WO2006137515A1 - シノビオリンの機能阻害ポリペプチドを有効成分とする癌治療剤 - Google Patents

シノビオリンの機能阻害ポリペプチドを有効成分とする癌治療剤 Download PDF

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WO2006137515A1
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WO
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polypeptide
protein
synoviolin
present
cancer
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PCT/JP2006/312591
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Toshihiro Nakajima
Takeshi Sasaki
Minako Nakazawa
Satoshi Yamazaki
Tetsuya Amano
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Locomogene, Inc.
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • compositions comprising synoviolin function-inhibiting polypeptides as active ingredients
  • the present invention relates to a polypeptide having an activity of inhibiting the function of Synoviolin protein, a P53 protein activator comprising the polypeptide as an active ingredient, and a cancer therapeutic agent comprising the p53 protein activator as an active ingredient.
  • a polypeptide having an activity of inhibiting the function of Synoviolin protein a P53 protein activator comprising the polypeptide as an active ingredient
  • a cancer therapeutic agent comprising the p53 protein activator as an active ingredient.
  • Synoviolin is a novel protein discovered as a membrane protein that is overexpressed in synovial cells derived from rheumatic patients (see Patent Document 1). Research using genetically modified animals revealed that Synoviolin is an essential molecule for the development of rheumatoid arthritis.
  • the p53 gene is located on chromosome 17 pl3 and is a very important tumor suppressor gene in the development and proliferation of cancer cells.
  • the p53 protein recognizes a specific base sequence [5 '-(A / T) GPyPyPy-3')] on DNA and promotes transcriptional activation of specific genes such as p21, GADD45, and BAX.
  • specific genes such as p21, GADD45, and BAX.
  • physiological functions such as specific binding to DNA containing mismatch are known.
  • Patent Literature l WO02 / 052007
  • An object of the present invention is to provide a drug that suppresses cancer. More specifically, p53 protein It is an object of the present invention to provide an activator for cancer and a cancer therapeutic agent containing the activator as an active ingredient. Means for solving the problem
  • the present inventors have intensively studied to solve the above problems.
  • a detailed analysis of synoviolin homozygous animals revealed that a larger number of apoptotic cells were observed compared to the wild type, and the p53 protein, which is deeply involved in the induction of apoptosis, was localized in the nucleus. And was found to be strongly expressed. It was also found that by inhibiting the function of Synoviolin, the P53 tumor suppressor gene or p53 tumor suppressor protein is activated and the growth of cancer cells is blocked.
  • Synoviolin suppresses its expression level and function as a transcription factor by ubiquitinating and degrading p53, a tumor suppressor gene product.
  • the present inventors fused each Synoviolin protein fragment with the GST protein and examined the binding activity with the full-length p53 protein translated in vitro. It was found that 35 amino acids of positions 236 to 270 are necessary and sufficient for binding.
  • a peptide encoding this 35 amino acids (hereinafter sometimes referred to as “53BD (p53-binding omain)”) competitively inhibited the binding of GST_Synoviolin • ⁇ to full-length p53.
  • 53BD-deficient synoviolin ( ⁇ 2 36-270) was introduced into cells together with p53, and immunoprecipitation experiments were performed, the 53BD-deficient and p53 were bound and weak. Wild-type Synoviolin, which had p53 accumulated in the cytoplasm, had no activity in the 3BD deletion mutant.
  • 53BD is a region necessary for binding to Synoviolin 3 ⁇ 453 and inhibiting its function as a tumor suppressor gene product in vitro and in vivo. did. That is, it was found that a partial fragment peptide of Synoviolin protein containing a region necessary for binding to p53 has a function of activating p53 by suppressing the function of Synopioline by competitive inhibition, and completed the present invention. I let you.
  • the present invention relates to an activator of P53 protein comprising a synoviolin protein partial fragment polypeptide as an active ingredient, and a cancer therapeutic agent comprising the activator as an active ingredient.
  • P53 protein activation comprising the polypeptide according to any one of the following (a) to (d), which contains as an active ingredient a polypeptide having a function of substantially binding to p53 protein Agent,
  • a P53 protein activator comprising, as an active ingredient, a vector comprising a polynucleotide encoding the polypeptide according to any one of (a) to (d) in [1],
  • a cancer therapeutic agent comprising the p53 protein activator according to [1] or [2] as an active ingredient
  • a method for inhibiting cytoplasmic retention of p53 protein which comprises introducing the polypeptide according to any one of (a) to (d) of [1] into a cell,
  • a method for localizing a p53 protein in the nucleus which comprises introducing the polypeptide according to any one of (a) to (d) in [1] into a cell,
  • a method for inhibiting the binding of Synoviolin protein and P53 protein comprising introducing the polypeptide according to any one of (a) to (d) of [1] into a cell, [8] A method for enhancing phosphorylation of p53 protein, which comprises introducing the polypeptide according to any one of (a) to (d) of [1] into a cell;
  • a method for inhibiting P53 protein ubiquitin characterized by introducing the polypeptide according to any one of (a) to (d) in [1] into a cell,
  • the present invention provides a method for inhibiting cancer, characterized in that p53 protein is activated by the method described in any one of [5] to [9].
  • the present invention comprises the above polypeptide according to the present invention, a vector containing a polynucleotide encoding the polypeptide, the p53 protein activator, or the p53 protein activator as an active ingredient.
  • a method for preventing or treating cancer comprising the step of administering a cancer therapeutic agent is provided.
  • the present invention also provides use of the above-described polypeptide according to the present invention or a vector comprising a polynucleotide encoding the polypeptide in the production of a p53 protein activator or a cancer therapeutic agent.
  • FIG. 1 is a photograph showing the results of fluorescent immunohistochemical staining in Synoviolin homo knockout mouse fetal fibroblasts (MEF).
  • FIG. 2 is a photograph showing the results of immunohistochemical staining with anti-p53 antibody in syno-/-embryos.
  • FIG. 3 is a photograph showing the results of Western blotting for p53.
  • FIG. 4 is a photograph showing the results of identifying the phosphorylation site of p53 in syno-/-MEF cultured cells.
  • FIG. 5 is a photograph of Western blotting investigating how Serl5 phosphorylation enhanced by siRNA treatment against Synoviolin is affected by force-fein supplementation.
  • FIG. 6 is a photograph of Western blotting showing that the expression of p53 and p21 is increased by siRNA treatment against Synoviolin.
  • FIG. 7 is a diagram showing the observation results of the cell cycle with a flow cytometer.
  • FIG. 8 is a photograph showing the result of immunostaining the Tissue array with an anti-sinoviolin antibody (lODa).
  • FIG. 9 is a photograph showing the result of immunostaining the Tissue array with an anti-sinoviolin antibody (lODa).
  • FIG. 10 is a photograph observing the localization of p53 in cells transfected with GFP wild type p53.
  • FIG. 11 is a photograph of GFP wild type p53 and FLAG wild type synoviolin co-expressing in Saos-2 cells and observing the localization of both transgene products.
  • FIG. 12 is a photograph showing the co-expression of GFP wild-type p53 and FLAG synoviolin C307S in Saos-2 cells and observing the localization of both transgene products.
  • FIG. 13 is a photograph showing the in vitro ubiquitination reaction of GST-p53 by MBP-Synoviolin ⁇ -His.
  • FIG. 14 is a graph showing the amount of p53 mRNA in RA synovial cells by Synoviolin RNAi.
  • FIG. 15 is a photograph showing the results of pull-down assay using synoviolin domains fused to GST and full-length p53 obtained by in vitro translation.
  • FIG. 16 is a photograph showing the results of pull-down assembly using a further subcloned region of synoviolin identified in FIG. 15 and in vitro translated full-length p53.
  • FIG. 17 is a photograph showing the results of pull-down assembly with full-length p53 obtained by cutting the synoviolin amino acids 236-270 from the N-terminus or C-terminus and translating in vitro.
  • FIG. 18 is a photograph showing the result of constructing GST-Synoviolin ⁇ ⁇ ⁇ lacking only 236-270 amino acids of Synoviolin and performing pull-down assembly with full-length p53 translated in vitro.
  • FIG. 19 is a diagram showing the minimum region of the p53 binding domain in Synoviolin.
  • FIG. 20 is a photograph showing detection of synoviolin-p53 binding by anti-HA antibody and anti-FLAG antibody in A: HEK293 cells.
  • B Photograph showing detection of synoviolin-p53 binding by anti-HA antibody and anti-F LAG antibody in HEK293 cells. Both figures show the coprecipitation circled.
  • FIG. 21 is a photograph showing the localization of synoviolin lacking 53BD and p53 in Saos-2 cells.
  • FIG. 22 is a photograph showing that 53BD peptide competitively inhibits the binding of Synoviolin and p53.
  • FIG. 23 is a photograph showing the inhibitory effect of 53BD peptide on p53 ubiquitination activity.
  • p53 When normal cells are exposed to ultraviolet rays or the like, the intracellular p53 is activated, and as a result, cell growth is blocked. Therefore, by increasing the concentration of p53, the growth of cancer cells can be stopped. In other words, if p53 does not function, cancer cell growth cannot be stopped and cancer progresses. In fact, p53 mutations are rarely found in cells of normal individuals, but about half of the cells from cancer patients have this p53 deletion or point mutation. Even when such a mutation has not occurred, some mutation has occurred in the regulatory mechanism of p53, and the tumor suppressor function has been lost. Therefore, it is necessary to make p53 function effectively in order to suppress the progression of cancer.
  • the present inventors focused on the function of synoviolin in order to make the activity of p53 protein one of the effective methods for cancer treatment.
  • Synoviolin homo-knockout animals were prepared and analyzed in detail. As a result, a large number of apoptotic cells were observed in comparison with the wild type. That is, it was found that inhibition of the function of synoviolin promotes the activity of the p53 protein that is deeply involved in apoptosis, and inhibition of the function of synoviolin contributes to cancer suppression.
  • Synoviolin partial fragment polypeptide for example, 53BD
  • a Synoviolin partial fragment polypeptide having a binding region to p53 has a function of activating p53 by inhibiting cytoplasmic retention of p53.
  • the present invention relates to a partial fragment polypeptide of a synoviolin protein having a binding region to p53 (having a binding activity to p53) (in the present specification, simply referred to as "the polypeptide of the present invention")
  • a p53 protein activator comprising as an active ingredient
  • the Synoviolin protein of the present invention is preferably a human Synoviolin protein.
  • the biological species from which it is derived is not particularly limited, and proteins equivalent to synoviolin in organisms other than humans (such as synoviolin homologs and orthologs) are also included in the “sinoviolin protein” in the present invention.
  • the present invention can be carried out if the organism has a protein corresponding to human p53 and has a protein equivalent to human synoviolin.
  • Table 1 shows the names of synoviolin and p53 "corresponding protein" in humans and other organisms, mRNA, and amino acid sequence accession numbers.
  • accession number in the public gene database Genbank of human Synoviolin gene is AB024690 (SEQ ID NO: 1).
  • SEQ ID NO: 1 shows the base sequence of a gene encoding Synoviolin in humans.
  • the amino acid sequence of the protein encoded by the base sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • Even proteins other than those described above exhibit high homology (usually 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, most preferably 95% or more) with the sequences described in the sequence listing, for example.
  • synoviolin protein has the functions (for example, the function to bind to p53 protein, the function to inhibit the activity of p53 phosphorylated protein, and the function to promote ubiquitination of Z or P53). Included in the synopioline of the present invention.
  • the above protein is, for example, a protein having an amino acid sequence ability in which one or more amino acids are added, deleted, substituted, or inserted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, and usually changes amino acids.
  • the number is within 30 amino acids, preferably within 10 amino acids, more preferably 5 amino acids. Within amino acids, most preferably within 3 amino acids.
  • synoviolin gene for example, an endogenous gene in another organism corresponding to a DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 (such as a homolog of a human synoviolin gene) Is included.
  • endogenous DNA of other organisms corresponding to the DNA consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 1 generally has high homology with the DNA described in SEQ ID NO: 1.
  • High homology means 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more (e.g., 95% or more, further 96%, 97%, 98% or 99% or more).
  • This homology is determined by the mBLAST algorithm (Altschul et al. (1990) Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA 87: 2264-8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873- 7) can be determined by.
  • the DNA when the DNA is isolated from a living body, it is considered that the DNA is neutralized under stringent conditions with the DNA of SEQ ID NO: 1.
  • stringent conditions for example, “2 X SSC, 0.1% SDS, 50 ° C”, “2 X SSC, 0.1% SDS, 42 ° C”, “1 X SSC, 0.1% SDS, 37 ⁇ ° C '', more stringent conditions: ⁇ 2 X SSC% 0.1% SDS ⁇ 65 ° C '', ⁇ 0.5 X SSC, 0.1% SDS ⁇ 42 ° C '' and ⁇ 0.2 X SSC, 0.1% SDS, 65 ° C ”can be mentioned.
  • synoviolin protein a protein (gene) corresponding to a synoviolin protein (gene) in a non-human organism or a protein (gene) functionally equivalent to the above-mentioned synoviolin is simply referred to as “synoviolin protein. (Gene) Sometimes described as J.
  • the "Synoviolin protein" of the present invention can be prepared not only as a natural protein but also as a recombinant protein using a gene recombination technique. Natural proteins can be prepared, for example, by a method using affinity chromatography using an antibody against synoviolin protein on a cell (tissue) extract that is thought to express synoviolin protein. is there. On the other hand, recombinant proteins can be prepared by culturing cells transformed with DNA encoding synoviolin protein. [0027] When the synoviolin protein of the present invention is human synoviolin, the essential region for binding to p53 is V in the amino acid sequence of human synopioline protein (SEQ ID NO: 2). It is the region from the first to the 270th (th). The sequence of the peptide region having a force of 35 amino acid residues is described in SEQ ID NO: 4, and the base sequence encoding the amino acid sequence is described in SEQ ID NO: 3.
  • a partial fragment polypeptide of Synoviolin protein having a binding region (amino acid sequence) to p53 is preferably a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. More preferably, it is a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
  • the polypeptide of the present invention is not necessarily limited to the above-described 53BD polypeptide (SEQ ID NO: 4). As long as it is a polypeptide functionally equivalent to 53BD (for example, a polypeptide that substantially binds to p53 or has a function to activate p53), any form (structure) of the polypeptide can be used. There may be. For example, a polypeptide having an amino acid sequence ability in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and Z or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, and substantially functions to bind to p53 Are included in the polypeptide of the present invention.
  • polypeptide comprising a sequence in which amino acids are appropriately modified based on these amino acid sequences.
  • the polypeptide of the present invention can be appropriately selected by preparing and evaluating whether the polypeptide has the above-mentioned function.
  • the binding activity (interaction activity) of p53 with a desired polypeptide is appropriately evaluated by those skilled in the art using known techniques such as immunoprecipitation and pull-down assay ( Measurement). Specifically, it can be evaluated by the method described in Examples described later.
  • the polypeptide of the present invention may be a partial fragment peptide having a binding region with p53 in a protein corresponding to Synoviolin of a non-human organism. That is, the polypeptide of the present invention corresponds to synoviolin of other organisms including the region corresponding to the region from position 236 to position 270 in the amino acid sequence of human synopioline protein (SEQ ID NO: 2). Partial fragment polypeptides of the protein.
  • a polypeptide serving as an active ingredient of the p53 activator of the present invention is a variant of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 4, and is a polypeptide having a function of substantially binding to p53. May be used.
  • polypeptides are usually polypeptides consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and Z or added. is there.
  • the polypeptide according to any one of the following (a) to (d), wherein the polypeptide substantially binds to p53, or activates p53.
  • the present invention relates to a P53 protein activator comprising a functional polypeptide as an active ingredient.
  • Synoviolin has a function of promoting p53 ubiquitination.
  • Ubiquitin refers to a post-translational modification reaction of a protein by ubiquitin, a protein degradation marker molecule. The physiological significance of this ubiquitin was previously recognized as a tag modification to be sent to the proteosome-based proteolytic mechanism. In subsequent studies, the significance of ubiquitin is currently positioned as a reversible protein modification system that controls protein function.
  • ubiquitin ⁇ becomes a substrate by repeating a cascade reaction of enzymes such as ubiquitin-active enzyme (E1), ubiquitin-conjugating enzyme (E2) and ubiquitin ligase (E3).
  • enzymes such as ubiquitin-active enzyme (E1), ubiquitin-conjugating enzyme (E2) and ubiquitin ligase (E3).
  • E1 ubiquitin-active enzyme
  • E2 ubiquitin-conjugating enzyme
  • E3 ubiquitin ligase
  • the polypeptide of the present invention has a feature of activating ⁇ 53 by inhibiting the ubiquitin-promoting action of Synoviolin ⁇ 53 protein.
  • polypeptide means a polymer composed of a plurality of amino acids, and the length of the amino acids is not particularly limited. Accordingly, the polypeptides of the present invention also include so-called “oligopeptides” and “proteins”. Polypeptides include both naturally occurring states of force that have not been modified and those that have been modified.
  • Modifications include acetylation, acylation, ADP-ribosylation, amide ⁇ , flavin covalent bond, heme moiety covalent bond, nucleotide or nucleotide derivative covalent bond, lipid or lipid derivative covalent bond, phosphatidylinositol covalent bond Bond, bridge, cyclization, disulfide bond formation, methylation, demethylation, covalent bridge formation, cystine formation, pyroglutamate formation, formylation, ⁇ -carboxylation, glycosylation, GPI anchor formation, Transfer of amino acids to proteins such as hydroxylation, iodination, methylation, myristoylation, oxidation, proteolytic processing, phosphorylation, prenylation, racemization, selenoylation, sulfation, arginylation RNA-mediated addition , Ubiquitination and the like are included.
  • the polypeptide of the present invention can be produced by a general chemical synthesis method in accordance with its amino acid sequence, and this method includes peptide synthesis methods by ordinary liquid phase methods and solid phase methods. Is done. More specifically, such a peptide synthesis method is based on the amino acid sequence information, and each amino acid is synthesized sequentially one by one to extend the chain, and the stepwise elongation method and a fragment consisting of several amino acids are used. A fragment 'condensation method in which each fragment is coupled in advance and then subjected to a coupling reaction is included, and any method may be used for the synthesis of the polypeptide of the present invention.
  • the condensation method used in such a peptide synthesis method can also be performed according to various methods. Specific examples thereof include an azide method, a mixed acid anhydride method, a DCC method, an active ester method, an oxidation-reduction method, a DPPA (diphenylphosphoryl azide) method, and a Woodward method.
