WO2006118289A1

WO2006118289A1 - 抗うつ作用を有する化合物の同定方法

Info

Publication number: WO2006118289A1
Application number: PCT/JP2006/309118
Authority: WO
Inventors: Osamu Ohara; Takahiro Nagase; Michio Ohishi; Daisuke Okajima; Hiroshi Yokota
Original assignee: Daiichi Sankyo Company, Limited; Kazusa Dna Research Institute Foundation
Priority date: 2005-05-02
Filing date: 2006-05-01
Publication date: 2006-11-09
Also published as: EP1884568A1; CA2606489A1; AU2006241710B2; AU2006241710A1; EP1884568A4; IL186647A0; JPWO2006118289A1

Abstract

　本発明は、Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）と同質の機能を有する蛋白質をコードする遺伝子および該蛋白質を見出し、該蛋白質の機能および／または発現を調節する化合物の同定方法、該遺伝子および蛋白質と関連する疾患の予防および／治療に有効な手段を提供することを課題とし、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖、該ＤＮＡの相同物、前記ＤＮＡがコードする蛋白質、前記ＤＮＡを含むベクター、前記ベクターを含む形質転換体、前記蛋白質に対する抗体、これらを用いる前記蛋白質の機能および／または発現を調節する化合物の同定方法、抑うつ状態の改善剤および改善方法、医薬組成物および試薬キットを提供した。

Description

明細書

抗うつ作用を有する化合物の同定方法

技術分野

本発明は、抗うつ作用を有する化合物の同定方法に関するものである。より詳しくは、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質と該蛋白質のスプライシングバリアントとからなる群力選ばれるいずれか 1の蛋白質のアンタゴニストである抗うつ作用を有する化合物の同定方法に関する。また本発明は、前記スプライシングバリアントをコードする DNAまたはその相補鎖、該 DNAまたはその相補鎖を含有する組換えベクター、および該組換えベクターを導入されてなる形質転換体に関する。さらに本発明は、前記スプライシングバリアントをコードする DNAから翻訳される蛋白質および該蛋白質の製造方法に関する。また本発明は、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAおよび該 DNAのスプライシングバリアント、該 DNAおよび該 DNAのスプライシングバリアントから選択されるヽずれか 1の DNAを含む組換えベクター、該組換えベクターを導入されてなる形質転換体、該 DNAによりコードされる蛋白質、および該蛋白質を認識する抗体のうち、少なくともいずれ力 1つを含有してなる試薬キットに関する。さらに本発明は、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質と該蛋白質のスプライシングバリアントとからなる群力も選ばれるいずれか 1の蛋白質の機能および Zまたは発現を阻害する化合物を含む抑うつ状態の改善剤に関する。また本発明は、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質と該蛋白質のスプライシングバリアントとからなる群力選ばれるいずれか 1の蛋白質の機能および Zまたは発現を阻害することを手段とする抑うつ状態の改善方法に関する。さらに本発明は、前記抑うつ状態の改善剤を有効量含んでなるうつ病の防止および Zまたは治療剤に関する。また本発明は、前記抑うつ状態の改善剤または前記抑うつ状態の改善方法を用いるうつ病の防止および Zまたは治療方法に関する。さらに本発明は、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAのスプライシングバリアントまたはその相補鎖、または該スプライシングバリアントによりコードされる蛋白質を定量的または定性的に測定する方法に関する。また本発明は、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAおよび該 DNAのスプライシングバリアントから選ばれる少なくともいずれ力 1の DNA、および Zまたは、該 DNAによりコードされる蛋白質を分析することを含んでなる、うつ病の診断に使用するための測定方法またはうつ病の診断方法に関する。

背景技術

[0002] 膜蛋白質受容体は、生体膜の脂質二重層を貫通するドメインを持ち、細胞膜に存在して、各種生理活性物質を特異的に認識し、その作用を伝達し発現する蛋白質である。膜蛋白質受容体に特異的に結合する生理活性物質を一般にリガンドと称する。リガンドとして、ペプチドホルモン、神経伝達物質、および増殖因子等が例示される。リガンドが膜蛋白質受容体に結合すると、セカンドメッセンジャーの形成、細胞内ィオン濃度の変化、および蛋白質のリン酸ィ匕等を介して細胞応答が惹き起こされる。リガンドの膜蛋白質受容体への結合により細胞内でセカンドメッセンジャーの形成、細胞内イオン濃度の変化、および蛋白質のリン酸化等の変化が生じる一連の反応を一般的に情報伝達と称し、該一連の反応の過程を情報伝達経路と称する。

[0003] G蛋白質共役型受容体（G— protein coupled receptor、以下、 GPCRと略称することがある）は細胞膜に存在する糖蛋白質で、細胞膜貫通ドメインを 7個有するという構造的特徴を持つ細胞膜 7回貫通型受容体の 1種であり、多数のメンバーを有するスーパーファミリーを構成している。既に 1000種類以上の GPCR遺伝子が同定され、 GPCRの 3次元構造、 GPCRに対するリガンド、 GPCRを介する細胞内情報伝達経路、およびその機能等に関する研究が進められている。

[0004] GPCRは、光、匂い、味の受容体であると同時に、ホルモンや神経伝達物質の受容体でもあり、酵母からヒトまで、生体において細胞の主要なセンサーとして働いている。

[0005] GPCRはリガンドにより刺激を受けると、細胞内に存在する G蛋白質と結合する。 G 蛋白質は、 GPCRと共役し、情報伝達因子として機能する蛋白質である。 G蛋白質は、細胞内情報伝達経路において情報伝達に関わる数々の因子（以下、エフェクタ一と称する）に対する機能と該蛋白質をコードする遺伝子の違いから、数種類のファミリ一に大別されている。いずれのファミリーに属する G蛋白質も、《、 |8および γと称する 3つのサブユニットからなる 3量体であり、通常、グアノシン^ー二リン酸（GDP )が _αサブユニットに特異的に結合している。 GDP結合型 G蛋白質は、エフェクターに対して作用を示さない不活性型である。 GPCRがリガンドにより刺激を受けると、 G 蛋白質に結合している GDPと細胞内に存在するグアノシン^—三リン酸 (GTP)との交換反応が生じ、 G蛋白質力 GDPが遊離し、それに続いて G蛋白質へ GTPが結合し、 GTP結合型 G蛋白質が形成される。 GTP結合型 G蛋白質は活性型と呼ばれ、 GTPが結合して!/、る aサブユニット ( a GTP)と j8および γサブユニットからなる 2量体（ j8 γ )とに速やかに解離する。 a GTPと β γは、エフェクター（例えばカルシウムイオンチャネルやカリウムイオンチャネル等）に直接作用して、細胞内情報伝達経路を活性化し、その結果、数々の細胞応答を惹き起こす。

[0006] GPCR^—パーファミリーのなかで、クラス B (Secretin like)に分類されているヒト月 ¾血管形成阻害因子 2 (human brain angiogenesis inhibitor 2、以下 hBAI 2と略称する）は、その遺伝子が GenBankにァクセッション番号 AB005298として登録されている。

[0007] hBAI2については、配列情報と発現分布に関する報告 (非特許文献 1)があるが、その機能および疾患との関連に関しては報告されていない。しかし、 BAI2のホモ口グである ΒΑΠとの構造比較により、細胞外ドメイン中にトロンボスボンジンタイプ Iドメイン (以下、 TSP— Iドメインと称する）が存在すると考えられている（非特許文献 2) 。 TSP— Iドメインは、トロンボスポンジン（thrombospondin)の第 385番目から第 52 2番目のアミノ酸配列で表される領域に認められる特徴のあるドメインであり、トロンボスポンジンの細胞外マトリックスへの関与およびその血管新生阻害能に重要な機能ドメインであることが知られて！/、る。

[0008] hBAIlにつ、ては、特異的にヒト脳組織での発現が高、こと、細胞外領域に血管新生抑制能を持つドメインが存在すること、 p53による発現制御を受けている可能性力 Sあること等が報告されており、この遺伝子が脳における血管新生に関する機構に何らかの関与をして、る可能性が示唆されて、る（非特許文献 1—4)。

[0009] hBAI2の関連遺伝子であるマウス BAI2については、脳虚血モデルラットの脳組織にお、て BAI2と血管内皮細胞増殖因子（VEGF： vascular endothelial growth factor)との間に発現量の負の相関が見られることが報告されており、 hBAIl同様に血管新生に関与している可能性が考えられている。具体的には、低酸素状態の後、 BAI2の発現が低下し、その後 VEGFの発現が増加した。また、マウス BAI2のスプライシングバリアントの存在が報告されて、る（非特許文献 3)。

[0010] hBAIlおよび hBAI2は共に配列情報より GPCRファミリーであることが予想されるにもかかわらず、リガンドに関する情報も含めてこれらの GPCRとしての機能に言及した報告は見られない。

[0011] 一方、コレシストキニン（cholecystokinin、以下、 CCKと略称する）は、十二指腸粘膜中の内分泌細胞から放出される消化管ホルモン（gastrointestinal hormone )として知られている。 CCKは、脂肪の摂取に伴って分泌され、胆嚢収縮ゃ脾酵素分泌を促進する。そして、胆嚢収縮、脾臓酵素分泌促進、腸管運動刺激等の消化器官での作用を示す。また、 CCKは満腹感を脳の-ユーロンに与える信号物質と考えられている。

[0012] CCKは、その C末端側から 7番目のチロシン残基が硫酸ィ匕されて、ることが知られている。 CCKは、翻訳後のプロセッシングにより、 CCK— 4、 CCK— 8、 CCK— 12、 CCK— 33、 CCK— 58等、 N末端側の切断部位が異なる数種の長さの断片が生じる。これら各断片の生理活性や存在量が異なることが確認されている。また、 CCKと類似した化学構造をもち、同一生物活性を示すィ匕合物として、力エルの皮膚力ゝら抽出されたセルレイン（cerulein)が報告されて!、る。

[0013] CCKは、また、脳組織に広く分布しており、例えば、大脳皮質、海馬、扁桃体ゃ視床下部に多く認められ、不安、鎮痛、鎮静、摂食抑制、記憶や学習への関与等の中枢神経での作用も報告されている。 CCKは、 DA (ドノくミン； Dopamine)や GABA( γァミノ酪酸； γ amino butyric acid)と一部共存しており、 5HT (セロト-ン； 5 — hydroxytryptamine)作動性神経系等との相互作用も報告されている。また、 C CKの放出が GABAによって調節されているという報告もある。脳内に存在して生理活性を示す CCKとして、主に CCK— 8や CCK— 4が報告されている。また、脳内に存在する CCK— 8は、 C末端側から 7番目のチロシン残基が硫酸ィ匕されているコレシストキ-ンォクタペプチド硫酸化型（CCK— 8S : cholecystokinin octapeptide s ulfated form)で teる。

[0014] 近年、 CCKが記憶の保持に必要不可欠であることが報告されている。例えば、 CC K 8Sが無いと記憶を意識レベルに呼び戻して行動に移すことが困難であること、また、 CCK— 4 (CCK— 33の C末端テトラペプチド）が記憶の想起を妨げること等が明らカ〖こされている。

[0015] CCKの受容体として、 CCK A受容体と CCK B受容体が報告されている。これらはいずれも G蛋白質共役型受容体である。 CCK A受容体の発現は、消化管由来の組織や細胞および血液中の白血球等で検出されている。 CCK A受容体は、細胞内情報伝達経路にぉ、て、例えばホスホリパーゼ Cやアデ-ルシクラーゼ等のエフェクターの促進を介して消化の調節に関与している。一方、 CCK B受容体の発現は、脳や消化管由来の組織や細胞および血液中の白血球等で検出されている。 CCK B受容体は、ガストリン受容体とも称され、細胞内情報伝達経路において、例えばホスホリパーゼ Cや細胞内カルシウムイオン流入等のエフェクターの促進を介して消化の調節や細胞増殖に関与している。近年、 CCK B受容体と不安との関係が注目されている。

[0016] 非特許文献 1 :シラッチ（Shiratsuchi, T. )ら、「サイトジエネテイクスアンドセルジエネテイクス（Cytogenetics and cell genetics)」、 1997年、第 79卷、 p. 103 108。

非特許文献 2 : -シモリ（Nishimori, H. )ら、「オンコジーン（Oncogene)」、 1997年、第 15卷、 p. 2145— 2150。

非特許文献 3 :キー（Kee, H. J. )ら、「ジャーナルォブセレブラルブラッドフロ一アンドメタボリスム (Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism )」、 2002年、第 22卷、 p. 1054— 1067。

非特許文献 4:カウル (Kaur B. )ら、「アメリカンジャーナルォブパソロジー（A merican Journal Of Pathology)」、 2003年、第 162卷、 p. 19— 27。

発明の開示

[0017] GPCRは生体において細胞の重要なセンサーとして働いており、様々な疾患の治療薬を開発する上で主要な標的分子である。既に数多くの GPCRが見出されている力新たな GPCRの同定は医薬開発の分野において多大な貢献を期待できる。

[0018] 本発明の課題は、 GPCRと同質の機能を有する新規蛋白質をコードする遺伝子および該蛋白質を見出して提供することである。また本発明の別の課題は、前記蛋白質の製造法を提供することである。さらに本発明の別の課題は、前記遺伝子を含有する組換えベクターおよび該組換えベクターを導入した形質転換体を提供することである。また本発明の別の課題は、前記遺伝子および蛋白質と疾患との関連を見出し、該疾患の予防および Z治療に有効な手段を提供することである。さらに本発明の別の課題は、前記疾患の予防および Z治療に用いる化合物の同定方法を提供することである。

[0019] 本発明者らは上記課題解決のために鋭意努力し、 GPCRと考えられる 7回膜貫通ドメインを有する機能的膜蛋白質受容体として機能する蛋白質および該蛋白質をコードする遺伝子を見出し、該遺伝子を用いてその遺伝子産物を取得することに成功した。そして、該遺伝子を発現させた動物細胞において、細胞膜上に該蛋白質が発現すること、リガンド刺激により細胞内情報伝達を介した細胞応答が生じることを実証した。さらに、該蛋白質が、その C末端領域で、細胞内情報伝達に関わる蛋白質と相互作用すること、またそのアミノ酸配列中に血管新生阻害機能に関与することが知られている TSP—Iドメインを 3個有することを明らかにした。またさらに、 CCK— 8Sが該機能的膜蛋白質受容体のリガンドとして作用することを実証した。

[0020] また本発明にお、て、前記遺伝子のスプライシングバリアントを見出した。そして、該スプライシングバリアントによりコードされる蛋白質力前記遺伝子によりコードされる蛋白質と同様に、動物細胞で発現させたときに細胞膜上に発現され、リガンド刺激により細胞内情報伝達を介した細胞応答を生じることを実証した。

[0021] さらに本発明において、前記遺伝子を発現させた動物細胞をリガンドで刺激して細胞応答を生じさせる実験系を用いることにより、該遺伝子によりコードされる蛋白質の機能、すなわち細胞応答を阻害する化合物を同定し得ることを実証した。

[0022] また本発明におヽて、前記遺伝子が脳組織、特に大脳皮質、海馬および扁桃体で強く発現していることを見出した。また、前記遺伝子およびそのスプライシングバリアントがうつ病に関与していることを見出した。 [0023] 本発明はこれら知見により完成したものである。

[0024] すなわち本発明は、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質またはそのホモログ蛋白質のアンタゴニストである抗うつ作用を有する化合物の同定方法であって、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAまたはそのホモログ DNA、該 DNAによりコードされる蛋白質および該 DNAを含む細胞力なる群力選択される少なくともいずれか 1を用いることを特徴とする同定方法に関する。

[0025] 本発明はまた、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質と該蛋白質のスプライシングバリアントとからなる群力選ばれるいずれカ 1の蛋白質のアンタゴニストである抗うつ作用を有する化合物の同定方法であつて、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAおよびそのスプライシングバリアントである DNAのうちいずれ力 1の塩基配列で表される DNA、該 DNAによりコードされる蛋白質および該 DNAを含む細胞力なる群力選択される少なくともいずれか 1を用いることを特徴とする同定方法に関する。

[0026] 本発明はさらに、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質と該蛋白質のスプライシングバリアントとからなる群力選択される V、ずれか 1の蛋白質のアンタゴニストである抗うつ作用を有する化合物の同定方法であって、配列表の配列番号 1、 15、 17、 19および 21に記載の塩基配列のうちいずれカゝ 1の塩基配列で表される DNAを含む細胞と被検化合物とを接触させ、該細胞の細胞膜上に発現された該 DNAによりコードされる蛋白質の機能を測定し、該細胞を被検化合物を接触させないときと比較して該蛋白質の機能を低下または消失させる被検化合物を抗うつ作用を有する化合物であると決定することを含む同定方法に関する。

[0027] 本発明はさらにまた、細胞の細胞膜上に発現された DNAによりコードされる蛋白質の機能が、該蛋白質のリガンドの添加により細胞内カルシウム濃度の上昇を惹き起こす機能である、前記同定方法に関する。

[0028] 本発明はまた、細胞の細胞膜上に発現された DNAによりコードされる蛋白質の機能が、該蛋白質のリガンドの添カ卩により膜電位変化を惹き起こす機能である、前記同定方法に関する。

[0029] 本発明はさらに、下記の群；

(i)コレシストキ-ンォクタペプチド硫酸ィ匕型（cholecystokinin octapeptide sulf ated form;配列番号 14、以下、 CCK 8Sと略称する）、

(ii) CCK 8Sのアミノ酸配列において、 1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付カロ等の変異を有し、かつ CCK 8Sと同質の機能を有するペプチド、

および

(iii)前記 (i)または (ii)に記載のペプチドのアミノ酸配列を含み、かつ CCK 8Sと同質の機能を有するペプチド、

より選択されるペプチドをリガンドとして用いる、前記同定方法に関する。

[0030] 本発明はさらにまた、配列表の配列番号 15に記載の塩基配列で表される DNAまたはその相補鎖に関する。

[0031] 本発明はまた、配列表の配列番号 17に記載の塩基配列で表される DNAまたはその相補鎖に関する。

[0032] 本発明はさらに、配列表の配列番号 15に記載の塩基配列で表される DNAもしくは配列表の配列番号 17に記載の塩基配列で表される DNAまたはこれらの相補鎖を含有する組換えベクターに関する。

[0033] 本発明はさらにまた、前記組換えベクターを導入されてなる形質転換体に関する。

[0034] 本発明はまた、配列表の配列番号 15に記載の塩基配列で表される DNAもしくは配列表の配列番号 17に記載の塩基配列で表される DNAまたはこれらの相補鎖によりコードされる蛋白質に関する。

[0035] 本発明はさらに、配列表の配列番号 16に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質に関する。

[0036] 本発明はさらにまた、配列表の配列番号 18に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質に関する。

[0037] 本発明はまた、配列表の配列番号 15に記載の塩基配列で表される DNAもしくは配列表の配列番号 17に記載の塩基配列で表される DNAまたはこれらの相補鎖を含有する発現組換えベクターを導入されてなる形質転換体を培養する工程を含む、前記蛋白質の製造方法に関する。

[0038] 本発明はさらに、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAおよび該 DNAのスプライシングバリアント、該 DNAおよび該 DNAのスプライシングバリアント力も選択される、ずれか 1の DNAを含む組換えベクター、該組換えベクターを導入されてなる形質転換体、該 DNAによりコードされる蛋白質、および該蛋白質を認識する抗体のうち、少なくともいずれか 1つを含有してなる試薬キットに関する。

[0039] 本発明はさらにまた、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAおよび該 DNAのスプライシングバリアントが、配列表の配列番号 1、 15および 17に記載の塩基配列のうちいずれ力 1の塩基配列で表される DNAであり、該 DNAによりコードされる蛋白質が配列表の配列番号 2、 16および 18に記載のアミノ酸配列のうちいずれ力 1のアミノ酸配列で表される蛋白質である前記試薬キットに関する。

[0040] 本発明はまた、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質と該蛋白質のスプライシングバリアントとからなる群力選択されるいずれ力 1の蛋白質の機能および Zまたは発現を阻害することを手段とする抑うつ状態の改善方法に関する。

[0041] 本発明はさらに、前記抑うつ状態の改善方法を用いるうつ病の防止および Zまたは治療方法に関する。

[0042] 本発明はさらにまた、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAおよび該 DNAのスプライシングバリアントから選ばれる少なくともいずれか 1の DNA、および Zまたは、該 DNAによりコードされる蛋白質をマーカーとして定量的または定性的に分析することを含んでなる、うつ病の診断に使用するための測定方法に関する。

[0043] 本発明はまた、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAおよび該 DNAのスプライシングバリアントから選ばれる少なくともいずれ力 1の DNA、および Zまたは、該 DNAによりコードされる蛋白質をマーカーとして定量的または定性的に分析することを含んでなるうつ病の診断方法に関する。

[0044] 本発明により、 GPCRと考えられる 7回膜貫通ドメインを有する機能的膜蛋白質受容体として作用する蛋白質および該蛋白質をコードする DNAを提供できる。本蛋白質は、細胞で発現させたときに細胞膜上に発現され、リガンド刺激により細胞内情報伝達を活性化し、細胞応答を惹き起こす。

[0045] 本発明により、本蛋白質が関与する情報伝達経路および細胞機能の解明とその調節を実施できる。本発明によりまた、本蛋白質および Zまたは DNAの異常に起因する疾患、例えばうつ病の防止および Zまたは治療の実施が可能になる。

図面の簡単な説明

[0046] [図 1-A]配列番号 2に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質が有する機能ドメインを、 hBAI2によりコードされる蛋白質と比較して示した模式図である。（実施例 1)

[0047] [図 1-B]配列番号 2に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質の構造的特徴を、そのスプライシングバリアントと比較して示した模式図である。 ph01207は配列番号 2に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質を示す。 7tmHR、 hkO 1941および variant 3 はいずれも、配列番号 2に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質のスプライシングバリアントを示す。（実施例 6)

[0048] [図 1-C]配列番号 2に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質とそのスプライシングバリアントとのアミノ酸配列を比較して示した図である。図中、二重下線はトロンボスボンジンタイプ Iドメイン (TSP— Iドメイン）を、下線は膜貫通ドメインを示す。 ph01207は配列番号 2に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質を示す。 7tmHR、 hk01941および variant 3は、ずれも、配列番号 2に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質のスプライシングバリアントを示す。（実施例 6)

[0049] [図 2]cDNAクローン ph01207を、 FLAG— tag融合蛋白質および HA— tag融合蛋白質としてそれぞれ動物細胞株 CHO—K1細胞で発現させたときに、これら蛋白質が細胞膜上に発現されたことを示す図である（それぞれ左パネルおよび右パネル)。細胞膜上の蛋白質の検出は、抗 FLAG— tag抗体および抗 HA— tag抗体並びに FI TC標識した二次抗体 (FITC—抗マウス IgG抗体)を用いたフルォロサイトメトリーにより解析した。図中、黒で示された領域は各 tag融合蛋白質を発現させた細胞を、白で示された領域は該蛋白質を発現させな力つたコントロール細胞を示す。（実施例 2)

[0050] [図 3]GPCRのリガンド応答を細胞の膜電位変化により測定した場合に観察され得る波形 (GPCR特異的な応答により生じる波形 (波形 1)、人為的要素等により生じる波形 (波形 2〜4)および応答が無、ときに認められる波形 (波形 5および 6) )を示す図である。（実施例 3)

[0051] [図 4-A]cDNAクローン ph01207を、 HA— tag融合蛋白質として安定的に発現する CHO— K1細胞株（HA— ph01207 # 10— 6)において、 InMの CCK— 8S (配列番号 14)により細胞内 Ca²⁺濃度が上昇したことを示す図である。一方、該 cDNAをトランスフエクシヨンして、な、CHO— K1細胞株にお!、ては、 CCK-8S (配列番号 1 4)による細胞内 Ca²⁺濃度の上昇は認められな力つた。横軸は細胞内 Ca²⁺濃度の測定を開始してからの時間（秒）（Time (sec) )を示す。縦軸は Ca²⁺濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度 (RFU)を示す。（実施例 5)

[0052] [図 4-B]cDNAクローン ph01207を、 HA— tag融合蛋白質として安定的に発現する CHO— K1細胞株（HA— ph01207 # 10— 6)において、 InMの CCK— 8NS (CC K-8 Nonsulfated form)による細胞内 Ca²⁺濃度の上昇が認められなかったことを示す図である。 CCK—8NSは、 CCK—8Sと同じアミノ酸配列で表される CCKォクタペプチドであるが、 C末端から 7番目のチロシン残基が硫酸ィ匕されていないぺプチドである。 cDNAクローン ph01207をトランスフエクシヨンしていない CHO— K1細胞株においても、 CCK—8NSによる細胞内 Ca²⁺濃度の上昇は認められなかった。横軸は細胞内 Ca²⁺濃度の測定を開始して力の時間（秒）（Time (sec) )を示す。縦軸は Ca²⁺濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度 (RFU)を示す。（実施例 5)

[0053] [図 4-C]cDNAクローン ph01207を、 HA— tag融合蛋白質として安定的に発現する CHO— K1細胞株（HA— ph01207 # 10— 6)において、 InMの CCK— 4による細胞内 Ca²⁺濃度の上昇が認められな力つたことを示す図である。該 cDNAをトランスフェクションして!/ヽな、CHO— K1細胞株においても、 CCK - 4による細胞内 Ca²⁺濃度の上昇は認められな力つた。横軸は細胞内 Ca²⁺濃度の測定を開始してからの時間（秒）（Time (sec) )を示す。縦軸は Ca²⁺濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度 (R FU)を示す。（実施例 5)

[0054] [図 4-D]cDNAクローン ph01207を、 HA— tag融合蛋白質として安定的に発現する CHO— K1細胞株（HA— ph01207 # 10— 6)において、 10 Mのカルシウムィォノフォア A23187により細胞内 Ca²⁺濃度が上昇したことを示す図である。該 cDNA をトランスフエクシヨンしていない CHO— K1細胞株においても、 A23187による細胞内 Ca²⁺濃度の上昇が認められた。横軸は細胞内 Ca²⁺濃度の測定を開始してからの時間（秒）（Time (sec) )を示す。縦軸は Ca²⁺濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度（ RFU)を示す。（実施例 5)

