KR101413590B1 - ＮＦＡＴ５／ＴｏｎＥＢＰ 활성화를 위하여 유효성분으로 ＴＡＺ 티로신 인산화의 억제제를 함유하는 신장 장애의 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 TAZ 티로신 인산화 억제제를 유효성분으로 함유하는 삼투 스트레스로 유발된 신장 장애의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 TAZ가 NFAT5/TonEBP의 활성을 저해하고, c-Abl 활성이 TAZ 및 NFAT5/TonEBP의 상호작용에 필요하며, 인산화된 TAZ가 NFAT5/TonEBP의 결합활성을 저해하고, 생체 내(in vivo)에서 탈수로 유래된 고장성 조건에서 TAZ의 억제가 고장성 자극의 영향을 완화시키기 위한 표적 유전자 발현 및 NFAT5/TonEBP의 활성을 극대화하는 것을 확인하였으므로, TAZ 티로신 인산화 억제제는 삼투 스트레스로 유발된 신장 장애의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ＮＦＡＴ５／ＴｏｎＥＢＰ 활성화를 위하여 유효성분으로 ＴＡＺ 티로신 인산화의 억제제를 함유하는 신장 장애의 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical compositions containing inhibitors of TAZ tyrosine phosphorylation as active ingredient for NFAT5/TonEBP activation for prevention and treatment of kidney disorder}

본 발명은 NFAT5/TonEBP 활성화를 위하여 유효성분으로 TAZ 티로신 인산화의 억제제를 함유하는 신장 장애의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

TAZ(Transcriptional Coactivator with PDZ-binding motif)단백질은 WW 도메인(domain)을 포함하는 WWTR1(WW domain containing transcription regulator 1, Wwtr1)이며, 전사조절 보조인자이다. 14-3-3 펩티드와 결합된 상태로 세포의 세포질에 위치해 있다가 외부 자극에 의하여 14-3-3 펩티드와 결합이 억제되면서 세포핵으로의 이동이 일어난다(Hong JH et al, Cell Cycle 5: 176-179, 2006; Kanai F et al, EMBO J 19: 6778-6791, 2000). 세포핵으로 이동한 TAZ 단백질은 단백질 구조적 특성을 통해 다양한 전사인자 단백질과 결합하고, 전사인자의 활성을 조절한다.

TAZ는 TTF-1와 결합을 통해 표면 활성 물질 C의 발현에 영향을 주며 단백질 분해 조절을 통하여 폐포의 온전한 상태에 필수적인 다른 표면 활성 물질 또는 인자의 수준을 조절하는 것으로 알려져 있다(Park KS et al., J Biol Chem 279: 17384-17390, 2004; Tian Y et al., MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, Y Sept. 2007, p. 6383-6395). 또한, TAZ 단백질은 임신 중반 마우스 배아(midgestation mouse embryo)에서 TAZ는 주로 축옆의 중배엽(paraxial mesoderm), 지아(limb bud), 및 신경관(neural tube)에서 발현된다(Murakami M et al., Biochem Biophys Res Commun 339: 533-539, 2006). 이러한 결과들은, TAZ 단백질이 다양한 조직 및 장기에 걸쳐 넓게 발현 분포하고, 성장 및 질병과 연관된 전사 인자의 활성을 조절하는데 매우 중요한 것을 제시한다. 그 외에도 TAZ 결합 단백질은 많이 규명되어 세포 증식 조절, 암 발생 등에 관련되었다고 알려져 있으나 생체 내(in vivo) 결과는 구체적으로 증명되어 있지 않다.

한편, TAZ 유전자를 제거한 마우스의 제작은 TAZ 기능의 생체 내에서의 역할을 잘 규명해 주는 중요한 모델이다. TAZ 넉아웃 마우스(TAZ knockout mouse)의 자손은 어린 나이에 대부분 사망하는 특징을 보인다. TAZ 넉아웃 마우스 자손의 조직 분석 결과, 폐에서의 심각한 섬유화(Lung emphysema)와 신장조직에서의 낭포형성(Glomerulocytic cystic kidney)을 보였다(Hossain, Z et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:1631-1636. 2008; Makita R et al., Am J Physiol Renal Physiol 294: F542-F553, 2008).

장력(tonicity)은 두 구획 사이의 삼투질 농도의 차이를 의미한다. 두 구획 사이에서 삼투질(osmolyte) 농도가 높은 쪽을 고장성이라 하고, 삼투질 농도가 낮은 쪽을 저장성이라 하며, 용매가 고장성에서 저장성으로 이동하여 두 구획이 평형이 된다. 상기 삼투질 농도는 삼투압 농도(osmolarity)로 환산된다. 염분과 요소(urea)의 높은 농도로 인하여, 포유동물 신장 수질의 삼투압 농도는 종종 혈액 삼투압 농도의 10 배 또는 그 이상으로 매우 높다. 끊임없이 반복되는 고장성(hypertonicity)은 세포를 줄어들게 하고, 물의 삼투 유출(osmotic efflux) 때문에 세포는 스트레스를 받게 된다. 또한, 고삼투압 농도는 이중나선 DNA 절단(double-stranded DNA break)(Ku¨ ltz, D., and Chakravarty, D.(2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98,1999-2004) 및 세포 죽음(Michea, L. et al, (2000) Am. J. Physiol. Renal Physiol. 278, F209-F218)의 원인이 되는 과도한 스트레스를 세포에 부과한다. 따라서, 상피의 수송 및 세포 부피를 유지하는 조절 메커니즘(mechanism)을 필요로 한다(Sun, A et al., Kidney International 36(5), 831-842.1989; Natke Jr., E., Renal, Fluid and Electrolyte Physiology F1657-F1665(6), 258. 1990).

신장의 장력 변화는 알도즈 리덕타제(aldose reductase)(Ko, B.C. et al., J. Biol. Chem.272:16431-16437, 1997), 베타인/GABA 수송체(betaine/GABA transporter, BGT)(Miyakawa, H et al. 1998. Am. J. Physiol. 274:F753-F761), 타우린 수송체(taurine transporter, TauT)(Ito, T et al. 2004. Biochem. J. 382:177-182), HSP-70(Woo, S.K et al, Mol. Cell. Biol. 22:5753-5760), 나트륨/미오-이노시톨 공동수송체(sodium/myo-inositol cotransporter, SMIT)(Rim, J.S et al. 1998. J. Biol. Chem. 273:20615-20621), 요소 수송체(urea transporter)(Nakayama, Y et al, J. Biol. Chem. 275:38275-38280) 및 아쿠아포린(aquaporin, AQP)(Hasler, U et al., 2006. J. Am. Soc. Nephrol. 17:1521-1531)을 포함하는, 다양한 유전자의 발현을 조절하는 것으로 밝혀졌다. 각각의 경우에, 유전자 발현의 증가는 TonE(TGGAAANNNCN, 여기서 N은 표적 유전자의 프로모터(promoter)에 위치한 임의의 뉴클레오티드이다)을 통해 조절되는 것이 확인된 바 있다(Miyakawa, H et al, Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96:2538-2542).