  • Solvents that can be used in these various methods are also appropriately selected from commonly used solvents. be able to. Examples thereof include dimethylformamide (DMF), dimethylsulfoxide (DMSO), hexaphosphoroamide, dioxane, tetrahydrofuran (THF), ethyl acetate, and a mixed solvent thereof.
  • DMF dimethylformamide
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • THF tetrahydrofuran
  • ethyl acetate a mixed solvent thereof.
  • amino acids that do not participate in the reaction and carboxyl groups in the peptide are generally esterified, for example, lower alkyl esters such as methyl esters, ethyl esters, and tertiary butyl esters, such as benzyl esters.
  • P-methoxybenzyl ester P-trobenzyl ester aralkyl ester and the like.
  • An amino acid having a functional group in the side chain for example, a hydroxyl group of Tyr may be protected with a acetyl group, a benzyl group, a benzyloxycarbonyl group, a tertiary butyl group, etc., but it is always necessary. Protection is not essential.
  • Arg's guazino group includes a nitro group, a tosyl group, a 2-methoxybenzenesulfol group, a methicylene-2-sulfol group, a benzyloxycarboxyl group, an isobornoxycarboxyl group, It can be protected with an appropriate protecting group such as an adamantyloxycarbonyl group.
  • polypeptide of the present invention that can be obtained as described above can be obtained by, for example, ion exchange resin, partition chromatography, gel chromatography, affinity chromatography, high performance liquid chromatography according to a conventional method. Purification can be appropriately performed according to a method widely used in the field of peptide chemistry such as (HPLC) and countercurrent distribution.
  • polypeptide of the present invention is synthesized, for example, by synthesizing the polypeptide described in SEQ ID NO: 2 or 4, or the DNA nucleic acid molecule described in SEQ ID NO: 1 or 3, and then introducing it into an appropriate expression vector. Then, it can also be obtained by genetic engineering techniques for expression in host cells.
  • the polynucleotide described in SEQ ID NO: 3 encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 is synthesized.
  • the method include chemical synthesis means such as phosphate triester method and phosphate amidite method [J. Am. Chem. Soc, 89, 4801 (1967); 91, 3350 (1969); Science, 150, 178 ( 1968); Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981); 24, 245 (1 983)] and combinations thereof. More specifically, DNA synthesis can be performed by chemical synthesis using the phosphoramidite method or triester method, and can also be performed on an automated polynucleotide synthesizer sold on the market. Double-stranded fragments are complementary strands Can be obtained from chemically synthesized single stranded products by either annealing the strands together under appropriate conditions or adding a complementary strand using DNA polymerase with an appropriate primer sequence.
  • the polypeptide of the present invention includes, for example, a polypeptide functionally equivalent to a polypeptide (53BD; SEQ ID NO: 4) having a p53 binding region force determined by the present inventors.
  • “functionally equivalent” means that the target polypeptide has the same (equivalent) biological function (activity) as the 53BD polypeptide. Examples of such a function include a function of 53BD polypeptide, that is, a function of binding to p53 protein, a function of activating p53 protein, and the like. Whether the target polypeptide has the same biological or biochemical function (activity) as the 53BD polypeptide is determined by, for example, measuring the binding activity to p53 protein, p53 activity, etc. It is possible to evaluate as appropriate.
  • polypeptide functionally equivalent to the polypeptide can be prepared.
  • Amino acid mutations in the polypeptide may also occur naturally.
  • a polypeptide functionally equivalent to the polypeptide is included in the polypeptide of the present invention.
  • the number of amino acids to be mutated in the mutant is not limited as long as the function of 53BD polypeptide is maintained, but is usually within 15 amino acids, preferably within 10 amino acids. Yes, more preferably within 5 amino acids, even more preferably 1 to 4 amino acids.
  • amino acid residue to be mutated is preferably mutated to another amino acid in which the properties of the amino acid side chain are conserved.
  • amino acid side chain properties include hydrophobic amino acids (A, I, M, F, P, W, Y, V), hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G , H, K, S, T), amino acids having lunar aliphatic side chains (G, A, V, L, I, P), amino acids having hydroxyl-containing side chains (S, T, ⁇ ), sulfur atoms
  • Amino acids with side chains C, M
  • amino acids with side chains containing carboxylic acids and amides D, N, E, Q
  • amino groups with side chains containing bases R, K, ⁇
  • aromatic Examples include amino acids having a side chain (H, F, Y, W) (in parentheses all represent a single letter of amino acid).
  • a polypeptide having an amino acid sequence modified by deletion or addition of one or more amino acid residues to a certain amino acid sequence and substitution by Z or another amino acid maintains its biological function (activity) It is already known (Mark, DF et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666, Zoller, MJ & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10 6487-6500, Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433, Dal badie—McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413).
  • Polypeptides having a plurality of amino acid residues added to the amino acid sequence of 53BD polypeptide include fusion polypeptides containing these polypeptides.
  • a fusion polypeptide is a fusion of these polypeptides with another peptide or polypeptide.
  • a method for producing a fusion polypeptide comprises ligating a polynucleotide (SEQ ID NO: 3) encoding a 53BD polypeptide (SEQ ID NO: 4) and a polynucleotide encoding another peptide or polypeptide so that the frames match. This can be introduced into an expression vector and expressed in a host, and techniques known to those skilled in the art can be used. Other peptides or polypeptides that are subjected to fusion with the polypeptide of the present invention are not particularly limited.
  • peptides to be subjected to fusion with the polypeptide of the present invention include, for example, FLAG (Ho pp, TP et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210), 6 His (histidine) Residue 6 X His, 10 X His, influenza agglutinin (HA), human c-myc fragment, VSV-GP fragment, pl8HIV fragment, T7-tag, HSV-tag, E-tag, SV40T
  • peptides such as antigen fragments, lck tag, a-tu bulin fragments, B-tag, and protein C fragments can be used.
  • a fusion polypeptide is prepared by fusing a commercially available polynucleotide encoding the peptide or polypeptide with a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention and expressing the prepared fusion polynucleotide. can do.
  • polypeptides functionally equivalent to a certain polypeptide include hybridization technology (SambrookJ et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). That is, a person skilled in the art can use a polynucleotide sample encoding 53BD polypeptide (base sequence described in SEQ ID NO: 1) or a part thereof from a polynucleotide sample derived from the same species or a heterogeneous organism. It is also usually possible to isolate a highly homologous polynucleotide and isolate a functionally equivalent polypeptide from the 53BD polypeptide from the polynucleotide.
  • the present invention includes polypeptides encoded by polynucleotides that hybridize with polynucleotides encoding 53BD polypeptides and functionally equivalent to 53BD polypeptides.
  • polypeptides include, for example, human or mouse and other mammalian homologs (eg, polypeptides derived from organisms such as rats, zebrafish, nematodes, and Drosophila melanogaster).
  • Conditions for hybridization and isolation for isolating a polynucleotide encoding a polypeptide functionally equivalent to the 53BD polypeptide can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the hybridization conditions include low stringency conditions.
  • the low stringent conditions are, for example, conditions of 42 ° C, 0.1 X SSC, and 0.1% SDS in washing after hybridization, preferably 50 ° C, 0.1 X SSC, and 0.1% SDS. It is a condition.
  • More preferable hybridization conditions include high stringency conditions. Highly stringent conditions are, for example, conditions of 65 ° C., 5 ⁇ SSC and 0.1% SDS. Under these conditions, it can be expected that DNA having high homology can be obtained efficiently as the temperature is increased.
  • the hybridization string A number of factors such as temperature and salt concentration can be considered as factors affecting the genency, and those skilled in the art can realize the same stringency by appropriately selecting these factors.
  • a primer was designed based on a part of the polynucleotide (SEQ ID NO: 3) encoding the 53BD polypeptide (SEQ ID NO: 4) of the present inventors using 6.1-6.4) and identified by the present inventors. It is also possible to isolate a polynucleotide fragment highly homologous to the polynucleotide encoding the polypeptide and obtain a polypeptide functionally equivalent to the polypeptide identified by the present inventors based on the polynucleotide. It is.
  • a polypeptide of the invention may be in the form of a "mature" polypeptide or may be part of a larger polypeptide, such as a fusion polypeptide.
  • the polypeptide of the present invention includes a leader sequence, a pro sequence, a sequence useful for purification, such as multiple histidine residues, or an additional sequence that ensures stability during recombinant production. Yo ...
  • a polypeptide functionally equivalent to the 53BD polypeptide encoded by a polynucleotide isolated by these hybridization techniques and gene amplification techniques is usually an amino acid and the polypeptide (SEQ ID NO: 4). Has high homology in sequence.
  • the polypeptides of the present invention also include polypeptides that are functionally equivalent to 53BD polypeptides and have high homology with the amino acid sequences of the polypeptides. High homology is usually at least 50% identity, preferably 75% identity, more preferably 85% identity, more preferably 95% identity (at the amino acid level). For example, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more).
  • the algorithm described in the literature Wang, W. J. and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730
  • the polypeptide of the present invention can be prepared as a recombinant polypeptide or a natural polypeptide by methods known to those skilled in the art. If it is a recombinant polypeptide, for example, a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention (for example, the polynucleotide described in SEQ ID NO: 3) is incorporated into an appropriate expression vector, and this is incorporated into an appropriate host cell. After the transformant obtained by introduction is recovered and an extract is obtained, chromatography such as ion exchange, reverse phase, gel filtration, or affinity chromatography in which an antibody against the polypeptide of the present invention is immobilized on a force column. It can be purified and prepared by graphy or by combining more than one of these columns.
  • a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention for example, the polynucleotide described in SEQ ID NO: 3
  • chromatography such as ion exchange, reverse phase,
  • the polypeptide of the present invention was expressed in a host cell (eg, animal cell or E. coli) as a fusion polypeptide with dartathione S-transferase protein or as a recombinant polypeptide to which a plurality of histidines were added.
  • a host cell eg, animal cell or E. coli
  • the expressed recombinant polypeptide can be purified using a dartathione column or a nickel column. After purification of the fusion polypeptide, if necessary, a region other than the target polypeptide in the fusion polypeptide can be cleaved with thrombin or factor Xa and removed.
  • an antibody that binds to the polypeptide of the present invention binds to a method well known to those skilled in the art, for example, an extract of a tissue or cell that expresses the polypeptide of the present invention. It can be isolated by purifying with a function column.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the length of the synoviolin protein partial fragment polypeptide of the present invention is not particularly limited as long as it includes a p53-binding region at positions 236 to 270, but is usually 200 amino acids or less, preferably It is 100 amino acids or less, more preferably 50 amino acids or less, and further preferably 40 amino acids or less. It is expected that fragments of these lengths will retain the same activity as 53BD.
  • the polypeptide of the present invention can be used, for example, for production of an antibody recognizing a p53 binding region, screening for a compound that changes the binding of synoviolin and p53, and the like.
  • the polynucleotide of the present invention may be in any form as long as it can encode the polypeptide of the present invention. That is, it does not matter whether the mRNA force is a synthesized cDNA force, a genomic DNA force, or a chemically synthesized DNA.
  • a polynucleotide having an arbitrary base sequence based on the degeneracy of the genetic code is included as long as it encodes the polypeptide of the present invention.
  • the polynucleotide of the present invention can be prepared by methods known to those skilled in the art.
  • a cDNA library is prepared from a cell expressing the polypeptide of the present invention, and a part of the polynucleotide of the present invention (for example, the base sequence described in SEQ ID NO: 1) is used as a probe to obtain a hybrid library It can be prepared by carrying out an application.
  • One cDNA library can be prepared by the method described in the literature (Sambrook, J. et al., Molecular loning, old Spring Harbor Laboratory Process (1989)) or a commercially available DNA library. May be used.
  • RNA is prepared from cells expressing the polypeptide of the present invention
  • cDNA is synthesized by reverse transcriptase, and then based on the polynucleotide of the present invention (for example, the base sequence described in SEQ ID NO: 1). It is possible to prepare by synthesizing oligo DNA, performing PCR reaction using this as a primer, and amplifying cDNA encoding the polypeptide of the present invention.
  • the translation region encoded by the cDNA can be determined, and the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention can be obtained.
  • genomic DNA can be isolated by screening a genomic DNA library using the obtained cDNA as a probe.
  • a cell, tissue, or organ force mRNA that expresses the polypeptide of the present invention is isolated. Isolation of mRNA can be performed by a known method such as guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, JM et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC (Chomczynski, P. and Sacchi, N , Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) etc., and prepare mRNA from total RNA using mRNA Purification Kit (Pharmacia) etc. To do. Alternatively, mRNA can be directly prepared by using QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • cDNA is synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase. cDNA synthesis can also be performed using AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (Seikagaku). In addition, using the primers described herein, 5'-RACE method (Frohman, MA) using 5'-Ampli FINDE R RACE Kit (Clontech) and polymerase chain reaction (PCR) et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (19 88) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919—2932) It can be performed.
  • 5'-RACE method Frohman, MA
  • 5'-Ampli FINDE R RACE Kit (Clontech)
  • PCR polymerase chain reaction
  • a recombinant vector is prepared, introduced into Escherichia coli, etc., and colonies are selected to prepare a desired recombinant vector.
  • the base sequence of the target DNA can be confirmed by a known method such as the dideoxynucleotide chain termination method.
  • a base sequence with higher expression efficiency can be designed in consideration of the codon usage frequency of the host used for expression (Grantham, R. et al., Nucelic Acids Research (1981) 9, r43-74).
  • the polynucleotide of the present invention can be modified by a commercially available kit or a known method. Examples of modifications include digestion with restriction enzymes, insertion of synthetic oligonucleotides and appropriate DNA fragments, addition of linkers, insertion of start codon (ATG) and Z or stop codon (TAA, TGA, or TAG). Can be mentioned.
  • the present invention also provides a P53 protein activator comprising as an active ingredient a vector comprising a polynucleotide encoding the polypeptide according to any one of (a) to (d) above.
  • the vector is generally a plasmid or viral vector carrying a DNA encoding the polypeptide of the present invention.
  • Those skilled in the art can appropriately prepare a vector having a desired DNA by a general genetic engineering technique. Usually, various commercially available vectors can be used.
  • the vector of the present invention is also useful for retaining the polynucleotide of the present invention or expressing the polypeptide of the present invention in a host cell.
  • the polynucleotide in the present invention is usually carried (inserted) into an appropriate vector and introduced into host cells.
  • the vector is not particularly limited as long as it can stably hold the inserted DNA.
  • E. coli is used as a host
  • a pBluescript vector (Stratagene) is preferred as a cloning vector.
  • An expression vector is particularly useful when a vector is used for the purpose of producing the polypeptide of the present invention.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it is a vector that expresses a polypeptide in vitro, in E. coli, in cultured cells, or in an individual organism.
  • pBEST vector manufactured by Promega
  • PET vector manufactured by Invitrogen
  • PME18S-FL3 vector GenBank Accession No. AB009864
  • pME18S vector Mol Cell Biol. 8: 466-472 (1988) for individual organisms)
  • the nucleic acid of the present invention can be inserted into a vector by a conventional method, for example, by a ligase reaction using a restriction enzyme site.
  • the host cell is not particularly limited, and various host cells can be used depending on the purpose.
  • Examples of cells for expressing the polypeptide include bacterial cells (eg, Streptococcus, Staphylococcus, Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus subtilis), insect cells (eg, Drofophila S2, Spodoptera SF9), animal cells ( Examples: CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HE K293, Bowes melanoma cells) and plant cells.
  • Vector introduction into host cells can be carried out by, for example, calcium phosphate precipitation, electric pulse perforation (Current protocol in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 9.1-9.9), lipofussion method ( GIBCO-BRL) and microinjection can be used.
  • an appropriate secretion signal can be incorporated into the polypeptide of interest.
  • These signals may be endogenous to the polypeptide of interest or they may be heterologous signals.
  • the polypeptide is collected when the polypeptide of the present invention is collected in the medium. Where the polypeptide of the present invention is produced intracellularly If so, the cells are first lysed and then the polypeptide is recovered.
  • the ability of recombinant cell culture to recover and purify the polypeptides of the present invention also includes ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, cation or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobicity.
  • Known methods including interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxylapatite chromatography and lectin chromatography can be used.
  • the DNA of the present invention is incorporated into an appropriate vector, for example, a retrovirus method, a ribosome method, a cationic ribosome method. And a method of introducing it into a living body by an adenovirus method or the like. Thereby, cancer treatment can be performed.
  • the vector used include, but are not limited to, an adenovirus vector and a retrovirus vector.
  • General genetic manipulations such as insertion of the DNA of the present invention into a vector can be performed according to conventional methods (Molecular Cloning, 5.61-5.63).
  • Administration to a living body may be an ex vivo method or an in vivo method.
  • the p53 protein activator of the present invention has an action of inhibiting the growth of cancer cells by activating p53, which is a tumor suppressor protein. Accordingly, the present invention provides a cancer therapeutic agent comprising the p53 protein activator of the present invention as an active ingredient.
  • the agent containing the p53 protein activator of the present invention can be a p21 protein activator or a cell cycle (particularly, transition from G1 phase to S phase) inhibitor.
  • the p53 protein activator of the present invention can be a therapeutic agent for neurodegenerative diseases.
  • the "cancer therapeutic agent” of the present invention includes “cancer cell growth inhibitor”, “cancer cell generation inhibitor”, “tumor” It can also be expressed as “tumor growth inhibitor”, “anticancer agent”, or “anticancer agent”. Further, in the present invention, “therapeutic agent” is expressed by “medicine”, “pharmaceutical composition”, “therapeutic drug”, and the like.
  • the “treatment” in the present invention includes a prophylactic effect that can suppress the occurrence of cancer in advance. Further, it is not necessarily limited to having a complete therapeutic effect on cancer cells (tissues), and may have a partial effect.
  • the polypeptide of the present invention is also useful as an anti-rheumatic agent.
  • “Rheumatoid” in the present invention includes so-called rheumatic diseases, and specifically, examples include rheumatoid arthritis: rheumatoid arthritis, acute rheumatoid arthritis, rheumatoid arthritis, rheumatoid arthritis, juvenile rheumatoid arthritis, and the like. Can do.
  • the rheumatic disease may be concurrent with other diseases.
  • anti-rheumatic agents include “rheumatic synovial cell proliferation inhibitor”, “rheumatic synovial cell growth inhibitor”, “rheumatic therapeutic agent”, “rheumatic disease therapeutic agent”, “anti-rheumatic drug”. Alternatively, it can be expressed as “anti-rheumatic disease drug”.
