JP2023550070A - ティラピア魚の遺伝子編集されたアルビノ赤色生殖系列 - Google Patents
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Abstract
ｓｌｃ４５ａ２遺伝子に機能喪失変異を含むティラピア属の魚であって、変異がホモ接合型であり、機能喪失変異が魚のアルビノ赤色表現型をもたらす、魚が開示される。この魚を作製する方法も開示される。【選択図】なし
Description
関連出願
本出願は、２０２０年１１月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／１１３，８９２号の優先権を主張するものであり、その内容は、参照によりその全体が本明細書に援用する。
本出願は、２０２０年１１月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／１１３，８９２号の優先権を主張するものであり、その内容は、参照によりその全体が本明細書に援用する。
配列表の記述
２０２１年１１月１５日に作成された、２４，５７６バイトを含む、本出願の出願と同時に提出された９００９９ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称のＡＳＣＩＩファイルを、参照により本明細書に援用する。
２０２１年１１月１５日に作成された、２４，５７６バイトを含む、本出願の出願と同時に提出された９００９９ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称のＡＳＣＩＩファイルを、参照により本明細書に援用する。
本発明は、そのいくつかの実施形態において、グレー／黒の色素沈着を欠いたアルビノレッドティラピア系統に関し、より具体的には、ただし非排他的に、遺伝子編集によってそれを作製することに関する。
ティラピアは、世界で２番目に多い水産養殖魚群であり、世界の生産量は、年間約５５０万トンであり、その大部分は、ナイルティラピア（Oreochromis niloticus）の生産量を含む。通常、モザンビークティラピア、ブルーティラピア及びザンジバルティラピア（O. mossambicus、O. aureus、O. hornorum）と交雑させたナイルティラピアの異なる交雑系統であるレッドティラピアは、近年、世界的に人気を得ており、それに応じてその価格が上昇している。フィリピンでのレッドティラピアの市場価格は、野生型（グレー）ティラピアの２倍であり、同様の理由のため、マレーシアで育てられるティラピアの８５％は、レッドティラピア系統である。赤い彩色は、不完全なメラノフォアの発達に起因することが示唆されているが、これにより、黒又は暗赤色の斑点を有する不安定な赤色表現型が生じることになり、魚の市場価値が低下する。赤い彩色の表現型選択の代替アプローチは、創始者効果のために遺伝的可変性の大幅な喪失をもたらした。さらに、最新のレッドティラピア系統は、商業的に使用される他のナイルティラピア系統と比較して成長の低下を示す。
これまでの研究では、魚の体色に関連する遺伝子に焦点が当てられてきた。色素合成が、例えば、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１、ドーパクロムトートメラーゼ及びシルバーなどを含む複数の遺伝子を伴う複雑なプロセスであることは、明らかである。さらに、魚に特異的なゲノム重複は、これらの遺伝子のほとんどについて複数のゲノムコピーをもたらした。硬骨魚類のゲノムでは、メラニン合成の調節に関与するほとんどの遺伝子が重複しているが、例えば、ｓｌｃ４５ａ２、眼皮膚白皮症２型（ｏｃａ２）及び溶質キャリアファミリー２４メンバー５（ｓｌｃ２４ａ５）を含むいくつかの例外がある。これらは、単一の遺伝子によりコードされるためである［Braasch, I. et al., BMC Evolutionary Biology (2007) 7: 74］。
膜結合輸送体タンパク質（ＭＡＴＰ）、アブセントインメラノーマ－１（Ａｉｍ－１）、眼皮膚白皮症４型（ＯＣＡ４）、Ｂ遺伝子及びアルビノ（ａｌｂ）としても知られている溶質キャリアファミリー４５メンバー２（ＳＬＣ４５Ａ２）は、進化的に保存されたメラニン生合成の重要なメディエーターである。ＳＬＣ４５Ａ２は、動物及び植物においてスクロース輸送体タンパク質と高い類似性を共有しているが、メラノソームのｐＨ調節を通してチロシナーゼ活性に影響を与える可能性がある。
ティラピアの赤色表現型は、メラノフォアの発達が乱れた魚における真皮の血液灌流に起因することがこれまでに示唆された［Hilsdorf A.W.S. et al., Pigment cell research / sponsored by the European Society for Pigment Cell Research and the International Pigment Cell Society (2002) 15: 57-61］。それにもかかわらず、赤～アルビノ様ピンクのティラピア系統は、黒い目の色素沈着を示し、通常、可変的な割合及びパターンの黒の斑点を伴う［Lago, A. et al., Journal of Applied Genetics (2019) 60: 393-400］。対照的に、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子に天然に存在する機能喪失変異は、メダカ［Fukamachi, S. et al., Nature Genetics (2001) 28: 381-385］及びゼブラフィッシュ［Dooley, C. M. et al., Pigment Cell & Melanoma Research (2013) 26: 205-217］において完全な遺伝性白皮症をもたらし、タイセイヨウサケ（Salmo salar）［Edvardsen, R. B. et al., PLoS ONE (2014) 9］及びマリンメダカ（Oryzias melastigma）［Jeong, C. B. et al., Marine pollution bulletin (2020) 154, 111038］においては、一過性に表現型がコピーされた。赤～アルビノ様のティラピア系統は、黒い目の色素沈着及び／又は黒の斑点を示すため、入手可能なレッドティラピアの系統は、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子において天然に存在するヌル変異から生じた可能性は低いであろうことが示唆された。
レッドティラピアの既知の系統では、赤色表現型は、種々の遺伝子によって制御され、これらは、少なくとも３つの異なる連鎖群（ｃｈｒＬＧ３、ｃｈｒＬＧ５及びｃｈｒＬＧ１５）［Li et al., Marine Biotechnology (2019) 21:384-395］と、異なる遺伝形式（優性の赤色アレルから劣性の赤色アレルを介してヘテロ接合性の赤色まで）［Li et al. (2019)、上記］と関連していることが示唆されている。さらに、これらのレッドティラピア系統における黒の斑点の分布及び強度は、赤色決定遺伝子とは別の遺伝子によって制御される。
近年、魚の逆遺伝学を可能にするいくつかの方法が開発された。これらには、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９法が含まれる。これらの科学技術は、高い科学的可能性及び関心を集めるだけでなく、農業的－商業的に負の価値を有する遺伝子の摂動など、農業関連の応用にも大きい可能性を有する。現在、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９法は、比較的技術的に簡単であり、且つそのインビボでの変異誘発率が高いため、最も効率的であると考えられている。さらに、最近、有効性の高いＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、注入された魚（Ｆ０）に既にある機能喪失変異に起因する表現型の特徴付けを可能にし得ることが実証された。実際、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡによるｓｌｃ４５ａ２特異的又はｔｙｒ特異的なｇＲＮＡのマイクロインジェクションは、ｔｙｒの遺伝子の体細胞欠失をもたらし、サケ及びヤツメウナギの幼生の皮膚におけるメラニン形成を低減した［Edvardsen, R. B. et al., (2014)、上記］。
本発明のいくつかの実施形態の態様によると、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子における機能喪失変異を含むティラピア属の魚であって、変異がホモ接合型であり、機能喪失変異が魚のアルビノ赤色表現型をもたらす、魚が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の態様によると、本発明のいくつかの実施形態の魚を作製する方法が提供され、本方法は、（ａ）ティラピア属の魚の接合体に、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子における機能喪失変異を付与するＤＮＡ編集剤を導入するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の接合体を魚に成長させるステップとを含み、それにより魚を作製する。
本発明のいくつかの実施形態によると、本方法は、（ｃ）ｓｌｃ４５ａ２遺伝子に機能喪失変異を含むティラピア属の魚を同定するステップをさらに含む。
本発明のいくつかの実施形態によると、本方法は、（ｄ）ステップ（ｂ）又は（ｃ）の魚をティラピア属の第２の魚と交配させて、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子に機能喪失変異を有するティラピア属の第３の魚を産生するステップをさらに含む。
本発明のいくつかの実施形態の態様によると、本発明のいくつかの実施形態の魚の後代が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の態様によると、本発明のいくつかの実施形態の魚を含む魚の個体群が提供され、この個体群は、アルビノ赤色表現型について安定している。
本発明のいくつかの実施形態の態様によると、本発明のいくつかの実施形態の魚の細胞が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の態様によると、本発明のいくつかの実施形態の魚を含む飼料又は食品が提供される。
本発明のいくつかの実施形態によると、アルビノ赤色表現型は、黒／グレーの色素沈着を欠いている。
本発明のいくつかの実施形態によると、アルビノ赤色表現型は、赤い目の表現型を含む。
本発明のいくつかの実施形態によると、機能喪失変異は、遺伝性である。
本発明のいくつかの実施形態によると、魚及び第２の魚の両方は、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子における機能喪失変異を有する少なくとも１つのアレルを保有する。
本発明のいくつかの実施形態によると、第３の魚は、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子における機能喪失変異についてホモ接合性である。
本発明のいくつかの実施形態によると、変異は、欠失、挿入、点変異、インデル及びこれらの組合せからなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態によると、変異は、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子における２つ以上の変異を含む。
本発明のいくつかの実施形態によると、変異は、配列番号１に対応する配列番号９、１０、１１及び１２から選択される配列を有する標的配列内にある。
本発明のいくつかの実施形態によると、変異は、体細胞において発現される。
本発明のいくつかの実施形態によると、変異は、生殖系列細胞において発現される。
本発明のいくつかの実施形態によると、ティラピア属の魚は、純血種である。
本発明のいくつかの実施形態によると、ティラピア属の魚は、交雑種（ｈｙｂｒｉｄ）である。
本発明のいくつかの実施形態によると、ティラピア属の魚は、ナイルティラピア（Oreochromis niloticus）、ブルーティラピア（Oreochromis aureus）、モザンビークティラピア（Oreochromis mossambicus）、ワミティラピア（Oreochromis urolepis）、スリースポッティドティラピア（Oreochromis andersonii）、ロングフィンティラピア（Oreochromis macrochir）、サバキティラピア（Oreochromis spilurus）、ブラックチンティラピア（Sarotherodon melanotheron）、マンゴーティラピア（Sarotherodon galilaeus）、ギニアティラピア（Coptodon guineensis）、レッドブレストティラピア（Coptodon rendalli）及びレッドベリーティラピア（Coptodon zillii）からなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態によると、ＤＮＡ編集剤を導入するステップは、２種以上のＤＮＡ編集剤を導入することを含む。
本発明のいくつかの実施形態によると、２種以上のＤＮＡ編集剤は、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子内の別個の部位を標的とする。
本発明のいくつかの実施形態によると、ＤＮＡ編集剤は、少なくとも１種のｇＲＮＡを含む。
本発明のいくつかの実施形態によると、ＤＮＡ編集剤は、エンドヌクレアーゼを含む。
本発明のいくつかの実施形態によると、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９を含む。
本発明のいくつかの実施形態によると、ＤＮＡ編集剤は、ＣＲＩＳＰＲ－エンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるＤＮＡ編集システムを含む。
本発明のいくつかの実施形態によると、ＤＮＡ編集剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＲＮＰとして細胞に適用される。
本発明のいくつかの実施形態によると、ＤＮＡ編集剤は、魚細胞における発現を監視するためのレポーターに連結される。
本発明のいくつかの実施形態によると、レポーターは、蛍光タンパク質である。
本発明のいくつかの実施形態によると、機能喪失変異は、遺伝子型で決定される。
本発明のいくつかの実施形態によると、機能喪失変異は、表現型で決定される。
本発明のいくつかの実施形態によると、表現型は、遺伝子型の前に決定される。
本発明のいくつかの実施形態によると、遺伝子型は、表現型の前に決定される。
本発明のいくつかの実施形態によると、飼料又は食品は、魚体、魚の部分、魚粉又は魚油である。
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び／又は科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様の又は均等な方法及び材料を本発明の実施形態の実行又は試験で使用することができるが、例示的な方法及び／又は材料が以下に記載される。矛盾する場合、定義を含む本特許明細書が優先される。さらに、材料、方法及び実施例は、単なる実例であり、必ずしも限定することを意図するものではない。
本発明のいくつかの実施形態は、添付図面を参照して単なる例として本明細書に記載される。特にここで図面を詳細に参照して、示される詳細は、例としてのものであり、本発明の実施形態の説明的な考察を目的としたものであることが強調される。これに関して、図面と共に行われる説明は、本発明の実施形態を実行し得る方法を当業者に明らかにする。
本発明は、そのいくつかの実施形態において、グレー／黒の色素沈着を欠いた安定したアルビノレッドティラピア系統に関し、より具体的には、ただし非排他的に、遺伝子編集によってそれを作製することに関する。
本発明の原理及び作用は、図面及び添付の説明を参照してよりよく理解され得る。
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その用途において、後述する説明に記載されるか又は実施例に例示される詳細に必ずしも限定されないことが理解されるべきである。本発明は、他の実施形態が可能であるか、又は種々の方法で実施若しくは実行され得る。また、本明細書で使用される表現及び用語は、説明を目的とするものであり、限定であるとみなされてはならないことが理解されるべきである。
近年、異なるティラピン（ｔｉｌａｐｉｉｎｅ）種（特定の系統に応じてO. niloticus、O. mossambicus、O. aureus及びO. hornorum）の交雑種又は高度に近交系のナイルティラピアの赤色バリアントの市販の系統である「レッドティラピア」の需要が高まっている。グレー～黒色を有する野生型と比較して、レッドティラピアは、需要が高く、市場価値が大幅に上昇している。しかし、赤色表現型は、遺伝的に不安定であり、その調節遺伝子の一部は、依然として分かっていない。野生型ティラピアでは、赤色表現型は、環境パラメータによる影響を受ける可能性があり、その結果、黒又は暗赤色の斑点を伴う不均一な彩色が生じ、魚の市場価値が低下する。これにより、世代を通して安定しており、種々の育種及び遺伝子選択プロトコル下でのその遺伝の扱い易さを可能にする明白な遺伝的背景において確立された、均一な赤を有するティラピア系統の必要性が強調される。
本発明が実施に至る間、本発明者らは、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子における機能喪失変異を付与することにより、安定した遺伝性のレッドティラピア表現型を作製した。
本明細書で以下及びそれに続く実施例の項に示されるように、本発明者らは、ナイルティラピアにおいてｓｌｃ４５ａ２遺伝子を特定し、それを部分的にクローニングし、これらのデータを使用して、ｓｌｃ４５ａ２ゲノム配列に対して高度に特異的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を設計した（後述する実施例１）。組換えＣａｓ９タンパク質及びｓｌｃ４５ａ２特異的ｇＲＮＡを含有するリボ核タンパク質のナイルティラピア接合体へのマルチプレックスマイクロインジェクションは、注入された魚において種々のレベルのメラニン喪失を誘導した（後述する実施例２）。アンプリコンの次世代シーケンシング（ＮＧＳ）分析により、注入された接合体から成長したＦ０魚は、全て様々な変異レベルでそのゲノムに変異アレルを保有することが実証された（後述する実施例２）。マイクロ注入した魚のうちの１匹は、皮膚のメラニンの約９７～９９％の喪失を示すオスであった（後述する実施例３）。現在入手可能なレッドティラピア系列と異なり、この系列は、その赤い目に反映されるように、目のメラニンの喪失も示した（後述する実施例３）。このオスの切除ヒレ、精子及び子孫（Ｆ１）から抽出されたｇＤＮＡからのｓｌｃ４５ａ２遺伝子のゲノム標的領域のシーケンシングにより、種々のゲノムインデルと、精子で特定されたインデルの生殖系列導入とが確認された（後述する実施例３）。さらに、サンガーシーケンシングと組み合わせた高解像度融解（ＨＲＭ）分析により、Ｆ１における１０個の遺伝性アレルの驚くべき予想外の存在が実証された（後述する実施例４）。さらに、第２世代（Ｆ２）ｓｌｃ４５ａ２－／－ティラピアは、明白な眼皮膚白皮症（ＯＣＡ）表現型、すなわち目及び皮膚におけるメラニンの完全な喪失を示し、赤色表現型をもたらした（後述する実施例４）。
まとめると、いずれも安定且つ遺伝的に追跡可能である体細胞及び生殖系列のｓｌｃ４５ａ２変異アレルを含むアルビノレッドティラピア魚が作製された。これらの魚は、魚の個体群内で安定していると共に遺伝性である、皮膚及び目の赤色表現型を示した。
したがって、本発明の一態様によると、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子に機能喪失変異を含むティラピア属の魚が提供され、変異は、ホモ接合型であり、機能喪失変異は、魚のアルビノ赤色表現型をもたらす。
本明細書で使用される「ティラピア属の魚」という用語は、ティラピンシクリッド（ｔｉｌａｐｉｉｎｅ ｃｉｃｈｌｉｄ）の群のメンバーを指す。ティラピア属の例示的なメンバーとしては、ナイルティラピア（Oreochromis niloticus）、ブルーティラピア（Oreochromis aureus）、モザンビークティラピア（Oreochromis mossambicus）、ワミティラピア（例えば、２つの亜種：Oreochromis urolepis urolepis及びOreochromis urolepis hornorum）、スリースポッティドティラピア（Oreochromis andersonii）、ロングフィンティラピア（Oreochromis macrochir）、サバキティラピア（Oreochromis spilurus）、ブラックチンティラピア（Sarotherodon melanotheron）、マンゴーティラピア（Sarotherodon galilaeus）、ギニアティラピア（Coptodon guineensis）、レッドブレストティラピア（Coptodon rendalli）及びレッドベリーティラピア（Coptodon zillii）又はこれらの交雑種が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のティラピア属の魚は、任意の年齢であり得る（例えば、稚魚、幼魚、小魚又は成魚／成熟魚）。さらに、以下でさらに議論されるように、本発明で使用される魚を貯蔵、維持、繁殖及び採取するために、当技術分野で知られている任意の魚の水産養殖技術を使用することができる。
「野生型」ティラピア魚は、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子の野生型配列を含む。
ティラピア属の野生型（ＷＴ）系統は、黒／グレー～赤／ピンク／ブロンドの彩色を呈することがある。
いくつかの実施形態によると、黒／グレーの表現型を呈するティラピアの野生型系統は、通常、皮膚及び腹膜での黒及び／又はグレーの色素沈着並びに黒い目を示す。ティラピアの黒～グレーの彩色は、通常、無色の外観に関連する。