TonE-결합 단백질(tonicity-responsive enhancer binding protein, NFAT5/TonEBP)은 NFAT(Nuclear factor of activated T cells 5)라고도 불리며 표적 유전자 프로모터에서 이것의 인식 성분을 효율적으로 둘러싸는, TonE에 관련된 이합체(dimer) 단백질이다(Stroud, J.C et al, 2002. Nat. Struct. Biol. 9:90-94). NFAT5/TonEBP는 유기적 삼투질(organic osmolyte)을 위한 합성 효소와 막 수송체(membrane transporter)의 전사를 자극하고, 유기적 삼투질의 세포 축적을 촉진한다(S.K. Woo et al, Int. Rev.Cytol. 215(2002) 189-202). 유기적 삼투질은 세포 부피 및 세포 내 이온 세기(ionic strength)에서 고장성이 유래된 변화를 정상화한다. 또한, NFAT5/TonEBP는 높은 요소의 유해한 영향으로부터 신장 수질 세포를 보호하는 HSP70(Woo, S.K et al, 2002. Mol. Cell. Biol. 22:5753-5760)의 발현을 자극한다(W. Neuhofer et al, J. Am. Soc. Nephrol. 12(2001) 2565-2571). 따라서, NFAT5/TonEBP은 고장성 신장(hyperosmotic kidney)에서 많은 경로의 중요한 조절자이다.

한편, NFAT5/TonEBP는 이방향성으로(bi-directionally) 조절된다. 즉, 저장성에 의해 저발현(down-regulated) 및 활성이 억제되고, 고장성에 의해 고발현(up-regulated) 및 활성화된다(S.K. Woo, et al, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 278(2000) F1006-F1012). 고장성에 반응하여 NFAT5/TonEBP는 인산화, 핵으로의 이동(nuclear localization), 전사활성의 증가를 나타낸다(S.C. Dahl, J.S. Handler, H.M. Kwon, Am. J. Physiol. Cell Physiol. 280(2001) C248-C253; J.D. Ferraris, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(2002) 739-744). 등장성의 상태에서, NFAT5/TonEBP는 핵과 세포질 모두에서 분포하지만, 생체 내에서의 절수(Cha, J.H., et al. 2001. J. Am. Soc. Nephrol. 12:2221-2230) 또는 시험관 내에서의 고장성 환경(S.C. Dahl, J.S. Handler, H.M. Kwon, , Am. J. Physiol. Cell Physiol. 280(2001) C248-C253; Zhang, Z., et al. 2005. Am. J. Physiol.Renal Physiol. 289:F506-F511)에 노출됨에 따라, NFAT5/TonEBP는 핵으로 이동한다. 기존에, 단백질 키나아제(protein kinase A, PKA), ATM(ataxia telangiectasia mutated), 포스파티딜이노시톨 3-키나아제 클래스 IA( phosphatidylinositol 3- kinase class IA, PI3K-IA), Fyn 및 p38를 포함하는 다수의 키나아제(kinase)가 높은 NaCl로 유래된 NFAT5/TonEBP의 활성과 관계가 있는 것이 확인된 바 있다(Burg, M. B., Ferraris, J. D., and Dmitrieva, N. I.(2007), Physiol. Rev. 87, 1441-1474). 또한, 고농도의 NaCl로 유도된 c-Abl 키나아제는 NFAT5/TonEBP 핵으로의 이동, 전사 활성 촉진을 유도하며, TonEBP-Y143를 인산화시킨다. 상기와 같이, TAZ의 생체내 역할과 NFAT5/TonEBP의 고장성 조건에서의 기능 등이 각각 밝혀진 바 있으나, 고장성 조건에서 TAZ의 티로신 인산화와 이에 따른 NFAT5/TonEBP의 활성 억제에 대해서는 연구된 바 없다.

이에, 본 발명자들은 고장성 조건에서, TAZ의 활성 변화와 NFAT5/TonEBP와의 상호작용 연구를 통해 TAZ의 신장에서 역할에 대해 연구한 결과, 고장성 조건에서 TAZ가 티로신 인산화 변형을 거쳐 NFAT5/TonEBP와 직접적으로 그리고 특이적으로 결합하여 NFAT5/TonEBP의 활성을 억제조절함을 확인하였다. 따라서, 고장성 삼투압 스트레스 조건하에서 발생하는 신장 기능 장애로부터 회복을 위하여, TAZ 티로신 인산화를 억제를 통한 NFAT5/TonEBP의 활성의 최적화가 가능할 것으로 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 TAZ 티로신 인산화 억제제를 함유하는 삼투압 농도에 의한 스트레스(osmolarity stress) 조절 이상으로 기인한 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 TAZ를 이용하여 삼투압 농도에 의한 스트레스 조절 이상으로 기인한 질환에 대한 발병기전을 제시함으로써 질병의 예방 또는 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TAZ 티로신 인산화 억제제를 함유하는 삼투 스트레스로 유발된 신장 장애의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 TAZ 티로신 인산화 억제제를 함유하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신장 조직 내 삼투압 농도에 의한 스트레스의 억제 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) TAZ 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 세포주에서 TAZ 단백질의 티로신 인산화 수준을 측정하는 단계; 및

3) 상기 TAZ 단백질의 티로신 인산화 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 삼투 스트레스로 유발된 신장 장애의 예방 및 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은

1) TAZ 및 TonEBP 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 단계 1)의 세포주에서 TAZ 및 TonEBP의 결합 활성을 측정하는 단계; 및