  • the drug of the present invention can be mixed with a physiologically acceptable carrier, excipient, diluent or the like, and can be administered orally or parenterally as a pharmaceutical composition.
  • a physiologically acceptable carrier such as granules, powders, tablets, capsules, solvents, emulsions or suspensions
  • parenteral preparation a dosage form such as an injection, a drip infusion, an external medicine, or a suppository can be selected. Examples of injections include subcutaneous injections, intramuscular injections, and intraperitoneal injections.
  • the topical drug may be a nasal agent or an ointment.
  • the preparation technique of the above dosage form so as to include the drug of the present invention as the main component is known.
  • a tablet for oral administration can be produced by adding an excipient, a disintegrant, a binder, a lubricant, and the like to the drug of the present invention, mixing, and compressing and shaping.
  • an excipient lactose, starch, mannitol or the like is generally used.
  • disintegrant calcium carbonate or carboxymethyl cellulose calcium is generally used.
  • binder gum arabic, carboxymethylcellulose, or polyvinylpyrrolidone is used.
  • talc magnesium stearate and the like are known.
  • the tablet containing the drug of the present invention can be subjected to known coating for masking or enteric preparation.
  • the coating agent ethyl cellulose, polyoxyethylene glycol or the like can be used.
  • the injection can be obtained by dissolving the agent of the present invention, which is the main component, together with an appropriate dispersant, or dissolving or dispersing in a dispersion medium.
  • aqueous solvent distilled water, physiological saline, Ringer's solution, or the like is used as a dispersion medium.
  • oil-based solvents various vegetable oils such as propylene glycol are used as dispersion media.
  • a preservative such as paraben can be added as necessary.
  • a known isotonic agent such as sodium chloride or glucose can be added.
  • a soothing agent such as salt benzalcoum can be added.
  • an external preparation can be obtained by making the agent of the present invention into a solid, liquid, or semi-solid composition.
  • a solid or liquid composition it can be set as an external preparation by setting it as the composition similar to what was described previously.
  • a semi-solid composition can be prepared by adding a thickener to an appropriate solvent as required.
  • the solvent water, ethyl alcohol, polyethylene glycol, or the like can be used.
  • the thickener bentonite, polybutyl alcohol, acrylic acid, methacrylic acid, polyvinylpyrrolidone, or the like is generally used.
  • a preservative such as salt benzalkonium.
  • a suppository can also be obtained by combining an oily base material such as cacao butter or an aqueous gel base material such as cellulose derivative as a carrier.
  • the agent of the present invention is used as a gene therapy agent, besides the method of directly administering the agent of the present invention by injection, a method of administering a vector incorporating a nucleic acid can be mentioned.
  • a method of administering a vector incorporating a nucleic acid examples include adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, herpes vinores vectors, vaccinia winores betaters, retro winores betaters, and lentivirus vectors. Can be invested well.
  • the drug of the present invention into a phospholipid vesicle such as a ribosome and administer the vesicle.
  • a phospholipid vesicle such as a ribosome
  • administer the vesicle For example, the polypeptide or vector of the present invention is retained.
  • the endoplasmic reticulum is introduced into a predetermined cell by a ribofusion method. Then, the obtained cells are systemically administered, for example, intravenously or intraarterially. It can also be administered locally to cancer tissue.
  • the necessary amount (effective amount) of the drug of the present invention is administered to mammals including humans within the safe dose range.
  • the dosage of the drug of the present invention can be appropriately determined finally based on the judgment of a doctor or veterinarian in consideration of the type of dosage form, administration method, patient age and weight, patient symptoms, and the like.
  • the power varies depending on age, sex, symptoms, administration route, number of administrations, and dosage forms.
  • the dose in the case of adenovirus is about 10 6 to 10 13 per day, 1 week to 8 It is administered at weekly intervals.
  • the application site or cancer type is not particularly limited, and brain tumor, tongue cancer, pharyngeal cancer, lung cancer, breast cancer, esophageal cancer, stomach cancer, spleen cancer, biliary tract cancer, gallbladder Cancer, duodenal cancer, colon cancer, liver cancer, uterine cancer, ovarian cancer, prostate cancer, renal cancer, bladder cancer, rhabdomyosarcoma, fibrosarcoma, osteosarcoma, chondrosarcoma, skin cancer, various leukemias (eg acute myeloid leukemia) , Acute lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic lymphocytic leukemia, adult T-cell leukemia, acute lymphoma), etc.
  • the cancer may be the primary lesion, metastasis, or other disease! /.
  • the present invention relates to a method for inhibiting cytoplasmic retention of p53, which comprises introducing the polypeptide of the present invention into a cell. More specifically, the “inhibition of cytoplasmic retention of p53” refers to inhibiting the retention of p53 on the endoplasmic reticulum membrane.
  • the p53 protein is strongly localized in the nucleus in the Synoviolin knockout mouse fetal MEF, and this nuclear localization is observed in the wild-type mouse fetal MEF. I helped.
  • synoviolin and p53 were co-expressed, p53 colocalized with synoviolin in the cytoplasm. This means that in the cytoplasm p53 protein is synoviolin protein. It is closely related, indicating that the synoviolin protein 3 ⁇ 453 is involved in the retention of the protein in the cytoplasm (on the endoplasmic reticulum membrane).
  • the present invention relates to a method for localizing (translocating into the nucleus) p53, which comprises introducing the polypeptide of the present invention into a cell.
  • Synoviolin promotes ubiquitination of p53, and thus inhibition of synoviolin-p53 binding can inhibit p53 ubiquitination, and inhibition of p53 ubiquitination results in P 53 Can be said to be active, leading to cancer suppression. Therefore, p53 ubiquitin can also be inhibited by introducing the polypeptide of the present invention into cells.
  • the addition of the polypeptide of the present invention was observed to reduce the p53 polyubiquitinylated. Therefore, the polypeptide of the present invention has a function of inhibiting p53 ubiquitin.
  • the present invention relates to a method for inhibiting ubiquitination of p53 protein, which comprises introducing the polypeptide of the present invention into a cell.
  • the above-mentioned “inhibiting p53 protein ubiquitin ⁇ ⁇ ” specifically refers to inhibiting the degradation of p53 protein by ubiquitin ⁇ .
  • the present invention provides a method for inhibiting the binding between Synoviolin protein and P53 protein, which comprises introducing the polypeptide of the present invention into a cell.
  • introducing a polypeptide into a cell refers to introducing the polypeptide directly into a cell.
  • a vector capable of expressing the polypeptide is introduced into a cell. Introducing it is also included.
  • Introduction into a cell can be carried out, for example, by introducing the polypeptide of the present invention into a highly liposoluble substance, for example, a phospholipid endoplasmic reticulum such as a liposome, and introducing the endoplasmic reticulum. .
  • the polypeptide can be bound (modified) with a molecule (drug) having an activity of moving into the cell.
  • a molecule drug having an activity of moving into the cell.
  • molecule Various known substances that can be used for transfer of peptides or nucleic acids, such as carriers, carriers, vectors, delivery molecules, carrier molecules, etc., can be used.
  • Synoviolin homo knockout mouse fetus MEF showed high radiosensitivity or UV sensitivity. Therefore, in the present invention, when the expression and / or function of synopioline in a cancer cell is inhibited to transfer P53 to the nucleus of the cancer cell, then the cancer cell is irradiated with radiation or ultraviolet rays, Cell proliferation can be effectively suppressed.
  • the radiation irradiation means is not particularly limited, and for example, ⁇ rays can be irradiated at 1 to 10 Gy.
  • ultraviolet irradiation (wavelength 100 to 400, preferably 290 to 400 nm) can be performed using an appropriate ultraviolet irradiation device (Funakoshi, Delmare, Keyence, etc.).
  • the present invention relates to a method for enhancing phosphorylation of p53 protein, which comprises introducing the polypeptide of the present invention into a cell.
  • cancer can be efficiently suppressed by contacting a cell containing p53 localized in the nucleus (particularly a cancer cell) with an anticancer agent.
  • cancer can be suppressed by embolizing the blood vessels (for example, blood vessels or lymph vessels) around cancer cells containing P53 localized in the nucleus.
  • Anticancer agents include alkylating agents, antimetabolites, microtubule inhibitors, platinum complex compounds, molecular targeted therapeutic agents and the like. Specific examples of these anticancer agents include the following: It is not limited to these.
  • Anolequinoresnorehon system Busunorefan etc.
  • Nitrosourea Nimustine, Mouth Mustine, etc.
  • Purine derivatives mercaptopurine, azathioprine, etc.
  • Vinca norekaloid Vincristine, Vinblastine, etc.
  • Taxane Paclitaxel, docetaxel, etc.
  • Cisplatin Cisplatin, carpoplatin, etc.
  • Imatinib Imatinib, rituximab, gefitinib, etc.
  • a method for bringing an anticancer drug into contact with cancer cells is a method of adding an anticancer drug to a cell or tissue (cancer cell or cancer tissue) containing cells in which p53 is localized in the nucleus, or a cancer-bearing patient.
  • a method of administering an anticancer agent to a cancer-bearing animal is employed.
  • the treatment amount of the anticancer agent in this case is not particularly limited, but when added, it is 100 pM to 100 / ⁇ /, preferably 1 ⁇ to 10 / ⁇ .
  • endoxane When administered into an animal body, for example, when endoxane is used as an anticancer agent, it is 0.1 to 100 mg / kg / day, preferably 2 to 25 mg / kg / day.
  • anticancer agents other than endoxan those skilled in the art can appropriately set the dose or addition amount.
  • p53 is localized in the nucleus.
  • embolization with fat, embolization with air or gas may be formed.
  • the present invention also provides a cancer treatment comprising as an active ingredient the polypeptide of the present invention, a vector comprising a polynucleotide encoding the polypeptide, the p53 protein activator of the present invention, or the p53 protein activator.
  • the present invention relates to a method for preventing or treating cancer, which comprises administering an agent to an individual (eg, a patient).
  • the individual in the prevention or treatment method of the present invention is preferably a human being and is not particularly limited, and may be a non-human animal.
  • administration to an individual can be performed by methods known to those skilled in the art, such as intraarterial injection, intravenous injection, and subcutaneous injection.
  • the dosage varies depending on the weight and age of the patient, the administration method, etc., but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dosage.
  • the present invention relates to the use of the polypeptide of the present invention or a vector containing a polynucleotide encoding the polypeptide in the production of a P53 protein activator or a cancer therapeutic agent.
  • MEF was immobilized on a slide glass according to a conventional method, and immunostaining was performed using an anti-p53 antibody (mouse monoclonal antibody BD: Becton, Dickinson).
  • a specimen that had been blocked with 3% bovine serum albumin (BSA) for 30 minutes was immunoreacted with an anti-p53 antibody (BD: 10 ⁇ g / mL) diluted with 0.3% BSA for 60 minutes at room temperature. After the reaction, the specimen was washed with PBS and immunoreacted with TRITC-labeled anti-mouse IgG antibody (Dako) as a secondary antibody.
  • TRITC-labeled anti-mouse IgG antibody Dako
  • Anti The antigen immunoreactive with the p53 antibody was confirmed with a fluorescence microscope.
  • syno-/-MEF cultured cells showed increased expression of p53 and nuclear translocation (Fig. 1, “MEF-/-” panel). ).
  • the examination of p53 activity in syno-/-mice was performed by immunostaining using embryos. That is, immunostaining in syno-/-fetuses was performed using a Vectorstain ABC kit (VECTOR) after fixing the tissue on a glass slide according to a conventional method. A sample blocked with a blocking reagent for 30 minutes was immunoreacted with anti-p53 antibody FL393 diluted to 5 g / mL at room temperature for 60 minutes. After the reaction, the specimen was washed with PBS and immunoreacted with HRP-labeled anti-rabbit IgG antibody as a secondary antibody.
  • VECTOR Vectorstain ABC kit
  • Antigens that immunoreacted with the anti-p53 antibody were confirmed by color development of 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride based on HRP activity. Methyldarin staining was performed as a counterstaining.
  • cell disruption solution 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1% NP40, 1 mM PMSF, 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), 2 ⁇ g / mL Leupeptin, 2 ⁇ g / mL Aprotinin, 2 ⁇ g / mL Pepstatin
  • SDS-PAGE SDS polyacrylamide electrophoresis
  • This NC membrane was blocked with Tris buffered saline (TBS) containing 5% skim milk at room temperature for 1 hour, and then anti-p53 antibody c-terminal aa; 195-393 or FL393 was added with TBS with 5% skim milk added. Dilute and immunoreact for 1 hour at room temperature. After the reaction, the NC membrane was washed with 0.1% Tween20 / TBS, horse radish peroxidase (HRP) -labeled anti-rabbit IgG antibody was used as a secondary antibody for 1 hour at room temperature, washed with 0.1% Tween20 / TBS, and HRP activity The target antigen was detected by detecting.
  • TBS Tris buffered saline
  • the ECL kit (Amersham) was used to detect HRP activity (Clinical Chemistry. 25, pi 531, 1979) 0 As a result, it was confirmed that the expression level of p53 in syno-/-MEF cultured cells increased by Western blotting (Fig. 3).
  • the phosphorylation site of p53 was identified by Western blotting using an anti-p53 antibody.
  • RKO human colorectal cancer-derived cell line
  • Caffe is an inhibitor of ATM (ataxia-telangiectasia mutat ed) and ATR (ATM and Rad3 related) that are important for Serl5 phosphorylation In (10 mM) was added and Western blotting was performed using Phospho-p53 (serl5) antibody against phosphorylated Serl5-p53.
  • RKO cells were treated with siRNA against Synoviolin and the expression of p21, a transcription product of p53 Changes were examined by Western blotting.
  • wild-type p53 was expressed as a cell line, and RKO (human colorectal cancer-derived cell line) was seeded on a 60 mm plate at l.OxlO 5 cells / plate / 2 mL. Then, Oligofectamine was used to transfect siRNA oligonucleotides against GFP and Synoviolin. Cells were harvested and prepared after 72 hours. The prepared protein was separated by SDS-PAGE, and Western blotting was performed using an anti-p21 polyclonal antibody (Santa Cruz). The operation of the Western blotting method is as described in Example 3, except that anti-p21 polyclonal antibody is used as the primary antibody and anti-mouse IgG Hedge-HRP is used as the labeled antibody.
  • RA synovial cells were seeded at 9.0Xl0 4 cells 10cm dish, after synoviolin siRNA (final concentration 25 nM) were transfected Hue Tato was observed cell cycle by flow cytometer.
  • siRNA 25 nM (h589) showed a cell cycle delay in the G0 / G1 phase (FIG. 7).
  • h589 was used as siRNA.
  • h589 means a double-stranded RNA in which the following sense strand and antisense strand are annealed.
  • Sense strand h589 GGU GUU CUU UGG GCA ACU G TT (SEQ ID NO: 6)
  • Antisense strand h589 CAG UUG CCC AAA GAA CAC C TT (SEQ ID NO: 7)
  • Tissue array (CHEMICON: 10 common human cancer tissue with normal human tissue) was immunostained using an anti-sinoviolin antibody (10 Da).
  • the antibody concentration used for immunostaining was 8 g / mL, and the kit used was Simple Stain MAX (M).
  • M Simple Stain MAX
  • synoviolin expression in normal tissues was observed in the large intestine, kidney, lung, ovary, testis, skin and mammary gland, but not in nerves and lymph nodes.
  • Synopioline expression was confirmed in each tumor tissue, especially when expression was clearly enhanced
  • the tissue determined to be V was the nerve 'lymph node ( Figures 8 and 9).
  • GFP-p53 Fusion protein expression of green fluorescence protein and wild-type p53 FLAG-synoviolin: Expression of wild-type synoviolin with FLAG tag
  • FLAG-synoviolin C307S (without ubiquitin (Ub) activation): Inactivated synoviolin expression with FLAG tag
  • MBP-Synoviolin ⁇ ⁇ -His A fraction obtained by purifying synopioline expressed in E. coli with MBP fused to the N-terminal side and His tag fused to the C-terminal side.
  • Escherichia coli (BL21) retaining pGEX / p53 was cultured in 500 mL of LB medium, induced by IPTG (1 mM, 30 ° C, 6h), and then a buffer containing 0.5% NP-40 from the culture.
  • the E. coli extract was prepared using
  • GST-p53 was purified from the E. coli extract using GSH-Sepharose resin in the presence of 0.1% NP-40. Using the sample after dialysis, MBP-Synoviolin ⁇ ⁇ -His and other compositions used for in vitro ubiquitination (ATP, PK-His-HA-Ub, yeast El, His-UbcH5 c) are combined. (Fig. 13). After the reaction, the protein was separated by 7.5% SDS-PAGE, transferred onto a PVDF membrane, and the p53 protein on the membrane was detected with an anti-p53 antibody (FL393 or DO-1). The same reaction and detection were performed by changing the amount of GST-p53 added.
  • RA synovial cells were seeded in 30000 cells / 10 cm dish, and 25 nM siRNA (No. 589) was transfected according to a conventional method, and cells were collected over time for 4 days of cell culture to obtain mRNA.
  • a reverse transcription reaction was performed using 1 ⁇ g of mRNA as a template and random primers to obtain cDNA.
  • the obtained cDNA was quantified using ABI TaqMan Gene expression assay (GE X). The amount of mRNA was calculated using the control gene as 18S rRNA.
  • the GEX reagent target assembly number (Atsusei ID) is Hs00381211_ml for Synoviolin and Hs00153340_ml for p53.
  • PepstatinA (Final 0.5 ⁇ g / mL) 2 ⁇ L
  • the beads were washed 4 times with -mercaptoethanoU 1 mM PMSF, 0.05% aprotinin). Centrifugation was performed at 2000 rpm, lmin, 4 ° C. After all of the remaining supernatant had been blotted clean, L 1 x GS T—Buffer IZ was removed to make a total of 100 ⁇ L. 10 ⁇ L of this was mixed with an equal amount of 2 ⁇ SDS Sample Buf fer, heated at 100 ° C. for 5 min in a heat block, and 10 L was applied to 10% gel. At the same time, 0.25-4 ⁇ g of BSA was also applied.
  • Electrophoresis 150 V, 50 min
  • CBB staining (30 min when not used)
  • decolorization lhr twice
  • glycerol water (30-60 min)
  • gel dry 80 ° C, lhr
  • GST protein The next day, 35 S-p53 was subjected to in vitro translation, and the following reagents were mixed.
  • Expression plasmids were transfected into HEK293 cells in the following combinations, and whole cell extracts were prepared 48 hours later. Immunoprecipitation was performed by adding anti-FLAG antibody or anti-HA antibody, and Western blotting was performed using anti-FLAG antibody and anti-HA antibody to detect binding between the two.
