyno 형질전환 파리에서 CG1937의 발현을 보여준다 (RT-PCR).
도 18은 역(Inverse) PCR에 의한 UAS-dsyno 형질전환 계의 주석을 보여준다.
도 19는 MS1096-Gal4; wg-LacZ; UAS-dsyno 파리의 유충 날개반을 보여준다.
도 20은 조직-특이 Gal4 드라이버를 갖는 CG1937 과발현의 우성 네거티브 형의 효과를 보여준다.
도 21은 e16E-Gal4; UAS-dsynoDN #12 형질전환 계의 날개 결손을 보여준다.
도 22는 Ser-Gal4; UAS-dsynoDN #12 파리의 날개 표현형을 보여준다.
도 23은 29℃에서 gmr-Gal4; UAS-dsynoDN # 12 의 눈 표현형을 보여준다.
도 24는 UAS-dsynoDN 형질전환 파리에서 CG1937(C305S)의 우성 네거티브 형의 발현을 보여준다 (RT-PCR).
도 25는 날개반(wing disc)에서 GE27750의 유사분열 클론을 보여준다.
도 26은 성충의 눈에서 GE27750의 유사분열 클론을 보여준다.
도 27은 e16E-Gal4; UAS-Dmp53 형질전환 파리의 날개 표현형을 보여준다.
도 28은 e16E-Gal4; UAS-Dmp53 형질전환 파리의 날개 표현형을 보여준다.
도 29는 항-p53 항체를 갖는 e16E-Gal4; UAS-Dmp53 형질전환 파리의 날개 표현형의 면역염색을 보여준다.
도 30은 e16E-Gal4; UAS-Dmp53 형질전환 파리의 아크리딘 오렌지 염색(acridine orange staining)을 보여준다.
본 발명은 실시예를 참조하여 하기에서 더 자세히 설명되지만, 그것에 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
실시예 1
dsyno 를 포함하는 형질전환 파리의 제조
1) 재조합 벡터의 제조
드로소필라 시노비올린(dsyno)의 유전자로써, CG1937이 사용되었다. CG1937은 파리 기재 배 싸이트 (http://flybase.bio.indiana.edu/blast/)에서 블라스트피(단백질-단백질 배)를 통해, 포유류의 시노비올린과 가장 높은 상동성(63%)을 갖는 유전자로써 발견되었다. 또한, 유비퀴틴 결합효소의 활성 중심인 CG1937의 추정상의 고리 영역(RING domain)은 매우 보존되어 있다 (82%). 따라서, 상기 유전자는 포유류 시노비올린의 파리 상동기관으로 예측되어졌고, E3 유비퀴틴 결합효소로서 작용할 수 있었다. 이어서, 드로소필라 시노비올린(dsyno)이 효소의 활성을 갖는지 조사하기 위해, 자동-유비퀴틴화 활성이 글루타치온 S-전이효소(Glutahione S-transferase) (GST)-dsyno Δ 막관통 영역 (TM)을 사용하여 분석되었다. 시험관내 자동-유비퀴틴화 검정을 위한 공정은 앞에서 설명되었다 (Amano et al., 2003). 1 ㎍의 GST-dsyno 단백질이 40 ng의 El (Affiniti-Reserch), 0.3 ㎍의 E2 (His-UbcH5c), 0.75 ㎍의 32P-표지된 유비퀴틴과 혼합되었다. 그 결과, GST-dsynoΔTM은 포유류 시노비올린과 같은 자동-유비퀴틴화 활 성을 보여주었고 (Amano et al., 2003) (도 l), 상기 활성은 dsyno의 고리 영역(C305S)에서 돌연변이에 의해 완전히 사라졌다 (도 1).
따라서, CG1937은 포유류의 시노비올린의 파리 상동기관이라는 것이 보여진다.
CG1937의 cDNA를 포함하는 EST GH11117은 Open Biosystems에서 구입하였다. CG1937(드로소필라)의 2.3 kb (~2282bp)의 cDNA는 EST GH11117로부터 EcoRI/Xho I으로 절단되었고, 그리고 pUAST 벡터 내로 서브클로닝되었다 (Brand and Perrimon, 1993).
2) 드로소필라 멜라노가스터의 트랜스포메이션
UAS-dsyno를 포함하는 형질전환 파리 (이후로는, UAS-dsyno TG 파리로써 간략히 언급함)는 해당 분야의 당업자에게 잘 알려진 표준 공정에 따라, 재조합 DNA를 1㎍/㎕ 의 농도에서 인자형 W 1118 의 드로소필라 멜라노가스터의 배아로 주입함에 의해 생성되었다 (Spradling, Drosophila : A Practical Approach, D.B. Roberts, ed., IRL Press, DC(1986), pp. 175-197). 특히, UAS-dsyno TG 파리를 위해, CG1937의 EST 클론인 GH11117이 구입되었고, pUAST 벡터 내로 서브클로닝되었다. 생성 UAS-dsyno 벡터는 미세주입을 통해 w1118 파리의 배아로 도입되었다. 40 개의 형질전환 계들이 회수되었고 안정화되었다(도 2). dsyno의 UAS-우성 네거티브 형(dsynoDN) 파리(UAS-dsynoDN 파리)를 위해, 본 발명자는 CG1937 cDNA를 dsyno 단백질의 우성 네거티브 형을 생성할 수 있는 CG1937(C305S)로 변경시켰고, 상기 변경된 cDNA는 pUAS 벡터 내로 서브클로닝되었다. pUAS-dsynoDN 벡터가 w1118 파리의 배아 내로 주입되었다. 30개의 형질전환 계들이 회수되었고 안정화되었다.