3) 단계 2)의 TAZ 및 TonEBP 결합 활성 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 삼투 스트레스 유발 신장애의 예방 및 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에서는 TAZ가 NFAT5/TonEBP의 활성을 저해하고, c-Abl 활성이 TAZ 및 NFAT5/TonEBP의 상호작용에 필요하며, 인산화된 TAZ가 NFAT5/TonEBP의 결합활성을 저해하고, 생체 내(in vivo)에서 탈수로 유래된 고장성 조건에서 TAZ의 억제가 고장성 자극의 영향을 완화시키기 위한 표적 유전자 발현 및 NFAT5/TonEBP의 활성을 극대화하는 것을 확인함으로써, TAZ 티로신 인산화 억제제는 삼투 스트레스로 유발된 신장 장애, 즉, 신질환, 신기능장애 및 신부전으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 고장성 조건에서 TAZ의 핵 위치 향상에 관한 도이다.
도 1A는 Cos7 세포는 GFP-TAZ 벡터로 일시적으로 형질전환하고, 4시간 동안 다른 농도의 NaCl에 노출한 후에, 세포를 DAPI로 염색하고, 공초점현미경으로 측정한 결과이다.
도 1B는 Cos7 세포안의 GFP-TAZ의 세포 이하의 위치는 현미경으로 정량한 결과이다.
도 1C는 mIMCD-3 세포를 4 시간 동안 다른 조건에서 배양하고, TAZ 면역염색하고, 그 후에 팔로이딘 및 DAPI 염색한 결과이다. 스케일 바(Scale bars) : 50 μm
도 1D는 장력 스트레스에 의해 자극된 mIMCD-3 세포로부터 핵(nuc) 및 세포질(cyto) 단백질을 분획한 후에, 단백질을 SDS-PAGE로 분석하고, TAZ, OCT1 및 액틴(actin)에 대한 항체와 함께 면역블랏한 결과이다.
도 2는 고장성에 의해 유도된 c-Abl 활성화에 의한 TAZ의 티로신 인산화에 관한 도이다.
도 2A는 mIMCD-3 세포를 4시간 동안 300 및 400 mOsm에 노출시키고, 전체 세포 추출물(Whole cell extracts, WCE)를 항-TAZ 항체로 면역침강하고, 면역 복합체를 포스포티로신(phosphotyrosine)(pY; 4G10), 포스포세린(phosphoserine) TAZ(pS; pS89) 및 TAZ에 대한 항체와 함께 면역블랏한 결과이다.
도 2B는 안정한 mIMCD-3 세포(mock/IMCD 및 Flag-TAZ/IMCD)를 저장성, 등장성 및 고장성에서 4시간 동안 자극하고, TAZ 면역 복합체를 4G10 및 항-TAZ 항체로 면역블랏하여 분석한 결과이다.
도 2C는 WCE를 인산화된 c-Abl(pAbl), c-Abl 및 액틴에 대한 항체로 면역블랏하여 분석한 결과이다.
도 2D는 Flag를 붙인 TAZ를 293T 세포에서 과발현시키고, Flag-M2 아가로스 비드(agarose beads)를 이용하여 침강시킨 후, 상기 활성 혼합물을 SDS-PAGE 및 방사선촬영으로 분석하고, 별도로, TAZ 수준을 면역블랏으로 분석한 결과이다.
도 2E는 293T 세포를 c-Abl 발현 벡터가 있거나 없는 Flag-TAZ로 형질전환하고, TAZ 면역 복합체 및 WCE를 SDS-PAGE로 분석하고, 4G10, TAZ 및 c-Abl 항체로 면역블랏한 결과이다.
도 2F는 293T 세포를 Flag-TAZ 및 c-Abl 발현 벡터로 형질전환시키고, 제니스테인(genistein)(GNS; 50 μM) 또는 STI-571(STI; 10 μM)의 존재하에 1시간 동안 배양한 후에 TAZ 면역 복합체를 4G10 및 TAZ 항체로 면역블랏하여 분석한 결과이다.
도 2G는 mIMCD-3 세포를 STI-571(STI; 10 μM) 가 있거나 없는 고장성으로 자극하고, TAZ 면역 복합체를 4G10 및 항-TAZ 항체로 별도로 분석한 결과이다.
도 3은 c-Abl로 유도한 TAZ의 티로신 316에서의 인산화를 나타낸 도이다.
도 3A는 293T 세포를 Flag-TAZ 및 c-Abl 발현 벡터로 형질전환하고, TAZ 면역 복합체를 SDS-PAGE로 분석하고, 4G10 및 pY116, pY141, pY300, pY316 TAZ, 또는 TAZ에 대한 항체와 면역블랏한 결과이다.
도 3B는 모(Parental) mIMCD-3 세포를 고장성의 배지에 4시간 동안 배양하고, 내생적 TAZ 단백질을 면역침강하고, pY316 TAZ 또는 TAZ 항체로 면역블랏한 결과이다.
도 3C는 293T 세포를 WT TAZ 및 c-Abl 발현 벡터가 있거나 없는 Y316F TAZ로 형질전환시키고, 면역 복합체를 분석하고, 4G10, pY316 TAZ, 및 TAZ 항체로 면역블랏한 결과이다.
도 3D는 mIMCD3 세포를 TAZ 발현 벡터로 안정하게 형질전환시키고, 안정한 세포를 퓨로마이신(puromycin)이 있는 데서 선별하고, 상기 세포들을 4 시간 동안 고장성 환경하에서 배양하고, 그 후에 면역침강 및 면역블랏 분석한 결과이다.
도 4는 인산화된 TAZ 및 NFAT5/TonEBP 사이의 물리적 상호작용에 관한 도이다. 도 4A 내지 4C는 293T 세포를 각 패널에 기재한 바와 같이 c-Abl, Myc-tagged WT 또는 돌연변이형(Y143F; MT) NFAT5/TonEBP 및 Flag를 붙인 TAZ WT 또는 돌연변이형 Y316F로 형질전환시킨 결과이다.
도 4A는 NFAT5/TonEBP 면역 복합체를 항-Myc 항체를 이용한 배양으로 침강시키고, SDS-PAGE로 분석하고, 면역블랏한 결과이다.
도 4B는 세포를 형질전환하고, 수확 전 1시간 동안 STI-571(10 μM)를 처리하고, TAZ 면역 복합체 및 WCE는 Myc, pY316, 및 TAZ에 대한 항체로 블랏한 결과이다.
도 4C는 TAZ 면역 복합체 및 WCE는 Myc 및 Flag 항체로 면역블랏한 결과이다.
도 4D는 mIMCD-3 세포를 4 시간 동안 다른 장력으로 자극하고, 내생적 TAZ 면역 복합체는 TAZ 항체로 침강하고, 그 후에 SDS-PAGE 하고, NFAT5/TonEBP 및 pY316 항체로 면역블랏한 결과이다.
도 4E는 장력으로 자극된 mIMCD3 세포를 고정하고, TAZ 및 NFAT5/TonEBP 항체와 배양하고, Duolink in situ PLA kit를 이용하여 특이적 2차 항체와 PLA 탐침(probe)과 함께 배양한 후에 시료를 공초점 현미경하에서 관찰한 결과이다.
도 5는 TAZ에 의한 NFAT5/TonEBP의 억제에 관한 도이다.
도 5A는 293T 세포를 NFAT5/TonEBP 및 다른 양의 TAZ 발현벡터와 함께 NFAT5/TonEBP에 대응하는 루시퍼라제 리포터 유전자(pTonE-luc)로 형질전환시키고, pCMVβ 대조군으로 사용하여, NFAT5/TonEBP 및 TAZ 발현은 면역블랏 분석한 결과이다. 루시퍼라제 리포터 유전자 활성을 β-갈락토시다제(β-galactosidase) 활성으로 표준화(nomalization)한 뒤에 산출하였다.
도 5B는 293T 세포를 pTonE-luc 및 pCMVβ 함께 NFAT5/TonEBP 및 TAZ 발현 벡터(WT, Y118F, 또는 Y316F)를 형질전환하고, 리포터 활성을 3개 독립적인 실험으로부터 산출하고 평균으로 표현한 결과이다.
도 5C는 NFAT5/TonEBP를 WT 또는 Y316F TAZ와 함께 293T 세포에 과발현시키고, WCE를 NFAT5/TonEBP에 결합하는 요소를 포함하는 비오틴이 붙은 2중 가닥 DNA으로 1시간 동안 배양하고, 연이어 부가적인 2 시간 동안 스트렙타아비딘-아가로스 비드(streptavidin-agarose beads)를 배양한 후, SDS-PAGE 및 면역블랏한 결과이다. DNA가 결합된 복합체 및 WCE는 NFAT5/TonEBP 및 TAZ 항체로 분석하였다. *, P < 0.05; **, P < 0.005.
도 6은 NFAT5/TonEBP를 유도하는 유전자 발현에서 TAZ의 저해 효과에 관한 도이다.
도 6A는 TAZ 안정한 형질전환체(TAZ) 및 대조군(CON)세포는 다른 장력 조건에서 4시간 동안 배양하고, TAZ 및 NFAT5/TonEBP의 발현을 면역블랏으로 확인한 결과이다.
도 6B는 TAZ 안정한 형질전환체(TAZ) 및 대조군(CON)세포는 다른 장력 조건에서 4시간 동안 배양하고, BGT1 및 SMIT1 수준을 측정하기 위해 실시간(real-time) PCR한 결과이다. 상대적인 발현 수준을 β-액틴 수준에 대하여 표준화한 후에 계산하였다.
도 6C는 TAZ 넉다운(knockdown)(shTAZ) 및 대조군(shcon)세포를 수립하고, 등장성 및 고장성 조건에서 4 시간 동안 자극한 후에, TAZ, NFAT5/TonEBP, 및 액틴의 단백질 수준을 면역블랏으로 확인한 결과이다.
도 6D는 TAZ 넉다운(knockdown) 및 대조군(shcon)세포를 수립하고, 등장성 및 고장성 조건에서 4 시간 동안 자극한 후에, 상대적인 BGT1 및 SMIT의 mRNA 수준을 실시간-PCR로 확인한 결과이다.
도 6E는 TAZ 넉다운(knockdown) 및 대조군(shcon)세포를 수립하고, 등장성 및 고장성 조건에서 4 시간 동안 자극한 후에, 24시간 동안 xCELLigence system를 이용하여 관측한 결과이다;
*, P < 0.05; **, P < 0.005.
도 7은 TAZ KO 세포에서, 회복된 TAZ에 의해 NFAT5/TonEBP 활성을 재억제시키지만, Y316F는 NFAT5/TonEBP 활성을 재억제시키지 못하는 것을 확인한 도이다.
도 7A는 TAZ 발현을 면역블랏에 의해 WT 및 KO MEF 세포에서 확인한 도이다.
도 7B는 WT 및 KO MEF 세포를 리포터 유전자(pTonE-luc 및 pCMVβ로 형질전환하고, 다른 장력 조건에서 24시간 동안 처리한 결과이다.
도 7C는 TAZ KO MEF 세포를 WT 또는 리포터 유전자(pTonE-luc 및 pCMVβ와 함께 Y316F TAZ 발현벡터로 형질전환시키고, 그 후에 세포를 등장성 또는 고장성 배지에서 24시간 동안 자극한 후에, 패널 B 및 C의 리포터 활성(RLU)을 β-갈락토시다제 활성으로 표준화한 후에 계산하고, 세개의 독립된 실험의 평균±SEM 으로서 표현한 도이다.
도 7D는 전체 RNA를 WT 및 KO 마이스의 신장에서 분리하고(10-12 주, n = 4), 역전사한 후에 실시간-PCR 분석한 결과이다;
**, P < 0.005; ***, P < 0.0005.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 TAZ(TRANSCRIPTIONAL COACTIVATOR with PDZ-binding motif) 티로신 인산화 억제제를 유효성분으로 함유하는 삼투압 농도에 의한 스트레스(osmolarity stress) 조절 이상으로 기인한 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 삼투압 농도에 의한 스트레스 조절 이상으로 기인한 질환은 신질환, 신기능장애 또는 신부전인 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 TAZ는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