[0055] [図 4-E]cDNAクローン ph01207を、 HA— tag融合蛋白質として安定的に発現する CHO— K1細胞株 (HA-ph01207 # 10— 6)または該 cDNAをトランスフエクションしてヽな、CHO— K1細胞株にお!、て、バッファーを添カ卩したときの細胞内 Ca²⁺ 濃度を示す。横軸は細胞内 Ca²⁺濃度の測定を開始して力の時間（秒）（Time (sec ) )を示す。縦軸は Ca²⁺濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度 (RFU)を示す。（実施例 5)

[0056] [図 5-A]7tmHR安定発現株において、 InMの CCK 8S (配列番号 14)により細胞内 Ca²⁺濃度が上昇した代表的な結果を示す図である。 7tmHR発現ベクターをトランスフヱクシヨンしていない宿主細胞では、 CCK 8S (配列番号 14)による細胞内 C a²⁺濃度の上昇は観察されな力つた。図中、 7tmHRZCHO # 6とは、 7tmHR安定発現株の 1クローンを、 CHO— K1は宿主細胞を意味する。横軸は細胞内 Ca²⁺濃度の測定を開始して力の時間（秒）（Time (sec) )を示す。縦軸は Ca²⁺濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度 (RFU)を示す。（実施例 8)

[0057] [図 5- B]7tmHR安定発現株において、 20 /z Mのカルシウムィオノフォア A23187 により細胞内 Ca²⁺濃度が上昇したことを示す図である。 7tmHR発現ベクターをトランスフヱクシヨンしていない宿主細胞においても、 A23187による細胞内 Ca²⁺濃度の上昇が認められた。図中、 7tmHRZCHO # 6とは、 7tmHR安定発現株の 1クローンを、 CHO—K1は宿主細胞を意味する。横軸は細胞内 Ca²⁺濃度の測定を開始して力ゝらの時間（秒）（Time (sec) )を示す。縦軸は Ca²⁺濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度 (RFU)を示す。（実施例 8)

[0058] [図 6- A]hk01941安定発現株において、 InMの CCK—8S (配列番号 14)により細胞内 Ca²⁺濃度が上昇した代表的な結果を示す図である。 hk01941発現ベクターをトランスフエクシヨンしていない宿主細胞では、 CCK—8S (配列番号 14)による細胞内 Ca²⁺濃度の上昇は観察されなかった。図中、 hk0194lZCHO # 13とは、 hkOl 941安定発現株の 1クローンを、 CHO— K1は宿主細胞を意味する。横軸は細胞内 Ca²⁺濃度の測定を開始して力の時間（秒）（Time (sec) )を示す。縦軸は Ca²⁺濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度 (RFU)を示す。（実施例 8)

[0059] [図 6- B]hk01941安定発現株において、 20 /z Mのカルシウムィオノフォア A2318 7により細胞内 Ca²⁺濃度が上昇したことを示す図である。 hk01941発現ベクターをトランスフエクシヨンしていない宿主細胞においても、 A23187による細胞内 Ca²⁺濃度の上昇が認められた。図中、 hk0194lZCHO # 13とは、 hk01941安定発現株の 1クローンを、 CHO— K1は宿主細胞を意味する。横軸は細胞内 Ca²⁺濃度の測定を開始してからの時間（秒）（Time (sec) )を示す。縦軸は Ca²⁺濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度 (RFU)を示す。（実施例 8)

[0060] [図 7- A]variant3安定発現株において、 InMの CCK— 8S (配列番号 14)により細胞内 Ca²⁺濃度が上昇した代表的な結果を示す図である。 _variant3発現ベクターをトランスフヱクシヨンしていない宿主細胞では、 CCK 8S (配列番号 14)による細胞内 Ca²⁺濃度の上昇は観察されなかった。図中、 variant3ZCHO # 14— 18とは varia nt3安定発現株の 1クローンを、 CHO— K1は宿主細胞を意味する。横軸は細胞内 Ca²⁺濃度の測定を開始して力の時間（秒）（Time (sec) )を示す。縦軸は Ca²⁺濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度 (RFU)を示す。（実施例 9)

[0061] [図 7- B]variant3安定発現株において、 20 /z Mのカルシウムィオノフォア A23187 により細胞内 Ca²⁺濃度が上昇したことを示す図である。 variant3発現ベクターをトランスフヱクシヨンしていない宿主細胞においても、 A23187による細胞内 Ca²⁺濃度の上昇が認められた。図中、 variant3ZCHO # 14—18とは &1^1^3安定発現株の 1クローンを、 CHO— K1は宿主細胞を意味する。横軸は細胞内 Ca²⁺濃度の測定を開始してからの時間（秒）（Time (sec) )を示す。縦軸は Ca²⁺濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度 (RFU)を示す。（実施例 9)

[0062] [図 8-A]phO 1207遺伝子がヒト扁桃体の原型質性ァストロサイトで強く発現していることを、抗ヒト BAI2ポリクローナル抗体を用いた組織免疫染色で解析したデータを示す図である。（実施例 10)

[0063] [図 8-B]phO 1207遺伝子がヒト扁桃体の-ユーロンおよびグリアで強く発現していることを、抗ヒト BAI2ポリクローナル抗体を用いた組織免疫染色で解析したデータを示す図である。（実施例 10)

[0064] [図 8-C]ph01207遺伝子が海馬の CA2領域の-ユーロンで強く発現していることを、抗ヒト BAI2ポリクローナル抗体を用いた組織免疫染色で解析したデータを示す図である。（実施例 10)

[0065] [図 8-D]ph01207遺伝子が海馬の CA1領域の-ユーロンで強く発現していることを、抗ヒト BAI2ポリクローナル抗体を用いた組織免疫染色で解析したデータを示す図である。（実施例 10)

[0066] [図 9-A]マウス BAI2遺伝子を標的としたターゲテイングベクターを導入した ES細胞を用いて作製された F1ヘテロ変異マウスの海馬で、ターゲテイングベクターに含まれる LacZ— Neo遺伝子が強く発現していることを、 LacZ発現解析により検出した結果を示す図である。この結果は、マウス BAI2遺伝子の標的部位に LacZ— Neo断片が挿入されたこと、すなわち該遺伝子が破壊されたことを示すと共に、マウス BAI2遺伝子が海馬で発現していることを示す。（実施例 11)

[0067] [図 9-B]マウス BAI2遺伝子を標的としたターゲテイングベクターを導入した ES細胞を用いて作製された F1ヘテロ変異マウスの扁桃体で、ターゲテイングベクターに含まれる LacZ— Neo遺伝子が強く発現していることを、 LacZ発現解析により検出した結果を示す図である。この結果は、マウス BAI2遺伝子の標的部位に LacZ— Neo断片が挿入されたこと、すなわち該遺伝子が破壊されたことを示すと共に、マウス BAI2遺伝子が扁桃体で発現していることを示す。（実施例 11)

[0068] [図 10]BAI2ノックアウトマウスおよび野生型マウスを用いた尾懸垂試験における、それぞれの無動時間（Immobility Time)を示した図である。図中、 + Z +は野生型マウスを、 Z は BAI2ノックアウトマウスを意味する。尾懸垂試験は、野生型マウス 16匹、 BAI2ノックアウトマウス 10匹を用いて行った。結果は各マウスの無動時間の平均値 (秒 (sec) )士標準誤差で示した。図中、アスタリスクは t 検定を用いた統計学的処理において有意差 (Pく 0. 05)が認められたことを示す。（実施例 11)

[0069] [図 ll-A]cDNAクローン ph01207を安定的に発現する CHO— K1細胞株において、 ΙΟηΜの CCK 8Sによる細胞内 Ca²⁺濃度の上昇力 gZmLの化合物 A(c ompound A)の添カ卩により阻害されたことを示す図である。コントロールとしてバッファー（buffer)をィ匕合物 Aの代わりに添カ卩した。化合物 Aまたはバッファ一は測定開始 15秒後に添カ卩し、 CCK—8Sは化合物 Aまたはバッファーの添加 35秒後に添カ卩した。横軸は細胞内 Ca²⁺濃度の測定を開始してからの時間（秒）（Time (sec) )を示す。縦軸は Ca²⁺濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度 (RFU)を示す。（実施例 12)

[0070] [図 11- B]cDNAクローン ph01207を安定的に発現する CHO— K1細胞株において、 ΙΟηΜの CCK 8Sによる細胞内 Ca²⁺濃度の上昇力 gZmLの化合物 B (c ompound B)の添カ卩により阻害されたことを示す図である。コントロールとしてバッファー（buffer)をィ匕合物 Bの代わりに添カ卩した。化合物 Bまたはバッファ一は測定開始 15秒後に添カ卩し、 CCK—8Sは化合物 Bまたはバッファーの添加 35秒後に添カ卩した。横軸は細胞内 Ca²⁺濃度の測定を開始してからの時間（秒）（Time (sec) )を示す。縦軸は Ca²⁺濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度 (RFU)を示す。（実施例 12)

[0071] [図 11- C]cDNAクローン ph01207を安定的に発現する CHO— K1細胞株において、 ΙΟηΜの CCK 8Sによる細胞内 Ca²⁺濃度の上昇力 gZmLの化合物 C (c ompound C)の添カ卩により阻害されたことを示す図である。コントロールとしてバッファー（buffer)をィ匕合物 Cの代わりに添カ卩した。化合物 Cまたはバッファ一は測定開始 15秒後に添カ卩し、 CCK—8Sは化合物 Cまたはバッファーの添加 35秒後に添カ卩した。横軸は細胞内 Ca²⁺濃度の測定を開始してからの時間（秒）（Time (sec) )を示す。縦軸は Ca²⁺濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度 (RFU)を示す。（実施例 12) 発明を実施するための最良の形態

[0072] 本明細書にぉヽて、単離された若しくは合成の完全長蛋白質；単離された若しくは合成の完全長ポリペプチド；または単離された若しくは合成の完全長オリゴペプチドを意味する総称的用語として「蛋白質」 t 、う用語を使用することがある。ここで蛋白質、ポリペプチド若しくはオリゴペプチドは最小サイズが 2アミノ酸である。以降、ァミノ酸を表記する場合、 1文字または 3文字にて表記することがある。

[0073] 本発明は、 7回膜貫通ドメインを有する機能的膜蛋白質受容体として機能する蛋白質および該蛋白質をコードする DNAに関する。より詳しくは、本発明は、 G蛋白質共役型受容体として機能する蛋白質および該蛋白質をコードする DNAに関する。

[0074] 「膜蛋白質受容体」とは、生体膜の脂質二重層を貫通するドメインを持つ蛋白質からなり、細胞膜に存在して、各種生理活性物質を特異的に認識し、その作用を伝達し発現する蛋白質を意味する。ここで、蛋白質は、糖蛋白質を含む。「機能的膜蛋白質受容体」とは、リガンドの作用により、細胞内情報伝達を介した細胞応答を惹き起こす機能を有する膜蛋白質受容体を意味する。膜蛋白質受容体は、リガンドと相互作用する細胞外ドメイン、生体膜の脂質二重層を貫通するドメイン、および細胞内情報伝達を介する細胞内ドメインを有する。

[0075] 「G蛋白質共役型受容体 (GPCR)」とは、リガンドにより刺激を受けると、細胞内に存在する G蛋白質と結合し、 G蛋白質を活性化する膜蛋白質受容体を意味する。「G 蛋白質」とは、 GPCRと共役する蛋白質であり、 GDPZGTP交換反応により GDP結合型 G蛋白質力 GTP結合型 G蛋白質に移行し、細胞内情報伝達因子として数々の細胞応答を惹き起こす蛋白質を意味する。「G蛋白質を活性ィ匕する」とは、 GDP/ GTP交換反応を誘導および Zまたは促進することにより、 GDP結合型 G蛋白質から GTP結合型 G蛋白質への移行を誘導および Zまたは促進し、その結果、 G蛋白質が共役して、る GPCRが関与する数々の細胞応答を誘導および Zまたは促進することを意味する。

[0076] 「リガンド」とは、膜蛋白質受容体に特異的に相互作用する生理活性物質を意味する。

[0077] 「相互作用」とは、例えば 2つの同種あるいは別種の蛋白質力特異的に作用し合い、その結果、一方のあるいは両方の機能が変化する、例えば亢進する、または低減することを意味する。特異的に作用するとは、その作用に関わる蛋白質以外の蛋白質に比べて、より選択的に作用することを意味する。相互作用には例えば、 2つの別種の蛋白質の結合あるいは一方の蛋白質による他方の蛋白質の活性ィ匕等が含まれる。

[0078] 「細胞内情報伝達」とは、受容体に対するリガンドの作用により細胞内でセカンドメッセンジャーの形成、細胞内イオン濃度の変化、および蛋白質のリン酸ィ匕等の変化が生じる一連の反応を意味し、「細胞内情報伝達経路」とは該一連の反応の過程を意味する。

[0079] 本発明にお、て用いる DNAは、より具体的には、配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNA、またはそのホモログ DNAである。本明細書中、「ホモログ DNA」とは、対象の DNAと配列相同性を有しかつ該 DNAによりコードされる蛋白質と構造的特徴ゃ生物学的機能の類似性等を有する蛋白質をコードする DNAをいう。

[0080] 本発明において用いる DNAによりコードされる蛋白質は、好ましくは、配列番号 1 に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質またはそのホモログ蛋白質である。本明細書中、「ホモログ蛋白質」とは、対象の蛋白質と配列相同性を有し、構造的特徴や生物学的機能の類似性等を有する蛋白質をいう。

[0081] 本発明において、 DNAおよび蛋白質はヒト由来の DNAおよび蛋白質であることが好ましいが、該ヒト由来の DNAおよび蛋白質と同質の機能を有し、かつ構造的相同性を有する哺乳動物由来の DNAおよび蛋白質、例えばマウス、ゥマ、ヒッジ、ゥシ、ィヌ、サル、ネコ、クマ、ラットまたはゥサギ等の DNAおよび蛋白質であることができる

[0082] 配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAは、 7回膜貫通ドメインを有する機能的膜蛋白質受容体として機能する蛋白質をコードする DNAである。配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質として、より具体的には、配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質が好ましく例示できる。

[0083] 配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質は構造的特徴として、 3個の TSP— Iドメイン、 1個の GPS (GPCR proteolytic site)ドメインおよび 1個の 7回膜貫通ドメインを有する（図 l—Aおよび図 l—B参照)。 7回膜貫通ドメインは GPCRファミリー 2ドメインとも呼ばれ、 GPSドメインと共〖こ、 G蛋白質共役型受容体に特徴的な構造である。 TSP— Iドメインは、トロンボスボンジンに認められる特徴のあるドメインであり、トロンボスポンジンの細胞外マトリックスへの関与およびその血管新生阻害能に重要な機能ドメインであることが知られている。

[0084] 配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAの遺伝子産物は、実際、膜蛋白質受容体としての機能を示した。具体的には、配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAを発現させた動物細胞において、細胞膜上に該 DNAによりコードされる蛋白質が発現すること、およびリガンド刺激、例えば CCK 8S (配列番号 14)刺激により細胞内情報伝達を介した細胞応答が生じることが観察された。 [0085] また、配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAの遺伝子産物はその C末端領域において、 MAGUKファミリー関連蛋白質である DLG2、 DLG3および DLG4 や、 AIP1、 MAGI3等と相互作用することが観察された。 MAGUKファミリー関連蛋白質は、蛋白質間相互作用にお、て標的蛋白質の最も C末端のアミノ酸配列を認識する PDZドメインを有し、細胞膜に局在して受容体やイオンチャネル等の膜蛋白質と相互作用することにより、これら膜蛋白質力の情報伝達に関与し、細胞間接着等に寄与していると考えられている。また、配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNA と配列相同性を有する hBAI2遺伝子の遺伝子産物と MAGUKファミリー関連蛋白質との相互作用も同様に認められた。一方、 hBAI2のホモログである hBAIl力 M AGUKファミリー関連蛋白質の 1つである BAP 1 (BAI 1 associated proteinl)と、hBAIlの末端領域の部分配列 (QTEV:配列番号 3)を介して結合することが報告されている（シラッチ（Shiratsuchi, T. )ら、「バイオケミカルアンドバイオフイジ力ノレリサーチコ^ュニケーションズ (Biochemical and Biophysical Research Communications)」、 1998年、第 247卷、 p. 597— 604)。

[0086] 配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質および該遺伝子と配列相同性を有する hBAI2遺伝子 (配列番号 21)によりコードされる蛋白質はいずれも、その C末端領域に配列番号 3に記載のアミノ酸配列 (QTEV)が保存されていることから、この配列部分において PDZドメインを持つ蛋白質と相互作用すると発明者らは考えている。

[0087] 配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAのホモログ DNAは、好ましくは、配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAと配列相同性を有し、かつ CCK 8S ( 配列番号 14)の作用により GPCRと同質の機能を示す蛋白質をコードする DNAである。

[0088] 配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAのホモログ DNAとして、配列番号 1 に記載の塩基配列で表される DNAのスプライシングバリアントが好ましく例示される

[0089] 配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質と構造的特徴や生物学的機能の類似性等を有する蛋白質として、配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質のスプライシングバリアントが好ましく例示される。

[0090] 「スプライシングバリアント」とは、真核生物における遺伝子の発現において、ゲノム力転写されたある遺伝子の mRNA前駆体の選択的スプライシングにより生成される 2種類以上の成熟 mRNA、該成熟 mRNAの相補的 DNA、または該成熟 mRNA 力も翻訳される蛋白質のいずれかを意味する。真核生物における遺伝子の発現は、ゲノム上に分散して存在するェキソンとェキソンの間に存在するイントロンと力なる領域カゝら転写された mRNA前駆体からスプライシングにより成熟 mRNAが形成されること〖こより行われる。さら〖こ、該成熟 mRNAの翻訳により蛋白質が生成される。スプライシングとは、 mRNA前駆体からイントロンがスプライス部位 (イントロンとェキソンの境界点）で切り出され、成熟 mRNAが形成される過程を意味する。スプライシングの際、スプライス部位の位置や組み合わせが変化して 2種類以上の成熟 mRNAが生成する、いわゆる選択的スプライシングが起こることがある。選択的スプライシングの結果、 1つの遺伝子から 2種以上の蛋白質が生成されることが多い。

[0091] 配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAのスプライシングバリアントは、該 D NAからなる遺伝子のゲノムカゝら転写された mRNA前駆体の選択的スプライシングにより生成される 2種類以上の成熟 mRNAまたは該成熟 mRNAの相補的 DNAであり得る。

[0092] 配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAのスプライシングバリアントとして、配列番号 15、 17、 19および 21に記載の塩基配列のうちいずれ力 1の塩基配列で表される DNAが好ましく例示できる。

[0093] 配列番号 19に記載の塩基配列で表わされる DNAは、配列番号 1、 15、 17、 19および 21に記載の塩基配列のうちいずれか 1の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質のうち最長のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードしている。

[0094] 配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAのスプライシングバリアントは、上記例示したスプライシングバリアントに限らず、該 DNAと配列相同性を有し、該 DNAの構造的特徴を有し、さらに該 DNAによりコードされる蛋白質と同質の生物学的機能を有する蛋白質をコードする DNAである限りにお!/、て、、ずれの DNAも含む。 [0095] 配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質のスプライシングバリアントは、ゲノムカゝら転写された該蛋白質をコードする遺伝子の mRNA前駆体の選択的スプライシングにより生成される 2種類以上の成熟 mRNA力翻訳される蛋白質である。

[0096] 配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質のスプライシングバリアントとして、配列番号 15、 17、 19および 21に記載の塩基配列のうちいずれ力 1の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質が好ましく例示できる

[0097] 配列番号 15、 17、 19および 21に記載の塩基配列のうちいずれ力 1の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質として、配列番号 16、 18、 20、および 22に記載のアミノ酸配列のうちいずれか 1のアミノ酸配列で表される蛋白質が好ましく例示できる。

[0098] 配列番号 20に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質は、配列番号 2、 16、 18、 2 0および 22に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質のうち最長のアミノ酸配列を有する蛋白質である。

[0099] 配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質のスプライシングバリアントは、上記例示したスプライシングバリアントに限らず、該蛋白質と配列相同性を有し、該蛋白質の構造的特徴を有し、さらに該 DNAによりコードされる蛋白質と同質の生物学的機能を有する蛋白質である限りにおいて、いずれの蛋白質も含む。

[0100] 配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質のスプライシングバリアントは、言い換えれば、配列番号 2に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質と配列相同性を有し、該蛋白質の構造的特徴を有し、さらに該蛋白質と同質の生物学的機能を有する蛋白質である限りにおいて、いずれの蛋白質も含む。

[0101] 本明細書中、「配列相同性」とは、通常、塩基配列またはアミノ酸配列の全体で 50 %以上、好ましくは少なくとも 70%であることが適当である。より好ましくは 70%以上、さらに好ましくは 80%以上、さらにより好ましくは 90%以上、またさらにより好ましくは 95%以上であることが適当である。 [0102] 配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAと配列相同性を有する DNAには、配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAの塩基配列にぉ、て 1個以上、例えば 1〜100個、好ましくは 1〜30個、より好ましくは 1〜20個、さらに好ましくは 1〜10 個、特に好ましくは 1個〜数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加または挿入といった変異が存する塩基配列で表される DNAが含まれる。好ましくは、このような DNAであって、配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAの生物学的機能と同質の機能を有する蛋白質をコードする DNAが望ましい。変異の程度およびそれらの位置等は、該変異を有する DNAが配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAと同様の構造的特徴を有し、配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質と同質の生物学的機能を有するものである限り特に制限されない。

[0103] 変異を有する DNAは、天然に存在するものであってよぐまた天然由来の遺伝子に基づ!/、て変異を導入して得たものであってもよ!/ヽ。変異を導入する手段は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはポリメラーゼ連鎖反応 (以下、 PCRと略称する）等を単独でまたは適宜組合せて使用できる。例えば成書に記載の方法 (サムブルック（Sambrook)ら編、「モレキュラークロー-ング，ァラボラトリーマ-ユアル第 2版」、 1989年、コールドスプリングノヽーバーラボラトリー;村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、 1988年、丸善株式会社）に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、ウルマ一の技術（ウルマー（Ulmer, K. M. )、「サイエンス（Science)」、 1983年、第 219 卷、 p. 666— 671)を利用することもできる。

[0104] 本発明にお、て用いる DNAには、配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNA および該 DNAのスプライシングバリアントにストリンジェントな条件下でノヽイブリダィゼーシヨンする DNAが含まれる。ノ、イブリダィゼーシヨンの条件は、例えば成書に記載の方法（サムブルック（Sambrook)ら編、「モレキュラークロー-ング，ァラボラトリーマ-ユアル第 2版」、 1989年、コールドスプリングハーバーラボラトリー）等が採用できる。具体的には、「ストリンジヱントな条件下」とは、例えば、 6 X SSC、 0. 5% SDS および 50% ホノレムアミドの溶液中で 42。Cにてカロ温した後、 0. 1 X SSC、 0. 5% S DSの溶液中で 68°Cにて洗浄する条件をいう。これら DNAは配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAおよび該 DNAのスプライシングバリアントにハイブリダィゼーシヨンする DNAであれば相補的配列を有する DNAでなくてもよい。好ましくは、コードする蛋白質力配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質の生物学的機能と同質の機能を有する DNAであることが望ましい。

[0105] 配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質と配列相同性を有する蛋白質として、例えば、配列番号 2に記載のアミノ酸配列において 1個以上、例えば 1〜： LOO個、好ましくは 1〜30個、より好ましくは 1〜20個、さらに好ましくは 1〜： LO個、特に好ましくは 1個〜数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入と V、つた変異を有するアミノ酸配列力なり、かつ配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質の生物学的機能と同質の機能を有する蛋白質が例示できる。アミノ酸の変異の程度およびそれらの位置等は、該変異を有する蛋白質力配列番号 2に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質と同質の機能を有するものである限り特に制限されない。

[0106] 変異を有する蛋白質は、天然において例えば突然変異や翻訳後の修飾等により生じたものであってよぐまた天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して取得したものであってもよい。変異を導入する手段は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法または PCR等を単独でまたは適宜組合せて使用できる。例えば成書に記載の方法 (サムブルック（Sambrook)ら編、「モレキュラークロー-ング，ァラボラトリーマ-ユアル第 2版」、 1989年、コールドスプリングノヽーバーラボラトリー；村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、 19 88年、丸善株式会社）に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、ウルマーの技術（ウルマー（Ulmer, K. M. )、「サイエンス（Science)」、 1983 年、第 219卷、 p. 666— 671)を利用することもできる。変異の導入において、当該蛋白質の基本的な性質 (物性、機能、生理活性または免疫学的活性等)を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸 (極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。

[0107] 構造的特徴として、 DNAについては 7回膜貫通ドメインコード領域や TSP— Iドメインコード領域を例示できる。また、該 DNAによりコードされる蛋白質については、構造的特徴として、 7回膜貫通ドメインや TSP— Iドメインを例示できる。このようなドメインゃ領域における配列相同性力好ましくは少なくとも 70%、より好ましくは 70%以上、さらに好ましくは 80%以上、さらにより好ましくは 90%以上、またさらにより好ましくは 95%以上である DNAまたは蛋白質が好ましい。さらに、これらドメインがその機能、例えば該ドメインを含む蛋白質を膜に局在させる機能あるいは血管新生阻害機能を保持してヽるドメインであることがより好ま、。

[0108] また構造的特徴として、 DNAについては^末端領域に配列番号 3に記載のァミノ酸配列（QTEV)をコードする領域が保存されてヽることが挙げられる。該 DNAによりコードされる蛋白質については、 C末端領域に配列番号 3に記載のアミノ酸配列（QT EV)が保存されて、ることが挙げられる。