3)드로소필라에서 시노비올린의 발현
dsyno의 발현은 하기에 설명되었듯이 면역염색에 의해 확인되었다. 성충반이 PBS에서 해부되었고, 50 mM의 Tris-Cl [pH 6.8], 1 mM의 EGTA, 1%의 Triton X-100, 2 mM의 MgSO4, 150 mM의 NaCl, 2.2%의 포름알데히드의 고정 완충제에서 15분 동안 고정되었으며, 그리고 50 mM의 Tris-Cl [pH 6.8], 150 mM의 NaCl, 0.5%의 NP40, 및 5 mg/ml의 BSA의 차단 완충제를 사용하여 차단되었다. 고정된 성충반은 1: 200의 묽기의 토끼 항-시노비올린 항체에서 4℃에서 밤새 배양되었다. 50 mM의 Tris-Cl [pH 6.8], 150 mM의 NaCl, 0.5%의 NP40, 및 1 mg/ml의 BSA의 세척 완충제에서 세척 후에, 그것은 1:200의 묽기에서 당나귀 항-토끼 FITC에서 4℃에서 3 시간 동안 배양되었고, 세척 완충제로 세척되었으며, 그리고나서 5 mg/ml의 페닐에틸렌디아민, 30%의 글리세롤, 150 mM의 NaCl, 및 50 mM의 Tri-Cl [pH 6.8]의 표본제작 용액에서 표본제작되었다. 항-Syno 항체와 함께 드로소필라 성충반을 면역염색한 결과는 도.3에 보여졌다. 본 발명자에 의해 제공된 항-시노비올린 모노클로닝 항체(Amano et al. 2003)와의 면역조직염색(immunohistostaining)은 드로소필라의 성충반에서 어떤 특별한 염색 패턴도 나타내지 않았다. 상기 항체는 시노비올린의 파리 상동기관인 CG1937을 인식하지 못할 수 있다. CG1937에 대해 특이한 항-dsyno 항체는 파리에서 dsyno 단백질 발현 패턴의 조사를 위해 생성되었다.
dsyno의 발현은 하기에서 설명되었듯이 제자리배합법에 의해서도 또한 확인되었다. 배아는 Ponzielli et al. (2002)에 의해 설명되었듯이 고정되었다. 해부된 3번째 영 유충은 Solano et al. (2003)에 의해 설명되었듯이 고정되었다. 재자리배합법은 RNA 프로브의 합성을 위한 선형화된 DNA 주형이 2 세트의 프라이머를 사용하여, 성충 파리의 모든 RNA로부터 RT-PCR에 의해 제조되었다는 점을 제외하고, Ponzielli et al. (2002)에 의해 설명되었듯이 실시되었으며, CG1937에 대해 특이한 딕옥시게닌(Dig)-표지된 센스(sense) 또는 안티센스(antisense) RNA 프로브(probe)를 사용하였다.
1) 안티센스 RNA 프로브의 합성 ;
Synoviolin-AntiSense-Rev: 5' - catcatgcagctgctcttatcgtc - 3' (SEQ ID NO: 3) 및
Synoviolin-AntiSense-For-T7,5' - taatacgactcactataggggttgacatcagattgtag ggcgtc - 3' (SEQ ID NO: 4)
2) 센스 RNA 프로브의 합성 ;
Synoviolin-Sense-Rev: 5' - gttgacatca gattgtagggcgtc - 3' (SEQ ID NO: 5) 및
Snoviolin-Sense-For-T7, 5'-taatacgactcactatagggcatcatgcagctgctcttatcgtc - 3' (SEQ ID NO: 6)
드로소필라 배아의 각각 다른 단계에서 dsyno(CG1937)의 제자리부합법의 결과는 도 4에 보여졌다. dsyno의 전사체는 파리에서 배아발생의 매우 이른 단계에서 검출되었다. 상기 신호는 편재된 패턴으로 배아발생 동안 계속적으로 발현되었다. 3번째 영 유충 단계에서 성충반에서 dsyno의 제자리부합법의 결과는 도 5에 보여졌다. dsyno 전사체는 3번째 영 유충의 성충반에서 검출되었다. 눈, 더듬이, 다리, 날개반이 CG1937의 안티센스 프로브로 염색되었다. 이는 또한 유충의 뇌에서 검출되었다. 대응하는 센스 프로브가 상기의 어떤 조직도 염색시키지 않았기 때문에, 염색은 비특이적이지 않다.
