KR20180023870A - Arl6ip1의 유전성 강직성 하반신마비의 치료 용도 - Google Patents

Arl6ip1의 유전성 강직성 하반신마비의 치료 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 ARL6IP1(ADP ribosylation factor like GTPase 6 interacting protein 1)의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 유전성 강직성 하반신마비(Hereditary Spastic Paraplegia, HSP)의 치료용 약학적 조성물 및 상기 유전자의 발현수준 측정을 통한 유전성 강직성 하반신마비의 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

Description

ARL6IP1의 유전성 강직성 하반신마비의 치료 용도 {Use of ARL6IP1 for treatment of Hereditary Spastic Paraplegia}
본 발명은 ARL6IP1(ADP ribosylation factor like GTPase 6 interacting protein 1)의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 유전성 강직성 하반신마비(Hereditary Spastic Paraplegia, HSP)의 치료용 약학적 조성물 및 상기 유전자의 발현수준 측정을 통한 유전성 강직성 하반신마비의 치료제 스크리닝 방법에 대한 것이다.
유전성 강직성 하반신마비(Hereditary spastic paraplegia, HSP)는 다리의 근육이 점차적으로 약해져 마비되고, 근육의 긴장성이 증가하며, 뻣뻣해지는 증상이 나타나는 유전성 신경계 질환이다. 유전성 강직성 하반신마비와 관련성이 있는 유전자 (Spastic paraplegia loci, SPG)는 70종 이상 알려져 있으며, 관련 돌연변이체도 수십종이 보고 되어 있으나, 발병기전은 아직 명확하지 않다 (Lo Giudice et al, Experimental neurology 261:518~539). 유전성 강직성 하반신마비의 증상은 SPG 유전자들의 돌연변이에 의한 기능상실이 척수의 피질 척수로의 점진적인 퇴행성 변화를 유도하기 때문에 나타나는 것으로 추정하고 있다. 유전성 강직성 하반신마비의 유전양상에 따라 염색체 우성질환 (autosomal dominant, AD type), 염색체 열성질환 (autosomal recessive, AR type) 혹은 X 염색체 링크 (X-chromosome liked type)으로 구분된다.
최근에 AR type (열성)의 유전성 강직성 하반신마비 환자 가계에서 다양한 유전자 돌연변이가 발견되어 유전성 강직성 하반신마비와 관련성이 보고되었다 (Novarino G et al, Science 343: 506~511, 2014). 그러나 이와 같이 다양한 유전자들이 유전성 강직성 하반신마비 환자에서 그 발현 수준 및/또는 돌연변이가 발생되는 것이 알려져 있으나, 이와 같은 유전자가 유전성 강직성 하반신마비의 질환 치료소재로 연구된 바 없다.
유전성 강직성 하반신마비의 근본적인 치료방법은 없으며, 환자의 근육 강직을 도와주는 대증적인 치료가 대안이 되고 있다. 유전자를 활용하는 치료 방법에는 AD type의 경우는 돌연변이의 형질이 우성이므로, 야생형 유전자로써 대체한다고 하여도 치료효과를 기대하기 어려우나, AR type의 경우는 야생형 유전자를 체내로 전달하여 치료효과를 기대할 수 있다. 이에, 유전성 강직성 하반신마비를 치료할 수 있는 새로운 기작 또는 근본적인 치료제 연구의 필요성이 대두되고 있다.
이러한 배경 하에 본 발명자들은 유전성 강직성 하반신마비의 유전자 치료제를 개발하고자 예의 노력한 결과, 신경세포에서의 ARL6IP1의 기능연구를 통해 ARL6IP1의 과발현에 따른 신경세포의 생존과 사멸이 조절되는 새로운 기전을 확인하고, 이를 표적으로 하는 물질의 경우, 유전성 강직성 하반신마비에 대한 치료적 효과를 가지고 올 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 ARL6IP1(ADP ribosylation factor like GTPase 6 interacting protein 1)의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 유전성 강직성 하반신마비(Hereditary Spastic Paraplegia, HSP)의 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 약학적 조성물을 유전성 강직성 하반신마비(Hereditary Spastic Paraplegia, HSP) 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 유전성 강직성 하반신마비의 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 (a) 유전성 강직성 하반신마비(Hereditary Spastic Paraplegia, HSP)가 유발된 신경세포에 유전성 강직성 하반신마비 치료 후보 물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 후보 물질이 처리된 신경세포에서 ARL6IP1(ADP ribosylation factor like GTPase 6 interacting protein 1)의 단백질 수준 또는 이의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 유전성 강직성 하반신마비 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한, 본 발명의 하나의 양태는 ARL6IP1(ADP ribosylation factor like GTPase 6 interacting protein 1)의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 유전성 강직성 하반신마비(Hereditary Spastic Paraplegia, HSP)의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
구체적으로, 본 발명에서 상기 치료는 ARL6IP1의 기능 이상이 발생한 신경세포에서 ARL6IP1의 기능을 회복시켜 (1) p53의 단백질 발현의 감소, (2) MDM2의 단백질 발현의 증가, (3) LC3B-Ⅱ의 단백질 발현의 증가 및 (4) ATG5―ATG12 결합체의 형성 증가 중 어느 하나에 의해 수행되는 것인, 약학적 조성물 일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서의 "ARL6IP1(ADP ribosylation factor like GTPase 6 interacting protein 1)"은 이 유전자는 ARL6IP 패밀리에 속하며 주로 세포질 내 막에서 막 횡단 단백질을 암호화한다. 본 발명의 목적상 신경세포에서 ARL6IP1의 발현에 따른 신경세포의 생존과 사멸이 조절되는 새로운 기전을 확인하였다.
ARL6IP1는 다른 이름으로 AIP1, ARMER(Apoptotic Regulator in the Membrane of the Endoplasmic Reticulum), SPG61 등으로 불리워지고 있다. 또한, 본 발명에서 상기 ARL6IP1은 ARMER와 동일한 의미로 사용될 수 있으며, 이들은 서로 혼용될 수 있다. 이의 유전적 정보는 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
ARL6IP1 단백질은 약 23.2kDa이며 ARL6IP1의 유전자에 의해 암호화된다. 본 발명의 ARL6IP1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자는 p53의 억제 활성, MDM2의 활성 촉진, 결합에 의한 LC3B-Ⅱ의 활성 촉진 및 ATG5-ATG12 결합체 형성 기능을 갖고 있는 한 인간을 포함한 다양한 포유류 유래의 ARL6IP1 단백질, 이를 코딩하는 유전자 또는 이와 기능적으로 동등한 상동 단백질을 포함하는 개념이다.
본 발명의 ARL6IP1 단백질은 이의 야생형 아미노산 서열을 갖는 단백질 뿐만아니라 이의 상동단백질 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 ARL6IP1 단백질 또는 이의 상동단백질은 천연에서 추출하거나 합성 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, 본 발명에서 ARL6IP1 단백질을 코딩하는 유전자는 ARL6IP1 단백질을 코딩하는 핵산분자를 의미하며, 이들은 자연에서 분리되거나 인위적으로 합성 변형된 것일 수 있다.
한편, 본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 단백질을 유효성분으로 사용할 경우, 상기 약학 조성물에 단백질 자체를 유효성분으로 포함할 수도 있고, 개체의 체내에서 ARL6IP1 또는 그의 상동단백질을 보다 용이하게 발현시킬 수 있도록, 상기 단백질을 코딩하는 핵산이 유전자 치료용 발현벡터에 포함된 형태로 상기 약학 조성물에 포함할 수도 있다. 이때, 상기 발현벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 포유류 세포(예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 마우스 세포 등)에서 상기 단백질을 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 구체적으로는 숙주세포에서 상기 단백질이 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동 가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별 마커를 포함하는 벡터가 될 수 있으며, 보다 구체적으로는 파아지, 플라스미드, 코스미드, 미니-염색체, 아데노바이러스 벡터, 아데노부속바이러스 벡터, 배큘로 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등에 상기 단백질을 코딩하는 핵산이 도입된 형태가 될 수 있다.
본 발명의 용어 "유전자 치료(gene therapy)"란, 유전자 이상에 의하여 유발되는 각종 유전병 등을 치료하기 위하여, 질병과 관련이 있는 유전자를 환자의 체내에 직접적으로 주입하고 상기 유전자를 세포 내에서 발현시켜 그의 기능을 정상화시키는 방법을 일컫는다.
본 발명에 따른 상기 발현벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세포에 도입할 수 있다. 예를 들어, 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electroporation), 유전자총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 세포내로 도입할 수 있다.
본 발명에서는 신경세포에서 ARL6IP1의 발현을 증가시키는 경우 세포의 사멸을 억제할 수 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 ARL6IP1을 과발현시키는 물질은 유전성 강직성 하반신마비 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, ARL6IP1 과발현에 의해 신경세포에서 p53의 발현 억제를 통해 세포사멸이 감소하고 (도 4c 및 4d), 신경세포의 자식작용 신호(autophagy signal)를 조절하는 ATG5―ATG12 결합체와 LC3B-II의 증가가 확인되었다 (도 6). 이에 본 발명자들은 ARL6IP1을 과발현시켜 유전성 강직성 하반신마비를 치료할 수 있을 것으로 판단하여 본 발명을 개발하게 되었다. 이는 종래 유전성 강직성 하반신마비 관련 분야에서 알려진 바 없는 내용에 해당한다.