[0109] 配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質の生物学的機能と同質の機能として、膜蛋白質受容体としての機能を例示できる。「膜蛋白質受容体としての機能」とは、動物細胞で発現させたときに膜蛋白質として発現され、リガンドの作用により細胞内情報伝達を促進し、細胞応答を誘発させる機能を意味する。例えば、 GPCRと同質の機能が挙げられる。「GPCRと同質の機能」とは、リガンドの作用により G蛋白質に結合してこれを活性ィ匕させ、細胞内情報伝達を促進し、細胞応答を誘発する機能をいう。

[0110] 細胞応答として具体的には、細胞膜電位の変化あるいは細胞内カルシウム濃度の変化を例示できる。細胞膜電位の変化あるいは細胞内カルシウム濃度の変化は自体公知の方法で測定できる。細胞膜電位の変化は、例えば、アフリカッメガエル卵母細胞に配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAまたは該 DNAのスプライシングノリアントを発現させ、リガンド刺激の存在下または非存在下で、膜蛋白質受容体特異的に発生する電流量を測定し、その電流量を比較することにより検出できる。細胞内カルシウム濃度の変化は、例えば、カルシウムイオンと結合し得る蛍光色素を細胞内に取り込ませ、リガンド刺激の存在下または非存在下で、励起光により蛍光現象を惹き起こし、その蛍光量を比較することにより検出できる。

[0111] リガンドとして、配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAまたは該 DNAのスプライシングバリアントの発現が認められた細胞または生体組織力ゝら調製した試料を例示できる。試料の調製は、例えば細胞または組織を自体公知の方法で培養し、その培養上清を遠心処理等により得る方法や、細胞または組織を自体公知の方法で破砕あるいは溶解する方法により実施できる。リガンドは、これら試料から自体公知の蛋白質精製方法、例えばゲルろ過クロマトグラフィー等により精製して用いることもできる。リガンドとして具体的には、本実施例に用いた HeLa細胞株の培養上清を例示できるがこれに限定されず、細胞に発現した本 DNAの遺伝子産物に作用して細胞応答を誘発させ得るものであれば、ずれを用いてもょ、。

[0112] リガンドとして CCK—8S (配列番号 14)をより好ましく例示できる。

[0113] 配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質の生物学的機能と同質の機能としてまた、グァニル酸キナーゼ活性および Zまたは細胞接着機能を有する蛋白質、例えば MAGUKファミリー関連蛋白質と相互作用する機能を例示できる。 MAGUKファミリー関連蛋白質として具体的には、 DLG2、 DLG3および DLG4や、 AIP1、 MAGI3を例示できる。

[0114] 上述のように、配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAおよび該 DNAのスプライシングバリアントは、 7回膜貫通ドメインを有する機能的膜蛋白質受容体として機能する蛋白質をコードする DNAである。本 DNAによりコードされる蛋白質は構造的特徴として、数個、好ましくは 2個〜 4個の TSP—Iドメイン、 1個の GPSドメインおよび 1個の 7回膜貫通ドメインを有する（図 1—Aおよび図 1—B参照)。

[0115] 配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAは、シグナル配列と予測される部分

(N末端より 20アミノ酸残基)を有する 1518アミノ酸残基 (配列番号 2)をコードするォープンリーディングフレーム（ORF)を含む 4557bpの塩基配列からなる。

[0116] 配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質として、配列番号 2に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質を好ましく挙げられる。

[0117] 配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質は、シグナル配列と予測される部分 (N末端より 20アミノ酸残基)を有する 1518アミノ酸残基力もなり、そのアミノ酸配列に 3個の TSP—Iドメインの他、 GPSドメインおよび 7回膜貫通ドメイン（7回膜貫通ドメイン)を有する（図 1 Aおよび図 1 B参照)。本蛋白質のァミノ酸配列は、配列番号 19に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列と比較して、 N末端側の 1個の TSP— Iドメインを含む 55アミノ酸残基が欠失している以外は同一である。欠失している 55アミノ酸残基は、配列番号 2 0に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質のアミノ酸配列において、第 296番目のグリシン (G)から第 350番目のプロリン（P)に相当する。 3個の TSP— Iドメインはそれぞれ、配列番号 2に記載のアミノ酸配列における第 297番目のヒスチジン (His)力も第 350番目のプロリン（Pro)までの領域；第 352番目のグルタミン酸（Glu)から第 405 番目のプロリン (Pro)までの領域；および第 408番目のァスパラギン酸 (Asp)から第 461番目のプロリン (Pro)までの領域力もなる。 7個の膜貫通ドメインはそれぞれ、配列番号 2に記載のアミノ酸配列における第 870番目のノリン (Val)力も第 890番目のフエ-ルァラニン（Phe)までの領域；第 899番目のセリン（Ser)から第 919番目のグリシン（Gly)までの領域；第 928番目のパリン (Val)から第 948番目のロイシン（Leu) までの領域；第 970番目のアルギニン (Arg)力も第 990番目のトレオニン (Thr)までの領域；第 1012番目のァラニン (Ala)力第 1032番目のフエ-ルァラニン（Phe)までの領域；第 1087番目のロイシン（Leu)力第 1107番目のァラニン (Ala)までの領域；および第 1114番目のパリン (Val)から第 1134番目のパリン (Val)までの領域からなる。

[0118] 配列番号 15に記載の塩基配列で表される DNAは、シグナル配列と予測される部分 (N末端より 20アミノ酸残基)を有する 1463アミノ酸残基 (配列番号 16)をコードする ORFを含む 4389bpの塩基配列からなる。

[0119] 配列番号 15に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質として、配列番号 16に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質が挙げられる。

[0120] 配列番号 15に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質は、シグナル配列と予測される部分 (N末端より 20アミノ酸残基)を有する 1463アミノ酸残基からなり、そのアミノ酸配列に 7回膜貫通ドメイン、 2個の TSP—Iドメインおよび 1個の GPSドメインを有する（図 1— B参照)。本蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号 19に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列と比較して、 N末端側の 2個の TSP-Iドメインを含む 110アミノ酸残基が欠失している以外は同一である。欠失している 110アミノ酸残基は、配列番号 20に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質のアミノ酸配列において、第 296番目のグリシン (G)から第 405番目のプロリン (P)に相当する。

[0121] 配列番号 17に記載の塩基配列で表される DNAは、シグナル配列と予測される部分 (N末端より 20アミノ酸残基)を有する 1518アミノ酸残基 (配列番号 18)をコードする ORFを含む 4554bpの塩基配列からなる。

[0122] 配列番号 17に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質として、配列番号 18に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質が挙げられる。

[0123] 配列番号 17に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質は、シグナル配列と予測される部分 (N末端より 20アミノ酸残基)を有する 1518アミノ酸残基（配列番号 18)からなり、そのアミノ酸配列に 7回膜貫通ドメイン、 3個の TSP-Iドメインおよび 1個の GPSドメインを有する（図 1 B参照)。本蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号 19に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列と比較して、 N末端側から 2番目の TSP— Iドメイン 1個を含む 55アミノ酸残基が欠失している以外は同一である。欠失している 55アミノ酸残基は、配列番号 20に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質にぉ、て、第 351番目のノリン (V)力も第 405番目のプロリン (P)に相当する。

[0124] 配列番号 19に記載の塩基配列で表される DNAは、 7tmHR (seven transmem brane herix receptor)遺伝子（GenBank、ァクセッション番号： AB065648)と称される。本 DNAは、シグナル配列と予測される部分 (N末端より 20アミノ酸残基)を有する 1573アミノ酸残基（配列番号 20)をコードする ORFを含む 4719bpの塩基配列からなる。

[0125] 配列番号 19に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質として、配列番号 20に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質が挙げられる。

[0126] 配列番号 19に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質は、 7tm HR (GenBank,ァクセッション番号: AB065648)と称される。本蛋白質は、 1573ァミノ酸残基からなり、そのアミノ酸配列に 7回膜貫通ドメイン、 4個の TSP-Iドメインおよび 1個の GPSドメインを有する（図 1 B参照）。 [0127] 配列番号 21に記載の塩基配列で表される DNAは、公知ヒト DNAであり、 hBAI2 遺伝子（GenBank、ァクセッション番号: AB005298)と称される。本 DNAは、シグナル配列と予測される部分 (N末端より 20アミノ酸残基)を有する 1572アミノ酸残基（配列番号 22)をコードする ORFを含む 5399bpの塩基配列からなる。

[0128] 配列番号 21に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質として、配列番号 22に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質が挙げられる。

[0129] 配列番号 21に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質は、公知ヒト蛋白質であり、 hBAI2 (GenBank、ァクセッション番号: AB005298)と称される。本蛋白質は、 1572アミノ酸残基力もなり、そのアミノ酸配列に 7回膜貫通ドメイン、 4 個の TSP—Iドメインおよび 1個の GPSドメインを有する（図 1—A参照）。本蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号 19に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列と比較して、 C末端領域において第 1461番目のリジンに相当する 1アミノ酸残基が欠失している以外は同一である。

[0130] 配列番号 1、 15、 17、 19および 21に記載の塩基配列のうちいずれ力 1の塩基配列で表される DNAおよび該 DNAによりコードされる蛋白質は、このように、互いに相同性を有し、 TSP— Iドメイン、 GPSドメインおよび 7回膜貫通ドメインを保存している。

[0131] 配列番号 1、 15、 17、 19および 21に記載の塩基配列のうちいずれ力 1の塩基配列で表される DNAおよび該 DNAによりコードされる蛋白質は、配列の相同性および構造的特徴の類似性から、スプライシングノリアントであると発明者らは考えて、る。

[0132] 配列番号 2、 16、 18、 20および 22に記載のアミノ酸配列のうちいずれ力 1のァミノ酸配列で表される蛋白質は、互いに相同性を有し、 TSP— Iドメイン、 GPSドメインおよび 7回膜貫通ドメインを保存してヽる。配列の相同性および構造的特徴の類似性から、これら蛋白質はスプライシングバリアントであると発明者らは考えている。

[0133] 配列番号 15、 17および 19に記載の塩基配列のうちいずれ力 1の塩基配列で表される DNAの遺伝子産物は、実際、膜蛋白質受容体としての機能を示した。具体的には、該遺伝子産物を発現させた動物細胞において、配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAの遺伝子産物を発現させた動物細胞と同様に、 CCK-8S (配列番号 14)刺激により細胞内情報伝達を介した細胞応答が生じることが観察された。 [0134] 本発明において用いる DNAは、上記 DNA、例えば配列番号 1、 15、 17、 19および 21に記載の塩基配列のうち、ずれか 1の塩基配列を含有する塩基配列で表される DNAであることができる。

[0135] また本発明にお、て用いる DNAは、配列番号 1に記載の塩基配列で表される DN Aまたは該 DNAのスプライシングノリアントの指定された領域に存在する部分塩基配列で表される DNA断片であることができる。このような DNA断片は、配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAまたは該 DNAのスプライシングバリアントを検出するためのプライマーやプローブ、あるいは本 DNAを製造するためのプライマーとして使用できるため有用である。プライマーは、好ましくは 15個〜 30個、より好ましくは 20 個〜 25個のヌクレオチドからなる。プローブは、好ましくは 8個〜 50個のヌクレオチド、より好ましくは 17個〜 35個のヌクレオチド、さらに好ましくは 17個〜 30個のヌクレオチドからなる。プライマーやプローブの長さが適当な長さより長いと、偽ハイブリダィゼーシヨンが増加するために特異性が低下する。また、長さが適当な長さより短いとミスマッチが生じるために特異性が低下する。

[0136] 配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAまたは該 DNAのスプライシングバリアントの指定された領域として、該 DNAによりコードされる蛋白質の断片であってリガンドが作用する部位を含む断片をコードする領域が好ましく挙げられる。リガンドが作用する部位を含む断片をコードする領域に存在する部分塩基配列で表される DNA 断片は、リガンドが作用する部位を含む断片の製造に使用できる。リガンドが作用する部位を含む断片は、本発明において用いる蛋白質に対するリガンドの作用、例えば本蛋白質とリガンドとの結合の検出、また該作用を促進するまたは阻害する化合物の同定に有用である。あるいは、本蛋白質に対してリガンドと同様の作用を有する化合物、すなわちァゴ-ストの同定に有用である。このような DNA断片は、その最小単位として好ましくは該領域において連続する 5個以上のヌクレオチド、より好ましくは 1 0個以上、より好ましくは 20個以上のヌクレオチド力もなる。

[0137] 配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAまたは該 DNAのスプライシングバリアントの指定された領域に存在する部分塩基配列で表される DNA断片はまた、蛋白質をコードするセンス鎖に相補的な DNA断片であるとき、配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAまたは該 DNAのスプライシングバリアントの発現を阻害するァンチセンスオリゴヌクレオチドとして有用である。一般的に 20個前後のヌクレオチドからなる DNA断片力遺伝子の発現を阻害できることが知られていることから、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは 15個以上、より好ましくは 20個以上のヌクレオチドからなる。

[0138] これら DNA断片は、配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAまたは該 DNA のスプライシングバリアントの塩基配列情報に従って、目的の配列を有するものを設計し、自体公知の化学合成法により製造できる。簡便には、 DNAZRNA自動合成装置を用いて製造できる。

[0139] 本発明において用いる蛋白質は、上記蛋白質、例えば配列番号 2、 16、 18、 20および 22に記載のアミノ酸配列のうちいずれか 1のアミノ酸配列を含有するアミノ酸配列で表される蛋白質であることができる。

[0140] また本発明において用いる蛋白質は、該蛋白質の指定された領域に存在する部分アミノ酸配列で表される断片であることができる。本蛋白質の断片は、本蛋白質に対する抗体を作製するための抗原として使用できるため有用である。

[0141] 本発明にお、て用いる蛋白質の指定された領域として、本蛋白質にお!、てリガンドが作用する部位が好ましく挙げられる。リガンドが作用する部位を含む断片は、本蛋白質に対するリガンドの作用、例えば本蛋白質とリガンドとの結合の検出、また該作用を促進するまたは阻害する化合物の同定に有用である。リガンドが作用する部位を含む断片は、本蛋白質に対するリガンドの作用、例えば本蛋白質とリガンドとの結合の検出、また該作用を促進するまたは阻害する化合物の同定に有用である。あるいは、本蛋白質に対してリガンドと同様の作用を有する化合物、すなわちァゴニストの同定に有用である。また、リガンドが作用する部位を含む断片のうち、リガンドと本蛋白質の相互作用を阻害する断片は、リガンドの作用による本蛋白質の機能の誘導を阻害する化合物として有用である。

[0142] 本発明において用いる蛋白質の指定された領域に存在する部分アミノ酸配列で表される断片は、その最小単位として好ましくは 5個以上、より好ましくは 8個以上、さらに好ましくは 12個以上、とくに好ましくは 15個以上の連続するアミノ酸力もなるものである。これら断片は、本蛋白質のアミノ酸配列情報に従って、目的の配列を有するものを設計し、例えば自体公知の化学合成法により製造できる。

[0143] 本発明において用いる蛋白質は、本蛋白質をコードする遺伝子を遺伝子工学的手法で発現させた細胞や生体試料から調製したもの、無細胞系合成産物または化学合成産物であってよぐあるいはこれらからさらに精製されたものであってもよい。また、本蛋白質は、本蛋白質をコードする遺伝子を含む細胞において発現しているものであり得る。該細胞は、本蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターをトランスフエクシヨンして得られた形質転換体であり得る。

[0144] 本発明において用いる蛋白質はさらに、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を伴わない限りにおいて改変できる。また、 N末端側や C末端側に別の蛋白質等を、直接的にまたはリンカ一ペプチド等を介して間接的に遺伝子工学的手法等を用いて付加することにより標識ィ匕したものであってもよい。好ましくは、本蛋白質の基本的な性質が阻害されないような標識化が望ましい。付加する蛋白質等として、例えば GST、 β ガラクトシダーゼ、 HRP または ALP等の酵素類、 His— tag、 Myc— tag、 HA -tag, FLAG— tagまたは Xp ress— tag等のタグペプチド類、フルォレセインイソチオシァネート（fluorescein is othiocyanate)またはフィコエリスリン（phycoerythrin)等の蛍光色素類、マルトース結合蛋白質、免疫グロブリンの Fc断片あるいはピオチン等を例示できる力これらに限定されない。また、放射性同位元素により標識することもできる。標識ィ匕に用いる物質は、 1つまたは 2つ以上を組合せて付加できる。これら標識化に用いた物質自体、またはその機能を測定することにより、本蛋白質を容易に検出または精製でき、また、例えば本発明において用いる蛋白質と他の蛋白質との相互作用を検出できる。

[0145] (DNAの取得）

本発明において用いる DNAは、当該 DNAの配列情報に基づいて、公知の遺伝子工学的手法（サムブルック（Sambrook)ら編、「モレキュラークローユング，ァラボラトリーマ-ユアル第 2版」、 1989年、コールドスプリングノヽーバーラボラトリー;村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、 1988年、丸善株式会社等を参照）により容易に取得できる。例えば、配列表の配列番号 1、 15、 17、 19および 21に記載の塩基配列で表される DNAは、その配列情報基づいて、公知の遺伝子工学的手法により取得できる。

[0146] 本発明において用いる DNAの取得は、具体的には、本 DNAの発現が確認されている適当な起源から、常法に従って cDNAライブラリーを調製し、該ライブラリーから、該 DNAに特有の適当なプローブやプライマーを用いて所望のクローンを選択することにより実施できる。 cDNAの起源として、本 DNAの発現が確認されている各種の細胞や組織、またはこれらに由来する培養細胞等を例示できる。配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAおよび該 DNAのスプライシングバリアントの起源として、例えば、ヒトの脳組織や脳細胞を例示できる。

[0147] 起源からの全 RNAの分離、 mRNAの分離や精製、 cDNAの取得とそのクロー- ング等はいずれも常法に従って実施できる。また、市販されているヒト脳、胎児脳、および脳海馬由来の polyA+RNAから cDNAライブラリーを構築して使用できる。所望のクローンを cDNAライブラリ一力選択する方法も特に制限されず、慣用の方法を使用できる。例えば、目的の DNA配列に選択的に結合するプローブを用いたブラークハイブリダィゼーシヨン法、コロニーハイブリダィゼーシヨン法等やこれらを組合せた方法等を例示できる。ここで用いるプローブとして、配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAまたは該 DNAのスプライシングノリアントの塩基配列に関する情報に基づいて化学合成された DNA等が一般的に使用できる。また、本 DNAの塩基配列情報に基づき設計したセンスプライマー、アンチセンスプライマーをこのようなプロ一ブとして使用できる。

[0148] cDNAライブラリーからの目的クローンの選択は、例えば公知の蛋白質発現系を利用して各クローンについて発現蛋白質の確認を行い、その生物学的機能を指標にして実施できる。

[0149] DNAの取得にはその他、 PCR (ウルマー（Ulmer, K. M. )、「サイエンス（Scienc e)」、 1983年、第 219卷、 p. 666— 671；エールリツヒ（Ehrlich, H. A.；)編、「PCR テクノロジー， DNA増幅の原理と応用」、 1989年、ストックトンプレス；サイキ（Saiki R. K. )ら、「サイエンス（Science)」、 1985年、第 230卷、 p. 1350— 1354) )による DNAZRNA増幅法が好適に利用できる。 cDNAライブラリーから全長の cDNAが得られ難いような場合には、 RACE法（「実験医学」、 1994年、第 12卷、第 6号、 p. 6 15— 618)、特に 5'— RACE法（フローマン（Frohman M. A. )ら、「プロシーディングスォブザナショナルアカデミーォブサイェンシズォブザュナイテツドステーッォブアメリカ（Proceedings of The National Academy of S ciences of The United States of America)」、 1988年、第 85卷、第 23号、 p. 8998— 9002)等の採用が好適である。 PCRに使用するプライマーは、 DNAの塩基配列情報に基づいて適宜設計でき、常法に従って合成により取得できる。増幅させた DNAZRNA断片の単離精製は、常法により実施できる。例えばゲル電気泳動法等により DNAZRNA断片の単離精製を実施できる。

[0150] DNAの塩基配列の決定は、常法、例えばジデォキシ法（「プロシーディンダスォブザナショナルアカデミーォブサイェンシズォブザユナイテッドステーッオフ 7メリ力 (Proceedings of Tne National Academy of sciences of The United States of America)」、 1977年、第 74卷、 p. 5463 - 5467) やマキサムギルバート法（「メソッズインェンザィモロジ一（Methods in Enzy mology)」、 1980年、第 65卷、 p. 499— 560)等【こより、また簡便【こ ίま市販のシーケンスキット等を用いて実施できる。

[0151] DNAは、その機能、例えばコードする蛋白質の発現や、発現された蛋白質の機能が阻害されない限りにおいて、 5,末端側や^末端側に、例えばグノレタチオン S トランスフェラーゼ（GST)、 β ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュパーォキシダーゼ（HRP)またはアルカリホスファターゼ（ALP)等の酵素類、 His— tag、 Myc— tag 、あるいは HA— tag、 FLAG— tagまたは Xpress— tag等のタグペプチド類等の遺伝子が、 1つまたは 2つ以上付加された DNAであることができる。これら遺伝子の付加は、慣用の遺伝子工学的手法により行うことができ、遺伝子や mRNAの検出を容易にするため有用である。

[0152] (ベクター）

本発明において用、る DNAを適当なベクター DNAに挿入することにより、該 DN Aを含む組換えベクターが得られる。組換えベクターは、該 DNAが組込まれている糸且換えベクターである限りにお、て、、ずれの糸且換えベクターであってもよ！/、。 [0153] ベクター DNAは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクター DNAは、天然に存在するものを抽出したもののほか、複製に必要な部分以外の DNAの部分が一部欠落して、るものでもよい。代表的なものとして、プラスミド、ノクテリオファージおよびウィルス由来のベクター DNAを例示できる。プラスミド DNAとして、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド等を例示できる。ノクテリオファージ DNAとして、 λファージ等を例示できる。ウィルス由来のベクター DNAとして、例えばレトロゥィルス、ワクシニアウィルス、アデノウイルス、パポバウィルス、 SV40、鶏痘ウィルス、および仮性狂犬病ウィルス等の動物ウィルス由来のベクター、あるいはバキュロウィルス等の昆虫ウィルス由来のベクターを例示できる。その他、トランスポゾン由来、揷入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来のベクター DNA等を例示できる。あるいは、これらを組合せて作成したベクター DNA、例えばプラスミドおよびバタテリオファージの遺伝学的エレメントを組合せて作成したベクター DNA (コスミドゃファージミド等）を例示できる。また、目的により発現ベクターやクローユングベクター等、いずれを用いることちでさる。

[0154] ベクターには、目的遺伝子の機能が発揮されるように遺伝子を組込むことが必要であり、少なくとも目的遺伝子配列とプロモーターとをその構成要素とする。これら要素に加えて、所望によりさらに、複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列、例えば、リボソーム結合配列、ターミネータ一、シグナル配列、ェンハンサ一等のシスエレメント、スプライシングシグナル、および選択マーカー等から選択した 1つまたは複数の遺伝子配列を自体公知の方法により組合せてベクター DNAに組込むことができる。選択マーカーとして、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等を例示できる。

[0155] ベクター DNAに目的遺伝子配列を組込む方法は、自体公知の方法を適用できる。例えば、目的遺伝子配列を適当な制限酵素により処理して特定部位で切断し、次 V、で同様に処理したベクター DNAと混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられる。あるいは、目的遺伝子配列に適当なリンカ一をライゲーシヨンし、これを目的に適したベクターのマルチクローユングサイトへ挿入することによつても、所望の組換えベクターが得られる。

[0156] (形質転換体）

本発明に用いる DNAを組込んだベクター DNAを宿主に導入することにより、形質転換体が得られる。ベクター DNAとして発現ベクターを使用すれば、本 DNAを発現させることができ、さらに該 DNAによりコードされる蛋白質を製造できる。該形質転換体には、本 DNA以外の所望の遺伝子を組込んだベクター DNAの 1つまたは 2っ以上をさら〖こ導人することちでさる。

[0157] 宿主として、原核生物および真核生物のいずれも使用できる。原核生物として、例えば大腸菌（ェシエリヒアコリ（Escherichia coli) )等のェシエリヒア属、枯草菌等のバシラス属、シユードモナスプチダ（Pseudomonas putida)等のシユードモナス属、リゾビゥムメリロティ（Rhizobium meliloti)等のリゾビゥム属に属する細菌を例示できる。真核生物として、サッカロミセス ·セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae) 、シゾサッカロミセスボンべ（Schizosaccharomyces pombe)等の酵母、 Sf9や Sf 21等の昆虫細胞、あるいはサル腎由来細胞（COS細胞、 Vero細胞）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウス L細胞、ラット GH3細胞、ヒト FL細胞や 293 EBNA細胞、アフリカッメガエル卵母細胞等の動物細胞を例示できる。好ましくは動物細胞を用いる。

[0158] ベクター DNAの宿主細胞への導入は、自体公知の手段が応用でき、例えば成書に記載されて、る標準的な方法 (サムブルック（Sambrook)ら編、「モレキュラークロ一-ング，ァラボラトリーマ-ユアル第 2版」、 1989年、コールドスプリングハーバ一ラボラトリー）により実施できる。より好ましい方法として、遺伝子の安定性を考慮するならば染色体内へのインテグレート法が挙げられるが、簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系を使用できる。具体的な方法として、リン酸カルシウムトランスフエクシヨン、 DEAE—デキストラン媒介トランスフエクシヨン、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフエクシヨン、エレクト口ポレーシヨン、形質導入、スクレープ負荷 (scrape loading)、バリスティック導入 (ballistic introduction)および感染等が挙げられる。

[0159] 動物細胞を宿主とする場合は、組換えベクターが該細胞中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、 RNAスプライス部位、目的遺伝子、ポリアデニルイ匕部位、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、所望により複製起点が含まれていてもよい。プロモーターとして、 SR aプロモーター、 SV40プロモーター、 LTR プロモーター、 CMVプロモーター等を用いることができ、また、サイトメガロウイノレスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもょ、。動物細胞への組換えベクターの導入方法として、好ましくは例えば、エレクト口ポレーシヨン法、リン酸カルシウム法、リポフエクシヨン法等を例示できる。