드로소필라의 발생 단계에서 dsyno의 발현은 하기에서 설명되었듯이 RT-PCR에 의해 dsyno mRNA의 발현을 조사함으로써 확인되었다. 형질전환 파리는 hsp70-Gal4 계까지 교배되었다. 자손들은 3번째 영 유충 단계에서 2 시간동안 37℃에서 배양되었다. 제조업자의 지시에 따라 easy- Blue Total RNA Extraction kit (iNtRON)를 사용하여 총 RNA가 5 개의 유충으로부터 추출되었다. 그것(1㎍)은 역전사 시스템(Promega)과 함께 실시된 cDNA 합성 반응에서 사용되었다. dsyno 및 편재되어 발현되는 드로소필라 리보좀의 단백질 유전자 rp49 mRNA의 양은 하기의 프라이머를 갖는 PCR(어닐링(annealing)을 위한 94℃ 5분, 94℃ 30초의 38 사이클., 60℃ 1분. 및 증폭을 위한 72℃ 1분30초 및 72℃ 7분)에 의해 측정되었다:
dsyno forward: 5' - ggtgattggatttgcctactacca - 3' (SEQ ID NO: 7);
dsyno reverse: 5' - gatacagggtattcatgttgcgaa - 3' (SEQ ID NO: 8);
rp49 forward: 5' - atgaccatccgcccagcatac - 3' (SEQ ID NO: 9) ;
rp49 reverse: 5' - gagaacgcaggcgaccgttgg - 3' (SEQ ID NO: 10)
그 결과, dsyno 신호는 배아로부터 성충에 이르기까지 파리의 각각 다른 발생 단계에서 검출되었다 (도 6).
드로소필라 멜라노가스터의 모든 발생 단계 동안 dsyno(CG1937)가 편재되어 발현되었다는 점이 명백히 보여졌다.
실시예2
드로소필라 시노비올린(dsyno)을 과발현하는 형질전환 파리
dsyno의 발현은 다양한 조직-특이 프로모터 및 인핸서, 예를 들어 gmr-Gal4, Ser-Gal4, MS1096-Gal4, 및 el6E-Gal4를 포함하는 Gal4 드라이버를 사용하여 Gal4-UAS 시스템을 거쳐 다양한 조직에서 유도되었다.
1)GE27750에서 dsyno 과발현의 효과 :
GE27750에서 dsyno 과발현의 효과가 확인되었다. GE27750은 Δ2-3 유전자전위효소(transposase)에 의해 EP 요소의 임의의 가동화(mobilization)를 통해 생성되었던 GenExel EP 라이브러리로부터의 계이다 (도 7). 그것은 CG1937의 UTR 영역에서 EP 요소의 삽입을 포함한다. GE27750(R)은 dsyno의 결실 또는 새로운 삽입 돌연변이를 제조하기 위해 EP 요소 도약(jumping-out) 공정에서 생성되었다 (도 8). 상기 새로운 삽입 EP 계에서, EP 요소는 원형 위치로부터 8-10의 염기쌍이 떨어진 곳에 삽입되며, 그 방향은 역이다. GE27750 계는 반-동종접합(semi-homozygous) 치사량이다. (GE27750(R) 계는 동종접합 치사량이다.)
다른 조직 특이 Gal4 드라이버는 GE27750과 교배되었다. 상기 GAL4 드라이버는 다양한 조직-특이 조절 요소의 조절 하에 GAL4 단백질을 발현하고, 눈, 날개 또는 다리에서 CG1937의 발현으로 유도한다. 그러나, 어떤 가시성 표현형도 상기 Gal4 드라이버 단독으로 보여지지는 않았다. 따라서, CG1937은 상기 계에서 Gal4 드라이버와 함께 과발현될 수 있다는 점이 보여졌다 (도 9 및 10).
2) 조직 특이 Gal4 드라이버를 갖는 UAS-dsyno 형질전환 파리에서 dsyno 과발현의 효과
- GE27750에서의 것과 비교하여, UAS-dsyno 형질전환 파리에서 CG1937의 과발현은 눈 및 날개에서 가시성 결손형을 야기하였다 (도 11 및 12). gmr-gal4 드라이버를 사용하여 눈에서의 CG1937의 발현은 25℃에서 탈색된 눈을 야기하였다 (도 11). 상기 파리에서 눈의 표현형은 29℃에서 성장할 때 더 악화되었다 (도 13). 심각한 탈색, 거칠음, 광택있는 눈의 표현형은 29℃에서 성장한 gmr-gal4; UAS-dsyno 형질전환 파리에서 보여졌다. Ser-Gal4 드라이버를 사용하여 날개 블레이드에서 CG1937의 발현은 아래로 구부러지는 날개를 야기하였다 (도 12). Ser-Gal4는 날개의 등 부분에서 UAS-표적 유전자의 발현을 유도하기 때문에, 아래로 구부러지는 표현형은 날개의 등 부분에서 세포 성장으로부터 초래될 수 있다. 다른 날개-특이 Gal4 드라이버인 MS1096-Gal4도 또한 UAS-dsyno TG 파리에서 날개 결손을 야기한다 (도 14). MS1096-Gal4; UAS-dsyno 파리는 위로 구부러진 날개를 갖는다. MS-1096은 날개 주머니에서 GAL4 단백질을 유도한다. 가장 명백한 날개의 결손형은 e16E-Gal4; UAS-dsyno 파리에서 조사되었다 (도 15). 상기 계에서, Gal4 단백질은 날개 블레이드의 후단의 반에서 발현된다. 상기 파리에서 날개의 전단의 반은 정상이지만, 날개의 후단의 반은 주름졌다. 상기 날개의 결손은 파리가 29℃에서 성장할 때 더 악화되었다.