  • HA-p53 was transiently expressed in Saos-2 cells (p53 gene-deficient human osteosarcoma-derived cells) together with Synoviolin-FLAG or Synoviolin ⁇ 53BD, and observed with a fluorescence microscope.
  • Synoviolin-FLAG and HA-p53 p53 was localized both in the cytoplasm and in the nucleus as previously reported (Fig. 21f), and Synoviolin was mainly localized in the cytoplasm (Fig. 21g).
  • Synoviolin A 53BD and HA-p53 Synoviolin ⁇ 53BD was localized in the cytoplasm (Fig. 21j), but HA-p53 was localized only in the nucleus (Fig. 21i, k). . From these results, it is clear that p53 has a close relationship with Synoviolin on the endoplasmic reticulum membrane, and the cytoplasm of Synoviolin 3 ⁇ 453 It was shown to be essential for residence.
  • a peptide corresponding to 35 amino acids of synoviolin 236-270 was synthesized, and the effect on the binding of synoviolin to p53 was investigated.
  • 35 S-Met p53HA was incubated in a 0, 10, 50, 100 / zM 53BD peptide solution and then bound to GST and GST-Synoviolin ⁇ ⁇ . Bound 35 S-Met p53HA was detected by BAS. As a result, competitive inhibition was observed for more than 50 ⁇ 1 5380 peptides (Fig. 22).
  • SEQ ID NO: 6 Synthetic oligonucleotide (DNA / RNA mixture)
  • SEQ ID NO: 7 Synthetic oligonucleotide (DNA / RNA mixture)
  • a polypeptide having an activity of inhibiting the function of Synoviolin protein for example, a partial fragment peptide of Synoviolin having a binding region with ⁇ 53; 53BD
  • a ⁇ 53 protein containing the polypeptide as an active ingredient An activator was provided.
  • the drug of the present invention is useful as a cancer therapeutic agent.
  • the tumor suppressor gene ⁇ 53 is an extremely important gene in the development and proliferation of cancer cells. In fact, mutations in this gene have been found in about 50% of cancers! It is also known that even in the remaining cancers, some kind of mutation occurs in the control mechanism of ⁇ 53 and loses its ability to suppress cancer. Therefore, as an effective method for cancer treatment, cancer treatment by ⁇ 53 gene transfer is currently being conducted in clinical trials! / Speak.
  • the polypeptide of the present invention is introduced into cells to suppress the function of synoviolin. It is possible to activate p53 and suppress cancer. Stabilization of p53 and intensive localization in the nucleus increase the sensitivity to radiation and increase the treatment efficiency, and clinical application as part of multidisciplinary treatment is also expected.
  • the p53 protein activator of the present invention is also useful as a research reagent for elucidating the cancer inhibitory action related to p53.

Abstract

　シノビオリンタンパク質のp53との結合領域を同定することに成功した。また、該結合領域からなるシノビオリンの部分ポリペプチドは、p53との結合をシノビオリンと競合阻害することにより、p53を活性化させる機能を有することを見出した。さらに、シノビオリンの機能を阻害することにより、p53の細胞質滞留を阻害すること、p53が核に局在すること、シノビオリンタンパク質とp53タンパク質の結合が阻害されること、p53タンパク質のリン酸化が亢進されること、およびp53タンパク質のユビキチン化が阻害されることを見出した。該部分ポリペプチドは、p53活性化剤もしくは癌治療剤として有用である。

Description

明 細 書
シノビォリンの機能阻害ポリペプチドを有効成分とする癌治療剤 技術分野
[0001] 本発明は、シノビオリンタンパク質の機能を阻害する活性を有するポリペプチド、お よび該ポリペプチドを有効成分とする P53タンパク質活性化剤、並びに p53タンパク質 活性化剤を有効成分とする癌治療剤に関する。
背景技術
[0002] シノビオリンは、リウマチ患者由来滑膜細胞で過剰発現している膜タンパク質として 発見された新規タンパク質である (特許文献 1参照)。そして、遺伝子改変動物を用 いた研究により、シノビオリンは関節リウマチの発症に必須の分子であることが判明し た。
[0003] タンパク質構造予測システムにより、シノビオリンは RING fingerモチーフを有するこ とが示唆されている。このモチーフはタンパク質のュビキチンィ匕に重要な役割を果た す E3ュビキチンライゲースという酵素に多く見出されている力 実際、シノビォリンが E 3ュビキチンライゲースの特徴のひとつである自己ュビキチンィ匕活性を有することが 証明されている (特許文献 1参照)。
[0004] ところで、 p53遺伝子は、第 17染色体 pl3に位置しており、癌細胞の発生および増殖 においてきわめて重要な癌抑制遺伝子である。 p53タンパク質は、 DNA上の特異的 塩基配列 [5'-(A/T)GPyPyPy-3')]を認識し、 p21、 GADD45、 BAX等の特定の遺伝子 の転写活性化を促す。また、（0その他の多くの遺伝子の転写を抑制すること、 G0SV4 0ラージ T抗原、アデノウイルス EIBタンパク質、パピローマウィルス E6などのウィルス性 癌遺伝子産物、あるいは mdm2等の細胞性癌遺伝子産物と結合すること、（iii)ミスマツ チを含む DNAと特異的に結合すること等の生理機能が知られている。
[0005] 特許文献 l :WO02/052007
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明は、癌を抑制する薬剤の提供を目的とする。より具体的には、 p53タンパク質 の活性化剤、および該活性化剤を有効成分とする癌治療剤の提供を課題とする。 課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。そして、シノビオリン ホモノックアウト動物を詳細に解析したところ、野生型に比し、アポトーシスを起こして いる細胞が多数観察され、また、アポトーシスの誘導に深く関与している p53タンパク 質が核内に局在し、強く発現していることが判明した。そして、シノビォリンの機能を 阻害することにより、 P53癌抑制遺伝子または p53癌抑制タンパク質が活性化されて癌 細胞の増殖が阻止されることを見出した。
[0008] また本発明者らは、シノビォリンの機能阻害による p53タンパク質の活性ィ匕のメカ- ズムを解明すベぐさらに詳細な研究を行った。
[0009] 近年の研究により、シノビオリンは癌抑制遺伝子産物である p53をュビキチンィ匕し、 分解することにより、その発現量、および転写因子としての機能を抑制していることが 見出された。そこで本発明者らは、シノビォリンの p53結合ドメインを同定するために、 シノビォリンタンパク質の各断片を GSTタンパク質と融合し、 in vitro翻訳した全長 p53 タンパク質との結合活性を調べたところ、シノビオリンタンパク質の 236-270番目の 35 アミノ酸が結合に必要十分であることが判明した。また、この 35アミノ酸をコードしたぺ プチド（以下「53BD (p53-Binding omain)」と記載する場合あり）は、 GST_Synoviolin • Δ ΤΜと全長 p53の結合を競合阻害した。野生型、 53BDを欠失したシノビオリン（Δ 2 36-270)を p53と一緒に細胞内へ導入し、免疫沈降実験を行ったところ、 53BD欠失体 と p53は結合しな力つた。また野生型シノビオリンは p53を細胞質中へ滞留させた力 5 3BD欠失体にはその活性は見られな力つた。
[0010] 上述の如く本発明者らは、 in vitro及び in vivoにおいて、シノビォリンカ ¾53と結合し 癌抑制遺伝子産物としての機能を阻害するのに、 53BDが必要な領域であることを明 らかにした。即ち、 p53との結合に必要な領域を含む、シノビオリンタンパク質の部分 断片ペプチドは、競合阻害によりシノピオリンの機能を抑制することによって、 p53を 活性ィ匕する機能を有することを見出し、本発明を完成させた。
[0011] 即ち本発明は、シノビオリンタンパク質の部分断片ポリペプチドを有効成分として含 有する P53タンパク質の活性化剤、および該活性化剤を有効成分とする癌治療剤に 関し、より詳しくは、
〔1〕 以下の（a)〜（d)のいずれかに記載のポリペプチドであって、 p53タンパク質と 実質的に結合する機能を有するポリペプチドを有効成分として含有する、 P53タンパ ク質活性化剤、
(a)配列番号： 4に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド
(b)配列番号: 4に記載のアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠 失、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなるポリペプチド
(c)配列番号： 3に記載の塩基配列力もなるポリペプチドにストリンジェントな条件下で ハイブリダィズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
(d)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列力もなるシノビオリンタンパク質の部分断片ポリ ペプチドであって、該シノビオリンタンパク質の 236位〜 270位のアミノ酸領域を含む ポリペプチド
〔2〕 〔1〕の（a)〜（d)のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド を含むベクターを有効成分として含有する P53タンパク質活性化剤、
〔3〕 〔1〕または〔2〕に記載の p53タンパク質活性化剤を有効成分とする、癌治療剤、
〔4〕 配列番号: 4に記載のアミノ酸配列力 なるポリペプチド、
〔5〕 〔1〕の（a)〜（d)のいずれかに記載のポリペプチドを細胞内へ導入することを特 徴とする、 p53タンパク質の細胞質滞留を阻害する方法、
〔6〕 〔1〕の（a)〜（d)のいずれかに記載のポリペプチドを細胞内へ導入することを特 徴とする、 p53タンパク質を核に局在化させる方法、
〔7〕 〔1〕の（a)〜（d)のいずれかに記載のポリペプチドを細胞内へ導入することを特 徴とする、シノビオリンタンパク質と P53タンパク質の結合を阻害する方法、 〔8〕 〔1〕の（a)〜（d)のいずれかに記載のポリペプチドを細胞内へ導入することを特 徴とする、 p53タンパク質のリン酸化を亢進する方法、
〔9〕 〔1〕の（a)〜（d)のいずれかに記載のポリペプチドを細胞内へ導入することを特 徴とする、 P53タンパク質のュビキチンィ匕を阻害する方法、
〔10〕 〔5〕〜〔9〕の 、ずれかに記載の方法によって p53タンパク質を活性ィ匕させるこ とを特徴とする、癌の抑制方法、を提供するものである。 [0012] さらに本発明は、本発明に記載の上記ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポ リヌクレオチドを含むベクター、上記 p53タンパク質活性化剤、あるいは該 p53タンパク 質活性化剤を有効成分とする癌治療剤を投与する工程を含む癌の予防もしくは治療 する方法を提供する。また本発明は、本発明に記載の上記ポリペプチドあるいは該 ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターの、 p53タンパク質活性化剤 あるいは癌治療剤の製造における使用を提供する。
図面の簡単な説明
[0013] [図 1]図 1は、シノビオリンホモノックアウトマウス胎仔線維芽細胞 (MEF)における蛍光 免疫組織染色の結果を示す写真である。
[図 2]図 2は、 syno-/-の embryoにおける抗 p53抗体による免疫組織染色の結果を示 す写真である。
[図 3]図 3は、 p53に関するウェスタンブロッテイングの結果を示す写真である。
[図 4]図 4は、 syno-/-の MEF培養細胞における p53のリン酸ィ匕部位を同定した結果を 示す写真である。
[図 5]図 5は、シノビォリンに対する siRNA処理によって亢進した Serl5のリン酸化が力 フェイン添カ卩によりどのように影響するかを調べたウェスタンブロッテイングの写真であ る。
[図 6]図 6は、シノビオリンに対する siRNA処理による、 p53及び p21の発現が高まるこ とを示すウェスタンブロッテイングの写真である。
[図 7]図 7は、フローサイトメーターによる細胞周期の観察結果を示す図である。
[図 8]図 8は、 Tissue arrayを、抗シノビオリン抗体 (lODa)を用いて免疫染色した結果を 示す写真である。
[図 9]図 9は、 Tissue arrayを、抗シノビオリン抗体 (lODa)を用いて免疫染色した結果を 示す写真である。
[図 10]図 10は、 GFP野生型 p53を導入した細胞における p53の局在を観察した写真 である。
[図 11]図 11は、 GFP野生型 p53及び FLAG野生型シノビオリンを Saos-2細胞に共発 現させ、両導入遺伝子産物の局在を観察した写真である。 [図 12]図 12は、 GFP野生型 p53及び FLAGシノビオリン C307Sを Saos-2細胞に共発現 させ、両導入遺伝子産物の局在を観察した写真である。
[図 13]図 13は、 MBP-Synoviolin Δ ΤΜ- Hisによる GST- p53の in vitroュビキチン化反 応を示す写真である。
[図 14]図 14は、シノビオリン RNAiによる RA滑膜細胞での p53 mRNA量を示すグラフ である。
[図 15]図 15は、シノビォリンの各ドメインを GSTに融合したものと、 in vitro translation した全長 p53とを用いてプルダウンアツセィを実施した結果を示す写真である。
[図 16]図 16は、図 15で同定されたシノビォリンの領域をさらにサブクローユングした ものと in vitro translationした全長 p53を用いて、プルダウンアツセィを実施した結果を 示す写真である。
[図 17]図 17は、シノビォリンの 236-270アミノ酸を N末、または C末から削っていき、 in vitro translationした全長 p53とのプルダウンアツセィを実施した結果を示す写真であ る。
[図 18]図 18は、シノビォリンの 236- 270アミノ酸のみを欠失した GST- Synoviolin Δ ΤΜ を構築し、 in vitro translationした全長 p53とのプルダウンアツセィを実施した結果を 示す写真である。
[図 19]図 19は、シノビォリンにおける p53結合ドメインの最小領域を表した図である。
[図 20]図 20は、 A: HEK293細胞内での抗 HA抗体及び抗 FLAG抗体による synoviolin と p53の結合の検出を示した写真である。 B： HEK293細胞内での抗 HA抗体及び抗 F LAG抗体による synoviolinと p53の結合の検出を示した写真である。両図とも、共沈を 丸で囲って示した。
[図 21]図 21は、 Saos-2細胞において 53BDを欠失させたシノビォリンと p53の局在を示 す写真である。
[図 22]図 22は、 53BDペプチドがシノビォリンと p53の結合を競合阻害することを示す 写真である。
[図 23]図 23は、 53BDペプチドによる p53ュビキチン化活性の阻害効果を示す写真で ある。 発明を実施するための最良の形態
[0014] 以下、本発明を詳細に説明する。
正常細胞を紫外線等にさらすと、細胞内の p53が活性ィ匕して、その結果細胞増殖が 阻止されることから、 p53の濃度を上昇させることにより、癌細胞の増殖を止めることが できる。つまり、 p53が機能しない場合は、癌細胞の増殖が止められず、癌が進行す ることになる。事実、 p53変異は正常な個体の細胞にはほとんど見られないが、癌患 者由来の細胞の約半数においてはこの p53の欠損又は点変異が起こっている。また 、このような変異が起こっていない場合でも、 p53の制御機構に何らかの変異が生じ て癌抑制機能が失われている。従って、癌の進行を抑えるには p53を有効に機能さ せることが必要である。
[0015] 本発明者らは、 p53タンパク質の活性ィ匕を癌治療の有効な方法の一つとするため、 シノビオリン (synoviolin)の機能に着目した。そして、シノビオリンホモノックアウト動物 を作製し、詳細に解析したところ、野生型に比してアポトーシスを起こしている細胞が 多数観察された。即ち、シノビォリンの機能を阻害すると、アポトーシスに深く関与し ている p53タンパク質の活性ィ匕が促進され、シノビオリンの機能阻害が癌抑制につな 力 ¾ことを見出した。
[0016] さらに本発明者らは、シノビオリンタンパク質の 236-270番目の 35アミノ酸（53BD)が p53タンパク質との結合に必須領域であることを解明した。また、野生型シノビォリン は p53タンパク質を細胞質中へ滞留させたが、 53BD欠失体にはその活性は見られな かった。
[0017] 即ち、 p53との結合領域を有するシノビォリンの部分断片ポリペプチド (例えば、 53B D)は、 p53の細胞質滞留を阻害することにより、 p53を活性化させる機能を有すること が見出された。
[0018] 本発明は、 p53との結合領域を有する (p53との結合活性を有する）シノビオリンタン ノ ク質の部分断片ポリペプチド (本明細書においては、単に「本発明のポリペプチド」 と記載する場合あり）を有効成分として含有する、 p53タンパク質活性化剤を提供する
[0019] 本発明のシノビオリンタンパク質は、ヒトのシノビオリンタンパク質であることが好まし いが、その由来する生物種は特に制限されず、ヒト以外の生物におけるシノビオリン と同等なタンパク質 (シノビォリンのホモログ.オルソログ等)も本発明における「シノビ ォリンタンパク質」に含まれる。例えば、ヒト p53に相当するタンパク質を有し、かつ、ヒ トのシノビォリンと同等なタンパク質を有する生物であれば、本発明を実施することは 可能である。
[0020] シノビオリン、および p53のヒト並びにその他の生物における「相当するタンパク質」 の名称、 mRNA、アミノ酸配列のァクセッション番号を表 1に示す。
[0021] [表 1]
Figure imgf000008_0001
[0022] ヒトのシノビオリン遺伝子の公共遺伝子データベース Genbankにおけるァクセッショ ン番号は、 AB024690 (配列番号： 1)である。
[0023] ヒトにおけるシノビオリンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号： 1に示す。また 該塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号： 2に示す。上 記以外のタンパク質であっても、例えば配列表に記載された配列と高い相同性 (通 常 70%以上、好ましくは 80%以上、より好ましくは 90%以上、最も好ましくは 95%以上 )を有し、かつ、シノビオリンタンパク質が有する機能 (例えば p53タンパク質と結合す る機能、 p53リン酸化タンパク質の活性を阻害する機能、および Zまたは P53のュビキ チン化を促進する機能等)を持つタンパク質は、本発明のシノピオリンに含まれる。上 記タンパク質とは、例えば、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において、 1以上のァ ミノ酸が付加、欠失、置換、挿入されたアミノ酸配列力 なるタンパク質であって、通 常変化するアミノ酸数が 30アミノ酸以内、好ましくは 10アミノ酸以内、より好ましくは 5ァ ミノ酸以内、最も好ましくは 3アミノ酸以内である。
