JPWO2006118289A1 - 抗うつ作用を有する化合物の同定方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）と同質の機能を有する蛋白質をコードする遺伝子および該蛋白質を見出し、該蛋白質の機能および／または発現を調節する化合物の同定方法、該遺伝子および蛋白質と関連する疾患の予防および／治療に有効な手段を提供することを課題とし、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖、該ＤＮＡの相同物、前記ＤＮＡがコードする蛋白質、前記ＤＮＡを含むベクター、前記ベクターを含む形質転換体、前記蛋白質に対する抗体、これらを用いる前記蛋白質の機能および／または発現を調節する化合物の同定方法、抑うつ状態の改善剤および改善方法、医薬組成物および試薬キットを提供した。

Description

本発明は、抗うつ作用を有する化合物の同定方法に関するものである。より詳しくは、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質と該蛋白質のスプライシングバリアントとからなる群から選ばれるいずれか１の蛋白質のアンタゴニストである抗うつ作用を有する化合物の同定方法に関する。また本発明は、前記スプライシングバリアントをコードするＤＮＡまたはその相補鎖、該ＤＮＡまたはその相補鎖を含有する組換えベクター、および該組換えベクターを導入されてなる形質転換体に関する。さらに本発明は、前記スプライシングバリアントをコードするＤＮＡから翻訳される蛋白質および該蛋白質の製造方法に関する。また本発明は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡのスプライシングバリアント、該ＤＮＡおよび該ＤＮＡのスプライシングバリアントから選択されるいずれか１のＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターを導入されてなる形質転換体、該ＤＮＡによりコードされる蛋白質、および該蛋白質を認識する抗体のうち、少なくともいずれか１つを含有してなる試薬キットに関する。さらに本発明は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質と該蛋白質のスプライシングバリアントとからなる群から選ばれるいずれか１の蛋白質の機能および／または発現を阻害する化合物を含む抑うつ状態の改善剤に関する。また本発明は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質と該蛋白質のスプライシングバリアントとからなる群から選ばれるいずれか１の蛋白質の機能および／または発現を阻害することを手段とする抑うつ状態の改善方法に関する。さらに本発明は、前記抑うつ状態の改善剤を有効量含んでなるうつ病の防止および／または治療剤に関する。また本発明は、前記抑うつ状態の改善剤または前記抑うつ状態の改善方法を用いるうつ病の防止および／または治療方法に関する。さらに本発明は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡのスプライシングバリアントまたはその相補鎖、または該スプライシングバリアントによりコードされる蛋白質を定量的または定性的に測定する方法に関する。また本発明は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡのスプライシングバリアントから選ばれる少なくともいずれか１のＤＮＡ、および／または、該ＤＮＡによりコードされる蛋白質を分析することを含んでなる、うつ病の診断に使用するための測定方法またはうつ病の診断方法に関する。
膜蛋白質受容体は、生体膜の脂質二重層を貫通するドメインを持ち、細胞膜に存在して、各種生理活性物質を特異的に認識し、その作用を伝達し発現する蛋白質である。膜蛋白質受容体に特異的に結合する生理活性物質を一般にリガンドと称する。リガンドとして、ペプチドホルモン、神経伝達物質、および増殖因子等が例示される。リガンドが膜蛋白質受容体に結合すると、セカンドメッセンジャーの形成、細胞内イオン濃度の変化、および蛋白質のリン酸化等を介して細胞応答が惹き起こされる。リガンドの膜蛋白質受容体への結合により細胞内でセカンドメッセンジャーの形成、細胞内イオン濃度の変化、および蛋白質のリン酸化等の変化が生じる一連の反応を一般的に情報伝達と称し、該一連の反応の過程を情報伝達経路と称する。
Ｇ蛋白質共役型受容体（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下、ＧＰＣＲと略称することがある）は細胞膜に存在する糖蛋白質で、細胞膜貫通ドメインを７個有するという構造的特徴を持つ細胞膜７回貫通型受容体の１種であり、多数のメンバーを有するスーパーファミリーを構成している。既に１０００種類以上のＧＰＣＲ遺伝子が同定され、ＧＰＣＲの３次元構造、ＧＰＣＲに対するリガンド、ＧＰＣＲを介する細胞内情報伝達経路、およびその機能等に関する研究が進められている。
ＧＰＣＲは、光、匂い、味の受容体であると同時に、ホルモンや神経伝達物質の受容体でもあり、酵母からヒトまで、生体において細胞の主要なセンサーとして働いている。
ＧＰＣＲはリガンドにより刺激を受けると、細胞内に存在するＧ蛋白質と結合する。Ｇ蛋白質は、ＧＰＣＲと共役し、情報伝達因子として機能する蛋白質である。Ｇ蛋白質は、細胞内情報伝達経路において情報伝達に関わる数々の因子（以下、エフェクターと称する）に対する機能と該蛋白質をコードする遺伝子の違いから、数種類のファミリーに大別されている。いずれのファミリーに属するＧ蛋白質も、α、βおよびγと称する３つのサブユニットからなる３量体であり、通常、グアノシン５´−二リン酸（ＧＤＰ）がαサブユニットに特異的に結合している。ＧＤＰ結合型Ｇ蛋白質は、エフェクターに対して作用を示さない不活性型である。ＧＰＣＲがリガンドにより刺激を受けると、Ｇ蛋白質に結合しているＧＤＰと細胞内に存在するグアノシン５´−三リン酸（ＧＴＰ）との交換反応が生じ、Ｇ蛋白質からＧＤＰが遊離し、それに続いてＧ蛋白質へＧＴＰが結合し、ＧＴＰ結合型Ｇ蛋白質が形成される。ＧＴＰ結合型Ｇ蛋白質は活性型と呼ばれ、ＧＴＰが結合しているαサブユニット（αＧＴＰ）とβおよびγサブユニットからなる２量体（βγ）とに速やかに解離する。αＧＴＰとβγは、エフェクター（例えばカルシウムイオンチャネルやカリウムイオンチャネル等）に直接作用して、細胞内情報伝達経路を活性化し、その結果、数々の細胞応答を惹き起こす。
ＧＰＣＲスーパーファミリーのなかで、クラスＢ（Ｓｅｃｒｅｔｉｎ ｌｉｋｅ）に分類されているヒト脳血管形成阻害因子２（ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ２、以下ｈＢＡＩ２と略称する）は、その遺伝子がＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＡＢ００５２９８として登録されている。
ｈＢＡＩ２については、配列情報と発現分布に関する報告（非特許文献１）があるが、その機能および疾患との関連に関しては報告されていない。しかし、ＢＡＩ２のホモログであるＢＡＩ１との構造比較により、細胞外ドメイン中にトロンボスポンジン タイプＩドメイン（以下、ＴＳＰ−Ｉドメインと称する）が存在すると考えられている（非特許文献２）。ＴＳＰ−Ｉドメインは、トロンボスポンジン（ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）の第３８５番目から第５２２番目のアミノ酸配列で表される領域に認められる特徴のあるドメインであり、トロンボスポンジンの細胞外マトリックスへの関与およびその血管新生阻害能に重要な機能ドメインであることが知られている。
ｈＢＡＩ１については、特異的にヒト脳組織での発現が高いこと、細胞外領域に血管新生抑制能を持つドメインが存在すること、ｐ５３による発現制御を受けている可能性があること等が報告されており、この遺伝子が脳における血管新生に関する機構に何らかの関与をしている可能性が示唆されている（非特許文献１−４）。
ｈＢＡＩ２の関連遺伝子であるマウスＢＡＩ２については、脳虚血モデルラットの脳組織においてＢＡＩ２と血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ：ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）との間に発現量の負の相関が見られることが報告されており、ｈＢＡＩ１同様に血管新生に関与している可能性が考えられている。具体的には、低酸素状態の後、ＢＡＩ２の発現が低下し、その後ＶＥＧＦの発現が増加した。また、マウスＢＡＩ２のスプライシングバリアントの存在が報告されている（非特許文献３）。
ｈＢＡＩ１およびｈＢＡＩ２は共に配列情報よりＧＰＣＲファミリーであることが予想されるにもかかわらず、リガンドに関する情報も含めてこれらのＧＰＣＲとしての機能に言及した報告は見られない。
一方、コレシストキニン（ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ、以下、ＣＣＫと略称する）は、十二指腸粘膜中の内分泌細胞から放出される消化管ホルモン（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｈｏｒｍｏｎｅ）として知られている。ＣＣＫは、脂肪の摂取に伴って分泌され、胆嚢収縮や膵酵素分泌を促進する。そして、胆嚢収縮、膵臓酵素分泌促進、腸管運動刺激等の消化器官での作用を示す。また、ＣＣＫは満腹感を脳のニューロンに与える信号物質と考えられている。
ＣＣＫは、そのＣ末端側から７番目のチロシン残基が硫酸化されていることが知られている。ＣＣＫは、翻訳後のプロセッシングにより、ＣＣＫ−４、ＣＣＫ−８、ＣＣＫ−１２、ＣＣＫ−３３、ＣＣＫ−５８等、Ｎ末端側の切断部位が異なる数種の長さの断片が生じる。これら各断片の生理活性や存在量が異なることが確認されている。また、ＣＣＫと類似した化学構造をもち、同一生物活性を示す化合物として、カエルの皮膚から抽出されたセルレイン（ｃｅｒｕｌｅｉｎ）が報告されている。
ＣＣＫは、また、脳組織に広く分布しており、例えば、大脳皮質、海馬、扁桃体や視床下部に多く認められ、不安、鎮痛、鎮静、摂食抑制、記憶や学習への関与等の中枢神経での作用も報告されている。ＣＣＫは、ＤＡ（ドパミン；Ｄｏｐａｍｉｎｅ）やＧＡＢＡ（γアミノ酪酸；γ ａｍｉｎｏ ｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）と一部共存しており、５ＨＴ（セロトニン；５−ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔａｍｉｎｅ）作動性神経系等との相互作用も報告されている。また、ＣＣＫの放出がＧＡＢＡによって調節されているという報告もある。脳内に存在して生理活性を示すＣＣＫとして、主にＣＣＫ−８やＣＣＫ−４が報告されている。また、脳内に存在するＣＣＫ−８は、Ｃ末端側から７番目のチロシン残基が硫酸化されているコレシストキニンオクタペプチド硫酸化型（ＣＣＫ−８Ｓ：ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ ｏｃｔａｐｅｐｔｉｄｅ ｓｕｌｆａｔｅｄ ｆｏｒｍ）である。
近年、ＣＣＫが記憶の保持に必要不可欠であることが報告されている。例えば、ＣＣＫ−８Ｓが無いと記憶を意識レベルに呼び戻して行動に移すことが困難であること、また、ＣＣＫ−４（ＣＣＫ−３３のＣ末端テトラペプチド）が記憶の想起を妨げること等が明らかにされている。
ＣＣＫの受容体として、ＣＣＫ−Ａ受容体とＣＣＫ−Ｂ受容体が報告されている。これらはいずれもＧ蛋白質共役型受容体である。ＣＣＫ−Ａ受容体の発現は、消化管由来の組織や細胞および血液中の白血球等で検出されている。ＣＣＫ−Ａ受容体は、細胞内情報伝達経路において、例えばホスホリパーゼＣやアデニルシクラーゼ等のエフェクターの促進を介して消化の調節に関与している。一方、ＣＣＫ−Ｂ受容体の発現は、脳や消化管由来の組織や細胞および血液中の白血球等で検出されている。ＣＣＫ−Ｂ受容体は、ガストリン受容体とも称され、細胞内情報伝達経路において、例えばホスホリパーゼＣや細胞内カルシウムイオン流入等のエフェクターの促進を介して消化の調節や細胞増殖に関与している。近年、ＣＣＫ−Ｂ受容体と不安との関係が注目されている。
シラツチ（Ｓｈｉｒａｔｓｕｃｈｉ，Ｔ．）ら、「サイトジェネティクス アンド セル ジェネティクス（Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、１９９７年、第７９巻、ｐ．１０３−１０８。 ニシモリ（Ｎｉｓｈｉｍｏｒｉ，Ｈ．）ら、「オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）」、１９９７年、第１５巻、ｐ．２１４５−２１５０。 キー（Ｋｅｅ，Ｈ．Ｊ．）ら、「ジャーナル オブ セレブラル ブラッド フロー アンド メタボリズム（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）」、２００２年、第２２巻、ｐ．１０５４−１０６７。 カウル（Ｋａｕｒ Ｂ．）ら、「アメリカン ジャーナル オブ パソロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）」、２００３年、第１６２巻、ｐ．１９−２７。
ＧＰＣＲは生体において細胞の重要なセンサーとして働いており、様々な疾患の治療薬を開発する上で主要な標的分子である。既に数多くのＧＰＣＲが見出されているが、新たなＧＰＣＲの同定は医薬開発の分野において多大な貢献を期待できる。
本発明の課題は、ＧＰＣＲと同質の機能を有する新規蛋白質をコードする遺伝子および該蛋白質を見出して提供することである。また本発明の別の課題は、前記蛋白質の製造法を提供することである。さらに本発明の別の課題は、前記遺伝子を含有する組換えベクターおよび該組換えベクターを導入した形質転換体を提供することである。また本発明の別の課題は、前記遺伝子および蛋白質と疾患との関連を見出し、該疾患の予防および／治療に有効な手段を提供することである。さらに本発明の別の課題は、前記疾患の予防および／治療に用いる化合物の同定方法を提供することである。
本発明者らは上記課題解決のために鋭意努力し、ＧＰＣＲと考えられる７回膜貫通ドメインを有する機能的膜蛋白質受容体として機能する蛋白質および該蛋白質をコードする遺伝子を見出し、該遺伝子を用いてその遺伝子産物を取得することに成功した。そして、該遺伝子を発現させた動物細胞において、細胞膜上に該蛋白質が発現すること、リガンド刺激により細胞内情報伝達を介した細胞応答が生じることを実証した。さらに、該蛋白質が、そのＣ末端領域で、細胞内情報伝達に関わる蛋白質と相互作用すること、またそのアミノ酸配列中に血管新生阻害機能に関与することが知られているＴＳＰ−Ｉドメインを３個有することを明らかにした。またさらに、ＣＣＫ−８Ｓが該機能的膜蛋白質受容体のリガンドとして作用することを実証した。
また本発明において、前記遺伝子のスプライシングバリアントを見出した。そして、該スプライシングバリアントによりコードされる蛋白質が、前記遺伝子によりコードされる蛋白質と同様に、動物細胞で発現させたときに細胞膜上に発現され、リガンド刺激により細胞内情報伝達を介した細胞応答を生じることを実証した。
さらに本発明において、前記遺伝子を発現させた動物細胞をリガンドで刺激して細胞応答を生じさせる実験系を用いることにより、該遺伝子によりコードされる蛋白質の機能、すなわち細胞応答を阻害する化合物を同定し得ることを実証した。
また本発明において、前記遺伝子が脳組織、特に大脳皮質、海馬および扁桃体で強く発現していることを見出した。また、前記遺伝子およびそのスプライシングバリアントがうつ病に関与していることを見出した。
本発明はこれら知見により完成したものである。
すなわち本発明は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質またはそのホモログ蛋白質のアンタゴニストである抗うつ作用を有する化合物の同定方法であって、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡまたはそのホモログＤＮＡ、該ＤＮＡによりコードされる蛋白質および該ＤＮＡを含む細胞からなる群から選択される少なくともいずれか１を用いることを特徴とする同定方法に関する。
本発明はまた、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質と該蛋白質のスプライシングバリアントとからなる群から選ばれるいずれか１の蛋白質のアンタゴニストである抗うつ作用を有する化合物の同定方法であって、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡおよびそのスプライシングバリアントであるＤＮＡのうちいずれか１の塩基配列で表されるＤＮＡ、該ＤＮＡによりコードされる蛋白質および該ＤＮＡを含む細胞からなる群から選択される少なくともいずれか１を用いることを特徴とする同定方法に関する。
本発明はさらに、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質と該蛋白質のスプライシングバリアントとからなる群から選択されるいずれか１の蛋白質のアンタゴニストである抗うつ作用を有する化合物の同定方法であって、配列表の配列番号１、１５、１７、１９および２１に記載の塩基配列のうちいずれか１の塩基配列で表されるＤＮＡを含む細胞と被検化合物とを接触させ、該細胞の細胞膜上に発現された該ＤＮＡによりコードされる蛋白質の機能を測定し、該細胞を被検化合物を接触させないときと比較して該蛋白質の機能を低下または消失させる被検化合物を抗うつ作用を有する化合物であると決定することを含む同定方法に関する。
本発明はさらにまた、細胞の細胞膜上に発現されたＤＮＡによりコードされる蛋白質の機能が、該蛋白質のリガンドの添加により細胞内カルシウム濃度の上昇を惹き起こす機能である、前記同定方法に関する。
本発明はまた、細胞の細胞膜上に発現されたＤＮＡによりコードされる蛋白質の機能が、該蛋白質のリガンドの添加により膜電位変化を惹き起こす機能である、前記同定方法に関する。
本発明はさらに、下記の群；
（ｉ）コレシストキニンオクタペプチド硫酸化型（ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ ｏｃｔａｐｅｐｔｉｄｅ ｓｕｌｆａｔｅｄ ｆｏｒｍ；配列番号１４、以下、ＣＣＫ−８Ｓと略称する）、
（ｉｉ）ＣＣＫ−８Ｓのアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加等の変異を有し、かつＣＣＫ−８Ｓと同質の機能を有するペプチド、
および
（ｉｉｉ）前記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のペプチドのアミノ酸配列を含み、かつＣＣＫ−８Ｓと同質の機能を有するペプチド、
より選択されるペプチドをリガンドとして用いる、前記同定方法に関する。
本発明はさらにまた、配列表の配列番号１５に記載の塩基配列で表されるＤＮＡまたはその相補鎖に関する。
本発明はまた、配列表の配列番号１７に記載の塩基配列で表されるＤＮＡまたはその相補鎖に関する。
本発明はさらに、配列表の配列番号１５に記載の塩基配列で表されるＤＮＡもしくは配列表の配列番号１７に記載の塩基配列で表されるＤＮＡまたはこれらの相補鎖を含有する組換えベクターに関する。
本発明はさらにまた、前記組換えベクターを導入されてなる形質転換体に関する。
本発明はまた、配列表の配列番号１５に記載の塩基配列で表されるＤＮＡもしくは配列表の配列番号１７に記載の塩基配列で表されるＤＮＡまたはこれらの相補鎖によりコードされる蛋白質に関する。
本発明はさらに、配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質に関する。
本発明はさらにまた、配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質に関する。
本発明はまた、配列表の配列番号１５に記載の塩基配列で表されるＤＮＡもしくは配列表の配列番号１７に記載の塩基配列で表されるＤＮＡまたはこれらの相補鎖を含有する発現組換えベクターを導入されてなる形質転換体を培養する工程を含む、前記蛋白質の製造方法に関する。
本発明はさらに、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡのスプライシングバリアント、該ＤＮＡおよび該ＤＮＡのスプライシングバリアントから選択されるいずれか１のＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターを導入されてなる形質転換体、該ＤＮＡによりコードされる蛋白質、および該蛋白質を認識する抗体のうち、少なくともいずれか１つを含有してなる試薬キットに関する。
本発明はさらにまた、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡのスプライシングバリアントが、配列表の配列番号１、１５および１７に記載の塩基配列のうちいずれか１の塩基配列で表されるＤＮＡであり、該ＤＮＡによりコードされる蛋白質が配列表の配列番号２、１６および１８に記載のアミノ酸配列のうちいずれか１のアミノ酸配列で表される蛋白質である前記試薬キットに関する。
本発明はまた、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質と該蛋白質のスプライシングバリアントとからなる群から選択されるいずれか１の蛋白質の機能および／または発現を阻害することを手段とする抑うつ状態の改善方法に関する。
本発明はさらに、前記抑うつ状態の改善方法を用いるうつ病の防止および／または治療方法に関する。
本発明はさらにまた、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡのスプライシングバリアントから選ばれる少なくともいずれか１のＤＮＡ、および／または、該ＤＮＡによりコードされる蛋白質をマーカーとして定量的または定性的に分析することを含んでなる、うつ病の診断に使用するための測定方法に関する。
本発明はまた、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡのスプライシングバリアントから選ばれる少なくともいずれか１のＤＮＡ、および／または、該ＤＮＡによりコードされる蛋白質をマーカーとして定量的または定性的に分析することを含んでなるうつ病の診断方法に関する。
本発明により、ＧＰＣＲと考えられる７回膜貫通ドメインを有する機能的膜蛋白質受容体として作用する蛋白質および該蛋白質をコードするＤＮＡを提供できる。本蛋白質は、細胞で発現させたときに細胞膜上に発現され、リガンド刺激により細胞内情報伝達を活性化し、細胞応答を惹き起こす。
本発明により、本蛋白質が関与する情報伝達経路および細胞機能の解明とその調節を実施できる。本発明によりまた、本蛋白質および／またはＤＮＡの異常に起因する疾患、例えばうつ病の防止および／または治療の実施が可能になる。
配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質が有する機能ドメインを、ｈＢＡＩ２によりコードされる蛋白質と比較して示した模式図である。（実施例１）
配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質の構造的特徴を、そのスプライシングバリアントと比較して示した模式図である。ｐｈ０１２０７は配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質を示す。７ｔｍＨＲ、ｈｋ０１９４１およびｖａｒｉａｎｔ ３はいずれも、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質のスプライシングバリアントを示す。（実施例６）
配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質とそのスプライシングバリアントとのアミノ酸配列を比較して示した図である。図中、二重下線はトロンボスポンジンタイプＩドメイン（ＴＳＰ−Ｉドメイン）を、下線は膜貫通ドメインを示す。ｐｈ０１２０７は配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質を示す。７ｔｍＨＲ、ｈｋ０１９４１およびｖａｒｉａｎｔ ３はいずれも、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質のスプライシングバリアントを示す。（実施例６）
ｃＤＮＡクローンｐｈ０１２０７を、ＦＬＡＧ−ｔａｇ融合蛋白質およびＨＡ−ｔａｇ融合蛋白質としてそれぞれ動物細胞株ＣＨＯ−Ｋ１細胞で発現させたときに、これら蛋白質が細胞膜上に発現されたことを示す図である（それぞれ左パネルおよび右パネル）。細胞膜上の蛋白質の検出は、抗ＦＬＡＧ−ｔａｇ抗体および抗ＨＡ−ｔａｇ抗体並びにＦＩＴＣ標識した二次抗体（ＦＩＴＣ−抗マウスＩｇＧ抗体）を用いたフルオロサイトメトリーにより解析した。図中、黒で示された領域は各ｔａｇ融合蛋白質を発現させた細胞を、白で示された領域は該蛋白質を発現させなかったコントロール細胞を示す。（実施例２）
ＧＰＣＲのリガンド応答を細胞の膜電位変化により測定した場合に観察され得る波形（ＧＰＣＲ特異的な応答により生じる波形（波形１）、人為的要素等により生じる波形（波形２〜４）および応答が無いときに認められる波形（波形５および６））を示す図である。（実施例３）
ｃＤＮＡクローンｐｈ０１２０７を、ＨＡ−ｔａｇ融合蛋白質として安定的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株（ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６）において、１ｎＭのＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）により細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇したことを示す図である。一方、該ｃＤＮＡをトランスフェクションしていないＣＨＯ−Ｋ１細胞株においては、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）による細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇は認められなかった。横軸は細胞内Ｃａ２＋濃度の測定を開始してからの時間（秒）（Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ））を示す。縦軸はＣａ２＋濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度（ＲＦＵ）を示す。（実施例５）
ｃＤＮＡクローンｐｈ０１２０７を、ＨＡ−ｔａｇ融合蛋白質として安定的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株（ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６）において、１ｎＭのＣＣＫ−８ＮＳ（ＣＣＫ−８ Ｎｏｎｓｕｌｆａｔｅｄ ｆｏｒｍ）による細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇が認められなかったことを示す図である。ＣＣＫ−８ＮＳは、ＣＣＫ−８Ｓと同じアミノ酸配列で表されるＣＣＫオクタペプチドであるが、Ｃ末端から７番目のチロシン残基が硫酸化されていないペプチドである。ｃＤＮＡクローンｐｈ０１２０７をトランスフェクションしていないＣＨＯ−Ｋ１細胞株においても、ＣＣＫ−８ＮＳによる細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇は認められなかった。横軸は細胞内Ｃａ２＋濃度の測定を開始してからの時間（秒）（Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ））を示す。縦軸はＣａ２＋濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度（ＲＦＵ）を示す。（実施例５）
ｃＤＮＡクローンｐｈ０１２０７を、ＨＡ−ｔａｇ融合蛋白質として安定的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株（ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６）において、１ｎＭのＣＣＫ−４による細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇が認められなかったことを示す図である。該ｃＤＮＡをトランスフェクションしていないＣＨＯ−Ｋ１細胞株においても、ＣＣＫ−４による細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇は認められなかった。横軸は細胞内Ｃａ２＋濃度の測定を開始してからの時間（秒）（Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ））を示す。縦軸はＣａ２＋濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度（ＲＦＵ）を示す。（実施例５）
ｃＤＮＡクローンｐｈ０１２０７を、ＨＡ−ｔａｇ融合蛋白質として安定的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株（ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６）において、１０μＭのカルシウムイオノフォア Ａ２３１８７により細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇したことを示す図である。該ｃＤＮＡをトランスフェクションしていないＣＨＯ−Ｋ１細胞株においても、Ａ２３１８７による細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇が認められた。横軸は細胞内Ｃａ２＋濃度の測定を開始してからの時間（秒）（Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ））を示す。縦軸はＣａ２＋濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度（ＲＦＵ）を示す。（実施例５）
ｃＤＮＡクローンｐｈ０１２０７を、ＨＡ−ｔａｇ融合蛋白質として安定的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株（ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６）または該ｃＤＮＡをトランスフェクションしていないＣＨＯ−Ｋ１細胞株において、バッファーを添加したときの細胞内Ｃａ２＋濃度を示す。横軸は細胞内Ｃａ２＋濃度の測定を開始してからの時間（秒）（Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ））を示す。縦軸はＣａ２＋濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度（ＲＦＵ）を示す。（実施例５）