- CG1937의 과발현에 의한 눈 및 날개에서의 결손형은 UAS-dsyno 형질전환 계 사이에서 동일하지 않다. 특정 형질전환 계만이 결손형을 보여주었고, 각 계에서의 결손 수준은 달랐다. 이는 UAS-dsyno 벡터가 각각의 UAS-dsyno 형질전환 계에 삽입된 염색체 환경의 차이에 따른 결과일 수 있다. 모든 40 개의 UAS-dsyno TG 계는 e16E-Gal4 드라이버와 함께 시험되어 각 계에서 결손 수준을 결정하였고, 결국 시노비올린의 변경인자 선별을 위해 적합한 UAS-dsyno TG 계를 발견하였다. 40 개의 UAS-dsyno TG 계들 중, 10 개의 계가 날개의 후단의 반에서 주름짐을 보여주었고, 2 개는 기타의 날개 결손, 톱니 모양 및 짧은 L4 정맥(vein)을 보여주었다. 후단 날개의 주름진 표현형을 보여주었던 10 개의 TG 계들 중, #21은 가장 심각한 결손을 가졌다 (도 16). #9는 e16E-Gal4와 교배될 때 치사하지만, 생존한 것은 #21보다 더 심각한 날개 결손을 보여주었다. #21은 변경인자 선별을 위한 좋은 후보라고 생각된다.
- CG1937의 발현은 주름진 날개 표현형을 보여주었던 7 개의 형질전환 계에서 RT-PCR에 의해 조사되었다. 예측한 대로, 더 심각한 날개 결손은 CG 1937의 더 높은 발현을 나타냈다 (도 17). 11 개의 UAS-dsyno TG 계에서 UAS-dsyno 벡터의 삽입 위치는 역 PCR에 의해 조사되었다 (도 18). #9-2는 X 염색체에서 2 개의 삽입을 가지고, #21을 포함하는 6 개의 계는 3번째 염색체에서 삽입을 가지 며, 4 개의 계는 2번째 염색체에서 삽입을 갖는다.
- 유충 날개반은 구부러진 날개 표현형이 3 번째 영 유충 단계에서 존재하는지 여부를 결정하기 위해 조사되었다. MS1096-Gal4; wg-LacZ; UAS-dsyno 파리의 유충 날개반은 LacZ로 염색되었다 (도 19). 그러나, 등 및 배 부분의 날개 주머니 사이에서 크기의 차이점은 검출되지 않았다.
그 결과, dsyno의 과발현이 날개 및 눈에서 가시적 표현형을 야기했다는 것이 보여졌다.
실시예3
조직-특이 Gal4 드라이버를 갖는 dsyno DN 의 과발현
1) 날개에서 dsynoDN (CG1937-C305S)의 과발현의 효과
다양한 조직 특이 Gal4 드라이버를 사용하여, dsyno (dsynoDN) 형질전환 파리의 우성 네거티브 형의 과발현은 #12 형질전환 파리를 제외하고는 25℃에서 날개의 어떤 결손도 보여주지 않았다. #12 TG 계는 3 번째 염색체에서 3 개의 삽입을 갖는다. el6E-Gal4는 야생형 CG1937의 과발현에 의해 야기되었던 것과 비교하여, 역 날개 표현형을 야기하였다. el6E-Gal4; UAS-dsynoDN #12 파리에서, 날개의 후단의 반이 결실되었다 (도 20 및 21). 또한, Ser-Gal4; UAS-dsynoDN #12 파리에서, 날개가 위로 구부러졌다 (도 20 및 22). MS1096-Gal4 드라이버도 또한 UAS-dsynoDN#12 에서 날개 결손을 야기하였지만, UAS-dsyno 파리에서와 동일한 윗방향으로 날개 표현형을 보여주었다.
2) 눈에서 dsynoDN 의 과발현의 효과
#12 TG 계만이 gmr-gal4 드라이버와 교배되었을 때, 눈의 결손을 보여주었다. gmr-gal4; UAS-dsynoDN #12 파리는 광택있는 눈의 표현형을 보여주었다 (도 23).
3) CG1937(C305S)의 발현 수준
CG1937의 우성 네거티브 형의 발현은 UAS-dsynoDN TG 계에서 RT-PCR에 의해 조사되었다 (도 24). #12 계에서 CG(C305S)의 발현 수준은 다른 TG 계에서의 것보다 더 높지 않았다. 따라서, #12 계에서 날개 및 눈의 표현형은 dsynoDN 단백질의 과발현의 결과가 아닐 것이다.
그 결과, dsyno(C305S)의 우성 네거티브 형의 과발현은 파리에서 어떤 가시성 표현형도 야기하지 않는다는 점이 보여졌다.