본 발명의 용어 "p53"이란 세포사멸(apoptosis)과 관련된 단백질로서 TP53 유전자에 의해 암호화된다. 보다 구체적으로는 G1기가 끝날 무렵, p53유전자에 의해 생성된 단백질은 세포의 DNA가 손상을 입었는지 점검한다. DNA가 건강하다면 p53은 세포분열을 진행시키고, 손상된 DNA를 발견할 경우에는 DNA를 활성화시켜 수선하기 위한 다른 단백질을 유도한다. DNA 손상이 수선하기에 너무 치명적이면 p53단백질은 세포가 스스로 파괴되도록 유도한다. 이를 세포사멸(apoptosis)라고 부른다. 세포사멸은 변이된 세포가 계속 성장하지 못하도록 한다. 다른 건강한 세포는 손상된 세포를 대체하기 위해 세포분열을 촉진한다.
본 발명의 신경세포에서 ARL6IP1이 과발현되는 경우, p53의 발현이 감소된다. 따라서, 본 발명의 ARL6IP1의 단백질 발현 수준을 증가시키는 물질은 유전성 강직성 하반신마비의 치료용 제제로서 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, ARL6IP1의 과발현시 세포사멸이 억제되는 이유를 확인하기 위해 세포사멸을 조절하는 p53 단백질 발현량을 확인하였을 때 ARL6IP1의 과발현에 따라 p53 단백질이 감소되는 것을 확인하였다(도 4d). 이를 통해, ARL6IP1의 과발현이 유전성 강직성 하반신마비의 치료 및 새로운 치료제 개발을 위한 타겟이 될 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명에서 사용되는 용어 "MDM2"는 mdm2 유전자의 발현 결과로 수득되는 단백질을 의미한다. 이 용어의 의미 내에서, MDM2는 mdm2, 그의 변종, 그의 택일적인 절편 단백질, 및 그의 인산화 단백질에 의해 코딩되는 모든 단백질을 포함한다. 부가적으로, "MDM2"는 MDM2 유사체, 예를 들어, 또한 MDM4로도 알려진 MDMX, 및 MDM2 동종 및 다른 동물의 유사체, 예를 들어, 인간 동종 HDM2 또는 인간 유사체 HDMX를 포함한다.
MDM2는 p53 기능의 핵심 음조절인자(negative regulator)이다. 이는 p53의 아미노 종단 전사활성 영역에 결합하여 음자동조절 루프(negative autoregulatory loop)를 형성하고, 따라서 MDM2는 전사를 활성화하는 p53의 능력을 저해하며, p53을 단백질 분해 목적으로 한다.
본 발명에서 MDM2 단백질은 E3 유비퀴틴 리가아제로서 기질단백질인 p53에 다량체 유비퀴틴을 접합시켜 프로테아좀 의존적 분해가 유도되어 p53 단백질을 감소시키는데 이용되고 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, ARL6IP1의 과발현시 세포내에서 ARL6IP1의 발현증가에 따른 MDM2의 효소활성의 증가 여부를 in vivo MDM2 유비퀴틴화 분석(ubiquitination assay)을 이용하여 확인하였다 (도 5d). 신경세포에서 ARL6IP1이 과발현되는 경우, MDM2의 효소활성이 증가되어 p53의 발현이 감소됨을 확인하였다. 이를 통해, ARL6IP1의 과발현이 유전성 강직성 하반신마비의 치료제 개발을 위한 타겟이 될 수 있음을 시사한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "LC3B-Ⅱ"는 자식작용(autophagy)에 관련된 단백질로서 LC3B(light chain 3β)의 활성형이다. LC3B 단백질은 LC3B 유전자에 의해 코딩되는 단백질이다. LC3는 자식작용 경로에서 중요한 단백질이며 자가포식소체의 마커로 널리 사용된다. 신경세포에서 자식작용은 세포내 소기관의 순환 (turn-over)에 중요하고 생존에 중요한 부분을 담당하고 있다.
LC3-II는 LC3의 지질 변형 형태로서, 자가포식소체 막의 팽창과 융합에 관여한다. 본 발명의 목적상, ARL6IP1의 과발현에 따라 자식작용이 활성화되어 LC3B-II가 증가된다. 이는 세포내의 자식작용이 활성화되었음을 의미한다. 따라서, 본 발명의 ARL6IP1의 mRNA 또는 이의 단백질 활성을 증가시키는 물질은 유전성 강직성 하반신마비의 치료용 제제로 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "ATG5"는 자식작용 단백질로서 인간의 ATG5 유전자에 의해 코딩되는 단백질이다. 또한, 자가포식소체 (autophagosome) 연장 역할을 하는 자식작용에 필요한 E3 유비퀴틴 리가아제이다. 그것은 ATG7에 의해 활성화 및 ATG12와 결합체를 형성한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "ATG12"는 자식작용 관련 단백질로서 인간의 ATG12 유전자에 의해 코딩되는 단백질이다. 자식작용은 세포 기관을 포함하여 세포질 구성 요소, 자가포식소체라고 불리워지는 이중 막 구조 등의 대량 단백질 분해의 과정이다. 자식작용은 유비퀴틴 같은 활용 시스템을 통해 ATG5에 단백질 ATG12의 공유 결합을 필요로 한다. ATG5-ATG12 결합체는 지질 포스파티딜에 ATG8의 결합을 촉진한다. 세포의 자식작용은 ATG 단백질들의 순차적인 상호활성화에 의하여 진행되고, 마지막으로 LC3-II에 의한 자식소포체의 형성에 의하여 자식작용이 완성된다.
본 발명의 목적상, ARL6IP1의 과발현에 따라 자식작용이 활성화되어 ATG5-ATG12 결합체가 증가된다. 이것은 따라서, 본 발명의 ARL6IP1의 mRNA 또는 이의 단백질 활성을 증가시키는 물질은 유전성 강직성 하반신마비의 치료용 제제로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, ARL6IP1의 과발현시 세포사멸이 억제되는 이유를 확인하기 위해 세포사멸을 조절하는 p53 단백질 발현량을 확인하였을 때 ARL6IP1의 과발현에 따라 p53 단백질이 감소되는 것을 확인하였다(도 4d).
이를 통해, ARL6IP1의 과발현이 p53 단백질의 감소 또는 Mdm2 활성이 증가되는 것을 측정하여 치료용 제제를 스크리닝 할 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, ARL6IP1이 신경세포의 자식작용 신호(autophagy signal)를 조절할 수 있는지를 확인하였다. 그 결과 ARL6IP1의 과발현에 따라 ATG5―ATG12 결합체가 증가하고, LC3B-II의 발현이 증가됨을 확인하였다(도 6).
이를 통해, 본 발명의 ARL6IP1의 과발현시, LC3B-Ⅱ의 단백질 발현의 증가나 ATG5―ATG12 결합체의 형성이 증가됨을 측정하여 유전성 강직성 하반신마비의 치료용 제제를 스크리닝 할 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명에서의 "유전성 강직성 하반신마비(Hereditary Spastic Paraplegia, HSP)"는 다리의 근육이 점차적으로 약해져 마비되고, 근육의 긴장성이 증가하며, 뻣뻣해지는 증상이 나타나는 유전성 신경계 질환이다. 유전성 강직성 하반신마비는 단순형 유전성 강직성 하반신마비(Uncomplicated HSP)와 복합형 유전성 강직성 하반신마비(Complicated HSP)로 나누어진다. 단순형 유전성 강직성 하반신마비는 진행성의 강직성 하반신 마비가 초기 소견으로 발생되고 근육 강직이 발달될 수 있고, 방광 조절에 어려움을 느낄 수 있으나, 복합형 유전성 강직성 하반신마비는 단순형에서 추가적으로 신경학적 이상이 보이는데 시각, 청각장애, 정신 지연, 수의적인 운동 조절의 부전(운동실조) 등의 이상이 나타날 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서의 용어, "치료"란 상기 약학 조성물의 투여에 유전성 강직성 하반신마비의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은, 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 상기와 같은 담체, 부형제 또는 희석제는 비자연적으로 발생된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 액제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(트윈) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함된 상기 ARL6IP1의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 함량은 약학 조성물이 유전성 강직성 하반신마비에 대한 치료 효과를 가지는 한 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9 중량%, 보다 구체적으로는 0.01 내지 80 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 다른 하나의 양태는, 상기 약학적 조성물을 유전성 강직성 하반신마비(Hereditary Spastic Paraplegia, HSP) 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 유전성 강직성 하반신마비의 치료 방법을 제공한다.
상기 "약학적 조성물" "유전성 강직성 하반신마비" 및 "치료"는 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어 "개체"란, 상기 질환이 발명하였거나 발병할 수 있는 인간과, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 질환을 효과적으로 치료할 수 있다면 개체의 종류는 제한없이 포함된다.
본 발명의 용어 "투여"란, 임의의 적절한 방법으로 대상체에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 도 있다. 구체적인 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피 내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다.
또한, 본 발명에 따른 화합물의 인체에 대한 투여용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질병 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70kg인 성인환자를 기준으로 할 때 일반적으로 1일 0.01mg 내지 5000mg이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 하나의 양태는, (a) 유전성 강직성 하반신마비(Hereditary Spastic Paraplegia, HSP)가 유발된 신경세포에 유전성 강직성 하반신마비 치료 후보 물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 후보 물질이 처리된 신경세포에서 ARL6IP1(ADP ribosylation factor like GTPase 6 interacting protein 1)의 단백질 수준 또는 이의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 유전성 강직성 하반신마비 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 ARL6IP1의 단백질 수준; 또는 이의 활성이 후보 물질이 처리되지 않은 신경세포에 비해 증가하면 유전성 강직성 하반신마비 치료제로 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 (b) 단계는 (1) p53의 단백질 발현, (2) LC3B-Ⅱ의 단백질 발현 및 (3) ATG5―ATG12 결합체의 형성 중 어느 하나를 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 (b) 단계에서 측정된 후보 물질이 처리되지 않은 ARL6IP1의 단백질 활성이 증가될 때, (1) p53의 단백질 발현의 감소, (2) LC3B-Ⅱ의 단백질 발현의 증가 및 (3) ATG5―ATG12 결합체의 형성 증가 중 어느 하나에 해당되면, 유전성 강직성 하반신마비 치료제로 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 "ARL6IP1", "p53", "LC3B-Ⅱ", "ATG5―ATG12" 및 "유전성 강직성 하반신마비"은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 사용된 용어 "후보 물질(test agent)"은 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예를 들어, 이들로 한정되지는 않으나, 단백질, 폴리펩티드, 소 유기분자(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다. 또한, 천연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "ARL6IP1의 발현 수준"이란 ARL6IP1 mRNA의 발현 수준 또는 ARL6IP1 단백질의 발현 수준을 모두 포함하는 개념이며, 본 발명에서 "ARL6IP1의 발현 수준 측정"은 상기 ARL6IP1 단백질의 발현 수준 측정을 통해 수행될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 ARL6IP1 발현 정도를 확인하기 위해, ReNcell 신경세포주에서 분화과정동안 ARL6IP1 발현이 증가함을 확인하였고(도 8 b), ARL6IP1 발현이 증가함에 따라 세포사멸이 감소하는 것을 확인하였다(도 4c).