상기 TAZ는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열에서 동일한 활성을 갖는 한, 하나 또는 몇 개의 아미노산이 첨가, 결실, 치환되는 아미노산 서열을 가질 수 있다.

상기 TAZ는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열에 80% 이상의 상동성, 바람직하게 90% 이상의 상동성, 더욱 바람직하게 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열일 수 있다.

상기 TAZ의 티로신 인산화 부위는 TAZ의 316 번째 티로신인 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

상기 TAZ 티로신 인산화 억제제는 NFAT5/TonEBP의 활성을 증가시키는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

상기 TAZ 티로신 인산화 억제제는 TAZ 단백질에 상보적으로 결합하는 기질 유사체, 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 갖는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

항체

TAZ에 대한 항체는 TAZ에 특이적이고 직접적으로 결합하여 TAZ의 활성을 효과적으로 억제할 수 있다. 상기 TAZ에 특이적으로 결합하는 항체는 폴리클로날(polyclonal) 항체 또는 모노클로날(monoclonal) 항체를 사용하는 것이 바람직하며, 모노클로날 항체를 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 상기 바이오마커에 특이적으로 결합하는 항체는 당업자에게 알려진 공지의 방법으로 제작하여도 무방하며, 상업적으로 알려진 항체를 구입하여 사용할 수 있다. 상기 항체는 당업자에게 알려진 종래 방법에 따라 면역원인 TAZ 단백질을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근내, 복강내 또는 피하 주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여할 수 있다. 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 형상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하여 항체를 분리할 수 있다.

기질 유사체

TAZ의 결합 도메인을 억제하는 유사체(예: 펩티드 또는 비펩티드성 약제)를 제작하여 TAZ의 활성을 억제할 수 있다. 특히 상기 펩티드 유사체 또는 TAZ의 기질인 작은 펩티드 기질(short peptide substrate: 미합중국 특허 제 7,650,034호)의 단편의 비가수분해형 펩티드 유사체가 사용될 수 있다. 상기 비가수분해성 펩티드 유사체는 β-턴 디펩티드 코어(Nagai et al., Tetrahedron. Lett. 26:647, 1985), 케토-메틸렌 슈도펩티드류(Ewenson et al., J. Med. Chem. 29:295, 1986; Ewenson et al., in Peptides: Structure and Function(Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, IL, 1985), 아제핀(Huffman et al., in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), 벤조디아제핀(Freidinger et al., in Peptides; Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), β-아미노알콜(Gordon et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 126:419 1985) 및 치환 감마 락탐환(Garvey et al., in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshell ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988) 을 사용하여 생성할 수 있다.

본 발명자들은 고장성 자극에 의하여 TAZ의 핵 위치가 변화하는지 확인하였고, 고장성(400 mOsm/kg) 자극은 점차적으로 TAZ의 핵 위치를 증가시켰다(도 1 참조).

고장성으로 유도된 c-Abl 활성화로 인한 TAZ의 티로신 인산화를 확인하고자 하였다. 면역침강된 TAZ 단백질이 무세포 시스템에서 c-Abl에 의해 직접적으로 인산화되는 것을 확인하였다(도 2D 참조). 따라서, 293T 세포안에서 c-Abl와 TAZ의 공동 발현은 TAZ의 티로신 인산화를 증가시켰다(도 2E 참조).

c-Abl 인산화 부위는 TAZ의 티로신 316인 것을 확인하였다. TAZ 인산화 및 활성에서 Y316의 중요성을 조사하고자, 티로신 316을 페닐알라닌(phenylalanine)으로 교체함으로써 돌연변이 TAZ(Y316F)를 구축하였다. c-Abl의 과발현은 야생형(WT) TAZ의 인산화를 증가시켰으나, 4G10 및 pY316 TAZ 항체로 면역블랏함으로써 증명한 바와 같이, Y316F 돌연변이를 인산화하는 것은 실패하였다(도 3C 참조). 추가하여, Flag로 표지된 야생형(WT) TAZ 및 이의 티로신 돌연변이(Y118F, Y141F, Y300F, 및 Y316F)를 발현하는 안정한 mIMCD-3 세포를 수립하였고, 고장성 조건에 노출하였다. 고장성 자극은 WT, Y118F, Y141F 및 Y300F TAZ 단백질을 유도하였으나, 이러한 고장성으로 유도된 인산화는 Y316F 돌연변이에서 손상되었으며(도 3D 참조), 이는 TAZ의 티로신 316이 c-Ab1 인산화 부위인 것을 나타낸다.