실시예4
dsyno 돌연변이의 유사분열 클론
1) 82FRT-GE27750 염색체의 생성 :
FRT-GE27750 염색체의 생성을 위해, GE27750 계가 82B-w+ FRT 계 및 82B-w+- GE27750과 교배되었거나, 또는 82B-w--GE27750 염색체가 F1 자손에서 상동 염색체 사이에 유사분열 교차(CO)에 의해 생성되었다. CO 염색체는 F2 세대에서 회수되었다. CO 자손에서 FRT의 존재는 G418 매질에서 성장하는 능력에 의해 시험되었고, FRT 특이 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 확인되었다. GE27750의 존재는 동종접합 치사에 의해 동정되었다. 3 개의 82FRT-w+-GE27750 CO 계 및 4 개의 82FRT-w--GE27750 CO 계가 회수되었다.
2) 발생 중 및 성충 파리 조직에서 dsyno의 손실 효과 :
파리에서 dsyno의 작용을 이해하기 위해서, GE27750의 유사분열 클론이 FLP/FRT 시스템을 사용하여 발생 중 및 성충의 눈에서 생성되었다. 앞에서 언급하였듯이, GE27750 동종접합인 성충 파리는 치사되고, 죽음의 이유는 알려지지 않았다. GE27750-/- 클론이 눈-FLP 드라이버와 함께 생성되는 경우, 눈-FLP; 82FRT-GFP/82FRT-GE27750 파리의 눈 및 더듬이반은 많은 GE27750-/- 클론을 포함했으며, 클론의 크기는 다양하였다 (도 25). 너무 많은 유사분열 클론이 생성되었기 때문에, 각 클론에 대한 쌍둥이 지점(twin spot)이 결정될 수 없었다. 따라서, 상기 클론 및 그것의 쌍둥이 지점 사이의 크기는 비교되지 않았다. 상기 분석에 대해, hs-FLP를 사용한 유사분열 클론의 생성은 진행중이다. GE27750-/- 클론을 포함하는 성충의 눈은 어떤 가시성 결손도 보여주지 않았다 (도 26).
그 결과, GE27750-/- 의 유사분열 클론은 눈에서 어떤 가시성 결손도 보여주지 않았다는 것이 보여졌다.
el6E-Gal4; UAS-dsyno 파리는 dsyno 변경인자의 선별을 위한 모델 파리로써 사용될 수 있다.
실시예5
세포 사멸 경로에 의존하는 드로소필라 시노비올린 조절 p53
1) Dmp53을 과발현하는 형질전환 파리의 제조
dsyno가 생체내 Dmp53을 물질대사 시키는 것을 증명하기 위해; p53의 드로소필라 상동(Dmp53)을 과발현하는 형질전환 파리가 하기에 설명된 날개 후단의 반에만 유도하는 el6E-Gal4 드라이버를 사용함으로써 생성되었다. Dmp53을 인코딩하는 DNA 서열은 SEQ ID NO: 11에서 보여졌다. Dmp53의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 12에서 보여졌다. UAS-dsyno 및 UAS-Dmp53을 포함하는 형질전환 파리는 표준 공정에 따라 드로소필라 멜라노가스터 배아 내로 1㎍/㎕의 농도에서 재조합 DNA를 주입함에 의해 생성되었다 (Spradling, 1986). dsyno 및 Dmp53의 발현은 조직-특이 프로모터 및 인핸서를 포함하는 el6E-Gal4 드라이버를 사용하는 Gal4-UAS 시스템을 거쳐 날개 후단의 반에서 유도되었다. el6E-Gal4/UAS-Dmp53; UAS-dsyno/+ 파리는 el6E-Gal4/UAS-Dmp53 암컷 및 el6E-Gal4/CyO; UAS-dsyno/TM2 수컷 사이의 교배로부터 생성되었다.
그 결과, 날개 블레이드 후단의 반에서 Dmp53의 발현만이 날개의 전단 및 후 단의 반 사이에서 비균등의 세포 성장에 의해 야기되는, 기포가 있는 날개 표현형을 보여주었다 (도 27). 다른 한편으로, el6E-Gal4 드라이버를 사용하는 dsyno의 과발현은 주름진 날개 표현형 및 기포가 있는 날개 표현형을 보여주었다 (도 27). 따라서, dsyno 및 Dmp53이 생체내에서 실제로 상호작용할 수 있는지 확인하기 위해, 각 형질전환 계들이 교배되었다. 현저하게, UAS-Dmp53 파리의 톱니모양 날개 표현형만이 파리에서 dsyno의 과발현에 의해 억제되었다 (도 28). 상기 결과는 dsyno가 Dmp53을 유비퀴틴화 시킬 뿐만 아니라, dsyno도 Dmp53을 생리학적으로 물질대사 시키며, dsyno가 Dmp53에 대한 우성 인자일 수 있다는 것을 강하게 보여준다.