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 유전성 강직성 하지마비의 AR type인 ARL6IP1의 녹-다운 조건에서 유도된 세포 사멸 및 신경분화의 저해가 ARL6IP1의 과발현이 유도되었을 때 신경세포의 사멸이 억제되며 신경분화가 유도됨을 확인하였다 (도 9, 10).
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 ARL6IP1 유전자를 녹다운 시킨 마우스에서 하지 강직성마비가 나타나는 것을 확인하였다 (도 11).
이를 통해, 본 발명의 ARL6IP1의 과발현을 이용하여 세포사멸을 억제하는 제제 또는 유전성 강직성 하반신마비 질환의 유전자 치료소재로서 해당 유전자가 타겟으로의 가능성이 있음을 알 수 있었다.
본 발명에 사용된 용어 "단백질 발현 수준 측정"이란 유전성 강직성 하반신마비 질환의 콜라겐 축적에 영향을 미치는 ARL6IP1의 발현 정도를 확인하는 과정으로 단백질의 양을 측정한다. 구체적으로 ARL6IP1 유전자로부터 발현되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 항체는 다클론 항체, 단일클론 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 상기 항체의 단편들도 본 발명의 항체에 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체 및 인간 항체 등도 포함하며, 신규한 항체 외에 이미 당해 기술분야에서 공지된 항체들도 포함될 수 있다. 상기 항체는 ARL6IP1 유전자로부터 발현되는 단백질을 특이적으로 인식하는 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 가지는 완전한 형태 뿐만아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체의 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F (ab'), F (ab')2 및 Fv 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 목적상, 상기 단백질 발현 수준 측정으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDI-TOF(Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LCMS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따르면, ARL6IP1(ADP ribosylation factor like GTPase 6 interacting protein 1)의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 유전성 강직성 하반신마비(Hereditary Spastic Paraplegia, HSP)의 치료용 약학적 조성물로서 사용할 수 있으며, 또한 상기 ARL6IP1의 활성을 측정함으로써 유전성 강직성 하반신마비 치료제의 스크리닝에 사용이 가능하다.
도 1a는 AR type의 ARL6IP1 돌연변이 플라스미드를 제작하여 염기서열을 확인한 결과이다.
도 1b는 HEK293 세포주를 사용하여 도 1a에서 제작된 ARL6IP1의 돌연변이 플라스미드(HSP-MT)와 야생형 (wild type, WT)간의 mRNA의 발현정도를 RT-PCR로 확인한 것이다.
도 1c는 도 1b의 조건에서 단백질 발현여부를 웨스턴 블랏으로 확인한 것이다.
도 2a는 ReNcell 신경세포주에서 아데노바이러스를 사용하여 ARL6IP1 유전자의 녹-다운 후 신경분화 조건인 레티노산 (retinoic acid, RA)을 처리 하여 3일 후 현미경을 통해 세포 표현형을 관찰한 결과이다.
도 2b는 도 2a의 조건에서 신경세포 분화조건인 레티노산 처리 후 각각의 시점에 ARL6IP1과 신경분화 마커인 MAP2의 단백질 발현정도를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 2c는 도 2a의 조건에서 신경분화 조건인 레티노산 처리 3일 후에 세포를 수거하여 세포사멸 마커인 아넥신 V로 염색 후 유세포 분석기를 이용하여 사멸 세포의 분포를 확인 한 결과이다.
도 3a는 U2OS 세포주에 ARL6IP1와 ER 막 표지자인 칼넥신 (calnexin)을 이용하여 형광 염색을 한 결과이다..
도 3b는 ReNcell 신경세포주에 아데노바이러스 벡터를 이용하여 ARL6IP1의 과발현을 유도한 후 2.5~25% 아이오딕사놀 농도 구배 조건에서 ARL6IP1이 발현되는 세포내 소기관 위치를 나타내는 결과이다.
도 4a는 ARL6IP1의 과발현과 ER 스트레스 유도자인 튜니카마이신 (tunicamycin, TM)처리 여부에 따른 ER 스트레스 마커의 단백질 발현정도를 웨스턴 블랏으로 확인한 것이다.
도 4b는 ARL6IP1의 과발현과 ER 스트레스 유도자인 탭시가긴 (thapsigargin, TG)처리 여부에 따른 ER 스트레스 마커 이자 전사조절인자인 ATF4의 타겟 유전자의 mRNA 발현 정도를 RT-PCR로 확인한 것이다.
도 4c는 ARL6IP1의 과발현과 TG 처리 여부에 따른 세포사멸을 조사하기 위해 신경세포에 ARL6IP1 과발현 후 ER 스트레스 유도인자를 처리하고 세포사멸 표지자인 아넥신 V로 염색한 후 사멸 정도를 유세포 분석기를 사용하여 확인한 것이다.
도 4d는 ARL6IP1의 발현량에 따라 세포사멸 경로인 p53과 카스파제 활성이 억제되는 것을 웨스턴 블랏으로 확인한 것이다.
도 5a는 ARL6IP1의 발현량에 따른 p53의 mRNA 발현정도를 RT-PCR로 확인한 것이다.
도 5b는 ARL6IP1의 발현량에 따른 p53 단백질 조절 경로를 확인하기 위해 프로테아좀 저해제인 MG132 처리 후 웨스턴 블랏으로 확인한 것이다.
도 5c는 ARL6IP1에 의한 p53의 단백질 조절 경로가 p53의 E3 유비퀴틴 리가아제인 MDM2의 효소활성에 의한 것인지를 확인하기 위해 in vitro MDM2-유비퀴틴화 분석 후 웨스턴 블랏으로 확인한 것이다.
도 5d는 ARL6IP1 발현 여부에 따라 세포내에서의 MDM2 효소활성 변화를 확인하기 위해 HEK293 세포주에서 in vivo MDM2-유비퀴틴화 분석을 수행 후 웨스턴 블랏으로 확인한 것이다.
도 6a는 신경세포의 수명을 조절하는 중요한 신호중의 하나인 자식작용(autophagy) 조절에 ARL6IP1의 과발현이 미치는 영향을 웨스턴 블랏으로 확인한 것이다.
도 6b는 자가포식소체(autophagosome)를 형성하는 LC3B와 ARL6IP1과의 단백질 결합여부를 웨스턴 블랏으로 확인한 것이다.
도 6 c는 LC3B와 유사한 기능을 하는 LC3 family와 ARL6IP1의 단백질 결합여부를 pull-down 어세이 후 웨스턴 블랏으로 확인한 것이다.
도 6d는 GFP-LC3B가 지속적으로 발현되게 제작한 HeLa-GFP-LC3B 세포주를 사용하여 ARL6IP1의 과발현 후 자가포식소체(autophagosome) 형성 여부를 형광 현미경을 통해 관찰한 결과이다.
도 6e는 도 6d의 자가포식소체 형성의 형광 발현을 imageJ software를 이용하여 정량하여 도식화한 결과이다.
도 7a는 HeLa-GFP-LC3B 세포주에 아데노바이러스를 사용하여 ARL6IP1 유전자 녹-다운 후 자가포식소체 형성 여부를 형광현미경을 통해 관찰한 결과이다.
도 7b는 도 7a의 자가포식소체 형성의 형광 발현을 imageJ software를 이용하여 정량하여 도식화한 결과이다.
도 7c는 HeLa-GFP-LC3B 세포주에 아데노바이러스를 사용하여 ARL6IP1의 유전자 녹-다운 후 48 시간 후에 유전자 조절 여부를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 8a는 ReNcell 신경세포주를 이용하여 신경세포 분화 조건에서 10 일간 세포주의 표현형을 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 8b는 도 8a의 조건에서 단백질의 발현변화를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 8 c는 ReNcell 신경세포주에 신경분화 조건인 레티노산을 3일간 처리 후 세포를 수거하여 2.5~25% 아이오딕사놀 농도 구배 조건에서 ARL6IP1, 칼넥신 (ER 소포체의 마커), LC3B의 발현정도와 발현 위치를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 9a는 SH-SY5Y 신경세포주에서 아데노바이러스 Ad-sh-ARL6IP1을 200 MOI 역가로 처리하여 ARL6IP1 유전자의 녹-다운 후 아데노바이러스 Ad-ARL6IP1을 100 MOI 역가로 처리하여 과발현을 유도한 조건에서 신경세포 분화조건을 주었을 때 세포의 표현형을 현미경으로 관찰한 것이다.
도 9b는 도 9a의 조건에서 유전자의 발현조절 여부를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 9c는 도 9a의 조건에서 세포사멸 마커인 아넥신V로 염색 후 유세포 분석기를 통해 사멸 세포의 분포 여부를 확인한 결과이다.