[0024] 本発明における「シノビオリン遺伝子」には、例えば、配列番号： 1に記載の塩基配 列からなる DNAに対応する他の生物における内在性の遺伝子 (ヒトのシノビオリン遺 伝子のホモログ等）が含まれる。
[0025] また、配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAに対応する他の生物の内在性 の DNAは、一般的に、配列番号： 1に記載の DNAと高い相同性を有する。高い相同 性とは、 50%以上、好ましくは 70%以上、さらに好ましくは 80%以上、より好ましくは 90 %以上 (例えば、 95%以上、さらには 96%、 97%、 98%または 99%以上)の相同性を 意味する。この相同性は、 mBLASTアルゴリズム (Altschul et al. (1990) Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA 87: 2264—8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7)によって決定することができる。また、該 DNAは、生体内から単離した場合、 配列番号： 1に記載の DNAとストリンジヱントな条件下でノヽイブリダィズすると考えられ る。ここで「ストリンジェントな条件」としては、例えば「2 X SSC、 0.1%SDS、 50°C」、「2 X SSC、 0.1%SDS、 42°C」、「1 X SSC、 0.1%SDS、 37°C」、よりストリンジェントな条件とし て「2 X SSCゝ 0.1%SDSゝ 65°C」、「0.5 X SSC、 0.1%SDSゝ 42°C」および「0.2 X SSC、 0.1 %SDS、 65°C」の条件を挙げることができる。当業者においては、他の生物における シノビオリン遺伝子に相当する内在性の遺伝子を、シノビオリン遺伝子の塩基配列を 基に適宜取得することが可能である。なお、本明細書においては、ヒト以外の生物に おけるシノビオリンタンパク質 (遺伝子）に相当するタンパク質 (遺伝子）、あるいは、 上述のシノビォリンと機能的に同等なタンパク質 (遺伝子）を、単に「シノビオリンタン パク質 (遺伝子) Jと記載する場合がある。
[0026] 本発明の「シノビオリンタンパク質」は、天然のタンパク質のほか、遺伝子組み換え 技術を利用した組換えタンパク質として調製することができる。天然のタンパク質は、 例えばシノビオリンタンパク質が発現して 、ると考えられる細胞 (組織)の抽出液に対 し、シノビオリンタンパク質に対する抗体を用いたァフィユティークロマトグラフィーを 用いる方法により調製することが可能である。一方、組換えタンパク質は、シノビオリ ンタンパク質をコードする DNAで形質転換した細胞を培養することにより調製すること が可能である。 [0027] 本発明のシノビオリンタンパク質がヒトのシノビォリンである場合には、 p53との結合 のための必須領域は、ヒトシノピオリンタンパク質のアミノ酸配列（配列番号： 2)にお V、て、 236位〜 270位 (番目）の領域である。当該 35アミノ酸残基力もなるペプチド領 域の配列を配列番号: 4に、該アミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号： 3に記 載する。
[0028] 本発明にお 、て、「p53との結合領域 (アミノ酸配列）を有するシノビオリンタンパク質 の部分断片ポリペプチド」とは、好ましくは、配列番号: 4に記載のアミノ酸配列を含む ポリペプチドであり、より好ましくは、配列番号: 4に記載のアミノ酸配列からなるポリべ プチドである。
[0029] 本発明のポリペプチドは、必ずしも具体的に示される上記の 53BDポリペプチド (配 列番号: 4)のみに限定されるものではない。 53BDと機能的に同等なポリペプチド (例 えば、 p53と実質的に結合する活性、もしくは p53を活性ィヒする機能を有するポリぺプ チド)であれば、いかなる形態 (構造)のポリペプチドであってもよい。例えば、配列番 号: 4に記載のアミノ酸配列において 1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入お よび Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなるポリペプチドであって、実質的に p53と 結合する機能を有するポリペプチドは、本発明のポリペプチドに含まれる。
[0030] 具体的なアミノ酸配列 (例えば、配列番号: 4)が開示された場合においては、当業 者であれば、これらアミノ酸配列を基に、適宜アミノ酸が改変された配列からなるポリ ペプチドを作製し、当該ポリペプチドについて、上述の機能を有するか否かを評価し 、本発明のポリペプチドを適宜選択することが可能である。
[0031] 例えば、所望のポリペプチドについて p53との結合活性 (相互作用活性）は、当業者 においては、公知の技術、例えば、免疫沈降法及びプルダウンアツセィ等を利用し て、適宜、評価 (測定)することができる。具体的には、後述の実施例に記載の方法 によって評価することができる。
[0032] また、本発明のポリペプチドは、ヒト以外の生物のシノビォリンに相当するタンパク質 における、 p53との結合領域を有する部分断片ペプチドであってもよい。即ち、本発 明のポリペプチドには、ヒトシノピオリンタンパク質のアミノ酸配列（配列番号： 2)にお いて 236位〜 270位の領域に相当する領域を含む、他の生物のシノビォリンに相当す るタンパク質の部分断片ポリペプチドが含まれる。
[0033] また、本発明の p53活性化剤の有効成分となるポリペプチドは、配列番号: 4に記載 のポリペプチドの改変体であって、 p53と実質的に結合する機能を有するポリべプチ ドであってもよい。
[0034] これらのポリペプチドは、通常、配列番号： 3に記載のアミノ酸配列において、 1もし くは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加されたアミノ酸配列から なるポリペプチドである。
[0035] 従って、本発明の好ましい態様においては、以下の（a)〜（d)のいずれかに記載の ポリペプチドであって、 p53と実質的に結合する機能、もしくは p53を活性ィ匕する機能 を有するポリペプチドを有効成分として含有する、 P53タンパク質活性化剤に関する。
(a)配列番号： 4に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド
(b)配列番号: 4に記載のアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠 失、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなるポリペプチド
(c)配列番号： 3に記載の塩基配列力 なるポリペプチドにストリンジェントな条件下で ハイブリダィズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
(d)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列力 なるシノビオリンタンパク質の部分断片ポリ ペプチドであって、該シノビオリンタンパク質の 236位〜 270位のアミノ酸領域を含む ポリペプチド
[0036] シノビオリンは、 p53のュビキチン化を促進する機能を有する。ュビキチンィ匕とは、タ ンパク質の分解マーカー分子であるュビキチンによるタンパク質の翻訳後の修飾反 応をいう。このュビキチンィ匕の生理的意義は、プロテオソーム系のタンパク質分解機 構へ送られるためのタグ修飾として、従来認識されていた。そして、その後の研究に より、現時点でのュビキチンィ匕の意義は、タンパク質機能を制御する可逆的タンパク 質修飾システムとして位置づけられて 、る。
[0037] ュビキチンィ匕は、具体的には、ュビキチン活性ィ匕酵素（E1)、ュビキチン結合酵素（ E2)およびュビキチンリガーゼ (E3)などの酵素が協同したカスケード反応を繰り返す ことにより、基質となるタンパク質にュビキチン分子を枝状に結合させてポリュビキチ ン鎖を形成する過程をいう。このポリュビキチン鎖は、ュビキチン分子内の 48番目の リシン残基の ε -アミノ基を介して形成され、 26Sプロテアノームへの分解シグナルとな り、標的タンパク質を分解に導く。
[0038] 本発明のポリペプチドは、シノビォリンの ρ53タンパク質のュビキチンィ匕促進作用を 阻害することにより、 ρ53を活性化させる特徴を有する。
[0039] 本明細書において用いられる「ポリペプチド」は、複数のアミノ酸からなる重合体を 意味し、そのアミノ酸の長さは特に制限されない。従って、本発明のポリペプチドには 、所謂「オリゴペプチド」および「タンパク質」も含まれる。ポリペプチドは、天然に存在 する状態力も修飾されていないもの、および修飾されているものの双方を含む。修飾 としては、ァセチル化、ァシル化、 ADP-リボシル化、アミドィ匕、フラビンの共有結合、 ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質また は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジ スルフイド結合の形成、メチル化、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピ ログルタメートの形成、ホルミル化、 γ -カルボキシル化、グリコシル化、 GPIアンカー 形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理 、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノィル化、硫酸化、アルギニル化のようなタン ノ ク質へのアミノ酸の転移 RNA媒介付加、ュビキチン化等が含まれる。
[0040] 本発明のポリペプチドは、そのアミノ酸配列に従って、一般的な化学合成法により 製造することが可能であり、該方法には、通常の液相法および固相法によるペプチド 合成法が包含される。かかるペプチド合成法は、より詳しくはアミノ酸配列の情報に 基づ 、て、各アミノ酸を 1個ずつ逐次合成させて鎖を延長して 、くステップワイズエロ ンゲーシヨン法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメン トをカップリング反応させるフラグメント'コンデンセーシヨン法を包含し、本発明のポリ ペプチドの合成は、いずれの方法を用いてもよい。
[0041] このようなペプチド合成法にて用いられる縮合法も、各種方法に従って行うことがで きる。その具体例としては、例えばアジド法、混合酸無水物法、 DCC法、活性エステ ル法、酸化還元法、 DPPA (ジフヱ-ルホスホリルアジド）法、ウッドワード法等を例示 できる。
[0042] これら各種方法に利用できる溶媒もまた、一般的に使用されるものを適宜利用する ことができる。その例としては、例えばジメチルホルムアミド（DMF)、ジメチルスルホキ シド（DMSO)、へキサホスホロアミド、ジォキサン、テトラヒドロフラン（THF)、酢酸ェチ ル等及びこれらの混合溶媒等を挙げることができる。なお、上記ペプチド合成反応に 際して、反応に関与しないアミノ酸およびペプチドにおけるカルボキシル基は、一般 にはエステル化により、例えばメチルエステル、ェチルエステル、第三級ブチルエス テル等の低級アルキルエステル、例えばべンジルエステル、 P—メトキシベンジルエス テル、 P—-トロベンジルエステルァラルキルエステル等として保護することができる。 また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えば Tyrの水酸基は、ァセチル基、ベンジ ル基、ベンジルォキシカルボニル基、第三級ブチル基等で保護されてもよいが、必 ずしも力かる保護は必須ではない。また、例えば、 Argのグァ-ジノ基は、ニトロ基、ト シル基、 2—メトキシベンゼンスルホ-ル基、メチシレン— 2—スルホ-ル基、ベンジル ォキシカルボ-ル基、イソボル-ルォキシカルボ-ル基、ァダマンチルォキシカルボ -ル基等の適当な保護基により保護することができる。
[0043] 上記のようにして得ることが可能な本発明のポリペプチドは、通常の方法に従って、 例えばイオン交換榭脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、ァフィ-ティ 一クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC)、向流分配法等のペプチド 化学の分野で汎用されている方法に従って、適宜、精製を行うことができる。
[0044] 本発明のポリペプチドは、例えば配列番号： 2もしくは 4に記載のポリペプチド、また は配列番号： 1もしくは 3に記載の DNA核酸分子を合成し、次いで適当な発現べクタ 一へ導入した後、宿主細胞内において発現させる遺伝子工学的手法によっても取得 することができる。
[0045] 一例を示せば、まず配列番号： 4に記載されたアミノ酸配列をコードする配列番号： 3に記載のポリヌクレオチドを合成する。該方法としては、リン酸トリエステル法ゃリン 酸アミダイト法などの化学合成手段〔J. Am.Chem. Soc, 89, 4801 (1967) ;同 91, 3350 (1969) ; Science, 150, 178 (1968) ; Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981) ;同 24, 245 (1 983)〕及びそれらの組合せ方法などが例示できる。より具体的には、 DNAの合成は、 ホスホルアミダイト法またはトリエステル法による化学合成により行うこともでき、巿販さ れている自動ポリヌクレオチド合成装置上で行うこともできる。二本鎖断片は、相補鎖 を合成し、適当な条件下で該鎖を共にアニーリングさせるか、または適当なプライマ 一配列と共に DNAポリメラーゼを用い相補鎖を付加するかによって、化学合成した一 本鎖生成物から得ることもできる。
[0046] 本発明のポリペプチドには、例えば、本発明者らによって決定された p53結合領域 力もなるポリペプチド (53BD;配列番号: 4)と機能的に同等なポリペプチドが含まれる 。ここで「機能的に同等」とは、対象となるポリペプチドが 53BDポリペプチドと同様の（ 同等の）生物学的ある ヽは生化学的機能 (活性)を有することを指す。このような機能 としては、例えば 53BDポリペプチドが有する機能、即ち、 p53タンパク質と結合する機 能、 p53タンパク質の活性化機能等を挙げることができる。対象となるポリペプチドが、 53BDポリペプチドと同等の生物学的あるいは生化学的な機能 (活性)を有しているか 否かは、例えば p53タンパク質との結合活性、 p53の活性等を測定することにより適宜 評価することが可能である。
[0047] あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知 られた方法としては、例えばポリペプチド中のアミノ酸配列に変異を導入する方法が 挙げられる。具体的には当業者であれば部位特異的変異誘発法 (Hashimoto-Gotoh , T. et al. (1995) Gene 152, 271—275、 Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enz ymol. 100, 468—500、 Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441—9456、 K ramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367、 Kunkel,TA(1985) P roc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492、 Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-27 66)などを用いて、配列番号: 4に記載のアミノ酸配列に適宜変異を導入することによ り、該ポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製することができる。また、ポリ ペプチド中のアミノ酸の変異は自然に生じることもある。このように、人工的か自然に 生じたものかを問わず、本発明者らにより同定された 53BDポリペプチド (配列番号: 4 )のアミノ酸配列において 1もしくは複数のアミノ酸配列が変異したアミノ酸配列を有し 、該ポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドは、本発明のポリペプチドに含まれる
[0048] 上記変異体における、変異するアミノ酸数は、 53BDポリペプチドの有する機能が保 持される限り制限はないが、通常 15アミノ酸以内であり、好ましくは 10アミノ酸以内で あり、より好ましくは 5アミノ酸以内であり、さらに好ましくは 1〜4アミノ酸である。
[0049] 変異するアミノ酸残基としては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸 に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸 (A 、 I、し、 M、 F、 P、 W、 Y、 V)、親水'性アミノ酸（R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K、 S、 T)、月旨 肪族側鎖を有するアミノ酸 (G、 A、 V、 L、 I、 P)、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸 (S、 T、 Υ)、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸 (C、 M)、カルボン酸及びアミド含有側鎖 を有するアミノ酸 (D、 N、 E、 Q)、塩基含有側鎖を有するアミノ離 (R、 K、 Η)、芳香族 含有側鎖を有するアミノ酸 (H、 F、 Y、 W)を挙げることができる (括弧内はいずれもアミ ノ酸の一文字表記を表す)。
[0050] あるアミノ酸配列に対する 1または複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び Z又は 他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生 物学的機能 (活性）を維持し得ることはすでに知られている（Mark, D. F. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666、 Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Ac ids Research (1982) 10, 6487—6500、 Wang, A. et al., Science 224, 1431—1433、 Dal badie— McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409—6413)。
[0051] 53BDポリペプチドのアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加されたポリべプチ ドには、これらポリペプチドを含む融合ポリペプチドが含まれる。融合ポリペプチドは、 これらポリペプチドと他のペプチド又はポリペプチドとが融合したものである。融合ポリ ペプチドを作製する方法は、 53BDポリペプチド (配列番号: 4)をコードするポリヌクレ ォチド（配列番号： 3)と他のペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを フレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させれ ばよく、当業者に公知の手法を用いることができる。本発明のポリペプチドとの融合に 付される他のペプチド又はポリペプチドは、特に制限されな ヽ。
[0052] 本発明のポリペプチドとの融合に付される他のペプチドとしては、例えば FLAG (Ho pp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204- 1210)、 6個の His (ヒスチジン）残基か らなる 6 X His, 10 X His,インフルエンザ凝集素（HA)、ヒト c-mycの断片、 VSV-GPの 断片、 pl8HIVの断片、 T7- tag、 HSV- tag、 E- tag、 SV40T抗原の断片、 lck tag, a - tu bulinの断片、 B-tag、 Protein Cの断片等の公知のペプチドを使用することができる。 また、本発明のポリペプチドとの融合に付される他のタンパク質としては、例えば、 GS T (ダルタチオン一 S—トランスフェラーゼ）、 HA、ィムノグロブリン定常領域、 j8—ガラ クトシダーゼ、 MBP (マルトース結合タンパク質)等が挙げられる。巿販されているこれ らペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを本発明のポリペプチドを コードするポリヌクレオチドと融合させ、これにより調製された融合ポリヌクレオチドを 発現させることにより、融合ポリペプチドを調製することができる。
[0053] またあるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製する当業者によく知られ た他の方法としては、ハイブリダィゼーシヨン技術（SambrookJ et al.， Molecular Cloni ng 2nd ed.， 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989)を利用する方法が挙 げられる。即ち、当業者であれば、 53BDポリペプチドをコードするポリヌクレオチド (配 列番号： 1に記載の塩基配列)もしくはその一部をもとに、同種または異種生物由来 のポリヌクレオチド試料から、これと相同性の高いポリヌクレオチドを単離して、該ポリ ヌクレオチドから 53BDポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを単離することも通 常行いうることである。