2) 날개반의 면역염색
다음으로, dsyno가 생체내 Dmp53을 물질대사 시키는 것을 증명하기 위해, el6E-Gal4/UAS-Dmp53; UAS-dsyno/+ 파리의 날개반에서의 Dmp53 발현수준이 하기에서 설명되었듯이 면역염색에 의해 분석되었다. 날개반은 PBS에서 해부되었고, 50 mM의 Tris-CHl (pH6.8), 1 mM의 EGTA, 1%의 Triton X-1OO, 2 mM의 MgSO4, 150 mM의 NaCl, 2.2%의 포름알데히드의 완충제에서 15분 동안 고정되었으며, 그리고 50 mM의 Tris-HCl (pH6.8), 150 mM의 NaCl, 0.5%의 NP40 및 5 ㎎/㎖의 BSA의 차단 완충제를 사용하여 차단되었다. 고정된 날개반은 토끼 항-Dmp53 항체의 1:200 묽기에서 4℃에서 밤새 배양되었다. 50 mM의 Tris-HCl (pH6.8), 150 mM의 NaCl, 0.5%의 NP40 및 1 ㎎/㎖의 BSA의 세척 완충제에서 세척한 후에, 그것들은 1:200 묽 기의 당나귀 항-토끼 FITC 에서 4℃에서 3시간 동안 배양되었고, 세척 완충제에서 세척되었으며, 그리고나서 5 ㎎/㎖의 페닐에틸렌디아민, 30%의 글리세롤, 150 mM의 NaCl 및 50 mM의 Tris-HCl (pH6.8)의 표본제작 용액에서 표본제작되었다.
그 결과, Dmp53은 dsyno의 과발현에 의해 상당히 감소되었고 (도 29), 상기 결과는 독립적인 클론에 의해 확인되었다.
3) 아크리딘 오렌지 염색
또한, dsyno의 과발현에 의해 Dmp53의 감소된 수준이 세포 사멸의 방지를 야기하는지 조사하기 위해, 아크리딘 오렌지 염색이 하기에 설명되었듯이 실시되었다. 해부 완충제(1×PBS, 드로소필라 링거액)에서 날개반을 해부, 및 1.6×10-6M의 아크리딘 오렌지 용액 (1 mM의 아크리딘 오렌지 원액 1.6㎕(5㎖의 무수에탄올에 1.51㎎의 아크리딘 오렌지를 용해)를 드로소필라 링거 용액에 희석)에서 5분 동안 조직을 배양. 드로소필라 링거액에서 간단히 헹군 후에, 드로소필라 링거액에서 표본제작 및 덮개유리로 덮기.
그 결과, el6E-Gal4/UAS-Dmp53 파리의 날개반에서 세포사멸 세포가 Dmp53이 과발현되었던 날개반 후단의 반에서 발견되었다 (도 30). 그러나, 상기 세포사멸 세포는 el6E-Gal4/UAS-Dmp53; UAS-dsyno/+ 파리의 날개반에서 상당히 감소되었다 (도 30). 지금까지, 파리 및 포유류 모두에서 p53의 생리학적 조절에서의 시노비올린의 역할이 명백히 증명되었다.
본 발명의 형질전환 파리는 다양한 분야에서 사용될 수 있으며, 그 용도는 하기를 포함한다: RA 및 암과 같은 특정 질환의 메카니즘을 명확히 하는 용도를 위한 도구로써; RA 및 암과 같은 특정 질환의 치료 용도를 위한 치료 화합물을 동정하는 선별 도구. 본 발명의 형질전환 파리는 RA 및 암과 같은 특정 질환의 치료 용도를 위한 치료제를 동정하도록 설계된 방법을 선별하기 위한 특정 용도를 가진다. 과발현된 시노비올린을 통한 RSC의 과성장을 포함하는 RA의 병인학은 모델 유기체로써 파리에 의해 증명될 것이다.
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590 Ser Ala Pro Val Val Arg Cys Gln Asn His Leu Ser Val Glu Pro Leu 150 155 160 165 acg gcc aat aac gca aaa atg cgc gag agc ttg ctg cgc agc gag aat 638 Thr Ala Asn Asn Ala Lys Met Arg Glu Ser Leu Leu Arg Ser Glu Asn 170 175 180 ccc aac agt gta tat tgt gga aat gct cag ggc aag gga att tcc gag 686 Pro Asn Ser Val Tyr Cys Gly Asn Ala Gln Gly Lys Gly Ile Ser Glu 185 190 195 cgt ttt tcc gtt gta gtc ccc ctg aac atg agc cgg tct gta acc cgc 734 Arg Phe Ser Val Val Val Pro Leu Asn Met Ser Arg Ser Val Thr Arg 200 205 210 agt ggg ctc acg cgc cag acc ctg gcc ttc aag ttc gtc tgc caa aac 782 Ser Gly Leu Thr Arg Gln Thr Leu Ala Phe Lys Phe Val Cys Gln Asn 215 220 225 tcg tgt atc ggg cga aaa gaa act tcc tta gtc ttc tgc ctg gag aaa 830 Ser Cys Ile Gly Arg Lys Glu Thr Ser Leu Val Phe Cys Leu Glu Lys 230 235 240 245 gca tgc ggc gat atc gtg gga cag cat gtt ata cat gtt aaa ata tgt 878 Ala Cys Gly Asp Ile Val Gly Gln His Val Ile His Val Lys Ile Cys 250 255 260 acg tgc ccc aag cgg gat cgc atc caa gac gaa cgc cag ctc aat agc 926 Thr Cys Pro Lys Arg Asp Arg Ile Gln Asp Glu Arg Gln Leu Asn Ser 265 270 275 aag aag cgc aag tcc gtg ccg gaa gcc gcc gaa gaa gat gag ccg tcc 974 Lys Lys Arg Lys Ser Val Pro Glu Ala Ala Glu Glu Asp Glu Pro Ser 280 285 290 aag gtg cgt cgg tgc att gct ata aag acg gag gac acg gag agc aat 1022 Lys Val Arg Arg Cys Ile Ala Ile Lys Thr Glu Asp Thr Glu Ser Asn 295 300 305 gat agc cga gac tgc gac gac tcc gcc gca gag