도 10a는 렛트 hippocampal 뉴런 세포를 이용하여 ARL6IP1 녹-다운 후 ARL6IP1의 과발현을 유도하여 치료효능 여부를 뉴런의 dendrite arborization을 형광현미경으로 관찰한 결과이다.
도 10b는 도 10a의 조건에서 뉴런의 primary dendrites를 계수하여 정량그래프로 확인한 결과이다.
도 10c는 도 10a의 조건에서 뉴런의 secondary dendrites를 계수하여 정량그래프로 확인한 결과이다.
도 11a는 ARL6IP1 knock-out (KO) 마우스 제작방법에 대한 모식도이다.
도 11b는 구축된 ARL6IP1 KO 마우스의 뇌조직에서 정상조직과 비교하여 mRNA 발현량을 RT-PCR로 확인한 결과이다.
도 11c는 구축된 ARL6IP1 KO 마우스의 뇌조직에서 정상조직과 비교하여 단백질 발현량을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 11d는 HSP 질환 표현형인 하지 강직성마비를 확인하기 위해 정상마우스와 ARL6IP1 KO 마우스를 비교한 사진 결과이다.
도 11e는 HSP 질환 표현형 확인을 위해 정상 마우스와 ARL6IP1 KO 마우스간의 발의 외전각을 확인한 결과이다.
도 11f는 정상 마우스 대비 발의 외전각의 정도를 정량그래프로 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: ARL6IP1 돌연변이의 단백질 발현 억제 확인
유전성 강직성 하반신마비는 염색체 우성질환 (autosomal dominant, AD type), 염색체 열성질환 (autosomal recessive, AR type)에서 발병되는 것으로 알려져 있다. 최근에 AR type (열성)의 유전성 강직성 하반신마비 환자 가계에서 다양한 유전자 돌연변이가 발견되어 유전성 강직성 하반신마비와 관련성이 보고되었다 (Novarino G et al, Science 343: 506~511, 2014). 공지된 문헌을 바탕으로 AR type의 ARL6IP1 돌연변이 재조합 플라스미드를 제작하여 야생형 (wild-type)과 비교하여 돌연변이의 기능 이상 여부와 유전자 치료소재로서의 가능성을 확인하고자 하였다.
pFlag-CMV2 벡터에 ARL6IP1-HSP-MT 재조합 플라스미드를 제작하여 염기서열 분석을 수행한 결과, 해당 돌연변이는 16번 염색체 576-579 위치의 4개 염기가 삭제되어 아미노산 서열 라이신 193에서 틀 이동 돌연변이(frameshift mutation)가 발생하여 야생형에 비해 36개의 아미노산이 추가되어 발현됨을 확인하였다(도 1a).
제작된 AR type의 ARL6IP1 돌연변이 재조합 플라스미드의 mRNA, 단백질 수준에서의 발현여부를 야생형과 비교하기 위하여, HEK293 세포주에 야생형의 Flag 태그된 ARL6IP1(WT)과 HSP 돌연변이(HSP-MT) 플라스미드를 5, 15 ug씩 형질도입 후 24 시간 배양하여 세포를 수거하였다. 수거된 세포에서 총 RNA를 분리 정제 (easy-spin™ (DNA free) 총 RNA 추출 키트, Intron) 하였고, mRNA는 cDNA로 합성(SuperScript® III Reverse Transcriptase, Invitrogen)하고 β-actin 프라이머를 사용하여 동일양의 cDNA가 합성 되었는지를 PCR로 확인하였다. 이 후에 ARL6IP1 유전자 특이적인 서열을 프라이머(표 1)로 제작하여 PCR을 수행하였다 (도 1b).
또한, 단백질 수준을 확인하기 위해 도 1b와 동일한 조건에서 세포를 수거하여 용해 버퍼(RIPA, 50 mM Tris-cl, pH8.0, 150 mM NaCl, 0.1% NP-40, 0.1% SDS, 0.5% sodium deoxycholate)를 사용하여 용해 후 원심분리 (13000 rpm, 10 min, 4℃)하여 용해된 단백질 시료를 얻었다. 이 후 12% SDS-PAGE 젤을 사용하여 질량차이에 따른 단백질 분리 후 PVDF 막(membrane)으로 옮겼다. 이 막은 블로킹(blocking) 버퍼 (1 x PBS, 0.05% 트윈-20, 5% 탈지유(skimmilk))로 상온에서 1 시간 반응시키고 PBST로 세척하였다. 단백질의 발현변화를 확인하기 위해 ARL6IP1 (1:3000) 및 β-actin (1:5000, sigma-aldrich)을 1차 항체로서 PBST로 희석 후 4℃에서 12 시간 동안 처리하였다. ARL6IP1항체는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)에서 분리 정제된 단백질을 사용하여 마우스 면역을 통해 직접 제작하여 사용하였다. 1차 항체 처리 후 PBST를 이용하여 세척 후 HRP (horseradish peroxidase) 결합되어 있는 2차 항체 (1:10000, santa-cruz)를 PBST로 희석하여 상온에서 1 시간 반응시킨 후 결합되지 않은 항체는 세척하였다. 이 후 루미놀(Luminol)을 처리하여 발색을 통해 필름 현상을 통해 확인하였다 (도 1c).
이 결과 AR type의 ARL6IP1 돌연변이의 경우 야생형과 비교하였을 때 유전자의 번역단계에서 발현이 억제되어 있음을 확인하였다.
실시예 2: ARL6IP1의 발현을 억제하는 sh - ARL6IP1는 신경세포의 사멸을 유도함
신경 세포내에서 ARL6IP1 유전자의 녹-다운을 유도하였을 때 신경세포 분화에 미치는 영향을 확인하기 위해 sh-ARL6IP1의 제조는 공지된 방법 (Fengjie 　 Guo et al. Mol Biol Rep 37:3819-3825, 2010)에 따라 수행되었고, ARL6IP1의 녹-다운을 위해 pSuper 벡터 BglII/HindIII 위치에 sh-ARL6IP1을 클로닝한 플라스미드와 아데노바이러스 게놈을 포함하는 플라스미드 (Adeasy vector)를 상동 재조합에 의해 아데노바이러스 벡터를 제작하였다. 제작된 아데노바이러스 벡터는 HEK293 세포주에 트랜스펙션하여 아데노바이러스를 생산, 농축하여 사용하였다. 아데노바이러스를 제작하여 신경세포의 낮은 형질 도입률을 개선하였다. ReNcell 신경세포주에 제작된 아데노바이러스 (Ad-sh-ARL6IP1)를 100, 200 MOI 역가로 24 시간 처리 후 신경세포 분화 배지(DMEM/F12, 1% FBS, 페니실린, 스트렙토마이신 및 10 uM 레티노산)에서 3일 동안 배양하여 분화된 신경세포의 표현형을 현미경으로 관찰하였다 (도 2a).
ReNcell 신경세포주에 아데노바이러스 (Ad-sh-ARL6IP1, Ad-sh-Ctrl)을 100 MOI 역가로 24 시간 처리 후 신경세포 분화 조건인 레티노산을 처리하여 신경분화를 유도하였고 각각의 시점에서 단백질 발현 여부를 웨스턴 블랏으로 확인하였다.
각각의 시점에서 수거된 단백질 시료는 12% SDS-PAGE 젤을 이용해 분리 후 ARL6IP1, 신경분화 마커인 MAP2 항체를 1차 항체로 사용하여 4℃에서 12 시간 동안 처리하였다. 1차 항체 처리 후 PBST를 이용하여 세척 후 HRP 표지된 2차 항체는 상온에서 1 시간 동안 처리하였다. 결합되지 않은 2차 항체는 세척 후 루미놀을 처리하여 발색을 통해 필름 현상하여 확인하였다 (도 2b).
ARL6IP1 유전자의 녹-다운이 신경세포의 분화를 억제함을 확인하였고, 동일한 조건에서 세포 사멸 조절을 확인하기 위해 신경 세포주에 아데노바이러스 (Ad-sh-ARL6IP1, Ad-sh-Ctrl)를 100 MOI 역가로 24 시간 처리 후 3 일간 레티노산을 처리한 세포를 수거하여 세포사멸 마커인 아넥신 V로 염색 후 유세포 분석기를 사용하여 세포사멸 분포 정도를 확인하였다.
이 결과 대조군 (Ad-sh-Ctrl)에 비해 ARL6IP1 유전자의 녹-다운이 41.85%의 세포사멸이 유도되었음을 확인할 수 있었다 (도 2c).
실시예 3: 소포체(ER)에서 ARL6IP1의 발현 여부 확인
ARL6IP1(ADP ribosylation factor like GTPase 6 interacting protein 1)이 발현되는 세포내 소기관을 확인하기 위해 U2OS 세포주를 6 웰 플레이트에 1 x 105 세포/웰 시딩한 후 24 시간 배양하였다. 이 후 4% 파라-포름알데하이드 (para-formaldehyde)로 상온에서 12 시간 이상 방치하여 세포를 고정한 후 PBS로 세척하고 0.5% 트리톤 X-100으로 5 분간 처리한 뒤 블로킹 버퍼 (1 x PBS, 0.05% 트윈 20, 0.5% 트리톤 X -100, 5% BSA)로 상온에서 1 시간 처리하였다. 1차 항체는 ARL6IP1 (1:1000)과 ER 막 표지자인 칼넥신(calnexin, 1:1000, AbFrontier) 항체를 PBST (1 x PBS, 0.05% 트윈 20)로 희석하여 4℃에서 16 시간 처리한 후 PBST를 이용하여 남아있는 1차 항체는 세척하였다. 형광 현미경을 사용하여 판독하기 위해서 ARL6IP1은 로다민(rodamin) 형광 dye가 표지된 2차 항체 (1:500, sigma-aldrich)를 사용하였으며, 칼넥신은 FITC 형광 dye가 표지된 2차 항체 (1:500, sigma-aldrich)를 사용하여 상온에서 1 시간 처리 후 PBST를 사용해서 결합되지 않고 남아있는 2차 항체는 모두 세척하였다. 형광현미경을 통해 표지된 dye를 이용하여 배양 세포에서 특정 단백질의 발현여부 및 위치를 확인하였다 (도 3a).