고장성이 매개하는 신호 경로에서 인산화된 TAZ의 기능을 확인하고자, TAZ와 고장성 신호 경로의 주요 조절자인 NFAT5/TonEBP 사이의 상호작용을 조사하였다. 공동-면역침강한 후에 면역블랏 분석한 결과, TAZ 및 NFAT5/TonEBP 사이의 물리적 상호작용을 증명하였다(도 4A 참조). mIMCD-3 세포의 핵에서 각각의 TAZ-NFAT5/TonEBP 상호작용을 가시화하기 위하여, 원 위치(in situ) proximity ligation assay(PLA) system를 실시하였다. 그 결과, 등장성 또는 고장성 배지에서 배양된 mIMCD-3 세포의 핵에서 각각의 TAZ-NFAT5/TonEBP 상호작용을 가시화하였지만, 저장성 배지에서는 가시화하지 못하였다(도 4E 참조).

NFAT5/TonEBP 활성에 대한 TAZ-NFAT5/TonEBP 상호작용의 효과를 확인하였다. NFAT5/TonEBP의 전사적 활성을 TAZ가 없는 조건에서, NFAT5/TonEBP에 반응하는 루시퍼라제 리포터 유전자(luciferase reporter gene, pTonE-luc)로 측정하였다. NFAT5/TonEBP의 이소성(Ectopic) 발현은 pTonE-luc의 루시퍼라제 활성을 증가시켰으나, TAZ의 공동발현은 현저히 용량 의존적으로 이러한 활성을 현저히 억제하였다(도 5 참조). 이러한 결과는 TAZ-NFAT5/TonEBP 상호작용이 NFAT5/TonEBP의 DNA 결합 활성을 저해함으로써 NFAT5/TonEBP의 전사적 활성을 억제하는 것을 나타낸다.

TAZ가 NFAT5/TonEBP 활성을 억제하기 때문에, TAZ 과발현 또는 결핍이 내생적 NFAT5/TonEBP 표적 유전자인 BGT1 및 SMIT의 발현에 영향을 주는지 조사하였다. BGT1 및 SMIT의 상대적인 발현은 대조군 세포에서 고장성에 의해 증가하였으나, 고장성으로 자극된 TAZ 안정화 세포에서 현저히 약화되었다(도 6B 참조). 역으로, BGT1 및 SMIT의 발현은 등장성 및 고장성 조건에서 TAZ 발현의 감소에 의해 점차적으로 증가하였다(도 6C 및 6D 참조).

TAZ의 부족에 의한 NFAT5/TonEBP 활성의 증가가 TAZ 회복에 의해 직접적으로 역전될 수 있는 것을 확인하였다. 그 결과, 상기 증가된 TAZ KO 세포에서 pTonE-luc 활성은 WT TAZ의 회복에서 기본적 수준으로 되돌아갔다. 하지만, Y316F TAZ의 도입은 리포터 활성 저해에 다소 효과적이지 않았다(도 7C 참조). 시험관 내에서 TAZ가 신장 세포에서 삼투조절물질 유전자의 발현을 억제하기 때문에, TAZ KO 신장에서 삼투조절물질 유전자의 생체 내 발현 수준을 측정하였다. WT 및 TAZ KO 마이스의 신장 수질에서 SMIT 및 BGT1의 상대적인 발현 수준을 분석하였고, 그 결과, TAZ KO 마이스의 신장에서 심각한 형태학적 결핍에도 불구하고, SMIT 및 BGT1의 발현은 WT 신장에 비해 TAZ KO 신장에서 현저히 증가한 것을 확인하였다(도 7D 참조).

그러므로, 본 발명의 TAZ 티로신 인산화 억제제는 감소된 TAZ의 발현이 고장성 자극의 영향을 완화시키기 위한 표적 유전자의 발현과 NFAT5/TonEBP의 활성을 최적화할 수 있으므로 신질환, 신기능장애 또는 신부전의 예방 및 치료를 위한 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 TAZ 단백질의 티로신 인산화 억제제에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상을 함유할 수 있다.

상기 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

상기 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

상기 조성물의 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 1회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하나 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.

상기 조성물은 실제 임상 투여 시에 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 TAZ 티로신 인산화 억제제를 함유하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 삼투압 농도에 의한 스트레스(osmolarity stress) 조절 이상으로 기인한 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

상기 질환이란 신질환, 신기능장애 및 신부전으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 TAZ 티로신 인산화 억제제는 NFAT5/TonEBP의 활성을 증가시키는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 약학적으로 유효한 양이란 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 이에 한정되는 것은 아니다. 투여량은 특정 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여기간, 투여방법, 제거율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

상기 투여는 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

상기 개체는 인간을 포함한 척추동물이고 바람직하게는 포유동물이며, 그보다 바람직하게는 쥐, 토끼, 기니아피그, 햄스터, 개, 고양이와 같은 실험동물이고, 가장 바람직하게는 침팬지, 고릴라와 같은 유인원류 동물이다.

본 발명의 TAZ 티로신 인산화 억제제는 감소된 TAZ의 발현이 고장성 자극의 영향을 완화시키기 위한 표적 유전자 발현 및 NFAT5/TonEBP의 활성을 극대화할 수 있으므로, 신장 조직 내 삼투압 농도에 의한 스트레스의 억제를 위하여 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 TAZ 티로신 인산화를 이용하여 삼투압 농도에 의한 스트레스(osmolarity stress) 조절 이상으로 기인한 질환의 예방 또는 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은

1) TAZ 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 세포주에서 TAZ 단백질의 티로신 인산화 수준을 측정하는 단계; 및

3) 상기 TAZ 단백질의 티로신 인산화 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 삼투 스트레스로 유발된 신장 장애의 예방 및 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 TAZ는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 단백질의 티로신 인산화 수준은 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블롯(western blot) 및 RT-PCR로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

아울러, 본 발명은

1) TAZ 및 TonEBP 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 단계 1)의 세포주에서 TAZ 및 TonEBP의 결합 활성을 측정하는 단계; 및

3) 단계 2)의 TAZ 및 TonEBP 결합 활성 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 삼투 스트레스 유발 신장애의 예방 및 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 단계 2)의 결합 활성은 웨스턴 블롯(Western Blot), 면역침강법, SDS-PAGE 및 효소면역분석(ELISA)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 NFAT5/TonEBP와 상호작용하는 TAZ 티로신 인산화가 NFAT5/TonEBP의 활성을 저해하고, c-Abl 활성이 TAZ 및 NFAT5/TonEBP의 상호작용에 필요하며, 인산화된 TAZ가 NFAT5/TonEBP의 결합활성을 저해한다는 것과 생체 내(in vivo)에서 탈수로 유래된 고장성 조건에서 TAZ의 억제가 고장성 자극의 영향을 완화시키기 위한 표적 유전자 발현 및 NFAT5/TonEBP의 활성을 극대화할 수 있는 것을 확인하였으므로, TAZ 티로신 인산화 수준의 변화 또는 TAZ 및 TonEBP 결합 활성 수준을 신질환, 신기능장애 및 신부전으로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 예방 또는 치료제 후보물질의 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있다.