tgg aac gtg tcg cgg 1070 Asp Ser Arg Asp Cys Asp Asp Ser Ala Ala Glu Trp Asn Val Ser Arg 310 315 320 325 aca ccg gat ggc gat tac cgt ctg gct att acg tgc ccc aat aag gaa 1118 Thr Pro Asp Gly Asp Tyr Arg Leu Ala Ile Thr Cys Pro Asn Lys Glu 330 335 340 tgg ctg ctg cag agc atc gag ggc atg att aag gag gcg gcg gct gaa 1166 Trp Leu Leu Gln Ser Ile Glu Gly Met Ile Lys Glu Ala Ala Ala Glu 345 350 355 gtc ctg cgc aat ccc aac caa gag aat cta cgt cgc cat gcc aac aaa 1214 Val Leu Arg Asn Pro Asn Gln Glu Asn Leu Arg Arg His Ala Asn Lys 360 365 370 ttg ctg agc ctt aag aaa cgt gcc tac gag ctg cca tgacttctga 1260 Leu Leu Ser Leu Lys Lys Arg Ala Tyr Glu Leu Pro 375 380 385 tctggtcgac aatctcccag gtatcagata cctttgaaat gtgttgcatc tgtggggtat 1320 actacatagc tattagtatc ttaagtttgt attagtcctt gttcgtaagg cgtttaacgg 1380 tgatattccc cttttggcat gttcgatggc cgaaaagaaa acatttttat atttttgata 1440 gtatactgtt gttaactgca gttctatgtg actacgtaac ttttgtctac cacaacaaac 1500 atactctgta caaaaaagcc aaaagtgaat ttattaaaga gttgtcatat tttgcaaaca 1560 tatcctc 1567 <210> 12 <211> 385 <212> PRT <213> Drosophila melanogaster <400> 12 Met Tyr Ile Ser Gln Pro Met Ser Trp His Lys Glu Ser Thr Asp Ser 1 5 10 15 Glu Asp Asp Ser Thr Glu Val Asp Ile Lys Glu Asp Ile Pro Lys Thr 20 25 30 Val Glu Val Ser Gly Ser Glu Leu Thr Thr Glu Pro Met Ala Phe Leu 35 40 45 Gln Gly Leu Asn Ser Gly Asn Leu Met Gln Phe Ser Gln Gln Ser Val 50 55 60 Leu Arg Glu Met Met Leu Gln Asp Ile Gln Ile Gln Ala Asn Thr Leu 65 70 75 80 Pro Lys Leu Glu Asn His Asn Ile Gly Gly Tyr Cys Phe Ser Met Val 85 90 95 Leu Asp Glu Pro Pro Lys Ser Leu Trp Met Tyr Ser Ile Pro Leu Asn 100 105 110 Lys Leu Tyr Ile Arg Met Asn Lys Ala Phe Asn Val Asp Val Gln Phe 115 120 125 Lys Ser Lys Met Pro Ile Gln Pro Leu Asn Leu Arg Val Phe Leu Cys 130 135 140 Phe Ser Asn Asp Val Ser Ala Pro Val Val Arg Cys Gln Asn His Leu 145 150 155 160 Ser Val Glu Pro Leu Thr Ala Asn Asn Ala Lys Met Arg Glu Ser Leu 165 170 175 Leu Arg Ser Glu Asn Pro Asn Ser Val Tyr Cys Gly Asn Ala Gln Gly 180 185 190 Lys Gly Ile Ser Glu Arg Phe Ser Val Val Val Pro Leu Asn Met Ser 195 200 205 Arg Ser Val Thr Arg Ser Gly Leu Thr Arg Gln Thr Leu Ala Phe Lys 210 215 220 Phe Val Cys Gln Asn Ser Cys Ile Gly Arg Lys Glu Thr Ser Leu Val 225 230 235 240 Phe Cys Leu Glu Lys Ala Cys Gly Asp Ile Val Gly Gln His Val Ile 245 250 255 His Val Lys Ile Cys Thr Cys Pro Lys Arg Asp Arg Ile Gln Asp Glu 260 265 270 Arg Gln Leu Asn Ser Lys Lys Arg Lys Ser Val Pro Glu Ala Ala Glu 275 280 285 Glu Asp Glu Pro Ser Lys Val Arg Arg Cys Ile Ala Ile Lys Thr Glu 290 295 300 Asp Thr Glu Ser Asn Asp Ser Arg Asp Cys Asp Asp Ser Ala Ala Glu 305 310 315 320 Trp Asn Val Ser Arg Thr Pro Asp Gly Asp Tyr Arg Leu Ala Ile Thr 325 330 335 Cys Pro Asn Lys Glu Trp Leu Leu Gln Ser Ile Glu Gly Met Ile Lys 340 345 350 Glu Ala Ala Ala Glu Val Leu Arg Asn Pro Asn Gln Glu Asn Leu Arg 355 360 365 Arg His Ala Asn Lys Leu Leu Ser Leu Lys Lys Arg Ala Tyr Glu Leu 370 375 380 Pro 385

Claims (23)

  1. 시노비올린(Synoviolin)을 인코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환 파리.