신경세포에서의 ARL6IP1의 발현여부 및 세포내 소기관의 위치를 확인하기 위해 ARL6IP1 유전자는 pShuttle-CMV 벡터에 XhoI/HindIII 위치에 클로닝 후 Adeasy 벡터와 상동 재조합에 의해 아데노바이러스 벡터를 제작하였다. 제작된 아데노바이러스 벡터는 HEK293 세포주에 트랜스펙션하여 아데노바이러스를 생산, 농축하여 사용하였다.
ReNcell 신경세포주에 ARL6IP1를 포함하는 아데노바이러스 벡터 (Ad-ARL6IP1)를 이용하여 100 MOI 역가로 처리 후 24 시간 배양 후에 세포를 수거하여 용해 버퍼 (0.25 M sucrose, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES-NaOH, pH7.4) 첨가 후 소니케이터를 이용하여 세포를 파쇄한 후 원심분리(5000rpm, 5min, 4℃)를 통해 상층액(lysate)만을 수거하였다. 이 후 2.5~25% 아이오딕사놀 농도 구배 조건을 준 후 준비 된 상층액를 올리고 원심분리 (35000 rpm, 3 h, 4℃)하여 튜브 탑(tube top)에서부터 500 ul씩 샘플을 수거하여 웨스턴 블랏으로 확인하였다.
웨스턴 블랏은 각각의 샘플을 12% SDS-PAGE 젤을 이용해 단백질 질량차이에 따라 분리 후 PVDF 막 (millipore)으로 이동하였고, 이 후 막은 블로킹 버퍼 (1 x PBS, 0.05% 트윈 20, 5% 탈지유)를 사용해 상온에서 1 시간 처리 후 PBST(1XPBS, 0.05% 트윈 20)로 세척하였다. 1차 항체로 ARL6IP1 (1:3000), 칼넥신 (1:3000) 을 사용하여 PBST로 희석하여 4℃에서 16 시간 반응시켰다. 각각의 membrane은 PBST로 세척 후 HRP 결합 된 2차 항체 (1:10000, santa-cruz)를 PBST로 희석하여 상온에서 1 시간 반응 후 결합하지 않은 2차 항체는 세척하였다. 화학발광(Chemiluminescence) 방법에 의해 루미놀 (ECL solution, Intron)을 이용하여 발현정도를 확인하였다 (도 3b).
상기 두 실험을 통해 ARL6IP1의 세포내 소기관의 위치를 확인 한 결과 ER 막 표지자인 칼넥신과 ARL6IP1이 분획 샘플의 위치가 동일한 것으로 확인되었으며 아데노바이러스에 의해 ARL6IP1 발현이 증가 된 경우 칼넥신의 발현도 동시에 증가됨을 확인하였다. 이를 통해 ARL6IP1은 세포내 소기관 중 소포체 (endoplasmic reticulum: ER)에 위치함을 알 수 있었다.
실시예 4: 신경세포에서 ARL6IP1의 과발현에 따라 ER 스트레스 유도 조건에서 세포사멸이 억제됨
전술한 바와 같이, ARL6IP1은 ER 막에 존재하여 ER의 형태(shape)에 중요한 기능을 함을 확인하였다. ER 막 단백질 중의 하나로 ARL6IP1의 발현 될 때 ER에서의 기능을 확인하기 위해 ER 스트레스 유도 후에 ER 스트레스 마커들의 발현 조절을 확인하였다. U2OS 세포주에 Flag 태그된 ARL6IP1 플라스미드(Flag-ARL6IP1)와 트랜스펙션 시약 (transfast transfection reagent, Promega)을 혼합하여 DNA/리포좀 복합체를 만든 후 세포에 처리하여 24 시간 동안 배양하였다. ARL6IP1의 과발현 조건에서 ER 스트레스를 유도하였을 때 ER 스트레스 마커들의 단백질 발현 정도를 확인하기 위해 ER 스트레스 유도자인 투니카마이신 (tunicamycin, TM, sigma-aldrich)을 10 μg/ml의 농도로 4 시간 처리 후 세포를 수거하여 용해 버퍼 (RIPA, 50 mM Tris-cl, pH8.0, 150 mM NaCl, 0.1% NP-40, 0.1% SDS, 0.5% sodium deoxycholate) 를 사용하여 4℃, 10 min 처리 후 원심분리 (13000 rpm, 10 min, 4℃)하여 총 상등액을 준비하였다. 이후 12% SDS PAGE 젤을 이용해 단백질 질량에 따라 분리하였다. PVDF 막으로 이동한 후 블로킹 버퍼를 사용해 상온에서 1 시간 반응시켰다.
ARL6IP1의 과발현을 확인하기 위해 Flag (1:5000, sigma-aldrich)과 ARL6IP1 (1:3000) 항체를 사용하였으며, ER 스트레스 마커들의 발현여부를 확인하기 위해 ATF4 (1:2000, cell signaling), CHOP(1:2000, cell signaling), XBP-1 (1:2000, cell signaling) 및 ATF6α(1:2000, cell signaling)를 1차 항체로 사용하여 PSBT로 희석 후 4℃에서 12 시간 처리하였다. HRP 결합된 2차 항체(1:10000, santa-cruz)를 사용하여 상온에서 1 시간 반응 후 루미놀 처리해서 발색을 통해 발현 여부를 확인하였다. 그 결과 ER 스트레스 마커 중 ATF4-CHOP은 세포사멸의 신호(apoptosis signal)를 활성화 하는 것으로 알려져 있으나 ARL6IP1의 과발현은 ATF4-CHOP signal 뿐만 아니라 XBP-1, ATF6α신호가 더 강하게 유도되는 것으로 확인하였고 (도 4a), 이는 XBP-1, ATF6α의 타겟 유전자 중 하나인 샤페론 (chapheron)등의 발현을 유도하여 세포의 사멸이 아닌 생존/성장이 활성화되는 것으로 확인되었다.
ARL6IP1의 과발현 후 발현이 유도된 ER 스트레스 마커 중 ATF4는 전사 조절인자로서 다양한 타겟 유전자의 발현을 조절한다. ARL6IP1에 의해 발현이 유도된 ATF4가 전사 조절인자로서 기능을 할 수 있는지를 확인하기 위해 U2OS 세포주에 Flag-ARL6IP1 플라스미드를 사용하여 트랜스펙션 후 ER 스트레스 유도제인 탭시가긴 (thapsigargin, TG, sigma-aldrich)을 10 uM의 농도로 4 시간 처리하여 ER 스트레스를 유도하였다. 이 후 세포를 수거하여 mRNA를 분리 (easy-spin™ (DNA free) Total RNA Extraction Kits, Intron)후 각각의 ATF4의 타겟 유전자들의 특이적인 서열을 프라이머로 제작하여 (표 1) PCR로 확인하였다. ATF4의 다양한 타겟 유전자들이 mRNA 수준에서 증가됨을 확인 할 수 있었다 (도 4b). 상기 실험에서 사용된 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타내었다.
RT- PCR 프라이머 서열
명칭 프리이머 염기서열 서열번호
ARL6IP1
 정방향 5’-GACTGCAAGTCTGGAAGAAC-3’ 1
역방향 5’-GAACAAGGTAGTCAGCCAAG-3’ 2
ATF4
 정방향 5’-CTGACCACGTTGGATGACAC-3’ 3
역방향 5’-GGGCTCATACAGATGCCACT-3’ 4
E-selectin
 정방향 5’-TGTTTCCAAAACCCTGGAAG-3’ 5
역방향 5’-AACTGGGATTTGCTGTGTCC-3’ 6
ASNS
 정방향 5’-CTCTGAGGAAGGCATTCAGG-3’ 7
역방향 5’-CATTTCTGGTGGCAGAGACA-3’ 8
CHOP
 정방향 5’-CTTGGCTGACTGAGGAGGAG-3’ 9
역방향 5’-TCACCATTCGGTCAATCAGA-3’ 10
VEGF
 정방향 5’-GGAGTACCCTGATGAGATCG-3’ 11
역방향 5’-TGCAGGAACATTTACACGTC-3’ 12
p53
 정방향 5’-CGTGTGGAGTATTTGGATGA-3’ 13
역방향 5’-TTCTCCATCCAGTGGTTTCT-3’ 14
MAP2
 정방향 5’-GAACCAGCAGAGATTCAGAG-3’ 15
역방향 5’-GCTGCCTCTTCTACTTCAAA-3’ 16
β-actin
 정방향 5’-AGGAGAAGCTGTGCTACGTC-3’ 17
역방향 5’-CTCAGGAGGAGCAATGATCT-3’ 18
이러한 유전자들의 발현 정도에 따라 ARL6IP1의 과발현이 세포의 성장 및 사멸에 영향을 미치는지를 확인하였다. ARL6IP1의 과발현 후 유도된 ER 스트레스에 의한 세포주기의 변화를 확인하기 위해 Neuro-2a 세포주에 Flag 태그된 ARL6IP1 플라스미드를 형질도입 후 24 시간 동안 배양하였다.