[0054] 本発明には、 53BDポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとハイブリダィズするポ リヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、 53BDポリペプチドと機能的 に同等なポリペプチドが含まれる。このようなポリペプチドとしては、例えばヒトあるい はマウスおよび他の哺乳動物のホモログ (例えば、ラット、ゼブラフィッシュ、線虫、キ イロショウジヨウバエ等の生物に由来するポリペプチド）が挙げられる。
[0055] 53BDポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単 離するためのノ、イブリダィゼーシヨンの条件は、当業者であれば適宜選択することが できる。ハイブリダィゼーシヨンの条件としては、例えば、低ストリンジェントな条件が挙 げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダィゼーシヨン後の洗浄において、 例えば 42°C、 0.1 X SSC、 0.1%SDSの条件であり、好ましくは 50°C、 0.1 X SSC、 0.1 %S DSの条件である。より好ましいハイブリダィゼーシヨンの条件としては、高ストリンジェ ントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば 65°C、 5 X SSC及び 0.1 %SDSの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有す る DNAが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダィゼーシヨンのストリン ジエンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業 者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジエンシーを実現すること が可能である。
[0056] また、ハイブリダィゼーシヨンにかえて、遺伝子増幅技術 (PCR) (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley &¾ons section
6.1-6.4)を用いて、本発明者の 53BDポリペプチド（配列番号： 4)をコードするポリヌク レオチド (配列番号： 3)の一部を基にプライマーを設計し、本発明者らにより同定され たポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相同性の高いポリヌクレオチド断片を単 離し、該ポリヌクレオチドを基に本発明者らにより同定されたポリペプチドと機能的に 同等なポリペプチドを取得することも可能である。
[0057] 本発明のポリペプチドは「成熟」ポリペプチドの形であっても、融合ポリペプチドのよ うな、より大きいポリペプチドの一部であってもよい。本発明のポリペプチドには、リー ダー配列、プロ配列、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、または組換え 生産の際の安定性を確保する付加的配列などが含まれて 、てもよ 、。
[0058] これらハイブリダィゼーシヨン技術や遺伝子増幅技術により単離されるポリヌクレオ チドがコードする、 53BDポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドは、通常、該ポリ ペプチド (配列番号: 4)とアミノ酸配列において高い相同性を有する。本発明のポリ ペプチドには、 53BDポリペプチドと機能的に同等であり、かつ該ポリペプチドのァミノ 酸配列と高い相同性を有するポリペプチドも含まれる。高い相同性とは、アミノ酸レべ ルにおいて、通常、少なくとも 50%以上の同一性、好ましくは 75%以上の同一性、さ らに好ましくは 85%以上の同一性、さらに好ましくは 95%以上（例えば、 96%以上、 97% 以上、 98%以上、 99%以上）の同一性を指す。ポリペプチドの相同性を決定するには、 文献（Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-73 0)に記載のアルゴリズムに従えばよい。
[0059] アミノ酸配列の同一性は、例えば、 Karlin and Altschulによるアルゴリズム BLAST ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:587 3-5877, 1993)によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、 BLASTX と呼ばれるプログラムが開発されている (Altschul et al. J. Mol. Biol.215: 403-410, 19 90)。 BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータ一は例えば、 sco re = 50、 wordlength = 3とする。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合には 、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法 は公知で &)る (nttp://www.ncbi. nlm.nih.gov.)。
[0060] 本発明のポリペプチドは、当業者に公知の方法により、組み換えポリペプチドとして 、また天然のポリペプチドとして調製することが可能である。組み換えポリペプチドで あれば、例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド (例えば、配列番 号： 3に記載のポリヌクレオチド)を、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿 主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、 ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは本発明のポリペプチドに対する抗体を力 ラムに固定したァフィユティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこ れらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。
[0061] また、本発明のポリペプチドをダルタチオン S-トランスフェラーゼタンパク質との融合 ポリペプチドとして、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えポリペプチドとして 宿主細胞 (例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させた 組み換えポリペプチドはダルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製す ることができる。融合ポリペプチドの精製後、必要に応じて融合ポリペプチドのうち、 目的のポリペプチド以外の領域を、トロンビンまたはファクター Xaなどにより切断し、 除去することも可能である。
[0062] 天然のポリペプチドであれば、当業者に周知の方法、例えば本発明のポリペプチド を発現している組織や細胞の抽出物に対し、本発明のポリペプチドに結合する抗体 が結合したァフィユティーカラムを作用させて精製することにより単離することができる 。抗体はポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。
[0063] 本発明のシノビオリンタンパク質の部分断片ポリペプチドは、 236位〜 270位の p53 結合領域を含むものであれば、特にその長さは制限されないが、通常、 200アミノ酸 以下であり、好ましくは 100アミノ酸以下であり、より好ましくは 50アミノ酸以下であり、さ らに好ましくは 40アミノ酸以下である。これらの長さの断片ポリペプチドであれば、 53B Dと同様の活性を保持することが期待される。 [0064] また、本発明のポリペプチドは例えば、 p53結合領域を認識する抗体の作製、およ び、シノビォリンと p53との結合を変化させる化合物のスクリーニング等に利用すること が可能である。
[0065] 本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードし得るものであればい かなる形態でもよい。即ち、 mRNA力も合成された cDNAである力 ゲノム DNAである 力 化学合成 DNAであるかなどを問わない。また、本発明のポリペプチドをコードしう る限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれ る。
[0066] 本発明のポリヌクレオチドは、当業者に公知の方法により調製することができる。例 えば、本発明のポリペプチドを発現している細胞より cDNAライブラリーを作製し、本 発明のポリヌクレオチド (例えば、配列番号： 1に記載の塩基配列）の一部をプローブ としてノ、イブリダィゼーシヨンを行うことにより調製できる。 cDNAライブラリ一は、例え は、文献 (Sambrook, J. et al., Molecularし loning、 し old Spring Harbor Laboratory Pr ess (1989))に記載の方法により調製してもよぐあるいは市販の DNAライブラリーを用 いてもよい。また、本発明のポリペプチドを発現している細胞より RNAを調製し、逆転 写酵素により cDNAを合成後、本発明のポリヌクレオチド (例えば、配列番号： 1に記 載の塩基配列）に基づいてオリゴ DNAを合成し、これをプライマーとして用いて PCR 反応を行い、本発明のポリペプチドをコードする cDNAを増幅させることにより調製す ることち可會である。
[0067] また、得られた cDNAの塩基配列を決定することにより、それがコードする翻訳領域 を決定でき、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列を得ることができる。また、得られた cDNAをプローブとしてゲノム DNAライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノム D NAを単離することができる。
[0068] 具体的には、次のようにすればよい。まず、本発明のポリペプチドを発現する細胞、 組織、臓器力 mRNAを単離する。 mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グァ-ジ ン超遠心法 (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294—5299)、 AGPC法 (C homczynski, P. and Sacchi, N.， Anal. Biochem. (1987) 162, 156- 159)等により全 RNA を調製し、 mRNA Purification Kit (Pharmacia)等を使用して全 RNAから mRNAを精製 する。また、 QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia)を用いることにより mRNA を直接調製することもできる。
[0069] 得られた mRNAから逆転写酵素を用いて cDNAを合成する。 cDNAの合成は、 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (生化学工業）等を用いて行 うこともできる。また、本明細書に記載されたプライマー等を用いて、 5'-Ampli FINDE R RACE Kit (Clontech製)およびポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction； PCR)を用いた 5'- RACE法 (Frohman, M. A. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (19 88) 85, 8998-9002； Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919—2932) に従い、 cDNAの合成および増幅を行うことができる。得られた PCR産物から目的と する DNA断片を調製し、ベクター DNAと連結する。さら〖こ、これより組換えベクターを 作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。 目的とする DNAの塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデォキシヌクレオチドチエイ ンターミネーシヨン法により確認することができる。
[0070] また、本発明のポリヌクレオチドの作成においては、発現に使用する宿主のコドン 使用頻度を考慮し、より発現効率の高い塩基配列を設計することができる（Grantham , R. et al., Nucelic Acids Research (1981) 9, r43- 74)。また、本発明のポリヌクレオチ ドは、市販のキットや公知の方法によって改変することができる。改変としては、例え ば、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドや適当な DNAフラグメントの挿入、 リンカ一の付加、開始コドン (ATG)及び Z又は終止コドン（TAA、 TGA、又は TAG)の 挿入等が挙げられる。
[0071] また本発明は、上記（a)〜（d)のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌ クレオチドを含むベクターを有効成分とする、 P53タンパク質活性化剤を提供する。 上記ベクターとしては、通常、本発明のポリペプチドをコードする DNAを担持するプ ラスミドもしくはウィルスベクターが一般的である。当業者においては、所望の DNAを 有するベクターを、一般的な遺伝子工学技術によって、適宜、作製することが可能で ある。通常、市販の種々のベクターを利用することができる。
本発明のベクターは、宿主細胞内において本発明のポリヌクレオチドを保持したり、 本発明のポリペプチドを発現させるためにも有用である。 [0072] 本発明におけるポリヌクレオチドは、通常、適当なベクターへ担持 (挿入)され、宿 主細胞へ導入される。該ベクターとしては、挿入した DNAを安定に保持するものであ れば特に制限されず、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローニング用べ クタ一として pBluescriptベクター (Stratagene社製）などが好まし!/、が、市販の種々の ベクターを利用することができる。本発明のポリペプチドを生産する目的としてべクタ 一を用いる場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験 管内、大腸菌内、培養細胞内、生物個体内でポリペプチドを発現するベクターであ れば特に制限されないが、例えば、試験管内発現であれば pBESTベクター（プロメガ 社製）、大腸菌であれば pETベクター（Invitrogen社製）、培養細胞であれば PME18S- FL3ベクター（GenBank Accession No. AB009864)、生物個体であれば pME18Sベタ ター（Mol Cell Biol. 8:466-472(1988))などを例示することができる。ベクターへの本 発明の核酸の挿入は、常法により、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応に より行うことができる。
[0073] 上記宿主細胞としては特に制限はなぐ 目的に応じて種々の宿主細胞が用いられ る。ポリペプチドを発現させるための細胞としては、例えば、細菌細胞 (例:ストレブトコ ッカス、スタフイロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、昆虫細胞（例：ドロソフ イラ S2、スポドプテラ SF9)、動物細胞（例： CHO、 COS, HeLa、 C127、 3T3、 BHK、 HE K293、 Bowesメラノーマ細胞）および植物細胞を例示することができる。宿主細胞へ のベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法 (Current pr otocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons . Section 9.1- 9.9)、リポフエクシヨン法（GIBCO- BRL社製）、マイクロインジェクション 法などの公知の方法で行うことが可能である。
[0074] 宿主細胞において発現したポリペプチドを小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、また は細胞外の環境に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに 組み込むことができる。これらのシグナルは目的のポリペプチドに対して内因性であ つても、異種シグナルであってもよい。
[0075] 上記製造方法におけるポリペプチドの回収は、本発明のポリペプチドが培地に分 泌される場合は、培地を回収する。本発明のポリペプチドが細胞内に産生される場 合は、その細胞をまず溶解し、その後にポリペプチドを回収する。
[0076] 組換え細胞培養物力も本発明のポリペプチドを回収し精製するには、硫酸アンモ -ゥムまたはエタノール沈殿、酸抽出、ァ-オンまたはカチオン交換クロマトグラフィ 一、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ァフィ- ティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマト グラフィーを含めた公知の方法を用いることができる。
[0077] また、動物の生体内で本発明のポリヌクレオチド (DNA)を発現させる方法としては、 本発明の DNAを適当なベクターに組み込み、例えば、レトロウイルス法、リボソーム法 、カチォニックリボソーム法、アデノウイルス法などにより生体内に導入する方法など が挙げられる。これにより、癌治療を行うことが可能である。用いられるベクターとして は、例えば、アデノウイルスベクターやレトロウイルスベクターなどが挙げられる力 こ れらに制限されな ヽ。ベクターへの本発明の DNAの挿入などの一般的な遺伝子操作 は、常法に従って行うことが可能である（Molecular Cloning ,5.61-5.63)。生体内への 投与は、 ex vivo法であっても、 in vivo法であってもよい。
[0078] 本発明の p53タンパク質活性化剤は、癌抑制タンパク質である p53を活性ィ匕すること により癌細胞の増殖を阻止する作用を有する。従って、本発明は、本発明の p53タン パク質活性化剤を有効成分とする、癌治療剤を提供する。
[0079] シノビォリンの発現もしくは機能を阻害すると、リン酸ィ匕酵素により p53がリン酸ィ匕さ れて p53が活性ィ匕し、サイクリン依存性リン酸ィ匕酵素阻害タンパク質である p21タンパ ク質の発現を高め、その結果、癌細胞の G1期から S期への移行を妨げることにより、 癌の発生または増殖を抑制するものと考えられる。従って、本発明の p53タンパク質 活性化剤を含有する薬剤は、 p21タンパク質活性化剤、あるいは、細胞周期 (特に G1 期から S期への移行)阻害剤となり得る。
[0080] なお p53が関与する疾患については、上述の癌の他にも、例えば神経変性疾患が 知られている（実験医学、増刊号、 2001、 p53研究の新たな挑戦、 p.122-127)。その ため本発明の p53タンパク質活性化剤は、神経変性疾患に対する治療剤ともなり得る と考えられる。
[0081] また、本発明の「癌治療剤」は、「癌細胞増殖抑制剤」、「癌細胞発生抑制剤」、「腫 瘍増殖抑制剤」、「抗癌剤」、あるいは「制癌剤」と表現することも可能である。また、本 発明において「治療剤」は、「医薬品」、「医薬組成物」、「治療用医薬」等と表現する ことちでさる。
なお、本発明における「治療」には、癌の発生を予め抑制し得る予防的な効果も含 まれる。また、癌細胞 (組織）に対して、必ずしも、完全な治療効果を有する場合に限 定されず、部分的な効果を有する場合であってもよい。
[0082] さらに本発明のポリペプチドは、抗リウマチ剤としても有用である。本発明における「 リウマチ」には、いわゆるリウマチ性疾患が含まれ、具体的には、リウマチ：関節リウマ チ、急性関節リウマチ、慢性関節リウマチ、悪性関節リウマチ、若年性関節リウマチな どを例示することができる。また上記リウマチ性疾患は、他の疾患と併発したものであ つてよい。
[0083] 上記「抗リウマチ剤」は、「リウマチ滑膜細胞増殖抑制剤」、「リウマチ滑膜細胞発生 抑制剤」、「リウマチ治療剤」、「リウマチ性疾患治療剤」、「抗リウマチ薬」、あるいは「 抗リウマチ性疾患薬」と表現することもできる。
[0084] 本発明の薬剤は、生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合 し、医薬組成物として経口、あるいは非経口的に投与することができる。経口剤として は、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型とする ことができる。非経口剤としては、注射剤、点滴剤、外用薬剤、あるいは座剤等の剤 型を選択することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内 注射剤等を示すことができる。外用薬剤には、経鼻投与剤、あるいは軟膏剤等を示 すことができる。主成分である本発明の薬剤を含むように、上記の剤型とする製剤技 術は公知である。
[0085] 例えば、経口投与用の錠剤は、本発明の薬剤に賦形剤、崩壊剤、結合剤、および 滑沢剤等を加えて混合し、圧縮整形することにより製造することができる。賦形剤に は、乳糖、デンプン、あるいはマン-トール等が一般に用いられる。崩壊剤としては、 炭酸カルシウムやカルボキシメチルセルロースカルシウム等が一般に用いられる。結 合剤には、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、あるいはポリビニルピロリドン が用いられる。滑沢剤としては、タルクゃステアリン酸マグネシウム等が公知である。 [0086] 本発明の薬剤を含む錠剤は、マスキングや、腸溶性製剤とするために、公知のコー ティングを施すことができる。コーティング剤には、ェチルセルロースやポリオキシェ チレングリコール等を用いることができる。