７ｔｍＨＲ安定発現株において、１ｎＭのＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）により細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇した代表的な結果を示す図である。７ｔｍＨＲ発現ベクターをトランスフェクションしていない宿主細胞では、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）による細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇は観察されなかった。図中、７ｔｍＨＲ／ＣＨＯ＃６とは、７ｔｍＨＲ安定発現株の１クローンを、ＣＨＯ−Ｋ１は宿主細胞を意味する。横軸は細胞内Ｃａ２＋濃度の測定を開始してからの時間（秒）（Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ））を示す。縦軸はＣａ２＋濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度（ＲＦＵ）を示す。（実施例８）
７ｔｍＨＲ安定発現株において、２０μＭのカルシウムイオノフォア Ａ２３１８７により細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇したことを示す図である。７ｔｍＨＲ発現ベクターをトランスフェクションしていない宿主細胞においても、Ａ２３１８７による細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇が認められた。図中、７ｔｍＨＲ／ＣＨＯ＃６とは、７ｔｍＨＲ安定発現株の１クローンを、ＣＨＯ−Ｋ１は宿主細胞を意味する。横軸は細胞内Ｃａ２＋濃度の測定を開始してからの時間（秒）（Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ））を示す。縦軸はＣａ２＋濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度（ＲＦＵ）を示す。（実施例８）
ｈｋ０１９４１安定発現株において、１ｎＭのＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）により細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇した代表的な結果を示す図である。ｈｋ０１９４１発現ベクターをトランスフェクションしていない宿主細胞では、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）による細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇は観察されなかった。図中、ｈｋ０１９４１／ＣＨＯ＃１３とは、ｈｋ０１９４１安定発現株の１クローンを、ＣＨＯ−Ｋ１は宿主細胞を意味する。横軸は細胞内Ｃａ２＋濃度の測定を開始してからの時間（秒）（Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ））を示す。縦軸はＣａ２＋濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度（ＲＦＵ）を示す。（実施例８）
ｈｋ０１９４１安定発現株において、２０μＭのカルシウムイオノフォア Ａ２３１８７により細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇したことを示す図である。ｈｋ０１９４１発現ベクターをトランスフェクションしていない宿主細胞においても、Ａ２３１８７による細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇が認められた。図中、ｈｋ０１９４１／ＣＨＯ＃１３とは、ｈｋ０１９４１安定発現株の１クローンを、ＣＨＯ−Ｋ１は宿主細胞を意味する。横軸は細胞内Ｃａ２＋濃度の測定を開始してからの時間（秒）（Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ））を示す。縦軸はＣａ２＋濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度（ＲＦＵ）を示す。（実施例８）
ｖａｒｉａｎｔ３安定発現株において、１ｎＭのＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）により細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇した代表的な結果を示す図である。ｖａｒｉａｎｔ３発現ベクターをトランスフェクションしていない宿主細胞では、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）による細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇は観察されなかった。図中、ｖａｒｉａｎｔ３／ＣＨＯ＃１４−１８とはｖａｒｉａｎｔ３安定発現株の１クローンを、ＣＨＯ−Ｋ１は宿主細胞を意味する。横軸は細胞内Ｃａ２＋濃度の測定を開始してからの時間（秒）（Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ））を示す。縦軸はＣａ２＋濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度（ＲＦＵ）を示す。（実施例９）
ｖａｒｉａｎｔ３安定発現株において、２０μＭのカルシウムイオノフォア Ａ２３１８７により細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇したことを示す図である。ｖａｒｉａｎｔ３発現ベクターをトランスフェクションしていない宿主細胞においても、Ａ２３１８７による細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇が認められた。図中、ｖａｒｉａｎｔ３／ＣＨＯ＃１４−１８とはｖａｒｉａｎｔ３安定発現株の１クローンを、ＣＨＯ−Ｋ１は宿主細胞を意味する。横軸は細胞内Ｃａ２＋濃度の測定を開始してからの時間（秒）（Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ））を示す。縦軸はＣａ２＋濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度（ＲＦＵ）を示す。（実施例９）
ｐｈ０１２０７遺伝子がヒト扁桃体の原型質性アストロサイトで強く発現していることを、抗ヒトＢＡＩ２ポリクローナル抗体を用いた組織免疫染色で解析したデータを示す図である。（実施例１０）
ｐｈ０１２０７遺伝子がヒト扁桃体のニューロンおよびグリアで強く発現していることを、抗ヒトＢＡＩ２ポリクローナル抗体を用いた組織免疫染色で解析したデータを示す図である。（実施例１０）
ｐｈ０１２０７遺伝子が海馬のＣＡ２領域のニューロンで強く発現していることを、抗ヒトＢＡＩ２ポリクローナル抗体を用いた組織免疫染色で解析したデータを示す図である。（実施例１０）
ｐｈ０１２０７遺伝子が海馬のＣＡ１領域のニューロンで強く発現していることを、抗ヒトＢＡＩ２ポリクローナル抗体を用いた組織免疫染色で解析したデータを示す図である。（実施例１０）
マウスＢＡＩ２遺伝子を標的としたターゲティングベクターを導入したＥＳ細胞を用いて作製されたＦ１ヘテロ変異マウスの海馬で、ターゲティングベクターに含まれるＬａｃＺ−Ｎｅｏ遺伝子が強く発現していることを、ＬａｃＺ発現解析により検出した結果を示す図である。この結果は、マウスＢＡＩ２遺伝子の標的部位にＬａｃＺ−Ｎｅｏ断片が挿入されたこと、すなわち該遺伝子が破壊されたことを示すと共に、マウスＢＡＩ２遺伝子が海馬で発現していることを示す。（実施例１１）
マウスＢＡＩ２遺伝子を標的としたターゲティングベクターを導入したＥＳ細胞を用いて作製されたＦ１ヘテロ変異マウスの扁桃体で、ターゲティングベクターに含まれるＬａｃＺ−Ｎｅｏ遺伝子が強く発現していることを、ＬａｃＺ発現解析により検出した結果を示す図である。この結果は、マウスＢＡＩ２遺伝子の標的部位にＬａｃＺ−Ｎｅｏ断片が挿入されたこと、すなわち該遺伝子が破壊されたことを示すと共に、マウスＢＡＩ２遺伝子が扁桃体で発現していることを示す。（実施例１１）
ＢＡＩ２ノックアウトマウスおよび野生型マウスを用いた尾懸垂試験における、それぞれの無動時間（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｔｉｍｅ）を示した図である。図中、＋／＋は野生型マウスを、−／−はＢＡＩ２ノックアウトマウスを意味する。尾懸垂試験は、野生型マウス１６匹、ＢＡＩ２ノックアウトマウス１０匹を用いて行った。結果は各マウスの無動時間の平均値（秒（ｓｅｃ））±標準誤差で示した。図中、アスタリスクはｔ−検定を用いた統計学的処理において有意差（Ｐ＜０．０５）が認められたことを示す。（実施例１１）
ｃＤＮＡクローンｐｈ０１２０７を安定的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株において、１０ｎＭのＣＣＫ−８Ｓによる細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇が、１０μｇ／ｍＬの化合物Ａ（ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ａ）の添加により阻害されたことを示す図である。コントロールとしてバッファー（ｂｕｆｆｅｒ）を化合物Ａの代わりに添加した。化合物Ａまたはバッファーは測定開始１５秒後に添加し、ＣＣＫ−８Ｓは化合物Ａまたはバッファーの添加３５秒後に添加した。横軸は細胞内Ｃａ２＋濃度の測定を開始してからの時間（秒）（Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ））を示す。縦軸はＣａ２＋濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度（ＲＦＵ）を示す。（実施例１２）
ｃＤＮＡクローンｐｈ０１２０７を安定的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株において、１０ｎＭのＣＣＫ−８Ｓによる細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇が、１０μｇ／ｍＬの化合物Ｂ（ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｂ）の添加により阻害されたことを示す図である。コントロールとしてバッファー（ｂｕｆｆｅｒ）を化合物Ｂの代わりに添加した。化合物Ｂまたはバッファーは測定開始１５秒後に添加し、ＣＣＫ−８Ｓは化合物Ｂまたはバッファーの添加３５秒後に添加した。横軸は細胞内Ｃａ２＋濃度の測定を開始してからの時間（秒）（Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ））を示す。縦軸はＣａ２＋濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度（ＲＦＵ）を示す。（実施例１２）
ｃＤＮＡクローンｐｈ０１２０７を安定的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株において、１０ｎＭのＣＣＫ−８Ｓによる細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇が、１０μｇ／ｍＬの化合物Ｃ（ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃ）の添加により阻害されたことを示す図である。コントロールとしてバッファー（ｂｕｆｆｅｒ）を化合物Ｃの代わりに添加した。化合物Ｃまたはバッファーは測定開始１５秒後に添加し、ＣＣＫ−８Ｓは化合物Ｃまたはバッファーの添加３５秒後に添加した。横軸は細胞内Ｃａ２＋濃度の測定を開始してからの時間（秒）（Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ））を示す。縦軸はＣａ２＋濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度（ＲＦＵ）を示す。（実施例１２）
本明細書において、単離された若しくは合成の完全長蛋白質；単離された若しくは合成の完全長ポリペプチド；または単離された若しくは合成の完全長オリゴペプチドを意味する総称的用語として「蛋白質」という用語を使用することがある。ここで蛋白質、ポリペプチド若しくはオリゴペプチドは最小サイズが２アミノ酸である。以降、アミノ酸を表記する場合、１文字または３文字にて表記することがある。
本発明は、７回膜貫通ドメインを有する機能的膜蛋白質受容体として機能する蛋白質および該蛋白質をコードするＤＮＡに関する。より詳しくは、本発明は、Ｇ蛋白質共役型受容体として機能する蛋白質および該蛋白質をコードするＤＮＡに関する。
「膜蛋白質受容体」とは、生体膜の脂質二重層を貫通するドメインを持つ蛋白質からなり、細胞膜に存在して、各種生理活性物質を特異的に認識し、その作用を伝達し発現する蛋白質を意味する。ここで、蛋白質は、糖蛋白質を含む。「機能的膜蛋白質受容体」とは、リガンドの作用により、細胞内情報伝達を介した細胞応答を惹き起こす機能を有する膜蛋白質受容体を意味する。膜蛋白質受容体は、リガンドと相互作用する細胞外ドメイン、生体膜の脂質二重層を貫通するドメイン、および細胞内情報伝達を介する細胞内ドメインを有する。
「Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）」とは、リガンドにより刺激を受けると、細胞内に存在するＧ蛋白質と結合し、Ｇ蛋白質を活性化する膜蛋白質受容体を意味する。「Ｇ蛋白質」とは、ＧＰＣＲと共役する蛋白質であり、ＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応によりＧＤＰ結合型Ｇ蛋白質からＧＴＰ結合型Ｇ蛋白質に移行し、細胞内情報伝達因子として数々の細胞応答を惹き起こす蛋白質を意味する。「Ｇ蛋白質を活性化する」とは、ＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応を誘導および／または促進することにより、ＧＤＰ結合型Ｇ蛋白質からＧＴＰ結合型Ｇ蛋白質への移行を誘導および／または促進し、その結果、Ｇ蛋白質が共役しているＧＰＣＲが関与する数々の細胞応答を誘導および／または促進することを意味する。
「リガンド」とは、膜蛋白質受容体に特異的に相互作用する生理活性物質を意味する。
「相互作用」とは、例えば２つの同種あるいは別種の蛋白質が、特異的に作用し合い、その結果、一方のあるいは両方の機能が変化する、例えば亢進する、または低減することを意味する。特異的に作用するとは、その作用に関わる蛋白質以外の蛋白質に比べて、より選択的に作用することを意味する。相互作用には例えば、２つの別種の蛋白質の結合あるいは一方の蛋白質による他方の蛋白質の活性化等が含まれる。
「細胞内情報伝達」とは、受容体に対するリガンドの作用により細胞内でセカンドメッセンジャーの形成、細胞内イオン濃度の変化、および蛋白質のリン酸化等の変化が生じる一連の反応を意味し、「細胞内情報伝達経路」とは該一連の反応の過程を意味する。
本発明において用いるＤＮＡは、より具体的には、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡ、またはそのホモログＤＮＡである。本明細書中、「ホモログＤＮＡ」とは、対象のＤＮＡと配列相同性を有しかつ該ＤＮＡによりコードされる蛋白質と構造的特徴や生物学的機能の類似性等を有する蛋白質をコードするＤＮＡをいう。
本発明において用いるＤＮＡによりコードされる蛋白質は、好ましくは、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質またはそのホモログ蛋白質である。本明細書中、「ホモログ蛋白質」とは、対象の蛋白質と配列相同性を有し、構造的特徴や生物学的機能の類似性等を有する蛋白質をいう。
本発明において、ＤＮＡおよび蛋白質はヒト由来のＤＮＡおよび蛋白質であることが好ましいが、該ヒト由来のＤＮＡおよび蛋白質と同質の機能を有し、かつ構造的相同性を有する哺乳動物由来のＤＮＡおよび蛋白質、例えばマウス、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ラットまたはウサギ等のＤＮＡおよび蛋白質であることができる。
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡは、７回膜貫通ドメインを有する機能的膜蛋白質受容体として機能する蛋白質をコードするＤＮＡである。配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質として、より具体的には、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質が好ましく例示できる。
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質は構造的特徴として、３個のＴＳＰ−Ｉドメイン、１個のＧＰＳ（ＧＰＣＲ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｓｉｔｅ）ドメインおよび１個の７回膜貫通ドメインを有する（図１−Ａおよび図１−Ｂ参照）。７回膜貫通ドメインはＧＰＣＲファミリー２ドメインとも呼ばれ、ＧＰＳドメインと共に、Ｇ蛋白質共役型受容体に特徴的な構造である。ＴＳＰ−Ｉドメインは、トロンボスポンジンに認められる特徴のあるドメインであり、トロンボスポンジンの細胞外マトリックスへの関与およびその血管新生阻害能に重要な機能ドメインであることが知られている。
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡの遺伝子産物は、実際、膜蛋白質受容体としての機能を示した。具体的には、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡを発現させた動物細胞において、細胞膜上に該ＤＮＡによりコードされる蛋白質が発現すること、およびリガンド刺激、例えばＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）刺激により細胞内情報伝達を介した細胞応答が生じることが観察された。
また、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡの遺伝子産物はそのＣ末端領域において、ＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質であるＤＬＧ２、ＤＬＧ３およびＤＬＧ４や、ＡＩＰ１、ＭＡＧＩ３等と相互作用することが観察された。ＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質は、蛋白質間相互作用において標的蛋白質の最もＣ末端のアミノ酸配列を認識するＰＤＺドメインを有し、細胞膜に局在して受容体やイオンチャネル等の膜蛋白質と相互作用することにより、これら膜蛋白質からの情報伝達に関与し、細胞間接着等に寄与していると考えられている。また、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡと配列相同性を有するｈＢＡＩ２遺伝子の遺伝子産物とＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質との相互作用も同様に認められた。一方、ｈＢＡＩ２のホモログであるｈＢＡＩ１が、ＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質の１つであるＢＡＰ１（ＢＡＩ１−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ１）と、ｈＢＡＩ１の末端領域の部分配列（ＱＴＥＶ：配列番号３）を介して結合することが報告されている（シラツチ（Ｓｈｉｒａｔｓｕｃｈｉ，Ｔ．）ら、「バイオケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）」、１９９８年、第２４７巻、ｐ．５９７−６０４）。
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質および該遺伝子と配列相同性を有するｈＢＡＩ２遺伝子（配列番号２１）によりコードされる蛋白質はいずれも、そのＣ末端領域に配列番号３に記載のアミノ酸配列（ＱＴＥＶ）が保存されていることから、この配列部分においてＰＤＺドメインを持つ蛋白質と相互作用すると発明者らは考えている。
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡのホモログＤＮＡは、好ましくは、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡと配列相同性を有し、かつＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）の作用によりＧＰＣＲと同質の機能を示す蛋白質をコードするＤＮＡである。
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡのホモログＤＮＡとして、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡのスプライシングバリアントが好ましく例示される。
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質と構造的特徴や生物学的機能の類似性等を有する蛋白質として、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質のスプライシングバリアントが好ましく例示される。
「スプライシングバリアント」とは、真核生物における遺伝子の発現において、ゲノムから転写されたある遺伝子のｍＲＮＡ前駆体の選択的スプライシングにより生成される２種類以上の成熟ｍＲＮＡ、該成熟ｍＲＮＡの相補的ＤＮＡ、または該成熟ｍＲＮＡから翻訳される蛋白質のいずれかを意味する。真核生物における遺伝子の発現は、ゲノム上に分散して存在するエキソンとエキソンの間に存在するイントロンとからなる領域から転写されたｍＲＮＡ前駆体からスプライシングにより成熟ｍＲＮＡが形成されることにより行われる。さらに、該成熟ｍＲＮＡの翻訳により蛋白質が生成される。スプライシングとは、ｍＲＮＡ前駆体からイントロンがスプライス部位（イントロンとエキソンの境界点）で切り出され、成熟ｍＲＮＡが形成される過程を意味する。スプライシングの際、スプライス部位の位置や組み合わせが変化して２種類以上の成熟ｍＲＮＡが生成する、いわゆる選択的スプライシングが起こることがある。選択的スプライシングの結果、１つの遺伝子から２種以上の蛋白質が生成されることが多い。
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡのスプライシングバリアントは、該ＤＮＡからなる遺伝子のゲノムから転写されたｍＲＮＡ前駆体の選択的スプライシングにより生成される２種類以上の成熟ｍＲＮＡまたは該成熟ｍＲＮＡの相補的ＤＮＡであり得る。
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡのスプライシングバリアントとして、配列番号１５、１７、１９および２１に記載の塩基配列のうちいずれか１の塩基配列で表されるＤＮＡが好ましく例示できる。
配列番号１９に記載の塩基配列で表わされるＤＮＡは、配列番号１、１５、１７、１９および２１に記載の塩基配列のうちいずれか１の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質のうち最長のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードしている。
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡのスプライシングバリアントは、上記例示したスプライシングバリアントに限らず、該ＤＮＡと配列相同性を有し、該ＤＮＡの構造的特徴を有し、さらに該ＤＮＡによりコードされる蛋白質と同質の生物学的機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡである限りにおいて、いずれのＤＮＡも含む。
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質のスプライシングバリアントは、ゲノムから転写された該蛋白質をコードする遺伝子のｍＲＮＡ前駆体の選択的スプライシングにより生成される２種類以上の成熟ｍＲＮＡから翻訳される蛋白質である。
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質のスプライシングバリアントとして、配列番号１５、１７、１９および２１に記載の塩基配列のうちいずれか１の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質が好ましく例示できる。
配列番号１５、１７、１９および２１に記載の塩基配列のうちいずれか１の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質として、配列番号１６、１８、２０、および２２に記載のアミノ酸配列のうちいずれか１のアミノ酸配列で表される蛋白質が好ましく例示できる。
配列番号２０に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質は、配列番号２、１６、１８、２０および２２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質のうち最長のアミノ酸配列を有する蛋白質である。
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質のスプライシングバリアントは、上記例示したスプライシングバリアントに限らず、該蛋白質と配列相同性を有し、該蛋白質の構造的特徴を有し、さらに該ＤＮＡによりコードされる蛋白質と同質の生物学的機能を有する蛋白質である限りにおいて、いずれの蛋白質も含む。
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質のスプライシングバリアントは、言い換えれば、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質と配列相同性を有し、該蛋白質の構造的特徴を有し、さらに該蛋白質と同質の生物学的機能を有する蛋白質である限りにおいて、いずれの蛋白質も含む。
本明細書中、「配列相同性」とは、通常、塩基配列またはアミノ酸配列の全体で５０％以上、好ましくは少なくとも７０％であることが適当である。より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、またさらにより好ましくは９５％以上であることが適当である。
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡと配列相同性を有するＤＮＡには、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡの塩基配列において１個以上、例えば１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１個〜数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加または挿入といった変異が存する塩基配列で表されるＤＮＡが含まれる。好ましくは、このようなＤＮＡであって、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡの生物学的機能と同質の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡが望ましい。変異の程度およびそれらの位置等は、該変異を有するＤＮＡが配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡと同様の構造的特徴を有し、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質と同質の生物学的機能を有するものである限り特に制限されない。
変異を有するＤＮＡは、天然に存在するものであってよく、また天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して得たものであってもよい。変異を導入する手段は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと略称する）等を単独でまたは適宜組合せて使用できる。例えば成書に記載の方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア ラボラトリーマニュアル 第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社）に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、ウルマーの技術（ウルマー（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１）を利用することもできる。
本発明において用いるＤＮＡには、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡのスプライシングバリアントにストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするＤＮＡが含まれる。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば成書に記載の方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア ラボラトリーマニュアル 第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー）等が採用できる。具体的には、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳおよび５０％ ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、０．１×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄する条件をいう。これらＤＮＡは配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡのスプライシングバリアントにハイブリダイゼーションするＤＮＡであれば相補的配列を有するＤＮＡでなくてもよい。好ましくは、コードする蛋白質が、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質の生物学的機能と同質の機能を有するＤＮＡであることが望ましい。
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質と配列相同性を有する蛋白質として、例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１個以上、例えば１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１個〜数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入といった変異を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質の生物学的機能と同質の機能を有する蛋白質が例示できる。アミノ酸の変異の程度およびそれらの位置等は、該変異を有する蛋白質が、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質と同質の機能を有するものである限り特に制限されない。