이 후 세포를 수거하여 70% 에탄올로 4℃에서 12 시간 이상 고정 후 세포사멸 표지자인 아넥신(annexin) V를 염색하여 세포사멸 여부를 확인 한 결과 대조군이 75.88%의 세포사멸이 나타난 것에 비해 ARL6IP1이 과발현된 경우 ER 스트레스가 유도되어도 45.06%로 현저히 낮게 세포사멸이 나타나는 것으로 확인되었다. 이를 통해 ARL6IP1의 과발현은 스트레스 조건에서 세포사멸을 억제할 수 있음을 알 수 있었다 (도 4c).
ARL6IP1의 과발현 후 ER 스트레스를 유도하였을 때 세포사멸이 억제되는 이유를 확인하기 위해 U2OS 세포주에 Flag 태그 된 ARL6IP1 플라스미드를 형질도입 (5, 15ug) 후 24 시간 배양하여 ARL6IP1의 과발현을 유도하였다. ARL6IP1 과발현된 세포주에 ER 스트레스 유도자인 튜니카마이신(TM)을 10 ug/ml의 농도로 4 시간 처리 후 세포를 수거하였다. RIPA 용해 버퍼를 이용하여 단백질 시료를 준비하였고, 12% SDS-PAGE 젤로 단백질을 질량에 따라 분리하였다. 세포사멸 경로인 p53 (1: 5000, santa-cruz), BAX (1:3000, santa-cruz), 카스파제 -9 (1:2000, cell signaling), 카스파제-3 (1:2000, cell signaling) 및 cleavage 카스파제-3 (1:2000, cell signaling)를 1차 항체로 사용하여 4℃에서 12 시간 동안 처리하였다. HRP 결합된 2차 항체는 상온에서 1 시간 동안 처리 후 루미놀 처리하여 발광을 필름으로 현상하여 확인하였다. 이 결과 세포사멸을 조절하는 p53 단백질 발현량을 확인하였을 때 ARL6IP1의 과발현에 따라 p53 단백질이 감소되는 것을 확인하였고, p53의 하위 경로인 BAX, 카스파제-9, 카스파제-3의 활성이 감소되는 것을 확인 할 수 있었다 (도 4d).
실시예 5: ARL6IP1은 MDM2의 E3 리가아제 효소 활성을 활성화시켜 p53의 단백질을 조절함
ARL6IP1의 과발현에 따른 p53의 단백질 감소가 전사 단계에서의 조절인지 또는 번역 이후 단계에서의 조절인지를 확인하기 위해, 도 4와 동일 조건으로 U2OS 세포주에 Flag-ARL6IP1 플라스미드를 이용해 과발현 유도 후 세포를 수거하여 총 RNA를 분리하고 cDNA 합성 후 ARL6IP1, p53 특이적인 프라이머(표 1)를 이용하여 PCR로 확인하였다. β-액틴의 경우 동일한 cDNA의 농도로 PCR이 수행되었음을 나타내는 대조군으로 사용되었다.
그 결과 ARL6IP1 과발현 후 p53의 mRNA 수준에서 변화가 나타나지 않음을 확인하였다. 이는 ARL6IP1에 의한 p53은 번역 후 수준에서 조절 받고 있음을 시사하는 것이다(도 5a).
p53의 단백질은 E3 유비퀴틴 리가아제인 MDM2에 의해 유비퀴틴화 되어 프로테아좀 의존적으로 분해된다고 알려져 있다. 이를 바탕으로 ARL6IP1 과발현에 의한 p53 단백질의 감소가 유비퀴틴화에 의한 프로테아좀 의존적인 분해 작용에 의한 것인지를 확인하기 위해 U2OS 세포주에 Flag-ARL6IP1 플라스미드를 형질도입 (5, 15 ug) 후 24 시간 배양하여 ARL6IP1의 과발현을 유도한 후 프로테아좀 저해제인 MG132를 10 uM의 농도로 12 시간 처리 후 세포를 수거하였다. 수거된 세포는 RIPA 용해 버퍼를 사용하여 단백질 시료를 준비하고, 12 % SDS-PAGE 젤로 단백질을 분리하였다.
또한, ARL6IP1이 농도 의존적으로 과발현 되는지를 확인하기 위해 Flag (1:5000), ARL6IP1 (1:3000)을 1차 항체로 사용하였으며, 프로테아좀 저해제 처리여부에 따른 p53 (1: 5000, santa-cruz), MDM2 (1:2000, BD pharmingen)의 발현여부를 확인하였다. 1차 항체는 PBST로 희석하여 4℃에서 12 시간 동안 처리하였고, HRP 결합된 2차 항체는 상온에서 1 시간 동안 처리 후 루미놀을 처리하여 필름현상으로 확인하였다 (도 5b).
그 결과 ARL6IP1의 과발현은 p53 단백질 수준이 감소되며, 프로테아좀 저해제를 처리하면 p53의 감소가 나타나지 않음을 확인하였다. 또한 p53의 E3 유비퀴틴 리가아제인 MDM2는 ARL6IP1의 과발현에 따른 발현 변화가 나타나지 않음을 확인하였다. 이는 ARL6IP1에 의한 p53의 감소가 유비퀴틴화와 연관되어 나타남을 시사하는 것이다.
p53은 E3 유비퀴틴 리가아제인 MDM2(Mouse double minute 2 homolog)에 의해 유비퀴틴화를 조절시킴이 알려져 있고, MDM2는 기질단백질로서 p53뿐만 아니라 스스로를 기질로 사용하여 기질단백질에 다량체 유비퀴틴을 연결하여 프로테아좀 의존적으로 기질 단백질을 분해시킬 수 있음이 알려져 있다.
본 발명에서는 ARL6IP1에 의한 p53 단백질이 유비퀴틴화에 의해 감소되는 것을 확인하였다. 하지만 세포내에서 ARL6IP1의 발현증가에 따른 MDM2의 단백질의 증가는 확인되지 않았다 (도 5b). 이러한 결과를 바탕으로 ARL6IP1에 의한 MDM2의 E3 효소활성은 스스로를 기질로하는 셀프 유비퀴틴화 (self-ubiquitination)로 in vitro 또는 in vivo MDM2 유비퀴틴화 분석(ubiquitination assay)을 통해 확인하였다.
ARL6IP1에 의한 p53의 단백질 조절 경로가 p53의 E3 유비퀴틴 리가아제인 MDM2의 효소활성에 의한 것인지를 확인하기 위해 in vitro MDM2-유비퀴틴화 분석을 수행하였다. in vitro MDM2-유비퀴틴화 분석은 His-E1; 0.5 μg, His-UBC5Hc; 0.2 μg, GST-MDM2; 0.2, 0.5, 1μg, His-ARL6IP1; 0.2, 0.5, 1μg, Flag-유비퀴틴 (Sigma-Adrich); 1.25μg을 반응 버퍼 (25 mM Tris-HCl pH7.5, 1 mM MgCl2, 2.5 mM DTT, 5 mM ATP, 및 ATP 재생 시스템(regeneration system) 1 mM 크레아틴 인산염(Sigma-Adrich), 1 mM 크레아틴 키나아제 (Sigma-Adrich), 0.5μg/ml 유비퀴틴 알데하이드(Boston Biohem, MA, USA)]와 섞은 후 37°C에서 1 시간 반응 후, 웨스턴 블랏으로 확인하였다.
이 결과 ARL6IP1의 단백질 농도 의존적으로 MDM2 효소활성의 변화가 나타나지 않았으며, 이는 ARL6IP1이 직접적으로 MDM2의 효소활성을 조절하지는 못하는 것으로 확인되었다 (도 5c).
ARL6IP1 발현 여부에 따라 세포내에서의 MDM2 효소활성 변화를 확인하기 위해 in vivo MDM2 유비퀴틴화 분석을 수행하였다. HEK293T 세포주에 GST 태그된 MDM2 (5 ug), Flag 태그된 ARL6IP1(5 ug), HA 태그된 유비퀴틴 (5 ug) 플라스미드를 함께 트랜스펙션 후 24 시간 배양하였다. 이 후 프로테아좀 저해제인 MG132 (10 uM)처리 후 12 시간 후에 세포를 수거하여 용해 버퍼(50 mM Tris-cl, pH7.5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA)를 이용하여 용해 하고 GST-MDM2를 pull-down하기 위해 GST resin (Amersharm)을 첨가하여 4에서 2 시간 동안 반응시켰다. 이 후 원심분리를 통해 GST resin에 결합되어 있는 GST-MDM2를 제외하고 결합하지 않은 단백질들은 PBST를 사용해 세척하였다. Resin은 2 X SDS 샘플 버퍼 (0.125 M 트리스 pH 6.8, 4% SDS, 20% 글리세롤, 0.2 M DTT, 0.02% 브로모페놀 블루)로 리서스펜션 후 10% SDS PAGE 젤로 분리 후 HA (1:2000, AbFrontier)를 1차 항체로 사용하여 4℃에서 12 시간 동안 처리하였다. HRP 결합된 2차 항체를 사용하여 MDM2의 유비퀴틴화를 확인하였다.
이 결과 ARL6IP1이 과발현 된 경우 대조군에 비해 MDM2의 유비퀴틴화가 급격하게 증가되었음을 확인하였으며 이를 통해 ARL6IP1은 직접적으로 MDM2의 효소활성에 영향을 미치지는 않으나 세포내에 존재하는 MDM2의 효소활성을 조절하는 co-factor를 조절함으로써 MDM2의 효소활성을 증가시킴을 알 수 있었다 (도 5d).