いくつかの実施形態によると、赤色表現型を呈するティラピアの野生型系統（レッドティラピアと称される）は、黒／グレーのティラピアで見られる黒及び／又はグレーの皮膚の色素沈着の大部分を欠いているが、通常、その皮膚上の黒／グレーの斑点（例えば、スポット、例えば染み）、黒／グレーの腹膜並びに黒い目の彩色を示す。
いくつかの実施形態によると、ブロンド～ピンクの表現型を呈するティラピアの野生型系統（ブロンド／ピンクティラピアと称される）は、通常、皮膚での色素沈着を欠いているが、その皮膚に暗色の斑点を示す（例えば、赤いスポットが散在するピンク、又は黒いスポットが散在するピンクとなる）ことがあり、通常、黒い目の彩色を示す。
言及されるように、本発明のティラピア属の魚は、アルビノ赤色表現型を含み、遺伝子改変されている。
本明細書で使用される「アルビノ赤色表現型」という用語は、皮膚、腹膜及び目においてメラニンの喪失を示すティラピアを指す。したがって、本発明のアルビノレッドティラピアは、皮膚及び腹膜において黒／グレーの色素沈着又は斑点を欠いている（すなわち黒／グレーの色素沈着又は黒／グレーの斑点が完全にない）。アルビノ赤色魚は、その皮膚又は腹膜に赤い斑点を示し得る。さらに、本発明のアルビノレッドティラピア魚は、赤い目の表現型（メラニンの完全な喪失に起因する）を示す。
アルビノ赤色表現型は、その体に色素性メラノフォアを欠いているため、その皮膚及び腹膜に黒／グレーの色素沈着を示さず、その目にメラニンを示さない。黒／グレーの色素の喪失の決定は、当技術分野で知られている任意の方法を用いて、例えば双眼鏡により、顕微鏡下において、画像分析により又はデジタル写真により実行することができる。魚の彩色を評価するための追加的な方法論は、参照により本明細書に援用されるSvensson and Skold, “Skin Biopsies as Tools to Measure Fish Coloration and Colour Change” (2011) In book: Skin Biopsy - Perspectivesでさらに議論されている。
本明細書で使用される場合、「ｓｌｃ４５ａ２遺伝子」という用語は、ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿００３４５１５３２（タンパク質）及びＸＭ＿００３４５１４８４（ｍＲＮＡ）を有する溶質キャリアファミリー４５メンバー２タンパク質をコードする遺伝子又はその相同体を指す。Ｓｌｃ４５ａ２は、膜結合輸送体タンパク質（ＭＡＴＰ）、アブセントインメラノーマ－１（Ａｉｍ－１）、眼皮膚白皮症４型（ＯＣＡ４）及びＢ遺伝子並びにアルビノ（ａｌｂ）とも称される。
一実施形態によると、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子相同体は、異なるティラピア系統のｓｌｃ４５ａ２タンパク質をコードする遺伝子を指す。
本発明の魚は、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子における機能喪失変異を含む。
本明細書で使用される場合、「機能喪失変異」という語句は、発現産物、すなわちｍＲＮＡ転写物及び／又は翻訳されたタンパク質の発現レベル及び／又は活性の下方制御をもたらす、遺伝子（例えば、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子）のＤＮＡ配列における任意の変異を指す。このような機能喪失変異の非限定的な例としては、ミスセンス変異、すなわちタンパク質内のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基により変化させ、それによりタンパク質の活性を消失させる変異；ナンセンス変異、すなわち終止コドン、例えば活性のないより短いタンパク質をもたらす早期終止コドンをタンパク質に導入する変異；フレームシフト変異、すなわちタンパク質のリーディングフレームを変化させる核酸の変異、通常、欠失又は挿入であって、終止コドンをリーディングフレーム内に導入することにより早期終結をもたらす（例えば、活性のない短縮タンパク質）か、又はタンパク質の二次若しくは三次構造に影響を与え、非変異ポリペプチドの活性のない非機能性タンパク質を生じる、より長いアミノ酸配列（例えば、リードスルータンパク質）をもたらし得る変異；フレームシフト変異又は改変された終止コドン変異（すなわち終止コドンがアミノ酸コドンに変異された場合）に起因する、活性が消失されたリードスルー変異；プロモーター変異、すなわち通常遺伝子の５’側から転写開始部位までのプロモーター配列の変異であって、特定の遺伝子産物の下方制御をもたらす変異；調節変異、すなわち遺伝子産物の発現に影響を与える、上流若しくは下流の領域又は遺伝子内の変異；欠失変異、すなわち遺伝子配列内のコード核酸を欠失させ、フレームシフト変異又はインフレーム変異（コード配列内、１つ又は複数のアミノ酸コドンの欠失）をもたらし得る変異；挿入変異、すなわちコード又は非コード核酸を遺伝子配列に挿入し、フレームシフト変異又は１つ若しくは複数のアミノ酸コドンのインフレーム挿入をもたらし得る変異；逆位、すなわち逆位コード又は非コード配列をもたらす変異；スプライス変異、すなわち異常なスプライシング又は不十分なスプライシングをもたらす変異；及び重複変異、すなわちインフレームであり得るか、又はフレームシフトを引き起こし得る、重複コード又は非コード配列をもたらす変異が挙げられる。
特定の実施形態によると、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子における機能喪失変異は、機能性ｓｌｃ４５ａ２タンパク質をコードしない遺伝子産物をもたらす。すなわち、機能性とは、ティラピアにおけるメラニン合成を媒介することを意味する。
特定の実施形態によると、遺伝子の機能喪失変異は、その遺伝子の少なくとも１つのアレルを含み得る。
他の特定の実施形態によると、遺伝子の機能喪失変異は、その遺伝子の両方のアレルを含む。このような例では、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子における機能喪失変異は、ホモ接合型であり得る。この実施形態によると、ホモ接合性は、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子座位における両方のアレルが機能喪失変異を特徴とする状態である。ヘテロ接合性は、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子座位のアレルの一方が機能喪失変異を特徴とする状態を指す。
一実施形態によると、機能喪失変異は、ホモ接合型である。２つのアレルのそれぞれにおける変異は、同じであるか又は異なり得る（例えば、以下で議論されるように挿入、欠失、インデル）ことが認識されるであろう。加えて、２つのアレルのそれぞれにおける変異は、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子座位の同じ位置又は異なる位置にあり得る。２つのアレルのそれぞれにおける変異又はその位置に関係なく、２つのアレルのそれぞれにおける変異は、機能喪失変異をもたらす。
一実施形態によると、機能喪失変異は、遺伝性であり、すなわち親から子孫に伝達可能である。
核酸変化を対象の遺伝子に導入する方法は、当技術分野でよく知られており［例えば、Menke D. Genesis (2013) 51: - 618；Capecchi, Science (1989) 244:1288-1292；Santiago et al. Proc Natl Acad Sci USA (2008) 105:5809-5814；国際公開第２０１４０８５５９３号パンフレット、国際公開第２００９０７１３３４号パンフレット及び国際公開第２０１１１４６１２１号パンフレット；米国特許第８７７１９４５号明細書、同第８５８６５２６号明細書、同第６７７４２７９号明細書並びに米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号明細書、同第２００５００２６１５７号明細書、同第２００６００１４２６４号明細書（これらの内容は、参照によりその全体が援用される）を参照されたい］、標的相同組換え、部位特異的リコンビナーゼ、ＰＢトランスポザーゼ及び操作されたヌクレアーゼによるゲノム編集が含まれる。核酸変化を対象の遺伝子に導入するための薬剤は、公的に利用可能な供給源によって設計するか、又はＴｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ社、Ａｄｄｇｅｎｅ社及びＳａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から商業的に得ることができる。
本発明の一態様によると、本発明のいくつかの実施形態の魚を作製するための方法が提供され、本方法は、（ａ）ティラピア属の魚の接合体に、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子における機能喪失変異を付与するＤＮＡ編集剤を導入するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の接合体を魚に成長させるステップとを含む。
以下は、ｓｌｃ４５ａ２の核酸配列（ゲノム）に核酸変化を導入するために使用される方法及びＤＮＡ編集剤並びにそれを実行するために本発明の特定の実施形態に従って使用することができる薬剤の種々の非限定的な例の説明である。
操作されたエンドヌクレアーゼを用いるゲノム編集 － このアプローチは、人工的に操作されたヌクレアーゼを用いて、ゲノム内の所望の位置で特定の二本鎖切断を切断及び作成し、次にこれが相同性配向型修復（ＨＤＲ）及び非相同末端結合（ＮＦｆＥＪ）などの細胞内因性プロセスによって修復される、リバースジェネティクス法を指す。ＮＦｆＥＪは、二本鎖切断におけるＤＮＡ末端を直接結合するが、ＨＤＲは、切断点で欠損しているＤＮＡ配列を再生するための鋳型として相同配列を利用する。ゲノムＤＮＡに特定のヌクレオチド改変を導入するために、ＨＤＲ中、所望の配列を含有するＤＮＡ修復鋳型が存在しなければならない。
ほとんどの制限酵素は、ＤＮＡ上の数個の塩基対をその標的として認識し、認識された塩基対の組合せがゲノム全体の多くの位置で見出される可能性が非常に高く、所望の位置に限定されない複数の切断につながるため、ゲノム編集は、従来の制限エンドヌクレアーゼを用いて実施することができない。この課題を克服し、部位特異的な一本鎖又は二本鎖切断を作成するために、いくつかの別個の種類のヌクレアーゼが今日までに発見されており、バイオエンジニアリングにより作られている。これらには、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｔ－ＧＥＥシステム及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが含まれる。
メガヌクレアーゼ － メガヌクレアーゼは、一般に、４つのファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ－ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ－Ｃｙｓボックスファミリー及びＨＮＨファミリーに分類される。これらのファミリーは、触媒活性及び認識配列に影響を与える構造モチーフを特徴とする。例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのメンバーは、保存されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフの１コピー又は２コピーのいずれかを有することを特徴とする。メガヌクレアーゼの４つのファミリーは、保存された構造要素に関して、したがってＤＮＡ認識配列特異性及び触媒活性に関して互いに大きく隔てられている。メガヌクレアーゼは、微生物種において一般的に見出され、非常に長い認識配列（＞１４ｂｐ）を有するという独特の特性を有し、したがって、これらは、当然のことながら、所望の位置での切断に対して非常に特異的になる。
これは、ゲノム編集において部位特異的な二本鎖切断を行うために利用することができる。当業者は、これらの天然に存在するメガヌクレアーゼを使用することができるが、このような天然に存在するメガヌクレアーゼの数は、限られている。この課題を克服するために、変異誘発及び高スループットスクリーニング方法を使用して、独特の配列を認識するメガヌクレアーゼバリアントが作り出されている。例えば、新しい配列を認識するハイブリッド酵素を作り出すために、種々のメガヌクレアーゼが融合されている。
代替的に、メガヌクレアーゼのＤＮＡ相互作用アミノ酸は、配列特異的メガヌクレアーゼを設計するように変化され得る（例えば、米国特許第８，０２１，８６７号明細書を参照されたい）。メガヌクレアーゼは、例えば、Certo, MT et al. Nature Methods (2012) 9:073-975；米国特許第８，３０４，２２２号明細書；同第８，０２１，８６７号明細書；同第８，１１９，３８１号明細書；同第８，１２４，３６９号明細書；同第８，１２９，１３４号明細書；同第８，１３３，６９７号明細書；同第８，１４３，０１５号明細書；同第８，１４３，０１６号明細書；同第８，１４８，０９８号明細書；又は同第８，１６３，５１４号明細書に記載される方法を用いて設計することができ、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。代替的に、部位特異的な切断特徴を有するメガヌクレアーゼは、市販の技術、例えばＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＤｉｒｅｃｔｅｄ Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｅｄｉｔｏｒ（商標）ゲノム編集技術を用いて得ることができる。
ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮ － 操作されたヌクレアーゼの２つの別個の種類であるジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、いずれも標的二本鎖切断を生じるのに有効であることが証明されている（Christian et al., 2010；Kim et al., 1996；Li et al., 2011；Mahfouz et al., 2011；Miller et al., 2010）。
基本的に、ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮ制限エンドヌクレアーゼ技術は、特定のＤＮＡ結合ドメイン（それぞれ一連のジンクフィンガードメイン又はＴＡＬＥリピート）に連結された非特異的なＤＮＡ切断酵素を利用する。通常、そのＤＮＡ認識部位及び切断部位が互いに分離されている制限酵素が選択される。切断部分は、分離され、次にＤＮＡ結合ドメインに連結され、それにより所望の配列に対して非常に高い特異性を有するエンドヌクレアーゼが得られる。このような特性を有する例示的な制限酵素は、Ｆｏｋｌである。さらに、Ｆｏｋｌは、ヌクレアーゼ活性を有するために二量体化を必要とするという利点を有し、これは、各ヌクレアーゼパートナーが独特のＤＮＡ配列を認識するため、特異性が劇的に増大することを意味する。この効果を増強するために、ヘテロ二量体としてのみ機能することができ、増大した触媒活性を有するＦｏｋｌヌクレアーゼが操作された。ヘテロ二量体機能性のヌクレアーゼは、望ましくないホモダイマー活性の可能性を回避し、したがって二本鎖切断の特異性を増大させる。
したがって、例えば特定の部位を標的とするために、ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮは、ヌクレアーゼ対として構築され、この対の各メンバーは、標的部位において隣接する配列に結合するように設計される。細胞における一過性発現時、ヌクレアーゼは、その標的部位に結合し、ＦｏｋＩドメインは、ヘテロ二量体化して、二本鎖切断（ＤＳＢ）を作り出す。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路によるこれらの二本鎖切断の修復は、ほとんどの場合、小さい欠失又は小さい配列挿入（インデル）をもたらす。ＮＨＥＪにより行われる各修復は、独特であるため、単一のヌクレアーゼ対の使用は、標的部位に様々な異なる欠失を有するアレルシリーズを生じ得る。
欠失は、通常、長さが数塩基対～数百塩基対の範囲にわたるが、２対のヌクレアーゼを同時に使用することにより、より大きい欠失が細胞培養物で問題なく生成された（Carlson et al., 2012；Lee et al., 2010）。加えて、ヌクレアーゼ対と共に、標的領域に対する相同性を有するＤＮＡの断片が導入される場合、二本鎖切断は、相同性配向型修復により修復されて、特定の改変を産生することができる（Li et al., 2011；Miller et al., 2010；Urnov et al., 2005）。
ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮの両方のヌクレアーゼ部分は、同様の特性を有するが、これらの操作されたヌクレアーゼ間の違いは、そのＤＮＡ認識ペプチドにある。ＺＦＮは、Ｃｙｓ２－Ｈｉｓ２ジンクフィンガーに依存し、ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥに依存する。これらのＤＮＡ認識ペプチドドメインは、いずれもそのタンパク質中に天然に組合せで見出されるという特徴を有する。Ｃｙｓ２－Ｈｉｓ２ジンクフィンガーは、通常、３ｂｐ離れたリピートに見出され、様々な核酸相互作用タンパク質において多様な組合せで見出される。一方、ＴＡＬＥは、アミノ酸と、認識されたヌクレオチド対との間の１対１の認識比でリピートに見出される。ジンクフィンガー及びＴＡＬＥは、いずれも繰り返しパターンで起こるため、様々な種類の配列特異性を作り出すために異なる組合せを試すことができる。部位特異的なジンクフィンガーエンドヌクレアーゼを作製するためのアプローチには、例えば、モジュールアセンブリ（トリプレット配列と関連しているジンクフィンガーが一列に結合されて、必要とされる配列をカバーする）、ＯＰＥＮ（ペプチドドメイン対トリプレットヌクレオチドの低ストリンジェンシー選択、その後の細菌系におけるペプチド組合せ対最終標的の高ストリンジェンシー選択）及びジンクフィンガーライブラリーの細菌ワン交雑種スクリーニングが特に含まれる。ＺＦＮは、例えば、Ｓａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）社（カリフォルニア州、リッチモンド）から商業的に設計及び入手することもできる。
ＴＡＬＥＮを設計及び入手するための方法は、例えば、Reyon et al. Nature Biotechnology 2012 May;30(5):460-5；Miller et al. Nat Biotechnol. (2011) 29: 143-148；Cermak et al. Nucleic Acids Research (2011) 39 (12): e82及びZhang et al. Nature Biotechnology (2011) 29 (2): 149-53に記載されている。最近開発されたＭｏｊｏ Ｈａｎｄという名称のウェブベースのプログラムは、ゲノム編集用途のためのＴＡＬ及びＴＡＬＥＮ構築物を設計するためにメイヨークリニックによって導入された（ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｔａｌｅｎｄｅｓｉｇｎ（ｄｏｔ）ｏｒｇによりアクセスすることができる）。ＴＡＬＥＮは、例えば、Ｓａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）社（カリフォルニア州、リッチモンド）から商業的に設計及び入手することもできる。
Ｔ－ＧＥＥシステム（ＴａｒｇｅｔＧｅｎｅ社のＧｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｅｎｇｉｎｅ） － 標的細胞においてインビボで構築され、所定の標的核酸配列と相互作用することができる、ポリペプチド部分及び特異性付与核酸（ＳＣＮＡ）を含有するプログラム可能な核タンパク質分子複合体が提供される。プログラム可能な核タンパク質分子複合体は、標的核酸配列内の標的部位を特異的に改変及び／若しくは編集し、且つ／又は標的核酸配列の機能を改変することができる。核タンパク質組成物は、（ａ）キメラポリペプチドをコードし、（ｉ）標的部位を改変することができる機能ドメイン、及び（ｉｉ）特異性付与核酸と相互作用することができる連結ドメインを含むポリヌクレオチド分子と、（ｂ）（ｉ）標的部位に隣接する標的核酸の領域に相補的なヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）ポリペプチドの連結ドメインに特異的に結合することができる認識領域を含む特異性付与核酸（ＳＣＮＡ）とを含む。この組成物は、特異性付与核酸及び標的核酸の塩基対形成により、標的核酸に対する分子複合体の高い特異性及び結合能力を用いて、所定の核酸配列標的を正確に、確実に且つコスト効率的に改変することを可能にする。この組成物は、遺伝毒性がより低く、そのアセンブリがモジュールであり、カスタマイズすることなく単一のプラットフォームを利用し、専門のコア施設外で独立して使用するのに実用的であり、且つより短い開発期間を有し、コストが削減される。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム － 多数の細菌及び古細菌は、侵入するファージ及びプラスミドの核酸を分解することができる内在性のＲＮＡベースの適応免疫系を含有する。これらのシステムは、ＲＮＡ成分を生成するｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）遺伝子と、タンパク質成分をコードするＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）遺伝子とからなる。ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）は、特定のウイルス及びプラスミドに対して相同性を有する短い区間を含有し、対応する病原体の相補的核酸を分解するようにＣａｓヌクレアーゼに指示するためのガイドとして作用する。Streptococcus pyogenesのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの研究により、３つの成分がＲＮＡ／タンパク質複合体を形成し、合わせると配列特異的ヌクレアーゼ活性に十分であることが示された：Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、標的配列に対して相同性を有する２０塩基対を含有するｃｒＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及びトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）（Jinek et al. Science (2012) 337: 816-821）。