[ 실시예 ]

이하, 본 발명을 실시예 및 제조예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예 및 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 고장성 자극에 의한 TAZ 의 핵 위치 확인

<1-1> 세포 배양

Cos7(African Green Monkey SV40-transf'd kidney fibroblast cell line) 및 HEK293T(Human Embryonic Kidney 293 cells) 세포를 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA)로부터 얻었고, Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 배양하였다. 세포를 인산 칼슘(calcium phosphate) 방법으로 일시적으로 형질전환하였다. 주변 장력이 TAZ 발현에 영향을 미치는지 확인하기 위해, GFP로 표지된(GFP-tagged) TAZ를 Cos7 세포에서 발현시켰고, 다른 장력 조건으로 자극하였다.

mIMCD-3(Tonicity-responsive immortalized mouse inner medullary collecting duct-3 cells)(ATCC)를 10% 열 불활성화시킨 FBS(HyClone, Logan, UT)를 보충한 DMEM에서 유지하였다. mIMCD-3 세포를 NaCl과 함께 2-4 시간 동안 저장성, 등장성 또는 고장성 배지(150, 300, 또는 400 mOsm/Kg H₂O 최종 삼투압농도)에 노출하였다. 등장성 또는 고장성 자극을 위해 세포를 2 시간 동안 저장성 조건에 노출한 뒤 등장성 또는 고장성 배지에서 4 시간 동안 처리하였다.

<1-2> 면역염색( immunofluorescence staining )을 통한 고장성 자극에 의한 TAZ 의 핵 위치 확인

Cos7 세포를 녹색 형광 단백질(green fluorescence protein, GFP)을 붙인 TAZ 또는 Myc을 붙인 NFAT5/TonEBP 발현 벡터로 형질전환시킨 후 150, 300, 또는 400 mOsmo/kg 장력에서 4 시간 동안 처리하였다. 세포를 4% 파라포름알데히드(4% paraformaldehyde)로 고정하였고, 항 Myc 항체, 4',6'-다이아미딘-2'-페닐 인돌(4',6'-diamidine-2'-phenyl indole, DAPI), 또는 형광성의 팔로이딘(fluorescent phalloidin)(red)으로 염색하였다. 형광을 공초점 현미경하에 조사하였다(LSM510 META, Carl Zeiss Inc., Germany).

그 결과, 등장성 조건(300 mOsm/kg)에서 TAZ 발현은 핵 및 세포질에서 관찰되었고, 저장성 조건(150 mOsm/kg) 에서 주로 세포질에서 관찰되었다(도 1A). 하지만, 고장성(400 mOsm/kg) 자극은 점차적으로 TAZ의 핵 위치를 증가시켰다(도 1A 및 B).

또한, 쥐 신장 수질 세포인 mIMCD-3에서 고장성 자극에 대하여 내생적 TAZ의 위치를 확인하였다. 신장 수질 mIMCD3 세포를 NaCl 150, 300, 또는 400 mOsm/Kg를 포함하는 배지에 2시간 동안 처리하였다. 그 후에, 상기 신장 수질 mIMCD3 세포를상기 실시예 <1-2>의 면역염색을 이용하고, 항체는 항 TAZ 항체(Abcam)를 이용하여 면역 염색하였고, 공초점 현미경하에 형광을 조사하였다(LSM510 META, Carl Zeiss Inc., Germany).

그 결과, 외인성의 TAZ 분포와 일관되게, 항 TAZ 항체를 이용한 면역염색은

내인성 TAZ가 등장성, 저장성 및 고장성 조건에서 각각 전체세포(pancellular), 세포질 및 핵에 분포하는 것을 보였다(도 1C).

<1-3> 면역블랏 ( immunoblot )을 통한 고장성 자극에 의한 TAZ 의 핵 위치 확인

상기 실시예 <1-1>에 기재된 바와 같이 배양된 mIMCD-3 세포를 차가운 용해 완충용액(10% glycerol, 50 mM HEPES, 0.1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 50 mM 베타-글리셀로인산칼슘(beta-glycerophosphate), 25 mM NaF, 20 mM EGTA, 15 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1 μg/ml 프로테아제 억제제(protease inhibitor), 1 mM Na3VO4)으로 30분 동안 용해하였고, 상청액으로서 용해물을 모으기 위해 원심분리(4℃, 12000 rpm, 20 분)하였다. 단백질 농도는 Bradford 분석에 의해 측정하였고, 단백질의 동등한 양은 도데실 황산 나트륨(sodium dodecyl sulfate, SDS)-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)에 의해 전기이동적인 방법으로 해결하였고, Immobilon-P 막(Millipore, Invitrogen)에 전기이동시켰다. 막을 TAZ(Abcam), OCT(Tissue-tek), 베타-엑틴(β-actin)(Santa cruz)에 대한 1차 항체와 함께 반응시킨 다음, 적절한 2차 항체는 HRP(Zymed Laboratories, Inc, South San Francisco, CA USA)를 결합하였고, 제조사의 지침서에 따라 ECL(Amersham Biosciences Inc, Piscataway, NJ USA) 검출 시스템으로 시각화하였다.

그 결과, 핵 및 세포질 세포 분획의 TAZ를 면역블랏하여 확인하였을 때, 상기 내생의 TAZ의 핵 위치는 고장성 조건의 신장세포에서 향상되었다(도 1D).

< 실시예 2> 고장성으로 유도된 c- Abl 활성화로 인한 TAZ 의 티로신 인산화 확인

고장성으로 유도된 c-Abl 활성화로 인한 TAZ의 티로신 인산화를 확인하고자표지된 단백질에 대하여 면역침강한 후에, 특이적 항체를 이용한 면역블랏하였다. 구체적으로, mIMCD-3 세포를 Flag 표지된 TAZ 및/또는 Myc 표지된 NFAT5/TonEBP 발현 벡터(vector)로 형질도입하였다. 48시간 후, 총 세포 추출물을 수득하였고 Flag-M2 아가로즈 비드(agarose beads)(Sigma-Aldrich)와 같이 반응시켰고, 상기 비드는 그런 다음 용해 완충용액(lysis buffer)으로 세척하였다. mIMCD-3 세포 추출물을 단백질 A/G 아가로즈 비드(protein A/G agarose beads)와 함께 4℃에서 1 시간 동안 프리클리어(preclear)하였고, 그 다음 항-TAZ 항체 및 단백질 A/G 아가로즈(protein A/G agarose)와 함께 4℃에서 밤새 반응시켰다. 상기 아가로즈 비드를 용해 완충용액으로 세척하였다. 면역 복합체 또는 총 세포 추출물을 SDS-PAGE으로 분석하였고, Immobilon-P 막(Millipore, Invitrogen)으로 이동시켰다. 블롯(blot)은 myc(Santa Cruz Biotechnology), flag(Sigma-Aldrich), NFAT5/TonEBP(Abcam), pY316(Abfrontier), 4G10(Upstate), 인산화된 Abl(phospho-Abl, pAbl)(Cell Signaling), c-Abl(Abcam) 및 TAZ(Abcam)에 대한 항체 중 myc 및 flag에 대한 항체와 반응시켰다.