실시예 6: ARL6IP1은 자식작용 ( autophagy )을 활성화 시켜 세포의 수명을 조절함
ER 소기관의 수명 조절, 세포의 생존과 사멸을 조절하는 중요한 경로 중에 하나인 자식작용 (autophagy)과 ARL6IP1 유전자의 연관성 여부를 확인하였다. ARL6IP1이 ER 소기관의 막에 위치한다는 실시예 3의 결과들을 바탕으로 이러한 ARL6IP1이 신경세포의 자식작용 신호(autophagy signal)를 조절할 수 있는지를 확인하였다. U2OS 세포주에 Flag-ARL6IP1 플라스미드를 형질도입 (5, 15 ug) 후 24 시간 배양하여 ARL6IP1의 과발현을 유도한 후 ER 스트레스 유도자인 튜니카마이신(TM)을 10 ug/ml의 농도로 4 시간 동안 처리 후 세포를 수거하여 RIPA 버퍼를 사용하여 단백질 시료를 준비하였다. 12% SDS-PAGE 젤을 사용하여 단백질 분리 후 자식작용 신호에 관련된 ATG5―ATG12 결합체 (1:2000, santa-cruz)와 LC3B(light chain 3β, 1:5000, sigma-aldrich)의 활성형인 LC3B-II의 단백질 발현량을 확인할 수 있는 1차 항체를 사용하여 4℃에서 12 시간 동안 처리하였다. HRP 결합된 2차 항체를 사용하여 반응 후 필름현상을 통해 단백질 발현 정도를 확인하였다(도 6a).
그 결과 ARL6IP1의 발현 증가에 따라 ATG5―ATG12 결합체과 LC3B-II의 단백질 증가가 확인되었으며, 이를 통해 자식작용 신호가 유도되었음을 알 수 있었다.
ARL6IP1이 직접적으로 자식작용 신호를 유도하는지를 확인하기 위해 자가포식소체(autophagosome)를 형성하는 LC3B 단백질과의 단백질 간 결합을 확인하였다. E.coli 발현 벡터인 pET28a (His tagged)벡터에 PCR을 통해 증폭 된 ARL6IP1을 BamHI/NotI 제한효소를 이용해 재조합 플라스미드를 제작하였고, pGEX4T1(GST tagged) 벡터에는 LC3B 유전자를 BamHI/NotI 제한효소를 이용해 재조합 플라스미드를 제작하였다. 이 후 E. coli에서 각각의 단백질을 분리정제 하였다. 분리 정제된 His-ARL6IP1(0.5 ug)과 GST-LC3B(0.5, 1 ug)는 PBS 버퍼에서 4℃ 에서 2 시간 동안 반응 시킨 후 GST resin을 첨가하여 pull-down 하였다. pull-down된 시료는 GST-LC3B에 결합되어있는 His-ARL6IP1을 확인하기 위해 12% SDS-PAGE 젤을 통해 분리 후 His (1:2000, santa-cruz)를 1차 항체로 사용하여 확인하였다 (도 6b). 그 결과 ARL6IP1은 LC3B와 직접적으로 결합함을 확인할 수 있었다.
또한, 자가포식소체를 형성할 수 있는 LC3B와 유사한 기능을 수행하는 LC3B family 단백질과 ARL6IP1의 단백질 간 결합여부를 확인하였다. GST-ARL6IP1과 His 태그된 LC3B family는 각각 E. coli에서 분리 정제하였으며, 이 후 GST-ARL6IP1(1 ug)과 His-LC3 family (1 ug)는 PBS 버퍼에서 4℃ 에서 2 시간 동안 반응 시킨 후 GST resin을 첨가하여 pull-down 시켰다. pull-down된 시료는 12% SDS-PAGE 젤을 통해 분리 후 His (1:2000, santa-cruz)를 1차 항체로 사용하여 확인하였다 (도 6 c). GST 단백질은 음성 대조군으로 사용되었다.
세포내에서 ARL6IP1과 LC3B가 직접적으로 결합하여 자가포식소체를 형성 한 후 자식작용 신호를 유도하는 것을 확인하기 위해 GFP-LC3B 점 형성 분석(puncta formation assay)을 수행하였다. HeLa 세포주에 GFP-LC3B가 지속적으로 발현되는 stable cell line을 제작하여 ARL6IP1 포함하는 아데노바이러스 벡터를 100 MOI 역가로 처리하여 24 시간 배양하였다. 이 후 HBSS (자식작용 신호 유도), wortmannin (자가포식소체 형성 저해제), bafilomycin A1 (라이소좀 저해제)를 처리하여 37℃에서 4 시간 배양하였다. 이 후 4%-파라포름알데하이드 (para-formaldehyde)로 상온에서 12시간 이상 방치하여 세포를 고정한 후 PBS로 세척하였다. 형광 현미경을 통해 GFP-LC3B 점(puncta) 형성을 관찰하였다 (도 6d).
그 결과 ARL6IP1의 과발현이 유도된 경우 대조군에 비해 강한 LC3B 점(puncta)이 형성됨을 확인하였고 이를 통해 ARL6IP1에 의해 자식작용 신호가 강하게 유도됨을 알 수 있었다. 반면, 자가포식소체 저해제를 처리하였을 때 ARL6IP1의 과발현이 유도된 경우에도 이러한 LC3B 점(puncta)이 관찰되지 않는것으로 보아 ARL6IP1의 발현증가가 직접적인 LC3B의 자가포식소체 형성에 관여함을 확인할 수 있었다. 도 6d의 LC3B 점 형성을 image J software를 활용하여 정량화 하였다(도 6e).
실시예 7: ARL6IP1 유전자의 녹-다운은 자식작용을 저해함
ARL6IP1의 과발현에 따라 자식작용의 유도를 확인하였다. 이러한 결과가 ARL6IP1 유전자 발현에 특이적으로 관찰되는 현상인지를 확인하기 위해 HeLa 세포주에 GFP-LC3B가 지속적으로 발현되는 세포주를 활용하였으며 아데노바이러스 (Ad-sh-ARL6IP1)를 사용하여 100 MOI 역가로 48 시간 동안 처리 하여 ARL6IP1 유전자의 녹-다운을 유도하였다.
이 후 자식작용 신호 유도조건인 HBSS를 4 시간 동안 처리 후 형광현미경을 통해 자가포식소체 형성을 관찰하였다 (도 7a). 또한, image J software를 사용하여 형광 발현 정도를 정량화하여 도식화하였다 (도 7b).
아데노바이러스 (Ad-sh-ARL6IP1)에 의한 ARL6IP1 유전자의 조절과 자식작용 조절 여부를 확인할 수 있는 LC3B-II 의 단백질 발현정도를 확인 하기위해 아데노바이러스를 100 MOI 역가로 48 시간 동안 처리 후 세포를 수거하여 웨스턴 블랏으로 확인하였다 (도 7c). Ad-sh-Ctrl 바이러스는 아데노바이러스에 대한 대조군으로 사용하였다.
그 결과 아데노바이러스 처리 후 ARL6IP1 유전자 발현은 억제 되었으며 동일한 조건에서 LC3B-II 의 발현도 감소되었음을 확인할 수 있었다.
실시예 8: 신경세포의 분화과정에서 ARL6IP1의 발현이 증가되며 자식작용이 유도됨
신경세포의 분화과정에서의 ARL6IP1의 발현과 자식작용의 조절 여부를 확인하고자 하였다. 신경세포 분화 조건에서 ARL6IP1 유전자의 발현조절을 확인하기 위해 ReNcell 신경세포주는 신경세포 분화 배지(DMEM/F12, 1% FBS, 페니실린, 스트렙토마이신 및 10 uM 레티노산)에서 10 일까지 배양한 후 2 일 마다 세포의 표현형의 변화를 확인하기 위해 현미경 관찰을 하였고 (도 8a) 각각의 시점(time point)에서 세포를 수거하여 RIPA 용해 버퍼를 사용하여 단백질 시료를 얻었다. 이 후 12% SDS-PAGE 젤을 사용하여 단백질 분리 후 ARL6IP1, LC3B 및 β-actin을 1차 항체로 사용하여 웨스턴 블랏으로 확인하였다 (도 8b).
그 결과 신경분화 조건을 준 후 신경세포의 표현형의 변화가 확인되었으며 신경세포 분화 조건인 레티노산 처리 후 1~3일에 ARL6IP1 단백질의 발현이 최대로 증가되었으며 동일한 시점에서 자가포식소체(autophagosome)을 형성하는 LC3B-II의 단백질 증가가 확인되었다. 신경세포의 분화 마커로 사용되는 MAP2 단백질은 레티노산 처리 조건에서 지속적으로 발현 증가가 확인되어 신경세포 분화가 유도되었음을 확인할 수 있었다. 분화 과정 동안에 신경세포는 생존을 위해 자식작용 경로를 활성화 시키는 것을 확인할 수 있었다.
ReNcell에 레티노산을 처리한 후 3 일 후에 세포를 수거하여 2.5~25% 아이오딕사놀 농도 구배 조건하에서 원심 분리하여 단백질 시료를 수거하여 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 위 실험을 통해 신경분화 조건인 레티노산 처리군에서 대조군에 비해 ARL6IP1 및 LC3B-II의 발현이 증가되어 있으며 ARL6IP1, ER 막 표지자인 칼넥신 및 LC3B의 발현이 동일한 분획 샘플의 위치에서 발현됨을 확인하였다. 이를 통해 신경분화 조건에서 ARL6IP1은 세포내 소기관인 ER에 존재하며 자식작용을 유도함이 확인되었다 (도 8c).
실시예 9: ARL6IP1의 발현 억제로 인한 신경세포 사멸을 ARL6IP1의 과발현이 억제함
유전성 강직성 하반신마비의 유전자 치료제로서 ARL6IP1의 치료소재로서의 가능성을 확인하기 위해 sh-ARL6IP1을 사용하여 ARL6IP1을 녹-다운 후 세포사멸이 유도되었을 때 과발현된 ARL6IP1에 의해 세포사멸이 억제되는지를 확인 하고자 하였다.