さらに、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの間の融合物で構成される単一の合成キメラガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、インビトロでｃｒＲＮＡに対して相補的なＤＮＡ標的を切断するようにＣａｓ９に指示できることが実証された。合成ｓｇＲＮＡと併用したＣａｓ９の一過性発現は、様々な異なる種において標的とされた二本鎖切断（ＤＳＢ）を産生するために使用可能であることも実証された（(Cho et al., 2013；Cong et al., 2013；DiCarlo et al., 2013；Hwang et al., 2013a,b；Jinek et al., 2013；Mali et al., 2013）。ｓｇＲＮＡ（本明細書では単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とも称される）は、通常、標的相同配列（ｃｒＲＮＡ）と、ｃｒＲＮＡをＣａｓ９ヌクレアーゼに連結する内在性の細菌ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との組合せを単一のキメラ転写物においてコードする８０～１００ヌクレオチド配列である。
ゲノム編集のためのＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓシステムは、２つの別個の成分：ｓｇＲＮＡ及びエンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９又は３つの別個の成分：ｇＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びエンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９を含有する。
ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体又はｇＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９は、ｇＲＮＡ配列と補体ゲノムＤＮＡとの間の塩基対形成によって標的配列に動員される。Ｃａｓ９の結合の成功のために、ゲノム標的配列は、標的配列の直後に正しいプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列も含有しなければならない。ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体又はｇＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９の結合は、Ｃａｓ９をゲノム標的配列に局在化させ、したがって、Ｃａｓ９は、ＤＮＡの両方の鎖を切断して、二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こすことができる。ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮの場合と同様に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓにより生じる二本鎖切断（ＤＳＢ）は、相同組換え又はＮＨＥＪを受けることができ、ＤＮＡ修復中に特定の配列改変の影響を受けやすい。
Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、２つの機能ドメイン：ＲｕｖＣ及びＨＮＨを有し、これらは、それぞれ異なるＤＮＡ鎖を切断する。これらのドメインの両方が活性である場合、Ｃａｓ９は、ゲノムＤＮＡにおいて二本鎖切断を引き起こす。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの大きい利点は、このシステムの高効率が、合成ｓｇＲＮＡ又はｇＲＮＡを容易に作り出す能力と結合されることである。これにより、異なるゲノム部位での改変を標的とし、及び／又は同じ部位での異なる改変を標的とするように容易に改変される（例えば、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子座位において）ことが可能なシステムが作り出される。さらに、複数の遺伝子の同時ターゲティングを可能にするプロトコルが確立されている。変異を保有する細胞の大部分は、標的化遺伝子において両アレル変異を提示する。
しかしながら、ｓｇＲＮＡ又はｇＲＮＡ配列とゲノムＤＮＡ標的配列との間の塩基対形成相互作用における見かけの柔軟性により、標的配列への不完全なマッチは、Ｃａｓ９によって切断することが可能になる。
単一の不活性触媒ドメイン、ＲｕｖＣ－又はＨＮＨ－のいずれかを含有するＣａｓ９酵素の改変バージョンは、「ニッカーゼ」と呼ばれる。１つのみの活性ヌクレアーゼドメインにより、Ｃａｓ９ニッカーゼは、標的ＤＮＡの１本の鎖のみを切断し、一本鎖切断又は「ニック」を作り出す。一本鎖切断又はニックは、主に、ＰＡＲＰ（センサー）及びＸＲＣＣ１／ＬＩＧ ＩＩＩ複合体（ライゲーション）など（これらのみではない）のタンパク質を含む一本鎖切断修復機序によって修復される。しかしながら、Ｃａｓ９ニッカーゼによって導入された２つの近接する反対鎖のニックは、「ダブルニック」ＣＲＩＳＰＲシステムと呼ばれることが多いシステムにおいて二本鎖切断として処理される。基本的に非平行ＤＳＢであるダブルニックは、他のＤＳＢのように、遺伝子標的に対する所望の効果に応じてＨＲ又はＮＨＥＪによって修復することができる。したがって、いずれかのｇＲＮＡ単独では、ゲノムＤＮＡを変化させる可能性の低いニックが生じ得るため、特異性及び低減したオフターゲット効果が重要である場合、Ｃａｓ９ニッカーゼを使用して、極めて近接しており、且つゲノムＤＮＡの反対の鎖上にある標的配列を有する２つのｇＲＮＡを設計することによってダブルニックを作り出すことにより、オフターゲット効果が低減されるであろう。
２つの不活性触媒ドメインを含有するＣａｓ９酵素の改変バージョン（ｄｅａｄ Ｃａｓ９又はｄＣａｓ９）は、ヌクレアーゼ活性を有さないが、ｓｇＲＮＡ又はｇＲＮＡの特異性に基づいて依然としてＤＮＡに結合することができる。ｄＣａｓ９は、不活性酵素を既知の制御ドメインに融合させることにより、ＤＮＡ転写制御因子が遺伝子発現を活性化又は抑制するためのプラットフォームとして利用することができる。例えば、ゲノムＤＮＡ中の標的配列へのｄＣａｓ９単独での結合は、遺伝子転写を妨げることができる。
代替的に、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＤＮＡ切断ドメインなどの種々のエフェクタードメインと融合され得る。ＤＮＡ切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼから得ることができる。ＤＮＡ切断ドメインを得ることができるエンドヌクレアーゼの非限定的な例としては、制限エンドヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼ（例えば、New England Biolabs社のカタログ又はBelfort et al. (1997) Nucleic Acids Res.を参照されたい）、例えばＦｏｋｌエンドヌクレアーゼ及びＩ－ＣｒｅＩが挙げられるが、これらに限定されない。
ｇＲＮＡによりＤＮＡ編集をもたらすために使用することができる追加的なＣａｓエンドヌクレアーゼとしては、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１（Zetsche et al., 2015, Cell. 163(3):759-71）、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３（Shmakov et al., Mol Cell. 2015 Nov. 5; 60(3):385-97）、ＣａｓＸ及びＣｐｆ１／Ｃａｓ１２ａが挙げられるが、これらに限定されない。
標的配列の選択及び／又は設計を促進するために利用可能であるいくつかの公的に利用可能な手段並びに異なる種の異なる遺伝子に対して生物情報学的に決定された独特のｓｇＲＮＡ又はｇＲＮＡのリストがあり、例えばＦｅｎｇ Ｚｈａｎｇ研究室のＴａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ、Ａｌｅｘ Ｓｃｉｅｒ研究室のＴａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ（ＣｈｏｐＣｈｏｐ）、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｂｏｕｔｒｏｓ研究室のＴａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ（Ｅ－ＣＲＩＳＰ）、ＲＧＥＮ Ｔｏｏｌｓ：Ｃａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒ、ＣａｓＦｉｎｄｅｒ：ゲノム内の特定のＣａｓ９標的を同定するためのフレキシブルアルゴリズム及びＣＲＩＳＰＲ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｔａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒなどであるが、これらに限定されない。
ＣＲＩＳＰＲシステムを使用するために、ｃｒＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）が標的細胞内で発現されるか、又は標的細胞内に存在しなければならない（例えば、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）として）。代替的に、ｓｇＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）の両方又はｇＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）が標的細胞内で発現されるか、又は標的細胞内に存在しなければならない（例えば、リボ核タンパク質複合体として）。挿入ベクターは、単一のプラスミド上に全てのカセットを含有することができるか、又はカセットは、別々のプラスミドから発現される。ＣＲＩＳＰＲプラスミドは、市販されており、例えばＡｄｄｇｅｎｅ社（マサチューセッツ州、ケンブリッジ）からのｐｘ３３０プラスミドである。
特定の実施形態によると、ＤＮＡ編集剤は、ＤＮＡターゲティングモジュール（例えば、ｇＲＮＡ）を含む。
特定の実施形態によると、ＤＮＡ編集剤は、２つ以上のＤＮＡターゲティングモジュール（例えば、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子座位内の異なる領域を標的とする２、３、４、５つ又はそれを超える異なるｇＲＮＡ）を含む。
特定の実施形態によると、ＤＮＡ編集剤は、ヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）及びＤＮＡターゲティングモジュール（例えば、ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。
特定の実施形態によると、ＤＮＡ編集剤は、ヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）及びＤＮＡターゲティングモジュール（例えば、ｓｇＲＮＡ）を含む。
特定の実施形態によると、ＤＮＡ編集剤は、ＣＲＩＳＰＲ／エンドヌクレアーゼである。
特定の実施形態によると、ＤＮＡ編集剤は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、例えばｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９又はｇＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｄＣａｓ９である。
本発明で使用することができるｇＲＮＡの非限定的な例は、配列番号１３、１４及び１５に記載される核酸配列（すなわちそれぞれｇＲＮＡ１、ｇＲＮＡ２及びｇＲＮＡ３）を含む。
一実施形態によると、本発明で使用することができるｇＲＮＡは、配列番号１３、１４及び１５に記載される核酸配列を有するｇＲＮＡの組合せ（例えば、ｇＲＮＡ２及びｇＲＮＡ３、ｇＲＮＡ１及びｇＲＮＡ３、ｇＲＮＡ１及びｇＲＮＡ２又はｇＲＮＡ１、ｇＲＮＡ２及びｇＲＮＡ３）を含む。
特定の実施形態によると、ＣＲＩＳＰＲは、配列番号１６に記載される核酸配列を含む短いガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む。
特定の実施形態によると、ｇＲＮＡは、例えば、配列番号４６～４８に記載されるｓｌｃ４５ａ２－エクソン１ゲノム領域（アクセッション番号ＸＭ＿００３４５１４８４）（すなわちゲノムデータベースからのゲノムｓｌｃ４５ａ２（ｃｈｒＬＧ７（逆鎖）：１６１５７４２０－１６１５６９６９））を標的とする。
本教示に従い、ｓｌｃ４５ａ２の核酸配列（ゲノム）に核酸変化を導入するために使用され得る追加的なＤＮＡ編集剤及びシステムには、トランスポゾン及びＴＦＯが含まれるが、これらに限定されない。これらは、以下で簡単に議論される。
トランスポゾン － 単細胞のゲノム内の異なる位置に移動することができるヌクレオチド配列を含む可動遺伝因子を指す。その過程で、トランスポゾンは、変異を引き起こし、且つ／又は細胞のゲノム内のＤＮＡの量を変化させることができる。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ［Izsvak and Ivics Molecular Therapy (2004) 9, 147-156］、ｐｉｇｇｙＢａｃ［Wilson et al. Molecular Therapy (2007) 15, 139-145］、Ｔｏｌ２［Kawakami et al. PNAS (2000) 97 (21): 11403-11408］又はＦｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ［Miskey et al. Nucleic Acids Res. Dec 1, (2003) 31(23): 6873-6881］など、細胞、例えば脊椎動物内で転位することもできるいくつかのトランスポゾン系が単離又は設計されている。一般に、ＤＮＡトランスポゾンは、簡単なカットアンドペースト法で１つのＤＮＡ部位から別の部位に移動する。
トリプレックス形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ） － 配列特異的な方法で二本鎖らせんＤＮＡ内のポリプリン／ポリピリミジン領域を認識及び結合し得るＴＦＯを設計することができる。これらの認識ルールは、Maher III, L. J., et al., Science, 1989;245:725-730；Moser, H. E., et al., Science, 1987; 238:645-630；Beal, P. A., et al, Science, 1992; 251:1360-1363；Cooney, M., et al., Science, 1988; 241:456-459；及びHogan, M. E., et al.の欧州特許出願公開第３７５４０８号明細書によって概説されている。インターカレーターの導入及び骨格置換などのオリゴヌクレオチドの改変並びに結合条件（ｐＨ及びカチオン濃度）の最適化は、電荷反発及び不安定性などのＴＦＯ活性への固有の障害を克服するのに役立ち、合成オリゴヌクレオチドは、特定の配列に対して標的化できることが示された（Seidman and Glazer, J Clin Invest (2003) 112:487-94を参照されたい）。
一般に、トリプレックス形成オリゴヌクレオチドは、以下の配列対応性を有する。
オリゴ ３’－－Ａ Ｇ Ｇ Ｔ
デュプレックス ５’－－Ａ Ｇ Ｃ Ｔ
デュプレックス ３’－－Ｔ Ｃ Ｇ Ａ
オリゴ ３’－－Ａ Ｇ Ｇ Ｔ
デュプレックス ５’－－Ａ Ｇ Ｃ Ｔ
デュプレックス ３’－－Ｔ Ｃ Ｇ Ａ
ＴＦＯによる細胞のトランスフェクション（例えば、カチオン性リポソームによる）と、標的ＤＮＡによる三重らせん構造の形成とにより、立体的及び機能的な変化が誘導され、転写開始及び伸長が遮断され、内在性ＤＮＡにおける所望の配列変化の導入が可能になり、結果的に遺伝子発現の特異的な下方制御がもたらされる。
さらに、上記の原理に従って設計されたＴＦＯは、ＤＮＡ修復をもたらし得る定方向変異誘発を誘導することができ、したがって内在性遺伝子の発現の下方制御及び上方制御の両方が提供される（Seidman and Glazer, J Clin Invest (2003) 112:487-94）。効果的なＴＦＯの設計、合成及び投与の詳細な説明は、米国特許出願公開第２００３０１７０６８号明細書及び同第２００３００９６９８０号明細書（Froehler et al）、同第２００２０１２８２１８号明細書及び同第２００２０１２３４７６号明細書（Emanuele et al）並びに米国特許第５，７２１，１３８号明細書（Lawn）に見出すことができる。
ＤＮＡ編集剤がランダム変異を引き起こす変異原であり得ることと、ｓｌｃ４５ａ２の発現レベルの下方制御を示す細胞が選択され得ることとが理解されるであろう。
変異原は、遺伝因子、化学物質又は放射線物質であり得るが、これらに限定されない。例えば、変異原は、限定されないが、紫外線、ガンマ線又はアルファ粒子などの電離放射線であり得る。他の変異原には、写し違いを生じ得る塩基類似体；亜硝酸などの脱アミノ化剤；臭化エチジウムなどの挿入剤；ブロモウラシルなどのアルキル化剤；トランスポゾン；天然及び合成アルカロイド；臭素及びその誘導体；アジ化ナトリウム；ソラレン（例えば、紫外線照射との組合せ）が含まれ得るが、これらに限定されない。変異原は、限定されないが、ＩＣＲ１９１、１，２，７，８－ジエポキシ－オクタン（ＤＥＯ）、５－アザＣ、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）又はＮ－エチル－Ｎ－ニトロソ尿素（ＥＮＵ）などの化学物資変異原であり得る。
使用されるＤＮＡ編集剤又は方法に関係なく、本発明の方法は、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子が欠失、挿入、点変異又はインデルの少なくとも１つによって改変されるように使用される。
ｓｌｃ４５ａ２の核酸配列（ゲノム）に核酸変化を導入するために使用される方法に関係なく、本方法は、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子座位の少なくとも１つの位置（例えば、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子座位の１、２、３、４、５つ又はそれを超える別個の位置）に変異が導入されるように使用される。
一実施形態によると、改変は、機能喪失変異を付与する（上記で議論した通り）。
一実施形態によると、変異は、配列番号１に対応する配列番号９、１０、１１及び１２から選択される配列を有する標的配列内にある。
一実施形態によると、変異は、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子座位の１つの位置にある。
一実施形態によると、変異は、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子座位の２つ以上の位置（例えば、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子座位の２、３、４、５つ又はそれを超える位置）にある。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、約１～１００，０００ヌクレオチド、約１～５０，０００ヌクレオチド、約１～２５，０００ヌクレオチド、約１～１０，０００ヌクレオチド、約１～７，５００ヌクレオチド、約１～５，０００ヌクレオチド、約１～２，５００ヌクレオチド、約１～２，０００ヌクレオチド、約１～１，０００ヌクレオチド、約１～７５０ヌクレオチド、約１～５００ヌクレオチド、約１～２５０ヌクレオチド、約１～２００ヌクレオチド、約１～１５０ヌクレオチド、約１～１００ヌクレオチド、約１～９０ヌクレオチド、約１～８０ヌクレオチド、約１～７０ヌクレオチド、約１～６０ヌクレオチド、約１～５０ヌクレオチド、約１～４０ヌクレオチド、約１～３０ヌクレオチド、約１～２５ヌクレオチド、約１～２０ヌクレオチド、約１～１５ヌクレオチド、約１～１０ヌクレオチド、約１～５ヌクレオチドの改変（野生型ｓｌｃ４５ａ２遺伝子と比較して）を含む。