変異を有する蛋白質は、天然において例えば突然変異や翻訳後の修飾等により生じたものであってよく、また天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して取得したものであってもよい。変異を導入する手段は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはＰＣＲ等を単独でまたは適宜組合せて使用できる。例えば成書に記載の方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア ラボラトリーマニュアル 第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社）に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、ウルマーの技術（ウルマー（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１）を利用することもできる。変異の導入において、当該蛋白質の基本的な性質（物性、機能、生理活性または免疫学的活性等）を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。
構造的特徴として、ＤＮＡについては７回膜貫通ドメインコード領域やＴＳＰ−Ｉドメインコード領域を例示できる。また、該ＤＮＡによりコードされる蛋白質については、構造的特徴として、７回膜貫通ドメインやＴＳＰ−Ｉドメインを例示できる。このようなドメインや領域における配列相同性が、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、またさらにより好ましくは９５％以上であるＤＮＡまたは蛋白質が好ましい。さらに、これらドメインがその機能、例えば該ドメインを含む蛋白質を膜に局在させる機能あるいは血管新生阻害機能を保持しているドメインであることがより好ましい。
また構造的特徴として、ＤＮＡについては３´末端領域に配列番号３に記載のアミノ酸配列（ＱＴＥＶ）をコードする領域が保存されていることが挙げられる。該ＤＮＡによりコードされる蛋白質については、Ｃ末端領域に配列番号３に記載のアミノ酸配列（ＱＴＥＶ）が保存されていることが挙げられる。
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質の生物学的機能と同質の機能として、膜蛋白質受容体としての機能を例示できる。「膜蛋白質受容体としての機能」とは、動物細胞で発現させたときに膜蛋白質として発現され、リガンドの作用により細胞内情報伝達を促進し、細胞応答を誘発させる機能を意味する。例えば、ＧＰＣＲと同質の機能が挙げられる。「ＧＰＣＲと同質の機能」とは、リガンドの作用によりＧ蛋白質に結合してこれを活性化させ、細胞内情報伝達を促進し、細胞応答を誘発する機能をいう。
細胞応答として具体的には、細胞膜電位の変化あるいは細胞内カルシウム濃度の変化を例示できる。細胞膜電位の変化あるいは細胞内カルシウム濃度の変化は自体公知の方法で測定できる。細胞膜電位の変化は、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞に配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡまたは該ＤＮＡのスプライシングバリアントを発現させ、リガンド刺激の存在下または非存在下で、膜蛋白質受容体特異的に発生する電流量を測定し、その電流量を比較することにより検出できる。細胞内カルシウム濃度の変化は、例えば、カルシウムイオンと結合し得る蛍光色素を細胞内に取り込ませ、リガンド刺激の存在下または非存在下で、励起光により蛍光現象を惹き起こし、その蛍光量を比較することにより検出できる。
リガンドとして、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡまたは該ＤＮＡのスプライシングバリアントの発現が認められた細胞または生体組織から調製した試料を例示できる。試料の調製は、例えば細胞または組織を自体公知の方法で培養し、その培養上清を遠心処理等により得る方法や、細胞または組織を自体公知の方法で破砕あるいは溶解する方法により実施できる。リガンドは、これら試料から自体公知の蛋白質精製方法、例えばゲルろ過クロマトグラフィー等により精製して用いることもできる。リガンドとして具体的には、本実施例に用いたＨｅＬａ細胞株の培養上清を例示できるがこれに限定されず、細胞に発現した本ＤＮＡの遺伝子産物に作用して細胞応答を誘発させ得るものであればいずれを用いてもよい。
リガンドとしてＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）をより好ましく例示できる。
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質の生物学的機能と同質の機能としてまた、グアニル酸キナーゼ活性および／または細胞接着機能を有する蛋白質、例えばＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質と相互作用する機能を例示できる。ＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質として具体的には、ＤＬＧ２、ＤＬＧ３およびＤＬＧ４や、ＡＩＰ１、ＭＡＧＩ３を例示できる。
上述のように、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡのスプライシングバリアントは、７回膜貫通ドメインを有する機能的膜蛋白質受容体として機能する蛋白質をコードするＤＮＡである。本ＤＮＡによりコードされる蛋白質は構造的特徴として、数個、好ましくは２個〜４個のＴＳＰ−Ｉドメイン、１個のＧＰＳドメインおよび１個の７回膜貫通ドメインを有する（図１−Ａおよび図１−Ｂ参照）。
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡは、シグナル配列と予測される部分（Ｎ末端より２０アミノ酸残基）を有する１５１８アミノ酸残基（配列番号２）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む４５５７ｂｐの塩基配列からなる。
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質として、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質を好ましく挙げられる。
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質は、シグナル配列と予測される部分（Ｎ末端より２０アミノ酸残基）を有する１５１８アミノ酸残基からなり、そのアミノ酸配列に３個のＴＳＰ−Ｉドメインの他、ＧＰＳドメインおよび７回膜貫通ドメイン（７回膜貫通ドメイン）を有する（図１−Ａおよび図１−Ｂ参照）。本蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号１９に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列と比較して、Ｎ末端側の１個のＴＳＰ−Ｉドメインを含む５５アミノ酸残基が欠失している以外は同一である。欠失している５５アミノ酸残基は、配列番号２０に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質のアミノ酸配列において、第２９６番目のグリシン（Ｇ）から第３５０番目のプロリン（Ｐ）に相当する。３個のＴＳＰ−Ｉドメインはそれぞれ、配列番号２に記載のアミノ酸配列における第２９７番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）から第３５０番目のプロリン（Ｐｒｏ）までの領域；第３５２番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）から第４０５番目のプロリン（Ｐｒｏ）までの領域；および第４０８番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）から第４６１番目のプロリン（Ｐｒｏ）までの領域からなる。７個の膜貫通ドメインはそれぞれ、配列番号２に記載のアミノ酸配列における第８７０番目のバリン（Ｖａｌ）から第８９０番目のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）までの領域；第８９９番目のセリン（Ｓｅｒ）から第９１９番目のグリシン（Ｇｌｙ）までの領域；第９２８番目のバリン（Ｖａｌ）から第９４８番目のロイシン（Ｌｅｕ）までの領域；第９７０番目のアルギニン（Ａｒｇ）から第９９０番目のトレオニン（Ｔｈｒ）までの領域；第１０１２番目のアラニン（Ａｌａ）から第１０３２番目のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）までの領域；第１０８７番目のロイシン（Ｌｅｕ）から第１１０７番目のアラニン（Ａｌａ）までの領域；および第１１１４番目のバリン（Ｖａｌ）から第１１３４番目のバリン（Ｖａｌ）までの領域からなる。
配列番号１５に記載の塩基配列で表されるＤＮＡは、シグナル配列と予測される部分（Ｎ末端より２０アミノ酸残基）を有する１４６３アミノ酸残基（配列番号１６）をコードするＯＲＦを含む４３８９ｂｐの塩基配列からなる。
配列番号１５に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質として、配列番号１６に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質が挙げられる。
配列番号１５に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質は、シグナル配列と予測される部分（Ｎ末端より２０アミノ酸残基）を有する１４６３アミノ酸残基からなり、そのアミノ酸配列に７回膜貫通ドメイン、２個のＴＳＰ−Ｉドメインおよび１個のＧＰＳドメインを有する（図１−Ｂ参照）。本蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号１９に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列と比較して、Ｎ末端側の２個のＴＳＰ−Ｉドメインを含む１１０アミノ酸残基が欠失している以外は同一である。欠失している１１０アミノ酸残基は、配列番号２０に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質のアミノ酸配列において、第２９６番目のグリシン（Ｇ）から第４０５番目のプロリン（Ｐ）に相当する。
配列番号１７に記載の塩基配列で表されるＤＮＡは、シグナル配列と予測される部分（Ｎ末端より２０アミノ酸残基）を有する１５１８アミノ酸残基（配列番号１８）をコードするＯＲＦを含む４５５４ｂｐの塩基配列からなる。
配列番号１７に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質として、配列番号１８に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質が挙げられる。
配列番号１７に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質は、シグナル配列と予測される部分（Ｎ末端より２０アミノ酸残基）を有する１５１８アミノ酸残基（配列番号１８）からなり、そのアミノ酸配列に７回膜貫通ドメイン、３個のＴＳＰ−Ｉドメインおよび１個のＧＰＳドメインを有する（図１−Ｂ参照）。本蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号１９に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列と比較して、Ｎ末端側から２番目のＴＳＰ−Ｉドメイン１個を含む５５アミノ酸残基が欠失している以外は同一である。欠失している５５アミノ酸残基は、配列番号２０に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質において、第３５１番目のバリン（Ｖ）から第４０５番目のプロリン（Ｐ）に相当する。
配列番号１９に記載の塩基配列で表されるＤＮＡは、７ｔｍＨＲ（ｓｅｖｅｎ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｈｅｒｉｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ、アクセッション番号：ＡＢ０６５６４８）と称される。本ＤＮＡは、シグナル配列と予測される部分（Ｎ末端より２０アミノ酸残基）を有する１５７３アミノ酸残基（配列番号２０）をコードするＯＲＦを含む４７１９ｂｐの塩基配列からなる。
配列番号１９に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質として、配列番号２０に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質が挙げられる。
配列番号１９に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質は、７ｔｍＨＲ（ＧｅｎＢａｎｋ、アクセッション番号：ＡＢ０６５６４８）と称される。本蛋白質は、１５７３アミノ酸残基からなり、そのアミノ酸配列に７回膜貫通ドメイン、４個のＴＳＰ−Ｉドメインおよび１個のＧＰＳドメインを有する（図１−Ｂ参照）。
配列番号２１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡは、公知ヒトＤＮＡであり、ｈＢＡＩ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ、アクセッション番号：ＡＢ００５２９８）と称される。本ＤＮＡは、シグナル配列と予測される部分（Ｎ末端より２０アミノ酸残基）を有する１５７２アミノ酸残基（配列番号２２）をコードするＯＲＦを含む５３９９ｂｐの塩基配列からなる。
配列番号２１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質として、配列番号２２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質が挙げられる。
配列番号２１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質は、公知ヒト蛋白質であり、ｈＢＡＩ２（ＧｅｎＢａｎｋ、アクセッション番号：ＡＢ００５２９８）と称される。本蛋白質は、１５７２アミノ酸残基からなり、そのアミノ酸配列に７回膜貫通ドメイン、４個のＴＳＰ−Ｉドメインおよび１個のＧＰＳドメインを有する（図１−Ａ参照）。本蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号１９に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列と比較して、Ｃ末端領域において第１４６１番目のリジンに相当する１アミノ酸残基が欠失している以外は同一である。
配列番号１、１５、１７、１９および２１に記載の塩基配列のうちいずれか１の塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡによりコードされる蛋白質は、このように、互いに相同性を有し、ＴＳＰ−Ｉドメイン、ＧＰＳドメインおよび７回膜貫通ドメインを保存している。
配列番号１、１５、１７、１９および２１に記載の塩基配列のうちいずれか１の塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡによりコードされる蛋白質は、配列の相同性および構造的特徴の類似性から、スプライシングバリアントであると発明者らは考えている。
配列番号２、１６、１８、２０および２２に記載のアミノ酸配列のうちいずれか１のアミノ酸配列で表される蛋白質は、互いに相同性を有し、ＴＳＰ−Ｉドメイン、ＧＰＳドメインおよび７回膜貫通ドメインを保存している。配列の相同性および構造的特徴の類似性から、これら蛋白質はスプライシングバリアントであると発明者らは考えている。
配列番号１５、１７および１９に記載の塩基配列のうちいずれか１の塩基配列で表されるＤＮＡの遺伝子産物は、実際、膜蛋白質受容体としての機能を示した。具体的には、該遺伝子産物を発現させた動物細胞において、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡの遺伝子産物を発現させた動物細胞と同様に、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）刺激により細胞内情報伝達を介した細胞応答が生じることが観察された。
本発明において用いるＤＮＡは、上記ＤＮＡ、例えば配列番号１、１５、１７、１９および２１に記載の塩基配列のうちいずれか１の塩基配列を含有する塩基配列で表されるＤＮＡであることができる。
また本発明において用いるＤＮＡは、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡまたは該ＤＮＡのスプライシングバリアントの指定された領域に存在する部分塩基配列で表されるＤＮＡ断片であることができる。このようなＤＮＡ断片は、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡまたは該ＤＮＡのスプライシングバリアントを検出するためのプライマーやプローブ、あるいは本ＤＮＡを製造するためのプライマーとして使用できるため有用である。プライマーは、好ましくは１５個〜３０個、より好ましくは２０個〜２５個のヌクレオチドからなる。プローブは、好ましくは８個〜５０個のヌクレオチド、より好ましくは１７個〜３５個のヌクレオチド、さらに好ましくは１７個〜３０個のヌクレオチドからなる。プライマーやプローブの長さが適当な長さより長いと、偽ハイブリダイゼーションが増加するために特異性が低下する。また、長さが適当な長さより短いとミスマッチが生じるために特異性が低下する。
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡまたは該ＤＮＡのスプライシングバリアントの指定された領域として、該ＤＮＡによりコードされる蛋白質の断片であってリガンドが作用する部位を含む断片をコードする領域が好ましく挙げられる。リガンドが作用する部位を含む断片をコードする領域に存在する部分塩基配列で表されるＤＮＡ断片は、リガンドが作用する部位を含む断片の製造に使用できる。リガンドが作用する部位を含む断片は、本発明において用いる蛋白質に対するリガンドの作用、例えば本蛋白質とリガンドとの結合の検出、また該作用を促進するまたは阻害する化合物の同定に有用である。あるいは、本蛋白質に対してリガンドと同様の作用を有する化合物、すなわちアゴニストの同定に有用である。このようなＤＮＡ断片は、その最小単位として好ましくは該領域において連続する５個以上のヌクレオチド、より好ましくは１０個以上、より好ましくは２０個以上のヌクレオチドからなる。
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡまたは該ＤＮＡのスプライシングバリアントの指定された領域に存在する部分塩基配列で表されるＤＮＡ断片はまた、蛋白質をコードするセンス鎖に相補的なＤＮＡ断片であるとき、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡまたは該ＤＮＡのスプライシングバリアントの発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドとして有用である。一般的に２０個前後のヌクレオチドからなるＤＮＡ断片が、遺伝子の発現を阻害できることが知られていることから、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは１５個以上、より好ましくは２０個以上のヌクレオチドからなる。
これらＤＮＡ断片は、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡまたは該ＤＮＡのスプライシングバリアントの塩基配列情報に従って、目的の配列を有するものを設計し、自体公知の化学合成法により製造できる。簡便には、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置を用いて製造できる。
本発明において用いる蛋白質は、上記蛋白質、例えば配列番号２、１６、１８、２０および２２に記載のアミノ酸配列のうちいずれか１のアミノ酸配列を含有するアミノ酸配列で表される蛋白質であることができる。
また本発明において用いる蛋白質は、該蛋白質の指定された領域に存在する部分アミノ酸配列で表される断片であることができる。本蛋白質の断片は、本蛋白質に対する抗体を作製するための抗原として使用できるため有用である。
本発明において用いる蛋白質の指定された領域として、本蛋白質においてリガンドが作用する部位が好ましく挙げられる。リガンドが作用する部位を含む断片は、本蛋白質に対するリガンドの作用、例えば本蛋白質とリガンドとの結合の検出、また該作用を促進するまたは阻害する化合物の同定に有用である。リガンドが作用する部位を含む断片は、本蛋白質に対するリガンドの作用、例えば本蛋白質とリガンドとの結合の検出、また該作用を促進するまたは阻害する化合物の同定に有用である。あるいは、本蛋白質に対してリガンドと同様の作用を有する化合物、すなわちアゴニストの同定に有用である。また、リガンドが作用する部位を含む断片のうち、リガンドと本蛋白質の相互作用を阻害する断片は、リガンドの作用による本蛋白質の機能の誘導を阻害する化合物として有用である。
本発明において用いる蛋白質の指定された領域に存在する部分アミノ酸配列で表される断片は、その最小単位として好ましくは５個以上、より好ましくは８個以上、さらに好ましくは１２個以上、とくに好ましくは１５個以上の連続するアミノ酸からなるものである。これら断片は、本蛋白質のアミノ酸配列情報に従って、目的の配列を有するものを設計し、例えば自体公知の化学合成法により製造できる。
本発明において用いる蛋白質は、本蛋白質をコードする遺伝子を遺伝子工学的手法で発現させた細胞や生体試料から調製したもの、無細胞系合成産物または化学合成産物であってよく、あるいはこれらからさらに精製されたものであってもよい。また、本蛋白質は、本蛋白質をコードする遺伝子を含む細胞において発現しているものであり得る。該細胞は、本蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターをトランスフェクションして得られた形質転換体であり得る。
本発明において用いる蛋白質はさらに、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を伴わない限りにおいて改変できる。また、Ｎ末端側やＣ末端側に別の蛋白質等を、直接的にまたはリンカーペプチド等を介して間接的に遺伝子工学的手法等を用いて付加することにより標識化したものであってもよい。好ましくは、本蛋白質の基本的な性質が阻害されないような標識化が望ましい。付加する蛋白質等として、例えばＧＳＴ、β−ガラクトシダーゼ、ＨＲＰまたはＡＬＰ等の酵素類、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）またはフィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）等の蛍光色素類、マルトース結合蛋白質、免疫グロブリンのＦｃ断片あるいはビオチン等を例示できるが、これらに限定されない。また、放射性同位元素により標識することもできる。標識化に用いる物質は、１つまたは２つ以上を組合せて付加できる。これら標識化に用いた物質自体、またはその機能を測定することにより、本蛋白質を容易に検出または精製でき、また、例えば本発明において用いる蛋白質と他の蛋白質との相互作用を検出できる。
（ＤＮＡの取得）
本発明において用いるＤＮＡは、当該ＤＮＡの配列情報に基づいて、公知の遺伝子工学的手法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア ラボラトリーマニュアル 第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社等を参照）により容易に取得できる。例えば、配列表の配列番号１、１５、１７、１９および２１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡは、その配列情報基づいて、公知の遺伝子工学的手法により取得できる。
本発明において用いるＤＮＡの取得は、具体的には、本ＤＮＡの発現が確認されている適当な起源から、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから、該ＤＮＡに特有の適当なプローブやプライマーを用いて所望のクローンを選択することにより実施できる。ｃＤＮＡの起源として、本ＤＮＡの発現が確認されている各種の細胞や組織、またはこれらに由来する培養細胞等を例示できる。配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡのスプライシングバリアントの起源として、例えば、ヒトの脳組織や脳細胞を例示できる。
起源からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニング等はいずれも常法に従って実施できる。また、市販されているヒト脳、胎児脳、および脳海馬由来のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを構築して使用できる。所望のクローンをｃＤＮＡライブラリーから選択する方法も特に制限されず、慣用の方法を使用できる。例えば、目的のＤＮＡ配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法等やこれらを組合せた方法等を例示できる。ここで用いるプローブとして、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡまたは該ＤＮＡのスプライシングバリアントの塩基配列に関する情報に基づいて化学合成されたＤＮＡ等が一般的に使用できる。また、本ＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計したセンスプライマー、アンチセンスプライマーをこのようなプローブとして使用できる。
ｃＤＮＡライブラリーからの目的クローンの選択は、例えば公知の蛋白質発現系を利用して各クローンについて発現蛋白質の確認を行い、その生物学的機能を指標にして実施できる。
ＤＮＡの取得にはその他、ＰＣＲ（ウルマー（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１；エールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．）編、「ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用」、１９８９年、ストックトンプレス；サイキ（Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ．）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８５年、第２３０巻、ｐ．１３５０−１３５４））によるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。ｃＤＮＡライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法（「実験医学」、１９９４年、第１２巻、第６号、ｐ．６１５−６１８）、特に５´−ＲＡＣＥ法（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ Ｍ．Ａ．）ら、「プロシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシズ オブ ザ ユナイテッド ステーツ オブ アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９８８年、第８５巻、第２３号、ｐ．８９９８−９００２）等の採用が好適である。ＰＣＲに使用するプライマーは、ＤＮＡの塩基配列情報に基づいて適宜設計でき、常法に従って合成により取得できる。増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離精製は、常法により実施できる。例えばゲル電気泳動法等によりＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離精製を実施できる。
ＤＮＡの塩基配列の決定は、常法、例えばジデオキシ法（「プロシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシズ オブ ザ ユナイテッド ステーツ オブ アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９７７年、第７４巻、ｐ．５４６３−５４６７）やマキサム−ギルバート法（「メソッズ イン エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、１９８０年、第６５巻、ｐ．４９９−５６０）等により、また簡便には市販のシーケンスキット等を用いて実施できる。
ＤＮＡは、その機能、例えばコードする蛋白質の発現や、発現された蛋白質の機能が阻害されない限りにおいて、５´末端側や３´末端側に、例えばグルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、β−ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）等の酵素類、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、あるいはＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類等の遺伝子が、１つまたは２つ以上付加されたＤＮＡであることができる。これら遺伝子の付加は、慣用の遺伝子工学的手法により行うことができ、遺伝子やｍＲＮＡの検出を容易にするため有用である。
（ベクター）
本発明において用いるＤＮＡを適当なベクターＤＮＡに挿入することにより、該ＤＮＡを含む組換えベクターが得られる。組換えベクターは、該ＤＮＡが組込まれている組換えベクターである限りにおいて、いずれの組換えベクターであってもよい。
ベクターＤＮＡは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクターＤＮＡは、天然に存在するものを抽出したもののほか、複製に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているものでもよい。代表的なものとして、プラスミド、バクテリオファージおよびウイルス由来のベクターＤＮＡを例示できる。プラスミドＤＮＡとして、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド等を例示できる。バクテリオファージＤＮＡとして、λファージ等を例示できる。ウイルス由来のベクターＤＮＡとして、例えばレトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病ウイルス等の動物ウイルス由来のベクター、あるいはバキュロウイルス等の昆虫ウイルス由来のベクターを例示できる。その他、トランスポゾン由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来のベクターＤＮＡ等を例示できる。あるいは、これらを組合せて作成したベクターＤＮＡ、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメントを組合せて作成したベクターＤＮＡ（コスミドやファージミド等）を例示できる。また、目的により発現ベクターやクローニングベクター等、いずれを用いることもできる。