[0160] 原核生物を宿主とする場合は、組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、目的遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。

[0161] 細菌を宿主として用いる場合、プロモーターとして、大腸菌等の宿主中で発現できるものであれば特に限定されず、いずれを用いてもよい。例えば、 trpプロモーター、 1 acプロモーター、 PLプロモーター、 PRプロモーター等の、大月募菌ゃファージに由来するプロモーターが例示できる。 tacプロモーター等の人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への糸且換えベクターの導入方法は、細菌に DNAを導入する方法であれば特に限定されない。好ましくは例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクト口ポレーシヨン法等を例示できる。

[0162] 酵母を宿主とする場合、プロモーターとして、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、いずれを用いてもよい。例えば、 gallプロモーター、 gallOプロモータ一、ヒートショック蛋白質プロモーター、 MF a 1プロモーター、 PH05プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプロモーター、 AOX1プロモーター等が例示できる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母に DNAを導入する方法であれば特に限定されず、好ましくは例えば、エレクト口ポレーシヨン法、スフエロプラスト法、酢酸リチウム法等を例示できる。

[0163] 昆虫細胞を宿主とする場合は、組換えベクターの導入方法として、好ましくは例えば、リン酸カルシウム法、リポフエクシヨン法、エレクト口ポレーシヨン法等を例示できる [0164] 配列表の配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAを含むベクター DNAをトランスフエクシヨンして得られた形質転換体として、具体的には、 HA— ph01207 # 1 0— 6細胞株が挙げられる。 HA— ph01207 # 10— 6細胞株は、配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAの ORFのうち、シグナル配列（配列番号 2に記載のアミノ酸配列の N末端より 20アミノ酸残基)をコードすると予測される部分を除いた塩基配列で表される DNAを N末端 HA— tag融合蛋白質として発現させるベクターを、 CH O—Kl細胞株にトランスフエクシヨンすることにより榭立した細胞株である。 HA-ph 01207 # 10— 6細胞株は、該 N末端 HA— tag融合蛋白質を安定的に発現している。本細胞株の具体的な作製方法は、実施例 2に詳述する。

[0165] HA—ph01207 # 10— 6細胞株は、受託番号 FERM BP— 10101号として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター (日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6)に平成 16年 8月 19日付けで寄託した。本細胞株の生存は、前記寄託センターにおいて平成 16年 9月 22日に実施された試験により確認されている。

[0166] (蛋白質の製造方法）

本発明にお、て用いる蛋白質の取得は、例えば本蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列情報に基づ、て一般的遺伝子工学的手法 (サムブルック（Sambrook)ら編、「モレキュラークロー-ング，ァラボラトリーマ-ユアル第 2版」、 1989年、コールドスプリングノヽーバーラボラトリー；村松正實編、「ラボマ-ユアル遺伝子工学」、 1988 年、丸善株式会社；ウルマー（Ulmer, K. M. )、「サイエンス（Science)」、 1983年、第 219卷、 p. 666— 671 ;エーノレリツヒ（Ehrlich, H. A.；)編、「PCRテクノロジー， DNA増幅の原理と応用」、 1989年、ストックトンプレス等を参照）により実施できる。例えば、本蛋白質をコードする遺伝子の発現が確認されている各種の細胞や組織、またはこれらに由来する培養細胞、例えばヒトの脳組織から常法に従って cDNAライブラリーを調製し、該遺伝子に特有の適当なプライマーを用いて該遺伝子を増幅し、得られた遺伝子を公知の遺伝子工学的手法により発現誘導することにより取得できる。

[0167] 具体的には例えば、上記 DNAを含むベクター DNAをトランスフエクシヨンした形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から目的とする蛋白質を回収することにより本蛋白質を製造できる。形質転換体の培養は、各々の宿主に最適な自体公知の培養条件および培養方法で実施できる。培養は、形質転換体により発現される本蛋白質自体またはその機能を指標にして実施できる。あるいは、宿主中または宿主外に産生された本蛋白質自体またはその蛋白質量を指標にして培養してもよぐ培地中の形質転換体量を指標にして継代培養またはバッチ培養を行ってもよい。

[0168] 目的とする蛋白質が形質転換体の細胞内あるいは細胞膜上に発現する場合には、形質転換体を破砕して目的とする蛋白質を抽出する。また、目的とする蛋白質が形質転換体外に分泌される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離処理等により形質転換体を除去した培養液を用いる。

[0169] 本発明において用いる蛋白質はまた、一般的な化学合成法により製造できる。例えば、蛋白質の化学合成方法として、固相合成方法や液相合成方法等が知られているがいずれを用いることもできる。このような蛋白質合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づ!、て、各アミノ酸を 1個ずつ逐次結合させて鎖を延長させて!、く、わゆるステップワイズェロンゲーシヨン法と、アミノ酸数個力もなるフラグメントを予め合成し、次、で各フラグメントをカップリング反応させるフラグメントコンデンセーシヨン法とを包含し、本蛋白質の合成は、そのいずれによっても実施できる。上記蛋白質合成において用いられる縮合法も、常法に従うことができ、例えば、アジド法、混合酸無水物法、 DCC法、活性エステル法、酸化還元法、 DPPA (ジフヱニルホスホリルアジド）法、 DCC +添カ卩物（1—ヒドロキシベンゾトリァゾール、 N—ヒドロキシサクシンアミド、 N—ヒドロキシ一 5—ノルボルネン一 2, 3—ジカルボキシイミド等）法、ウッドワード法等を例示できる。化学合成により得られた蛋白質は、さらに上記のような慣用の各種精製方法に従って、適宜精製を実施できる。

[0170] 本発明において用いる蛋白質は適当なぺプチダーゼを用、て切断することにより断片化することができ、その結果、本蛋白質の断片が取得できる。

[0171] 蛋白質は、所望により、その物理的性質、化学的性質等を利用した各種分離操作方法により精製および Zまたは分離できる。分離および Zまたは精製は、本蛋白質の機能を指標にして実施できる。分離操作方法として、例えば硫酸アンモ-ゥム沈殿、限外ろ過、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィユティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、透析法等を単独でまたは適宜組合せて使用できる。好ましくは、本蛋白質のアミノ酸配列情報に基づき、これらに対する特異的抗体を作成し、該抗体を用いて特異的に吸着する方法、例えば該抗体を結合させたカラムを利用するァフィ-ティクロマトグラフィーを用いることが推奨される。

[0172] (抗体）

本発明において用いる蛋白質またはその断片を抗原として用いることにより、該蛋白質に対する抗体を作製できる。抗原として用いる蛋白質またはその断片は、少なくとも 8個、好ましくは少なくとも 10個、より好ましくは少なくとも 12個、さらに好ましくは 1 5個以上のアミノ酸で構成される。本発明にお、て用いる蛋白質および Zまたはその断片に特異的な抗体を作製するためには、該蛋白質またはその断片に固有なァミノ酸配列で表される領域を用いることが好ましい。この領域のアミノ酸配列は、必ずしも本発明にお、て用いる蛋白質またはその断片のものと相同または同一である必要はなぐその立体構造上の外部への露出部位が好ましぐ露出部位のアミノ酸配列が一次構造上で不連続であっても、該露出部位にっ、て連続的なアミノ酸配列であればよい。抗体は免疫学的に本発明において用いる蛋白質および Zまたはその断片を特異的に結合または認識する限り特に限定されない。この結合または認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応によって決定できる。

[0173] 抗体の産生には、自体公知の抗体作製法を利用できる。例えば、抗原をアジュバントの存在下または非存在下で、単独でまたは担体に結合して動物に投与し、体液性応答および Zまたは細胞性応答等の免疫誘導を行うことにより抗体が得られる。担体はそれ自体が宿主に対して有害作用を示さずかつ抗原性を増強せしめるものであれば特に限定されず、例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミンおよびキーホールリンペットへモシァニン等が例示できる。アジュバントは、フロイント完全アジュバント (FCA)、フロイント不完全アジュバント（FIA)、 Ribi (MPL)、 Ribi (TDM)、 Ribi (M +丁0]^)、百日咳ヮクチン（80 (16 611& pertussis vaccine)、ムラミルジぺプチド（MDP)、アルミニウムアジュバント（ALUM)、およびこれらの組み合わせが例示できる。免疫される動物は、マウス、ラット、ゥサギ、ャギ、ゥマ等が好適に用いられる。

[0174] ポリクローナル抗体は、抗原を投与された動物の血清から自体公知の抗体回収法によって取得できる。好ま、抗体回収手段として免疫ァフィ二ティクロマトグラフィー法が挙げられる。

[0175] モノクローナル抗体は、抗原を投与された動物から抗体産生細胞 (例えば、脾臓またはリンパ節由来のリンパ球)を回収し、自体公知の永久増殖性細胞 (例えば、 P3- X63— Ag8株等のミエローマ株）を用いた形質転換手段を導入することにより生産できる。例えば、抗体産生細胞と永久増殖性細胞とを自体公知の方法で融合させてハイブリドーマを作製してこれをクローンィ匕し、本発明において用いる蛋白質を特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマを選別し、該ハイブリドーマの培養液から抗体を回収する。

[0176] 本発明において用いる蛋白質を認識し結合し得るポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、本蛋白質の精製用抗体、試薬または標識マーカー等として利用できる。特に本蛋白質の機能を阻害する抗体、あるいは本蛋白質に結合して本蛋白質のリガンド様作用を示す抗体は、本蛋白質の機能調節に使用できる。これら抗体は、本蛋白質およびその機能の異常に起因する各種疾患の解明、防止、改善および Z または治療のために有用である。

[0177] (膜蛋白質受容体の機能）

本発明において用いる蛋白質は、膜蛋白質受容体として機能する蛋白質であり、動物細胞において発現させたときに CCK 8S (配列番号 14)による細胞応答を誘発することができた。すなわち、 CCK— 8S (配列番号 14)は本蛋白質力もなる膜蛋白質受容体のリガンドの 1つである。以下、本蛋白質からなる膜蛋白質受容体を本発明に係る膜蛋白質受容体と称することがある。

[0178] 本発明において用いる蛋白質を発現させた動物細胞にお、て CCK -8S (配列番号 14)により惹き起こされた細胞応答は、具体的には、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAを安定的に発現させた上記 HA— ph01207 # 10— 6 細胞株において観察された。より具体的には、 HA— ph01207 # 10— 6細胞株において、 CCK 8S (配列番号 14)の作用により細胞内カルシウム濃度の上昇が認められた（実施例 5参照）。 InMの CCK— 8S (配列番号 14)による該細胞株における細胞内カルシウム濃度の上昇の程度は、ポジティブコントロールであるカルシウムィオノファ A23187によるものとほぼ同等であった。本 DNAを発現させていない CHO— K 1細株胞では、 CCK 8S (配列番号 14)によるこのような細胞内カルシウム濃度の上昇は認められなかった。一方、 HA— ph01207 # 10— 6細胞株は、 CCK— 8S ( 配列番号 14)と同じアミノ酸配列で表される CCKオタタペプチドであっても C末端から 7番目のチロシン残基が硫酸化されてヽな、ペプチド（CCK 8 Nonsulfated f orm、以下、 CCK— 8NSと称する）に対しては応答しなかった。また、 CCK— 8S (配列番号 14)の C末端力も 4番目までのアミノ酸残基力なるテトラペプチド (CCK— 4) に対しても応答しなかった。具体的には、 InMの CCK—8NSまたは InMの CCK 4による細胞内カルシウム濃度の上昇は認められなかった。これらから、 HA-phOl 207 # 10— 6細胞株は、 CCK— 8S (配列番号 14)に対して特異的に応答し、膜蛋白質受容体として機能することが判明した。また、 HA— ph01207 # 10— 6細胞株力 CCK—8S (配列番号 14)に応答したが CCK—8NSには応答しなかったことから、 CCK 8S (配列番号 14)のリガンド作用には、 CCK 8S (配列番号 14)のアミノ酸配列の C末端から 7番目のチロシン残基が硫酸化されていることが重要であると発明者らは考えている。

[0179] CCK-8S (配列番号 14)による細胞応答の惹起はまた、配列番号 15に記載の塩基配列で表される DNA、配列番号 17に記載の塩基配列で表される DNA、または配列番号 19に記載の塩基配列で表される DNAを発現させた細胞のいずれにおいても観察された。より具体的には、これら細胞において、 InMの CCK— 8S (配列番号 14)の作用により細胞内カルシウム濃度の上昇が認められた (実施例 8参照)。これに対して、配列番号 15に記載の塩基配列で表される DNA、配列番号 17に記載の塩基配列で表される DNA、または配列番号 19に記載の塩基配列で表される DN Aを発現させていない CHO— K1細株胞では、 CCK—8S (配列番号 14)によるこのような細胞内カルシウム濃度の上昇は認められな力つた。

[0180] 配列番号 1、 15、 17および 19に記載の塩基配列から選ばれるいずれか 1の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質は、そのアミノ酸配列において N末端細胞外領域の TSP— Iドメインのリピート数が異なる力該ドメイン以外のアミノ酸配列はほぼ同一である（図 1— B)。配列番号 1、 15、 17および 19に記載の塩基配列力も選ばれる!/ヽずれか 1の塩基配列で表される DNAを発現させた細胞の!/ヽずれにお、ても CCK 8S (配列番号 14)による細胞応答が惹起された (実施例 5、実施例 8および実施例 9)。したがって、配列番号 1、 15、 17および 19に記載の塩基配列から選ばれるいずれ力 1の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質と CCK 8Sとの結合および該結合により生じる細胞内シグナル伝達には、 TSP— Iドメインは大きく関与して、な、と発明者らは考えて！/、る。

[0181] CCK—8S (配列番号 14)が InMという低濃度で、 HA— ph01207 # 10— 6細胞株、および配列番号 15、配列番号 17または配列番号 19に記載の塩基配列で表される DNAを発現させた細胞の細胞応答を惹き起こしたことから、 CCK-8S (配列番号 14)は生体内で実際に、該 DNAによりコードされる蛋白質を介して細胞応答を惹き起こしていると考えられる。つまり、 CCK— 8S (配列番号 14)は、 GPCRと予想された本発明に係る機能性膜蛋白質受容体の生体内リガンドの 1つであると発明者らは考えている。また、本膜蛋白質受容体は、アフリカッメガエル卵母細胞において、 He La細胞培養上清をリガンド供給源として用いたときに膜電位の変化といった細胞応答を示した。

[0182] 本発明に係る膜蛋白質受容体のリガンドの範囲には、 CCK-8S (配列番号 14)以外に、 CCK 8S (配列番号 14)のアミノ酸配列において、 1個〜数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入といった変異を有するアミノ酸配列力もなり、かつ CCK— 8Sと同質の機能を有するペプチドが含まれる。「CCK— 8Sと同質の機能」とは、本発明に係る膜蛋白質受容体の生物学的機能を誘導する機能、より具体的には、本膜蛋白質受容体を発現している細胞において、細胞内カルシウム濃度の上昇や膜電位の変化等の細胞応答を惹き起こす機能をいう。 CCK-8S (配列番号 14)にお V、て C末端から 7番目のチロシン残基が硫酸ィ匕されて、ることが、 CCK-8S (配列番号 14)のリガンド作用に重要であると考えられることから、本膜蛋白質受容体のリガンドは、該硫酸化されたチロシン残基が保存されていることが好ましい。変異を有する蛋白質は、天然において例えば突然変異や翻訳後の修飾等により生じたものであつてよぐまた天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して得たものであってもよい。変異を導入する手段は自体公知であり、上述の方法を利用できる。当該蛋白質の基本的な性質 (物性、機能、生理活性または免疫学的活性等)を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸 (極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。また、 CCK— 8S (配列番号 14)、または CCK -8S (配列番号 14)のアミノ酸配列において 1個〜数個の変異を有するアミノ酸配列力もなりかつ CCK—8Sと同質の機能を有するペプチドを含むペプチドも、本膜蛋白質受容体のリガンドの範囲に含まれる。このようなペプチドにおいて、じじ1^ 83のじ末端から 7番目に存在する硫酸ィ匕チ口シン残基が保有されていることが好ましい。

[0183] CCKの組織発現は、脳組織、特に大脳皮質、海馬、扁桃体や視床下部に多く認められる (表 3参照)。

[0184] 本発明において用いる蛋白質をコードする DNAの組織発現は、具体的には、大脳皮質、海馬および扁桃体で著しく強く認められることを発明者らは見出した (実施例 10および表 3参照参照)。本発明にお、て用いる蛋白質をコードする DNAと CC Kの発現分布が一致することからも、本膜蛋白質受容体のリガンドが CCK、例えば C CK 8S (配列番号 14)であると発明者らは考えている。

[0185] 本発明に係る膜蛋白質受容体のリガンドの 1つ力上記のように CCK—8S (配列番号 14)であることから、 CCK—8S (配列番号 14)が関与すると考えられている記憶の保持といった神経機能に、本発明に係る膜蛋白質受容体が関与していると発明者らは考えている。 CCK-8S (配列番号 14)の量および Zまたは機能の低下や消失により、記憶を意識レベルに呼び戻して行動に移すことが困難になる等の病的症状が現れる。このような神経機能に対する CCK—8S (配列番号 14)の作用は、本膜蛋白質受容体を介していると発明者らは考えている。したがって、このような記憶機能の障害を伴う疾患や症状を、本膜蛋白質受容体のァゴ-ストにより緩和することができる。このような疾患として、記憶等の神経機能の障害を伴う疾患、具体的には例えば痴呆やアルッノヽイマ一病等が挙げられる。

[0186] これらから、これまでに CCKの関与が想定されて、る、不安、鎮痛、鎮静、摂食抑制、記憶、学習といった生理機能に、 CCK受容体として本膜蛋白質受容体が関与していると発明者らは考えている。さらに、 CCKは、消ィ匕器官で数々の作用を示すことが報告され、また満腹感を脳の-ユーロンに与える信号物質と考えられている。このこと力ら、 CCKのファミリーである CCK— 8Sも、脳の-ユーロンに満腹感を与える信号物質として作用すると発明者らは考えている。 CCK— 8Sの量的および機能的な低下は、満腹感の低下による肥満を惹き起こすと発明者らは考えている。このような肥満に、 CCK受容体として本膜蛋白質受容体が関与していると発明者らは考えている。また、 CCK—8Sを糖尿病患者に投与するとインスリン量の増加が促進され、食後のグルコース量の増加が抑制されたことが報告されている（ボー（BO A. )ら、「ザジャーナルォブクリニカルエンドクリノロジーアンドメタボリズム（The Journ al of Clinical Endocrinology & Metabolism)」、 2000年、第 85卷、 p. 10 43— 1048)。このことから、本機能的膜蛋白質受容体が糖尿病と関連している可能性がある。したがって、本膜蛋白質受容体に対するァゴニスト、アンタゴニストは、このような生理機能の障害を伴う疾患や症状を緩和することができる。すなわち、本膜蛋白質受容体に対するァゴ-スト、アンタゴニストは、抗不安薬、鎮痛剤、あるいは様々な中枢神経系の異常により惹き起こされる疾患に対する予防および Zまたは治療剤の有効成分として使用できる。このような疾患として、具体的には、痴呆、パーキンソン病、パニック症候群、薬物依存症、肥満、糖尿病等の疾患が挙げられる。

[0187] より具体的には、本膜蛋白質受容体は、該受容体蛋白質をコードする DNAの発現から、神経性疾患、例えばうつ病に関与すると発明者らは考えている。

[0188] 「うつ病」は、抑うつ症とも呼ばれ、悲哀感等の感情障害、思考制止等の思考障害、意欲低下、行動抑制、睡眠障害、抑うつ状態の日内変動等を主症状とする情動性精神障害である。うつ病の原因は、脳内の神経伝達物質の減少であるといわれている。また、その発症には、生物学的な要因、心理的な要因、社会 ·環境的な要因が関わつていると考えられている。

[0189] 「抑うつ状態」とは、うつ病において一般的に認められる症状、例えば悲哀感等の感情障害、思考制止等の思考障害、意欲低下、行動抑制、睡眠障害等を意味する。 [0190] 本発明において用いる蛋白質をコードする DNAの発現は、上記のように、大脳皮質、海馬、扁桃体で強い発現が認められた (実施例 10および表 3参照参照)。扁桃体はうつ病に関与するという報告がある（ウェイレン (Whalen P. J. )ら、「セミナーズインタリ-力ノレニューロサイカイアトリー (Seminars in Clinical Neuropsych iatry)」、 2002年、第 7卷、第 4号、 p. 234— 242 ;ドレべッッ（Drevets W. C. )ら、「ェンノレズォブザニューヨークアカデミーォブサイェンシズ (Annals of the New York Academy of Sciences)」、 2003年、第 985卷、 p. 420— 44 4 ;ネスラー（Nestler E. J. )ら、「ニューロン（Neuron)」、 2002年、第 34卷、第 1号、 p. 13— 25)。

[0191] BAI2遺伝子のノックアウトマウスを用いた尾懸垂試験において、該マウスが抗うつ様の表現型を示すことが観察された (実施例 11参照)。 BAI2遺伝子は、本発明において用いる蛋白質をコードする DNAのスプライシングバリアントである。尾懸垂試験は、うつ病の表現型を調べる試験法として一般的に用いられている手法であり、抗ぅつ薬の評価等、うつ病との関連性を調べる試験系として用いられている (ステル (Ste ru L. )ら、「サイコファーマコロジー (Psychopharmacology (Berl) )」、 1985年、第 85卷、第 3号、 p. 367— 370 ;クラウリー（Crowley J. J. )ら、「ファーマコロジーノィオケストリーアンドビヘイビア (Pharmacological Biochemical Behavio r」、 2004年、第 78卷、第 2号、 p. 269— 274 ; -—ルセン（Nielsen D. M. )ら、「ョ一口ピアンジャーナノレォブファーマコロジー (European Journal of Phar macology)」、 2004年、第 499卷、第 1—2号、 p. 135— 146 )。

[0192] BAI2遺伝子のノックアウトマウスでは、尾懸垂試験において抗うつ様の表現型が認められた以外には、その他の行動学的検査において行動活性の上昇は観察されなかった。その他、本ノックアウトマウスは、生理学的検査、病理学的検査、解剖学的検査等多くの検査項目において野生型マウスと比較して有意な差は観察されなかつた。

[0193] BAI2遺伝子のノックアウトマウスでは、 BAI2遺伝子が破壊されているため、 BAI2 遺伝子およびそのスプライシングバリアントは発現されない。すなわち、 BAI2遺伝子およびそのスプライシングバリアントの遺伝子産物が欠損したマウスにおいて、抗うつ状態が誘導された。これらの結果から、 BAI2遺伝子およびそのスプライシングバリアントの遺伝子産物がうつ病に関与して、ると発明者らは考えて、る。

[0194] ヒトにおいても、 BAI2遺伝子およびそのスプライシングバリアント、すなわち本発明において用いる蛋白質をコードする DNAおよびそのスプライシングバリアントがうつ病に関与して、ると発明者らは考えて、る。

[0195] 一方、 CCK受容体として、 CCK—A受容体 (CCK1受容体とも呼称される）および CCK—B受容体（CCK2受容体とも呼称される）の 2種類の GPCRが報告されている (へランツ（Herranz, R. )、「メディカルリサーチレビューズ（Medicinal Resear ch Reviews)」、 2003年、第 23卷、第 5号、 p. 559— 605、レビュー）。これらはいずれもクラス A (ロドプシン類; rhodopsin like)に属する GPCRである。

[0196] 本膜蛋白質受容体は、 CCK A受容体および CCK B受容体と比較して、リガンド親和性および発現分布が異なることから、 CCK— A受容体および CCK—B受容体とは異なる生理作用を担っていると発明者らは考えている。具体的には、本膜蛋白質受容体は、 CCK— A受容体とリガンド親和性が類似しているが発現分布が異なり、 C CK—B受容体と発現分布が類似しているがリガンド親和性が異なる。

[0197] 本発明にお、て用いる蛋白質をコードする DNAの発現が脳糸且織で特異的に高ヽことから、該蛋白質からなる本膜蛋白質受容体は、脳組織における発現が低い CCK A受容体と比較して、 CCKの中枢神経系での作用に関与していると発明者らは考えている。また、脳組織で発現している CCK—B受容体と比較して、リガンド親和性が異なることから、本発明に係る膜蛋白質受容体は脳内で CCK B受容体と異なる生理活性を示すと発明者らは考えている。

[0198] また、本膜蛋白質受容体は、上記のように、その遺伝子のノックアウトマウスにおいて抗うつ状態が観察された。それに対して、 CCK— A受容体遺伝子のノックアウトマウス、 CCK B受容体遺伝子のノックアウトマウス、並びに CCK A受容体遺伝子および CCK B受容体遺伝子のダブルノックアウトマウスの表現型が報告されており、 CCK—B受容体遺伝子のノックアウトマウスにぉ、て行動活性が亢進して!/、ると!/ヽう報告があるが、これらノックアウトマウスとうつ病との関連を示す報告はない。

[0199] 本膜蛋白質受容体、 CCK A受容体および CCK B受容体はいずれも CCKに応答する受容体である力組織発現分布およびノックアウトマウスの表現型から、これら受容体の中で本膜蛋白質受容体のみがうつ病と関連する膜蛋白質受容体であると発明者らは考え、さらに、 CCK— A受容体は脳組織においてはその発現が低いため、脳組織における CCKの生理活性には関与していないと考えられる。 CCK— B受容体は脳組織において発現しているが、 CCK B受容体蛋白質をコードする遺伝子のノックアウトマウスの表現型とうつ病との関連を示唆する報告はない。

[0200] CCK A受容体は主に消ィ匕器官で強く発現しており、脳組織では一部で発現が認められる。 CCK— A受容体のリガンド親和性については、 CCK—8S > >CCK— 8NS、ガストリン >CCK— 4の順に強い。 CCK— A受容体は CCK— 8S (配列番号 1 4)に強く応答するが、 CCK A受容体のリガンドに対する特異性は認められない。