一実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、２５００、５０００、７５００又は１０，０００ヌクレオチドの改変（野生型ｓｌｃ４５ａ２遺伝子と比較して）を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、１ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、約５ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、約１０ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、約２０ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、約３０ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、約５０ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、約６０ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、５ヌクレオチドまでの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、１０ヌクレオチドまでの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、１５ヌクレオチドまでの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、２０ヌクレオチドまでの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、２５ヌクレオチドまでの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、５０ヌクレオチドまでの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、６０ヌクレオチドまでの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、７０ヌクレオチドまでの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、８０ヌクレオチドまでの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、９０ヌクレオチドまでの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、１００ヌクレオチドまでの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、２５０ヌクレオチドまでの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、５００ヌクレオチドまでの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、１０００ヌクレオチドまでの改変を含む。
一実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、２５００、５０００、７５００又は最大で１０，０００ヌクレオチドの改変（野生型ｓｌｃ４５ａ２遺伝子と比較して）を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、最大で１０００ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、最大で７５０ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、最大で５００ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、最大で２５０ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、最大で１００ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、最大で９０ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、最大で８０ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、最大で７０ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、最大で６０ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、最大で５０ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、最大で４０ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、最大で３０ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、最大で２５ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、最大で２０ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、最大で１５ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、最大で１０ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、最大で５ヌクレオチドの改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子の１つのアレルに改変を含む。
特定の実施形態によると、改変（例えば、挿入、欠失、点変異及び／又はインデル）は、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子の両方のアレルに改変を含む。したがって、改変は、両方のアレルにおける挿入、両方のアレルにおける欠失、両方のアレルにおける点変異又は両方のアレルにおけるインデルを含み得る。代替的に、変異は、一方のアレルにおける挿入及び他方のアレルにおける欠失、点変異若しくはインデル、一方のアレルにおける欠失及び他方のアレルにおける挿入、点変異若しくはインデル、一方のアレルにおける点変異及び他方のアレルにおける挿入、欠失若しくはインデル又は一方のアレルにおけるインデル及び他方のアレルにおける挿入、欠失若しくは点変異を含み得る。
特定の実施形態によると、改変は、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子（配列番号１に記載される）の５７ヌクレオチドの欠失を含む。
特定の実施形態によると、改変は、全遺伝子（すなわちｓｌｃ４５ａ２遺伝子）の欠失を含む。
特定の実施形態によると、改変は、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子全体の染色体欠失を含む。
有効性を認定し、配列変化を決定するための方法は、当技術分野でよく知られており、これには、ＤＮＡシーケンシング、次世代アンプリコンシーケンシング（ＮＧＳ）、電気泳動法、酵素ベースのミスマッチ検出アッセイ並びにハイブリダイゼーションアッセイ、例えばＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、高解像度融解曲線（ＨＲＭ）、ＲＮａｓｅプロテクション、インサイツハイブリダイゼーション、プライマー伸長法、サザンブロット、ノーザンブロット及びドットブロット分析が含まれるが、これらに限定されない。
特定の遺伝子における配列変化は、例えば、クロマトグラフィ、電気泳動法、免疫検出アッセイ、例えばＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット分析並びに免疫組織化学を用いて、タンパク質レベルで決定することもできる。
一実施形態によると、ＤＮＡ編集剤（例えば、ｇＲＮＡ若しくはｓｇＲＮＡ又はこれらをコードするベクター）は、レポーターを含有する形質転換細胞が、負の選択（レポーターを含有しない細胞の成長を阻害することによる）又は正の選択（レポーターによりコードされる産物をスクリーニングすることによる）のいずれかによって回収されることを可能にする少なくとも１つのレポーターを含む（例えば、連結される）ことができる。
一実施形態によると、レポーターは、蛍光レポータータンパク質である。
「蛍光タンパク質」という用語は、蛍光を放出するポリペプチドを指し、通常、フローサイトメトリー、顕微鏡法又は任意の蛍光イメージングシステムによって検出可能であり、したがってこのようなタンパク質を発現する細胞の選択の基礎として使用することができる。
マーカーとして使用することができる蛍光タンパク質の例は、限定されないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）及び赤色蛍光タンパク質（例えば、ｄｓＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＲＦＰ）である。
例えば、クラゲであるAequorea victoria由来のＧＦＰは、基質を添加しなくても紫外線にさらされると蛍光を生成する（Chalfie et al., Science 263:802-5 (1994)）。標準条件下で野生型ＧＦＰよりも５０倍も大きい蛍光を発生する、いくつかの改変されたＧＦＰが作製されている（Cormack et al., Gene 173:33-8 (1996)；Zolotukhin et al., J. Virol 70:4646-54 (1996)）。このレベルの蛍光は、生きている動物における低レベルの組織特異的発現の検出を可能にする。
新しい種類の蛍光タンパク質及び応用の概要は、Trends in Biochemical Sciences［Rodriguez, Erik A.; Campbell, Robert E.; Lin, John Y.; Lin, Michael Z.; Miyawaki, Atsushi; Palmer, Amy E.; Shu, Xiaokun; Zhang, Jin; Tsien, Roger Y. “The Growing and Glowing Toolbox of Fluorescent and Photoactive Proteins”. Trends in Biochemical Sciences. Doi:10.1016/j.tibs.2016.09.010］に見出すことができる。
一実施形態によると、レポーターは、特定の検出可能な産物を生成し得るβ－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ及びアルカリホスファターゼなどの酵素並びに直接検出することができるタンパク質である。
一実施形態によると、レポーターは、合成色素、例えばシアニンである。シアニン色素は、一般式：Ｒ２Ｎ［ＣＨ＝ＣＨ］ｎＣＨ＝Ｎ＋Ｒ２⇔Ｒ２Ｎ＋＝ＣＨ［ＣＨ＝ＣＨ］ｎＮＲ２（ｎは、小さい数である）を有し、通常、核酸又はタンパク質分子のいずれかに化学的に結合することができるように窒素末端の一方又は両方に反応基を有する２、３、５又は７－メチン構造から合成される。例示的なシアニン色素には、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５及びＣｙ７が含まれるが、これらに限定されない。
本発明のいくつかの実施形態の開示されたティラピア属の魚は、魚の細胞、好ましくは胚細胞、最も好ましくは単細胞胚（例えば、接合体、すなわち精子による受精後の卵細胞）にＤＮＡ編集剤を導入することによって作製する。ＤＮＡ編集剤が胚細胞に導入される場合、ティラピア属の魚は、１つ又は複数の胚細胞を魚に成長させることによって得られる（以下に詳細に記載される通り）。魚の胚細胞へのＤＮＡ編集剤の導入と、それに続く魚の成長とは、ほとんどの魚種では胚が親魚の外側で成長するという事実によって単純化される。
一実施形態によると、本方法は、魚の細胞、例えば胚細胞（例えば、接合体）にＤＮＡ編集剤を導入することによって達成される。
一実施形態によると、本方法は、魚の細胞、例えば胚細胞（例えば、接合体）に２種以上のＤＮＡ編集剤（例えば、２、３、４、５種又はそれを超える異なるＤＮＡ編集剤）を導入することによって達成される。
一実施形態によると、２種以上のＤＮＡ編集剤は、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子座位内の別個の部位を標的とする。
特定の実施形態によると、本方法は、魚の細胞、例えば胚細胞（例えば、接合体）に、配列番号１３、１４及び１５に記載される核酸配列を有するｇＲＮＡ（すなわち、それぞれｇＲＮＡ１、ｇＲＮＡ２及びｇＲＮＡ３）を導入することによって達成される。
特定の実施形態によると、本方法は、魚の細胞、例えば胚細胞（例えば、接合体）に、配列番号１３、１４及び１５に記載される核酸配列を有する２種以上のｇＲＮＡを導入する（例えば、ｇＲＮＡ２及びｇＲＮＡ３、ｇＲＮＡ１及びｇＲＮＡ３、ｇＲＮＡ１及びｇＲＮＡ２又はｇＲＮＡ１、ｇＲＮＡ２及びｇＲＮＡ３を同時導入する）ことによって達成される。
特定の実施形態によると、本方法は、魚の細胞、例えば胚細胞（例えば、接合体）に、配列番号１６に記載される核酸配列を有するｓｇＲＮＡを導入することによって達成される。
本発明のＤＮＡ編集剤は、ＤＮＡデリバリー方法（例えば、発現ベクターによる）又はＤＮＡフリーの方法を用いて、ティラピア属の魚の細胞（例えば、魚の接合体）に導入され得る。
一実施形態によると、ｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡ（又は使用されるＤＮＡ編集システムに応じて、使用される任意の他のＤＮＡ認識モジュール）は、ＲＮＡとして細胞に提供することができる。
したがって、本技術は、ＲＮＡトランスフェクション（例えば、ｍＲＮＡ＋ｓｇＲＮＡトランスフェクション）又はリボ核タンパク質（ＲＮＰ）トランスフェクション（例えば、タンパク質－ＲＮＡ複合体トランスフェクション、例えばＣａｓ９／ｓｇＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体トランスフェクション）などの一過性ＤＮＡ又はＤＮＡフリーの方法を用いたＤＮＡ編集剤の導入に関することが認識されるであろう。
例えば、Ｃａｓ９は、ＤＮＡ発現プラスミド、インビトロ転写物（すなわちＲＮＡ）又はリボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）中のＲＮＡ部分に結合した組換えタンパク質として導入することができる。ｓｇＲＮＡは、例えば、ＤＮＡプラスミド又はインビトロ転写物（すなわちＲＮＡ）として送達することができる。
ＲＮＡ又はＲＮＰトランスフェクションのための、当技術分野で知られている任意の方法は、本教示に従って使用することができ、例えば、限定されないが、マイクロインジェクション［参照により本明細書に援用されるCho et al., “Heritable gene knockout in Caenorhabditis elegans by direct injection of Cas9-sgRNA ribonucleoproteins,” Genetics (2013) 195:1177-1180によって記載される］、エレクトロポレーション［参照により本明細書に援用されるKim et al., “Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins” Genome Res. (2014) 24:1012-1019によって記載される］又は例えばリポソームを使用する脂質媒介性トランスフェクション［参照により本明細書に援用されるZuris et al., “Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo” Nat Biotechnol. (2014) doi: 10.1038/nbt.3081によって記載される］である。ＲＮＡトランスフェクションの追加的な方法は、参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１６０２８９６７５号明細書に記載されている。
本発明のＲＮＡトランスフェクション方法の１つの利点は、ＲＮＡトランスフェクションが本質的に一過性であり、ベクターを含まないことである。ＲＮＡ導入遺伝子は、追加的な配列（例えば、ウイルス配列）を必要とすることなく、最小の発現カセットとして細胞に送達して、そこで発現させることができる。
一実施形態によると、細胞における本発明の外因性ＤＮＡ編集剤の発現のために、ＤＮＡ編集剤をコードするポリヌクレオチド配列は、細胞発現に適した核酸構築物に連結される。このような核酸構築物は、細胞において構成的又は誘導的な方法でポリヌクレオチド配列の転写を指示するためのプロモーター配列を含む。
本発明のいくつかの実施形態の核酸構築物（本明細書では「発現ベクター」とも称される）は、このベクターを真核生物における複製及び組込みに適したものにする追加的な配列を含む（例えば、シャトルベクター）。加えて、典型的なクローニングベクターは、転写及び翻訳開始配列、発現配列、転写及び翻訳ターミネーター並びにポリアデニル化シグナルも含有し得る。
発現配列は、プロモーター及びエンハンサーの２つの主な種類に分けられる。プロモーターは、一般に、転写開始部位に関して比較的固定された位置にあるときに機能するＤＮＡの１つ又は複数の配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ及び転写因子の基本的な相互作用に必要とされるコアエレメントを含有し、上流エレメント及び応答エレメントを含有し得る。真核生物プロモーターは、通常、ＴＡＴＡボックス及び上流プロモーターエレメントの２種類の認識配列を含有する。転写開始部位の２５～３０塩基対上流に位置するＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡ合成を開始するようにＲＮＡポリメラーゼに指示することに関与していると考えられる。他の上流プロモーターエレメントは、転写が開始される速度を決定する。
好ましくは、開示される魚の作製に利用されるプロモーターは、形質転換された特定の細胞集団において活性である。魚細胞における発現のために、使用されるプロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、キメラプロモーター又は発生学的に調節されたプロモーターであり得る。本発明のいくつかの実施形態の方法に有用な好ましいプロモーターの例としては、ＶＡＳＡ、ＥＦ１α、β－アクチン、Ｕ６、ＣＭＶが挙げられるが、これらに限定されない。
エンハンサーは、一般に、転写開始部位から固定されない距離で機能し、いずれの向きでもあり得るＤＮＡの配列を指す。エンハンサーは、近くのプロモーターからの転写を増大させる機能を果たす。エンハンサーは、多くの場合、転写の調節を媒介する応答エレメントも含有する。プロモーターも、転写の調節を媒介する応答エレメントを含有することができる。
エンハンサーは、多くの場合、遺伝子の発現の調節を決定する。この効果は、プロモーターに動作可能に連結されたレポーター遺伝子を含有する構築物の導入が、この構築物がエンハンサーのドメインに挿入される場合にのみ発現される、いわゆるエンハンサートラップ構築物に見られる（O’Kane and Gehring, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:9123-9127 (1987)、Allen et al., Nature 333:852-855 (1988)、Kothary et al., Nature 335:435-437 (1988)、Gossler et al., Science 244:463-465 (1989)）。このような場合、構築物の発現は、新たに関連付けられたエンハンサーのパターンに従って調節される。最小のプロモーターのみを有する構築物は、開示される魚においてエンハンサーを同定するために使用することができる。
言及されるように、レポータータンパク質は、発現配列からの発現を検出又は定量化するために有用である。例えば、レポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列を組織特異的発現配列に動作可能に連結すると、系譜の発達を慎重に研究することが可能になる。多数のレポータータンパク質が知られており、他の生物において同様の目的で使用されている。これらには、上記で議論されるように、蛍光タンパク質及び酵素が含まれる。
既に記載されたエレメントに加えて、本発明のいくつかの実施形態の発現ベクターは、通常、クローニングされた核酸の発現のレベルを増大させるか、又は組換えＤＮＡを保有する細胞の特定を容易にすることが意図される他の特殊なエレメントを含有し得る。例えば、いくつかの動物ウイルスは、許容細胞型におけるウイルスゲノムの染色体外複製を促進するＤＮＡ配列を含有する。これらのウイルスレプリコンを有するプラスミドは、プラスミド上に保有されるか、又は宿主細胞のゲノムにより保有される遺伝子によって適切な因子が提供される限り、エピソームとして複製される。
ベクターは、真核生物レプリコンを含んでも又は含まなくてもよい。真核生物レプリコンが存在する場合、ベクターは、適切な選択可能なマーカーを用いて、真核細胞において増幅可能である。ベクターが真核生物レプリコンを含まない場合、エピソーム増幅は、不可能である。代わりに、操作された細胞のゲノムに組換えＤＮＡが組み込まれ、プロモーターが所望の核酸の発現を指示する。
発現ベクター内に含まれる個々のエレメントは、様々な構成で配置可能であることが認識されるであろう。例えば、エンハンサーエレメント及びプロモーターなど、並びにさらにＤＮＡ編集剤をコードするポリヌクレオチド配列は、「ヘッドトゥーテール」構成で配置され得、逆補体として存在し得るか、又は相補的な構成で逆平行鎖として存在し得る。このような様々な構成は、発現ベクターの非コードエレメントによって起こる可能性がより高いが、発現ベクター内のコード配列の代替構成も想定される。
魚の発現ベクターの例としては、例えば、Ａｄｄｇｅｎｅ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｋａｗａｋａｍｉ研究室及びＣｈｉｅｎ研究室から入手可能なｐＣＤＮＡ３．１、ｐＣＤＮＡ６、Ｔｏｌ２ｋｉｔプラスミド、ｐＳＣ２が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態によると、機能性ＤＮＡ編集剤を発現させるために、切断モジュール（ヌクレアーゼ）がＤＮＡ認識ユニットの不可欠な部分ではない場合、発現ベクターは、切断モジュール及びＤＮＡ認識ユニット（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの場合、ｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡ）をコードし得る。
代替的に、切断モジュール（ヌクレアーゼ）及びＤＮＡ認識ユニット（例えば、ｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡ）は、別々の発現ベクターにクローニングされ得る。このような場合、少なくとも２つの異なる発現ベクターが同じ真核細胞内に形質転換されなければならない。