[0087] また注射剤は、主成分である本発明の薬剤を適当な分散剤とともに溶解、分散媒 に溶解、あるいは分散させること〖こより得ることができる。分散媒の選択により、水性溶 剤と油性溶剤のいずれの剤型とすることもできる。水性溶剤とするには、蒸留水、生 理食塩水、あるいはリンゲル液等を分散媒とする。油性溶剤では、各種植物油ゃプ ロピレングリコール等を分散媒に利用する。このとき、必要に応じてパラベン等の保存 剤を添加することもできる。また注射剤中には、塩ィ匕ナトリウムゃブドウ糖等の公知の 等張化剤をカ卩えることができる。更に、塩ィ匕ベンザルコ-ゥムゃ塩酸プロ力インのよう な無痛化剤を添加することができる。
[0088] また、本発明の薬剤を固形、液状、あるいは半固形状の組成物とすることにより外 用剤とすることができる。固形、あるいは液状の組成物については、先に述べたもの と同様の組成物とすることで外用剤とすることができる。半固形状の組成物は、適当 な溶剤に必要に応じて増粘剤を加えて調製することができる。溶剤には、水、ェチル アルコール、あるいはポリエチレングリコール等を用いることができる。増粘剤には、 一般にベントナイト、ポリビュルアルコール、アクリル酸、メタクリル酸、あるいはポリビ -ルピロリドン等が用いられる。この組成物には、塩ィ匕ベンザルコ -ゥム等の保存剤 を加えることができる。また、担体としてカカオ脂のような油性基材、あるいはセルロー ス誘導体のような水性ゲル基材を組み合わせることにより、座剤とすることもできる。
[0089] 本発明の薬剤を遺伝子治療剤として使用する場合は、本発明の薬剤を注射により 直接投与する方法のほか、核酸が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる 。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、ヘル ぺスゥイノレスベクター、ワクシニアウイノレスベタター、レトロウイノレスベタター、レンチウ ィルスべクタ一等が挙げられ、これらのウィルスベクターを用いることにより効率よく投 与することができる。
[0090] また、本発明の薬剤をリボソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投 与することも可能である。例えば、本発明のポリペプチドもしくはベクターを保持させ た小胞体をリボフヱクシヨン法により所定の細胞に導入する。そして、得られる細胞を 例えば静脈内、動脈内等に全身投与する。癌組織等に局所的に投与することもでき る。
[0091] 本発明の薬剤は、安全とされている投与量の範囲内において、ヒトを含む哺乳動物 に対して、必要量 (有効量)が投与される。本発明の薬剤の投与量は、剤型の種類、 投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、最終的には医師または 獣医師の判断により適宜決定することができる。一例を示せば、年齢、性別、症状、 投与経路、投与回数、剤型によって異なる力 例えばアデノウイルスの場合の投与量 は 1日 1回あたり 106〜1013個程度であり、 1週〜 8週間隔で投与される。
[0092] 本発明の薬剤を使用する場合は、適用部位もしくは癌種は特に限定されず、脳腫 瘍、舌癌、咽頭癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、脾臓癌、胆道癌、胆嚢癌、十二指腸 癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、線維 肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、皮膚癌、各種白血病（例えば急性骨髄性白血病、急性リ ンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、成人型 T細胞白血病、悪 性リンパ腫)、等を対象として適用される。上記癌は、原発巣であっても、転移したも のであっても、他の疾患と併発したものであってもよ！/、。
[0093] また後述の実施例で示すように、シノビオリンは p53の細胞質滞留に必須であること が示された。また、シノビォリンと p53の結合を阻害することにより、 p53の細胞質滞留 が阻害されることが見出された。従って、本発明のポリペプチドは、 p53に対する結合 をシノビォリンと競合阻害することにより、 P53の細胞質滞留を阻害する機能を有する
[0094] 本発明は、本発明のポリペプチドを細胞内へ導入することを特徴とする、 p53の細胞 質滞留を阻害する方法に関する。上記「p53の細胞質滞留の阻害」とは、より具体的 には、 p53の小胞体膜上への滞留を阻害することを指す。
[0095] 後述の実施例で示すように、シノビオリンノックアウトマウス胎仔 MEFにお!/、て、 p53 タンパク質は核内に強く局在し、この核の局在は野生型マウス胎仔 MEFでは観察さ れな力つた。また、シノビォリンと p53を共発現させると、 p53は細胞質内にシノビオリン と共局在した。このことは、細胞質において p53タンパク質はシノビオリンタンパク質と 密接に関係し、シノビオリンタンパク質力 ¾53タンパク質の細胞質 (小胞体膜上)への 滞留に関与していることを示している。即ち、本発明のポリペプチドの作用によって、 p53の細胞質滞留を阻害することにより、 p53を核に局在化させることが可能である。 従って本発明は、本発明のポリペプチドを細胞内へ導入することを特徴とする、 p53を 核に局在化させる (核内へ移行させる）方法に関する。
[0096] また、シノビオリンは p53のュビキチン化を促進するため、シノビォリンと p53との結合 を阻害することにより、 p53のュビキチン化を阻害することができ、 p53のュビキチンィ匕 を阻害すれば、 P53は活性ィ匕され、ひいては癌の抑制につながるといえる。従って、 本発明のポリペプチドを細胞へ導入することにより、 p53のュビキチンィ匕を阻害させる ことも可能である。
[0097] また後述の実施例で示すように、本発明のポリペプチドを添加することにより、ポリ ュビキチンィ匕された p53の減少が観察された。従って、本発明のポリペプチドは、 p53 のュビキチンィ匕を阻害する機能を有する。
[0098] 本発明は、本発明のポリペプチドを細胞内へ導入することを特徴とする、 p53タンパ ク質のュビキチン化を阻害する方法に関する。上記「p53タンパク質のュビキチンィ匕を 阻害」とは、より具体的には、 p53タンパク質のュビキチンィ匕による分解を阻害すること を指す。
[0099] また本発明のポリペプチドを細胞内へ導入することによって、シノビオリンタンパク 質と p53タンパク質との結合を阻害することができる。従って、本発明は、本発明のポ リペプチドを細胞内へ導入することを特徴とする、シノビオリンタンパク質と P53タンパ ク質との結合を阻害する方法を提供する。
[0100] 本方法にお!、て「ポリペプチドを細胞内へ導入する」とは、該ポリペプチド直接細胞 内へ導入することにカ卩えて、例えば、該ポリペプチドを発現し得るベクターを細胞内 へ導入することも含まれる。
[0101] 細胞内への導入は、例えば本発明のポリペプチドを脂溶性の高い物質、例えばリ ポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を導入することによって実施す ることができる。あるいは別の態様として、該ポリペプチドを細胞内へ移行する活性を 有する分子 (薬物）と結合 (修飾)させること〖こよっても行うことができる。該分子として は、ペプチドあるいは核酸の移行の際に利用可能な種々の公知の物質、例えば、担 体、運搬体、ベクター、デリバリー分子、キャリア分子等を利用することができる。
[0102] 本発明にお 、て、胎児胚における p53の免疫染色を行ったところ、シノビオリンホモ ノックアウトマウス胎児胚では全身において P53が強く発現することが分力つた。また、 シノビォリンホモノックアウトマウス胎児胚カも単離した胎仔線維芽細胞 (MEF)も、野 生型から単離したものに比して強く発現しており、し力も p53は核内に強く局在した。 この核局在は野生型ではまったく観察されな力つた。また、シノビォリンと p53を共発 現させると、 p53は細胞質内にシノビォリンと共局在した。このことは、シノビオリンの発 現および/または機能を阻害することにより、 P53を核内へ移行させることができること を意味する。
[0103] さらに、シノビオリンホモノックアウトマウス胎仔 MEFでは、高い放射線感受性または 紫外線感受性を示した。従って、本発明において、癌細胞中のシノピオリンの発現お よび/または機能を阻害して P53を癌細胞の核に移行させた後に、癌細胞に対して放 射線照射または紫外線照射を行うと、癌細胞の増殖を効果的に抑制することができ る。放射線照射手段は、特に限定されるものではないが、例えば γ線を 1〜10 Gy照 射することができる。また、紫外線照射は、紫外線 (波長 100〜400應、好ましくは 290 〜400 nm)を、適当な紫外線照射装置 (フナコシ社、デルマレイ社、キーエンス社製 等)を用いて照射することができる。
[0104] また後述の実施例で示すように、シノビォリンの発現を阻害することによって、リン酸 化酵素により P53がリン酸化されて p53が活性化されることを見出した。従って本発明 は、本発明のポリペプチドを細胞内へ導入することを特徴とする、 p53タンパク質のリ ン酸化を亢進する方法に関する。
[0105] さらに、核に局在化した p53を含む細胞 (特に癌細胞）に、さらに抗癌剤を接触させ ることにより、効率良く癌を抑制することが可能である。あるいは、上記核に局在化し た P53を含む癌細胞の周囲の脈管 (例えば血管またはリンパ管）に塞栓を施すことで 、癌を抑制することもできる。
[0106] 「抗癌剤」には、アルキル化剤、代謝拮抗薬、微小管阻害薬、白金錯化合物、分子 標的治療薬などが含まれる。これらの抗癌剤の具体例として以下のものを挙げること ができる力 これらに限定されるものではない。
<アルキル化剤 >
マスタード系：シクロホスフアミド (エンドキサン）、メルファラン等
アジリジン系：チォテパ等
ァノレキノレスノレホン系：ブスノレファン等
ニトロソ尿素系：ニムスチン、口ムスチン等
く代謝拮抗薬〉
葉酸誘導体：メトトレキセート等
プリン誘導体:メルカプトプリン、ァザチォプリン等
ピリミジン誘導体： 5—フルォロウラシル、テガフール、カルモフール等 <微小管阻害薬 >
ビンカァノレカロイド：ビンクリスチン、ビンブラスチン等
タキサン：パクリタキセル、ドセタキセル等
くホルモン類似薬 >
タモキシフェン、エストロゲン等
<白金錯化合物 >
シスプラチン、カルポプラチン等
<分子標的治療薬 >
イマ二チブ、リツキシマブ、ゲフィ二チブ等
[0107] 抗癌剤を癌細胞に接触させるための方法は、 p53が核に局在化した細胞が含まれ る細胞または組織 (癌細胞または癌組織）に、抗癌剤を添加する方法、あるいは担癌 患者または担癌動物に抗癌剤を投与する方法などが採用される。この場合の抗癌剤 の処理量は、特に限定されるものではないが、添加する場合には 100 pM〜100 /ζ Μ 、好ましくは 1 ηΜ〜10 /ζ Μである。動物体内に投与するときは、例えば抗癌剤として エンドキサンを使用するときは、 0.1〜100 mg/kg/day、好ましくは 2〜25 mg/kg/dayで ある。エンドキサン以外の抗癌剤についても、当業者は投与量または添加量を適宜 設定することができる。
[0108] 核に局在化した p53を含む癌細胞の周囲の脈管に塞栓を施すには、 p53が核に局 在化した癌細胞が含まれる細胞集団または組織の周囲の血管に血栓を形成させて もよぐ血管またはリンパ管については脂肪による塞栓、空気やガスによる塞栓を形 成させてもよい。
[0109] また本発明は、本発明のポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド を含むベクター、本発明の p53タンパク質活性化剤、あるいは該 p53タンパク質活性 ィ匕剤を有効成分とする癌治療剤を個体 (例えば、患者等)へ投与することを特徴とす る、癌を予防もしくは治療する方法に関する。本発明の予防もしくは治療方法におけ る個体とは、好ましくはヒトである力 特に制限されず非ヒト動物であってもよい。
[0110] 個体への投与は、一般的には、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射など 当業者に公知の方法により行うことができる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方 法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能 である。
[0111] さらに本発明は、本発明のポリペプチドあるいは該ポリペプチドをコードするポリヌク レオチドを含むベクターの、 P53タンパク質活性化剤あるいは癌治療剤の製造におけ る使用に関する。
[0112] なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。
実施例
[0113] 以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施 例に限定されるものではない。
〔実施例 1〕 MEF培養細胞における p53の活性ィ匕の検討
シノビオリンホモノックアウトマウス（syno-/-)胎児線維芽細胞 (MEF)における p53を 免疫蛍光染色により確認した。
すなわち、免疫染色法は、 MEFを常法に従いスライドガラス上に固定し、抗 p53抗体 (マウスモノクローナル抗体 BD : Becton, Dickinson社）を用いて免疫染色を行った。 3 %牛血清アルブミン（BSA)で 30分ブロッキングを行った標本に、 0.3%BSAで希釈した 抗 p53抗体 (BD： 10 μ g/mL)を室温で 60分免疫反応させた。反応後の標本を PBSで 洗浄後、 TRITC標識抗マウス IgG抗体 (Dako社)を 2次抗体として免疫反応させた。抗 p53抗体に免疫反応する抗原の確認は、蛍光顕微鏡で行った。
その結果、野生型に比し、 syno-/-の MEF培養細胞では p53の発現上昇、及び核内 移行を起こして 、る細胞が多数確認された（図 1、「MEF-/-」のパネル)。
[0114] 〔実施例 2〕 syno- /-マウスにおける p53活性ィ匕の検討
syno-/-マウスにおける p53活性ィ匕の検討を、 embryoを用い免疫染色により行った。 すなわち、 syno-/-の胎仔における免疫染色は、常法に従い組織をスライドガラス 上に固定し、ベクタスティン ABCキット (VECTOR社)を用いて行った。ブロッキング試 薬で 30分ブロッキングした標本に対して、 5 g/mLに希釈した抗 p53抗体 FL393を室 温で 60分間免疫反応させた。反応後の標本を PBSで洗浄し、 HRP標識抗ゥサギ IgG 抗体を 2次抗体として免疫反応させた。抗 p53抗体に免疫反応する抗原は、 HRP活性 に基づく 3,3'-ジァミノべンジジン四塩酸塩の発色により確認した。対比染色としてメ チルダリーン染色を行った。
この結果、 syno-/-の embryoにおける p53が安定化及び発現上昇して!/、ることが確 認された（図 2)。
[0115] 〔実施例 3〕 p53に対するシノビォリンの効果
syno-/-の MEF培養細胞における p53をウェスタンブロッテイングにより検出した。 すなわち、各種細胞を細胞破砕液（50 mM Tris- HCl (pH 8.0)、 150 mM NaCl、 1% NP40、 1 mM PMSF、 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS)、 2 μ g/mL Leupeptin、 2 μ g/ mL Aprotinin, 2 μ g/mL Pepstatin)を用いて細胞破砕画分を調製した。その後、 SDS ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE)により細胞破砕画分を分離した。 SDS-PAG E後、細胞由来タンパク質は、エレクトロブロッテイング法により-トロセルロース（NC) 膜に転写した。この NC膜に対し、 5%スキムミルクをカ卩えた Tris buffered saline (TBS)で 室温、 1時間ブロッキングした後、抗 p53抗体 c- terminal aa;195- 393または FL393を 5% スキムミルクを加えた TBSで希釈して室温、 1時間免疫反応させた。反応後の NC膜を 0.1% Tween20/TBSで洗浄し、 horse radish peroxidase (HRP)標識抗ゥサギ IgG抗体 を 2次抗体として室温、 1時間免疫反応させ、 0.1% Tween20/TBSで洗浄し、 HRP活性 を検出することにより目的抗原を検出した。 HRP活性の検出には ECLキット (Amersha m社）を用いた（Clinical Chemistry. 25, pi 531 , 1979) 0 その結果、ウェスタンブロッテイングにより syno-/-の MEF培養細胞における p53発現 量が増加して 、ることが確認された（図 3)。
[0116] 〔実施例 4〕 syno-/-の MEF培養細胞における p53のリン酸ィ匕部位の同定
本実施例においては、抗 p53抗体を用いたウェスタンブロッテイングにより p53のリン 酸ィ匕部位の同定を行った。
すなわち、 p53 (配列番号： 5)の異なるセリン残基のリン酸ィ匕を認識する 4種の抗リン 酸化 p53モノクローナル抗体（Phospho- p53(serl5)、 Phospho- p53(ser20)、 Phospho- p 53(ser37)および Phospho-p53(ser46) ; Cell Signaling社）を用いて、 MEF細胞のタンパ ク質を SDS-PAGEで分離し、ウェスタンブロッテイング法を行った。ウェスタンブロッティ ング法の操作は、一次抗体として抗リン酸化 p53モノクローナル抗体を、そして標識抗 体として抗マウス IgGヒッジ -HRPを用いる他は実施例 3に記載のとおりである。
その結果、 syno-/-の MEF培養細胞において、 p53のアミノ酸配列（配列番号： 5)中 、第 15番目のセリン残基のリン酸ィ匕が顕著であった（図 4)。図 4において、左上のパ ネルが、第 15番目のセリン残基がリン酸ィ匕されたものである。 53kDa付近のバンドが 顕著に濃く表れている。
[0117] 〔実施例 5〕 Serl5のリン酸化亢進のメカニズムの解明
細胞株として野生型の P53を発現して 、ることが確認されて 、る RKO (ヒト大腸がん 由来細胞株)を 60 mmプレートに l.OxlO5細胞/プレート /2mLで細胞を播種し、 Oligofe ctamineを用いて GFPおよびシノビオリンに対する siRNAオリゴヌクレオチドをトランスフ ェタトした後、 72時間後に Serl5のリン酸化に重要な ATM(ataxia-telangiectasia mutat ed)および ATR(ATM and Rad3 related)の阻害剤であるカフェイン (10 mM)を添カロし、 リン酸化 Serl5-p53に対する抗体 Phospho-p53(serl5)を用いてウェスタンブロッテイン グを行った。
その結果、シノビォリンに対する siRNAによって亢進した Serl5のリン酸ィ匕はカフエイ ン添加（添加後 12時間、 24時間）により、完全に阻害された（図 5)。シノビオリンの発 現を阻害すると、 ATMおよび ATRによる p53の活性を誘導することが示唆された。
[0118] 〔実施例 6〕 p53により誘導される p21の発現にシノビォリンが及ぼす影響
RKO細胞をシノビォリンに対する siRNA処理し、 p53の転写産物である p21の発現の 変化をウェスタンブロッテイングで検討した。
すなわち、細胞株として野生型の p53を発現して 、ることが確認されて 、る RKO (ヒト 大腸がん由来細胞株)を 60 mmプレートに l.OxlO5細胞/プレート /2mLで細胞を播種し 、 Oligofectamineを用いて GFPおよびシノビオリンに対する siRNAオリゴヌクレオチドを トランスフエタトした。 72時間後に細胞を回収し調製した。調製したタンパク質を SDS- PAGEで分離し、抗 p21ポリクローナル抗体（Santa Cruz社）を用いて、ウェスタンブロッ ティング法を行った。ウェスタンブロッテイング法の操作は、一次抗体として抗 p21ポリ クローナル抗体を、そして標識抗体として抗マウス IgGヒッジ -HRPを用いる他は実施 例 3に記載のとおりである。
その結果、シノビォリンに対する siRNA処理によって、 p53の発現が高まると同時に、 p21の発現も増加した。この効果は 72時間で明確に示された（図 6)。
[0119] 〔実施例 7〕 シノビオリン発現阻害による細胞周期への影響の検討
本実施例においては、リウマチ患者由来滑膜細胞におけるシノビオリンを、 RNAi効 果により阻害した際の細胞周期への影響の検討を行った。
RA滑膜細胞を 10cmディッシュに 9.0xl04細胞で播種し、シノビオリン siRNA (最終濃 度 25nM)をトランスフエタトした後、フローサイトメーターにより細胞周期を観察した。そ の結果、 siRNA 25 nM(h589)では、 G0/G1期における細胞周期の遅延が見られた（図 7)。 siRNAとしては h589を用いた。
[0120] なお、 h589とは、以下のセンス鎖およびアンチセンス鎖をァニールさせた 2本鎖 RN Aを意味する。
センス鎖 h589 : GGU GUU CUU UGG GCA ACU G TT (配列番号： 6) アンチセンス鎖 h589 : CAG UUG CCC AAA GAA CAC C TT (配列番号： 7)
[0121] 〔実施例 8〕 癌組織におけるシノピオリンの発現の検討
Tissue array (CHEMICON社： 10 common human cancer tissue with normal human tissue)を、抗シノビオリン抗体 (10 Da)を用いて免疫染色した。免疫染色に使用した 抗体濃度は 8 g/mLであり、使用したキットはシンプルスティン MAX (M)である。 その結果、正常組織でのシノビォリンの発現は、大腸、腎、肺、卵巣、精巣、皮膚お よび乳腺で認められたのに対し、神経およびリンパ節では認められな力つた。また、 各腫瘍組織においてシノピオリンの発現が確認され、特に、発現が明らかに亢進して
V、ると判断された組織は、神経'リンパ節であった（図 8および図 9)。