[0201] 一方、 CCK B受容体は消ィ匕器官に加えて脳組織でも広く発現している。 CCK- B受容体のリガンド親和性については CCK— 8S≥CCK— 8NS、ガストリン〉 CCK 4の順で強ぐ CCK A受容体よりも選択性が低い。

[0202] CCK— A受容体のノックアウトマウスの表現型については、胆石、脾酵素分泌および胆嚢収縮等の異常といった消化器系における機能異常の他には、体温調節等のホメォスタシスの異常（ノモト（Nomoto S. )ら、「アメリカンジャーナルォブフィジオロジーレギユレイトリーインテグレイティブアンドコンパラティブフイジォロン ~~ American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology)」、 2004年、第 287卷、第 3号、 R556— 61)、行動活性の上昇（ミヤサカ（Miyasaka K. )ら、「ニューロサイエンスレターズ（Neuroscie nce Letters)」、 2002年、第 335卷、第 2号、 p. 115— 118)、および食欲調節の異常（ビ（Bi S. )ら、「ニューロぺプタイズ（Neuropeptides)」、 2002年、第 36卷、第 2— 3号、 p. 171— 181)が報告されている。

[0203] CCK B受容体のノックアウトマウスの表現型については、胃酸分泌異常、胃粘膜の形成異常といった消ィ匕器系の異常の他、不安、痛み、記憶等、中枢系の表現型に関する報告等、数多くの報告がある（ノーブル (Noble F. )ら、「ニューロぺプタイズ ( Neuropeptides)」、 2002年、第 36卷、第 2— 3号、 p. 157—170)。より具体的には、不安行動の抑制（ホリノゥチ（Horinouchi Y. )ら、「ョ一口ビアンニューロサイコファーマコロジー (European Neuropsychopharmacology)、 2004年、第 14 卷、第 2号、 p. 157— 161)、不安行動の亢進（ミヤサカ（Miyasaka K. )ら、「-ュ一口サイエンスレターズ（Neuroscience Letters)」、 2002年、第 335卷、第 2号、p. 115— 118)、行動活性の上昇や記憶障害 (ダウジ (Dauge V. )ら、「ニューロサイコファーマコロジー（Neuropsychopharmacology；)、 2001年、第 25卷、第 5号、 p. 690— 698)、痛覚の異常およびォピオイドシステムとの相関（クリコフ (Kurrikof f K. )ら、「ザョ一口ビアンジャーナノレォブニューロサイエンス（The Europe an Journal of Neuroscience)、 2004年、第 20卷、第 6号、 p. 1577- 1586) 等が報告されている。

[0204] また、 CCK A受容体および CCK B受容体のダブルノックアウトマウスの表現系についても報告されている力ダブルノックアウトマウスに特徴的な表現型は報告されていない（ミヤサカ（Miyasaka K. )ら、「ニューロサイエンスレターズ（Neuroscie nce Letters)」、 2002年、第 335卷、第 2号、 p. 115— 118)。

[0205] 本発明において用いる蛋白質をコードする DNA、すなわち配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAおよび該 DNAのスプライシングバリアントは、うつ病に関与していると発明者らは考えている。例えば、配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAまたは該 DNAのスプライシングバリアントの発現が増加するといつた異常により、抑うつ状態およびうつ病が誘導されると発明者らは考えている。

[0206] 配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAおよび該 DNAのスプライシングバリアントがうつ病に関与していると考えられることから、該 DNAによりコードされる蛋白質と該蛋白質のスプライシングバリアントとからなる群力選ばれるいずれか 1の蛋白質の機能および Zまたは発現を阻害することにより、抑うつ状態を改善し、うつ病を回復させることができる。

[0207] 本発明は、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質と該蛋白質のスプライシングバリアントとからなる群力も選ばれるいずれか 1の蛋白質の機能および Zまたは発現を阻害することを手段とする抑うつ状態の改善方法に関する。

[0208] 「抑うつ状態の改善」とは、抑うつ状態を改善する方法を実施する前と比較して、抑うつ状態が軽減または回復されることをいう。例えば、感情障害、思考障害、意欲低下、行動抑制、睡眠障害等が軽減または回復することをいう。

[0209] 本発明において用いる蛋白質の機能および Zまたは発現を阻害することは、例えば、本蛋白質の機能および Zまたは発現を阻害する化合物により実施できる。

[0210] 本発明書において、「本発明において用いる蛋白質の機能を阻害する化合物」と「本蛋白質のアンタゴ-スト」という用語は交換可能に使用される。本発明書において、「アンタゴニスト」とは、本発明において用いる蛋白質の機能を阻害する化合物であればよぐ例えば、受容体に結合してァゴニストの効果を阻害するがそれ自体は受容体と結合してもァゴニストが示す効果を発揮できな、化合物、リガンドの受容体への結合を阻害する化合物、または本蛋白質に対してインバースァゴニスト (逆作動薬)として作用する化合物が挙げられる。近年、 GPCRのような受容体がリガンドの作用とは関係なく活性型カゝら不活性型に、若しくは不活性型カゝら活性型に変換されることが知られている。ここで、 GPCRのような受容体がリガンドの作用とは関係なく不活性型力も活性型に変換される工程を阻害する物質は、インバースァゴニストと呼ばれている。本蛋白質のインバースァゴ-ストも本発明において用いる蛋白質の機能を阻害すると考えられる。

[0211] 本発明において用いる蛋白質のアンタゴニストは、本蛋白質力もなる膜蛋白質受容体に結合してリガンドの効果を阻害する。本蛋白質をコードする DNAの発現の増加といった異常により抑うつ状態およびうつ病が誘導されると考えられることから、本蛋白質のアンタゴ-ストにより本蛋白質力なる受容体へのリガンドの作用を阻害すれば、抑うつ状態およびうつ病を改善できると発明者らは考えている。

[0212] このように、本発明において用いる蛋白質のアンタゴニストは、抗うつ作用を有すると考える。「抗うつ作用」とは、抑うつ状態を改善する効果を意味する。

[0213] 本発明において用いる蛋白質の機能を阻害する化合物、例えば本蛋白質のアンタゴニストは、好ましくは、本蛋白質力もなる膜蛋白質受容体において CCK—8Sにより惹き起こされる機能を阻害するアンタゴニストであることが好ましい。また、本アンタゴ二ストは、本蛋白質力もなる膜蛋白質受容体において CCK—8Sと同質の機能を有するペプチドにより惹き起こされる機能を阻害するアンタゴ-ストであることができる。 [0214] 本発明において用いる蛋白質のアンタゴニストは、後述する化合物の同定方法により取得できる。本蛋白質のアンタゴニストとして、本蛋白質からなる膜蛋白質受容体のリガンドが蛋白質であるとき、該リガンドの部分ペプチドであって、該膜蛋白質受容体とは結合するがリガンドが示す効果を発揮できない物質を使用できる。該膜蛋白質受容体のリガンドの部分ペプチドは、該リガンドを同定した後、そのアミノ酸配列から数々の部分ペプチドを設計して合成し、後述する化合物の同定方法により、合成した部分ペプチド力もアンタゴ-ストとしての活性を有するものを選択することにより取得できる。

[0215] 本発明において用いる蛋白質のアンタゴニストとして、後述する化合物の同定方法により同定した 3種類の化合物 (式 (I)、 (II)および (ΠΙ) )が例示できる（実施例 12参照)。

[0216] 式（I) :

[化 1]

[化 2]

[0219] また、本発明は、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質と該蛋白質のスプライシングバリアントとからなる群力も選ばれるいずれか 1の蛋白質の機能および Zまたは発現を阻害する化合物を含む抑うつ状態の改善剤を提供することができる。以下、抑うつ状態の改善剤を抗うつ剤と称することがある。

[0220] 「抑うつ状態の改善剤」あるいは「抗うつ剤」は、抑うつ状態を改善する効果を有する薬剤を意味する。

[0221] (化合物の同定方法）

本発明において用いる蛋白質の機能を阻害する化合物の同定方法は、本蛋白質、 DNA、組換えベクター、形質転換体または抗体のうち少なくともいずれか 1つを用いて、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して実施できる。本同定方法により、該蛋白質の立体構造に基づくドラッグデザインによる拮抗剤の選別、蛋白質合成系を利用した遺伝子レベルでの発現の阻害剤または促進剤の選別、または抗体を利用した抗体認識物質の選別等が実施できる。

[0222] 本発明において用いる蛋白質の機能を阻害する化合物の同定方法は、抗うつ作用を有する化合物の同定方法として使用できる。より好ましくは、本同定方法を、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質と該蛋白質のスプライシングバリアントとからなる群力も選ばれるいずれか 1の蛋白質のァンタゴ二ストである抗うつ作用を有する化合物の同定方法として使用できる。本ィ匕合物が抗うつ作用を示す力否かの確認は、一般的に用いられている抗うつ作用の試験方法、例えばマウスを用いた尾懸垂試験や強制水泳試験を用いて実施できる。具体的には、マウスに本ィ匕合物を投与し、尾懸垂試験において、化合物を投与していないマウスと比較して、無動時間が短縮されれば、本化合物が抗うつ作用を有すると判定できる。このような化合物は、抗うつ剤として有用である。

[0223] 本発明において用いる蛋白質の機能を阻害する化合物の同定は、具体的には例えば、本蛋白質の機能を測定することのできる実験系を用いて実施できる。本実験系において、該蛋白質と調べようとする化合物 (以下、被検化合物と称する）の相互作用を可能にする条件下で、該蛋白質と被検化合物とを共存させてその機能を測定し、ついで、被検化合物の非共存下での測定結果との比較における蛋白質の機能の変化 (低減、増カロ、消失または出現)を検出することにより、本同定方法を実施できる。被検化合物を共存させた場合の本蛋白質の機能を、被検化合物を共存させなかつた場合の本蛋白質の機能と比較することにより、該被検化合物が本蛋白質の機能に及ぼす効果を判定できる。例えば、被検化合物を共存させた場合の本蛋白質の機能が、被検化合物を共存させな力つた場合の本蛋白質の機能と比較して減少した場合、該被検化合物には本蛋白質の機能を阻害する作用があると判定できる。

[0224] 本発明において用いる蛋白質の機能として、本蛋白質が膜蛋白質受容体として機能することから、リガンドとの結合、細胞内情報伝達機構の活性化、細胞応答の誘発が例示される。より具体的には、 CCK— 8S (配列番号 14)との結合や MAGUKファミリ一関連蛋白質との相互作用等が例示できる。

[0225] 本発明において用いる蛋白質と該蛋白質のリガンドとの結合を阻害する化合物の同定方法は、本蛋白質と該蛋白質のリガンドとを被検化合物の存在下および非存在下で反応させ、本蛋白質とリガンドとの結合を測定することにより実施できる。本同定方法に用いる蛋白質は、本蛋白質をコードする DNAを含む細胞の細胞膜に発現した蛋白質であり得る。該細胞は、本蛋白質をコードする DNA含むベクターをトランスフエクシヨンして得られた形質転換体であり得る。本蛋白質と該蛋白質のリガンドとの結合の測定は、一般的な医薬品スクリーニングシステムで用いられて、る様々な結合解析方法を利用して実施できる。例えば、リガンドと本蛋白質との結合反応を行い、本蛋白質とリガンドとの結合により形成される複合体と、結合していない遊離のリガンドおよび本蛋白質を分離し、該複合体をィムノブロッテイング等の公知の方法によつて検出することにより実施できる。また、例えば、リガンドと本蛋白質との結合反応を行い、その後、本蛋白質に結合したリガンドを、抗リガンド抗体を用いて測定することにより、結合の測定が実施できる。リガンドに結合した抗リガンド抗体は、 HRPやピオチン等で標識した二次抗体を用いて検出できる。あら力じめ HRPやピオチン等で標識ィ匕した抗リガンド抗体を用いて、本蛋白質に結合したリガンドを検出することもできる。あるいは、本蛋白質との結合反応に用いるリガンドとして、あら力じめ所望の標識物質で標識ィ匕したリガンドを用いて上記同定方法を行い、該標識物質を検出することにより、本蛋白質に結合したリガンドを測定できる。標識物質として、一般的な結合解析方法で用いられている物質がいずれも利用でき、 GST、 His -tag, Myc-tag 、 HA -tag, FLAG— tagまたは Xpress— tag等のタグペプチド類、あるいは蛍光色素等が例示できる。簡便には、放射性同位体元素が利用できる。

[0226] 本発明において用いる蛋白質と該蛋白質のリガンドとの結合を阻害する化合物の同定方法で得られた化合物は、本蛋白質が膜蛋白質受容体であることから、本膜蛋白質受容体の機能を阻害する化合物であり得る。

[0227] 本発明において用いる蛋白質と該蛋白質のリガンドとの結合を阻害し、本蛋白質からなる膜蛋白質受容体の機能を阻害する化合物は、該膜蛋白質受容体のアンタゴニストとして使用できる。該化合物が、本発明に係る膜蛋白質受容体の機能を阻害する化合物であるか否かは、該化合物の存在下および非存在下で、リガンドにより惹き起こされる本膜蛋白質受容体の機能の変化を測定することにより決定できる。化合物により本膜蛋白質受容体の機能変化が生じない場合は、該化合物は、本膜蛋白質受容体に結合するが該膜蛋白質受容体を介する細胞応答を誘導しない化合物である力または、リガンドに作用してリガンドと該膜蛋白質受容体の結合を阻害する化合物であると判定できる。それに対して、化合物による本膜蛋白質受容体の機能変化力リガンド、例えば CCK 8S (配列番号 14)により本膜蛋白質受容体に生じる機能変化と同質であれば、該化合物は、本膜蛋白質受容体に結合して該膜蛋白質受容体を介する細胞応答を誘導するァゴニストであると判定される。

[0228] 本発明において用いる蛋白質の機能の測定方法として、本蛋白質を発現させた形質転換体を用いた実験系におヽて、該形質転換体と被検化合物とを接触させた後に、または被検化合物の共存下で、該蛋白質に対するリガンドを作用させ、形質転換体に発生する細胞応答の変化を測定することを含む方法を例示できる。

[0229] 上記蛋白質の機能の測定方法は、本蛋白質の機能、例えば細胞内情報伝達機構の活性ィ匕ゃ細胞応答の誘発を阻害する化合物の同定方法の実施に利用できる。被検化合物の非存在下での測定結果との比較における機能の変化 (低減、増カロ、消失または出現)を検出することにより、本蛋白質の機能を阻害する化合物を選択できる。本蛋白質を発現させた形質転換体に発生する細胞応答の変化として、例えば細胞膜電位の変化や細胞内カルシウム濃度の変化等が挙げられる。被検化合物により、該形質転換体の細胞膜電位の変化が低減する、または細胞内カルシウム濃度が低減する等の変化が惹き起こされた場合、該被検化合物は、本蛋白質の機能を阻害すると判定できる。細胞膜電位の変化や細胞内カルシウム濃度の変化の測定は、周知の方法を用いて実施できる。また、本蛋白質の機能の測定を、 MAGUKファミリー関連蛋白質との相互作用を測定することにより実施できる MAGUKファミリー関連蛋白質との相互作用の変化や G蛋白質との結合変化の測定は、周知の方法を用、て実施できる。

[0230] 実際に、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAを含むベクターでトランスフクシヨンした細胞を用いて細胞応答を測定する実験系を用い、該細胞応答に対して阻害効果を示す化合物の同定を実施した (実施例 12参照)。本実験系においては、上記細胞に CCK—8Sを作用させて細胞応答を誘導し、細胞応答の測定は細胞内カルシウム濃度変化を測定することにより行った。被検化合物として、化合物ライブラリーであるソフトフォーカスジーピーシーアールターゲットダイレクティットフイブフリ ~~ (SoftFocus LrPCR Target― Directed Library^ BioFocus 社製)を用いた。その結果、上記細胞の CCK—8Sに対する細胞応答を阻害するィ匕合物が 3種類同定できた (上記式 (1)、（Π)および (III) )。これら化合物は、配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質のアンタゴニストとして作用していると発明者らは考えている。

[0231] この結果から、本蛋白質を発現させた形質転換体を用いた実験系、例えば該形質転換体を用いた細胞内カルシウム濃度変化測定系により、本蛋白質のリガンド、例えば CCK 8Sに対する応答を阻害するアンタゴニストを同定できると発明者らは考えている。

[0232] また、本発明において用いる蛋白質と MAGUKファミリー関連蛋白質との相互作用に影響を与え得る化合物の同定方法は、例えば、単離した本蛋白質と MAGUK ファミリー関連蛋白質とを用いて、公知の蛋白質結合解析方法により本蛋白質と MA GUKファミリー関連蛋白質との結合の検出を行うことにより実施できる。具体的には、例えば MAGUKファミリー関連蛋白質を遺伝子工学的手法により GST— tag融合蛋白質として発現させ、その後ダルタチオンセファロースに結合させ、これに結合する本蛋白質の量を、本蛋白質に対する抗体、例えば HRPや ALP等の酵素、放射性同位元素、蛍光色素またはピオチン等で標識した抗体を用いて定量できる。または、タグペプチドを融合した本蛋白質を用いれば、抗タグ抗体を用いて定量することもできる。勿論、本蛋白質を上記酵素、放射性同位元素、蛍光色素、ピオチン等で直接標識してもよい。あるいは、上記酵素、放射性同位元素、蛍光色素、ピオチン等で標識した二次抗体を用いてもょ、。あるいは本蛋白質をコードする DNAと MAGUKフアミリー関連蛋白質をコードする DNAとを適当な細胞を用いて共発現させ、プルダウン法により両者の結合を検出することにより、両者の相互作用を測定できる。 [0233] 本発明にお、て用いる蛋白質と MAGUKファミリー関連蛋白質との相互作用に影響する化合物の同定方法はまた、例えば、ツーハイブリッド (two— hybrid)法を用いて、本蛋白質と DNA結合蛋白質を融合蛋白質として発現するプラスミド、 MAGUK ファミリー関連蛋白質と転写活性化蛋白質を融合蛋白として発現するプラスミド、および適切なプロモーター遺伝子に接続した lacZ等レポーター遺伝子を含有するプラスミドを酵母や真核細胞等に導入し、被検化合物を共存させた場合のレポーター遺伝子の発現量を被検化合物非存在下でのレポーター遺伝子の発現量とを比較することにより実施できる。被検化合物を共存させた場合のレポーター遺伝子の発現量が被検化合物非存在下でのレポーター遺伝子の発現量と比較して減少した場合には、該被検化合物には本蛋白質と MAGUKファミリー関連蛋白質との結合を阻害する作用があると判定できる。一方、被検化合物を共存させた場合のレポーター遺伝子の発現量が被検化合物非存在下でのレポーター遺伝子の発現量と比較して増加した場合には、該被検化合物には本蛋白質と MAGUKファミリー関連蛋白質との結合を安定ィ匕する作用があると判定できる。

[0234] 本発明にお、て用いる蛋白質と MAGUKファミリー関連蛋白質との相互作用に影響する化合物の同定は、ビアコアシステム（BIACORE system)等の表面プラズモン共鳴センサーを用いて実施することもできる。

[0235] 本発明にお、て用いる蛋白質と MAGUKファミリー関連蛋白質との相互作用に影響する化合物の同定はまた、シンチレーシヨンプロキシミティアツセィ法（Scintillatio n proximity assay、 SPA)ゃ光 Λ¾ェ不ル ~~ (Fluorescence resona nce energy transfer、 FRET)を応用した方法を用いて実施できる。

[0236] 本発明に係る同定方法にぉ、て用いる MAGUKファミリー関連蛋白質として具体的には、 DLG2、 DLG3および DLG4や、 AIP1、 MAGI3を例示できる。 MAGUK ファミリー関連蛋白質は、本発明において用いる蛋白質との相互作用に影響がない限りにおいて、一部を欠損したものであってよぐあるいは別の蛋白質等の標識物質が付加されたものであってもょ、。

[0237] 本発明にお、て用いる蛋白質の発現を阻害する化合物の同定方法は、本 DNA、組換えベクター、形質転換体のうち少なくともいずれか 1つを用いて、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して実施できる。

[0238] 本発明において用いる蛋白質の発現を阻害する化合物の同定方法は、抗うつ作用を有する化合物の同定方法として使用できる。すなわち、本同定方法により得られる化合物は、抗うつ作用を有すると考えられるため、抗うつ剤として使用できる。

[0239] 本発明において用いる蛋白質の発現を阻害する化合物の同定方法は、該 DNAの発現を測定できる実験系にお、て、該 DNAと被検化合物とを共存させてその発現を測定し、ついで、被検化合物の非存在下での測定結果との比較における発現の変ィ匕 (低減または消失)を検出することにより実施できる。発現の測定は、 DNAによりコードされる蛋白質の直接的な検出により実施できるし、例えば発現の指標となるシグナルを実験系に導入して該シグナルを検出することにより実施できる。シグナルとしてゝ GST、 His -tag, Myc— tag、 HA -tag, FLAG -tag, Xpress— tag等のタグぺプチド類、あるいは蛍光色素等を使用できる。

[0240] 本発明において用いる蛋白質の発現を阻害する化合物の同定方法は、具体的には、該 DNAを含む発現ベクターをトランスフエクシヨンした形質転換体を用いて本蛋白質を発現させる実験系において、該形質転換体と被検化合物とを接触させた後に、発現された蛋白質を測定することによって実施できる。被検化合物の非共存下での測定結果との比較における発現の変化 (低減または消失)を検出することにより、本蛋白質の発現を阻害する化合物を選択できる。蛋白質の発現の有無または変化の検出は、公知の蛋白質検出法、例えばウェスタンブロッテイング等により実施できる。また、蛋白質の発現の有無または変化の検出は、発現される蛋白質の生物学的機能ゃ該蛋白質を介した細胞応答、例えばリガンドを作用させたときに発生する MAG UKファミリー関連蛋白質との相互作用、細胞膜電位の変化、細胞内カルシウム濃度の変化を指標〖こして実施できる。

[0241] 本発明にお、て用いる蛋白質の発現を阻害する化合物の同定方法はまた、例えば該 DNAを含む遺伝子のプロモーター領域の下流に、該 DNAの代わりにレポータ一遺伝子を連結したベクターを作成し、該ベクターを導入した細胞、例えば真核細胞等と被検化合物とを接触させ、レポーター遺伝子の発現の有無および変化を測定することにより実施できる。レポーター遺伝子として、レポーターアツセィで一般的に用いられている遺伝子を使用でき、例えば、ルシフェラーゼ、 13—ガラタトシダーゼまたはクロラムフエ-コールァセチルトランスフェラーゼ等の酵素活性を有する遺伝子を例示できる。レポーター遺伝子の発現の検出は、その遺伝子産物の活性、例えば、上記例示したレポーター遺伝子の場合は酵素活性を検出することにより実施できる

[0242] 上記同定方法に使用する実験系や測定系を利用することにより、本発明において用いる蛋白質の機能や発現を促進する化合物の同定方法を実施できる。例えば、本蛋白質と該蛋白質のリガンドとの結合を測定する実験系、本蛋白質の機能の測定方法、本蛋白質と MAGUKファミリー関連蛋白質との結合を測定する実験系を利用して、本蛋白質の機能を促進する化合物の同定方法を実施できる。また、本発明において用いる DNAの発現を測定できる実験系を利用して、本蛋白質の発現を促進する化合物の同定方法を実施できる。このような実験系や測定系において、被検化合物により本蛋白質の機能や発現が増加または発生した場合、該被検化合物は本蛋白質の機能や発現を促進すると判定できる。

[0243] また、上記同定方法に使用する実験系や測定系を利用することにより、本発明に係る膜蛋白質受容体のァゴニストの同定方法を実施できる。本発明に係る膜蛋白質受容体のァゴニストの同定方法として、例えば、本蛋白質を発現させた形質転換体を用いた実験系において、該形質転換体と被検化合物とを接触させた後に、または被検化合物の共存下で、形質転換体に発生する機能変化を測定することを含む方法を例示できる。被検化合物の非存在下での測定結果との比較における本膜蛋白質受容体機能の変化、例えば低減、増カロ、消失、出現等を検出することにより、本膜蛋白質受容体のァゴニストが選択できる。より好ましくは、本膜蛋白質受容体のリガンド、例えば CCK 8S (配列番号 14)による該膜蛋白質受容体の機能変化を測定し、該機能変化と比較することにより、ァゴニストが選択できる。ァゴ-ストは、リガンド、例えば CCK 8S (配列番号 14)により本膜蛋白質受容体に生じる機能変化と同質の機能変化を該膜蛋白質受容体にもたらすィ匕合物であることが好ましい。ァゴニストによる本膜蛋白質受容体に生じる機能変化は、リガンド、例えば CCK 8S (配列番号 1 4)により本膜蛋白質受容体に生じる機能変化と同質であればよぐ量的に差異があつてもよい。例えば、ァゴ-ストによる本膜蛋白質受容体に生じる機能変化がリガンド

、例えば CCK 8S (配列番号 14)により本膜蛋白質受容体に生じる機能変化より弱くてもよい。好ましくは、同等の機能変化を惹き起こすァゴ-ストを選択することが好ましい。本膜蛋白質受容体の機能変化は、形質転換体の該膜蛋白質受容体を介する細胞応答の変化を指標にして測定できる。したがって、リガンド、例えば CCK 8S ( 配列番号 14)により本膜蛋白質受容体に生じる機能変化と同質の機能変化として、例えば、形質転換体における該膜蛋白質受容体を介する細胞内カルシウム濃度の上昇が挙げられる。細胞内カルシウム濃度の変化の測定は、周知の方法を用いて実施できる（実施例 5参照)。その他、リガンド、例えば CCK—8S (配列番号 14)により本膜蛋白質受容体に生じる機能変化と同質の機能変化として、形質転換体における該膜蛋白質受容体を介する膜電位の変化が挙げられる。膜電位の変化の測定は、周知の方法を用いて実施できる（実施例 3参照)。リガンドは、リガンドを含む試料、または上記リガンドの同定方法により得たリガンド自身のいずれも使用できる。 CCK- 8S (配列番号 14)が、本蛋白質の生体内リガンドであると考えられることから、好ましくは CCK— 8S (配列番号 14)をリガンドとして用いることが好まし、。 CCK-8S (配列番号 14)は、一般的な化学合成法により製造できる。また、市販のペプチド合成装置によっても合成できる。