세린(serine) 89의 인산화는 14-3-3 결합을 통한 TAZ의 세포질 유지를 요구하기 때문에[Kanai F et al.,(2000), EMBO J 19(24):6778-6791], TAZ 인산화에서 고장성의 효과를 확인하였다. 실시예 <1-3>에 기재된 바와 같이, 4G10(Upstate) 및 TAZ의 인산화된 세린(serine)(pS89)에 대한 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc.)를 이용하여 면역블랏을 실시하였다.

그 결과, mIMCD-3 세포의 고장성 자극은 등장성 조건과 비교하였을 때, TAZ의 세린 89의 인산화에 영향을 주지 않은 것을 확인하였다(도 2A). 그러나, TAZ의 티로신 잔기에서 인산화는 고장성 조건에서 두드러지게 증가하였다(4G10)(도 2A). 이러한 관찰은 이소성으로 발현된 TAZ 단백질의 티로신 인산화가 저장성이 아닌 고장성에 의해 증가하는 것에 대한 결과로 확인하였다(도 2B). 고장성에 반응하여, 전체 c-Abl가 아닌 인산화된 c-Abl의 증가된 탐지에 의해 증명되는 바와 같이(도 2C), 내생적 c-Abl 티로신 키나아제(tyrosine kinase)는 고장성 자극에 의해 활성화된다.

c-Abl이 TAZ에 대한 상류의 티로신 키나아제인지 확인하기 위해, 재조합 c-Abl 키나아제를 이용한 시험관 내 키나아제 분석을 확인하였다. 면역침강된 TAZ 단백질은 무세포 시스템에서 c-Abl에 의해 직접적으로 인산화된다(도 2D). 따라서, 293T 세포안에서 c-Abl와 TAZ의 공동 발현은 TAZ의 티로신 인산화를 증가시켰다(도 2E).

이러한 c-Abl로 유도된 티로신 인산화는 비선택성 티로신 키나제 저해제인 제니스테인(genistein)(Signma-Aldrich) 및 c-Abl 키나제 특이적 저해제인 STI-571(Novartis Pharmaceuticals)(Basel, Switzerland)에 의해 저해되었다(도 2F). 또한, 고장성은 c-Abl 활성화와 함께 내생의 TAZ 단백질의 티로신 인산화를 촉진하였지만, STI-571가 있을 때에는 TAZ의 티로신 인산화를 유도하는 것은 실패하였다(도 2G).

< 실시예 3> c- Abl 인산화 부위는 티로신 316인 것을 확인

TAZ 안에서 c-Abl 인산화 부위 확인을 시도하였다. TAZ는 4개의 티로신 잔기를 포함하기 때문에(Y118, Y141, Y300, 및 Y316), 적절한 포스포티로신(phosphotyrosine)을 포함하는 합성의 TAZ 펩티드를 이용하여 TAZ 특이적 포스포티로신 항체(pY118, pY141, pY300, 및 pY316)(AbFrontier Inc.)(Seoul, Republic of Korea)를 만들었다.

그 결과, 상기 TAZ의 c-Abl로 유도한 티로신 인산화는 상기 실시예 <1-3>의 방법 및 4G10 및 pY316 TAZ 항체를 이용하여 면역블랏하였을 때, 현저하게 탐지되었으나, 다른 항체로는 탐지되지 않았다(도 3A). 또한, 고장성이 선택적으로 Y316에서 내생적 TAZ의 티로신 인산화를 증가시키는 것을 확인하였다(도 3B). TAZ 인산화 및 활성에서 Y316의 중요성을 연구하고자, 티로신 316을 페닐알라닌(phenylalanine)으로 교체함으로써 돌연변이 TAZ(Y316F)를 구축하였다. c-Abl의 과발현은 야생형(WT) TAZ의 인산화를 증가시켰으나, 4G10 및 pY316 TAZ 항체로 면역블랏함으로써 증명한 바와 같이, Y316F 돌연변이를 인산화하는 것은 실패하였다(도 3C).

추가하여, Flag로 표지된 야생형(WT) TAZ 및 이의 티로신 돌연변이(Y118F, Y141F, Y300F 및 Y316F)를 발현하는 안정한 mIMCD-3 세포를 수립하였고, 고장성 조건에 노출하였다.

그 결과, 고장성 자극은 WT, Y118F, Y141F 및 Y300F TAZ 단백질을 유도하였으나, 이러한 고장성으로 유도된 인산화는 Y316F 돌연변이에서 실패하였으며(도 3D), 이는 TAZ의 티로신 316이 c-Ab1 인산화 부위인 것을 나타낸다.

< 실시예 4> 고장성에 의해 유도된 인산화를 통한 NFAT5 / TonEBP 와 물리적으로 상호작용하는 TAZ 확인

<4-1> 레트로바이러스 형질도입에 의한 안정한 세포주 수립 및 고장성에 의해 유도된 인산화를 통한 NFAT5/TonEBP와 물리적으로 상호작용하는 TAZ 확인

고장성이 매개하는 신호 경로에서 인산화된 TAZ의 기능을 확인하고자, TAZ와 고장성 신호 경로의 주요 조절자인 NFAT5/TonEBP 사이의 상호작용을 조사하였다. TAZ 및 NFAT5/TonEBP 사이의 상호작용을 확인하기 위해, 293T 세포에서 c-Abl와 함께 Flag-TAZ 및 NFAT5/TonEBP를 일시적으로 발현하였다. 구체적으로, 바이러스를 만드는 불멸화 세포를 10% FBS로 보충한 DMEM에 배양하였고, 인산칼슘 형질전환 방법을 이용하여 TAZ를 발현하는 레트로바이러스 벡터를 형질전환하였다. 바이러스 상층액을 수득하였고, 수득한 바이러스 상층액을 폴리브렌(polybrene)(4 mg/ml, Sigma-Aldrich)이 있을 때에 4 시간 동안 mIMCD-3 또는 MEF 세포에 첨가하였다. 안정한 세포를 퓨로 마이신(puromycin)(Sigma-Aldrich) 저항성으로 수립하였다. 상기 수립된 세포를 공동-면역침강 및 면역블랏으로 분석하였다.

그 결과, 공동-면역침강 및 면역블랏 분석은 TAZ 및 NFAT5/TonEBP 사이의 물리적 상호작용을 증명하였다(도 4A). 하지만, Y316F 돌연변이 TAZ는 NFAT5/TonEBP와 상호작용할 수 없었다(도 4A). 게다가, STI-571가 처리된 세포는 TAZ 및 NFAT5/TonEBP 사이의 물리적 상호작용이 감소하였고, TAZ의 티로신 인산화가 감소하였으며(도 4B), 이 결과는 TAZ 및 NFAT5/TonEBP 사이의 티로신 인산화가 독립적인 상호작용인 것을 나타낸다.