ベクターには、目的遺伝子の機能が発揮されるように遺伝子を組込むことが必要であり、少なくとも目的遺伝子配列とプロモーターとをその構成要素とする。これら要素に加えて、所望によりさらに、複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列、例えば、リボソーム結合配列、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、および選択マーカー等から選択した１つまたは複数の遺伝子配列を自体公知の方法により組合せてベクターＤＮＡに組込むことができる。選択マーカーとして、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等を例示できる。
ベクターＤＮＡに目的遺伝子配列を組込む方法は、自体公知の方法を適用できる。例えば、目的遺伝子配列を適当な制限酵素により処理して特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターＤＮＡと混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられる。あるいは、目的遺伝子配列に適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても、所望の組換えベクターが得られる。
（形質転換体）
本発明に用いるＤＮＡを組込んだベクターＤＮＡを宿主に導入することにより、形質転換体が得られる。ベクターＤＮＡとして発現ベクターを使用すれば、本ＤＮＡを発現させることができ、さらに該ＤＮＡによりコードされる蛋白質を製造できる。該形質転換体には、本ＤＮＡ以外の所望の遺伝子を組込んだベクターＤＮＡの１つまたは２つ以上をさらに導入することもできる。
宿主として、原核生物および真核生物のいずれも使用できる。原核生物として、例えば大腸菌（エシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））等のエシェリヒア属、枯草菌等のバシラス属、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウムメリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌を例示できる。真核生物として、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）等の酵母、Ｓｆ９やＳｆ２１等の昆虫細胞、あるいはサル腎由来細胞（ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３細胞、ヒトＦＬ細胞や２９３ＥＢＮＡ細胞、アフリカツメガエル卵母細胞等の動物細胞を例示できる。好ましくは動物細胞を用いる。
ベクターＤＮＡの宿主細胞への導入は、自体公知の手段が応用でき、例えば成書に記載されている標準的な方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア ラボラトリーマニュアル 第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー）により実施できる。より好ましい方法として、遺伝子の安定性を考慮するならば染色体内へのインテグレート法が挙げられるが、簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系を使用できる。具体的な方法として、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ負荷（ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄｉｎｇ）、バリスティック導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）および感染等が挙げられる。
動物細胞を宿主とする場合は、組換えベクターが該細胞中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、ＲＮＡスプライス部位、目的遺伝子、ポリアデニル化部位、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、所望により複製起点が含まれていてもよい。プロモーターとして、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等を用いることができ、また、サイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法として、好ましくは例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を例示できる。
原核生物を宿主とする場合は、組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、目的遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
細菌を宿主として用いる場合、プロモーターとして、大腸菌等の宿主中で発現できるものであれば特に限定されず、いずれを用いてもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等の、大腸菌やファージに由来するプロモーターが例示できる。ｔａｃプロモーター等の人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されない。好ましくは例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等を例示できる。
酵母を宿主とする場合、プロモーターとして、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、いずれを用いてもよい。例えば、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等が例示できる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、好ましくは例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を例示できる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、組換えベクターの導入方法として、好ましくは例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等を例示できる。
配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡを含むベクターＤＮＡをトランスフェクションして得られた形質転換体として、具体的には、ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株が挙げられる。ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株は、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡのＯＲＦのうち、シグナル配列（配列番号２に記載のアミノ酸配列のＮ末端より２０アミノ酸残基）をコードすると予測される部分を除いた塩基配列で表されるＤＮＡをＮ末端ＨＡ−ｔａｇ融合蛋白質として発現させるベクターを、ＣＨＯ−Ｋ１細胞株にトランスフェクションすることにより樹立した細胞株である。ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株は、該Ｎ末端ＨＡ−ｔａｇ融合蛋白質を安定的に発現している。本細胞株の具体的な作製方法は、実施例２に詳述する。
ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株は、受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１０１号として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国 茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に平成１６年８月１９日付けで寄託した。本細胞株の生存は、前記寄託センターにおいて平成１６年９月２２日に実施された試験により確認されている。
（蛋白質の製造方法）
本発明において用いる蛋白質の取得は、例えば本蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列情報に基づいて一般的遺伝子工学的手法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア ラボラトリーマニュアル 第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社；ウルマー（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１；エールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．）編、「ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用」、１９８９年、ストックトンプレス等を参照）により実施できる。例えば、本蛋白質をコードする遺伝子の発現が確認されている各種の細胞や組織、またはこれらに由来する培養細胞、例えばヒトの脳組織から常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該遺伝子に特有の適当なプライマーを用いて該遺伝子を増幅し、得られた遺伝子を公知の遺伝子工学的手法により発現誘導することにより取得できる。
具体的には例えば、上記ＤＮＡを含むベクターＤＮＡをトランスフェクションした形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から目的とする蛋白質を回収することにより本蛋白質を製造できる。形質転換体の培養は、各々の宿主に最適な自体公知の培養条件および培養方法で実施できる。培養は、形質転換体により発現される本蛋白質自体またはその機能を指標にして実施できる。あるいは、宿主中または宿主外に産生された本蛋白質自体またはその蛋白質量を指標にして培養してもよく、培地中の形質転換体量を指標にして継代培養またはバッチ培養を行ってもよい。
目的とする蛋白質が形質転換体の細胞内あるいは細胞膜上に発現する場合には、形質転換体を破砕して目的とする蛋白質を抽出する。また、目的とする蛋白質が形質転換体外に分泌される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離処理等により形質転換体を除去した培養液を用いる。
本発明において用いる蛋白質はまた、一般的な化学合成法により製造できる。例えば、蛋白質の化学合成方法として、固相合成方法や液相合成方法等が知られているがいずれを用いることもできる。このような蛋白質合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させて鎖を延長させていくいわゆるステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメントコンデンセーション法とを包含し、本蛋白質の合成は、そのいずれによっても実施できる。上記蛋白質合成において用いられる縮合法も、常法に従うことができ、例えば、アジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等）法、ウッドワード法等を例示できる。化学合成により得られた蛋白質は、さらに上記のような慣用の各種精製方法に従って、適宜精製を実施できる。
本発明において用いる蛋白質は適当なペプチダーゼを用いて切断することにより断片化することができ、その結果、本蛋白質の断片が取得できる。
蛋白質は、所望により、その物理的性質、化学的性質等を利用した各種分離操作方法により精製および／または分離できる。分離および／または精製は、本蛋白質の機能を指標にして実施できる。分離操作方法として、例えば硫酸アンモニウム沈殿、限外ろ過、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、透析法等を単独でまたは適宜組合せて使用できる。好ましくは、本蛋白質のアミノ酸配列情報に基づき、これらに対する特異的抗体を作成し、該抗体を用いて特異的に吸着する方法、例えば該抗体を結合させたカラムを利用するアフィニティクロマトグラフィーを用いることが推奨される。
（抗体）
本発明において用いる蛋白質またはその断片を抗原として用いることにより、該蛋白質に対する抗体を作製できる。抗原として用いる蛋白質またはその断片は、少なくとも８個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１２個、さらに好ましくは１５個以上のアミノ酸で構成される。本発明において用いる蛋白質および／またはその断片に特異的な抗体を作製するためには、該蛋白質またはその断片に固有なアミノ酸配列で表される領域を用いることが好ましい。この領域のアミノ酸配列は、必ずしも本発明において用いる蛋白質またはその断片のものと相同または同一である必要はなく、その立体構造上の外部への露出部位が好ましく、露出部位のアミノ酸配列が一次構造上で不連続であっても、該露出部位について連続的なアミノ酸配列であればよい。抗体は免疫学的に本発明において用いる蛋白質および／またはその断片を特異的に結合または認識する限り特に限定されない。この結合または認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応によって決定できる。
抗体の産生には、自体公知の抗体作製法を利用できる。例えば、抗原をアジュバントの存在下または非存在下で、単独でまたは担体に結合して動物に投与し、体液性応答および／または細胞性応答等の免疫誘導を行うことにより抗体が得られる。担体はそれ自体が宿主に対して有害作用を示さずかつ抗原性を増強せしめるものであれば特に限定されず、例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミンおよびキーホールリンペットヘモシアニン等が例示できる。アジュバントは、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ）、Ｒｉｂｉ（ＴＤＭ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ）、百日咳ワクチン（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｖａｃｃｉｎｅ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、アルミニウムアジュバント（ＡＬＵＭ）、およびこれらの組み合わせが例示できる。免疫される動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等が好適に用いられる。
ポリクローナル抗体は、抗原を投与された動物の血清から自体公知の抗体回収法によって取得できる。好ましい抗体回収手段として免疫アフィニティクロマトグラフィー法が挙げられる。
モノクロ−ナル抗体は、抗原を投与された動物から抗体産生細胞（例えば、脾臓またはリンパ節由来のリンパ球）を回収し、自体公知の永久増殖性細胞（例えば、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８株等のミエローマ株）を用いた形質転換手段を導入することにより生産できる。例えば、抗体産生細胞と永久増殖性細胞とを自体公知の方法で融合させてハイブリドーマを作製してこれをクローン化し、本発明において用いる蛋白質を特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマを選別し、該ハイブリドーマの培養液から抗体を回収する。
本発明において用いる蛋白質を認識し結合し得るポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、本蛋白質の精製用抗体、試薬または標識マーカー等として利用できる。特に本蛋白質の機能を阻害する抗体、あるいは本蛋白質に結合して本蛋白質のリガンド様作用を示す抗体は、本蛋白質の機能調節に使用できる。これら抗体は、本蛋白質およびその機能の異常に起因する各種疾患の解明、防止、改善および／または治療のために有用である。
（膜蛋白質受容体の機能）
本発明において用いる蛋白質は、膜蛋白質受容体として機能する蛋白質であり、動物細胞において発現させたときにＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）による細胞応答を誘発することができた。すなわち、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）は本蛋白質からなる膜蛋白質受容体のリガンドの１つである。以下、本蛋白質からなる膜蛋白質受容体を本発明に係る膜蛋白質受容体と称することがある。
本発明において用いる蛋白質を発現させた動物細胞においてＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）により惹き起こされた細胞応答は、具体的には、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡを安定的に発現させた上記ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株において観察された。より具体的には、ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株において、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）の作用により細胞内カルシウム濃度の上昇が認められた（実施例５参照）。１ｎＭのＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）による該細胞株における細胞内カルシウム濃度の上昇の程度は、ポジティブコントロールであるカルシウムイオノファＡ２３１８７によるものとほぼ同等であった。本ＤＮＡを発現させていないＣＨＯ−Ｋ１細株胞では、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）によるこのような細胞内カルシウム濃度の上昇は認められなかった。一方、ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株は、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）と同じアミノ酸配列で表されるＣＣＫオクタペプチドであってもＣ末端から７番目のチロシン残基が硫酸化されていないペプチド（ＣＣＫ−８ Ｎｏｎｓｕｌｆａｔｅｄ ｆｏｒｍ、以下、ＣＣＫ−８ＮＳと称する）に対しては応答しなかった。また、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）のＣ末端から４番目までのアミノ酸残基からなるテトラペプチド（ＣＣＫ−４）に対しても応答しなかった。具体的には、１ｎＭのＣＣＫ−８ＮＳまたは１ｎＭのＣＣＫ−４による細胞内カルシウム濃度の上昇は認められなかった。これらから、ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株は、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）に対して特異的に応答し、膜蛋白質受容体として機能することが判明した。また、ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株が、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）に応答したがＣＣＫ−８ＮＳには応答しなかったことから、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）のリガンド作用には、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）のアミノ酸配列のＣ末端から７番目のチロシン残基が硫酸化されていることが重要であると発明者らは考えている。
ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）による細胞応答の惹起はまた、配列番号１５に記載の塩基配列で表されるＤＮＡ、配列番号１７に記載の塩基配列で表されるＤＮＡ、または配列番号１９に記載の塩基配列で表されるＤＮＡを発現させた細胞のいずれにおいても観察された。より具体的には、これら細胞において、１ｎＭのＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）の作用により細胞内カルシウム濃度の上昇が認められた（実施例８参照）。これに対して、配列番号１５に記載の塩基配列で表されるＤＮＡ、配列番号１７に記載の塩基配列で表されるＤＮＡ、または配列番号１９に記載の塩基配列で表されるＤＮＡを発現させていないＣＨＯ−Ｋ１細株胞では、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）によるこのような細胞内カルシウム濃度の上昇は認められなかった。
配列番号１、１５、１７および１９に記載の塩基配列から選ばれるいずれか１の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質は、そのアミノ酸配列においてＮ末端細胞外領域のＴＳＰ−Ｉドメインのリピート数が異なるが、該ドメイン以外のアミノ酸配列はほぼ同一である（図１−Ｂ）。配列番号１、１５、１７および１９に記載の塩基配列から選ばれるいずれか１の塩基配列で表されるＤＮＡを発現させた細胞のいずれにおいてもＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）による細胞応答が惹起された（実施例５、実施例８および実施例９）。したがって、配列番号１、１５、１７および１９に記載の塩基配列から選ばれるいずれか１の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質とＣＣＫ−８Ｓとの結合および該結合により生じる細胞内シグナル伝達には、ＴＳＰ−Ｉドメインは大きく関与していないと発明者らは考えている。
ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）が１ｎＭという低濃度で、ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株、および配列番号１５、配列番号１７または配列番号１９に記載の塩基配列で表されるＤＮＡを発現させた細胞の細胞応答を惹き起こしたことから、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）は生体内で実際に、該ＤＮＡによりコードされる蛋白質を介して細胞応答を惹き起こしていると考えられる。つまり、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）は、ＧＰＣＲと予想された本発明に係る機能性膜蛋白質受容体の生体内リガンドの１つであると発明者らは考えている。また、本膜蛋白質受容体は、アフリカツメガエル卵母細胞において、ＨｅＬａ細胞培養上清をリガンド供給源として用いたときに膜電位の変化といった細胞応答を示した。
本発明に係る膜蛋白質受容体のリガンドの範囲には、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）以外に、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）のアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入といった変異を有するアミノ酸配列からなり、かつＣＣＫ−８Ｓと同質の機能を有するペプチドが含まれる。「ＣＣＫ−８Ｓと同質の機能」とは、本発明に係る膜蛋白質受容体の生物学的機能を誘導する機能、より具体的には、本膜蛋白質受容体を発現している細胞において、細胞内カルシウム濃度の上昇や膜電位の変化等の細胞応答を惹き起こす機能をいう。ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）においてＣ末端から７番目のチロシン残基が硫酸化されていることが、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）のリガンド作用に重要であると考えられることから、本膜蛋白質受容体のリガンドは、該硫酸化されたチロシン残基が保存されていることが好ましい。変異を有する蛋白質は、天然において例えば突然変異や翻訳後の修飾等により生じたものであってよく、また天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して得たものであってもよい。変異を導入する手段は自体公知であり、上述の方法を利用できる。当該蛋白質の基本的な性質（物性、機能、生理活性または免疫学的活性等）を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。また、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）、またはＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）のアミノ酸配列において１個〜数個の変異を有するアミノ酸配列からなりかつＣＣＫ−８Ｓと同質の機能を有するペプチドを含むペプチドも、本膜蛋白質受容体のリガンドの範囲に含まれる。このようなペプチドにおいて、ＣＣＫ−８ＳのＣ末端から７番目に存在する硫酸化チロシン残基が保有されていることが好ましい。
ＣＣＫの組織発現は、脳組織、特に大脳皮質、海馬、扁桃体や視床下部に多く認められる（表３参照）。
本発明において用いる蛋白質をコードするＤＮＡの組織発現は、具体的には、大脳皮質、海馬および扁桃体で著しく強く認められることを発明者らは見出した（実施例１０および表３参照参照）。本発明において用いる蛋白質をコードするＤＮＡとＣＣＫの発現分布が一致することからも、本膜蛋白質受容体のリガンドがＣＣＫ、例えばＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）であると発明者らは考えている。
本発明に係る膜蛋白質受容体のリガンドの１つが、上記のようにＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）であることから、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）が関与すると考えられている記憶の保持といった神経機能に、本発明に係る膜蛋白質受容体が関与していると発明者らは考えている。ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）の量および／または機能の低下や消失により、記憶を意識レベルに呼び戻して行動に移すことが困難になる等の病的症状が現れる。このような神経機能に対するＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）の作用は、本膜蛋白質受容体を介していると発明者らは考えている。したがって、このような記憶機能の障害を伴う疾患や症状を、本膜蛋白質受容体のアゴニストにより緩和することができる。このような疾患として、記憶等の神経機能の障害を伴う疾患、具体的には例えば痴呆やアルツハイマー病等が挙げられる。
これらから、これまでにＣＣＫの関与が想定されている、不安、鎮痛、鎮静、摂食抑制、記憶、学習といった生理機能に、ＣＣＫ受容体として本膜蛋白質受容体が関与していると発明者らは考えている。さらに、ＣＣＫは、消化器官で数々の作用を示すことが報告され、また満腹感を脳のニューロンに与える信号物質と考えられている。このことから、ＣＣＫのファミリーであるＣＣＫ−８Ｓも、脳のニューロンに満腹感を与える信号物質として作用すると発明者らは考えている。ＣＣＫ−８Ｓの量的および機能的な低下は、満腹感の低下による肥満を惹き起こすと発明者らは考えている。このような肥満に、ＣＣＫ受容体として本膜蛋白質受容体が関与していると発明者らは考えている。また、ＣＣＫ−８Ｓを糖尿病患者に投与するとインスリン量の増加が促進され、食後のグルコース量の増加が抑制されたことが報告されている（ボー（ＢＯ Ａ．）ら、「ザ ジャーナル オブ クリニカル エンドクリノロジー アンド メタボリズム（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）」、２０００年、第８５巻、ｐ．１０４３−１０４８）。このことから、本機能的膜蛋白質受容体が糖尿病と関連している可能性がある。したがって、本膜蛋白質受容体に対するアゴニスト、アンタゴニストは、このような生理機能の障害を伴う疾患や症状を緩和することができる。すなわち、本膜蛋白質受容体に対するアゴニスト、アンタゴニストは、抗不安薬、鎮痛剤、あるいは様々な中枢神経系の異常により惹き起こされる疾患に対する予防および／または治療剤の有効成分として使用できる。このような疾患として、具体的には、痴呆、パーキンソン病、パニック症候群、薬物依存症、肥満、糖尿病等の疾患が挙げられる。
より具体的には、本膜蛋白質受容体は、該受容体蛋白質をコードするＤＮＡの発現分布および該ＤＮＡのスプライシングバリアントのノックアウトマウスを用いた実験結果から、神経性疾患、例えばうつ病に関与すると発明者らは考えている。
「うつ病」は、抑うつ症とも呼ばれ、悲哀感等の感情障害、思考制止等の思考障害、意欲低下、行動抑制、睡眠障害、抑うつ状態の日内変動等を主症状とする情動性精神障害である。うつ病の原因は、脳内の神経伝達物質の減少であるといわれている。また、その発症には、生物学的な要因、心理的な要因、社会・環境的な要因が関わっていると考えられている。
「抑うつ状態」とは、うつ病において一般的に認められる症状、例えば悲哀感等の感情障害、思考制止等の思考障害、意欲低下、行動抑制、睡眠障害等を意味する。
本発明において用いる蛋白質をコードするＤＮＡの発現は、上記のように、大脳皮質、海馬、扁桃体で強い発現が認められた（実施例１０および表３参照参照）。扁桃体はうつ病に関与するという報告がある（ウェイレン（Ｗｈａｌｅｎ Ｐ．Ｊ．）ら、「セミナーズ イン クリニカル ニューロサイカイアトリー（Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ）」、２００２年、第７巻、第４号、ｐ．２３４−２４２；ドレベッツ（Ｄｒｅｖｅｔｓ Ｗ．Ｃ．）ら、「エンルズ オブ ザ ニューヨーク アカデミー オブ サイエンシズ（Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、２００３年、第９８５巻、ｐ．４２０−４４４；ネスラー（Ｎｅｓｔｌｅｒ Ｅ．Ｊ．）ら、「ニューロン（Ｎｅｕｒｏｎ）」、２００２年、第３４巻、第１号、ｐ．１３−２５）。