[0244] 本発明に係る膜蛋白質受容体のァゴニストの同定方法は、本膜蛋白質受容体に結合する化合物の同定方法により得られたィ匕合物について、上記同定方法を用いて本膜蛋白質受容体の機能変化を誘導するか否かを決定することにより実施することもできる。

[0245] 上記同定方法に使用する実験系や測定系を利用することにより、また、本発明において用いる蛋白質力もなる膜蛋白質受容体のリガンドの同定を実施できる。例えば、調べようとする物質 (以下、被検物質と称する)と該蛋白質の結合を自体公知の結合解析方法により検出することにより実施できる。あるいは、本蛋白質を発現する細胞を用いた同定方法において、被検物質を該蛋白質に接触させたときに誘発される該細胞の細胞応答を測定することにより実施できる。被検物質を該蛋白質に接触させたときの細胞応答が、接触させな力つたときと比較して変化 (促進、発生、低減または消失)した場合、該被検物質はリガンドである、またはリガンドを含むと判定できる。細胞応答として具体的には、細胞膜電位の変化または細胞内カルシウム濃度の変化を例示できる。細胞膜電位または細胞内カルシウム濃度の測定は自体公知の方法により実施できる。あるいは、本蛋白質を発現する細胞を用いた同定方法において、細胞応答の指標として、本蛋白質と MAGUKファミリー関連蛋白質との相互作用を測定することにより、目的とするリガンド得ることもできる。被検物質を該蛋白質に接触させたときの細胞における本蛋白質と MAGUKファミリー関連蛋白質との相互作用が、接触させなかったときと比較して変化 (促進または発生)した場合、該被検物質はリガンドである、またはリガンドを含むと判定できる。本蛋白質と MAGUKファミリー関連蛋白質との相互作用は、ィムノブロッテイング等の自体公知の方法により検出できる。

[0246] リガンドを同定する対象となる被検物質として、例えば本発明にお!/、て用いる DNA の発現が認められた細胞または生体組織力も調製した試料を例示できる。ある、は、天然物由来あるいは合成された各種化合物を対象とすることもできる。

[0247] このような同定方法は、試料中にリガンドが含まれている力否かの判定に有用である他、リガンドが含有されて、ると判明した試料力リガンドを精製する過程にぉ、ても、有効に使用できる。例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー等を用いて試料を分画し精製する場合に、該分画物にリガンドが含まれているカゝ否かを判定できる。

[0248] (化合物）

本発明に係る同定方法により取得された化合物は、本発明において用いる蛋白質の機能、例えば、リガンドとの結合、細胞内情報伝達の活性化、細胞応答の誘発等の機能の阻害剤、拮抗剤、促進剤または安定化剤等として利用できる。また、本発明において用いる蛋白質に対する遺伝子レベルでの発現阻害剤または発現促進剤として利用できる。これら化合物は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮してさらに選別することにより医薬として調製できる。またこれら化合物は、本蛋白質の機能および Zまたは該蛋白質をコードする DNAの発現の異常に起因する各種病的症状の防止効果および Zまたは治療効果を期待できる。

[0249] (医薬組成物）

本発明において用いる蛋白質、 DNA、組換えベクター、形質転換体、抗体、リガンドまたは化合物は、本蛋白質の機能および Zまたは発現を阻害する、拮抗する、または促進することに基づく医薬または医薬組成物の有効成分として有用である。

[0250] 本発明に係る医薬または医薬組成物は、本発明において用いる蛋白質の機能および Zまたは該蛋白質をコードする DNAの発現の異常に起因する疾患の防止および Zまたは治療剤として使用できる。また、当該疾患の防止および Zまたは治療方法に使用できる。

[0251] 本発明にお、て用いる蛋白質の機能および Zまたは該蛋白質をコードする DNA の発現が過剰な場合、 1つの方法として該蛋白質の機能および Zまたは該 DNAの発現を阻害する有効量の阻害剤を医薬上許容される担体とともに対象に投与して、該蛋白質の機能を阻害し、そのことにより異常な症状を改善できる。さらに、発現プロック法を用いて内在性の該蛋白質をコードする DNAの発現を阻害してもよい。例えば本 DNAの断片をアンチセンスオリゴヌクレオチドとして遺伝子治療に用い、本蛋白質をコードする DNAの発現を阻害できる。アンチセンスオリゴヌクレオチォドとして用いる DNA断片は、本 DNAの翻訳領域のみでなぐ非翻訳領域に対応するものであつても有用である。本 DNAの発現を特異的に阻害するためには、該 DNAに固有な領域の塩基配列を用いることが好まし、。

[0252] 本発明において用いる蛋白質の機能および Zまたは該蛋白質をコードする DNA の発現の異常に起因する疾患として、神経性疾患、例えばうつ病が好ましく挙げられる。本蛋白質の発現は、脳組織、特に大脳皮質、海馬および扁桃体で強く認められ、本蛋白質力なる機能的膜蛋白質受容体のリガンドである CCKの発現分布と一致している。 CCKは、不安、鎮痛、鎮静、摂食抑制、記憶、学習といった生理機能に関与していることが知られている。また、 BAI2遺伝子のノックアウトマウスを用いた尾懸垂試験において、該マウスは抗うつ様の表現型を示した。 BAI2遺伝子は、本蛋白質をコードする DNAのスプライシングバリアントである。すなわち、本蛋白質をコードする DNAのスプライシングバリアントは、うつ病に関与していると発明者らは考えている。例えば、本蛋白質をコードする DNAまたは該 DNAのスプライシングバリアントの発現が増加するといつた異常により、うつ病が誘導されると発明者らは考えている。

[0253] 本発明において用いる蛋白質の機能および Zまたは発現の阻害剤、例えば本蛋白質力なる膜蛋白質受容体のアンタゴ-スト、および該阻害剤を有効量含む医薬組成物は、うつ病の緩和、改善、防止および Zまたは治療に有効であると発明者らは考えている。本発明に係る医薬または医薬組成物は、うつ病の防止および Zまたは治療方法に使用できる。具体的には、本医薬または医薬組成物は、本蛋白質機能および Zまたは発現の阻害剤、例えば本蛋白質力なる膜蛋白質受容体のアンタゴニストを有効成分として、その有効量含んでなるうつ病の防止および Zまたは治療剤であり得る。言い換えれば、本医薬または医薬組成物は、上記抗うつ剤を有効成分として、その有効量含んでなるうつ病の防止および Zまたは治療剤であり得る。上記抗うつ剤を適用することにより、うつ病の防止および Zまたは治療方法を実施できる。

[0254] 本発明において用いる蛋白質の機能および Zまたは該蛋白質をコードする DNA の発現の異常に起因する疾患として、その他、本蛋白質がアミノ酸配列中に TSP— I ドメインを有することから、血管新生阻害に起因する疾患や血管新生阻害を伴う疾患が挙げられる。 TSP-Iドメインは、血管新生阻害機能を担うドメインであることが報告されていることから、本蛋白質は、血管新生阻害機能を有すると考えられる。したがつて、血管新生阻害に起因する疾患や血管新生阻害を伴う疾患に、本蛋白質が関与している可能性がある。このような疾患においては、血管新生を促進することにより治療が可能になるため、本蛋白質の機能や発現を阻害することが好ましい。このような疾患として例えば脳挫傷や脳梗塞が例示できる。

[0255] 本発明において用いる蛋白質の機能および Zまたは該蛋白質をコードする DNA の発現の減少や欠失等に関連する異常な症状の治療には、 1つの方法として該蛋白質の機能および Zまたは該 DNAの発現を促進するまたは安定化する有効量の促進剤を医薬上許容される担体とともに投与し、そのことにより異常な症状を改善することを特徴とする方法が挙げられる。あるいは、遺伝子治療を用いて、対象中の細胞内で該蛋白質を生成せしめてもよい。本 DNAを利用した遺伝子治療は、公知の方法が利用できる。例えば、本 DNAまたは該 DNAの転写産物である RNAを組込んだ複製欠損レトロウイルスベクターを作製し、該ベクターを用いたエタスビボ（ex vivo) において対象由来の細胞を処理し、次いで、細胞を対象に導入することもできる。 [0256] 本発明に係る医薬は、上記蛋白質、 DNA、組換えベクター、形質転換体、抗体、リガンドまたは化合物のうち少なくともいずれか 1つを有効成分としてその有効量含む医薬となしてもよいが、通常は、 1種または 2種以上の医薬用担体を用いて医薬組成物を製造することが好まし、。

[0257] 本発明に係る医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択される力通常約 0. 00001〜70重量％、好ましくは 0. 0001〜5重量％程度の範囲とするのが適当である。

[0258] 医薬用担体として、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤や賦形剤等を例示できる。これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択使用される。

[0259] 例えば水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビュルアルコール、ポリビュルピロリドン、カルボキシビュルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、力ゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ヮセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マン-トール、ソルビトール、ラタトース等が挙げられる。これらは、剤形に応じて適宜 1種類または 2種類以上を組合せて使用される。

[0260] 所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、 pH調整剤、界面活性剤等を適宜使用して調製することちでさる。

[0261] 安定化剤としては、例えばヒト血清アルブミンや通常の L アミノ酸、糖類、セルロース誘導体等を例示でき、これらは単独でまたは界面活性剤等と組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。上記 L—アミノ酸は、特に限定はなぐ例えばグリシン、システィン、グルタミン酸等のいずれでもよい。糖類も特に限定はなぐ例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マン-トール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類等およびそれらの誘導体等のいずれでもよい。セルロース誘導体も特に限定はなぐメチルセルロース、ェチルセルロース、ヒドロキシェチノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレメチノレセノレロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のいずれでもよい。界面活性剤も特に限定はなぐイオン性および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。これには、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシェチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノァシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等が包含される。

[0262] 緩衝剤として、ホウ酸、リン酸、酢酸、クェン酸、 ε アミノカプロン酸、グルタミン酸および Ζまたはそれらに対応する塩 (例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシゥム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩)等を例示できる。

[0263] 等張化剤として、例えば塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウム、糖類、グリセリン等を例示できる。

[0264] キレート剤として、例えばェデト酸ナトリウム、クェン酸等を例示できる。

[0265] 本発明に係る医薬および医薬組成物は、溶液製剤として使用できる他に、これを凍結乾燥ィ匕し保存し得る状態にした後、用時、水や生埋的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することもできる。

[0266] 医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質 (体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重 lkgあたり約 0. 01 μ g〜100mg程度、好ましくは約 0.： L g〜 lmg程度の範囲であることが好ましい。し力しながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量を変更できる。上記投与量は 1日 1回〜数回に分けて投与することができ、数日または数週間に 1回の割合で間欠的に投与してもよい。

[0267] 本発明に係る医薬組成物を投与するときには、該医薬組成物を単独で使用してもよぐあるいは治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。

[0268] 投与経路は、全身投与または局所投与の!/ヽずれも選択できる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内等への投与が挙げられる。あるいは経口経路で投与できる。さらに、経粘膜投与または経皮投与も実施できる。癌疾患に用いる場合は、腫瘍に注射等により直接投与することが好ましい。

[0269] 投与形態は、各種の形態が目的に応じて選択できる。その代表的なものは、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リボソーム製剤、シクロデキストリン等の包接体、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。

[0270] 本発明に係る医薬組成物を遺伝子治療剤として用いる場合は、一般的には、注射剤、点滴剤、あるいはリボソーム製剤として調製することが好ましい。遺伝子治療剤が、遺伝子が導入された細胞を含む形態に調製される場合は、該細胞をリン酸緩衝生理食塩水 (PH7. 4)、リンゲル液、細胞内組成液用注射剤中に配合した形態等に調製することもできる。また、プロタミン等の遺伝子導入効率を高める物質と共に投与されるような形態に調製することもできる。遺伝子治療剤として用いる場合、本医薬組成物は、 1日に 1回または数回に分けて投与でき、また、 1日から数週間の間隔で間歇的に投与できる。投与の方法は、一般的な遺伝子治療法で用いられている方法に従って実施できる。

[0271] (診断方法）

本発明において用いる蛋白質、 DNA、組換えベクター、形質転換体、抗体または化合物は、それ自体を、診断マーカーや診断試薬等の疾患診断手段として使用できる。

[0272] 本発明において用いる DNAを含む遺伝子の、個体若しくは各種組織における異常の有無あるいは発現の有無をの特異的な検出が、本発明により、例えば本 DNA の一部または全部の塩基配列を利用することにより実施できる。本 DNAの検出により、該遺伝子に起因する疾患の易罹患性、発症、および Zまたは予後の診断が実施できる。該遺伝子に起因する疾患とは、該遺伝子の量的異常および Zまたは機能異常等に起因する疾患を意味する。本遺伝子に起因する疾患として、神経性疾患、例えばうつ病等が挙げられる。

[0273] 遺伝子の検出による疾患の診断は、例えば被検試料について、該遺伝子に相応する核酸の存在を検出すること、その存在量を決定すること、および Zまたはその変異を同定することによって実施できる。正常な対照試料との比較において、目的遺伝子に対応する核酸の存在の変化、その量的変化を検出できる。また、正常遺伝子型との比較において、目的遺伝子に対応する核酸を公知の手法により増幅した増幅生成物について、例えばサイズ変化を測定することにより欠失および挿入を検出できる。また増幅 DNAを、例えば標識した本発明において用いる DNAとハイブリダィゼーシヨンさせることにより点突然変異を同定できる。このような変化および変異の検出により、上記診断を実施できる。

[0274] 被検試料中の目的とする遺伝子の定性的または定量的な測定方法、または該遺伝子の特定領域の変異の定性的または定量的な測定方法も、本発明により実施できる。

[0275] 被検試料は、目的遺伝子および Zまたはその変異遺伝子の核酸を含むものである限り特に制限されず、例えば、細胞、血液、尿、唾液、髄液、組織生検または剖検材料等の生体生物由来の生物学的試料を例示できる。あるいは所望により生物学的試料から核酸を抽出して核酸試料を調製して用いることもできる。核酸は、ゲノム DNA を検出に直接使用してもよぐあるいは分析前に PCRまたはその他の増幅法を用いることにより酵素的に増幅してもよい。 RNAまたは cDNAを同様に用いてもよい。核酸試料は、また、標的配列の検出を容易にする様々な方法、例えば変性、制限酵素による消化、電気泳動またはドットブロッテイング等により調製してもよ、。

[0276] 検出方法は、公知の遺伝子検出法を用いることができ、例えばプラークハイブリダィゼーシヨン、コロニーハイブリダィゼーシヨン、サザンブロット法、ノザンブロット法、 N ucleic Acid Sequence -Based Amplification (NASBA)法、または RT—P CR等が挙げられる。また、 in situ RT— PCRや in situ ハイブリダィゼーシヨン等を利用した細胞レベルでの測定を用いることもできる。目的遺伝子の検出に用いることのできる方法は上記方法に限定されず、自体公知の遺伝子検出法がいずれも使用できる。

[0277] このような遺伝子検出法において、目的遺伝子またはその変異遺伝子の同定および Zまたはその増幅の実施に、本発明において用いる DNAの断片であってプロ一ブとしての性質を有するものまたはプライマーとしての性質を有するものが有用である。プローブとしての性質を有する DNA断片とは、目的の DNAのみに特異的にハイブリダィゼーシヨンできる該 DNA特有の配列力もなるものを意味する。プライマーとしての性質を有するものとは本 DNAのみを特異的に増幅できる該 DNA特有の配列からなるものを意味する。また、増幅できる変異遺伝子を検出する場合には、遺伝子内の変異を有する箇所を含む所定の長さの配列を持つプライマーあるいはプローブを作成して用いる。プローブまたはプライマーは、塩基配列長が一般的に 5〜50ヌクレォチド程度であるものが好ましぐ 10〜35ヌクレオチド程度であるものがより好ましぐ 15〜30ヌクレオチド程度であるものがさらに好ましい。プローブは、通常は標識したプローブを用いるが、非標識であってもよぐ直接的または間接的に標識したリガンドとの特異的結合によって検出してもよい。プローブおよびリガンドを標識する方法は、数々の方法が知られており、例えばニックトランスレーション、ランダムプライミングまたはキナーゼ処理を利用する方法等を例示できる。適当な標識物質として、放射性同位体、ピオチン、蛍光色素、化学発光物質、酵素、抗体等が挙げられる。

[0278] 遺伝子検出法は、 PCRが感度の点力好ま、。 PCRは、目的遺伝子を特異的に増幅することのできる DNA断片をプライマーとして用いる方法である限り特に制限されず、従来公知の方法、例えば RT— PCRが例示される力当該分野で用いられる数々の変法を適用できる。

[0279] PCRにより、遺伝子の検出の他に、目的遺伝子および Zまたはその変異遺伝子の DNAの定量も実施できる。このような分析方法として、 Multi— channel Simplex Stimulated Annealing (MSSA)法のごとき競合的定量法、または一本鎖 DNA の高次構造の変化に伴う移動度の変化を利用した突然変異検出法として知られる P CR— SSCP法を例示できる。

[0280] 個体若しくは各種組織における該蛋白質およびその機能の異常の有無を特異的な検出が、本発明により、例えば本発明において用いる蛋白質を利用することにより、実施できる。本蛋白質およびその機能の異常の検出により、該遺伝子に起因する疾患の易罹患性、発症および Zまたは予後の診断が実施できる。

[0281] 蛋白質の検出による疾患の診断は、例えば被検試料について、該蛋白質の存在を検出すること、その存在量を決定すること、および Zまたはその変異を検出することによって実施できる。すなわち、本蛋白質および Zまたはその変異体を定量的あるいは定性的に測定する。正常な対照試料との比較において、目的蛋白質の存在の変化、その量的変化を検出できる。正常蛋白質との比較において、例えばアミノ酸配列を決定することによりその変異を検出できる。このような変化および変異の検出により、上記診断を実施できる。被検試料は、目的蛋白質および Zまたはその変異体を含むものである限り特に制限されず、例えば、血液、血清、尿、生検組織等の生体生物由来の生物学的試料を例示できる。

[0282] 本発明において用いる蛋白質および変異を有する該蛋白質の測定は、本蛋白質、例えば配列表の配列番号 2に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質、または該蛋白質のアミノ酸配列において 1個若しくは 2個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列、これらの断片、または該蛋白質やその断片に対する抗体を用、ることにより実施できる。

[0283] 蛋白質の定量的あるいは定性的な測定は、この分野における慣用技術による蛋白質検出法あるいは定量法を用いて実施できる。例えば、目的蛋白質のアミノ酸配列分析により変異蛋白質の検出ができるが、さらに好ましくは、抗体 (ポリクローナルまたはモノクローナル抗体)を用いて、目的蛋白質の配列の相違、または目的蛋白質の有無を検出できる。

[0284] 被検試料中の本発明において用いる蛋白質の定性的または定量的な測定方法、または該蛋白質の特定領域の変異の定性的または定量的な測定方法が、本発明により実施できる。

[0285] 具体的には、被検試料について、目的蛋白質に対する特異抗体を用いて免疫沈降を行い、ウェスタンブロット法またはィムノブロット法で目的蛋白質の解析を行うことにより、上記検出が実施できる。また、目的蛋白質に対する抗体により、免疫組織ィ匕学的技術を用いてパラフィンまたは凍結組織切片中の目的蛋白質を検出できる。

[0286] 目的蛋白質またはその変異体を検出する方法の好ま、具体例として、モノクロ一ナル抗体および Zまたはポリクローナル抗体を用いるサンドイッチ法を含む、酵素免疫測定法 (ELISA)、放射線免疫検定法 (RIA)、免疫放射線検定法 (IRMA)、および免疫酵素法 (IEMA)等が挙げられる。その他、ラジオィムノアツセィゃ競争結合ァッセィ等を禾 IJ用することもできる。

[0287] (試薬および試薬キット）

本発明において用いる蛋白質、 DNA、組換えベクター、形質転換体、および抗体はいずれも、それ自体を単独で、試薬等として使用でき、例えば、本発明に係る化合物の同定方法、あるいは発明に係る蛋白質および Zまたは DNAの測定方法に使用するための試薬として使用できる。該試薬は本蛋白質または DNAが関与する細胞情報伝達経路の解明、並びに該蛋白質および Zまたは DNAの異常に起因する疾患等に関する基礎的研究等に有用である。

[0288] 具体的には、本発明に係る試薬キットとして、配列表の配列番号 1、 15および 17に記載の塩基配列のうちヽずれか 1の塩基配列で表される DNA、該 DNAを含む組換えベクター、該組換えベクターを導入されてなる形質転換体、該 DNAによりコードされる蛋白質、および該蛋白質を認識する抗体のうち、少なくともいずれか 1つを含有してなる試薬キットが例示できる。より具体的には、配列表の配列番号 1、 15および 1 7に記載の塩基配列のうち!、ずれか 1の塩基配列で表される DNA、該 DNAを含む組換えベクター、該組換えベクターを導入されてなる形質転換体、配列番号 2、 16および 18に記載のアミノ酸配列のうちいずれか 1のアミノ酸配列で表される蛋白質および該蛋白質を認識する抗体のうち、少なくともいずれか 1つを含有してなる試薬キットが例示できる。

[0289] これらは試薬であるとき、緩衝液、塩、安定化剤、および Zまたは防腐剤等の物質を含んでいてもよい。なお、製剤化にあたっては、各性質に応じた自体公知の製剤化手段を導入すればよい。

[0290] 本発明にお、て用いる蛋白質、 DNA、組換えベクター、形質転換体、および抗体のうちの少なくともいずれ力 1つを含んでなる試薬キットが、本発明により提供される。これらは試薬キットであるとき、本蛋白質や DNAを検出するための標識物質、標識の検出剤、反応希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄剤および反応停止液等、測定の実施に必要とされる物質を含むことができる。標識物質として、上述の標識用蛋白質、および化学修飾物質等が挙げられるが、予め該標識物質が本蛋白質あるいは DN Aに付加されていてもよい。

[0291] 本発明に係る試薬キットは、上記同定方法および測定方法に使用できる。さらに本発明は、前記測定方法を用いる検査方法に、検査剤並びに検査用キットとして使用できる。また、前記測定方法を用いる診断方法にも、診断剤並びに診断用キットとして使用できる。

[0292] 以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。

実施例 1

[0293] (ヒト脳由来 cDNAライブラリーの構築と遺伝子の分取）

巿販ヒト脳、胎児脳、および脳海馬由来の polyA+RNA(Clontech社製:カタログ No. 6516— 1、 6525— 1、および 6578— 1)を出発原料として常法により cDNAライブラリーを構築し、 dbEST分析により cDNA断片を単離して cDNAクローンの塩基配列を決定した。具体的には、小原らの方法 (オハラ（Ohara, O. )ら、「ディーェヌエーリサーチ（DNA Research)」、 1997年、第 4卷、 p. 53— 59)に従って調製した上記ヒト脳由来の cDNAライブラリーから、約 50, 000個の組換え体をランダムに選択し、このうち約 30, 000個のクローンの cDNAについて、その 5' 末端および 3 ' 末端の塩基配列を決定した。さらに約 1, 100個を主にインビトロの転写翻訳実験によって選択し、それらの cDNAの塩基配列を小原らの方法に従って決定した。

[0294] 全塩基配列の決定を行った cDNAクローンについて、コンピュータプログラムを用 V、た汎用解析方法によって ORFを予想し、この領域にっ、て 7回膜貫通ドメインを有する cDNAクローンを得た。

[0295] 同定した cDNAクローン ph01207は、シグナル配列と予測される部分 (N末端より 20アミノ酸残基）を有する 1518アミノ酸残基力もなる ORFを含む全長 4557bpの塩基配列を有する DNA (配列番号 1)である。相同性検索により、 ph01207は、 hBAI 2 (GenBank ァクセッション番号 AB005298)の配列のうち、 N末端領域の 55ァミノ酸残基をコードする領域が欠損し、さらに C末端側領域に 1アミノ酸残基 (配列番号 2 に記載のアミノ酸配列における第 1406番目のリジン）が挿入されたスプライシングバリアントであると考えられた（図 1—A)。

[0296] ph01207によりコードされる蛋白質には構造的特徴として、 3個の TSP— Iドメインの他、 GPSドメインおよび 7回膜貫通ドメインが存在することが判明した。

[0297] 一方、 hBAI2によりコードされる蛋白質は、 4個の TSP— Iドメインの他、 GPSドメインおよび 7回膜貫通ドメインを有すると考えられる。 ph01207によりコードされる蛋白質においては、 hBAI2の N末端領域側の 1個の TSP— Iドメインを含む領域に相当する 55アミノ酸残基が欠失していることが明らかになった。

[0298] ph01207遺伝子の発現組織解析により、正常の脳組織全般 (例えば、大脳皮質（大脳側頭極 (temporal pole)、運動皮質 (motor cortex) )、海馬、扁桃体等）において本遺伝子の特異的に高い発現が認められた。さらに卵巣癌、肝臓癌および副腎癌において、各正常組織と比較して、発現の亢進が認められた。

実施例 2

[0299] (ph01207発現細胞株の作製と、該細胞株における DNAの発現）

実施例 1で同定したクローン ph01207を用いて ph01207によりコードされる蛋白質を N末端ェピトープタグ (epitope - tag)融合蛋白質として発現させた。

[0300] まず、 phO 1207遺伝子を含む発現ベクターを構築した。実施例 1で同定したクローン ph01207を用いて、シグナル配列と予測される部分 (N末端より 20アミノ酸残基）を除いたアミノ酸配列をコードする DNAを PCRおよび制限酵素処理により pDONR 201にクローユングし、 ph01207エントリーベクターを構築した。 PCRは、プライマーとして配列表の配列番号 4〜： L 1のそれぞれに記載した塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを用い、ポリメラーゼとして Pfu turbo DNA polymerase (Stratagene 社製)を用いて実施した。