代替的に、ヌクレアーゼが利用されない（すなわち外因性供給源から細胞に投与されない）場合、ＤＮＡ認識ユニット（例えば、ｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡ）は、単一の発現ベクターを用いてクローニング及び発現され得る。
一実施形態によると、ＤＮＡ編集剤は、真核細胞において活性なシス作用性調節エレメント（例えば、プロモーター）に動作可能に連結された少なくとも１つのＤＮＡ認識ユニット（例えば、ｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡ）をコードする核酸剤を含む。
一実施形態によると、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）及びＤＮＡ認識ユニット（例えば、ｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡ）は、同じ発現ベクターからコードされる。このようなベクターは、ヌクレアーゼ及びＤＮＡ認識ユニットの両方の発現のために真核細胞において活性な単一のシス作用性調節エレメント（例えば、プロモーター）を含み得る。代替的に、ヌクレアーゼ及びＤＮＡ認識ユニットは、それぞれ真核細胞において活性なシス作用性調節エレメント（例えば、プロモーター）に動作可能に連結され得る。
一実施形態によると、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）及びＤＮＡ認識ユニット（例えば、ｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡ）は、異なる発現ベクターからコードされ、それにより真核細胞において活性なシス作用性調節エレメント（例えば、プロモーター）に動作可能にそれぞれ連結される。
開示される構築物は、任意の適切な技術を用いて魚の胚細胞（例えば、接合体）に導入することができる。このような外因性遺伝物質の導入のための多くの技術は、魚及び他の動物において実証されている。これらには、マイクロインジェクション（例えば、Culp et al. (1991)によって記載される）、エレクトロポレーション（例えば、Inoue et al., Cell. Differ. Develop. 29:123-128 (1990)；Muller et al., FEBS Lett. 324:27-32 (1993)；Murakami et al., J. Biotechnol. 34:35-42 (1994)；Muller et al., Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1:276-281 (1992)；及びSymonds et al., Aquaculture 119:313-327 (1994)によって記載される）、粒子ガン衝撃（(Zelenin et al., FEBS Lett. 287:118-120 (1991)）及びリポソームの使用（Szelei et al., Transgenic Res. 3:116-119 (1994)）が含まれる。マイクロインジェクションが好ましい。マイクロインジェクションによる魚の胚細胞への構築物の導入のための好ましい方法は、実施例に記載される。
ティラピア属の魚の胚又は胚細胞は、一般に、産卵直後に卵を採取することによって得ることができる。魚の種類に応じて、卵は、採卵前又は採卵の時点で授精させることが一般的に好ましい。これは、好ましくは、採卵が可能な水槽に１匹のオス及び４～５匹のメスの魚を一緒に入れることによって達成される。最初の細胞分裂前の受精卵細胞は、１つの細胞胚と考えられ、したがって、受精卵細胞は、胚細胞と考えられる。
ＤＮＡ編集剤の導入後、胚は、魚に成長される。これは、通常、卵のインキュベーションに使用されるのと同じ条件下、例えば２７℃の一定の攪拌下で胚をインキュベートすることによって実行される。適切な場合、胚の成長中、導入された構築物の発現を観察することができる。途中の任意の段階において、遺伝子型若しくは表現型又はその両方で魚を選出することができる。
ｓｌｃ４５ａ２遺伝子における機能喪失変異を有する魚は、任意の適切な手段により、魚の成長の任意の段階（例えば、幼魚又は成魚）で同定することができる。
一実施形態によると、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子における機能喪失変異は、表現型で決定される。
ｓｌｃ４５ａ２遺伝子における機能喪失変異は、メラニン合成の欠如、それにより魚がアルビノ赤色表現型を示すことによって明らかであるため、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子における機能喪失変異を含む魚は、黒／グレーの色素沈着が欠如し、且つ皮膚の黒／グレーの斑点が欠如した、皮膚及び目におけるその赤い彩色で同定することができる（上記で議論した通り）。
一実施形態によると、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子における機能喪失変異は、遺伝子型で決定される。
例えば、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子における機能喪失変異は、例えば、ＤＮＡシーケンシング、次世代アンプリコンシーケンシング（ＮＧＳ）、電気泳動法、酵素ベースのミスマッチ検出アッセイ並びにハイブリダイゼーションアッセイ、例えばＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、高解像度融解曲線（ＨＲＭ）、ＲＮａｓｅプロテクション、インサイツハイブリダイゼーション、プライマー伸長法、サザンブロット、ノーザンブロット及びドットブロット分析を用いて、配列変化を検出することによって同定することができる。追加的又は代替的に、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子における機能喪失変異は、例えば、クロマトグラフィ、電気泳動法、免疫検出アッセイ、例えばＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット分析並びに免疫組織化学を用いて、タンパク質レベルで決定することもできる。
さらに、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子における機能喪失変異は、発達中の異なる時点（発生学的に調節された発現又は発達段階特異的な発現）で異なる細胞系譜（細胞系譜特異的な発現）、例えば体細胞又は生殖系列細胞において測定又は同定することができる。
一実施形態によると、変異は、体細胞に存在する。
一実施形態によると、変異は、生殖系列細胞に存在する。
一実施形態によると、遺伝子型の前に表現型が決定される。
一実施形態によると、表現型の前に遺伝子型が決定される。
一実施形態によると、本方法は、魚を育種するステップをさらに含む。
本明細書で使用される場合、「育種」という用語は、魚の系譜の遺伝的構成の遺伝性をもたらすあらゆる生殖方法を包含する。このような生殖方法には、交配、人工受精及び染色体操作（雌性発生及び雄性発生など）が含まれる。適用可能な育種プログラムには、同系交配、異種交配、種間又は属間交配及び選択的育種が含まれる。
「同系交配」は、個体群平均よりも密接に関連している近縁種又は魚の交配を指し、その結果、近交系の子孫が生じる。「異種交配」は、個体群平均よりも密接に関連しない個体の交配を指し、その結果、交雑種子孫が生じる。「種間及び属間交配」は、それぞれ異なる種又は属からの個体の交配を指す。「選択的育種」は、対照と比較したその表現型又は既知の遺伝子型／ハプロタイプに基づいて、優れた個体の交配を可能にすることを指す。
異なる育種プログラムを提携して組み合わせるか又は使用して、本発明のｓｌｃ４５ａ２遺伝子における機能喪失変異を有するアルビノレッドティラピア魚を産生することができる。
当技術分野で知られている任意の魚孵化場業務及び育種プログラムを本発明に従って使用することができる。例えば、Gjedrem, T. 2005, “Selection And Breeding Programs In Aquaculture,” Springer；Tave D, 1999, “Inbreeding and Brood Stock Management,” Fisheries Technical Paper 392, FAO United Nations；Tave D, 1995, “Selective Breeding Programmes,” Fisheries Technical Paper 352, FAO United Nations；Purdom, Colin, 1993, “Genetics and Fish Breeding,” Kluwer；Tave D. 1993, “Genetics for fish hatchery managers,” 2nd ed., Van Nostrand Reinhold, N.Y.；及びKirpichnikov V S, 1981, “Genetic Bases of Fish Selection,” Springer-Verlag, New York；Arai K. “Genetic improvement of finfish species by chromosomal manipulation techniques in Japan,” Aquaculture 197, issues 1-4:205-228, 2001；Khan, T. A., Bhise, M. P. and Lakra, W. S. “Chromosome manipulations in fish--a review.” Indian Journal of Animal Sciences 70: 213-221, 2000；Pandian, T. J. and Koteeswaran, R. “Ploidy induction and sex control in fish,” Hydrobiologia 384: 167-243, 1998を参照されたい。
一実施形態によると、本発明の方法は、同系交配プログラムを含む。新しい品種又は変種を産生するためのあらゆる既知の同系交配技術又はプログラムを使用することができる。この方法では、オスがアルビノレッドティラピア魚であり、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子における機能喪失変異を有すると決定される場合、そのオスは、表現型及び遺伝子型がそのオスに似ている魚の個体群を産生するために、多数のメス並びに複数のその娘及び孫娘と交配される。例えば、オスの魚が交配され、その子孫及び第２世代子孫がその個体群のメンバーと交配され、次に戻ってオスの魚がそのひ孫と交配する。同系交配の別の例は、オスの個体をその娘、孫娘、ひ孫娘などと繰り返し交配させることを含む。後者のプログラムでは、そのオスに遺伝的に非常によく似た個体を産生することができる。得られた近交系の子孫は、遺伝的に改善された魚の新しい変種として維持することができる。特定の実施形態では、２つの異なる近交系列の魚を異種交配させて、両方の優れた形質を有する交雑種を産生することができる。
本発明の別の実施形態では、本方法は、異なる品種又は変種（種内交雑）又は異なる種（種間交雑）、例えば異なるティラピア系統の魚などを伴う異種交配プログラムを含む。異種交配は、ヘテロ接合性を増大させ、子孫の適応度が２つの親系列の平均値の平均を超えるヘテロシス（又は雑種強勢）をもたらすことができる。異種交配は、２つ以上の種又は品種の特徴を組み合わせた新しい品種を開発するために、異なる種又は品種の親を含む遺伝的に遠い親を伴うことができる。異種交配は、病気又は環境要因の変化に対する耐性のための遺伝形質を導入することにより、品種の生存率を上昇させるために使用することができる。交雑種ストライプドバスを作り出すのに使用される技術などの周知の異種交配技術を適用することができる。
本発明の別の実施形態では、本方法は、選択的育種プログラムを含む。選択手順は、個体レベル若しくはファミリーレベルで行うことができ、ファミリー平均に基づいてファミリー全体が選択若しくは選抜される（すなわちファミリー間の選択）か、又はいくつかのファミリーのそれぞれからの最良の魚が保存される（すなわちファミリー内の選択）。保存された魚は、選択された繁殖用魚の第１世代（Ｆ１）になる。それらの子孫は、次に、「Ｆ２世代」などと呼ばれる。選択された繁殖用魚は、その間でランダムに交配することができ、次にこのプロセスが次の世代で繰り返される。多くの種は、一方の性別がより大きく成長するか又はより速く成長する性的二型性を示す。種が性的二型性を示さない場合又は性的二型性が始まる前に選択が起こることになる場合、個体群全体に対して単一のカットオフ値を作成することができる。種が性的二型性を示す場合、各性別に対して別々のカットオフ値を作成しなければならないか、又は選択された個体群は、より大きい性別のみで構成され得る。
個体選択（集団選択としても知られている）において、全ての個体が評価され、魚を選択又は選別する決定は、その魚の表現型値（例えば、アルビノ赤色表現型）のみに基づく。
ファミリー選択は、魚を保存又は選別する決定がファミリーレベルで行われ、個体の表現型値がそのファミリーの平均に関連する場合にのみ重要である点で個体選択と異なる。２種類のファミリー選択を適用することができる。ファミリー間選択及びファミリー内選択を本発明の方法で使用することができる。ファミリー間選択では、各ファミリーの平均値が決定され、次にその平均値がランク付けされる。その後、ファミリー全体が保存又は選別される。ファミリー内選択では、各ファミリーは、一時的な部分個体群であると考えられ、選択は、各ファミリー内で独立して行われる。いずれを保存し、いずれを選別するかを決定するために魚が測定される場合、各ファミリーの魚がランク付けされ、各ファミリーから最良の魚が保存される。
一実施形態によると、本方法は、魚をティラピア属の第２の魚と交配させて、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子における機能喪失変異を有するティラピア属の第３の魚を産生するステップをさらに含む。
特定の実施形態によると、ティラピア属の魚は、本発明のいくつかの実施形態に従い、すなわちｓｌｃ４５ａ２遺伝子における機能喪失変異を付与するＤＮＡ編集剤を魚の接合体に導入することによって作製する。これらの魚（Ｆ０と称される）は、成魚に成長させ、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子における機能喪失変異を有すること及びアルビノ赤色表現型を有することについて、それぞれ遺伝的及び表現型的にスクリーニングされる。ｓｌｃ４５ａ２遺伝子における機能喪失変異を含み、アルビノ赤色表現型を有するオスの魚（Ｆ０）は、メスの野生型ティラピア魚（すなわちｓｌｃ４５ａ２遺伝子における機能喪失変異を有さない）と交雑される。得られた子孫（Ｆ１）は、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子の一方のアレルに機能喪失変異を有する（すなわち、変異がヘテロ接合性である）ことについて選択され、さらに、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子の一方のアレルにおける機能喪失変異を有するティラピア属の第２の魚と交配させて、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子に機能喪失変異を有するティラピア属の第３の魚（すなわち、変異がホモ接合性である）を産生する。得られた子孫（Ｆ２）は、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子に機能喪失変異（すなわち、変異がホモ接合性であること）及びアルビノ赤色表現型を有することについて、遺伝的及び表現型的に選択される。Ｆ２魚は、第２世代の個体群のメンバーと交配させる。
別の特定の実施形態によると、ティラピア属の魚は、本発明のいくつかの実施形態に従い、すなわち、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子における機能喪失変異を付与するＤＮＡ編集剤を魚の接合体に導入することによって、作製する。これらの魚（Ｆ０と称される）は、成魚に成長させ、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子の少なくとも１つのアレルに機能喪失変異を有する（すなわち変異がヘテロ接合性である）ことについて遺伝的にスクリーニングされる。ｓｌｃ４５ａ２遺伝子における機能喪失変異についてヘテロ接合性であるオス及びメスの魚（Ｆ０）は、分離され、変異についてヘテロ接合性である第２の魚と交雑されて、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子に機能喪失変異を有する（すなわち変異がホモ接合性である）ティラピア属の第３の魚を産生する。得られた子孫（Ｆ１）は、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子に機能喪失変異を有すること及びアルビノ赤色表現型を有することについて、それぞれ遺伝的及び表現型的に選択される。Ｆ１魚は、第１世代の個体群のメンバー（Ｆ１）と交配される。
言及したように、育種は、人工受精によって実行され得る。この方法は、特に異なる種又は品種が交雑される場合に認められる。したがって、本発明の特定の実施形態によると、精子／卵を魚から手作業で取り出し、インビトロで受精させることができる。参照により本明細書に援用されるM. Szczepkowski et al., “A simple method for collecting sturgeon eggs using a catheter”, Arch. Pole. Fich. (2011) 19:123-128により教示されるように、取出しは、当技術分野で知られている任意の方法を用いて、例えばカテーテルを用いて成熟したメスから排卵された卵を抽出することによって実行することができる。したがって、卵又は精子は、真空によって除去又は吸引することができる。追加的又は代替的に、卵又は精子は、腹腔から卵又は精子を単にマッサージすることにより得ることができる。次に、受精卵は、本発明のいくつかの実施形態の方法に従い、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子における機能喪失変異を付与するＤＮＡ編集剤を魚の接合体に導入することによって処理される。これらの魚（Ｆ０と称される）は、成魚に成長され、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子の少なくとも１つのアレルに機能喪失変異を有する（すなわち変異がヘテロ接合性である）ことについて遺伝的にスクリーニングされる。ｓｌｃ４５ａ２遺伝子における機能喪失変異についてヘテロ接合性であるオス及びメスの魚（Ｆ０）は、分離され、変異についてヘテロ接合性である第２の魚と交雑されて、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子に機能喪失変異を有する（すなわち変異がホモ接合性である）ティラピア属の第３の魚を産生する。この交雑は、上記で議論されるように、精子／卵の取出し又は自然交配によって達成することができる。得られた子孫（Ｆ１）は、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子に機能喪失変異を有すること及びアルビノ赤色表現型を有することについて、それぞれ遺伝的及び表現型的に選択される。Ｆ１魚は、再度精子／卵を取り出されるか、又は第１世代の個体群のメンバー（Ｆ１）と交配させる。
言及したように、変異についてホモ接合性である魚は、両方の親からの同じ変異を示し得る。代替的に、変異についてホモ接合性である魚は、各アレルにおいて異なる変異（Ｆ０における事象に従って）を示す可能性もあり、したがって２つの異なる変異アレルを保有し得る。
一実施形態によると、ティラピア属の魚は、同じ系統の魚と交配され、すなわち純血種である。純血種は、遺伝的及び表現型的安定性を可能にする遺伝源として有利であり得る。
一実施形態によると、ティラピア属の魚は、異なる系統の魚と交配され、すなわちティラピアバイブリッドである。交雑種は、特定の特徴（例えば、魚の大きさ、温度安定性、塩分耐性など）が正当化される状況において有利であり得る。したがって、例えば、ナイルティラピアは、モザンビークティラピア、ブルーティラピア又はザンジバルティラピアと交雑させることができる。
一実施形態によると、本発明のいくつかの実施形態の魚を含む魚の個体群が提供され、この個体群は、アルビノ赤色表現型について安定している。
本発明は、記載される方法によって作製した魚、その配偶子（精子及び卵）、胚及び後代も包含する。
本明細書で使用される場合、魚の後代は、有性生殖又はクローニングによる第１の魚の子孫であり、遺伝物質が受け継がれている魚である。
本発明のいくつかの実施形態によると、ティラピア魚は、非トランスジェニックである。
本発明のいくつかの実施形態によると、ティラピア魚は、トランスジェニックである。
一実施形態によると、ティラピア魚は、遺伝子改変されていない（非ＧＭＯ）。
一実施形態によると、ティラピア魚は、遺伝子改変されている（ＧＭＯ）。
一実施形態によると、本発明のある実施形態の魚又はその一部を含む飼料又は食品が提供される。
一実施形態によると、飼料又は食品は、魚体、魚の部分、魚粉又は魚油である。
特定の実施形態によると、飼料又は食品は、本発明のいくつかの実施形態に従うアルビノレッドティラピアのゲノムＤＮＡを含む。
本明細書で使用される場合、「魚粉」は、陸揚げした魚及び他の水生動物種（捕獲されたか又は生産されたかのいずれか）をボイルし、水及び油を分離し（例えば、プレスの使用により）、次に乾燥させることにより生成される粉を指す。通常、魚粉は、約１０％以下の水分含量まで乾燥され、その後、魚粉は、室温で流通される。
特定の実施形態によると、魚の飼料又は食品は、すり身、すりつぶした魚肉、ゼラチン、コラーゲン又は魚卵である。
特定の実施形態によると、魚の飼料又は食品は、固体、ペースト又は液体の形態である。
特定の実施形態によると、魚の飼料又は食品は、生であるか、凍結されるか、調理されるか、ボイルされるか、油で揚げられるか又はグリルされる。