ＢＡＩ２遺伝子のノックアウトマウスを用いた尾懸垂試験において、該マウスが抗うつ様の表現型を示すことが観察された（実施例１１参照）。ＢＡＩ２遺伝子は、本発明において用いる蛋白質をコードするＤＮＡのスプライシングバリアントである。尾懸垂試験は、うつ病の表現型を調べる試験法として一般的に用いられている手法であり、抗うつ薬の評価等、うつ病との関連性を調べる試験系として用いられている（ステル（Ｓｔｅｒｕ Ｌ．）ら、「サイコファーマコロジー（Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（Ｂｅｒｌ））」、１９８５年、第８５巻、第３号、ｐ．３６７−３７０；クラウリー（Ｃｒｏｗｌｅｙ Ｊ．Ｊ．）ら、「ファーマコロジー バイオケミストリー アンド ビヘイビア（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｅｈａｖｉｏｒ」、２００４年、第７８巻、第２号、ｐ．２６９−２７４；ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｄ．Ｍ．）ら、「ヨーロピアン ジャーナル オブ ファーマコロジー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」、２００４年、第４９９巻、第１−２号、ｐ．１３５−１４６ ）。
ＢＡＩ２遺伝子のノックアウトマウスでは、尾懸垂試験において抗うつ様の表現型が認められた以外には、その他の行動学的検査において行動活性の上昇は観察されなかった。その他、本ノックアウトマウスは、生理学的検査、病理学的検査、解剖学的検査等多くの検査項目において野生型マウスと比較して有意な差は観察されなかった。
ＢＡＩ２遺伝子のノックアウトマウスでは、ＢＡＩ２遺伝子が破壊されているため、ＢＡＩ２遺伝子およびそのスプライシングバリアントは発現されない。すなわち、ＢＡＩ２遺伝子およびそのスプライシングバリアントの遺伝子産物が欠損したマウスにおいて、抗うつ状態が誘導された。これらの結果から、ＢＡＩ２遺伝子およびそのスプライシングバリアントの遺伝子産物がうつ病に関与していると発明者らは考えている。
ヒトにおいても、ＢＡＩ２遺伝子およびそのスプライシングバリアント、すなわち本発明において用いる蛋白質をコードするＤＮＡおよびそのスプライシングバリアントがうつ病に関与していると発明者らは考えている。
一方、ＣＣＫ受容体として、ＣＣＫ−Ａ受容体（ＣＣＫ１受容体とも呼称される）およびＣＣＫ−Ｂ受容体（ＣＣＫ２受容体とも呼称される）の２種類のＧＰＣＲが報告されている（ヘランツ（Ｈｅｒｒａｎｚ，Ｒ．）、「メディカル リサーチ レビューズ（Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｖｉｅｗｓ）」、２００３年、第２３巻、第５号、ｐ．５５９−６０５、レビュー）。これらはいずれもクラスＡ（ロドプシン類；ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ ｌｉｋｅ）に属するＧＰＣＲである。
本膜蛋白質受容体は、ＣＣＫ−Ａ受容体およびＣＣＫ−Ｂ受容体と比較して、リガンド親和性および発現分布が異なることから、ＣＣＫ−Ａ受容体およびＣＣＫ−Ｂ受容体とは異なる生理作用を担っていると発明者らは考えている。具体的には、本膜蛋白質受容体は、ＣＣＫ−Ａ受容体とリガンド親和性が類似しているが発現分布が異なり、ＣＣＫ−Ｂ受容体と発現分布が類似しているがリガンド親和性が異なる。
本発明において用いる蛋白質をコードするＤＮＡの発現が脳組織で特異的に高いことから、該蛋白質からなる本膜蛋白質受容体は、脳組織における発現が低いＣＣＫ−Ａ受容体と比較して、ＣＣＫの中枢神経系での作用に関与していると発明者らは考えている。また、脳組織で発現しているＣＣＫ−Ｂ受容体と比較して、リガンド親和性が異なることから、本発明に係る膜蛋白質受容体は脳内でＣＣＫ−Ｂ受容体と異なる生理活性を示すと発明者らは考えている。
また、本膜蛋白質受容体は、上記のように、その遺伝子のノックアウトマウスにおいて抗うつ状態が観察された。それに対して、ＣＣＫ−Ａ受容体遺伝子のノックアウトマウス、ＣＣＫ−Ｂ受容体遺伝子のノックアウトマウス、並びにＣＣＫ−Ａ受容体遺伝子およびＣＣＫ−Ｂ受容体遺伝子のダブルノックアウトマウスの表現型が報告されており、ＣＣＫ−Ｂ受容体遺伝子のノックアウトマウスにおいて行動活性が亢進しているという報告があるが、これらノックアウトマウスとうつ病との関連を示す報告はない。
本膜蛋白質受容体、ＣＣＫ−Ａ受容体およびＣＣＫ−Ｂ受容体はいずれもＣＣＫに応答する受容体であるが、組織発現分布およびノックアウトマウスの表現型から、これら受容体の中で本膜蛋白質受容体のみがうつ病と関連する膜蛋白質受容体であると発明者らは考え、さらに、ＣＣＫ−Ａ受容体は脳組織においてはその発現が低いため、脳組織におけるＣＣＫの生理活性には関与していないと考えられる。ＣＣＫ−Ｂ受容体は脳組織において発現しているが、ＣＣＫ−Ｂ受容体蛋白質をコードする遺伝子のノックアウトマウスの表現型とうつ病との関連を示唆する報告はない。
ＣＣＫ−Ａ受容体は主に消化器官で強く発現しており、脳組織では一部で発現が認められる。ＣＣＫ−Ａ受容体のリガンド親和性については、ＣＣＫ−８Ｓ＞＞ＣＣＫ−８ＮＳ、ガストリン＞ＣＣＫ−４の順に強い。ＣＣＫ−Ａ受容体はＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）に強く応答するが、ＣＣＫ−Ａ受容体のリガンドに対する特異性は認められない。
一方、ＣＣＫ−Ｂ受容体は消化器官に加えて脳組織でも広く発現している。ＣＣＫ−Ｂ受容体のリガンド親和性についてはＣＣＫ−８Ｓ≧ＣＣＫ−８ＮＳ、ガストリン＞ＣＣＫ−４の順で強く、ＣＣＫ−Ａ受容体よりも選択性が低い。
ＣＣＫ−Ａ受容体のノックアウトマウスの表現型については、胆石、膵酵素分泌および胆嚢収縮等の異常といった消化器系における機能異常の他には、体温調節等のホメオスタシスの異常（ノモト（Ｎｏｍｏｔｏ Ｓ．）ら、「アメリカン ジャーナル オブ フィジオロジー レギュレイトリー インテグレイティブ アンド コンパラティブ フィジオロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ． Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ， ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）」、２００４年、第２８７巻、第３号、Ｒ５５６−６１）、行動活性の上昇（ミヤサカ（Ｍｉｙａｓａｋａ Ｋ．）ら、「ニューロサイエンス レターズ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ）」、２００２年、第３３５巻、第２号、ｐ．１１５−１１８）、および食欲調節の異常（ビ（Ｂｉ Ｓ．）ら、「ニューロペプタイズ（Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ）」、２００２年、第３６巻、第２−３号、ｐ．１７１−１８１）が報告されている。
ＣＣＫ−Ｂ受容体のノックアウトマウスの表現型については、胃酸分泌異常、胃粘膜の形成異常といった消化器系の異常の他、不安、痛み、記憶等、中枢系の表現型に関する報告等、数多くの報告がある（ノーブル（Ｎｏｂｌｅ Ｆ．）ら、「ニューロペプタイズ（Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ）」、２００２年、第３６巻、第２−３号、ｐ．１５７−１７０）。より具体的には、不安行動の抑制（ホリノウチ（Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ Ｙ．）ら、「ヨーロピアン ニューロサイコファーマコロジー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）、２００４年、第１４巻、第２号、ｐ．１５７−１６１）、不安行動の亢進（ミヤサカ（Ｍｉｙａｓａｋａ Ｋ．）ら、「ニューロサイエンス レターズ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ）」、２００２年、第３３５巻、第２号、ｐ．１１５−１１８）、行動活性の上昇や記憶障害（ダウジ（Ｄａｕｇｅ Ｖ．）ら、「ニューロサイコファーマコロジー（Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）、２００１年、第２５巻、第５号、ｐ．６９０−６９８）、痛覚の異常およびオピオイドシステムとの相関（クリコフ（Ｋｕｒｒｉｋｏｆｆ Ｋ．）ら、「ザ ヨーロピアン ジャーナル オブ ニューロサイエンス（Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）、２００４年、第２０巻、第６号、ｐ．１５７７−１５８６）等が報告されている。
また、ＣＣＫ−Ａ受容体およびＣＣＫ−Ｂ受容体のダブルノックアウトマウスの表現系についても報告されているが、ダブルノックアウトマウスに特徴的な表現型は報告されていない（ミヤサカ（Ｍｉｙａｓａｋａ Ｋ．）ら、「ニューロサイエンス レターズ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ）」、２００２年、第３３５巻、第２号、ｐ．１１５−１１８）。
本発明において用いる蛋白質をコードするＤＮＡ、すなわち配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡのスプライシングバリアントは、うつ病に関与していると発明者らは考えている。例えば、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡまたは該ＤＮＡのスプライシングバリアントの発現が増加するといった異常により、抑うつ状態およびうつ病が誘導されると発明者らは考えている。
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡのスプライシングバリアントがうつ病に関与していると考えられることから、該ＤＮＡによりコードされる蛋白質と該蛋白質のスプライシングバリアントとからなる群から選ばれるいずれか１の蛋白質の機能および／または発現を阻害することにより、抑うつ状態を改善し、うつ病を回復させることができる。
本発明は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質と該蛋白質のスプライシングバリアントとからなる群から選ばれるいずれか１の蛋白質の機能および／または発現を阻害することを手段とする抑うつ状態の改善方法に関する。
「抑うつ状態の改善」とは、抑うつ状態を改善する方法を実施する前と比較して、抑うつ状態が軽減または回復されることをいう。例えば、感情障害、思考障害、意欲低下、行動抑制、睡眠障害等が軽減または回復することをいう。
本発明において用いる蛋白質の機能および／または発現を阻害することは、例えば、本蛋白質の機能および／または発現を阻害する化合物により実施できる。
本発明書において、「本発明において用いる蛋白質の機能を阻害する化合物」と「本蛋白質のアンタゴニスト」という用語は交換可能に使用される。本発明書において、「アンタゴニスト」とは、本発明において用いる蛋白質の機能を阻害する化合物であればよく、例えば、受容体に結合してアゴニストの効果を阻害するがそれ自体は受容体と結合してもアゴニストが示す効果を発揮できない化合物、リガンドの受容体への結合を阻害する化合物、または本蛋白質に対してインバースアゴニスト（逆作動薬）として作用する化合物が挙げられる。近年、ＧＰＣＲのような受容体がリガンドの作用とは関係なく活性型から不活性型に、若しくは不活性型から活性型に変換されることが知られている。ここで、ＧＰＣＲのような受容体がリガンドの作用とは関係なく不活性型から活性型に変換される工程を阻害する物質は、インバースアゴニストと呼ばれている。本蛋白質のインバースアゴニストも本発明において用いる蛋白質の機能を阻害すると考えられる。
本発明において用いる蛋白質のアンタゴニストは、本蛋白質からなる膜蛋白質受容体に結合してリガンドの効果を阻害する。本蛋白質をコードするＤＮＡの発現の増加といった異常により抑うつ状態およびうつ病が誘導されると考えられることから、本蛋白質のアンタゴニストにより本蛋白質からなる受容体へのリガンドの作用を阻害すれば、抑うつ状態およびうつ病を改善できると発明者らは考えている。
このように、本発明において用いる蛋白質のアンタゴニストは、抗うつ作用を有すると考える。「抗うつ作用」とは、抑うつ状態を改善する効果を意味する。
本発明において用いる蛋白質の機能を阻害する化合物、例えば本蛋白質のアンタゴニストは、好ましくは、本蛋白質からなる膜蛋白質受容体においてＣＣＫ−８Ｓにより惹き起こされる機能を阻害するアンタゴニストであることが好ましい。また、本アンタゴニストは、本蛋白質からなる膜蛋白質受容体においてＣＣＫ−８Ｓと同質の機能を有するペプチドにより惹き起こされる機能を阻害するアンタゴニストであることができる。
本発明において用いる蛋白質のアンタゴニストは、後述する化合物の同定方法により取得できる。本蛋白質のアンタゴニストとして、本蛋白質からなる膜蛋白質受容体のリガンドが蛋白質であるとき、該リガンドの部分ペプチドであって、該膜蛋白質受容体とは結合するがリガンドが示す効果を発揮できない物質を使用できる。該膜蛋白質受容体のリガンドの部分ペプチドは、該リガンドを同定した後、そのアミノ酸配列から数々の部分ペプチドを設計して合成し、後述する化合物の同定方法により、合成した部分ペプチドからアンタゴニストとしての活性を有するものを選択することにより取得できる。
本発明において用いる蛋白質のアンタゴニストとして、後述する化合物の同定方法により同定した３種類の化合物（式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ））が例示できる（実施例１２参照）。
式（Ｉ）：
式（ＩＩ）：
式（ＩＩＩ）：
また、本発明は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質と該蛋白質のスプライシングバリアントとからなる群から選ばれるいずれか１の蛋白質の機能および／または発現を阻害する化合物を含む抑うつ状態の改善剤を提供することができる。以下、抑うつ状態の改善剤を抗うつ剤と称することがある。
「抑うつ状態の改善剤」あるいは「抗うつ剤」は、抑うつ状態を改善する効果を有する薬剤を意味する。
（化合物の同定方法）
本発明において用いる蛋白質の機能を阻害する化合物の同定方法は、本蛋白質、ＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体または抗体のうち少なくともいずれか１つを用いて、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して実施できる。本同定方法により、該蛋白質の立体構造に基づくドラッグデザインによる拮抗剤の選別、蛋白質合成系を利用した遺伝子レベルでの発現の阻害剤または促進剤の選別、または抗体を利用した抗体認識物質の選別等が実施できる。
本発明において用いる蛋白質の機能を阻害する化合物の同定方法は、抗うつ作用を有する化合物の同定方法として使用できる。より好ましくは、本同定方法を、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質と該蛋白質のスプライシングバリアントとからなる群から選ばれるいずれか１の蛋白質のアンタゴニストである抗うつ作用を有する化合物の同定方法として使用できる。本化合物が抗うつ作用を示すか否かの確認は、一般的に用いられている抗うつ作用の試験方法、例えばマウスを用いた尾懸垂試験や強制水泳試験を用いて実施できる。具体的には、マウスに本化合物を投与し、尾懸垂試験において、化合物を投与していないマウスと比較して、無動時間が短縮されれば、本化合物が抗うつ作用を有すると判定できる。このような化合物は、抗うつ剤として有用である。
本発明において用いる蛋白質の機能を阻害する化合物の同定は、具体的には例えば、本蛋白質の機能を測定することのできる実験系を用いて実施できる。本実験系において、該蛋白質と調べようとする化合物（以下、被検化合物と称する）の相互作用を可能にする条件下で、該蛋白質と被検化合物とを共存させてその機能を測定し、ついで、被検化合物の非共存下での測定結果との比較における蛋白質の機能の変化（低減、増加、消失または出現）を検出することにより、本同定方法を実施できる。被検化合物を共存させた場合の本蛋白質の機能を、被検化合物を共存させなかった場合の本蛋白質の機能と比較することにより、該被検化合物が本蛋白質の機能に及ぼす効果を判定できる。例えば、被検化合物を共存させた場合の本蛋白質の機能が、被検化合物を共存させなかった場合の本蛋白質の機能と比較して減少した場合、該被検化合物には本蛋白質の機能を阻害する作用があると判定できる。
本発明において用いる蛋白質の機能として、本蛋白質が膜蛋白質受容体として機能することから、リガンドとの結合、細胞内情報伝達機構の活性化、細胞応答の誘発が例示される。より具体的には、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）との結合やＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質との相互作用等が例示できる。
本発明において用いる蛋白質と該蛋白質のリガンドとの結合を阻害する化合物の同定方法は、本蛋白質と該蛋白質のリガンドとを被検化合物の存在下および非存在下で反応させ、本蛋白質とリガンドとの結合を測定することにより実施できる。本同定方法に用いる蛋白質は、本蛋白質をコードするＤＮＡを含む細胞の細胞膜に発現した蛋白質であり得る。該細胞は、本蛋白質をコードするＤＮＡ含むベクターをトランスフェクションして得られた形質転換体であり得る。本蛋白質と該蛋白質のリガンドとの結合の測定は、一般的な医薬品スクリーニングシステムで用いられている様々な結合解析方法を利用して実施できる。例えば、リガンドと本蛋白質との結合反応を行い、本蛋白質とリガンドとの結合により形成される複合体と、結合していない遊離のリガンドおよび本蛋白質を分離し、該複合体をイムノブロッティング等の公知の方法によって検出することにより実施できる。また、例えば、リガンドと本蛋白質との結合反応を行い、その後、本蛋白質に結合したリガンドを、抗リガンド抗体を用いて測定することにより、結合の測定が実施できる。リガンドに結合した抗リガンド抗体は、ＨＲＰやビオチン等で標識した二次抗体を用いて検出できる。あらかじめＨＲＰやビオチン等で標識化した抗リガンド抗体を用いて、本蛋白質に結合したリガンドを検出することもできる。あるいは、本蛋白質との結合反応に用いるリガンドとして、あらかじめ所望の標識物質で標識化したリガンドを用いて上記同定方法を行い、該標識物質を検出することにより、本蛋白質に結合したリガンドを測定できる。標識物質として、一般的な結合解析方法で用いられている物質がいずれも利用でき、ＧＳＴ、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類、あるいは蛍光色素等が例示できる。簡便には、放射性同位体元素が利用できる。
本発明において用いる蛋白質と該蛋白質のリガンドとの結合を阻害する化合物の同定方法で得られた化合物は、本蛋白質が膜蛋白質受容体であることから、本膜蛋白質受容体の機能を阻害する化合物であり得る。
本発明において用いる蛋白質と該蛋白質のリガンドとの結合を阻害し、本蛋白質からなる膜蛋白質受容体の機能を阻害する化合物は、該膜蛋白質受容体のアンタゴニストとして使用できる。該化合物が、本発明に係る膜蛋白質受容体の機能を阻害する化合物であるか否かは、該化合物の存在下および非存在下で、リガンドにより惹き起こされる本膜蛋白質受容体の機能の変化を測定することにより決定できる。化合物により本膜蛋白質受容体の機能変化が生じない場合は、該化合物は、本膜蛋白質受容体に結合するが該膜蛋白質受容体を介する細胞応答を誘導しない化合物であるか、または、リガンドに作用してリガンドと該膜蛋白質受容体の結合を阻害する化合物であると判定できる。それに対して、化合物による本膜蛋白質受容体の機能変化が、リガンド、例えばＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）により本膜蛋白質受容体に生じる機能変化と同質であれば、該化合物は、本膜蛋白質受容体に結合して該膜蛋白質受容体を介する細胞応答を誘導するアゴニストであると判定される。
本発明において用いる蛋白質の機能の測定方法として、本蛋白質を発現させた形質転換体を用いた実験系において、該形質転換体と被検化合物とを接触させた後に、または被検化合物の共存下で、該蛋白質に対するリガンドを作用させ、形質転換体に発生する細胞応答の変化を測定することを含む方法を例示できる。
上記蛋白質の機能の測定方法は、本蛋白質の機能、例えば細胞内情報伝達機構の活性化や細胞応答の誘発を阻害する化合物の同定方法の実施に利用できる。被検化合物の非存在下での測定結果との比較における機能の変化（低減、増加、消失または出現）を検出することにより、本蛋白質の機能を阻害する化合物を選択できる。本蛋白質を発現させた形質転換体に発生する細胞応答の変化として、例えば細胞膜電位の変化や細胞内カルシウム濃度の変化等が挙げられる。被検化合物により、該形質転換体の細胞膜電位の変化が低減する、または細胞内カルシウム濃度が低減する等の変化が惹き起こされた場合、該被検化合物は、本蛋白質の機能を阻害すると判定できる。細胞膜電位の変化や細胞内カルシウム濃度の変化の測定は、周知の方法を用いて実施できる。また、本蛋白質の機能の測定を、ＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質との相互作用を測定することにより実施できるＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質との相互作用の変化やＧ蛋白質との結合変化の測定は、周知の方法を用いて実施できる。
実際に、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡを含むベクターでトランスフェクションした細胞を用いて細胞応答を測定する実験系を用い、該細胞応答に対して阻害効果を示す化合物の同定を実施した（実施例１２参照）。本実験系においては、上記細胞にＣＣＫ−８Ｓを作用させて細胞応答を誘導し、細胞応答の測定は細胞内カルシウム濃度変化を測定することにより行った。被検化合物として、化合物ライブラリーであるソフトフォーカス ジーピーシーアール ターゲットダイレクティッド ライブラリー（ＳｏｆｔＦｏｃｕｓ ＧＰＣＲ Ｔａｒｇｅｔ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｌｉｂｒａｒｙ、ＢｉｏＦｏｃｕｓ社製）を用いた。その結果、上記細胞のＣＣＫ−８Ｓに対する細胞応答を阻害する化合物が３種類同定できた（上記式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ））。これら化合物は、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質のアンタゴニストとして作用していると発明者らは考えている。
この結果から、本蛋白質を発現させた形質転換体を用いた実験系、例えば該形質転換体を用いた細胞内カルシウム濃度変化測定系により、本蛋白質のリガンド、例えばＣＣＫ−８Ｓに対する応答を阻害するアンタゴニストを同定できると発明者らは考えている。
また、本発明において用いる蛋白質とＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質との相互作用に影響を与え得る化合物の同定方法は、例えば、単離した本蛋白質とＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質とを用いて、公知の蛋白質結合解析方法により本蛋白質とＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質との結合の検出を行うことにより実施できる。具体的には、例えばＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質を遺伝子工学的手法によりＧＳＴ−ｔａｇ融合蛋白質として発現させ、その後グルタチオンセファロースに結合させ、これに結合する本蛋白質の量を、本蛋白質に対する抗体、例えばＨＲＰやＡＬＰ等の酵素、放射性同位元素、蛍光色素またはビオチン等で標識した抗体を用いて定量できる。または、タグペプチドを融合した本蛋白質を用いれば、抗タグ抗体を用いて定量することもできる。勿論、本蛋白質を上記酵素、放射性同位元素、蛍光色素、ビオチン等で直接標識してもよい。あるいは、上記酵素、放射性同位元素、蛍光色素、ビオチン等で標識した二次抗体を用いてもよい。あるいは本蛋白質をコードするＤＮＡとＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質をコードするＤＮＡとを適当な細胞を用いて共発現させ、プルダウン法により両者の結合を検出することにより、両者の相互作用を測定できる。
本発明において用いる蛋白質とＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質との相互作用に影響する化合物の同定方法はまた、例えば、ツーハイブリッド（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）法を用いて、本蛋白質とＤＮＡ結合蛋白質を融合蛋白質として発現するプラスミド、ＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質と転写活性化蛋白質を融合蛋白として発現するプラスミド、および適切なプロモーター遺伝子に接続したｌａｃＺ等レポーター遺伝子を含有するプラスミドを酵母や真核細胞等に導入し、被検化合物を共存させた場合のレポーター遺伝子の発現量を被検化合物非存在下でのレポーター遺伝子の発現量とを比較することにより実施できる。被検化合物を共存させた場合のレポーター遺伝子の発現量が被検化合物非存在下でのレポーター遺伝子の発現量と比較して減少した場合には、該被検化合物には本蛋白質とＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質との結合を阻害する作用があると判定できる。一方、被検化合物を共存させた場合のレポーター遺伝子の発現量が被検化合物非存在下でのレポーター遺伝子の発現量と比較して増加した場合には、該被検化合物には本蛋白質とＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質との結合を安定化する作用があると判定できる。
本発明において用いる蛋白質とＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質との相互作用に影響する化合物の同定は、ビアコアシステム（ＢＩＡＣＯＲＥ ｓｙｓｔｅｍ）等の表面プラズモン共鳴センサーを用いて実施することもできる。
本発明において用いる蛋白質とＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質との相互作用に影響する化合物の同定はまた、シンチレーションプロキシミティアッセイ法（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ａｓｓａｙ、ＳＰＡ）や蛍光共鳴エネルギー転移（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＦＲＥＴ）を応用した方法を用いて実施できる。
本発明に係る同定方法において用いるＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質として具体的には、ＤＬＧ２、ＤＬＧ３およびＤＬＧ４や、ＡＩＰ１、ＭＡＧＩ３を例示できる。ＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質は、本発明において用いる蛋白質との相互作用に影響がない限りにおいて、一部を欠損したものであってよく、あるいは別の蛋白質等の標識物質が付加されたものであってもよい。
本発明において用いる蛋白質の発現を阻害する化合物の同定方法は、本ＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体のうち少なくともいずれか１つを用いて、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して実施できる。
本発明において用いる蛋白質の発現を阻害する化合物の同定方法は、抗うつ作用を有する化合物の同定方法として使用できる。すなわち、本同定方法により得られる化合物は、抗うつ作用を有すると考えられるため、抗うつ剤として使用できる。
本発明において用いる蛋白質の発現を阻害する化合物の同定方法は、該ＤＮＡの発現を測定できる実験系において、該ＤＮＡと被検化合物とを共存させてその発現を測定し、ついで、被検化合物の非存在下での測定結果との比較における発現の変化（低減または消失）を検出することにより実施できる。発現の測定は、ＤＮＡによりコードされる蛋白質の直接的な検出により実施できるし、例えば発現の指標となるシグナルを実験系に導入して該シグナルを検出することにより実施できる。シグナルとして、ＧＳＴ、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇ、Ｘｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類、あるいは蛍光色素等を使用できる。
本発明において用いる蛋白質の発現を阻害する化合物の同定方法は、具体的には、該ＤＮＡを含む発現ベクターをトランスフェクションした形質転換体を用いて本蛋白質を発現させる実験系において、該形質転換体と被検化合物とを接触させた後に、発現された蛋白質を測定することによって実施できる。被検化合物の非共存下での測定結果との比較における発現の変化（低減または消失）を検出することにより、本蛋白質の発現を阻害する化合物を選択できる。蛋白質の発現の有無または変化の検出は、公知の蛋白質検出法、例えばウエスタンブロッティング等により実施できる。また、蛋白質の発現の有無または変化の検出は、発現される蛋白質の生物学的機能や該蛋白質を介した細胞応答、例えばリガンドを作用させたときに発生するＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質との相互作用、細胞膜電位の変化、細胞内カルシウム濃度の変化を指標にして実施できる。
本発明において用いる蛋白質の発現を阻害する化合物の同定方法はまた、例えば該ＤＮＡを含む遺伝子のプロモーター領域の下流に、該ＤＮＡの代わりにレポーター遺伝子を連結したベクターを作成し、該ベクターを導入した細胞、例えば真核細胞等と被検化合物とを接触させ、レポーター遺伝子の発現の有無および変化を測定することにより実施できる。レポーター遺伝子として、レポーターアッセイで一般的に用いられている遺伝子を使用でき、例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ等の酵素活性を有する遺伝子を例示できる。レポーター遺伝子の発現の検出は、その遺伝子産物の活性、例えば、上記例示したレポーター遺伝子の場合は酵素活性を検出することにより実施できる。
上記同定方法に使用する実験系や測定系を利用することにより、本発明において用いる蛋白質の機能や発現を促進する化合物の同定方法を実施できる。例えば、本蛋白質と該蛋白質のリガンドとの結合を測定する実験系、本蛋白質の機能の測定方法、本蛋白質とＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質との結合を測定する実験系を利用して、本蛋白質の機能を促進する化合物の同定方法を実施できる。また、本発明において用いるＤＮＡの発現を測定できる実験系を利用して、本蛋白質の発現を促進する化合物の同定方法を実施できる。このような実験系や測定系において、被検化合物により本蛋白質の機能や発現が増加または発生した場合、該被検化合物は本蛋白質の機能や発現を促進すると判定できる。