[0301] N末端 epitope— tag融合型発現ベクターとして、 p3 X FLAG— CMV9— attRと T 8HA— attRZpCINeoの 2種類を準備した。 p3 X FLAG— CMV9— attRは、 p3 X FLAG-CMV9 (Sigma社製）をゲートウェイベクターコンバージョンシステム（GA TEWAY Vector Conversion System, Invitrogen社製）によりゲートウェイシステム（GATEWAY system)に対応化させたベクターである。 T8HA— attRZp CINeoは、文献情報 (ケラー (Koller, K. J. )ら、「アナリティカルバイオケミストリー (Analytical Biochemistry)」、 1997年、第 250卷、 p. 51— 60)【こ従!ヽ、 pCINe o (Promega社製）および合成オリゴ (T8SP— HA (配列番号 12)および T8SP— H A as (配列番号 13) )、並びに GATEWAY Vector Conversion Systemを用いて構築した。両ベクターともに epitope— tagの前 (N末端側）に分泌シグナル配列 (FLAG : PPTLS、 HA:T8)を有する。これらベクターを用いて、マンマリアンェクス

(Mammalian Expression sys tern with GATEWAY technology, Invitrogen社製）の LR反応により、 N末端 FLAG— tagまたは HA— tag融合型発現ベクターを構築した。構築した各発現べクタ一は、制限酵素処理およびシークェンス解析により、導入した配列の翻訳領域に塩基置換や欠損のなヽことを確認した。

[0302] 構築した 2種類の発現ベクターをそれぞれ CHO—K1細胞株へフュージーン 6 (Fu gene6、 Roche社製）を用いてトランスフエクシヨンした後、 G418を含む培地（400 g/mL G418および 10%牛胎仔血清を含む DMEMZF12培地）で培養することにより発現細胞株の選抜を行った。生育した発現細胞株について、 epitope— tagに対するパーォキシダーゼ (POD)標識抗体 (抗 FLAG M2- POD抗体および抗 H A— POD抗体： 3F10)を用いてセルェンザィムィムノアッセィ（cell EIA)により、さらに選抜を行った。選抜した細胞株について、さらに一次抗体 (抗 FLAG M2抗体および抗 HA抗体：クローン HA— 7)およびフルォレセインイソチオシァネート（FITC )標識した二次抗体 (FITC—抗マウス IgG抗体)を用いたフルォロサイトメトリー (FC M)解析による選抜を行い、発現細胞株を取得した。

[0303] FCM解析の結果、細胞膜上に抗 FLAG抗体により認識される蛋白質 (FLAG— t ag融合蛋白質)を発現してヽるクローン 8株、抗 HA抗体により認識される蛋白質 (H A— tag融合蛋白質）を発現しているクローン 4株が得られた。いずれのクローンも、 F LAG— tagまたは HA— tagを認識する抗体が結合したことによる蛍光シグナルが宿主細胞株 (CHO— K1)よりも明らかに強いことから、目的の遺伝子が発現していることが明らかになった。代表的な結果を図 2に示す。

[0304] FCM解析の結果から、 N—末端 epitope— tag融合型の ph01207遺伝子産物が細胞膜上に発現することが判明した。

[0305] HA—tag融合蛋白質の発現が認められたクローンのうち HA—ph01207 # 10— 6と称する細胞株を、受託番号 FERM BP— 10101号として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成 16年 8月 19日付けで寄託した。本細胞株の生存は、前記寄託センターにおいて平成 16年 9月 22日に実施された試験により確認されている。 HA— ph01207 # 10— 6細胞株は、配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAのオープンリーディングフレーム（ORF)のうち、シグナル配列（配列番号 2に記載のアミノ酸配列の N末端より 20アミノ酸残基)をコードすると予測される部分を除、た塩基配列で表される DNAを N末端 HA— tag融合蛋白質として発現させるベクターを、 CHO—K1細胞株にトランスフエクシヨンすることにより榭立した細胞株であり、 N末端 HA— tag融合蛋白質を安定的に発現している。

実施例 3

[0306] (phO 1207遺伝子産物の機能解析）

ph01207遺伝子産物の機能解析は、 ph01207を発現させたアフリカッメガエル卵母細胞にリガンドを添加したときの細胞応答の測定により実施した。細胞応答の測定は、コントロール卵母細胞 (遺伝子導入していないもの）および遺伝子 (_Ph01207 c DNAクローン)を発現させた卵母細胞をそれぞれ 6個ずつ用いて、リガンドを添加したときの卵母細胞の膜電位変化の測定により行った。リガンドとして、 ph01207を発現していることが認められた HeLa細胞株の培養上清を用いた。培養上清は、細胞数 1. 2 X 10⁶の HeLa細胞株を 10%牛胎仔血清を含む DMEMにて 2日間培養した後に培養上清を回収し、フィルターろ過 (0. 45 m)することにより調製した。リガンドとして、同様に調製したロットの異なる 2種類の培養上清を用いた (以下、リガンドサンプル 1および 2と称する）。

[0307] phO 1207遺伝子を発現させた卵母細胞とコントロール卵母細胞にリガンドサンプル 1または 2を添加し、膜電位変化を測定した。評価は電流量の変化と電流量の変化を示す波形により行い、電流量の変化が 0. 2 /z A以上であり、かつ GPCR特異的なパターンの波形が認められた場合に、リガンド刺激に対する応答があると判定した

。 GPCR特異的なパターンとは図 3に示す波形 1のパターンをいう。図 3に示す波形 2 〜4のようなパターンは溶媒等何らかの成分の影響あるいは高濃度のリガンド等の人為的要素により生じる波形パターンであり、リガンド刺激に対する応答ではないと判定した。また、波形 5および 6のようなパターンが認められた場合は、リガンド刺激に対する応答が無いと判定した。

[0308] その結果、 ph01207発現細胞にのみ電流量の変化が認められた（表 1および表 2) 。表 2中 NDとは、電流変化量が 0. 2 A以下であり、応答が認められなかったことを示す。表 1に示すように、 ph01207発現細胞株 6検体の全てにおいてリガンド刺激に対する応答が認められた。それに対し、コントロール細胞は全くリガンドに対して応答しな力つた (表 2)。このことから、 ph01207発現細胞のリガンド刺激による応答は、発現させた受容体に特異的な応答であると考える。リガンドサンプル 1および 2のどちらを用いても同様の結果が得られた。

[0309] [表 1]

[0310] [表 2]

ph01207遺伝子の発現によりリガンド刺激による細胞応答が生じたことから、 phOl 207遺伝子産物は、リガンドに応答して細胞内情報伝達経路を活性化する機能を有する GPCRであると考える。

実施例 4

[0312] (ph01207遺伝子産物の蛋白質相互作用解析）

ph01207遺伝子産物の蛋白質相互作用解析をイーストツーハイブリッドシステムを用いて検討した。

[0313] ph01207配列情報と hBAI2配列情報に基づいて、 ph01207遺伝子産物の N末端領域 (4ケ所)と C末端領域 (2ケ所)、および hBAI2遺伝子産物の N末端領域 (phO 1207で 55アミノ酸残基欠失している領域）と C末端領域 (ph01207で 1アミノ酸残基挿入のある領域）にそれぞれ bait (ベイト）を設定し、 hBAI2の発現分布に関する報告 (非特許文献 1)より選択した cDNAライブラリー (脳、海馬、乳癌と前立腺癌、心臓、骨格筋に由来する）に対してスクリーニングを行った。

[0314] phO 1207遺伝子産物（配列番号 20に記載のアミノ酸配列の第 1461番目に相当する 1アミノ酸残基の挿入有り）および hBAI2遺伝子産物（前記アミノ酸残基の挿入なし)の各 C末端領域に設計した baitのいずれを用いたときも、 prey (プレイ）として M AGUKファミリー関連蛋白質である DLG2、 DLG3および DLG4や、 AIP1、 MAGI 3等が得られた。この他、 hBAI2遺伝子産物特異的な preyとして、 HOMER2、 Citr on、 SYNE— 1、 KIF5Aおよび KIFAP3が得られた。

[0315] ph01207遺伝子産物の N末端領域（55アミノ酸残基の欠失有り）に設計された bai tに対しては、 BAT1 (HLA— B associated transcript 3)のみ力 ¾reyとして得られたが、 hBAI2遺伝子産物の N末端領域 (前記アミノ酸残基の欠失なし）に設計され 7こ baitに对し飞 f¾、 KCNN2、potassium intermediate/ small conductance calcium― activated channel, subfamily N, member2)等力 Sヒットした。

[0316] このように、 ph01207遺伝子産物と hBAI2遺伝子産物とでは、 MAGUKファミリー関連蛋白質を除いて、イーストツーハイブリッドシステムにより検出される相互作用蛋白質に違いがあることが判明した。

[0317] ph01207遺伝子産物および hBAI2遺伝子産物は、それぞれの C末端領域において、 MAGUKファミリー関連蛋白質と相互作用することが判明した。 MAGUKフアミリー関連蛋白質は細胞質内に存在し、細胞膜に存在する受容体やイオンチャネル等の膜蛋白質と結合することにより、これら膜蛋白質力の情報伝達に関与している。したがって、 ph01207遺伝子産物と hBAI2遺伝子産物は、 MAGUKファミリー関連蛋白質を介して細胞内情報伝達に関与する機能的膜蛋白質受容体であると考える。実施例 5

[0318] (CCK8による ph01207発現細胞株の細胞内カルシウム濃度変化の測定）

実施例 2で作製した ph01207発現細胞株を用いて、 CCK— 8S (配列番号 14)、 C CK— 8NSまたは CCK— 4による細胞内カルシウム (Ca²⁺)濃度変化を測定した。実施例 2で作製した細胞株は、 ph01207によりコードされる蛋白質を FLAG— tag融合蛋白質として発現している 8株および ph01207によりコードされる蛋白質を HA— tag 融合蛋白質として発現している 4株である。このうち、本実施例においては、 ph0120 7によりコードされる蛋白質を HA— tag融合蛋白質として安定的に発現している細胞株の 1つを細胞クローユングして得られた株である、 HA— ph01207 # 10— 6細胞株を使用した。 CCK— 8NSは、 CCK—8S (配列番号 14)と同じアミノ酸配列で表される CCKオタタペプチドである力 C末端から 7番目のチロシン残基が硫酸化されていない。 CCK 4は、 CCK—8S (配列番号 14)の C末端から 4番目までのアミノ酸残基力なるテトラペプチドである。

[0319] CCK—8S (配列番号 14)による HA—ph01207 # 10— 6細胞株の細胞内じ&²⁺ 濃度の変化の具体的な測定方法とその結果を以下に述べる。 HA— ph01207 # 10 —6細胞株を、 96ゥエルプレート (壁面が黒色で底面が透明なもの）に、細胞数 2 X 1 存在下で培養した。培

地（medium)は、 10% 牛胎仔血清（Moregate社製）を含む DMEMZF12 (Gibe o社製）を用いた。翌日、各ゥエルより培地を 50 /z Lずつ抜き取り、ローデイングバッファー（Loading buffer)を 50 Lずつ各ゥエルに添カ卩して、室温で 1. 5時間反応させ、ローデイングバッファ一中に含まれる蛍光色素を細胞内に取り込ませた。ローデイングバッファ一は、 FLIPRカルシウム 3 アツセィキット（FLIPR Calcium 3 Ass ay Kit, Molecular Device社製）のコンポーネント Aを、 9. 9mLのコンポーネント Bに 0. lmLの 500mM プロべネシド（probenecid Sigma社製）をカ卩えた溶液にて溶解することにより調製した。反応後、フレックスステーション（FLEXstation、 Mol ecular Device社製)を用いて CCK— 8S (ペプチド研究所製)添加時の蛍光強度の経時変化をゥエル毎に測定した。また、 CCK— 8NS (ペプチド研究所製)および C CK— 4 (ペプチド研究所製）についても同様の測定を行なった。 CCK— 8S (配列番号 14)は、 0. 52mgを 4. 5mLの 1% NaHCO (Wako社製）で溶解し、 0. ImM濃

3

度の溶液を調製した。 CCK— 8NSは、 0. 53mgを 0. 50mLのジメチルスルホキサイド（DMSO、 Sigma社製）で溶解後、 4. 50mLの再蒸留水 H Oを添カ卩し、 0. ImM

2

濃度の溶液を調製した。 CCK 4は、 0. 54mgを 0. 46mLの DMSOで溶解後、 4. 09mLの再蒸留水を添カ卩し、 0. 2mM濃度の溶液を調製した。 CCK— 8S (配列番号 14)、 CCK—8NSおよび CCK—4は、それぞれリン酸緩衝化生理食塩水（PBS) で希釈して 5nM溶液とし、各 25 μ L添カ卩（終濃度 InM)して測定を行った。細胞内 C a²⁺濃度の上昇を惹き起こすポジティブコントロールとして A23187 (Calbiochem社製）を終濃度 10 Mで用いた。ネガティブコントロールとして、 HA— ph01207 # 10 6細胞株の作製にぉ、て宿主として用いた CHO— K1細胞株を用いた。 CHO K1細胞株には ph01207発現ベクターがトランスフエクシヨンされていないため、 phO 1207遺伝子産物は発現して、なヽ。

[0320] その結果、 CCK— 8S (配列番号 14)により刺激した HA— ph01207 # 10— 6細胞株の細胞内 Ca²⁺濃度（図 4— A)力無刺激の HA— ph01207 # 10— 6細胞株（図 4— E)と比較して上昇した。し力し、 HA— ph01207 # 10— 6細胞株の細胞内 Ca²⁺ 濃度の上昇は、 CCK 8NSや CCK 4による刺激では認められなかつた（図 4 B および図 4— C)。また、 A23187による HA— ph01207 # 10— 6細胞株の細胞内 C a²⁺濃度の上昇が認められた（図 4 D)。

[0321] InM CCK 8S (配列番号 14)による HA— ph01207 # 10— 6細胞株の細胞内 Ca²⁺濃度の上昇の程度（図 4— A)は、ポジティブコントロールに用いた A23187による細胞内 Ca²⁺濃度の上昇の程度（図 4 D)と、ほぼ同等であった。

[0322] 一方、 CHO— K1細胞株は、 CCK 8S (配列番号 14)、 CCK 8NSおよび CCK —4のいずれで刺激したときも、細胞内 Ca²⁺濃度の上昇を示さな力つた（図 4— A、図 4— Bおよび図 4— C)。し力し、 A23187による CHO— K1細胞の細胞内 Ca²⁺濃度の上昇は認められた（図 4 D)。 [0323] これら結果から、 HA— ph01207 # 10— 6細胞株力 CCK— 8S (配列番号 14)に対して特異的に応答することが明らかになった。また、 CCK— 8S (配列番号 14)による HA— ph01207 # 10— 6細胞株の細胞内 Ca²⁺濃度の上昇には、該細胞株で発現された _Ph01207によりコードされる蛋白質が関与することが明らかになった。これらから、 CCK— 8S (配列番号 14)は、 phOl 207遺伝子産物のリガンドであると考える。

[0324] また、 11八ー 1101207 # 10— 6細胞株は、 InMの CCK—8S (配列番号 14)により、十分に高い細胞応答を示した。 InMという低濃度の CCK—8S (配列番号 14)が、 HA— ph01207 # 10— 6細胞株の細胞応答を惹き起こしたことから、 CCK— 8は生体内で実際に、 ph01207によりコードされる蛋白質を介して細細胞応答を惹き起こしていると考える。つまり、 CCK 8S (配列番号 14)は、 GPCRと予想された ph01207 の生体内リガンドの一つであると考える。

実施例 6

[0325] (ph01207遺伝子のスプライシングバリアントの同定）

ph01207遺伝子のスプライシングバリアントを、 RT— PCRによるクローユングを行つて取得した。

[0326] ph01207遺伝子のスプライシングノリアントの取得は、次のように実施した。まず、ヒト脳由来の polyA ( + ) RNA(Clontech社製）を出発原料として常法により cDN Aライブラリーを構築し、 dbEST分析により cDNA断片を単離して cDNAクローンの塩基配列を決定した。具体的には、 polyA( + ) RNA 0. 1 gを含む 10 Lの反 i糸 \ Superscript first— strand synthesis system for RT— Pし R(Invit rogen社製）を用いて RT— PCRを行、cDNAライブラリーを構築した。この cDNAを铸型として配列番号 23の塩基配列力もなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号 24の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて PCRを行った。これらブライマ一を用いた PCRにより、 hBAI2 (配列番号 22)の第 44番目のァスパラギン酸（D )力も第 475番目のシスティン (C)までのアミノ酸配列をコードする領域の DNA、および hBAI2 (配列番号 22)のスプライシングバリアントにおいて、該領域に相当する D NAが増幅される（図 1—C参照）。得られた各クローンと phO 1207 cDNAクローンとの間で、 Sealおよび Xholによる組換えを行い、 3種類の全長 cDNAクローンを得た。各クローンの塩基配列の確認は、シーケンス解析により実施した。

[0327] その結果、配列相同性および構造類似性カゝら ph01207遺伝子のスプライシングバリアントと考えられる 3種類の全長 cDNAクローンが得られた。これら cDNAクローンを、 7tmHR遺伝子、 hkO 1941遺伝子および variant 3遺伝子と称する。これらスプライシングバリアントは全て、 N末端細胞外領域の TSP— Iドメインのリピート数が異なるバリアントである（図 1— B)。これらスプライシングバリアントのうち、 7tmHR遺伝子が最長の蛋白質をコードしている。

[0328] 7tmHR遺伝子は、シグナル配列と予測される部分 (N末端より 20アミノ酸残基)を有する 1573アミノ酸残基（配列番号 20)をコードする ORFを含む 4719bpの塩基配列からなる（配列番号 19)。 7tmHR遺伝子は、 GenBankにァクセッション番号: AB 065648として登録されている。本遺伝子によりコードされる蛋白質は、 7回膜貫通ドメインを有し、 4個の TSP—Iドメインおよび 1個の GPSドメインを有する（図 1—B参照 )。該蛋白質は、 hBAI2 (GenBank ァクセッション番号 AB005298)の配列と比較して、 C末端側領域において 1アミノ酸残基が挿入されている以外は、 hBAI2と同一のアミノ酸配列を有する。該 1アミノ酸残基の挿入は、 hBAI2のアミノ酸配列の第 146 0番目のグルタミン酸 (E)と第 1461番目のノリン (V)の間に認められ、該挿入されたアミノ酸残基はリジンである。該挿入されたリジンは、 7tmHR遺伝子によりコードされる蛋白質 (配列番号 20)のアミノ酸配列において第 1461番目に相当する。配列相同性および構造類似性から、 7tmHR遺伝子および該遺伝子によりコードされる蛋白質は、 hBAI2遺伝子のスプライシングバリアントであると考えられた。

[0329] hk01941遺伝子は、新規遺伝子であり、シグナル配列と予測される部分 (N末端より 20アミノ酸残基)を有する 1463アミノ酸残基 (配列番号 16)をコードする ORFを含む 4389bpの塩基配列力もなる（配列番号 15)。本 DNAによりコードされる蛋白質は、 7回膜貫通ドメインを有し、 2個の TSP— Iドメインおよび 1個の GPSドメインを有する (図 1—B参照）。本 DNAによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列は、 7tmHR遺伝子によりコードされる蛋白質 (配列番号 20)と比較して、 N末端側の 2個の TSP— Iドメインを含む 110アミノ酸残基が欠失して、る以外は同一である。欠失して、る 110ァミノ酸残基は、 7tmHR遺伝子によりコードされる蛋白質のアミノ酸配列（配列番号 20 )にお、て、第 296番目のグリシン (G)力も第 405番目のプロリン (P)に相当する。

[0330] variant 3遺伝子は、新規遺伝子であり、シグナル配列と予測される部分 (N末端より 20アミノ酸残基)を有する 1518アミノ酸残基 (配列番号 18)をコードする ORFを含む 4554bpの塩基配列力もなる（配列番号 17)。本 DNAによりコードされる蛋白質は、 7回膜貫通ドメインを有し、 3個の TSP— Iドメインおよび 1個の GPSドメインを有する（図 1—B参照）。 DNAによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列は、 7tmHR遺伝子によりコードされる蛋白質 (配列番号 20)と比較して、 N末端側から 2番目の TSP— Iドメイン 1個を含む 55アミノ酸残基が欠失している以外は同一である。欠失している 55アミノ酸残基は、 7tmHR遺伝子によりコードされる蛋白質のアミノ酸配列（配列番号 20)にお、て、第 351番目のパリン (V)力も第 405番目のプロリン (P)に相当する

[0331] ph01207遺伝子によりコードされる蛋白質のアミノ酸配列は、 7tmHR遺伝子によりコードされる蛋白質のアミノ酸配列（配列番号 20)と比較して、 N末端側の 1個の TS P— Iドメインを含む 55アミノ酸残基が欠失している以外は同一である。欠失している 55アミノ酸残基は、 7tmHR遺伝子によりコードされる蛋白質のアミノ酸配列（配列番号 20)にお!/、て、第 296番目のグリシン（G)から第 350番目のプロリン（P)に相当する。

実施例 7

[0332] (ph01207遺伝子のスプライシングバリアントの安定発現株の構築）

ph01207遺伝子のスプライシングノリアントの安定発現株を構築し、該安定発現株において CCK—8Sによる細胞応答が惹き起こされるか検討した。スプライシングノリアントとして、実施例 6で取得した 3種類のスプライシングバリアント、 7tmHR遺伝子、 hk01941遺伝子および variant 3遺伝子を用いた。

[0333] まず、各全長 cDNAクローンの発現ベクターを、動物細胞用発現ベクターである pc DNA3. 1 (+ ) (Invitrogen社製）を用いて各全長 cDNAクローンとの組換え反応を、 Asp718Iおよび Notlにより行うことにより構築した。得られた発現ベクターを、 7tm HR/pcDNA3. 1、 hk01941/pcDNA3. 1および variant3/pcDNA3. 1と称する。

[0334] 7tmHR安定発現株および hk01941安定発現株は、 7tmHR発現ベクター（7tm HR/pcDNA3. 1)および hk01941発現ベクター（hk0194lZpcDNA3. 1)をそれぞれ、 CHO—K1細胞株にトランスフエクシヨンすることにより作製した。具体的には、発現ベクターをリポフエクトァミン 2000 (Lipofectamine 2000、 LF2000と略称することがある、 Invitrogen社製）と混合し（4 g DNA/250 μ L DMEM/F 12培地 + 10 /z L LF2000/250 μ L DMEMZF12培地）、 6ゥエルプレートに培養した CHO— K1株（2mL 培地 Zwell)に添加してトランスフエクシヨンを行った。翌日、細胞を回収し 96ゥエルプレートに 1細胞 Zwellの細胞密度で播種し、 G418 (400 μ g/mL)を含む選択培地（10% FCSを含む DMEM/F12培地）による培養を行い、発現細胞株を選抜した。また、選抜した発現細胞株について、抗 hBAI2 抗体を用いた FCM解析、ウェスタンブロッテイング解析を行い、それぞれ導入遺伝子の発現を確認した。

実施例 8

[0335] (ph01207遺伝子のスプライシングバリアントの安定発現株の機能解析）

ph01207遺伝子のスプライシングバリアントの安定発現株を用いて、 CCK— 8Sによる細胞内カルシウム（Ca²⁺)濃度変化を、実施例 5に記載の方法と同様の方法で測定した。 ph01207遺伝子のスプライシングバリアントの安定発現株として、実施例 7 で構築した安定発現株を使用した。また、 hk01941安定発現株を用いて同様の検討を行った。 hk01941安定発現株として、実施例 7で構築した安定発現株を使用した。コントロールとして、 7tmHR発現ベクターまたは hk01941発現ベクターをトランスフエクシヨンして、な、宿主細胞を使用した。

[0336] 細胞は、細胞数 3 X lo lOO μ L 培地 Zwellを、 96ゥエルプレート（黒色の壁および透明な底を持つプレート）に播種し、 37°Cにて 5% COインキュベーターで一

2

晚培養した。翌日、各ゥエルより培地を 50 μ Lを抜き取り、ローデイングバッファー（L oading buffer)を 50 μ Lずつ各ゥエルに添カ卩して、室温で 1時間反応させ、ローデイングバッファ一中に含まれる蛍光色素を細胞内に取り込ませた。ローデイングバッファ一は、実施例 5に記載の方法と同様の方法で調製した。反応後、フレックスステーシヨン（FLEXstation、 Molecular Device社製）を用いて CCK— 8S添カ卩時の蛍光強度の経時変化をゥエル毎に測定した。 CCK— 8Sは終濃度 ΙΟρΜ— 1 Mで用いた。また、アツセィのポジティブコントロールとして A23187を終濃度 20 μ Μで用いた。

[0337] 7tmHR安定発現株および hk01941安定発現株のどちらにおいても、 CCK—8S 添カ卩により、細胞内カルシウム (Ca²⁺)濃度の上昇が観察された。それに対して、 7t mHR発現ベクターまたは hk01941発現ベクターをトランスフエクシヨンしていない宿主細胞では、 CCK 8S添カ卩による細胞内カルシウム濃度の変化は観察されなかつた。両方の安定発現株共に複数のクローンで同様の傾向が確認できた。 7tmHR安定発現株および hk01941安定発現株の代表的なクローンについて、生理的濃度（1 nM)の CCK— 8Sを添カ卩したときの細胞内カルシウム（Ca²⁺)濃度変化を図 5— Aおよび図 6— Aに示す。また、ポジティブコントロールに用いた A23187 (20 M)に対しては発現細胞株および宿主細胞のいずれにおいても同様の応答が観察された（図 5— Bおよび図 6— : B)。