[0122] 〔実施例 9〕 培養細胞中でシノビオリンおよび p53を共発現させた場合の各々の局在 への影響
3種類のプラスミド、 GFP- p53、 FLAG- synoviolin、および FLAG- synoviolin C307S( ュビキチン (Ub)化活性なし)を Saos- 2細胞に導入した。
[0123] 各プラスミドは、以下の通りである。
GFP-p53 : Green fluorescence proteinと野生型 p53のフュージョン蛋白発現 FLAG-synoviolin： FLAGタグつき野生型シノビオリン発現
FLAG-synoviolin C307S (ュビキチン（Ub)化活性なし)： FLAGタグつき失活型シノビ ォリン発現
[0124] FuGene6 (Roche)によるトランスフエクシヨン処理して 24時間後に 10%ホルマリンで固 定し、 400倍希釈一次抗体 α -FLAG抗体、 200倍希釈二次抗体 α -mouse IgG-TRIT C、 1 M DAPIで核を染色して、その局在を観察した。
その結果、野生型 p53は共発現させると核に局在することが観察された（図 10)。野 生型シノビオリンは共発現すると細胞質 (特に核周辺）に局在した。また、野生型 P53 と野生型シノビオリンを共発現させると、本来核に局在する p53が核周辺に細力 、ドッ ト状に分布し、シノビォリンと共局在していることが観察された（図 11)。野生型 p53と シノビオリン C307S mutantを共発現させると、 p53が細胞質内に大きなドットを形成し、 シノビオリンと共局在して 、ることが観察された（図 12)。
以上のことから、シノビォリンと p53は一定条件下で共局在することが示された。ュビ キチンィ匕活性の有無でその局在の形態が変化することが考えられる。
[0125] 〔実施例 10〕 MBP- Synoviolin Δ ΤΜ- Hisによる GST- p53の in vitroュビキチン化の検 討
シノビォリンの細胞内における増減により P53の細胞内タンパク質量の変動が観察 されており、シノビォリンによる p53の制御が示唆されている。そこで、シノビォリンが直 接 p53をュビキチン化（Ub)するか否かを調べるために、 GST-p53および MBP-Synovi οϋη Δ ΤΜ -Hisを用いて in vitroュビキチン化反応の検討を行った。 [0126] GST-p53 :N末端側に GSTを融合させた p53を大腸菌内で発現させ、それを精製し て得た画分。
MBP-Synoviolin Δ ΤΜ- His :N末端側に MBP, C末端側に Hisタグを融合させたシノ ピオリンを大腸菌内で発現させ、それを精製して得た画分。
[0127] pGEX/p53を保持した大腸菌 (BL21)を 500 mLの LB培地で培養し、 IPTGによる誘導 後 (1 mM、 30°C、 6h)、培養液より 0.5% NP-40を含む緩衝液を用いて大腸菌抽出液を 調製した。
大腸菌抽出液より GST- p53を GSH-セファロース榭脂を用いて 0.1% NP- 40存在下で 精製した。その透析後の試料を用いて、 MBP-Synoviolin Δ ΤΜ -Hisおよび他の in vit roュビキチン化反応に用いる組成物（ATP、 PK- His- HA- Ub、 yeast El、 His- UbcH5 c)を組み合わせて反応を行った（図 13)。反応後、タンパク質を 7.5% SDS-PAGEによ り分離し、 PVDF膜上に転写して抗 p53抗体 (FL393あるいは DO- 1)により膜上の p53タ ンパク質を検出した。また、 GST-p53の添加量を変化させて同様の反応および検出 を行った。
その結果、 GST-p53精製画分および MBP-Synoviolin Δ TM-Hisを含む全ての組成 物を添カ卩した場合に、約 90kDaの位置を中心として p53由来のラダー状のシグナルが 観察された（図 13)。これらの結果から、シノビォリンが直接 p53のュビキチンィ匕に関 与していると言える。従って、シノビォリンの発現および/または機能を阻害することに より、 p53のュビキチンィ匕を抑制できることが示された。
[0128] 〔実施例 11〕 RNAi下におけるシノビオリン、 p53 mRNA量の検討
本実施例では、シノビオリン RNAi条件下において、シノビォリンおよび関連遺伝子 について、経時的に mRNA量の変化を検討することでシノピオリンが細胞周期、アポト 一シスなどへ及ぼす影響を検討した。
RA滑膜細胞を 30000cells/10cmディッシュで播種し、定法に従い 25 nM siRNA(No. 589)をトランスフエクシヨンし、細胞培養 4日間の間、経時的に細胞を回収し、 mRNAを 得た。 1 μ gの mRNAをテンプレートとし、ランダムプライマーを用いて逆転写反応を行 い、 cDNAを得た。得られた cDNAについて、 ABI TaqMan Gene expression assay (GE X)を用いて、定量を行った。対照遺伝子を 18S rRNAとして mRNA量を算出した。 GEX試薬ターゲットアツセィ No. (アツセィ ID)は、シノビォリンが Hs00381211_ml、 p5 3が Hs00153340_mlである。
その結果、シノビオリン siRNA存在下では、シノビオリン mRNA量が減少する力 p53 の mRNA量は変化して!/、な!/、ことが確認された（図 14)。
[0129] 〔実施例 12〕 シノビォリンの p53結合ドメイン最小領域の決定
さらに、シノビォリンの p53結合ドメインをより明確に示すために、以下のような実験を 行った。
シノビォリンと P53の結合ドメインを同定するためサブクローユングを行った。シノビ ォリンの各ドメインを GSTに融合したものと in vitro translationした全長 p53を用いて下 記のようにプルダウンアツセィを行った。 100 μ Lの Competent cell (BL- 21株）を 1 L の各 GSTタンパク質をコードしたプラスミドで形質転換した。
[0130] 4 mLの LB- Amp+に接種し、 37°Cでー晚培養した。翌日 Pre- cultureの OD600を測 定し、 15 mLの LB-Amp+に OD600=3.0相当を接種した（終濃度 0.2)。 25°C恒温槽 で約 2hr培養し、 OD600=0.6〜0.8になったことを確認した後、恒温槽に氷をカ卩えて 20 °Cに冷却し、培養容器を 10分つけて 20°Cまで冷却した。 0.1 M IPTGを 15 ja L (終濃 度 = 0.1 mM、通常の 1/1000)、 1 mM ZnClを 150 L (終濃度 =10 M)カロえて、 20°C
2
で 4hr震盪培養し GSTタンパク質の発現を誘導した。誘導後、遠心して細胞を回収し た（5000 rpm、 5min、 4°C) 0 1 mL PBS (-)に細胞を再懸濁し、エツペンドルフチューブ に移し、細胞を回収した（14000 rpm、 lmin、 4°C) 0上清を全て吸い取った後、 500 L の PBS (-) I Z (PBS (-) / lO ^ M ZnCl )に再懸濁し、液体窒素で凍結、 20°Cで保存
2
した。翌日—20°Cのサンプルを 37°Cの恒温槽に lOminつけて融かし、次に氷水中に つけて 0°Cまで冷却した。以下のプロテアーゼ阻害剤を混合し、 1サンプルあたり 6.5 μしカ口 た。
[0131] 100 mM PMSF (Final 1 mM) 20 μ L
Aprotinin (Final 0.1%) 2 μ L
0.5 mg/mL PepstatinA (Final 0.5 μ g/mL) 2 μ L
1 mg/mL Leupeptin (Pinal 1 μ g/mL) 2 μ L
[0132] 各サンプルを超音波破砕した（Power Level 7、 15秒、 3回）。一回ごとに氷水中に 3 0秒つけて冷却した。次に 500 μ Lの 2 X GST Buffer / Z (2% TritonX- 100、 720 mM N aCl、 1 x PBS (-)、 ΙΟ ^ Μ ZnCl、 10 mM j8 - Mercaptoethaol、 2 mM PMSFゝ 0.1% aprot
2
inin)を加え混合後、さらに超音波破砕した（Power Level 7、 15秒、 1回）。破砕した液 を 14000 rpm 30min 4°Cで遠心した。この間に 1 mLの 1 x PBS (-)で 200 μ Lの 80%- slur ry Glutathione Sepharoseビーズを 3回洗い、 160 μ Lの 1 x PBS (-)を加え、 50%- slurry に調整した。遠心後の上清 1 mLに 80 μ Lの 50%- slurry Glutathione Sepharoseビーズ を加え、 4°Cで 2hr Rotationして GSTタンパク質をビーズに結合させた。 1 mLの 1 x GS T— Buffer I Z (1% TritonX— 100、 360 mM NaCl、 0.5 x PBS (-)ゝ 5 ^ M ZnCl、 5 mM j8
2
-mercaptoethanoU 1 mM PMSF, 0.05% aprotinin)で 4回ビーズを洗った。遠心は 2000 rpm、 lmin、 4°Cで行った。残った上清を全てきれいに吸いとつた後、 Lの 1 x GS T— Buffer I Zをカロえ、合計 100 μ Lにした。このうち 10 μ Lを等量の 2 x SDS Sample Buf ferと混ぜ、 100°C、 5min、ヒートブロックで熱し、 10 Lずつ 10%ゲルに Applyした。同時 に 0.25〜4 μ gの BSAも Applyした。泳動（150 V 50min)、 CBB染色（未使用のもので 30 min)、脱色（lhrを 2回）、グリセロール水（30〜60min)、（ゲル乾（80°C、 lhr)して、 GST タンパク質の発現、回収効率をチェックした。翌日、 35S-p53の In vitro Translationを 行った。まず、以下の試薬を混合した。
TNT Reticulocyte Lysate 25 μ L
TNT Reticulocyte Buffer 2 μ L
Amino Acids Mixture (-Met) 1 μ L
DEPC— treated Water 15 ^ L
RNase Inhioitor 1 μ L
TNT polymerase 1 μ L
35S— Met 4 μ L
Plasmid (ρ53 · ΗΑ) l i L
Total 50 ^ L
30°C恒温槽で 1.5〜2.5hr保温し、 In vitro Translationした。この間に G- 25カラムの ふたを緩めて軽く遠心（2500 rpm、 lmin、 4°C)し、 100 μ Lの PuU-down Buffer V (20 m M HEPES pH 7.9、 150 mM NaCl、 0.2% Triton X- 100)を乗せてさらに遠心し、カラム を洗った。このカラムに In vitro Translation溶液を 50 μ L全量乗せて遠心した（2500 r pm、 lmin、 4°C) 0さらに 200 μ Lの PuU- down Buffer Vを乗せて、再度遠心した（2500 r pm、 lmin、 4°C) 0これを In vitro Translation Product (IvTL)として用いた。そのうち 4 μ Lを、 16 μ Lの Milli— Q、 20 μ Lの 2 x SDS Bufferと混ぜ、 On put 10%とした。 30 μ gの GSTタンパクが結合したビーズを含んだ lmLの PuU-down Buffer Vに 120 μ Lの IvTLを 加え、 4°Cで lhr Rotationした。遠心（10000 rpm、 lmin、 4°C)した後、上清を 370 L ずつ GST、各 GST- Synoviolinビーズを含んだ 1 mLの PuU- down Buffer Vにカロえ、 4°C で lhr Rotationした。このビーズを 1 mLの PuU-down Buffer Vで 4回洗った。この時上 清は必ず 100 Lぐらい残し、ビーズを吸い取らないようにした。遠心は 2500 rpm、 lmi n、 4°Cで行った。上清を吸いとつた後、 40 μ Lの 1 x SDS Sample Bufferをカ卩えて、 Pull -downサンプルとした。 On put 10%と PuU-downサンプルを 100°Cで 5min、熱し、 - 20°C で保存した。翌日サンプルを 37°Cの恒温槽で lOmin温め、 10 /z Lずつ 10%ゲルに Appl yした。泳動（150 V 50min)、 CBB染色（30min)、脱色（lhr x 2)、グリセロール水（30 〜60min)、ゲル乾（80°C、 lhr)した後、 IP Plateに露光させた。 14時間後、露光した IP Plateを BASで読み取り、 ImageGaugeで定量した。また C.B.B.染色したゲルはフィルム スキャナーで読み取った。
その結果、 Pro-F領域のみ 20.8%の結合効率を示した（図 15)。
さらに Pro-F領域をサブクローユングしたものと in vitro translationした全長 p53を用 いて、プルダウンアツセィを行ったところ、 C末を削ったものは 236-270アミノ酸からな る 35アミノ酸が 66.2%の高い結合効率を示した力 N末を削ったものはどれも結合しな 力つた（図 16)。さらに、 p53結合ドメインが 35アミノ酸以下になる力検討するため 236- 270アミノ酸を N末、または C末から削っていき、 in vitro translationした全長 p53とのプ ルダウンアツセィを行った。その結果、 p53結合ドメインの deletion seriesはどれも結合 活性を著しく失っており、 35アミノ酸は結合最小領域であることが明らかとなった（図 1 7)。また、 p53結合ドメイン力 236-270アミノ酸以外にもあるか検討するため、 236-27 0アミノ酸のみを欠失した GST- synoviolin A TMを構築し、 in vitro translationした全長 p53とのプルダウンアツセィを行ったところ、 p53結合ドメインの欠失体は結合活性をほ ぼ完全に失っていた（図 18)。シノビォリンの p53結合ドメインは 236-270の一ヶ所であ ると考えられた。
[0136] 〔実施例 13〕 シノビオリン 53BD欠失体と p53の細胞内での結合の検証
発現プラスミドを以下の組み合わせで HEK293細胞にトランスフエクシヨンし、 48時間 後に全細胞抽出液を調製した。抗 FLAG抗体または抗 HA抗体を加えて免疫沈降を 行い、抗 FLAG抗体および抗 HA抗体を用いてウェスタンブロッテイングを行い、両者 の結合を検出した。
[0137] <組み合わせ >
pcDNA3 / pcDNA3
bynoviolin-FLAG Z HA-poj
SynoviolinC307S- FLAG / HA- p53
Synoviolin Δ 53BD- FLAG / HA- p53
Synoviolin- HA Z FLAG- p53
SynoviolinC307S-HA / FLAG- p53
Synoviolin Δ 53BD-HA / FLAG- p53
[0138] その結果、シノビォリンの免疫沈降による p53の共沈は野生型シノビオリン及び C30 7S変異体で検出できたが、 53BD欠損シノビオリンでは検出されな力つた（図 20A,B) 。この結果は FLAGタグ及び HAタグ両者で認められたため、 53BDを欠損しているシノ ピオリンは p53に対する結合能をほとんど有しないことが示された。また、野生型と C30 7S変異体を比較すると C307S変異体の p53への結合が若干強い傾向があり、 p53との 結合にシノビォリンのュビキチンィ匕活性の関与が示唆された。
[0139] 〔実施例 14〕 シノビォリンと p53の細胞質滞留との関連
HA-p53を Synoviolin- FLAGまたは Synoviolin Δ 53BDとともに Saos- 2細胞（p53遺伝 子欠損ヒト骨肉種由来細胞）に一過性発現させ、蛍光顕微鏡で観察した。 Synoviolin - FLAGと HA-p53の共発現では、 p53は既報告の通り細胞質内、核内両方に局在し（ 図 21f)、シノビオリンは主として細胞質に局在していた（図 21g)。一方、 Synoviolin A 53BDと HA-p53の共発現では、 Synoviolin Δ 53BDは細胞質に局在していたが（図 21j )、 HA-p53は核内のみに局在していた（図 21i,k)。これらの結果から、小胞体膜上で p53はシノビォリンと密接な関係をもつことが明ら力となり、シノビオリンカ ¾53の細胞質 滞留に必須であることが示された。
[0140] 〔実施例 15〕 53BDペプチドによるシノビオリン— p53結合の競合阻害
シノビォリンの 236-270の 35アミノ酸に相当するペプチド（53BDペプチド）を合成し、 シノビォリンと p53の結合への影響を調べた。 In vitro Translationした35 S-Met p53HA を 0、 10、 50、 100 /z Mの 53BDペプチド溶液中でインキュベーションした後、 GSTなら びに GST-Synoviolin Δ ΤΜと結合させた。結合した35 S-Met p53HAを BASで検出した 。その結果、 50 \1以上の5380ぺプチドにょり、競合阻害が観察された（図 22)。
[0141] 〔実施例 16〕 53BDペプチドによるシノビオリンの p53ュビキチンィ匕活性の阻害
53BDペプチドによるシノビオリンの p53ュビキチンィ匕活性の阻害効果を検討した。 E 1、 E2、 MBP-Synoviolin Δ TM-6xHis, GST— p53、 ATPを含む反応系に 0、 10、 25、 50 Μの 53BDペプチドをカ卩ぇ（図 23レーン 1-4)、 37°Cで 1時間反応させた。ネガティブ コントロール（陰性対照）として同反応系から Synoviolin (図 23レーン 5)、または ATP( 図 23レーン 6)を除いたものを用意した。 53BDペプチドの添カ卩により、ポリュビキチン 化された p53の減少が観察された。またこの反応系での IC50は 40.2 μ Μであった。 配列表フリーテキスト
[0142] 配列番号： 6：合成オリゴヌクレオチド (DNA/RNA混合物）
配列番号： 7：合成オリゴヌクレオチド (DNA/RNA混合物）
産業上の利用可能性
[0143] 本発明により、シノビオリンタンパク質の機能を阻害する活性を有するポリペプチド（ 例えば、 ρ53との結合領域を有するシノビオリンの部分断片ペプチド; 53BD)、および 該ポリペプチドを有効成分として含有する ρ53タンパク質活性化剤が提供された。本 発明の薬剤は癌治療剤として有用である。
[0144] 癌抑制遺伝子 ρ53は癌細胞の発生や増殖においてきわめて重要な遺伝子であり、 事実約 50%の癌にぉ 、てこの遺伝子の変異が見つかって!/、る。また残りの癌にお!ヽ ても ρ53の制御機構に何らかの変異が生じ、その癌抑制能を失って 、ることが知られ ている。このため癌治療の有効な方法の一つとして、 ρ53の遺伝子導入による癌治療 が現在臨床試験で行われて！/ヽる。
[0145] 即ち本発明のポリペプチドを細胞内へ導入し、シノビォリンの機能を抑制することに より p53を活性化させて、癌を抑制させることが可能である。 p53の安定化、核内への 集中的な局在を引き起こすことにより、放射線への感受性を高め治療効率を上げ、 集学的治療の一環としての臨床応用も期待される。
さらに、本発明者らによって見出された種々の知見は、 p53の癌抑制作用のメカ- ズムを解明するための学術的研究に対しても大いに貢献するものと期待される。また 、本発明の p53タンパク質活性化剤は、 p53に関連する癌抑制作用の解明のための 研究用試薬としても有用である。

Claims

請求の範囲
[1] 以下の（a)〜（d)の 、ずれかに記載のポリペプチドであって、 p53タンパク質と実質 的に結合する機能を有するポリペプチドを有効成分として含有する、 P53タンパク質 活性化剤。
(a)配列番号： 4に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド
(b)配列番号: 4に記載のアミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠 失、挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなるポリペプチド
(c)配列番号： 3に記載の塩基配列力 なるポリペプチドにストリンジェントな条件下で ハイブリダィズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
(d)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列力 なるシノビオリンタンパク質の部分断片ポリ ペプチドであって、該シノビオリンタンパク質の 236位〜 270位のアミノ酸領域を含む ポリペプチド
[2] 請求項 1の（a)〜（d)のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド を含むベクターを有効成分として含有する P53タンパク質活性化剤。
[3] 請求項 1または 2に記載の p53タンパク質活性化剤を有効成分とする、癌治療剤。
[4] 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列力 なるポリペプチド。
[5] 請求項 1の（a)〜（d)のいずれかに記載のポリペプチドを細胞内へ導入することを 特徴とする、 P53タンパク質の細胞質滞留を阻害する方法。
[6] 請求項 1の（a)〜（d)のいずれかに記載のポリペプチドを細胞内へ導入することを 特徴とする、 p53タンパク質を核に局在化させる方法。
[7] 請求項 1の（a)〜（d)のいずれかに記載のポリペプチドを細胞内へ導入することを 特徴とする、シノビオリンタンパク質と P53タンパク質の結合を阻害する方法。
[8] 請求項 1の（a)〜（d)のいずれかに記載のポリペプチドを細胞内へ導入することを 特徴とする、 p53タンパク質のリン酸化を亢進する方法。
[9] 請求項 1の（a)〜（d)のいずれかに記載のポリペプチドを細胞内へ導入することを 特徴とする、 P53タンパク質のュビキチンィ匕を阻害する方法。
[10] 請求項 5〜9の 、ずれかに記載の方法によって p53タンパク質を活性ィ匕させることを 特徴とする、癌の抑制方法。
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