また、上記同定方法に使用する実験系や測定系を利用することにより、本発明に係る膜蛋白質受容体のアゴニストの同定方法を実施できる。本発明に係る膜蛋白質受容体のアゴニストの同定方法として、例えば、本蛋白質を発現させた形質転換体を用いた実験系において、該形質転換体と被検化合物とを接触させた後に、または被検化合物の共存下で、形質転換体に発生する機能変化を測定することを含む方法を例示できる。被検化合物の非存在下での測定結果との比較における本膜蛋白質受容体機能の変化、例えば低減、増加、消失、出現等を検出することにより、本膜蛋白質受容体のアゴニストが選択できる。より好ましくは、本膜蛋白質受容体のリガンド、例えばＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）による該膜蛋白質受容体の機能変化を測定し、該機能変化と比較することにより、アゴニストが選択できる。アゴニストは、リガンド、例えばＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）により本膜蛋白質受容体に生じる機能変化と同質の機能変化を該膜蛋白質受容体にもたらす化合物であることが好ましい。アゴニストによる本膜蛋白質受容体に生じる機能変化は、リガンド、例えばＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）により本膜蛋白質受容体に生じる機能変化と同質であればよく、量的に差異があってもよい。例えば、アゴニストによる本膜蛋白質受容体に生じる機能変化がリガンド、例えばＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）により本膜蛋白質受容体に生じる機能変化より弱くてもよい。好ましくは、同等の機能変化を惹き起こすアゴニストを選択することが好ましい。本膜蛋白質受容体の機能変化は、形質転換体の該膜蛋白質受容体を介する細胞応答の変化を指標にして測定できる。したがって、リガンド、例えばＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）により本膜蛋白質受容体に生じる機能変化と同質の機能変化として、例えば、形質転換体における該膜蛋白質受容体を介する細胞内カルシウム濃度の上昇が挙げられる。細胞内カルシウム濃度の変化の測定は、周知の方法を用いて実施できる（実施例５参照）。その他、リガンド、例えばＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）により本膜蛋白質受容体に生じる機能変化と同質の機能変化として、形質転換体における該膜蛋白質受容体を介する膜電位の変化が挙げられる。膜電位の変化の測定は、周知の方法を用いて実施できる（実施例３参照）。リガンドは、リガンドを含む試料、または上記リガンドの同定方法により得たリガンド自身のいずれも使用できる。ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）が、本蛋白質の生体内リガンドであると考えられることから、好ましくはＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）をリガンドとして用いることが好ましい。ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）は、一般的な化学合成法により製造できる。また、市販のペプチド合成装置によっても合成できる。
本発明に係る膜蛋白質受容体のアゴニストの同定方法は、本膜蛋白質受容体に結合する化合物の同定方法により得られた化合物について、上記同定方法を用いて本膜蛋白質受容体の機能変化を誘導するか否かを決定することにより実施することもできる。
上記同定方法に使用する実験系や測定系を利用することにより、また、本発明において用いる蛋白質からなる膜蛋白質受容体のリガンドの同定を実施できる。例えば、調べようとする物質（以下、被検物質と称する）と該蛋白質の結合を自体公知の結合解析方法により検出することにより実施できる。あるいは、本蛋白質を発現する細胞を用いた同定方法において、被検物質を該蛋白質に接触させたときに誘発される該細胞の細胞応答を測定することにより実施できる。被検物質を該蛋白質に接触させたときの細胞応答が、接触させなかったときと比較して変化（促進、発生、低減または消失）した場合、該被検物質はリガンドである、またはリガンドを含むと判定できる。細胞応答として具体的には、細胞膜電位の変化または細胞内カルシウム濃度の変化を例示できる。細胞膜電位または細胞内カルシウム濃度の測定は自体公知の方法により実施できる。あるいは、本蛋白質を発現する細胞を用いた同定方法において、細胞応答の指標として、本蛋白質とＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質との相互作用を測定することにより、目的とするリガンド得ることもできる。被検物質を該蛋白質に接触させたときの細胞における本蛋白質とＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質との相互作用が、接触させなかったときと比較して変化（促進または発生）した場合、該被検物質はリガンドである、またはリガンドを含むと判定できる。本蛋白質とＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質との相互作用は、イムノブロッティング等の自体公知の方法により検出できる。
リガンドを同定する対象となる被検物質として、例えば本発明において用いるＤＮＡの発現が認められた細胞または生体組織から調製した試料を例示できる。あるいは、天然物由来あるいは合成された各種化合物を対象とすることもできる。
このような同定方法は、試料中にリガンドが含まれているか否かの判定に有用である他、リガンドが含有されていると判明した試料からリガンドを精製する過程においても、有効に使用できる。例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー等を用いて試料を分画し精製する場合に、該分画物にリガンドが含まれているか否かを判定できる。
（化合物）
本発明に係る同定方法により取得された化合物は、本発明において用いる蛋白質の機能、例えば、リガンドとの結合、細胞内情報伝達の活性化、細胞応答の誘発等の機能の阻害剤、拮抗剤、促進剤または安定化剤等として利用できる。また、本発明において用いる蛋白質に対する遺伝子レベルでの発現阻害剤または発現促進剤として利用できる。これら化合物は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮してさらに選別することにより医薬として調製できる。またこれら化合物は、本蛋白質の機能および／または該蛋白質をコードするＤＮＡの発現の異常に起因する各種病的症状の防止効果および／または治療効果を期待できる。
（医薬組成物）
本発明において用いる蛋白質、ＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体、抗体、リガンドまたは化合物は、本蛋白質の機能および／または発現を阻害する、拮抗する、または促進することに基づく医薬または医薬組成物の有効成分として有用である。
本発明に係る医薬または医薬組成物は、本発明において用いる蛋白質の機能および／または該蛋白質をコードするＤＮＡの発現の異常に起因する疾患の防止および／または治療剤として使用できる。また、当該疾患の防止および／または治療方法に使用できる。
本発明において用いる蛋白質の機能および／または該蛋白質をコードするＤＮＡの発現が過剰な場合、１つの方法として該蛋白質の機能および／または該ＤＮＡの発現を阻害する有効量の阻害剤を医薬上許容される担体とともに対象に投与して、該蛋白質の機能を阻害し、そのことにより異常な症状を改善できる。さらに、発現ブロック法を用いて内在性の該蛋白質をコードするＤＮＡの発現を阻害してもよい。例えば本ＤＮＡの断片をアンチセンスオリゴヌクレオチドとして遺伝子治療に用い、本蛋白質をコードするＤＮＡの発現を阻害できる。アンチセンスオリゴヌクレオチオドとして用いるＤＮＡ断片は、本ＤＮＡの翻訳領域のみでなく、非翻訳領域に対応するものであっても有用である。本ＤＮＡの発現を特異的に阻害するためには、該ＤＮＡに固有な領域の塩基配列を用いることが好ましい。
本発明において用いる蛋白質の機能および／または該蛋白質をコードするＤＮＡの発現の異常に起因する疾患として、神経性疾患、例えばうつ病が好ましく挙げられる。本蛋白質の発現は、脳組織、特に大脳皮質、海馬および扁桃体で強く認められ、本蛋白質からなる機能的膜蛋白質受容体のリガンドであるＣＣＫの発現分布と一致している。ＣＣＫは、不安、鎮痛、鎮静、摂食抑制、記憶、学習といった生理機能に関与していることが知られている。また、ＢＡＩ２遺伝子のノックアウトマウスを用いた尾懸垂試験において、該マウスは抗うつ様の表現型を示した。ＢＡＩ２遺伝子は、本蛋白質をコードするＤＮＡのスプライシングバリアントである。すなわち、本蛋白質をコードするＤＮＡのスプライシングバリアントは、うつ病に関与していると発明者らは考えている。例えば、本蛋白質をコードするＤＮＡまたは該ＤＮＡのスプライシングバリアントの発現が増加するといった異常により、うつ病が誘導されると発明者らは考えている。
本発明において用いる蛋白質の機能および／または発現の阻害剤、例えば本蛋白質からなる膜蛋白質受容体のアンタゴニスト、および該阻害剤を有効量含む医薬組成物は、うつ病の緩和、改善、防止および／または治療に有効であると発明者らは考えている。本発明に係る医薬または医薬組成物は、うつ病の防止および／または治療方法に使用できる。具体的には、本医薬または医薬組成物は、本蛋白質機能および／または発現の阻害剤、例えば本蛋白質からなる膜蛋白質受容体のアンタゴニストを有効成分として、その有効量含んでなるうつ病の防止および／または治療剤であり得る。言い換えれば、本医薬または医薬組成物は、上記抗うつ剤を有効成分として、その有効量含んでなるうつ病の防止および／または治療剤であり得る。上記抗うつ剤を適用することにより、うつ病の防止および／または治療方法を実施できる。
本発明において用いる蛋白質の機能および／または該蛋白質をコードするＤＮＡの発現の異常に起因する疾患として、その他、本蛋白質がアミノ酸配列中にＴＳＰ−Ｉドメインを有することから、血管新生阻害に起因する疾患や血管新生阻害を伴う疾患が挙げられる。ＴＳＰ−Ｉドメインは、血管新生阻害機能を担うドメインであることが報告されていることから、本蛋白質は、血管新生阻害機能を有すると考えられる。したがって、血管新生阻害に起因する疾患や血管新生阻害を伴う疾患に、本蛋白質が関与している可能性がある。このような疾患においては、血管新生を促進することにより治療が可能になるため、本蛋白質の機能や発現を阻害することが好ましい。このような疾患として例えば脳挫傷や脳梗塞が例示できる。
本発明において用いる蛋白質の機能および／または該蛋白質をコードするＤＮＡの発現の減少や欠失等に関連する異常な症状の治療には、１つの方法として該蛋白質の機能および／または該ＤＮＡの発現を促進するまたは安定化する有効量の促進剤を医薬上許容される担体とともに投与し、そのことにより異常な症状を改善することを特徴とする方法が挙げられる。あるいは、遺伝子治療を用いて、対象中の細胞内で該蛋白質を生成せしめてもよい。本ＤＮＡを利用した遺伝子治療は、公知の方法が利用できる。例えば、本ＤＮＡまたは該ＤＮＡの転写産物であるＲＮＡを組込んだ複製欠損レトロウイルスベクターを作製し、該ベクターを用いたエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）において対象由来の細胞を処理し、次いで、細胞を対象に導入することもできる。
本発明に係る医薬は、上記蛋白質、ＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体、抗体、リガンドまたは化合物のうち少なくともいずれか１つを有効成分としてその有効量含む医薬となしてもよいが、通常は、１種または２種以上の医薬用担体を用いて医薬組成物を製造することが好ましい。
本発明に係る医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択されるが、通常約０．００００１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％程度の範囲とするのが適当である。
医薬用担体として、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤や賦形剤等を例示できる。これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択使用される。
例えば水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース等が挙げられる。これらは、剤形に応じて適宜１種類または２種類以上を組合せて使用される。
所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤等を適宜使用して調製することもできる。
安定化剤としては、例えばヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体等を例示でき、これらは単独でまたは界面活性剤等と組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。上記Ｌ−アミノ酸は、特に限定はなく、例えばグリシン、システイン、グルタミン酸等のいずれでもよい。糖類も特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類等およびそれらの誘導体等のいずれでもよい。セルロース誘導体も特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のいずれでもよい。界面活性剤も特に限定はなく、イオン性および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。これには、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエ−テル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等が包含される。
緩衝剤として、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）等を例示できる。
等張化剤として、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン等を例示できる。
キレート剤として、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸等を例示できる。
本発明に係る医薬および医薬組成物は、溶液製剤として使用できる他に、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時、水や生埋的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することもできる。
医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ〜１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ〜１ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量を変更できる。上記投与量は１日１回〜数回に分けて投与することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与してもよい。
本発明に係る医薬組成物を投与するときには、該医薬組成物を単独で使用してもよく、あるいは治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。
投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択できる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内等への投与が挙げられる。あるいは経口経路で投与できる。さらに、経粘膜投与または経皮投与も実施できる。癌疾患に用いる場合は、腫瘍に注射等により直接投与することが好ましい。
投与形態は、各種の形態が目的に応じて選択できる。その代表的なものは、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リポソーム製剤、シクロデキストリン等の包接体、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。
本発明に係る医薬組成物を遺伝子治療剤として用いる場合は、一般的には、注射剤、点滴剤、あるいはリポソーム製剤として調製することが好ましい。遺伝子治療剤が、遺伝子が導入された細胞を含む形態に調製される場合は、該細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）、リンゲル液、細胞内組成液用注射剤中に配合した形態等に調製することもできる。また、プロタミン等の遺伝子導入効率を高める物質と共に投与されるような形態に調製することもできる。遺伝子治療剤として用いる場合、本医薬組成物は、１日に１回または数回に分けて投与でき、また、１日から数週間の間隔で間歇的に投与できる。投与の方法は、一般的な遺伝子治療法で用いられている方法に従って実施できる。
（診断方法）
本発明において用いる蛋白質、ＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体、抗体または化合物は、それ自体を、診断マーカーや診断試薬等の疾患診断手段として使用できる。
本発明において用いるＤＮＡを含む遺伝子の、個体若しくは各種組織における異常の有無あるいは発現の有無をの特異的な検出が、本発明により、例えば本ＤＮＡの一部または全部の塩基配列を利用することにより実施できる。本ＤＮＡの検出により、該遺伝子に起因する疾患の易罹患性、発症、および／または予後の診断が実施できる。該遺伝子に起因する疾患とは、該遺伝子の量的異常および／または機能異常等に起因する疾患を意味する。本遺伝子に起因する疾患として、神経性疾患、例えばうつ病等が挙げられる。
遺伝子の検出による疾患の診断は、例えば被検試料について、該遺伝子に相応する核酸の存在を検出すること、その存在量を決定すること、および／またはその変異を同定することによって実施できる。正常な対照試料との比較において、目的遺伝子に対応する核酸の存在の変化、その量的変化を検出できる。また、正常遺伝子型との比較において、目的遺伝子に対応する核酸を公知の手法により増幅した増幅生成物について、例えばサイズ変化を測定することにより欠失および挿入を検出できる。また増幅ＤＮＡを、例えば標識した本発明において用いるＤＮＡとハイブリダイゼーションさせることにより点突然変異を同定できる。このような変化および変異の検出により、上記診断を実施できる。
被検試料中の目的とする遺伝子の定性的または定量的な測定方法、または該遺伝子の特定領域の変異の定性的または定量的な測定方法も、本発明により実施できる。
被検試料は、目的遺伝子および／またはその変異遺伝子の核酸を含むものである限り特に制限されず、例えば、細胞、血液、尿、唾液、髄液、組織生検または剖検材料等の生体生物由来の生物学的試料を例示できる。あるいは所望により生物学的試料から核酸を抽出して核酸試料を調製して用いることもできる。核酸は、ゲノムＤＮＡを検出に直接使用してもよく、あるいは分析前にＰＣＲまたはその他の増幅法を用いることにより酵素的に増幅してもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡを同様に用いてもよい。核酸試料は、また、標的配列の検出を容易にする様々な方法、例えば変性、制限酵素による消化、電気泳動またはドットブロッティング等により調製してもよい。
検出方法は、公知の遺伝子検出法を用いることができ、例えばプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、サザンブロット法、ノザンブロット法、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＮＡＳＢＡ）法、またはＲＴ−ＰＣＲ等が挙げられる。また、ｉｎ ｓｉｔｕ ＲＴ−ＰＣＲや ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション等を利用した細胞レベルでの測定を用いることもできる。目的遺伝子の検出に用いることのできる方法は上記方法に限定されず、自体公知の遺伝子検出法がいずれも使用できる。
このような遺伝子検出法において、目的遺伝子またはその変異遺伝子の同定および／またはその増幅の実施に、本発明において用いるＤＮＡの断片であってプローブとしての性質を有するものまたはプライマーとしての性質を有するものが有用である。プローブとしての性質を有するＤＮＡ断片とは、目的のＤＮＡのみに特異的にハイブリダイゼーションできる該ＤＮＡ特有の配列からなるものを意味する。プライマーとしての性質を有するものとは本ＤＮＡのみを特異的に増幅できる該ＤＮＡ特有の配列からなるものを意味する。また、増幅できる変異遺伝子を検出する場合には、遺伝子内の変異を有する箇所を含む所定の長さの配列を持つプライマーあるいはプローブを作成して用いる。プローブまたはプライマーは、塩基配列長が一般的に５〜５０ヌクレオチド程度であるものが好ましく、１０〜３５ヌクレオチド程度であるものがより好ましく、１５〜３０ヌクレオチド程度であるものがさらに好ましい。プローブは、通常は標識したプローブを用いるが、非標識であってもよく、直接的または間接的に標識したリガンドとの特異的結合によって検出してもよい。プローブおよびリガンドを標識する方法は、数々の方法が知られており、例えばニックトランスレーション、ランダムプライミングまたはキナーゼ処理を利用する方法等を例示できる。適当な標識物質として、放射性同位体、ビオチン、蛍光色素、化学発光物質、酵素、抗体等が挙げられる。
遺伝子検出法は、ＰＣＲが感度の点から好ましい。ＰＣＲは、目的遺伝子を特異的に増幅することのできるＤＮＡ断片をプライマーとして用いる方法である限り特に制限されず、従来公知の方法、例えばＲＴ−ＰＣＲが例示されるが、当該分野で用いられる数々の変法を適用できる。
ＰＣＲにより、遺伝子の検出の他に、目的遺伝子および／またはその変異遺伝子のＤＮＡの定量も実施できる。このような分析方法として、Ｍｕｌｔｉ−ｃｈａｎｎｅｌ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ａｎｎｅａｌｉｎｇ（ＭＳＳＡ）法のごとき競合的定量法、または一本鎖ＤＮＡの高次構造の変化に伴う移動度の変化を利用した突然変異検出法として知られるＰＣＲ−ＳＳＣＰ法を例示できる。
個体若しくは各種組織における該蛋白質およびその機能の異常の有無を特異的な検出が、本発明により、例えば本発明において用いる蛋白質を利用することにより、実施できる。本蛋白質およびその機能の異常の検出により、該遺伝子に起因する疾患の易罹患性、発症および／または予後の診断が実施できる。
蛋白質の検出による疾患の診断は、例えば被検試料について、該蛋白質の存在を検出すること、その存在量を決定すること、および／またはその変異を検出することによって実施できる。すなわち、本蛋白質および／またはその変異体を定量的あるいは定性的に測定する。正常な対照試料との比較において、目的蛋白質の存在の変化、その量的変化を検出できる。正常蛋白質との比較において、例えばアミノ酸配列を決定することによりその変異を検出できる。このような変化および変異の検出により、上記診断を実施できる。被検試料は、目的蛋白質および／またはその変異体を含むものである限り特に制限されず、例えば、血液、血清、尿、生検組織等の生体生物由来の生物学的試料を例示できる。
本発明において用いる蛋白質および変異を有する該蛋白質の測定は、本蛋白質、例えば配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質、または該蛋白質のアミノ酸配列において１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列、これらの断片、または該蛋白質やその断片に対する抗体を用いることにより実施できる。
蛋白質の定量的あるいは定性的な測定は、この分野における慣用技術による蛋白質検出法あるいは定量法を用いて実施できる。例えば、目的蛋白質のアミノ酸配列分析により変異蛋白質の検出ができるが、さらに好ましくは、抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル抗体）を用いて、目的蛋白質の配列の相違、または目的蛋白質の有無を検出できる。
被検試料中の本発明において用いる蛋白質の定性的または定量的な測定方法、または該蛋白質の特定領域の変異の定性的または定量的な測定方法が、本発明により実施できる。
具体的には、被検試料について、目的蛋白質に対する特異抗体を用いて免疫沈降を行い、ウェスタンブロット法またはイムノブロット法で目的蛋白質の解析を行うことにより、上記検出が実施できる。また、目的蛋白質に対する抗体により、免疫組織化学的技術を用いてパラフィンまたは凍結組織切片中の目的蛋白質を検出できる。
目的蛋白質またはその変異体を検出する方法の好ましい具体例として、モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体を用いるサンドイッチ法を含む、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）、免疫放射線検定法（ＩＲＭＡ）、および免疫酵素法（ＩＥＭＡ）等が挙げられる。その他、ラジオイムノアッセイや競争結合アッセイ等を利用することもできる。
（試薬および試薬キット）
本発明において用いる蛋白質、ＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体、および抗体はいずれも、それ自体を単独で、試薬等として使用でき、例えば、本発明に係る化合物の同定方法、あるいは発明に係る蛋白質および／またはＤＮＡの測定方法に使用するための試薬として使用できる。該試薬は本蛋白質またはＤＮＡが関与する細胞情報伝達経路の解明、並びに該蛋白質および／またはＤＮＡの異常に起因する疾患等に関する基礎的研究等に有用である。
具体的には、本発明に係る試薬キットとして、配列表の配列番号１、１５および１７に記載の塩基配列のうちいずれか１の塩基配列で表されるＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターを導入されてなる形質転換体、該ＤＮＡによりコードされる蛋白質、および該蛋白質を認識する抗体のうち、少なくともいずれか１つを含有してなる試薬キットが例示できる。より具体的には、配列表の配列番号１、１５および１７に記載の塩基配列のうちいずれか１の塩基配列で表されるＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターを導入されてなる形質転換体、配列番号２、１６および１８に記載のアミノ酸配列のうちいずれか１のアミノ酸配列で表される蛋白質および該蛋白質を認識する抗体のうち、少なくともいずれか１つを含有してなる試薬キットが例示できる。
これらは試薬であるとき、緩衝液、塩、安定化剤、および／または防腐剤等の物質を含んでいてもよい。なお、製剤化にあたっては、各性質に応じた自体公知の製剤化手段を導入すればよい。
本発明において用いる蛋白質、ＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体、および抗体のうちの少なくともいずれか１つを含んでなる試薬キットが、本発明により提供される。これらは試薬キットであるとき、本蛋白質やＤＮＡを検出するための標識物質、標識の検出剤、反応希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄剤および反応停止液等、測定の実施に必要とされる物質を含むことができる。標識物質として、上述の標識用蛋白質、および化学修飾物質等が挙げられるが、予め該標識物質が本蛋白質あるいはＤＮＡに付加されていてもよい。
本発明に係る試薬キットは、上記同定方法および測定方法に使用できる。さらに本発明は、前記測定方法を用いる検査方法に、検査剤並びに検査用キットとして使用できる。また、前記測定方法を用いる診断方法にも、診断剤並びに診断用キットとして使用できる。
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
（ヒト脳由来ｃＤＮＡライブラリーの構築と遺伝子の分取）
市販ヒト脳、胎児脳、および脳海馬由来のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製：カタログＮｏ．６５１６−１、６５２５−１、および６５７８−１）を出発原料として常法によりｃＤＮＡライブラリーを構築し、ｄｂＥＳＴ分析によりｃＤＮＡ断片を単離してｃＤＮＡクローンの塩基配列を決定した。具体的には、小原らの方法（オハラ（Ｏｈａｒａ，Ｏ．）ら、「ディーエヌエー リサーチ（ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９７年、第４巻、ｐ．５３−５９）に従って調製した上記ヒト脳由来のｃＤＮＡライブラリーから、約５０，０００個の組換え体をランダムに選択し、このうち約３０，０００個のクローンのｃＤＮＡについて、その５′末端および３′末端の塩基配列を決定した。さらに約１，１００個を主にインビトロの転写翻訳実験によって選択し、それらのｃＤＮＡの塩基配列を小原らの方法に従って決定した。
全塩基配列の決定を行ったｃＤＮＡクローンについて、コンピュータプログラムを用いた汎用解析方法によってＯＲＦを予想し、この領域について７回膜貫通ドメインを有するｃＤＮＡクローンを得た。
同定したｃＤＮＡクローンｐｈ０１２０７は、シグナル配列と予測される部分（Ｎ末端より２０アミノ酸残基）を有する１５１８アミノ酸残基からなるＯＲＦを含む全長４５５７ｂｐの塩基配列を有するＤＮＡ（配列番号１）である。相同性検索により、ｐｈ０１２０７は、ｈＢＡＩ２（ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号ＡＢ００５２９８）の配列のうち、Ｎ末端領域の５５アミノ酸残基をコードする領域が欠損し、さらにＣ末端側領域に１アミノ酸残基（配列番号２に記載のアミノ酸配列における第１４０６番目のリジン）が挿入されたスプライシングバリアントであると考えられた（図１−Ａ）。
ｐｈ０１２０７によりコードされる蛋白質には構造的特徴として、３個のＴＳＰ−Ｉドメインの他、ＧＰＳドメインおよび７回膜貫通ドメインが存在することが判明した。
一方、ｈＢＡＩ２によりコードされる蛋白質は、４個のＴＳＰ−Ｉドメインの他、ＧＰＳドメインおよび７回膜貫通ドメインを有すると考えられる。ｐｈ０１２０７によりコードされる蛋白質においては、ｈＢＡＩ２のＮ末端領域側の１個のＴＳＰ−Ｉドメインを含む領域に相当する５５アミノ酸残基が欠失していることが明らかになった。
ｐｈ０１２０７遺伝子の発現組織解析により、正常の脳組織全般（例えば、大脳皮質（大脳側頭極（ｔｅｍｐｏｒａｌ ｐｏｌｅ）、運動皮質（ｍｏｔｏｒ ｃｏｒｔｅｘ））、海馬、扁桃体等）において本遺伝子の特異的に高い発現が認められた。さらに卵巣癌、肝臓癌および副腎癌において、各正常組織と比較して、発現の亢進が認められた。
（ｐｈ０１２０７発現細胞株の作製と、該細胞株におけるＤＮＡの発現）
実施例１で同定したクローンｐｈ０１２０７を用いてｐｈ０１２０７によりコードされる蛋白質をＮ末端エピトープタグ（ｅｐｉｔｏｐｅ−ｔａｇ）融合蛋白質として発現させた。