  2. 제 1 항에 있어서, 파리가 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)인 형질전환 파리.
  3. 제 1 항에 있어서, 파리가 눈에서의 가시성 결손형 및/또는 날개 결손형을 나타내는 형질전환 파리.
  4. 제 3 항에 있어서, 눈에서의 가시성 결손형이 탈색, 거칠음 및 광택있는 눈으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 형질전환 파리.
  5. 제 3 항에 있어서, 날개 결손형이 주름진 날개, 구부러진 날개, 톱니모양 및 주머니모양의 날개로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 형질전환 파리.
  6. 제 1 항에 있어서, 파리가 p53의 세포 내 핵으로의 이동 억제를 나타내는 형질전환 파리.
  7. 시노비올린을 인코딩하는 유전자를 파리의 게놈(genome)으로 도입하는 것을 포함하는 파리에서의 시노비올린을 발현하는 방법.
  8. 하기를 포함하는, 시노비올린 발현을 억제하는 활성을 갖는 화합물을 선별하는 방법 :
    (a) 제 1 항의 형질전환 파리를 후보 화합물에 접촉시키는 단계 ; 및
    (b) 후보 화합물과 접촉하지 않은 제 1 항의 상기 파리의 표현형과 비교하여, 제 1 항의 상기 파리의 표현형에서의 변화를 검정하는 단계.
  9. 하기를 포함하는, 항종양 약물로써 유용한 화합물을 선별하는 방법 :
    (a) 제 1 항의 형질전환 파리를 후보 화합물에 접촉시키는 단계 ; 및
    (b) 후보 화합물과 접촉하지 않은 제 1 항의 상기 파리의 표현형과 비교하여, 제 1 항의 상기 파리의 표현형에서의 변화를 검정하는 단계.
  10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 파리가 눈에서의 가시성 결손형 및/또는 날개 결손형을 나타내는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 눈에서의 가시성 결손형이 탈색, 거칠음 및 광택있는 눈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 방법.
  12. 제 10 항에 있어서, 날개 결손형이 주름진 날개, 구부러진 날개, 톱니모양 및 주머니모양의 날개로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 방법.
  13. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 파리가 p53의 세포 내 핵으로의 이동 촉진을 나타내는 방법.
  14. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 표현형이 제 1 항의 형질전환 파리의 세포 또는 조직에서 p53의 생물학적 및/또는 병리학적 발현 신호인 방법.
  15. 세포에서 시노비올린의 활성을 억제하는 것을 포함하는, p53의 활성을 발현하는 방법.
  16. 하기 단계를 포함하는, 표적 세포 또는 조직에서 p53의 조절 작용을 분석하는 방법 :
    (a) 제 1 항의 형질전환 파리로부터 제조된 세포 또는 조직에서 시노비올린 발현을 억제하는 단계 ;
    (b) 상기 표적 세포 또는 조직에서 p53의 생물학적 및/또는 병리학적 발현 신호를 검출하여 표적 표현형을 수득하는 단계 ; 및
    (c) 시노비올린의 발현이 억제되지 않은 상기 세포 또는 조직의 표현형과 비교하여 상기 세포 또는 조직의 표적 표현형에서의 변화를 검정하는 단계.
  17. 제 16 항에 있어서, p53이 항종양 활성을 유도하는 조절 작용을 갖는 방법.
  18. 하기 단계를 포함하는, 세포 자멸(apoptosis) 또는 세포 증식을 증강시키는 활성을 갖는 화합물을 선별하는 방법 :
    (a) 제 1 항의 형질전환 파리를 후보 화합물과 접촉시키는 단계 ; 및
    (b) 후보 화합물과 접촉하지 않은 제 1 항의 상기 파리의 표현형과 비교하여, 제 1 항의 상기 파리의 표현형에서의 변화를 검정하는 단계.
  19. 하기 단계를 포함하는, 세포 자멸 또는 세포 증식을 억제하는 활성을 갖는 화합물을 선별하는 방법 :
    (a) 제 1 항의 형질전환 파리의 우성 네거티브 형을 후보 화합물과 접촉시키는 단계 ; 및
    (b) 후보 화합물과 접촉하지 않은 제 1 항의 파리의 상기 우성 네거티브 형의 표현형과 비교하여, 제 1 항의 파리의 상기 우성 네거티브 형의 날개 결손형에서의 변화를 검정하는 단계.
  20. 제 19 항에 있어서, 제 1 항의 형질전환 파리의 우성 네거티브 형이 SEQ ID NO:2에서 보여지듯이 305번째 아미노산 잔기에서 시스테인이 세린으로 치환된 폴리펩티드를 포함하는 방법.
  21. 제 19 항에 있어서, 파리가 눈에서의 가시성 결손형 및/또는 날개 결손형을 나타내는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 눈에서의 가시성 결손형이 광택있는 눈인 방법.
  23. 제 21 항에 있어서, 날개 결손형이 주름진 날개 및 구부러진 날개로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 방법.
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