신경세포주인 SH-SY5Y 세포주를 사용하여 아데노바이러스 Ad-sh-ARL6IP1을 이용하여 200 MOI 역가로 처리하여 ARL6IP1 유전자의 녹-다운을 유도한 후 아데노바이러스 Ad-ARL6IP1/Ad-LacZ를 이용하여 200 MOI 역가로 24 시간 배양하여 ARL6IP1의 과발현을 유도하였다. 이 후 신경세포의 분화를 유도하는 레티노산을 처리하여 3 일간 배양 후 분화된 신경세포의 표현형을 현미경을 통해 관찰하였다 (도 9a).
그 결과 ARL6IP1 녹-다운 후 세포사멸이 유도되어 신경세포의 분화가 되지 않았던 조건에서 ARL6IP1 과발현이 유도된 경우 신경세포의 분화가 대조군 (untreated) 조건과 유사하게 진행됨을 확인할 수 있었다.
또한, 아데노바이러스에 의한 ARL6IP1유전자의 단백질 발현조절을 확인하기 위해 neuro-2a 신경세포주에 각각의 아데노바이러스를 (Ad-sh Ctrl, Ad-sh-ARL6IP1 및 Ad-ARL6IP1) 200 MOI 역가로 처리하고 24 시간 배양한 후 세포를 수거하였다. 수거된 세포는 RIPA 용해 버퍼를 사용하여 단백질 시료를 얻었다. 이 후 12% SDS-PAGE 젤을 사용하여 단백질 분리 후 ARL6IP1, ATF4 및 β-actin을 1차 항체로 사용하여 웨스턴 블랏으로 확인하였다 (도 9b).
ARL6IP1유전자의 녹-다운에 의해 유도되는 세포사멸 조건에서 ARL6IP1의 과발현을 유도하였을 때 세포사멸을 조절할 수 있는지를 확인하기 위해 도 9 b와 동일한 조건인 각각의 아데노바이러스를 (Ad-sh Ctrl, Ad-sh-ARL6IP1 및 Ad-ARL6IP1) 200 MOI 역가로 처리하고 24 시간 배양한 후 세포를 수거하였다. 수거된 세포는 세포 사멸 표지자인 아넥신 V를 이용하여 염색 후 유세포 분석기를 통해 확인하였다 (도 9c).
이와 같은 결과는 유전성 강직성 하반신마비질환의 AR type인 ARL6IP1의 녹-다운에 의해 신경세포의 사멸과 분화 저해가 나타나며 이 조건하에서 ARL6IP1 의 과발현이 유도되면 신경세포의 사멸은 억제되고 분화가 증가됨을 확인한 결과로써 해당 유전자에 돌연변이에 의해 유발된 유전성 강직성 하반신마비 질환의 유전자 치료소재로서 가능성이 있음을 시사하는 것이다.
실시예 10: 렛트 hippocampal 뉴런에서 ARL6IP1 유전자 녹-다운 후 ARL6IP1 과발현에 따른 치료효과 검증
렛트 hippocampal 뉴런 primary cell은 embryonic 18일의 뇌 조직에서 분리하여 glass coverslip에서 배양하였고, 렛트 특이적인 ARL6IP1 녹-다운을 위한 ARL6IP1-shRNA (shRNA target region: 5'-GATGCTGATGGCTGACAAA-3')과 ARL6IP1 과발현 플라스미드를 제작하여 primary cell 배양 후 5일 후에 인산칼슘(calcium-phosphate) 방법으로 형질도입 하였다. 9일 후에 세포를 고정 후 염색하여 현미경으로 관찰하였다 (도 10a).
ARL6IP1의 녹-다운 후 뉴런의 dendrite arborization의 발달 정도를 확인 하기 위해 뉴런의 primary와 secondary dendrites를 각각 계수하여 하였을 때, ARL6IP1 녹-다운에 의해 뉴런의 primary와 secondary dendrite 모두 현저하게 감소된 결과를 보였다. 또한, ARL6IP1을 동시에 과발현 하였을 때 감소되었던 primary dendrite가 대조군과 유사한 정도의 유의성 있는 증가 효과를 보였으며, secondary dendrite는 대조군 정도로 회복되지는 않았으나 유의성 있는 증가가 확인되었다 (도 10b).
이와 같은 결과-는 ARL6IP1의 녹-다운은 뉴런의 dendrite arborization을 현저히 저해하며 ARL6IP1의 과발현을 유도하였을 때 dendrite arborization이 대조군 정도로 증가됨을 확인하여 ARL6IP1이 유전자 치료소재로서 활용 가능함을 시사하는 것이다.
실시예 11: ARL6IP1 유전자 knock-out 에 의한 마우스 HSP 질환모델 구축
유전성 강직성 하반신마비의 유전자 치료제로서 ARL6IP1의 가능성을 확인한 결과를 바탕으로 ARL6IP1 유전자의 녹-다운에 의한 HSP 질환 표현형이 확인되는지를 검증하기 위해 ARL6IP1의 knock-out 마우스를 제작하였다 (도 11a).
구축된 HSP 질환모델인 ARL6IP1 KO 마우스의 조직내 ARL6IP1 발현량을 조사한 결과 뇌조직에서 ARL6IP1의 mRNA 및 단백질 수준에서 발현이 감소되어 있음을 확인하였다. (도 11b 및 11c)
ARL6IP1 KO 마우스는 10개월에 신경 퇴행으로 인한 하지 근육 강직 증상이 확인되었다 (도 11d). 또한, 신경 퇴행 표현형 분석으로 마우스 발의 외전각을 확인한 결과 10 개월의 ARL6IP1 KO 마우스에서 정상 마우스에 비해 25도 이상의 발의 외전각 감소가 확인되었다 (도 11e 및 11f).
이와 같은 결과는 ARL6IP1 발현 억제는 상염색체 열성의 HSP 질환을 유발하며 상기 유전자를 활용한 ARL6IP1 KO 마우스에서 HSP 질환 특이적인 표현형이 확인되며 이는 마우스 HSP 질환모델로서 치료효능 검증에 활용 될 수 있음을 시사하는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> Use of ARL6IP1 for treatment of Hereditary Spastic Paraplegia <130> KPA161072-KR-P1 <150> KR 10-2016-0109406 <151> 2016-08-26 <160> 19 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer F1 <400> 1 gactgcaagt ctggaagaac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer R1 <400> 2 gaacaaggta gtcagccaag 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer F2 <400> 3 ctgaccacgt tggatgacac 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer R2 <400> 4 gggctcatac agatgccact 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer F3 <400> 5 tgtttccaaa accctggaag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer R3 <400> 6 aactgggatt tgctgtgtcc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer F4 <400> 7 ctctgaggaa ggcattcagg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer R4 <400> 8 catttctggt ggcagagaca 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer F5 <400> 9 cttggctgac tgaggaggag 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer R5 <400> 10 tcaccattcg gtcaatcaga 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer F6 <400> 11 ggagtaccct gatgagatcg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer R6 <400> 12 tgcaggaaca tttacacgtc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer F7 <400> 13 cgtgtggagt atttggatga 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer R7 <400> 14 ttctccatcc agtggtttct 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer F8 <400> 15 gaaccagcag agattcagag 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer R8 <400> 16 ctcaggagga gcaatgatct 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer F9 <400> 17 aggagaagct gtgctacgtc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer R9 <400> 18 ctcaggagga gcaatgatct 20 <210> 19 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARL6IP1-shRNA <400> 19 gatgctgatg gctgacaaa 19

Claims (9)

  1. ARL6IP1(ADP ribosylation factor like GTPase 6 interacting protein 1)의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 유전성 강직성 하반신마비(Hereditary Spastic Paraplegia, HSP)의 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 치료는 하기 (1) 내지 (4)중 어느 하나에 의해 수행되는 것인, 약학적 조성물:
    (1) p53의 단백질 발현의 감소;
    (2) MDM2의 단백질 발현의 증가;
    (3) LC3B-Ⅱ의 단백질 발현의 증가; 및
    (4) ATG5―ATG12 결합체의 형성이 증가.
  3. 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 인간을 제외한 유전성 강직성 하반신마비(Hereditary Spastic Paraplegia, HSP) 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 유전성 강직성 하반신마비의 치료 방법.
  5. (a) 유전성 강직성 하반신마비(Hereditary Spastic Paraplegia, HSP)가 유발된 신경세포에 유전성 강직성 하반신마비 치료 후보 물질을 처리하는 단계; 및
    (b) 상기 후보 물질이 처리된 신경세포에서 ARL6IP1(ADP ribosylation factor like GTPase 6 interacting protein 1)의 단백질 발현 수준 또는 이의 활성을 측정하는 단계를 포함하는,
    유전성 강직성 하반신마비 치료제의 스크리닝 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 방법은 (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 ARL6IP1의 단백질 수준; 또는 이의 활성이 후보 물질이 처리되지 않은 신경세포에 비해 증가하면 유전성 강직성 하반신마비 치료제로 판정하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 스크리닝 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    상기 (b) 단계는 하기 (1) 내지 (3)중 어느 하나를 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 스크리닝 방법:
    (1) p53의 단백질 발현;
    (2) LC3B-Ⅱ의 단백질 발현; 및
    (3) ATG5―ATG12 결합체의 형성.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 측정된 후보 물질이 처리되지 않은 신경세포에 비해 ARL6IP1의 단백질 활성이 증가될 때, 하기 (1) 내지 (3)중 어느 하나에 해당되면, 유전성 강직성 하반신마비 치료제로 판정하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 스크리닝 방법:
    (1) p53의 단백질 발현의 감소;
    (2) LC3B-Ⅱ의 단백질 발현의 증가; 및
    (3) ATG5―ATG12 결합체의 형성이 증가.
  9. 제5항 있어서,
    상기 단백질의 발현 수준은 단백질에 특이적으로 결합하는 항체로 측정하는 것인, 스크리닝 방법.
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