本発明は、例えば、化粧品又は肥料などの非食品又は非飼料製品に魚製品を組み込むことにも関する。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、±１０％を指す。
「含む」、「含んでいる」、「包含する」、「包含している」、「有している」という用語及びこれらの活用形は、「含むが、限定されない」を意味する。
「からなる」という用語は、「含み、且つ限定される」を意味する。
「から本質的になる」という用語は、組成物、方法又は構造が追加的な成分、ステップ及び／又は部分を含み得るが、その追加的な成分、ステップ及び／又は部分が、特許請求される組成物、方法又は構造の基本的な及び新規の特徴を実質的に変化させない場合に限られることを意味する。
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数の参照を含む。例えば、「化合物」又は「少なくとも１つの化合物」という用語は、その混合物を含む複数の化合物を含み得る。
本出願を通して、本発明の種々の実施形態は、範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は、単に利便性及び簡潔さのためのものであり、本発明の範囲に対する確固たる限定であると解釈されてはならないことが理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、全ての可能な部分範囲及びその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると考えられるべきである。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分範囲並びにその範囲内の個々の数、例えば１、２、３、４、５及び６を具体的に開示していると考えられるべきである。これは、範囲の広さに関係なく適用される。
本明細書で数の範囲が示される場合には常に、示された範囲内の任意の記載された数（分数又は整数）を含むことを意味する。第１の指示数と第２の表示数との間の「範囲にわたる／範囲」及び第１の指示数「～（から）」第２の指示数の「範囲にわたる／範囲」という語句は、本明細書では互換的に使用され、第１の指示数及び第２の表示数並びにそれらの間の分数及び整数の全てを含むことを意味する。
本明細書で使用される場合、「方法」という用語は、所与の課題を達成するための方法、手段、技術及び手順を指し、化学、薬理学、生物学、生化学及び医学分野の従事者に既知であるか、又は既知の方法、手段、技術及び手順から容易に開発される方法、手段、技術及び手順を含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「処置する」という用語は、状態の進行を抑止するか、実質的に阻害するか、遅らせるか若しくは逆転させること、状態の臨床的症状若しくは審美的症状を実質的に改善すること又は状態の臨床的症状若しくは審美的症状の出現を実質的に防止することを含む。
明確にするために別々の実施形態に関連して記載される本発明の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることが認識される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態に関連して記載される本発明の種々の特徴は、別々に若しくは任意の適切な部分組合せにおいて又は本発明の任意の他の記載される実施形態で適切であるように提供され得る。種々の実施形態に関連して記載される特定の特徴は、それらの要素がなければその実施形態が動作不能でない限り、それらの実施形態の本質的な特徴であると考えられるべきではない。
上記で詳述され、後述する特許請求の範囲で特許請求される本発明の種々の実施形態及び態様は、後述する実施例で実験的な支持を得る。
本出願で開示される任意の配列識別番号（配列番号）は、その配列番号がＤＮＡ配列形式又はＲＮＡ配列形式でのみ表されているとしても、その配列番号が言及される文脈に応じて、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列のいずれかを指し得ると理解される。例えば、配列番号１は、ＤＮＡ配列形式で表される（例えば、チミンについてＴと記述される）が、それは、ｓｌｃ４５ａ２核酸配列に対応するＤＮＡ配列又はＲＮＡ分子核酸配列のＲＮＡ配列のいずれかを指し得る。同様に、いくつかの配列は、記載される分子の実際のタイプに応じて、ＲＮＡ配列形式で表される（例えば、ウラシルについてＵと記述される）が、それは、ｄｓＲＮＡを含むＲＮＡ分子の配列又は示されるＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ分子の配列のいずれかを指し得る。いずれにしても、いずれかの置換と共に開示される配列を有するＤＮＡ及びＲＮＡ分子の両方が想定される。
ここで、後述する実施例が参照されるが、これらの実施例は、上記の記載と共に非限定的に本発明を説明する。
一般に、本明細書で使用される命名法及び本発明で利用される実験手順には、分子技術、生化学的技術、微生物学的技術及び組換えＤＮＡ技術が含まれる。このような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、“Molecular Cloning: A laboratory Manual” Sambrook et al., (1989)；“Current Protocols in Molecular Biology” Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994)；Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)；Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, New York (1988)；Watson et al., “Recombinant DNA”, Scientific American Books, New York；Birren et al. (eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)；米国特許第４，６６６，８２８号明細書；同第４，６８３，２０２号明細書；同第４，８０１，５３１号明細書；同第５，１９２，６５９号明細書及び同第５，２７２，０５７号明細書において記載される方法論；“Cell Biology: A Laboratory Handbook”, Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994)；“Current Protocols in Immunology” Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994)；Stites et al. (eds), “Basic and Clinical Immunology” (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)；Mishell and Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman and Co., New York (1980)を参照されたい。利用可能なイムノアッセイは、特許及び科学文献に広く記載されており、例えば米国特許第３，７９１，９３２号明細書；同第３，８３９，１５３号明細書；同第３，８５０，７５２号明細書；同第３，８５０，５７８号明細書；同第３，８５３，９８７号明細書；同第３，８６７，５１７号明細書；同第３，８７９，２６２号明細書；同第３，９０１，６５４号明細書；同第３，９３５，０７４号明細書；同第３，９８４，５３３号明細書；同第３，９９６，３４５号明細書；同第４，０３４，０７４号明細書；同第４，０９８，８７６号明細書；同第４，８７９，２１９号明細書；同第５，０１１，７７１号明細書及び同第５，２８１，５２１号明細書；“Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J., ed. (1984)；“Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985)；“Transcription and Translation” Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984)；“Animal Cell Culture” Freshney, R. I., ed. (1986)；“Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986)；“A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984)及び“Methods in Enzymology” Vol. 1-317, Academic Press；“PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990)；Marshak et al., “Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996)を参照されたい。これらの全ては、本明細書中に完全に記載されたかのように参照により援用される。その他の一般的な参考文献は、本明細書全体にわたって提供される。その中の手順は、当技術分野で周知であると考えられ、読者の利便性のために提供される。その中に含まれる情報は、全て参照により本明細書に援用される。
一般的な材料及び実験手順
魚の取扱い
実験は、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｅｔｈｉｃｓ ｉｎ Ｕｓｉｎｇ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｎｉｍａｌｓの承認を受けた。性的に成熟したナイルティラピアを１匹のオス及び４～６匹のメスからなるハーレムで１５０Ｌの水槽中で維持した。温度は、２４～２６℃、１４Ｌ：１０Ｄの光周期で維持した。産卵行動についてハーレムを常に監視した。自然産卵の直後に又は体外受精を実施することにより、受精した接合体を集めた［Fernandes, A. F. A. et al., Reproduction in Domestic Animals (2013) 48: 1049-1055］。自然交配によって作製した場合、自然受精の２～３日後にＦ１及びＦ２分析のための幼生を集めた。
魚の取扱い
実験は、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｅｔｈｉｃｓ ｉｎ Ｕｓｉｎｇ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｎｉｍａｌｓの承認を受けた。性的に成熟したナイルティラピアを１匹のオス及び４～６匹のメスからなるハーレムで１５０Ｌの水槽中で維持した。温度は、２４～２６℃、１４Ｌ：１０Ｄの光周期で維持した。産卵行動についてハーレムを常に監視した。自然産卵の直後に又は体外受精を実施することにより、受精した接合体を集めた［Fernandes, A. F. A. et al., Reproduction in Domestic Animals (2013) 48: 1049-1055］。自然交配によって作製した場合、自然受精の２～３日後にＦ１及びＦ２分析のための幼生を集めた。
ｇＲＮＡの標的部位のクローニング
既に記載されたように、ＨｏｔＳＨＯＴ法を用いて、切除ヒレサンプルからゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出した［Meeker, N. D. et al., BioTechniques (2007) 43, 610-614］。ゲノム標的配列は、ＵＣＳＣゲノムブラウザ（ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｇｅｎｏｍｅ（ｄｏｔ）ｕｃｓｃ（ｄｏｔ）ｅｄｕ／）からダウンロードした。ｓｌｃ４５ａ２－エクソン１ゲノム領域（アクセッション番号ＸＭ＿００３４５１４８４）の増幅は、既に記載されたように、特定のプライマー対（後述する表１）を用いて実施した［Segev-Hadar, A. et al., Frontiers in Endocrinology (2020) 11, 94-94］。簡単に言うと、ＰＣＲ産物は、ＤｒｅａｍＴａｑ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（リトアニア国、ヴィリニュス、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて増幅し、１ｘトリス－酢酸－ＥＤＴＡ緩衝液（イスラエル国、キブツベイト－ハエメク、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社）中のＲｅｄｓａｆｅＴＭ染料（韓国、城南市、Ｉｎｔｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を含有する１％アガロース（イスラエル国、モディアン、ＬｉｆｅＧｅｎｅ社）において分析した。ＧＥＬ／ＰＣＲ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（イスラエル国、レホヴォト、Ｈｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ．）を用いて、予測されるアンプリコンサイズのＰＣＲ産物をゲルから抽出し、ｐＧＥＭ（登録商標）－Ｔ ｅａｓｙベクター（米国、ウィスコンシン州、Ｐｒｏｍｅｇａ社）にクローニングし、Ｈｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ．（イスラエル国、レホヴォト）においてＴ７プライマーを用いてシーケンシングした。
既に記載されたように、ＨｏｔＳＨＯＴ法を用いて、切除ヒレサンプルからゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出した［Meeker, N. D. et al., BioTechniques (2007) 43, 610-614］。ゲノム標的配列は、ＵＣＳＣゲノムブラウザ（ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｇｅｎｏｍｅ（ｄｏｔ）ｕｃｓｃ（ｄｏｔ）ｅｄｕ／）からダウンロードした。ｓｌｃ４５ａ２－エクソン１ゲノム領域（アクセッション番号ＸＭ＿００３４５１４８４）の増幅は、既に記載されたように、特定のプライマー対（後述する表１）を用いて実施した［Segev-Hadar, A. et al., Frontiers in Endocrinology (2020) 11, 94-94］。簡単に言うと、ＰＣＲ産物は、ＤｒｅａｍＴａｑ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（リトアニア国、ヴィリニュス、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて増幅し、１ｘトリス－酢酸－ＥＤＴＡ緩衝液（イスラエル国、キブツベイト－ハエメク、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社）中のＲｅｄｓａｆｅＴＭ染料（韓国、城南市、Ｉｎｔｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を含有する１％アガロース（イスラエル国、モディアン、ＬｉｆｅＧｅｎｅ社）において分析した。ＧＥＬ／ＰＣＲ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（イスラエル国、レホヴォト、Ｈｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ．）を用いて、予測されるアンプリコンサイズのＰＣＲ産物をゲルから抽出し、ｐＧＥＭ（登録商標）－Ｔ ｅａｓｙベクター（米国、ウィスコンシン州、Ｐｒｏｍｅｇａ社）にクローニングし、Ｈｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ．（イスラエル国、レホヴォト）においてＴ７プライマーを用いてシーケンシングした。
ＣＲＩＳＰＲ標的部位の設計及び合成
ｓｇＲＮＡの設計及び合成は、若干の修正を伴って、既に記載されたように実施した［Biran, J. et al., Scientific Reports (2020) 10: 9559］。簡単に言うと、ｇＲＮＡは、ＣＨＯＰＣＨＯＰ［Montague, T. G. et al., Nucleic Acids Research (2014) 42: W401-W407］を用いて設計し、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ７キット（米国、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてインビトロで転写し、ｍｉＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット（米国、メリーランド州、ジャーマンタウン、Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。ｓｌｃ４５ａ２特異的ｃｒＲＮＡ（すなわちｇＲＮＡ１～３）及びｔｒａｃｒＲＮＡ（ＴＲＡＣＲＲＮＡ０５Ｎ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｉｓｒａｅｌ Ｌｔｄ．（イスラエル国、レホヴォト）から購入し、１０ｍＭのＴＲＩＺＭＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｉｓｒａｅｌ Ｌｔｄ．）で希釈した。組換えＣａｓ９（ｒＣａｓ９）タンパク質は、Ｗｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｕｎｉｔ（イスラエル国、レホヴォト）により、鋳型としてｐＥＴ－２８ｂ－Ｃａｓ９－Ｈｉｓ（Ａｌｅｘ Ｓｃｈｉｅｒ研究室のプラスミド、米国、マサチューセッツ州、ケンブリッジ、Ａｄｄｇｅｎｅ社）を用いて生成した。研究で使用したｇＲＮＡ標的配列及びｇＲＮＡの配列は、後述する表２Ａ～表２Ｂに記載される。
ｓｇＲＮＡの設計及び合成は、若干の修正を伴って、既に記載されたように実施した［Biran, J. et al., Scientific Reports (2020) 10: 9559］。簡単に言うと、ｇＲＮＡは、ＣＨＯＰＣＨＯＰ［Montague, T. G. et al., Nucleic Acids Research (2014) 42: W401-W407］を用いて設計し、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ７キット（米国、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてインビトロで転写し、ｍｉＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット（米国、メリーランド州、ジャーマンタウン、Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。ｓｌｃ４５ａ２特異的ｃｒＲＮＡ（すなわちｇＲＮＡ１～３）及びｔｒａｃｒＲＮＡ（ＴＲＡＣＲＲＮＡ０５Ｎ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｉｓｒａｅｌ Ｌｔｄ．（イスラエル国、レホヴォト）から購入し、１０ｍＭのＴＲＩＺＭＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｉｓｒａｅｌ Ｌｔｄ．）で希釈した。組換えＣａｓ９（ｒＣａｓ９）タンパク質は、Ｗｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｕｎｉｔ（イスラエル国、レホヴォト）により、鋳型としてｐＥＴ－２８ｂ－Ｃａｓ９－Ｈｉｓ（Ａｌｅｘ Ｓｃｈｉｅｒ研究室のプラスミド、米国、マサチューセッツ州、ケンブリッジ、Ａｄｄｇｅｎｅ社）を用いて生成した。研究で使用したｇＲＮＡ標的配列及びｇＲＮＡの配列は、後述する表２Ａ～表２Ｂに記載される。
マイクロインジェクション手順
ティラピア接合体へのマイクロインジェクション及びｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ヘテロ複合体形成は、一般に、既に記載されたように実施した［Biran, J. et al., Scientific Reports (2020) 10: 9559］。手短に言うと、自然産卵又はＩＶＦの直後にティラピア接合体を集め、単細胞段階でマイクロインジェクション時間を延長するために氷上で２１℃に冷却した。単細胞段階のティラピア接合体に、
（１）ｓｇＲＮＡ１及びｒＣａｓ９；又は
（２）ｓｌｃ４５ａ２ ｇＲＮＡ（すなわちｇＲＮＡ１～ｇＲＮＡ３）の１～３種、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｒＣａｓ９
を含有する混合物を注入した。
ティラピア接合体へのマイクロインジェクション及びｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ヘテロ複合体形成は、一般に、既に記載されたように実施した［Biran, J. et al., Scientific Reports (2020) 10: 9559］。手短に言うと、自然産卵又はＩＶＦの直後にティラピア接合体を集め、単細胞段階でマイクロインジェクション時間を延長するために氷上で２１℃に冷却した。単細胞段階のティラピア接合体に、
（１）ｓｇＲＮＡ１及びｒＣａｓ９；又は
（２）ｓｌｃ４５ａ２ ｇＲＮＡ（すなわちｇＲＮＡ１～ｇＲＮＡ３）の１～３種、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｒＣａｓ９
を含有する混合物を注入した。
ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９又はｇＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９混合物（各ｇＲＮＡ１－３及びｔｒａｃｒＲＮＡについて１００ｐｍｏｌ；又はｓｇＲＮＡについて３９．７２ｐｍｏｌを４．４μｇのｒＣａｓ９と混合し、最終容積は９μｌ）を室温で５分間インキュベートして、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）ヘテロ複合体の作製を可能にした。マイクロインジェクションは、Ｐｕｌ－１０００ ４ステップマイクロピペットプラー（ＷＰＩ社）で引いたガラスキャピラリー（１Ｂ１５０Ｆ－４ １００ｍｍ、米国、フロリダ州、サラソータ、ＷＰＩ社）を用いて実施した。マイクロインジェクションは、約３～５ｎＬの量を送達するように較正されたＰＶ８３０ Ｐｎｅｕｍａｔｉｃ Ｐｉｃｏｐｕｍｐ（ＷＰＩ社）を用いて実行した。マイクロインジェクション後、２７℃の一定の攪拌下で接合体を成長させた。ｇＲＮＡ１について３セット、ｓｇＲＮＡ１＋ｇＲＮＡ２＋ｇＲＮＡ３について１セット及びｇＲＮＡ２＋ｇＲＮＡ３について４セットの注入を実施した。各注入セットは、広い死亡率範囲及び変異率を有する約３０～５０の接合体を含有した。同一条件下で別個に対照の非注入接合体を成長させた。
注入された胚及び子孫の分析
受精の４日後（ｄｐｆ）の全胚又はＦ０及びＦ１魚からの切除ヒレ及び精子からｇＤＮＡを抽出し、ゲノムｓｌｃ４５ａ２－エクソン１における標的領域の増幅のために使用した。増幅産物をクローニングし、上記のようにシーケンシングした。ＭＵＳＣＬＥ（ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｅｂｉ（ｄｏｔ）ａｃ（ｄｏｔ）ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｍｕｓｃｌｅ／）により、検索された配列を整列させた。
受精の４日後（ｄｐｆ）の全胚又はＦ０及びＦ１魚からの切除ヒレ及び精子からｇＤＮＡを抽出し、ゲノムｓｌｃ４５ａ２－エクソン１における標的領域の増幅のために使用した。増幅産物をクローニングし、上記のようにシーケンシングした。ＭＵＳＣＬＥ（ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｅｂｉ（ｄｏｔ）ａｃ（ｄｏｔ）ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｍｕｓｃｌｅ／）により、検索された配列を整列させた。
アンプリコンの次世代シーケンシング（ＮＧＳ）
ｓｐ１及びｓｐ２プライマー（上記の表１）を用いて、注入された４０匹の魚のｇＤＮＡからｇＲＮＡ２及びｇＲＮＡ３の標的領域を増幅した。各アンプリコンは、ＧＥＬ／ＰＣＲ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（イスラエル国、レホヴォト、Ｈｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ．）を用いて精製した。続いて、サンプルをシーケンシングライブラリーの作成のために使用し、Ｓｙｎｔｅｚｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ（イスラエル国、エルサレム）のＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑシステムプロトコルに従ってシーケンシングした。ＮＧＳ Ｃａｓ－アナライザーを用いて、問題なくシーケンシングされた３９個のサンプルのデータを分析した［Park J et al., Bioinformatics (2017) 33: 286-288］。続いて、長さ、ｇＲＮＡ位置、特定されたインデル及び各アレルのリードに従って結果を手作業で分析した。マッピングされていない配列は、重要でないフットプリントであるとみなした。各アレルの頻度は、全リードから計算した。
ｓｐ１及びｓｐ２プライマー（上記の表１）を用いて、注入された４０匹の魚のｇＤＮＡからｇＲＮＡ２及びｇＲＮＡ３の標的領域を増幅した。各アンプリコンは、ＧＥＬ／ＰＣＲ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（イスラエル国、レホヴォト、Ｈｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ．）を用いて精製した。続いて、サンプルをシーケンシングライブラリーの作成のために使用し、Ｓｙｎｔｅｚｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ（イスラエル国、エルサレム）のＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑシステムプロトコルに従ってシーケンシングした。ＮＧＳ Ｃａｓ－アナライザーを用いて、問題なくシーケンシングされた３９個のサンプルのデータを分析した［Park J et al., Bioinformatics (2017) 33: 286-288］。続いて、長さ、ｇＲＮＡ位置、特定されたインデル及び各アレルのリードに従って結果を手作業で分析した。マッピングされていない配列は、重要でないフットプリントであるとみなした。各アレルの頻度は、全リードから計算した。
高解像度融解（ＨＲＭ）分析
ＨｏｔＳＨＯＴ法を用いて、３３０匹のＦ１魚の切除ヒレサンプルからｇＤＮＡを抽出した。各反応は、５μＬのＡｃｃｕｍｅｌｔ（商標）ＨＲＭ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（米国、メリーランド州、ゲイザースバーグ、Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、１μＬのＤＮＡ（１：４００希釈）、３．４μＬの超純水（ＵＰＷ）並びにそれぞれ０．３μＬの１０μＭのフォワード及びリバースプライマー（上記の表１）で構成された。反応は、９６ウェルプレートで実施した。ＷＴ及び既知の変異アレルのゲノムＤＮＡを対照サンプルとして使用し、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）Ｖ２．３ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（米国、カリフォルニア州、フォスターシティ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いてデュプリケートで実行した。増幅は、次の条件下で実施した：９５．０℃で１０分間及び９５．０℃で１５秒間、６０．０℃で３０秒間、７２℃で１５秒間の４０サイクル。融解曲線は、９５．０℃で１５秒間、６０．０℃で１分間、その後、０．３％の傾斜率で温度を９５．０℃まで上昇させる一段階により作成した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｌｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ３．１（米国、カリフォルニア州、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を用いて、８４．１℃～８９．９℃の分析温度範囲でデータベースをさらに分析した。
ＨｏｔＳＨＯＴ法を用いて、３３０匹のＦ１魚の切除ヒレサンプルからｇＤＮＡを抽出した。各反応は、５μＬのＡｃｃｕｍｅｌｔ（商標）ＨＲＭ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（米国、メリーランド州、ゲイザースバーグ、Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、１μＬのＤＮＡ（１：４００希釈）、３．４μＬの超純水（ＵＰＷ）並びにそれぞれ０．３μＬの１０μＭのフォワード及びリバースプライマー（上記の表１）で構成された。反応は、９６ウェルプレートで実施した。ＷＴ及び既知の変異アレルのゲノムＤＮＡを対照サンプルとして使用し、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）Ｖ２．３ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（米国、カリフォルニア州、フォスターシティ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いてデュプリケートで実行した。増幅は、次の条件下で実施した：９５．０℃で１０分間及び９５．０℃で１５秒間、６０．０℃で３０秒間、７２℃で１５秒間の４０サイクル。融解曲線は、９５．０℃で１５秒間、６０．０℃で１分間、その後、０．３％の傾斜率で温度を９５．０℃まで上昇させる一段階により作成した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｌｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ３．１（米国、カリフォルニア州、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を用いて、８４．１℃～８９．９℃の分析温度範囲でデータベースをさらに分析した。
メラニンの定量化
２０匹のランダムに選択されたＦ１魚（５匹のＷＴ及び１５匹のヘテロ接合）の体の中心から５～１０個の鱗をランダムにサンプリングし、ＨＲＭにより遺伝子型を同定した。さらに、Ｆ２ホモ接合性変異体からの鱗をサンプリングして、完全なメラニン喪失を実証した。鱗をＰＦＡで固定し、次にリン酸緩衝食塩水中で３回洗浄した。Ｎｉｋｏｎ ＳＭＺ２５ステレオスコープを用いて、鱗を画像化した。側線管陽性の鱗は、その構造的相違のために除外した。各鱗について上皮面積を測定し、ＩｍａｇｅＪを用いてメラノフォア細胞カウントを実施した。２～８個の鱗／魚からの平均メラノフォア密度をメラノフォア／ｍｍ２として計算した。
２０匹のランダムに選択されたＦ１魚（５匹のＷＴ及び１５匹のヘテロ接合）の体の中心から５～１０個の鱗をランダムにサンプリングし、ＨＲＭにより遺伝子型を同定した。さらに、Ｆ２ホモ接合性変異体からの鱗をサンプリングして、完全なメラニン喪失を実証した。鱗をＰＦＡで固定し、次にリン酸緩衝食塩水中で３回洗浄した。Ｎｉｋｏｎ ＳＭＺ２５ステレオスコープを用いて、鱗を画像化した。側線管陽性の鱗は、その構造的相違のために除外した。各鱗について上皮面積を測定し、ＩｍａｇｅＪを用いてメラノフォア細胞カウントを実施した。２～８個の鱗／魚からの平均メラノフォア密度をメラノフォア／ｍｍ２として計算した。
実施例１
ナイルティラピアゲノムにおけるｓｌｃ４５ａ２遺伝子の特定
既に特定されたゼブラフィッシュｓｌｃ４５ａ２ ｍＲＮＡ配列（ＮＭ＿００１１１０３７７）を用いて、ナイルティラピアｓｌｃ４５ａ２遺伝子を探索した［上述したDooley, C. M. et al., (2013)］。ゼブラフィッシュ配列をクエリー入力として使用し、ナイルティラピア（ｔａｘｉｄ：８１２８）のヌクレオチドコレクションデータベースに対してＢＬＡＳＴｎ検索を実施した。予想通り、この検索により、（現在の染色体の番号付けに基づく）ｃｈｒＬＧ７に局在し、ヌクレオチド配列の５’において７７％を超える同一性を共有する単一の予測ｓｌｃ４５ａ２ ｍＲＮＡ（ＸＭ＿００３４５１４８４）が得られた。哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類及び魚類を含む種々の脊椎動物種からのｓｌｃ４５ａ２ ｍＲＮＡ配列の系統発生解析により、系統根として無顎類ウミヤツメを用いて、ｓｌｃ４５ａ２は、魚からヒトに進化的に保存されていることが実証された（図１Ａ）。さらに、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子は、ゼブラフィッシュだけでなく、ヒト及びニワトリでもその染色体領域の高度のシンテニー保存を実証した（図１Ｂ）。これらの知見により、脊椎動物における共通祖先ｓｌｃ４５ａ２遺伝子の仮説が支持され、進化を通してＳＬＣ４５Ａ２の機能的保存が示唆される。
ナイルティラピアゲノムにおけるｓｌｃ４５ａ２遺伝子の特定
既に特定されたゼブラフィッシュｓｌｃ４５ａ２ ｍＲＮＡ配列（ＮＭ＿００１１１０３７７）を用いて、ナイルティラピアｓｌｃ４５ａ２遺伝子を探索した［上述したDooley, C. M. et al., (2013)］。ゼブラフィッシュ配列をクエリー入力として使用し、ナイルティラピア（ｔａｘｉｄ：８１２８）のヌクレオチドコレクションデータベースに対してＢＬＡＳＴｎ検索を実施した。予想通り、この検索により、（現在の染色体の番号付けに基づく）ｃｈｒＬＧ７に局在し、ヌクレオチド配列の５’において７７％を超える同一性を共有する単一の予測ｓｌｃ４５ａ２ ｍＲＮＡ（ＸＭ＿００３４５１４８４）が得られた。哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類及び魚類を含む種々の脊椎動物種からのｓｌｃ４５ａ２ ｍＲＮＡ配列の系統発生解析により、系統根として無顎類ウミヤツメを用いて、ｓｌｃ４５ａ２は、魚からヒトに進化的に保存されていることが実証された（図１Ａ）。さらに、ｓｌｃ４５ａ２遺伝子は、ゼブラフィッシュだけでなく、ヒト及びニワトリでもその染色体領域の高度のシンテニー保存を実証した（図１Ｂ）。これらの知見により、脊椎動物における共通祖先ｓｌｃ４５ａ２遺伝子の仮説が支持され、進化を通してＳＬＣ４５Ａ２の機能的保存が示唆される。
実施例２
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の設計及びティラピア接合体への適用
ナイルティラピアの地理分布が広域的であることは、比較的高い遺伝的多様性につながる。ｓｌｃ４５ａ２に対して非常に特異的なｇＲＮＡを設計することを目的として、そのエクソン１を繁殖用ストックにおいて社内でシーケンシングし、ナイルティラピアゲノムの公的な配列とそれぞれ１ヌクレオチドが異なる２つのアレルを特定した（図５）。４つの特異的なｇＲＮＡを使用し、そのうちの１つ（ｓｇＲＮＡ１）は、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として合成した。マイクロインジェクション前にｇＲＮＡをｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒＲＮＡ）及び組換えＣａｓ９（ｒＣａｓ９）タンパク質と混合し、ＲＮＰヘテロ複合体の生成を可能にした。同様に、ｓｇＲＮＡをｒＣａｓ９タンパク質と混合して、ＲＮＰヘテロ複合体の生成を可能にした。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の設計及びティラピア接合体への適用
ナイルティラピアの地理分布が広域的であることは、比較的高い遺伝的多様性につながる。ｓｌｃ４５ａ２に対して非常に特異的なｇＲＮＡを設計することを目的として、そのエクソン１を繁殖用ストックにおいて社内でシーケンシングし、ナイルティラピアゲノムの公的な配列とそれぞれ１ヌクレオチドが異なる２つのアレルを特定した（図５）。４つの特異的なｇＲＮＡを使用し、そのうちの１つ（ｓｇＲＮＡ１）は、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として合成した。マイクロインジェクション前にｇＲＮＡをｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒＲＮＡ）及び組換えＣａｓ９（ｒＣａｓ９）タンパク質と混合し、ＲＮＰヘテロ複合体の生成を可能にした。同様に、ｓｇＲＮＡをｒＣａｓ９タンパク質と混合して、ＲＮＰヘテロ複合体の生成を可能にした。
単細胞段階のナイルティラピア接合体にｓｌｃ４５ａ２－ＲＮＰをマルチプレックスでマイクロ注入し、４ｄｐｆにメラニンの発生を追跡した。この発達段階では、非注入ティラピア胚は、その体及び卵黄表面の著しい量のメラノフォアと、目における明らかなメラニン形成とを示した（図２Ａ～図２Ｃ）。際立ったことに、ｓｌｃ４５ａ２－ＲＮＰを注入した幼生は、その体及び目においてメラニンの重度～完全な喪失を示した（図２Ｄ～図２Ｆ）。ｓｌｃ４５ａ２－ＲＮＰ注入幼生から抽出したｇＤＮＡを用いた標的領域の分析により、胚によって異なる複数のゲノムインデルが実証された（図２Ｇ）。さらに、データは、ｓｇＲＮＡ及び２成分（ｔｒａｃｒＲＮＡを伴うｇＲＮＡ）の両方が、接合体へのマイクロインジェクションにより、ゲノムインデルを誘導するために使用され得ることを示した。
注入した魚における編集事象のより高い解像度を得ることを目的として、４つの異なる注入セッションから多重注入した魚からのｇＲＮＡ２及びｇＲＮＡ３のゲノム標的領域にアンプリコンのシーケンシングを受けさせた。この分析は、注入した魚の全てにおける変異原性活性の可変レベルを明らかにした（図２Ｈ）。しかしながら、全ての魚は、変異アレルを示した（データは示されない）。一般的な変異原性の結果の分析により、ほとんどの変異アレルが両方のｇＲＮＡの共活性又はｇＲＮＡ３の単独活性に起因するが、ｇＲＮＡ２の排他的な活性に起因するアレルは、ほとんど検出されないことが示された（図２Ｉ）。ｇＲＮＡ特異的変異原性活性のさらなる分析は、ｇＲＮＡ２の活性がより低いと、変異原性の結果も大幅に少なくなることとを示した（図２Ｊ）。それにもかかわらず、両方のｇＲＮＡの組合せ活性は、７０個の独特なアレルの発生をもたらした（データは示されない）。
実施例３
ｓｌｃ４５ａ２変異アレルを有する生殖系列の作製
ｓｌｃ４５ａ２機能喪失の一過性の効果の分析に続いて、本発明者らは、次に、ティラピアｓｌｃ４５ａ２において遺伝的なヌル変異を誘導することを目的とした。ゼブラフィッシュでは、多重化が変異誘発スループットを増大させ得ることと、魚の接合体においてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を一過性に使用する場合、オフターゲット変異誘発の心配が少ないこととが以前に実証されている［Varshney, G. K. et al., Genome Research, (2015)］。したがって、ｇＲＮＡ２及びｇＲＮＡ３を含有するＲＮＰ（図３Ａ）をナイルティラピア接合体に同時注入することによってｓｌｃ４５ａ２－エクソン１を標的とした。トリプルｓｌｃ４５ａ２－ＲＮＰ多重化（図２Ｇ）の場合と同様に、同時注入した胚は、その体及び目の全体でメラニンの大幅な低減を示した（図３Ａ～図３Ｅ）。具体的には、注入しなかった同胞は、受精の１か月後に正常な色素の発生を示した（図３Ｂ）が、注入したＦ０魚のうちの１匹は、皮膚において約９７～９９％のメラニンの喪失を示し、目ではメラニンが見られず（図３Ｃ）、その発生初期における非常に強力な変異原性活性が示唆される。眼皮膚白皮症（ＯＣＡ）の表現型、すなわち赤色表現型をもたらす目及び皮膚におけるメラニンの完全な喪失は、注入しなかった同胞（図３Ｄ）と比較して、このオスの性的成熟まで持続した（図３Ｅ）。
ｓｌｃ４５ａ２変異アレルを有する生殖系列の作製
ｓｌｃ４５ａ２機能喪失の一過性の効果の分析に続いて、本発明者らは、次に、ティラピアｓｌｃ４５ａ２において遺伝的なヌル変異を誘導することを目的とした。ゼブラフィッシュでは、多重化が変異誘発スループットを増大させ得ることと、魚の接合体においてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を一過性に使用する場合、オフターゲット変異誘発の心配が少ないこととが以前に実証されている［Varshney, G. K. et al., Genome Research, (2015)］。したがって、ｇＲＮＡ２及びｇＲＮＡ３を含有するＲＮＰ（図３Ａ）をナイルティラピア接合体に同時注入することによってｓｌｃ４５ａ２－エクソン１を標的とした。トリプルｓｌｃ４５ａ２－ＲＮＰ多重化（図２Ｇ）の場合と同様に、同時注入した胚は、その体及び目の全体でメラニンの大幅な低減を示した（図３Ａ～図３Ｅ）。具体的には、注入しなかった同胞は、受精の１か月後に正常な色素の発生を示した（図３Ｂ）が、注入したＦ０魚のうちの１匹は、皮膚において約９７～９９％のメラニンの喪失を示し、目ではメラニンが見られず（図３Ｃ）、その発生初期における非常に強力な変異原性活性が示唆される。眼皮膚白皮症（ＯＣＡ）の表現型、すなわち赤色表現型をもたらす目及び皮膚におけるメラニンの完全な喪失は、注入しなかった同胞（図３Ｄ）と比較して、このオスの性的成熟まで持続した（図３Ｅ）。
次に、ｓｌｃ４５ａ２－ＲＮＰ誘導性の体細胞と生殖系列インデルとの間の可能性のある相関関係を調査した。アルビノのオスの切除ヒレ及び精子から抽出したｇＤＮＡを用いて、ｓｌｃ４５ａ２－エクソン１の標的領域を増幅し、個々のシーケンシングのためにクローニングした。切除ヒレのｇＤＮＡからの１０個のコロニー及び精子のｇＤＮＡからの１８個のコロニーの分析により、ヒレにおいて６個の異なるインデルと、精子において８個（７個の変異体＋ＷＴ）の異なる産物とが特定され、そのうちの２つは、ヒレと精子との間で同一であり（図４Ａ～Ｂ）、体細胞事象と胚細胞事象との間の低～中程度の相関関係が示唆された。それにもかかわらず、精子は、軽度の物理的圧力の適用によって抽出されたため、このサンプルで特定されたインデルの一部は、生殖腺の体細胞に由来するｇＤＮＡから生じた可能性がある。したがって、オスを野生型（ＷＴ）のメスと交雑させ、Ｆ１魚からの切除ヒレの配列分析を実施した。この分析は、Ｆ１ヘテロ接合性子孫において、精子で特定された変異アレルの全てとＷＴアレルとが存在することを実証した（図４Ｃ）。まとめると、Ｆ０アルビノ変異体及びそのヘテロ接合性Ｆ１子孫からのｇＤＮＡの配列分析により、新規のｓｌｃ４５ａ２変異アレルが遺伝性であり、安定していることが明らかに示された。
実施例４
高解像度融解（ＨＲＭ）分析及びＦ２表現型決定
ｓｌｃ４５ａ２－／＋遺伝子型を保有するＦ１魚は、そのＷＴ同胞と比べて色素沈着の変化を示さず（図６Ａ～図６Ｄ）、これによりＦ１子孫をその遺伝子型に従って選別するための効率的な方法の必要性が生じた。ＨＲＭは、ゲノム編集により生じた変異を検出するための効果的な方法として以前に示された［Thomas HR et al., PLOS ONE. (2014) 9:e114632］。ＨＲＭは、低コスト、高スループット及び高感度であるため、ｓｌｃ４５ａ２－／＋Ｆ１個体群におけるアレル遺伝頻度の評価のためのその適用を試験するために選択された。このために、５匹のランダムなメスが産んだ３３０匹のＦ１子孫のテイルクリップから抽出されたｇＤＮＡを、ＨＲＭを用いて分析した。分析により、精子で特定された全ての変異アレルの存在が明らかになった。驚くべきことに、分析されたいくつかの胚の融解曲線は、既知のアレルの参照ＤＮＡのいずれとも一致しなかった。これらの個体の標的領域のサンガーシーケンシングにより、Ｆ１個体群内に３つの追加的な変異アレルの存在が確認された。したがって、１０個の異なる遺伝性変異アレルが特定された（図４Ｃ）。これらの結果は、ＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓ９編集個体群の評価に対するこのアッセイの高スループット及び精度を強調する。