まず、ｐｈ０１２０７遺伝子を含む発現ベクターを構築した。実施例１で同定したクローンｐｈ０１２０７を用いて、シグナル配列と予測される部分（Ｎ末端より２０アミノ酸残基）を除いたアミノ酸配列をコードするＤＮＡをＰＣＲおよび制限酵素処理によりｐＤＯＮＲ２０１にクローニングし、ｐｈ０１２０７エントリーベクターを構築した。ＰＣＲは、プライマーとして配列表の配列番号４〜１１のそれぞれに記載した塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを用い、ポリメラーゼとしてＰｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて実施した。
Ｎ末端ｅｐｉｔｏｐｅ−ｔａｇ融合型発現ベクターとして、ｐ３×ＦＬＡＧ−ＣＭＶ９−ａｔｔＲとＴ８ＨＡ−ａｔｔＲ／ｐＣＩＮｅｏの２種類を準備した。ｐ３×ＦＬＡＧ−ＣＭＶ９−ａｔｔＲは、ｐ３×ＦＬＡＧ−ＣＭＶ９（Ｓｉｇｍａ社製）をゲートウェイベクターコンバージョンシステム（ＧＡＴＥＷＡＹ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）によりゲートウェイシステム（ＧＡＴＥＷＡＹ ｓｙｓｔｅｍ）に対応化させたベクターである。Ｔ８ＨＡ−ａｔｔＲ／ｐＣＩＮｅｏは、文献情報（ケラー（Ｋｏｌｌｅｒ，Ｋ．Ｊ．）ら、「アナリティカル バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９７年、第２５０巻、ｐ．５１−６０）に従い、ｐＣＩＮｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）および合成オリゴ（Ｔ８ＳＰ−ＨＡ（配列番号１２）およびＴ８ＳＰ−ＨＡ ａｓ（配列番号１３））、並びにＧＡＴＥＷＡＹ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて構築した。両ベクターともにｅｐｉｔｏｐｅ−ｔａｇの前（Ｎ末端側）に分泌シグナル配列（ＦＬＡＧ：ＰＰＴＬＳ、ＨＡ：Ｔ８）を有する。これらベクターを用いて、マンマリアンエクスプレッションシステムウイズゲートウェイテクノロジー（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ ＧＡＴＥＷＡＹ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＬＲ反応により、Ｎ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＨＡ−ｔａｇ融合型発現ベクターを構築した。構築した各発現ベクターは、制限酵素処理およびシークエンス解析により、導入した配列の翻訳領域に塩基置換や欠損のないことを確認した。
構築した２種類の発現ベクターをそれぞれＣＨＯ−Ｋ１細胞株へフュージーン６（Ｆｕｇｅｎｅ６、Ｒｏｃｈｅ社製）を用いてトランスフェクションした後、Ｇ４１８を含む培地（４００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８および１０％牛胎仔血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）で培養することにより発現細胞株の選抜を行った。生育した発現細胞株について、ｅｐｉｔｏｐｅ−ｔａｇに対するパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗体（抗ＦＬＡＧ Ｍ２−ＰＯＤ抗体および抗ＨＡ−ＰＯＤ抗体：３Ｆ１０）を用いてセルエンザイムイムノアッセイ（ｃｅｌｌ ＥＩＡ）により、さらに選抜を行った。選抜した細胞株について、さらに一次抗体（抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体および抗ＨＡ抗体：クローンＨＡ−７）およびフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識した二次抗体（ＦＩＴＣ−抗マウスＩｇＧ抗体）を用いたフルオロサイトメトリー（ＦＣＭ）解析による選抜を行い、発現細胞株を取得した。
ＦＣＭ解析の結果、細胞膜上に抗ＦＬＡＧ抗体により認識される蛋白質（ＦＬＡＧ−ｔａｇ融合蛋白質）を発現しているクローン８株、抗ＨＡ抗体により認識される蛋白質（ＨＡ−ｔａｇ融合蛋白質）を発現しているクローン４株が得られた。いずれのクローンも、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＨＡ−ｔａｇを認識する抗体が結合したことによる蛍光シグナルが宿主細胞株（ＣＨＯ−Ｋ１）よりも明らかに強いことから、目的の遺伝子が発現していることが明らかになった。代表的な結果を図２に示す。
ＦＣＭ解析の結果から、Ｎ−末端ｅｐｉｔｏｐｅ−ｔａｇ融合型のｐｈ０１２０７遺伝子産物が細胞膜上に発現することが判明した。
ＨＡ−ｔａｇ融合蛋白質の発現が認められたクローンのうちＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６と称する細胞株を、受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１０１号として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１６年８月１９日付けで寄託した。本細胞株の生存は、前記寄託センターにおいて平成１６年９月２２日に実施された試験により確認されている。ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株は、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のうち、シグナル配列（配列番号２に記載のアミノ酸配列のＮ末端より２０アミノ酸残基）をコードすると予測される部分を除いた塩基配列で表されるＤＮＡをＮ末端ＨＡ−ｔａｇ融合蛋白質として発現させるベクターを、ＣＨＯ−Ｋ１細胞株にトランスフェクションすることにより樹立した細胞株であり、Ｎ末端ＨＡ−ｔａｇ融合蛋白質を安定的に発現している。
（ｐｈ０１２０７遺伝子産物の機能解析）
ｐｈ０１２０７遺伝子産物の機能解析は、ｐｈ０１２０７を発現させたアフリカツメガエル卵母細胞にリガンドを添加したときの細胞応答の測定により実施した。細胞応答の測定は、コントロール卵母細胞（遺伝子導入していないもの）および遺伝子（ｐｈ０１２０７ ｃＤＮＡクローン）を発現させた卵母細胞をそれぞれ６個ずつ用いて、リガンドを添加したときの卵母細胞の膜電位変化の測定により行った。リガンドとして、ｐｈ０１２０７を発現していることが認められたＨｅＬａ細胞株の培養上清を用いた。培養上清は、細胞数１．２×１０６のＨｅＬａ細胞株を１０％牛胎仔血清を含むＤＭＥＭにて２日間培養した後に培養上清を回収し、フィルターろ過（０．４５μｍ）することにより調製した。リガンドとして、同様に調製したロットの異なる２種類の培養上清を用いた（以下、リガンドサンプル１および２と称する）。
ｐｈ０１２０７遺伝子を発現させた卵母細胞とコントロール卵母細胞にリガンドサンプル１または２を添加し、膜電位変化を測定した。評価は電流量の変化と電流量の変化を示す波形により行い、電流量の変化が０．２μＡ以上であり、かつＧＰＣＲ特異的なパターンの波形が認められた場合に、リガンド刺激に対する応答があると判定した。ＧＰＣＲ特異的なパターンとは図３に示す波形１のパターンをいう。図３に示す波形２〜４のようなパターンは溶媒等何らかの成分の影響あるいは高濃度のリガンド等の人為的要素により生じる波形パターンであり、リガンド刺激に対する応答ではないと判定した。また、波形５および６のようなパターンが認められた場合は、リガンド刺激に対する応答が無いと判定した。
その結果、ｐｈ０１２０７発現細胞にのみ電流量の変化が認められた（表１および表２）。表２中ＮＤとは、 電流変化量が０．２μＡ以下であり、応答が認められなかったことを示す。表１に示すように、ｐｈ０１２０７発現細胞株６検体の全てにおいてリガンド刺激に対する応答が認められた。それに対し、コントロール細胞は全くリガンドに対して応答しなかった（表２）。このことから、ｐｈ０１２０７発現細胞のリガンド刺激による応答は、発現させた受容体に特異的な応答であると考える。リガンドサンプル１および２のどちらを用いても同様の結果が得られた。
ｐｈ０１２０７遺伝子の発現によりリガンド刺激による細胞応答が生じたことから、ｐｈ０１２０７遺伝子産物は、リガンドに応答して細胞内情報伝達経路を活性化する機能を有するＧＰＣＲであると考える。
（ｐｈ０１２０７遺伝子産物の蛋白質相互作用解析）
ｐｈ０１２０７遺伝子産物の蛋白質相互作用解析をイーストツーハイブリッドシステムを用いて検討した。
ｐｈ０１２０７配列情報とｈＢＡＩ２配列情報に基づいて、ｐｈ０１２０７遺伝子産物のＮ末端領域（４ヶ所）とＣ末端領域（２ヶ所）、およびｈＢＡＩ２遺伝子産物のＮ末端領域（ｐｈ０１２０７で５５アミノ酸残基欠失している領域）とＣ末端領域（ｐｈ０１２０７で１アミノ酸残基挿入のある領域）にそれぞれｂａｉｔ（ベイト）を設定し、ｈＢＡＩ２の発現分布に関する報告（非特許文献１）より選択したｃＤＮＡライブラリー（脳、海馬、乳癌と前立腺癌、心臓、骨格筋に由来する）に対してスクリーニングを行った。
ｐｈ０１２０７遺伝子産物（配列番号２０に記載のアミノ酸配列の第１４６１番目に相当する１アミノ酸残基の挿入有り）およびｈＢＡＩ２遺伝子産物（前記アミノ酸残基の挿入なし）の各Ｃ末端領域に設計したｂａｉｔのいずれを用いたときも、ｐｒｅｙ（プレイ）としてＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質であるＤＬＧ２、ＤＬＧ３およびＤＬＧ４や、ＡＩＰ１、ＭＡＧＩ３等が得られた。この他、ｈＢＡＩ２遺伝子産物特異的なｐｒｅｙとして、ＨＯＭＥＲ２、Ｃｉｔｒｏｎ、ＳＹＮＥ−１、ＫＩＦ５ＡおよびＫＩＦＡＰ３が得られた。
ｐｈ０１２０７遺伝子産物のＮ末端領域（５５アミノ酸残基の欠失有り）に設計されたｂａｉｔに対しては、ＢＡＴ１（ＨＬＡ−Ｂ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ３）のみがｐｒｅｙとして得られたが、ｈＢＡＩ２遺伝子産物のＮ末端領域（前記アミノ酸残基の欠失なし）に設計されたｂａｉｔに対しては、ＫＣＮＮ２（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ／ｓｍａｌｌ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｃａｌｃｉｕｍ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｈａｎｎｅｌ， ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｎ， ｍｅｍｂｅｒ２）等がヒットした。
このように、ｐｈ０１２０７遺伝子産物とｈＢＡＩ２遺伝子産物とでは、ＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質を除いて、イーストツーハイブリッドシステムにより検出される相互作用蛋白質に違いがあることが判明した。
ｐｈ０１２０７遺伝子産物およびｈＢＡＩ２遺伝子産物は、それぞれのＣ末端領域において、ＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質と相互作用することが判明した。ＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質は細胞質内に存在し、細胞膜に存在する受容体やイオンチャネル等の膜蛋白質と結合することにより、これら膜蛋白質からの情報伝達に関与している。したがって、ｐｈ０１２０７遺伝子産物とｈＢＡＩ２遺伝子産物は、ＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質を介して細胞内情報伝達に関与する機能的膜蛋白質受容体であると考える。
（ＣＣＫ８によるｐｈ０１２０７発現細胞株の細胞内カルシウム濃度変化の測定）
実施例２で作製したｐｈ０１２０７発現細胞株を用いて、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）、ＣＣＫ−８ＮＳまたはＣＣＫ−４による細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）濃度変化を測定した。実施例２で作製した細胞株は、ｐｈ０１２０７によりコードされる蛋白質をＦＬＡＧ−ｔａｇ融合蛋白質として発現している８株およびｐｈ０１２０７によりコードされる蛋白質をＨＡ−ｔａｇ融合蛋白質として発現している４株である。このうち、本実施例においては、ｐｈ０１２０７によりコードされる蛋白質をＨＡ−ｔａｇ融合蛋白質として安定的に発現している細胞株の１つを細胞クローニングして得られた株である、ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株を使用した。ＣＣＫ−８ＮＳは、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）と同じアミノ酸配列で表されるＣＣＫオクタペプチドであるが、Ｃ末端から７番目のチロシン残基が硫酸化されていない。ＣＣＫ−４は、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）のＣ末端から４番目までのアミノ酸残基からなるテトラペプチドである。
ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）によるＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株の細胞内Ｃａ２＋濃度の変化の具体的な測定方法とその結果を以下に述べる。ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株を、９６ウエルプレート（壁面が黒色で底面が透明なもの）に、細胞数２×１０４／１００μＬ ｍｅｄｉｕｍ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃にて５％ＣＯ２存在下で培養した。培地（ｍｅｄｉｕｍ）は、１０％ 牛胎仔血清（Ｍｏｒｅｇａｔｅ社製）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ社製）を用いた。翌日、各ウエルより培地を５０μＬずつ抜き取り、ローディングバッファー（Ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）を５０μＬずつ各ウエルに添加して、室温で１．５時間反応させ、ローディングバッファー中に含まれる蛍光色素を細胞内に取り込ませた。ローディングバッファーは、ＦＬＩＰＲカルシウム３ アッセイキット（ＦＬＩＰＲ Ｃａｌｃｉｕｍ ３ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製）のコンポーネントＡを、９．９ｍＬのコンポーネントＢに０．１ｍＬの５００ｍＭ プロベネシド（ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ、Ｓｉｇｍａ社製）を加えた溶液にて溶解することにより調製した。反応後、フレックスステーション（ＦＬＥＸｓｔａｔｉｏｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製）を用いてＣＣＫ−８Ｓ（ペプチド研究所製）添加時の蛍光強度の経時変化をウエル毎に測定した。また、ＣＣＫ−８ＮＳ（ペプチド研究所製）およびＣＣＫ−４（ペプチド研究所製）についても同様の測定を行なった。ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）は、０．５２ｍｇを４．５ｍＬの１％ ＮａＨＣＯ３（Ｗａｋｏ社製）で溶解し、０．１ｍＭ濃度の溶液を調製した。ＣＣＫ−８ＮＳは、０．５３ｍｇを０．５０ｍＬのジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ社製）で溶解後、４．５０ｍＬの再蒸留水Ｈ２Ｏを添加し、０．１ｍＭ濃度の溶液を調製した。ＣＣＫ−４は、０．５４ｍｇを０．４６ｍＬのＤＭＳＯで溶解後、４．０９ｍＬの再蒸留水を添加し、０．２ｍＭ濃度の溶液を調製した。ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）、ＣＣＫ−８ＮＳおよびＣＣＫ−４は、それぞれリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈して５ｎＭ溶液とし、各２５μＬ添加（終濃度１ｎＭ）して測定を行った。細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇を惹き起こすポジティブコントロールとしてＡ２３１８７（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を終濃度１０μＭで用いた。ネガティブコントロールとして、ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株の作製において宿主として用いたＣＨＯ−Ｋ１細胞株を用いた。ＣＨＯ−Ｋ１細胞株にはｐｈ０１２０７発現ベクターがトランスフェクションされていないため、ｐｈ０１２０７遺伝子産物は発現していない。
その結果、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）により刺激したＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株の細胞内Ｃａ２＋濃度（図４−Ａ）が、無刺激のＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株（図４−Ｅ）と比較して上昇した。しかし、ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株の細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇は、ＣＣＫ−８ＮＳやＣＣＫ−４による刺激では認められなかった（図４−Ｂおよび図４−Ｃ）。また、Ａ２３１８７によるＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株の細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇が認められた（図４−Ｄ）。
１ｎＭ ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）によるＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株の細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇の程度（図４−Ａ）は、ポジティブコントロールに用いたＡ２３１８７による細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇の程度（図４−Ｄ）と、ほぼ同等であった。
一方、ＣＨＯ−Ｋ１細胞株は、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）、ＣＣＫ−８ＮＳおよびＣＣＫ−４のいずれで刺激したときも、細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇を示さなかった（図４−Ａ、図４−Ｂおよび図４−Ｃ）。しかし、Ａ２３１８７によるＣＨＯ−Ｋ１細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇は認められた（図４−Ｄ）。
これら結果から、ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株が、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）に対して特異的に応答することが明らかになった。また、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）によるＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株の細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇には、該細胞株で発現されたｐｈ０１２０７によりコードされる蛋白質が関与することが明らかになった。これらから、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）は、ｐｈ０１２０７遺伝子産物のリガンドであると考える。
また、ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株は、１ｎＭのＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）により、十分に高い細胞応答を示した。１ｎＭという低濃度のＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）が、ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株の細胞応答を惹き起こしたことから、ＣＣＫ−８は生体内で実際に、ｐｈ０１２０７によりコードされる蛋白質を介して細細胞応答を惹き起こしていると考える。つまり、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）は、ＧＰＣＲと予想されたｐｈ０１２０７の生体内リガンドの一つであると考える。
（ｐｈ０１２０７遺伝子のスプライシングバリアントの同定）
ｐｈ０１２０７遺伝子のスプライシングバリアントを、ＲＴ−ＰＣＲによるクローニングを行って取得した。
ｐｈ０１２０７遺伝子のスプライシングバリアントの取得は、次のように実施した。まず、ヒト脳由来のｐｏｌｙＡ（＋） ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を出発原料として常法によりｃＤＮＡライブラリーを構築し、ｄｂＥＳＴ分析によりｃＤＮＡ断片を単離してｃＤＮＡクローンの塩基配列を決定した。具体的には、ｐｏｌｙＡ（＋） ＲＮＡ ０．１μｇを含む１０μＬの反応系で、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行いｃＤＮＡライブラリーを構築した。このｃＤＮＡを鋳型として配列番号２３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号２４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーに用いてＰＣＲを行った。これらプライマーを用いたＰＣＲにより、ｈＢＡＩ２（配列番号２２）の第４４番目のアスパラギン酸（Ｄ）から第４７５番目のシステイン（Ｃ）までのアミノ酸配列をコードする領域のＤＮＡ、およびｈＢＡＩ２（配列番号２２）のスプライシングバリアントにおいて、該領域に相当するＤＮＡが増幅される（図１−Ｃ参照）。得られた各クローンとｐｈ０１２０７ ｃＤＮＡクローンとの間で、ＳｃａＩおよびＸｈｏＩによる組換えを行い、３種類の全長ｃＤＮＡクローンを得た。各クローンの塩基配列の確認は、シーケンス解析により実施した。
その結果、配列相同性および構造類似性からｐｈ０１２０７遺伝子のスプライシングバリアントと考えられる３種類の全長ｃＤＮＡクローンが得られた。これらｃＤＮＡクローンを、７ｔｍＨＲ遺伝子、ｈｋ０１９４１遺伝子およびｖａｒｉａｎｔ ３遺伝子と称する。これらスプライシングバリアントは全て、Ｎ末端細胞外領域のＴＳＰ−Ｉドメインのリピート数が異なるバリアントである（図１−Ｂ）。これらスプライシングバリアントのうち、７ｔｍＨＲ遺伝子が最長の蛋白質をコードしている。
７ｔｍＨＲ遺伝子は、シグナル配列と予測される部分（Ｎ末端より２０アミノ酸残基）を有する１５７３アミノ酸残基（配列番号２０）をコードするＯＲＦを含む４７１９ｂｐの塩基配列からなる（配列番号１９）。７ｔｍＨＲ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号：ＡＢ０６５６４８として登録されている。本遺伝子によりコードされる蛋白質は、７回膜貫通ドメインを有し、４個のＴＳＰ−Ｉドメインおよび１個のＧＰＳドメインを有する（図１−Ｂ参照）。該蛋白質は、ｈＢＡＩ２（ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号ＡＢ００５２９８）の配列と比較して、Ｃ末端側領域において１アミノ酸残基が挿入されている以外は、ｈＢＡＩ２と同一のアミノ酸配列を有する。該１アミノ酸残基の挿入は、ｈＢＡＩ２のアミノ酸配列の第１４６０番目のグルタミン酸（Ｅ）と第１４６１番目のバリン（Ｖ）の間に認められ、該挿入されたアミノ酸残基はリジンである。該挿入されたリジンは、７ｔｍＨＲ遺伝子によりコードされる蛋白質（配列番号２０）のアミノ酸配列において第１４６１番目に相当する。配列相同性および構造類似性から、７ｔｍＨＲ遺伝子および該遺伝子によりコードされる蛋白質は、ｈＢＡＩ２遺伝子のスプライシングバリアントであると考えられた。
ｈｋ０１９４１遺伝子は、新規遺伝子であり、シグナル配列と予測される部分（Ｎ末端より２０アミノ酸残基）を有する１４６３アミノ酸残基（配列番号１６）をコードするＯＲＦを含む４３８９ｂｐの塩基配列からなる（配列番号１５）。本ＤＮＡによりコードされる蛋白質は、７回膜貫通ドメインを有し、２個のＴＳＰ−Ｉドメインおよび１個のＧＰＳドメインを有する（図１−Ｂ参照）。本ＤＮＡによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列は、７ｔｍＨＲ遺伝子によりコードされる蛋白質（配列番号２０）と比較して、Ｎ末端側の２個のＴＳＰ−Ｉドメインを含む１１０アミノ酸残基が欠失している以外は同一である。欠失している１１０アミノ酸残基は、７ｔｍＨＲ遺伝子によりコードされる蛋白質のアミノ酸配列（配列番号２０）において、第２９６番目のグリシン（Ｇ）から第４０５番目のプロリン（Ｐ）に相当する。
ｖａｒｉａｎｔ ３遺伝子は、新規遺伝子であり、シグナル配列と予測される部分（Ｎ末端より２０アミノ酸残基）を有する１５１８アミノ酸残基（配列番号１８）をコードするＯＲＦを含む４５５４ｂｐの塩基配列からなる（配列番号１７）。本ＤＮＡによりコードされる蛋白質は、７回膜貫通ドメインを有し、３個のＴＳＰ−Ｉドメインおよび１個のＧＰＳドメインを有する（図１−Ｂ参照）。ＤＮＡによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列は、７ｔｍＨＲ遺伝子によりコードされる蛋白質（配列番号２０）と比較して、Ｎ末端側から２番目のＴＳＰ−Ｉドメイン１個を含む５５アミノ酸残基が欠失している以外は同一である。欠失している５５アミノ酸残基は、７ｔｍＨＲ遺伝子によりコードされる蛋白質のアミノ酸配列（配列番号２０）において、第３５１番目のバリン（Ｖ）から第４０５番目のプロリン（Ｐ）に相当する。
ｐｈ０１２０７遺伝子によりコードされる蛋白質のアミノ酸配列は、７ｔｍＨＲ遺伝子によりコードされる蛋白質のアミノ酸配列（配列番号２０）と比較して、Ｎ末端側の１個のＴＳＰ−Ｉドメインを含む５５アミノ酸残基が欠失している以外は同一である。欠失している５５アミノ酸残基は、７ｔｍＨＲ遺伝子によりコードされる蛋白質のアミノ酸配列（配列番号２０）において、第２９６番目のグリシン（Ｇ）から第３５０番目のプロリン（Ｐ）に相当する。
（ｐｈ０１２０７遺伝子のスプライシングバリアントの安定発現株の構築）
ｐｈ０１２０７遺伝子のスプライシングバリアントの安定発現株を構築し、該安定発現株においてＣＣＫ−８Ｓによる細胞応答が惹き起こされるか検討した。スプライシングバリアントとして、実施例６で取得した３種類のスプライシングバリアント、７ｔｍＨＲ遺伝子、ｈｋ０１９４１遺伝子およびｖａｒｉａｎｔ ３遺伝子を用いた。
まず、各全長ｃＤＮＡクローンの発現ベクターを、動物細胞用発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて各全長ｃＤＮＡクローンとの組換え反応を、Ａｓｐ７１８ＩおよびＮｏｔＩにより行うことにより構築した。得られた発現ベクターを、７ｔｍＨＲ／ｐｃＤＮＡ３．１、ｈｋ０１９４１／ｐｃＤＮＡ３．１およびｖａｒｉａｎｔ３／ｐｃＤＮＡ３．１と称する。
７ｔｍＨＲ安定発現株およびｈｋ０１９４１安定発現株は、７ｔｍＨＲ発現ベクター（７ｔｍＨＲ／ｐｃＤＮＡ３．１）およびｈｋ０１９４１発現ベクター（ｈｋ０１９４１／ｐｃＤＮＡ３．１）をそれぞれ、ＣＨＯ−Ｋ１細胞株にトランスフェクションすることにより作製した。具体的には、発現ベクターをリポフェクトアミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、ＬＦ２０００と略称することがある、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と混合し（４μｇ ＤＮＡ／２５０μＬ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地＋１０μＬ ＬＦ２０００／２５０μＬ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）、６ウエルプレートに培養したＣＨＯ−Ｋ１株（２ｍＬ 培地／ｗｅｌｌ）に添加してトランスフェクションを行った。翌日、細胞を回収し９６ウエルプレートに１細胞／ｗｅｌｌの細胞密度で播種し、Ｇ４１８（４００μｇ／ｍＬ）を含む選択培地（１０％ ＦＣＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）による培養を行い、発現細胞株を選抜した。また、選抜した発現細胞株について、抗ｈＢＡＩ２抗体を用いたＦＣＭ解析、ウエスタンブロッティング解析を行い、それぞれ導入遺伝子の発現を確認した。
（ｐｈ０１２０７遺伝子のスプライシングバリアントの安定発現株の機能解析）
ｐｈ０１２０７遺伝子のスプライシングバリアントの安定発現株を用いて、ＣＣＫ−８Ｓによる細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）濃度変化を、実施例５に記載の方法と同様の方法で測定した。ｐｈ０１２０７遺伝子のスプライシングバリアントの安定発現株として、実施例７で構築した安定発現株を使用した。また、ｈｋ０１９４１安定発現株を用いて同様の検討を行った。ｈｋ０１９４１安定発現株として、実施例７で構築した安定発現株を使用した。コントロールとして、７ｔｍＨＲ発現ベクターまたはｈｋ０１９４１発現ベクターをトランスフェクションしていない宿主細胞を使用した。
細胞は、細胞数３×１０４／１００μＬ 培地／ｗｅｌｌを、９６ウエルプレート（黒色の壁および透明な底を持つプレート）に播種し、３７℃にて５％ ＣＯ２インキュベーターで一晩培養した。翌日、各ウエルより培地を５０μＬを抜き取り、ローディングバッファー（Ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）を５０μＬずつ各ウエルに添加して、室温で１時間反応させ、ローディングバッファー中に含まれる蛍光色素を細胞内に取り込ませた。ローディングバッファーは、実施例５に記載の方法と同様の方法で調製した。反応後、フレックスステーション（ＦＬＥＸｓｔａｔｉｏｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製）を用いてＣＣＫ−８Ｓ添加時の蛍光強度の経時変化をウエル毎に測定した。ＣＣＫ−８Ｓは終濃度１０ｐＭ−１μＭで用いた。また、アッセイのポジティブコントロールとしてＡ２３１８７を終濃度２０μＭで用いた。