[0338] 7tmHR安定発現株および hk01941安定発現株において、 CCK— 8S添加により、宿主細胞では認められな、細胞内カルシウム (Ca²⁺)濃度変化が観察されたことから、 7tmHR遺伝子および hk01941遺伝子の遺伝子産物はいずれも、 CCK— 8Sにより惹き起こされる細胞応答を媒介すると考える。すなわち、 7tmHR遺伝子および h kO 1941遺伝子の遺伝子産物はいずれも細胞膜表面上に発現され、細胞外の CCK —8Sの作用により、細胞内情報伝達経路を活性ィ匕して細胞内カルシウム (Ca²⁺)濃度の上昇と!/ヽぅ細胞応答を惹き起こしたと考える。

実施例 9

[0339] (variant 3遺伝子安定発現株の機能解析）

variant 3遺伝子の機能を解析するために、 variant 3遺伝子の安定発現株を用いて、 CCK— 8Sによる細胞内カルシウム (Ca²⁺)濃度変化を検討した。細胞内カルシゥム (Ca²⁺)濃度変化は、実施例 5に記載の方法と同様の方法で測定した。 varian t 3遺伝子のスプライシングバリアントの安定発現株は、実施例 7で構築した variant

3遺伝子発現ベクターを使用して、実施例 7に記載の方法と同様の方法により作製た。

[0340] 細胞は、細胞数 3 X lo lOO μ L 培地 Zwellを、 96ゥエルプレート（黒色の壁および透明な底を持つプレート）に播種し、 37°Cにて 5% COインキュベーターで一

2

晚培養した。翌日、各ゥエルより培地を 50 μ Lを抜き取り、ローデイングバッファー（L oading buffer)を 50 μ Lずつ各ゥエルに添カ卩して、室温で 1時間反応させ、ローデイングバッファ一中に含まれる蛍光色素を細胞内に取り込ませた。ローデイングバッファ一は、実施例 5に記載の方法と同様の方法で調製した。反応後、フレックスステーシヨン（FLEXstation、 Molecular Device社製）を用いて CCK— 8S添カ卩時の蛍光強度の経時変化をゥエル毎に 40秒間測定した。 CCK 8Sは終濃度 ΙΟρΜ— 1 Mで用いた。また、アツセィのポジティブコントロールとして Α23187を終濃度 20 Μで用いた。

[0341] variant 3遺伝子安定発現株において、 CCK— 8S添カ卩により、細胞内カルシウム

(Ca²⁺)濃度の上昇が観察された。それに対して、 variant 3発現ベクターをトランスフエクシヨンしていない宿主細胞では、 CCK—8S添カ卩による細胞内カルシウム濃度の変化は観察されなかった。 variant 3安定発現株の代表的なクローンについて、生理的濃度（InM)の CCK— 8Sを添加したときの細胞内カルシウム (Ca²⁺)濃度変化を図 7— Aに示す。また、ポジティブコントロールに用いた A23187 (20 μ Μ)に対しては発現細胞株および宿主細胞のいずれにおいても同様の応答が観察された（図 7— Β)。

[0342] variant 3遺伝子安定発現株において、 CCK 8S添カ卩により、宿主細胞では認められな、細胞内カルシウム（Ca²⁺)濃度変化が観察されたことから、 variant 3遺伝子の遺伝子産物は、 CCK 8Sにより惹き起こされる細胞応答を媒介すると考える。すなわち、 variant 3遺伝子の遺伝子産物はいずれも細胞膜表面上に発現され、細胞外の CCK 8Sの作用により、細胞内情報伝達経路を活性ィ匕して細胞内カルシゥム (Ca²⁺)濃度の上昇と、う細胞応答を惹き起こしたと考える。

実施例 10

[0343] (phO 1207遺伝子の組織発現）

phO 1207遺伝子の組織発現を、 LifeSpan DrugTarget Database™ (LifeSp an Biosciences社)の検索、および BioExpress Database (Gene Logic社)の検索により解析した。

[0344] Lifespan DrugTarget Database (LifeSpan Biosciences社)の検索による解析により、 3種類のゥサギ抗ヒト BAI2ポリクローナル抗体（LS— A981、 A982、 A984 ;Life Span社製）により得られた組織免疫染色データから、扁桃体、海馬、髄質、視床、黒質、大脳皮質の各部位の-ユーロンとァストロサイト、および下垂体前葉の一部の細胞、下垂体後葉のへリング体が共通して強く染色されることが明らかになった。図 8—Aおよび図 8— Bにそれぞれ、扁桃体の原型質性ァストロサイト (proto plasmic astrocyte)、並びに扁桃体の-ユーロンおよびグリアの LS—A981による組織免疫染色データを示す。また、図 8— Cおよび図 8— Dにそれぞれ、海馬の CA2 領域の-ユーロンおよび CA1領域の-ユーロンの LS— A981による組織免疫染色データを示す。

[0345] BioExpress Database (Gene Logic社）の Genetip解析データを用いた発現解析は、 ph01207 (hBAI2)、 CCK— A受容体（CCK— AR)、 CCK— B受容体（C CK—BR)および CCKについて行った。その結果を表 3に示す。

[0346] ph01207 (hBAI2)遺伝子は、脳組織、特に大脳皮質 (大脳側頭極、運動皮質等 )、海馬、および扁桃体等に限局して強く発現していることが認められた (表 3)。本遺伝子は消化管、例えば脾臓、小腸、胃および胆嚢等ではほとんど認められな力つた

[0347] それに対し、 CCK A受容体 (表中 CCK ARと表示する）は脳組織内での発現はほとんど認められず、消化管、例えば脾臓、胃および胆嚢等で発現していることが確認できた (表 3)。また、 CCK— B受容体 (表中 CCK— BRと表示する）は脾臓および小腸での発現が高ぐまた脳組織、例えば大脳皮質、海馬および扁桃体等で発現して、ることが確認できた (表 3)。 ph01207 (hBAI2)遺伝子の脳組織内での発現量は、 CCK B受容体の発現量と比較して、より高い発現量であった。

[0348] CCKの組織発現を解析したところ、 phO 1207の組織発現と同様の分布が認められた。したがって、 ph01207と CCKとは同じ部位で強く発現していることが確認された (表 3)。 [0349] [表 3]

実施例 11

[0350] ノックアウトマウスの機能に関する情報データベース（Deltagen社)から、 BAI2ノックァ外マウスの機能に関する情報を得た。

[0351] BAI2ノックアウトマウスは、相同組換えによる遺伝子破壊により作製された。相同組換えによる遺伝子破壊は、具体的には、マウス BAI2遺伝子（1560アミノ酸残基をコードする）の塩基配列中の、マウス BAI2の第 876番目のァスパラギン酸 (D)から第 9 17番目のロイシン (L)をコードする領域 (876D— 917L領域)を標的としたターゲテイングベクターを作成し、該ターゲティングベクターを 129Z〇laHsdマウス由来の E S細胞に導入することにより実施された。ターゲテイングベクターには、 LacZ— Neo 遺伝子カセットが含まれ、該カセットの 5 則（5'arm)にはマウス BAI2遺伝子の 876 D— 917L領域の上流にあるイントロンより 0. 8kb上流側のゲノム配列、 3 則（3'arm )には同遺伝子の 876D— 917L領域の下流にあるイントロンより 1. 2kb下流側のゲノム配列が含まれている。本ターゲテイングベクターを用いた相同組換えにより、マウス BAI2遺伝子の標的部位には LacZ— Neo断片が挿入される。相同組換えが起きた ES細胞を G418含有の選択培地により選抜し、 C57BL/6マウスを用いて常法によりキメラマウスが作製された。得られたキメラマウスと C57BLZ6マウスを交配することにより、雑種第一代 (F1)ヘテロ変異マウスが作製された。さらに F1ヘテロ変異マウス同士の交配により雑種第二代 (F2)ホモ変異マウスが作製された。

[0352] F1ヘテロ変異マウスおよび F2ホモ変異マウスの遺伝子型の確認は、 PCRおよびノザン解析により実施された。

[0353] マウス BAI2遺伝子の標的部位に LacZ— Neo断片が挿入されたか否かの確認は、 Flヘテロ変異マウスについて LacZ発現解析により行われた。その結果、 F1ヘテロ変異マウスにおいて、組織、特に海馬および扁桃体で LacZの強い発現が認められた（図 9— Aおよび図 9— B)。この結果から、 F1ヘテロ変異マウスにおいて、マウス B AI2遺伝子の標的部位に LacZ— Neo断片が挿入されたこと、すなわち該遺伝子が破壊されたことが確認された。この結果はまた、 F1ヘテロ変異マウスにおいて、マウス BAI2遺伝子が、脳組織、特に海馬および扁桃体で強く発現していることを示すものである。

[0354] BAI2ノックアウトマウスの機能の検討を、行動学的検査、生理学的検査、病理学的検査および解剖学的検査により行った。

[0355] BAI2ノックアウトマウスは、行動学的検査にお!、て尾懸垂試験の結果に、野生型マウスと比較して有意な差が観察された (図 10)。一方、生理学的検査、病理学的検查、解剖学的検査等、多くの検査項目において野生型マウスと比較して有意な差は認められなかった。

[0356] 尾懸垂試験は、マウスの尾を固定して逆さ釣りにした状態で、逃げようと動き始めるまでの静止時間を測定する試験法であり、うつ病の表現型を調べる試験法として一般的に用いられている手法である。尾懸垂試験は、抗うつ薬の評価等、うつ病との関連性を調べる試験系として用いられている（ステル（Stem L. )ら、「サイコファーマコロジ一（p_sychopharmacology (Berl) )」、 1985年、第 85卷、第 3号、 p. 367— 3 70 ;クラウリー（Crowley J. J. )ら、「ファーマコロジーバイオケミストリーアンドビヘイビア (Pharmacological Biochemical BehaviorJ、 2004年、第 78卷、第 2 号、 p. 269— 274 ;ニールセン（Nielsen D. M. )ら、「ョ一口ビアンジャーナルォブファーマコロジー (European Journal of Pharmacology)」、 2004年、第 499卷、第 1—2号、 p. 135 - 146 )。

[0357] 尾懸垂試験において無動時間が長いほど抑うつ状態、短いほど抗うつ状態である事が知られている。例えば、抗うつ薬投与により、無働時間が短縮されることが知られている。

[0358] 尾懸垂試験は、 BAI2ノックアウトマウス 10匹を用いて実施された。コントロールとして、野生型マウス 16匹を用いて同様に尾懸垂試験を実施した。 [0359] BAI2ノックアウトマウスは、尾懸垂試験において野生型マウスと比較して無働時間が有意に短縮された（図 10)。結果は、 BAI2ノックアウトマウス群および野生型マウス群の各マウスの無動時間の平均値士標準誤差で示した。有意差は Tテストを用いた統計学的処理にぉ、て認められた。

[0360] 尾懸垂試験の結果から、 BAI2 ノックアウトマウスが抗うつ状態にあると解釈できる

。 BAI2ノックアウトマウスが抗うつ様の表現型を示すことから、 BAI2遺伝子はうつ病に関連していると考えられる。

[0361] BAI2ノックアウトマウスでは、 BAI2遺伝子が破壊されているため、 BAI2遺伝子およびそのスプライシングバリアントは発現されない。したがって、 BAI2遺伝子のみならず、そのスプライシングバリアントもうつ病に関与すると考える。

実施例 12

[0362] ph01207発現細胞株を用いた細胞内カルシウム濃度変化測定系により、リガンドに対する ph01207遺伝子産物の応答を阻害する化合物の同定を行った。

[0363] ph01207発現細胞株は、次のように構築した。まず、実施例 1で同定した _Ph0120 7 cDNAクローンと pcDNA3. 1 (Invitrogen社製）との間で Asp718I (Boehringe r社製)および NotI (TAKARA社製）による組換えを行い、ェピトープタグを含まな V、phO 1207発現ベクターを構築した。 phO 1207発現ベクターを宿主細胞である CH O—Kl株にリポフエクトァミン 2000 (Invitrogen社製）を用いてトランスフエクシヨンし、 G418を含む選択培地により安定発現株の選抜を行った。細胞における導入遺伝子の発現の検出は、抗 phO 1207抗体を用いて FCM解析により行った。

[0364] その結果、 phO 1207を安定発現する複数の細胞株が得られた。その中の 1クローンである _Ph01207 # 3F8— 17株を用いて化合物の同定を実施した。

[0365] リガンドは、 CCK 8S (ペプチド研究所製）を用いた。 CCK-8S (配列番号 14)は、0. 52mgを 4. 5mLの 1% NaHCO (Wako社製）で溶解し、 0. ImM濃度の溶

3

液を調製した。被検化合物として、化合物ライブラリーであるソフトフォーカスジーピ一シーア一ノレターゲットダイレクティッドライブラリー（SoftFocus GPCR Targe t - Directed Library、 BioFocus社製）を用、た。化合物は、ずれも、 2mg/mL DMSO溶液を PBSで 25倍希釈し、 80 gZmLの濃度に調製して用いた。 [0366] 化合物の同定は、具体的には以下のように行った。 ph01207 # 3F8— 17株を、 9 6ゥエルプレート（壁面が黒色で底面が透明なもの）に、細胞数 3 X 10 V 100 μ L mediumZwellで播種し、 37°Cにて 5%CO存在下で培養した。培地（medium)は

2

、 10% 牛胎仔血清（Moregate社製）を含む DMEMZF12 (Gibco社製）を用いた。翌日、各ゥエルに、 6 Xローデイングバッファー（Loading buffer)を 20 μ Lずつ添カロして 37°Cで 1時間反応させ、ローデイングバッファ一中に含まれる蛍光色素を細胞内に取り込ませた。 6 Xローデイングバッファ一は、 FLIPRカルシウム 3 アツセィキット（FLIPR Calcium 3 Assay Kitゝ Molecular Device社製）のコンポーネント Aをコンポーネント Bで溶解後、プロべネシド（probenecid、 Sigma社製）を終濃度 1 5mMとなるように加えて調製した。反応後、 CCK— 8S (ペプチド研究所製)および化合物を添加して、蛍光強度の経時変化をゥエル毎に 80秒間測定した。コントロールとして、化合物の代わりにバッファーを用いて同様の測定を行った。測定開始 15 秒後に化合物を終濃度 10 gZmLとなるように添加する力またはバッファーを添カロし、化合物またはバッファーの添加 35秒後に CCK— 8Sを終濃度 ΙΟηΜとなるように添加した。蛍光強度の経時変化の測定は、フレックスステーション（FLEXstation、 Molecular Device社製）を用いて行った。

[0367] 試験した化合物のうちいくつかの化合物力 ¾h01207 # 3F8— 17株の CCK 8S に対する応答を阻害した。代表例として、 3つの化合物 (ィ匕合物 A、化合物 Bおよび化合物 C)をそれぞれ添カ卩したときの、 phO 1207 # 3F8 17株の CCK 8Sに対する応答を図 11— A、図 11— Bおよび図 11— Cに示す。化合物 A、化合物 Bおよびィ匕合物 Cはそれぞれ上記式 (I)、 (II)および (III)で表される化合物である。

[0368] 測定開始 15秒後に化合物 Aを添加したときもノッファーを添加したときも蛍光強度の変化はなかった。化合物 Aまたはバッファー添カ卩の 35秒後にリガンドである CCK —8Sを添加したとき、ノッファーを添加したゥエルでは蛍光強度が上がり、リガンドに対する phO 1207 # 3F8— 17株の応答が観察されたが、化合物 Aを添加したゥエルではこのような応答が阻害された（図 11— A)。このことは、化合物 Aが、 CCK— 8Sと phO 1207の相互作用に対するアンタゴニストとして作用していることを示唆する。

[0369] 化合物 Bおよびィ匕合物 Cはいずれも、化合物 Aと同様に、リガンドに対する ph0120 7 # 3F8— 17株の応答を阻害した（図 11— Bおよび図 11— C)。このことは、化合物 Bおよび化合物 Cがいずれも、 CCK— 8Sと ph01207の相互作用に対するアンタゴ二ストとして作用して、ることを示唆する。

[0370] 上記結果より、 phO 1207発現細胞株を用いた細胞内カルシウム濃度変化測定系により、 ph01207のそのリガンド、例えば CCK— 8Sに対する応答を阻害するアンタゴニストを同定できると考える。

産業上の利用可能性

[0371] 本発明により、 GPCRと考えられる 7回膜貫通ドメインを有する機能的膜蛋白質受容体として作用する蛋白質および該蛋白質をコードする DNAを提供できる。本蛋白質は、細胞で発現させたときに細胞膜上に発現され、リガンド刺激により細胞内情報伝達を活性化し、細胞応答を惹き起こす。

[0372] 本発明により、本蛋白質が関与する情報伝達経路および細胞機能の解明とその調節を実施できる。本発明によりまた、本蛋白質および Zまたは DNAの異常に起因する疾患、例えばうつ病の防止および Zまたは治療の実施が可能になる。

[0373] このように、本発明は基礎科学分野力医薬開発分野まで広く寄与する有用なものである。

配列表フリーテキスト

[0374] 配列番号 1：新規機能的膜蛋白質受容体をコードする DNA。

配列番号 2：配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質。

配列番号 2 : (297)： (350)丁3?—1ドメィン。

配列番号 2 : (352)： (405)TSP—Iドメイン。

配列番号 2 : (408)： (461)TSP—Iドメイン。

配列番号 2 : (870)： (890)膜貫通ドメイン。

配列番号 2 : (899)： (919)膜貫通ドメイン。

配列番号 2 : (928)： (948)膜貫通ドメイン。

配列番号 2 : (970)： (990)膜貫通ドメイン。

配列番号 2 : (1012)： (1032)膜貫通ドメイン。配列番号 2 (1087)： (1107)膜貫通ドメイン。

配列番号 2 (1114) : (1134)膜貫通ドメイン。

配列番号 3 配列番号 2に記載のアミノ酸配列で表されるペプチド、 hBAIl、および h

BAI2のそれぞれの C末端側領域に存在する部分アミノ酸配列。

配列番号 4：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。

配列番号 5：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。

配列番号 6：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。

配列番号 7：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。

配列番号 8：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。

配列番号 9：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。

配列番号 10：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。

配列番号 11：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。

配列番号 12：合成オリゴヌクレオチド。

配列番号 13：合成オリゴヌクレオチド。

配列番号 14 : CCK 8S

配列番号 14 : (2) : (2)硫酸化。

配列番号 15：配列番号 1に記載の DNAのスプライシングバリアント。

配列番号 16 :配列番号 15に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質。

配列番号 16

配列番号 16 1032)： (1052)膜貫通ドメイン。

配列番号 16 1059)： (1079)膜貫通ドメイン。配列番号 17配列番号 1に記載の DNAのスプライシングバリアント。

配列番号 18 配列番号 17に記載の塩基配列で表される DNAによりコ -ドされる蛋白質。

配列番号 18 (297)： (350)TSP— Iドメイン。

配列番号 18 (352)： (405) TSP—Iドメイン。

配列番号 18 (408)： (461)TSP— Iドメイン。

配列番号 18 (870)： (890)膜貫通ドメイン。

配列番号 18 (899)： (919)膜貫通ドメイン。

配列番号 18 (928)： (948)膜貫通ドメイン。

配列番号 18 (970)： (990)膜貫通ドメイン。

配列番号 18 (1012)： (1032)膜貫通ドメイン。

配列番号 18 (1087)： (1107)膜貫通ドメイン。

配列番号 18 (1114) : (1134)膜貫通ドメイン。

配列番号 19 配列番号 1に記載の DNAのスプライシングバリアント。

配列番号 20配列番号 19に記載の塩基配列で表される DNAによりコ -ドされる蛋白質。

配列番号 20 (297)： (350)TSP— Iドメイン。

配列番号 20 (352)： (405) TSP—Iドメイン。

配列番号 20 (407)： (460) TSP—Iドメイン。

配列番号 20 (463)： (516)TSP— Iドメイン。

配列番号 20 (925)： (945)膜貫通ドメイン。

配列番号 20 (954)： (974)膜貫通ドメイン。

配列番号 20 (983)： (1003)膜貫通ドメイン。

配列番号 20 (1025)： (1045)膜貫通ドメイン。

配列番号 20 (1067)： (1087)膜貫通ドメイン。

配列番号 20 (1142)： (1162)膜貫通ドメイン。

配列番号 20 (1169)： (1189)膜貫通ドメイン。

配列番号 21 hBAI2をコードする DNAであり、配列番号 1に記載の DNAのスプライシングバリアント。

配列番号 22：配列番号 21に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質。

配列番号 22 (297)： (350)TSP—Iドメイン。

配列番号 22 (352)： (405)TSP—Iドメイン。

配列番号 22 (407)： (460)TSP—Iドメイン。

配列番号 22 (463)： (516)TSP—Iドメイン。

配列番号 22 (925)： (945)膜貫通ドメイン。

配列番号 22 (954)： (974)膜貫通ドメイン。

配列番号 22 (983)： (1003)膜貫通ドメイン。

配列番号 22 (1025) : (1045)膜貫通ドメイン。

配列番号 22 (1067) : (1087)膜貫通ドメイン。

配列番号 22 (1142) : (1162)膜貫通ドメイン。

配列番号 22 (1169) : (1189)膜貫通ドメイン。

配列番号 23 プライマ一用に設計されたオリゴヌクレオチド。

配列番号 24プライマ一用に設計されたオリゴヌクレオチド。

Claims

請求の範囲

[1] 配列表の配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質またはそのホモログ蛋白質のアンタゴニストである抗うつ作用を有する化合物の同定方法であって、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAまたはそのホモログ DNA、該 DNAによりコードされる蛋白質および該 DNAを含む細胞力もなる群力選択される少なくともいずれか 1を用いることを特徴とする同定方法。

[2] 配列表の配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質と該蛋白質のスプライシングバリアントとからなる群力も選ばれるいずれか 1の蛋白質のアンタゴニストである抗うつ作用を有する化合物の同定方法であって、配列表の配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAおよびそのスプライシングバリアントである DNAのうちいずれ力 1の塩基配列で表される DNA、該 DNAによりコードされる蛋白質および該 DNAを含む細胞からなる群から選択される少なくともヽずれか 1を用いることを特徴とする同定方法。

[3] 配列表の配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質と該蛋白質のスプライシングバリアントとからなる群力選択されるいずれ力 1の蛋白質のアンタゴニストである抗うつ作用を有する化合物の同定方法であって、配列表の配列番号 1、 15、 17、 19および 21に記載の塩基配列のうちいずれ力 1の塩基配列で表される DNAを含む細胞と被検化合物とを接触させ、該細胞の細胞膜上に発現された該 DNAによりコードされる蛋白質の機能を測定し、該細胞を被検化合物を接触させないときと比較して該蛋白質の機能を低下または消失させる被検化合物を抗ぅつ作用を有する化合物であると決定することを含む同定方法。

[4] 細胞の細胞膜上に発現された DNAによりコードされる蛋白質の機能が、該蛋白質のリガンドの添カ卩により細胞内カルシウム濃度の上昇を惹き起こす機能である、請求項 3に記載の同定方法。

[5] 細胞の細胞膜上に発現された DNAによりコードされる蛋白質の機能が、該蛋白質のリガンドの添カ卩により膜電位変化を惹き起こす機能である、請求項 3に記載の同定方法。

[6] 下記の群； (i)コレシストキ-ンォクタペプチド硫酸ィ匕型（cholecystokinin octapeptide sulf ated form;配列番号 14、以下、 CCK 8Sと略称する）、

(ii) CCK 8Sのアミノ酸配列において、 1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付カロなどの変異を有し、かつ CCK 8Sと同質の機能を有するペプチド、

および

より選択されるペプチドをリガンドとして用いる、請求項 4または 5に記載の同定方法。

[7] 配列表の配列番号 15に記載の塩基配列で表される DNAまたはその相補鎖。

[8] 配列表の配列番号 17に記載の塩基配列で表される DNAまたはその相補鎖。

[9] 請求項 7または 8に記載の DNAまたはその相補鎖を含有する組換えベクター。

[10] 請求項 9に記載の組換えベクターを導入されてなる形質転換体。

[11] 請求項 7に記載の DNAによりコードされる蛋白質。

[12] 配列表の配列番号 16に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質。

[13] 請求項 8に記載の DNAによりコードされる蛋白質。

[14] 配列表の配列番号 18に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質。

[15] 請求項 7または 8に記載の DNAを含有する発現組換えベクターを導入されてなる形質転換体を培養する工程を含む、請求項 11から 14のいずれか 1項に記載の蛋白質の製造方法。

[16] 配列表の配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAおよび該 DNAのスプライシングバリアント、該 DNAおよび該 DNAのスプライシングバリアントから選択されるヽずれか 1の DNAを含む組換えベクター、該組換えベクターを導入されてなる形質転換体、該 DNAによりコードされる蛋白質、および該蛋白質を認識する抗体のうち、少なくともいずれ力 1つを含有してなる試薬キット。

[17] 配列表の配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAおよび該 DNAのスプライシングバリアントが、配列表の配列番号 1、 15および 17に記載の塩基配列のうちいずれか 1の塩基配列で表される DNAであり、該 DNAによりコードされる蛋白質が配列表の配列番号 2、 16および 18に記載のアミノ酸配列のうちいずれ力 1のアミノ酸配列で表される蛋白質である請求項 16に記載の試薬キット。

[18] 配列表の配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAによりコードされる蛋白質と該蛋白質のスプライシングバリアントとからなる群力選択されるいずれ力 1の蛋白質の機能および Zまたは発現を阻害することを手段とする抑うつ状態の改善方法。

[19] 請求項 18に記載の抑うつ状態の改善方法を用いるうつ病の防止および Zまたは治療方法。

[20] 配列表の配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAおよび該 DNAのスプライシングバリアントから選ばれる少なくともいずれ力 1の DNA、および Zまたは、該 DNA によりコードされる蛋白質をマーカーとして定量的または定性的に分析することを含んでなる、うつ病の診断に使用するための測定方法。

[21] 配列表の配列番号 1に記載の塩基配列で表される DNAおよび該 DNAのスプライシングバリアントから選ばれる少なくともいずれ力 1の DNA、および Zまたは、該 DNA によりコードされる蛋白質をマーカーとして定量的または定性的に分析することを含んでなるうつ病の診断方法。