高解像度融解（ＨＲＭ）分析及びＦ２表現型決定
ｓｌｃ４５ａ２－／＋遺伝子型を保有するＦ１魚は、そのＷＴ同胞と比べて色素沈着の変化を示さず（図６Ａ～図６Ｄ）、これによりＦ１子孫をその遺伝子型に従って選別するための効率的な方法の必要性が生じた。ＨＲＭは、ゲノム編集により生じた変異を検出するための効果的な方法として以前に示された［Thomas HR et al., PLOS ONE. (2014) 9:e114632］。ＨＲＭは、低コスト、高スループット及び高感度であるため、ｓｌｃ４５ａ２－／＋Ｆ１個体群におけるアレル遺伝頻度の評価のためのその適用を試験するために選択された。このために、５匹のランダムなメスが産んだ３３０匹のＦ１子孫のテイルクリップから抽出されたｇＤＮＡを、ＨＲＭを用いて分析した。分析により、精子で特定された全ての変異アレルの存在が明らかになった。驚くべきことに、分析されたいくつかの胚の融解曲線は、既知のアレルの参照ＤＮＡのいずれとも一致しなかった。これらの個体の標的領域のサンガーシーケンシングにより、Ｆ１個体群内に３つの追加的な変異アレルの存在が確認された。したがって、１０個の異なる遺伝性変異アレルが特定された（図４Ｃ）。これらの結果は、ＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓ９編集個体群の評価に対するこのアッセイの高スループット及び精度を強調する。
Ｆ１個体群におけるアレル頻度により、差次的なアレル遺伝が明らかになった（図７Ａ）。Ｆ１個体群の２６．７％は、ＷＴであると特徴付けられた。アレルＯ５（単一部位のインデル）は、最高の遺伝頻度（１６．７％）を示したが、恐らくマルチプレックスＲＮＰ活性に起因するアレルＯ８は、最低のアレル頻度（１．８％；図７Ａ）を示した。興味深いことに、他の変異アレルは、Ｆ１個体群において５．８％～１１．５％の頻度を示し、ゲノムＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の結果と、その遺伝レベルとの間に明らかな相関関係はなかった（後述する表３）。ＨＲＭ分析が高感度であるにもかかわらず、２ヌクレオチドだけ異なるアレルＯ７及びＯ１０は、区別することができなかったため、これらの２つのアレルは、一緒に提示された。個々の部位のゲノム結果の分析により、両方のＲＮＰが同一のモル比でマイクロ注入されたが、生殖系列伝達のレベルでは、部位３は、より高い変異原性応答（Ｆ１子孫の７３％）を示し、部位２は、約５０％の遺伝性子孫を示すことが明らかになった（図７Ｂ～図７Ｃ及び後述する表３）。
Ｆ１魚をＦ１魚と交雑させることにより、ｓｌｃ４５ａ２－／－遺伝子型を保有するＦ２魚を作製した。５ｄｐｆのＦ２胚の表現型分析は、メンデル遺伝を有するＯＣＡ表現型を示した（図７Ｄ～図７Ｆ）。さらに、Ｆ２変異体のこのＯＣＡ表現型は性的成熟後も持続し、その結果、赤い目を有するアルビノ赤色魚が生じた（図８Ａ～図８Ｂ）。
本発明は、その特定の実施形態と関連して記載されたが、多くの代替形態、修正形態及び変化形態が当業者に明らかになることは明白である。したがって、特許請求の範囲の趣旨及び広い範囲内に入る全てのこのような代替形態、修飾形態及び変化形態を包含することが意図される。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許及び特許出願は、参照により本明細書に援用されると言及されている場合、あたかも個々の刊行物、特許又は特許出願がそれぞれ具体的且つ個別に記載されたかのように参照によりその全体が本明細書に援用されることが本出願人の意図である。加えて、本出願中の任意の参考文献の引用又は特定は、このような参考文献が本発明の先行技術として利用可能であることの承認として解釈されてはならない。セクションの見出しが使用されている範囲では、それらは、必ずしも限定的であると解釈されるべきではない。さらに、本出願の任意の優先権文献は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
配列番号３： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号４： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号５： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号６： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号７： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号８： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号９： ｇＲＮＡ標的配列
配列番号１０： ｇＲＮＡ標的配列
配列番号１１： ｇＲＮＡ標的配列
配列番号１２： ｇＲＮＡ標的配列
配列番号１３： ｇＲＮＡ核酸配列
配列番号１４： ｇＲＮＡ核酸配列
配列番号１５： ｇＲＮＡ核酸配列
配列番号１６： ｓｇＲＮＡ核酸配列
配列番号１７： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号１８： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号１９： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号２０： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号２１： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号２２： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号２３： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号２４： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号２５： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号２６： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号２７： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号２８： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号２９： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号３０： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号３１： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号３２： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号３３： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号３４： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号３５： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号３６： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号３７： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号３８： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号３９： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号４０： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号４１： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号４２： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号４３： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号４４： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号４５： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号４６： ゲノムデータベースのゲノムｓｌｃ４５ａ２－エクソン１（ｃｈｒＬＧ７（リバース鎖）：１６１５７４２０－１６１５６９６９
配列番号４７： ナイルティラピア繁殖用ストックのアレル１
配列番号４８： ナイルティラピア繁殖用ストックのアレル２
配列番号４９： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号５０： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号４： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号５： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号６： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号７： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号８： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号９： ｇＲＮＡ標的配列
配列番号１０： ｇＲＮＡ標的配列
配列番号１１： ｇＲＮＡ標的配列
配列番号１２： ｇＲＮＡ標的配列
配列番号１３： ｇＲＮＡ核酸配列
配列番号１４： ｇＲＮＡ核酸配列
配列番号１５： ｇＲＮＡ核酸配列
配列番号１６： ｓｇＲＮＡ核酸配列
配列番号１７： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号１８： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号１９： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号２０： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号２１： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号２２： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号２３： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号２４： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号２５： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号２６： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号２７： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号２８： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号２９： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号３０： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号３１： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号３２： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号３３： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号３４： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号３５： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号３６： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号３７： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号３８： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号３９： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号４０： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号４１： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号４２： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号４３： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号４４： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号４５： ｇＤＮＡ産物のシーケンシング
配列番号４６： ゲノムデータベースのゲノムｓｌｃ４５ａ２－エクソン１（ｃｈｒＬＧ７（リバース鎖）：１６１５７４２０－１６１５６９６９
配列番号４７： ナイルティラピア繁殖用ストックのアレル１
配列番号４８： ナイルティラピア繁殖用ストックのアレル２
配列番号４９： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号５０： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
Claims (35)
- ｓｌｃ４５ａ２遺伝子に機能喪失変異を含むティラピア属の魚であって、前記変異がホモ接合型であり、前記機能喪失変異が前記魚のアルビノ赤色表現型をもたらす、魚。
- 前記アルビノ赤色表現型が黒／グレーの色素沈着を欠いている、請求項１に記載の魚。
- 前記アルビノ赤色表現型が赤い目の表現型を含む、請求項１又は２に記載の魚。
- 前記機能喪失変異が遺伝性である、請求項１～３のいずれか一項に記載の魚。
- 請求項１～４のいずれか一項に記載の魚を作製する方法であって、
（ａ）前記ティラピア属の魚の接合体に、前記ｓｌｃ４５ａ２遺伝子における機能喪失変異を付与するＤＮＡ編集剤を導入するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）の前記接合体を魚に成長させるステップ
を含み、それにより前記魚を作製する、方法。 - （ｃ）前記ｓｌｃ４５ａ２遺伝子に前記機能喪失変異を含む前記ティラピア属の魚を同定するステップ
をさらに含む、請求項５に記載の方法。 - （ｄ）前記ステップ（ｂ）又は（ｃ）の前記魚を前記ティラピア属の第２の魚と交配させて、前記ｓｌｃ４５ａ２遺伝子における前記機能喪失変異を有する前記ティラピア属の第３の魚を産生するステップ
をさらに含む、請求項５又は６に記載の方法。 - 前記魚及び前記第２の魚の両方が、前記ｓｌｃ４５ａ２遺伝子に機能喪失変異を有する少なくとも１つのアレルを保有する、請求項７に記載の方法。
- 前記第３の魚が、前記ｓｌｃ４５ａ２遺伝子の前記機能喪失変異についてホモ接合性である、請求項７又は８に記載の方法。
- 前記変異が、欠失、挿入、点変異、インデル及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の魚又は請求項５～９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変異が、前記ｓｌｃ４５ａ２遺伝子の２つ以上の変異を含む、請求項１～４若しくは１０のいずれか一項に記載の魚又は請求項５～１０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変異が、配列番号１に対応する配列番号９、１０、１１及び１２から選択される配列を有する標的配列内にある、請求項１～４又は１０若しくは１１のいずれか一項に記載の魚或いは請求項５～１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変異が、体細胞において発現される、請求項１～４若しくは１０～１２のいずれか一項に記載の魚又は請求項５～１２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変異が、生殖系列細胞において発現される、請求項１～４若しくは１０～１２のいずれか一項に記載の魚又は請求項５～１２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ティラピア属の魚が純血種である、請求項１若しくは１０～１４のいずれか一項に記載の魚又は請求項５～１４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ティラピア属の魚が交雑種である、請求項１若しくは１０～１４のいずれか一項に記載の魚又は請求項５～１４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ティラピア属の魚が、ナイルティラピア（Oreochromis niloticus）、ブルーティラピア（Oreochromis aureus）、モザンビークティラピア（Oreochromis mossambicus）、ワミティラピア（Oreochromis urolepis）、スリースポッティドティラピア（Oreochromis andersonii）、ロングフィンティラピア（Oreochromis macrochir）、サバキティラピア（Oreochromis spilurus）、ブラックチンティラピア（Sarotherodon melanotheron）、マンゴーティラピア（Sarotherodon galilaeus）、ギニアティラピア（Coptodon guineensis）、レッドブレストティラピア（Coptodon rendalli）及びレッドベリーティラピア（Coptodon zillii）からなる群から選択される、請求項１～４若しくは１０～１６のいずれか一項に記載の魚又は請求項５～１６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＤＮＡ編集剤の導入が、２種以上のＤＮＡ編集剤の導入を含む、請求項５～１７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記２種以上のＤＮＡ編集剤が前記ｓｌｃ４５ａ２遺伝子内の別個の部位を標的とする、請求項１８に記載の方法。
- 前記ＤＮＡ編集剤が少なくとも１種のｇＲＮＡを含む、請求項５～１９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＤＮＡ編集剤がエンドヌクレアーゼを含む、請求項５～２０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記エンドヌクレアーゼがＣａｓ９を含む、請求項２１に記載の方法。
- 前記ＤＮＡ編集剤が、ＣＲＩＳＰＲ－エンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるＤＮＡ編集システムを含む、請求項５～２２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＤＮＡ編集剤がＤＮＡ、ＲＮＡ又はＲＮＰとして前記細胞に適用される、請求項５～２３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＤＮＡ編集剤が、魚細胞における発現を監視するためのレポーターに連結される、請求項５～２４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レポーターが蛍光タンパク質である、請求項２５に記載の方法。
- 前記機能喪失変異を遺伝子型で決定する、請求項５～２６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記機能喪失変異を表現型で決定する、請求項５～２６のいずれか一項に記載の方法。
- 表現型を遺伝子型の前に決定する、請求項２７又は２８に記載の方法。
- 遺伝子型を表現型の前に決定する、請求項２７又は２８に記載の方法。
- 請求項１～４又は１０～１７のいずれか一項に記載の魚の後代。
- 請求項１～４又は１０～１７のいずれか一項に記載の魚を含む魚の個体群であって、前記アルビノ赤色表現型が安定している、個体群。
- 請求項１～４又は１０～１７のいずれか一項に記載の魚の細胞。
- 請求項１～４又は１０～１７のいずれか一項に記載の魚を含む飼料又は食品。
- 魚体、魚の部分、魚粉又は魚油である、請求項３４に記載の飼料又は食品。
Applications Claiming Priority (3)
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|---|---|---|---|
| US202063113892P | 2020-11-15 | 2020-11-15 | |
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|---|---|---|---|
| JP2023528722A Pending JP2023550070A (ja) | 2020-11-15 | 2021-11-15 | ティラピア魚の遺伝子編集されたアルビノ赤色生殖系列 |
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