７ｔｍＨＲ安定発現株およびｈｋ０１９４１安定発現株のどちらにおいても、ＣＣＫ−８Ｓ添加により、細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）濃度の上昇が観察された。それに対して、７ｔｍＨＲ発現ベクターまたはｈｋ０１９４１発現ベクターをトランスフェクションしていない宿主細胞では、ＣＣＫ−８Ｓ添加による細胞内カルシウム濃度の変化は観察されなかった。両方の安定発現株共に複数のクローンで同様の傾向が確認できた。７ｔｍＨＲ安定発現株およびｈｋ０１９４１安定発現株の代表的なクローンについて、生理的濃度（１ｎＭ）のＣＣＫ−８Ｓを添加したときの細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）濃度変化を図５−Ａおよび図６−Ａに示す。また、ポジティブコントロールに用いたＡ２３１８７（２０μＭ）に対しては発現細胞株および宿主細胞のいずれにおいても同様の応答が観察された（図５−Ｂおよび図６−Ｂ）。
７ｔｍＨＲ安定発現株およびｈｋ０１９４１安定発現株において、ＣＣＫ−８Ｓ添加により、宿主細胞では認められない細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）濃度変化が観察されたことから、７ｔｍＨＲ遺伝子およびｈｋ０１９４１遺伝子の遺伝子産物はいずれも、ＣＣＫ−８Ｓにより惹き起こされる細胞応答を媒介すると考える。すなわち、７ｔｍＨＲ遺伝子およびｈｋ０１９４１遺伝子の遺伝子産物はいずれも細胞膜表面上に発現され、細胞外のＣＣＫ−８Ｓの作用により、細胞内情報伝達経路を活性化して細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）濃度の上昇という細胞応答を惹き起こしたと考える。
（ｖａｒｉａｎｔ ３遺伝子安定発現株の機能解析）
ｖａｒｉａｎｔ ３遺伝子の機能を解析するために、ｖａｒｉａｎｔ ３遺伝子の安定発現株を用いて、ＣＣＫ−８Ｓによる細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）濃度変化を検討した。細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）濃度変化は、実施例５に記載の方法と同様の方法で測定した。ｖａｒｉａｎｔ ３遺伝子のスプライシングバリアントの安定発現株は、実施例７で構築したｖａｒｉａｎｔ ３遺伝子発現ベクターを使用して、実施例７に記載の方法と同様の方法により作製た。
細胞は、細胞数３×１０４／１００μＬ 培地／ｗｅｌｌを、９６ウエルプレート（黒色の壁および透明な底を持つプレート）に播種し、３７℃にて５％ ＣＯ２インキュベーターで一晩培養した。翌日、各ウエルより培地を５０μＬを抜き取り、ローディングバッファー（Ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）を５０μＬずつ各ウエルに添加して、室温で１時間反応させ、ローディングバッファー中に含まれる蛍光色素を細胞内に取り込ませた。ローディングバッファーは、実施例５に記載の方法と同様の方法で調製した。反応後、フレックスステーション（ＦＬＥＸｓｔａｔｉｏｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製）を用いてＣＣＫ−８Ｓ添加時の蛍光強度の経時変化をウエル毎に４０秒間測定した。ＣＣＫ−８Ｓは終濃度１０ｐＭ−１μＭで用いた。また、アッセイのポジティブコントロールとしてＡ２３１８７を終濃度２０μＭで用いた。
ｖａｒｉａｎｔ ３遺伝子安定発現株において、ＣＣＫ−８Ｓ添加により、細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）濃度の上昇が観察された。それに対して、ｖａｒｉａｎｔ ３発現ベクターをトランスフェクションしていない宿主細胞では、ＣＣＫ−８Ｓ添加による細胞内カルシウム濃度の変化は観察されなかった。ｖａｒｉａｎｔ ３安定発現株の代表的なクローンについて、生理的濃度（１ｎＭ）のＣＣＫ−８Ｓを添加したときの細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）濃度変化を図７−Ａに示す。また、ポジティブコントロールに用いたＡ２３１８７（２０μＭ）に対しては発現細胞株および宿主細胞のいずれにおいても同様の応答が観察された（図７−Ｂ）。
ｖａｒｉａｎｔ ３遺伝子安定発現株において、ＣＣＫ−８Ｓ添加により、宿主細胞では認められない細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）濃度変化が観察されたことから、ｖａｒｉａｎｔ ３遺伝子の遺伝子産物は、ＣＣＫ−８Ｓにより惹き起こされる細胞応答を媒介すると考える。すなわち、ｖａｒｉａｎｔ ３遺伝子の遺伝子産物はいずれも細胞膜表面上に発現され、細胞外のＣＣＫ−８Ｓの作用により、細胞内情報伝達経路を活性化して細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）濃度の上昇という細胞応答を惹き起こしたと考える。
（ｐｈ０１２０７遺伝子の組織発現）
ｐｈ０１２０７遺伝子の組織発現を、ＬｉｆｅＳｐａｎ ＤｒｕｇＴａｒｇｅｔ ＤａｔａｂａｓｅＴＭ（ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）の検索、およびＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓ Ｄａｔａｂａｓｅ（Ｇｅｎｅ Ｌｏｇｉｃ社）の検索により解析した。
ＬｉｆｅＳｐａｎ ＤｒｕｇＴａｒｇｅｔ ＤａｔａｂａｓｅＴＭ（ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）の検索による解析により、３種類のウサギ抗ヒトＢＡＩ２ポリクローナル抗体（ＬＳ−Ａ９８１、Ａ９８２、Ａ９８４；Ｌｉｆｅ Ｓｐａｎ社製）により得られた組織免疫染色データから、扁桃体、海馬、髄質、視床、黒質、大脳皮質の各部位のニューロンとアストロサイト、および下垂体前葉の一部の細胞、下垂体後葉のへリング体が共通して強く染色されることが明らかになった。図８−Ａおよび図８−Ｂにそれぞれ、扁桃体の原型質性アストロサイト（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍｉｃ ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）、並びに扁桃体のニューロンおよびグリアのＬＳ−Ａ９８１による組織免疫染色データを示す。また、図８−Ｃおよび図８−Ｄにそれぞれ、海馬のＣＡ２領域のニューロンおよびＣＡ１領域のニューロンのＬＳ−Ａ９８１による組織免疫染色データを示す。
ＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓ Ｄａｔａｂａｓｅ（Ｇｅｎｅ Ｌｏｇｉｃ社）のＧｅｎｅｔｉｐ解析データを用いた発現解析は、ｐｈ０１２０７（ｈＢＡＩ２）、ＣＣＫ−Ａ受容体（ＣＣＫ−ＡＲ）、ＣＣＫ−Ｂ受容体（ＣＣＫ−ＢＲ）およびＣＣＫについて行った。その結果を表３に示す。
ｐｈ０１２０７（ｈＢＡＩ２）遺伝子は、脳組織、特に大脳皮質（大脳側頭極、運動皮質等）、海馬、および扁桃体等に限局して強く発現していることが認められた（表３）。本遺伝子は消化管、例えば膵臓、小腸、胃および胆嚢等ではほとんど認められなかった。
それに対し、ＣＣＫ−Ａ受容体（表中ＣＣＫ−ＡＲと表示する）は脳組織内での発現はほとんど認められず、消化管、例えば膵臓、胃および胆嚢等で発現していることが確認できた（表３）。また、ＣＣＫ−Ｂ受容体（表中ＣＣＫ−ＢＲと表示する）は膵臓および小腸での発現が高く、また脳組織、例えば大脳皮質、海馬および扁桃体等で発現していることが確認できた（表３）。ｐｈ０１２０７（ｈＢＡＩ２）遺伝子の脳組織内での発現量は、ＣＣＫ−Ｂ受容体の発現量と比較して、より高い発現量であった。
ＣＣＫの組織発現を解析したところ、ｐｈ０１２０７の組織発現と同様の分布が認められた。したがって、ｐｈ０１２０７とＣＣＫとは同じ部位で強く発現していることが確認された（表３）。
ノックアウトマウスの機能に関する情報データベース（Ｄｅｌｔａｇｅｎ社）から、ＢＡＩ２ノックアウトマウスの機能に関する情報を得た。
ＢＡＩ２ノックアウトマウスは、相同組換えによる遺伝子破壊により作製された。相同組換えによる遺伝子破壊は、具体的には、マウスＢＡＩ２遺伝子（１５６０アミノ酸残基をコードする）の塩基配列中の、マウスＢＡＩ２の第８７６番目のアスパラギン酸（Ｄ）から第９１７番目のロイシン（Ｌ）をコードする領域（８７６Ｄ−９１７Ｌ領域）を標的としたターゲティングベクターを作成し、該ターゲティングベクターを１２９／ＯｌａＨｓｄマウス由来のＥＳ細胞に導入することにより実施された。ターゲティングベクターには、ＬａｃＺ−Ｎｅｏ遺伝子カセットが含まれ、該カセットの５´側（５´ａｒｍ）にはマウスＢＡＩ２遺伝子の８７６Ｄ−９１７Ｌ領域の上流にあるイントロンより０．８ｋｂ上流側のゲノム配列、３´側（３´ａｒｍ）には同遺伝子の８７６Ｄ−９１７Ｌ領域の下流にあるイントロンより１．２ｋｂ下流側のゲノム配列が含まれている。本ターゲティングベクターを用いた相同組換えにより、マウスＢＡＩ２遺伝子の標的部位にはＬａｃＺ−Ｎｅｏ断片が挿入される。相同組換えが起きたＥＳ細胞をＧ４１８含有の選択培地により選抜し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いて常法によりキメラマウスが作製された。得られたキメラマウスとＣ５７ＢＬ／６マウスを交配することにより、雑種第一代（Ｆ１）ヘテロ変異マウスが作製された。さらにＦ１ヘテロ変異マウス同士の交配により雑種第二代（Ｆ２）ホモ変異マウスが作製された。
Ｆ１ヘテロ変異マウスおよびＦ２ホモ変異マウスの遺伝子型の確認は、ＰＣＲおよびノザン解析により実施された。
マウスＢＡＩ２遺伝子の標的部位にＬａｃＺ−Ｎｅｏ断片が挿入されたか否かの確認は、Ｆ１ヘテロ変異マウスについてＬａｃＺ発現解析により行われた。その結果、Ｆ１ヘテロ変異マウスにおいて、組織、特に海馬および扁桃体でＬａｃＺの強い発現が認められた（図９−Ａおよび図９−Ｂ）。この結果から、Ｆ１ヘテロ変異マウスにおいて、マウスＢＡＩ２遺伝子の標的部位にＬａｃＺ−Ｎｅｏ断片が挿入されたこと、すなわち該遺伝子が破壊されたことが確認された。この結果はまた、Ｆ１ヘテロ変異マウスにおいて、マウスＢＡＩ２遺伝子が、脳組織、特に海馬および扁桃体で強く発現していることを示すものである。
ＢＡＩ２ノックアウトマウスの機能の検討を、行動学的検査、生理学的検査、病理学的検査および解剖学的検査により行った。
ＢＡＩ２ノックアウトマウスは、行動学的検査において尾懸垂試験の結果に、野生型マウスと比較して有意な差が観察された（図１０）。一方、生理学的検査、病理学的検査、解剖学的検査等、多くの検査項目において野生型マウスと比較して有意な差は認められなかった。
尾懸垂試験は、マウスの尾を固定して逆さ釣りにした状態で、逃げようと動き始めるまでの静止時間を測定する試験法であり、うつ病の表現型を調べる試験法として一般的に用いられている手法である。尾懸垂試験は、抗うつ薬の評価等、うつ病との関連性を調べる試験系として用いられている（ステル（Ｓｔｅｒｕ Ｌ．）ら、「サイコファーマコロジー（Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（Ｂｅｒｌ））」、１９８５年、第８５巻、第３号、ｐ．３６７−３７０；クラウリー（Ｃｒｏｗｌｅｙ Ｊ．Ｊ．）ら、「ファーマコロジー バイオケミストリー アンド ビヘイビア（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｅｈａｖｉｏｒ」、２００４年、第７８巻、第２号、ｐ．２６９−２７４；ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｄ．Ｍ．）ら、「ヨーロピアン ジャーナル オブ ファーマコロジー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」、２００４年、第４９９巻、第１−２号、ｐ．１３５−１４６ ）。
尾懸垂試験において無動時間が長いほど抑うつ状態、短いほど抗うつ状態である事が知られている。例えば、抗うつ薬投与により、無働時間が短縮されることが知られている。
尾懸垂試験は、ＢＡＩ２ノックアウトマウス１０匹を用いて実施された。コントロールとして、野生型マウス１６匹を用いて同様に尾懸垂試験を実施した。
ＢＡＩ２ノックアウトマウスは、尾懸垂試験において野生型マウスと比較して無働時間が有意に短縮された（図１０）。結果は、ＢＡＩ２ノックアウトマウス群および野生型マウス群の各マウスの無動時間の平均値±標準誤差で示した。有意差はＴテストを用いた統計学的処理において認められた。
尾懸垂試験の結果から、ＢＡＩ２ ノックアウトマウスが抗うつ状態にあると解釈できる。ＢＡＩ２ノックアウトマウスが抗うつ様の表現型を示すことから、ＢＡＩ２遺伝子はうつ病に関連していると考えられる。
ＢＡＩ２ノックアウトマウスでは、ＢＡＩ２遺伝子が破壊されているため、ＢＡＩ２遺伝子およびそのスプライシングバリアントは発現されない。したがって、ＢＡＩ２遺伝子のみならず、そのスプライシングバリアントもうつ病に関与すると考える。
ｐｈ０１２０７発現細胞株を用いた細胞内カルシウム濃度変化測定系により、リガンドに対するｐｈ０１２０７遺伝子産物の応答を阻害する化合物の同定を行った。
ｐｈ０１２０７発現細胞株は、次のように構築した。まず、実施例１で同定したｐｈ０１２０７ ｃＤＮＡクローンとｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）との間でＡｓｐ７１８Ｉ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社製）およびＮｏｔＩ（ＴＡＫＡＲＡ社製）による組換えを行い、エピトープタグを含まないｐｈ０１２０７発現ベクターを構築した。ｐｈ０１２０７発現ベクターを宿主細胞であるＣＨＯ−Ｋ１株にリポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてトランスフェクションし、Ｇ４１８を含む選択培地により安定発現株の選抜を行った。細胞における導入遺伝子の発現の検出は、抗ｐｈ０１２０７抗体を用いてＦＣＭ解析により行った。
その結果、ｐｈ０１２０７を安定発現する複数の細胞株が得られた。その中の１クローンであるｐｈ０１２０７＃３Ｆ８−１７株を用いて化合物の同定を実施した。
リガンドは、ＣＣＫ−８Ｓ（ペプチド研究所製）を用いた。ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）は、０．５２ｍｇを４．５ｍＬの１％ ＮａＨＣＯ３（Ｗａｋｏ社製）で溶解し、０．１ｍＭ濃度の溶液を調製した。被検化合物として、化合物ライブラリーであるソフトフォーカス ジーピーシーアール ターゲットダイレクティッド ライブラリー（ＳｏｆｔＦｏｃｕｓ ＧＰＣＲ Ｔａｒｇｅｔ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｌｉｂｒａｒｙ、ＢｉｏＦｏｃｕｓ社製）を用いた。化合物はいずれも、２ｍｇ／ｍＬ ＤＭＳＯ溶液をＰＢＳで２５倍希釈し、８０μｇ／ｍＬの濃度に調製して用いた。
化合物の同定は、具体的には以下のように行った。ｐｈ０１２０７＃３Ｆ８−１７株を、９６ウエルプレート（壁面が黒色で底面が透明なもの）に、細胞数３×１０４／１００μＬ ｍｅｄｉｕｍ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃にて５％ＣＯ２存在下で培養した。培地（ｍｅｄｉｕｍ）は、１０％ 牛胎仔血清（Ｍｏｒｅｇａｔｅ社製）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ社製）を用いた。翌日、各ウエルに、６×ローディングバッファー（Ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）を２０μＬずつ添加して３７℃で１時間反応させ、ローディングバッファー中に含まれる蛍光色素を細胞内に取り込ませた。６×ローディングバッファーは、ＦＬＩＰＲカルシウム３ アッセイキット（ＦＬＩＰＲ Ｃａｌｃｉｕｍ ３ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製）のコンポーネントＡをコンポーネントＢで溶解後、プロベネシド（ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ、Ｓｉｇｍａ社製）を終濃度１５ｍＭとなるように加えて調製した。反応後、ＣＣＫ−８Ｓ（ペプチド研究所製）および化合物を添加して、蛍光強度の経時変化をウエル毎に８０秒間測定した。コントロールとして、化合物の代わりにバッファーを用いて同様の測定を行った。測定開始１５秒後に化合物を終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように添加するかまたはバッファーを添加し、化合物またはバッファーの添加３５秒後にＣＣＫ−８Ｓを終濃度１０ｎＭとなるように添加した。蛍光強度の経時変化の測定は、フレックスステーション（ＦＬＥＸｓｔａｔｉｏｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製）を用いて行った。
試験した化合物のうちいくつかの化合物がｐｈ０１２０７＃３Ｆ８−１７株のＣＣＫ−８Ｓに対する応答を阻害した。代表例として、３つの化合物（化合物Ａ、化合物Ｂおよび化合物Ｃ）をそれぞれ添加したときの、ｐｈ０１２０７＃３Ｆ８−１７株のＣＣＫ−８Ｓに対する応答を図１１−Ａ、図１１−Ｂおよび図１１−Ｃに示す。化合物Ａ、化合物Ｂおよび化合物Ｃはそれぞれ上記式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）で表される化合物である。
測定開始１５秒後に化合物Ａを添加したときもバッファーを添加したときも蛍光強度の変化はなかった。化合物Ａまたはバッファー添加の３５秒後にリガンドであるＣＣＫ−８Ｓを添加したとき、バッファーを添加したウェルでは蛍光強度が上がり、リガンドに対するｐｈ０１２０７＃３Ｆ８−１７株の応答が観察されたが、化合物Ａを添加したウェルではこのような応答が阻害された（図１１−Ａ）。このことは、化合物Ａが、ＣＣＫ−８Ｓとｐｈ０１２０７の相互作用に対するアンタゴニストとして作用していることを示唆する。
化合物Ｂおよび化合物Ｃはいずれも、化合物Ａと同様に、リガンドに対するｐｈ０１２０７＃３Ｆ８−１７株の応答を阻害した（図１１−Ｂおよび図１１−Ｃ）。このことは、化合物Ｂおよび化合物Ｃがいずれも、ＣＣＫ−８Ｓとｐｈ０１２０７の相互作用に対するアンタゴニストとして作用していることを示唆する。
上記結果より、ｐｈ０１２０７発現細胞株を用いた細胞内カルシウム濃度変化測定系により、ｐｈ０１２０７のそのリガンド、例えばＣＣＫ−８Ｓに対する応答を阻害するアンタゴニストを同定できると考える。
本発明により、ＧＰＣＲと考えられる７回膜貫通ドメインを有する機能的膜蛋白質受容体として作用する蛋白質および該蛋白質をコードするＤＮＡを提供できる。本蛋白質は、細胞で発現させたときに細胞膜上に発現され、リガンド刺激により細胞内情報伝達を活性化し、細胞応答を惹き起こす。
本発明により、本蛋白質が関与する情報伝達経路および細胞機能の解明とその調節を実施できる。本発明によりまた、本蛋白質および／またはＤＮＡの異常に起因する疾患、例えばうつ病の防止および／または治療の実施が可能になる。
このように、本発明は基礎科学分野から医薬開発分野まで広く寄与する有用なものである。
配列番号１：新規機能的膜蛋白質受容体をコードするＤＮＡ。
配列番号２：配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質。
配列番号２：（２９７）：（３５０）ＴＳＰ−Ｉドメイン。
配列番号２：（３５２）：（４０５）ＴＳＰ−Ｉドメイン。
配列番号２：（４０８）：（４６１）ＴＳＰ−Ｉドメイン。
配列番号２：（８７０）：（８９０）膜貫通ドメイン。
配列番号２：（８９９）：（９１９）膜貫通ドメイン。
配列番号２：（９２８）：（９４８）膜貫通ドメイン。
配列番号２：（９７０）：（９９０）膜貫通ドメイン。
配列番号２：（１０１２）：（１０３２）膜貫通ドメイン。
配列番号２：（１０８７）：（１１０７）膜貫通ドメイン。
配列番号２：（１１１４）：（１１３４）膜貫通ドメイン。
配列番号３：配列番号２に記載のアミノ酸配列で表されるペプチド、ｈＢＡＩ１、およびｈＢＡＩ２のそれぞれのＣ末端側領域に存在する部分アミノ酸配列。
配列番号４：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号５：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号６：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号７：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号８：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号９：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１０：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１１：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１２：合成オリゴヌクレオチド。
配列番号１３：合成オリゴヌクレオチド。
配列番号１４：ＣＣＫ−８Ｓ
配列番号１４：（２）：（２）硫酸化。
配列番号１５：配列番号１に記載のＤＮＡのスプライシングバリアント。
配列番号１６：配列番号１５に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質。
配列番号１６：（２９７）：（３５０）ＴＳＰ−Ｉドメイン。
配列番号１６：（３５３）：（４０６）ＴＳＰ−Ｉドメイン。
配列番号１６：（８１５）：（８３５）膜貫通ドメイン。
配列番号１６：（８４４）：（８６４）膜貫通ドメイン。
配列番号１６：（８７３）：（８９３）膜貫通ドメイン。
配列番号１６：（９１５）：（９３５）膜貫通ドメイン。
配列番号１６：（９５７）：（９７７）膜貫通ドメイン。
配列番号１６：（１０３２）：（１０５２）膜貫通ドメイン。
配列番号１６：（１０５９）：（１０７９）膜貫通ドメイン。
配列番号１７：配列番号１に記載のＤＮＡのスプライシングバリアント。
配列番号１８：配列番号１７に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質。
配列番号１８：（２９７）：（３５０）ＴＳＰ−Ｉドメイン。
配列番号１８：（３５２）：（４０５）ＴＳＰ−Ｉドメイン。
配列番号１８：（４０８）：（４６１）ＴＳＰ−Ｉドメイン。
配列番号１８：（８７０）：（８９０）膜貫通ドメイン。
配列番号１８：（８９９）：（９１９）膜貫通ドメイン。
配列番号１８：（９２８）：（９４８）膜貫通ドメイン。
配列番号１８：（９７０）：（９９０）膜貫通ドメイン。
配列番号１８：（１０１２）：（１０３２）膜貫通ドメイン。
配列番号１８：（１０８７）：（１１０７）膜貫通ドメイン。
配列番号１８：（１１１４）：（１１３４）膜貫通ドメイン。
配列番号１９：配列番号１に記載のＤＮＡのスプライシングバリアント。
配列番号２０：配列番号１９に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質。
配列番号２０：（２９７）：（３５０）ＴＳＰ−Ｉドメイン。
配列番号２０：（３５２）：（４０５）ＴＳＰ−Ｉドメイン。
配列番号２０：（４０７）：（４６０）ＴＳＰ−Ｉドメイン。
配列番号２０：（４６３）：（５１６）ＴＳＰ−Ｉドメイン。
配列番号２０：（９２５）：（９４５）膜貫通ドメイン。
配列番号２０：（９５４）：（９７４）膜貫通ドメイン。
配列番号２０：（９８３）：（１００３）膜貫通ドメイン。
配列番号２０：（１０２５）：（１０４５）膜貫通ドメイン。
配列番号２０：（１０６７）：（１０８７）膜貫通ドメイン。
配列番号２０：（１１４２）：（１１６２）膜貫通ドメイン。
配列番号２０：（１１６９）：（１１８９）膜貫通ドメイン。
配列番号２１：ｈＢＡＩ２をコードするＤＮＡであり、配列番号１に記載のＤＮＡのスプライシングバリアント。
配列番号２２：配列番号２１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質。
配列番号２２：（２９７）：（３５０）ＴＳＰ−Ｉドメイン。
配列番号２２：（３５２）：（４０５）ＴＳＰ−Ｉドメイン。
配列番号２２：（４０７）：（４６０）ＴＳＰ−Ｉドメイン。
配列番号２２：（４６３）：（５１６）ＴＳＰ−Ｉドメイン。
配列番号２２：（９２５）：（９４５）膜貫通ドメイン。
配列番号２２：（９５４）：（９７４）膜貫通ドメイン。
配列番号２２：（９８３）：（１００３）膜貫通ドメイン。
配列番号２２：（１０２５）：（１０４５）膜貫通ドメイン。
配列番号２２：（１０６７）：（１０８７）膜貫通ドメイン。
配列番号２２：（１１４２）：（１１６２）膜貫通ドメイン。
配列番号２２：（１１６９）：（１１８９）膜貫通ドメイン。
配列番号２３：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号２４：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。

Claims (21)

  1. 配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質またはそのホモログ蛋白質のアンタゴニストである抗うつ作用を有する化合物の同定方法であって、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡまたはそのホモログＤＮＡ、該ＤＮＡによりコードされる蛋白質および該ＤＮＡを含む細胞からなる群から選択される少なくともいずれか１を用いることを特徴とする同定方法。
  2. 配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質と該蛋白質のスプライシングバリアントとからなる群から選ばれるいずれか１の蛋白質のアンタゴニストである抗うつ作用を有する化合物の同定方法であって、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡおよびそのスプライシングバリアントであるＤＮＡのうちいずれか１の塩基配列で表されるＤＮＡ、該ＤＮＡによりコードされる蛋白質および該ＤＮＡを含む細胞からなる群から選択される少なくともいずれか１を用いることを特徴とする同定方法。
  3. 配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質と該蛋白質のスプライシングバリアントとからなる群から選択されるいずれか１の蛋白質のアンタゴニストである抗うつ作用を有する化合物の同定方法であって、配列表の配列番号１、１５、１７、１９および２１に記載の塩基配列のうちいずれか１の塩基配列で表されるＤＮＡを含む細胞と被検化合物とを接触させ、該細胞の細胞膜上に発現された該ＤＮＡによりコードされる蛋白質の機能を測定し、該細胞を被検化合物を接触させないときと比較して該蛋白質の機能を低下または消失させる被検化合物を抗うつ作用を有する化合物であると決定することを含む同定方法。
  4. 細胞の細胞膜上に発現されたＤＮＡによりコードされる蛋白質の機能が、該蛋白質のリガンドの添加により細胞内カルシウム濃度の上昇を惹き起こす機能である、請求項３に記載の同定方法。
  5. 細胞の細胞膜上に発現されたＤＮＡによりコードされる蛋白質の機能が、該蛋白質のリガンドの添加により膜電位変化を惹き起こす機能である、請求項３に記載の同定方法。
  6. 下記の群；
    （ｉ）コレシストキニンオクタペプチド硫酸化型（ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ ｏｃｔａｐｅｐｔｉｄｅ ｓｕｌｆａｔｅｄ ｆｏｒｍ；配列番号１４、以下、ＣＣＫ−８Ｓと略称する）、
    （ｉｉ）ＣＣＫ−８Ｓのアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などの変異を有し、かつＣＣＫ−８Ｓと同質の機能を有するペプチド、
    および
    （ｉｉｉ）前記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のペプチドのアミノ酸配列を含み、かつＣＣＫ−８Ｓと同質の機能を有するペプチド、
    より選択されるペプチドをリガンドとして用いる、請求項４または５に記載の同定方法。
  7. 配列表の配列番号１５に記載の塩基配列で表されるＤＮＡまたはその相補鎖。
  8. 配列表の配列番号１７に記載の塩基配列で表されるＤＮＡまたはその相補鎖。
  9. 請求項７または８に記載のＤＮＡまたはその相補鎖を含有する組換えベクター。
  10. 請求項９に記載の組換えベクターを導入されてなる形質転換体。
  11. 請求項７に記載のＤＮＡによりコードされる蛋白質。
  12. 配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質。
  13. 請求項８に記載のＤＮＡによりコードされる蛋白質。
  14. 配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質。
  15. 請求項７または８に記載のＤＮＡを含有する発現組換えベクターを導入されてなる形質転換体を培養する工程を含む、請求項１１から１４のいずれか１項に記載の蛋白質の製造方法。
  16. 配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡのスプライシングバリアント、該ＤＮＡおよび該ＤＮＡのスプライシングバリアントから選択されるいずれか１のＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターを導入されてなる形質転換体、該ＤＮＡによりコードされる蛋白質、および該蛋白質を認識する抗体のうち、少なくともいずれか１つを含有してなる試薬キット。
  17. 配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡのスプライシングバリアントが、配列表の配列番号１、１５および１７に記載の塩基配列のうちいずれか１の塩基配列で表されるＤＮＡであり、該ＤＮＡによりコードされる蛋白質が配列表の配列番号２、１６および１８に記載のアミノ酸配列のうちいずれか１のアミノ酸配列で表される蛋白質である請求項１６に記載の試薬キット。
  18. 配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質と該蛋白質のスプライシングバリアントとからなる群から選択されるいずれか１の蛋白質の機能および／または発現を阻害することを手段とする抑うつ状態の改善方法。
  19. 請求項１８に記載の抑うつ状態の改善方法を用いるうつ病の防止および／または治療方法。
  20. 配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡのスプライシングバリアントから選ばれる少なくともいずれか１のＤＮＡ、および／または、該ＤＮＡによりコードされる蛋白質をマーカーとして定量的または定性的に分析することを含んでなる、うつ病の診断に使用するための測定方法。
  21. 配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡのスプライシングバリアントから選ばれる少なくともいずれか１のＤＮＡ、および／または、該ＤＮＡによりコードされる蛋白質をマーカーとして定量的または定性的に分析することを含んでなるうつ病の診断方法。
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