또한, NFAT5/TonEBP는 c-Abl에 의해 티로신 143에서 인산화되기 때문에, NFAT5/TonEBP의 티로신 인산화가 TAZ와의 상호작용에 필수적인지 시험하였다. TAZ 면역 복합체에서 야생형(WT)과 돌연변이 NFAT5/TonEBP의 비슷한 존재에서 나타난 바와 같이, NFAT5/TonEBP와 TAZ 사이의 상호작용은 Y143F 돌연변이에서 유지되었다(도 4C). 가장 중요하게, 내생적 TAZ 면역 복합체의 분석은 등장성 조건하에서 NFAT5/TonEBP와 상호작용하는 TAZ 및 고장성 조건에서 더 강하게 티로신 인산화-의존적인 방법에서 확인하였다(도 4D). 이러한 내생적 TAZ 및 NFAT5/TonEBP 사이의 물리적 상호작용은 저장성 조건에서 탐지되지 않았다(도 4D).

<4-2> 원 위치( in situ ) proximity ligation assay ( PLA ) systems 을 통한 고장성에 의해 유도된 인산화를 통한 NFAT5 / TonEBP 와 물리적으로 상호작용하는 TAZ 확인

mIMCD-3 세포의 핵에서 각각의 TAZ-NFAT5/TonEBP 상호작용을 가시화하기 위하여, 원 위치(in situ) proximity ligation assay(PLA) system를 실시하였다. 구체적으로, 신장 수질 mIMCD-3 세포를 슬라이드 글라스에 놓고, 등장성 및 고장성 배지에서 4 시간 동안 배양하였다. 세포를 고정하였고, 마우스 항TAZ 항체(1:100, Abcam) 및 토끼 항NFAT5/TonEBP 항체로 배양하였다(Miyakawa H, et al,(1999), Proc Natl Acad Sci U S A 96(5):2538-2542.). In situ PLA를 제조업자의 지시에 따라 수행하였다(DUO-link, Olink Bioscience, Uppsala, Sweden).

더욱이, 상기 원 위치(in situ) proximity ligation assay(PLA) system은 등장성 또는 고장성 배지에서 배양된 mIMCD-3 세포의 핵에서 각각의 TAZ-NFAT5/TonEBP 상호작용을 가시화하였지만, 저장성 배지에서는 가시화하지 못하였다(도 4E).

< 실시예 5> TAZ 에 의한 NFAT5 / TonEBP 의 DNA -결합 및 전사적 활성 억제 확인

<5-1> 리포터 유전자 분석( Reporter gene assays )을 통한 TAZ 에 의한 NFAT5 / TonEBP 의 전사적 활성 억제 확인

NFAT5/TonEBP 활성에 TAZ-NFAT5/TonEBP 상호작용의 효과를 확인하였다. NFAT5/TonEBP의 전사적 활성을 TAZ가 없는 조건에서, NFAT5/TonEBP에 반응하는 루시퍼라제 리포터 유전자(luciferase reporter gene, pTonE-luc)로 측정하였다. 구체적으로, 293T 세포를 6-웰 플레이트에 5×10⁵ 세포/웰의 수로 두었고, NFAT5/TonEBP 및 TAZ 발현벡터를 일시적으로 형질전환시켰고, NFAT5/TonEBP에 반응하는 요소가 연결된 루시퍼라제(NFAT5/TonEBP-responsive element-linked luciferase, pTonE-luc) 및 pCMVβ를 형질전환 대조군으로 형질전환시켰다. 루시퍼라제 활성은 Bright-Glo luciferase assay kit(Promega, Madison, WI)를 이용하여 분석하였다. 상대적인 루시퍼라제 단위를 β-갈락토시다제 활성(β-galactosidase activity)(TROPIX, Bedford, MA)으로 표준화한 후에 계산하였다.

NFAT5/TonEBP의 이소성(Ectopic) 발현은 pTonE-luc의 루시퍼라제 활성을 증가시켰으나, TAZ의 공동발현은 현저히 용량 의존적으로 이러한 활성을 현저히 억제하였다(도 5A). 더욱이, 상기 NFAT5/TonEBP를 유도하는 리포터 활성은 WT 또는 Y118F TAZ에 의해 저해되는 반면, NFAT5/TonEBP와 상호작용하는 Y316F의 불능과 일치하여 Y316F TAZ는 NFAT5/TonEBP 활성을 억제하지 못하였다(도 5B).

<5-2> DNA 풀-다운 분석( DNA - pull - down assay )을 통한 TAZ 에 의한 NFAT5 / TonEBP 의 DNA -결합 활성 억제 확인

상기 TAZ가 매개하는 NFAT5/TonEBP 전사적 활성의 저해는 TAZ가 있을 때 NFAT5/TonEBP의 DNA-결합 활성을 시험함으로써 확인하였다. DNA-pull-down assay를 통해 NFAT5/TonEBP의 DNA-결합 활성을 측정하였으며, 구체적인 방법은 하기와 같다. Myc으로 표지된 NFAT5/TonEBP 및 Flag로 표지된 TAZ 및 Y316F를 형질전환시킨 세포를 HKMG buffer(10 mM Hepes, pH 7.9, 100 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 10% glycerol, 0.1% NP-40, and 1 mM DTT)에 용해한 후 비오틴을 붙인 이중 가닥 DNA와 함께 배양하였고, 그 후에 스트렙타아비딘 아가로즈 비즈와 함께 배양하였다. 침전물을 HKMG buffer로 3회 세척하였고, 면역블랏 분석을 위해 SDS-PAGE로 적용하였다. NFAT5/TonEBP에 결합하는 요소를 포함하는 DNA 서열은 하기와 같다: 5'-cttggtggaaaattaccgctggt-3' (서열번호 2) 및 5'-aaccagcggtccttttccaccaa-3'(서열번호 3).

그 결과, DNA-pull-down assay는 NFAT5/TonEBP가 직접적으로 NFAT5/TonEBP-결합 요소를 포함하는 DNA 서열에 직접적으로 결합하는 것을 나타내었고, 이러한 DNA- NFAT5/TonEBP 연관성은 현저히 TAZ의 과발현에 의해 저해되었지만, Y316F 돌연변이는 DNA- NFAT5/TonEBP 연관성을 저해하지 못하였다(도 5C). 이러한 결과는 TAZ- NFAT5/TonEBP 상호작용이 NFAT5/TonEBP의 DNA 결합 활성을 저해함으로써 NFAT5/TonEBP의 전사적 활성을 억제하는 것을 나타낸다.

< 실시예 6> TAZ 에 의한 고장성조건에서 삼투조절물질의 축적 유전자의 발현 및 세포 지수의 조절 확인

TAZ가 NFAT5/TonEBP 활성을 억제하기 때문에, TAZ 과발현 또는 결핍이 내생적 NFAT5/TonEBP 표적 유전자인 BGT1 및 SMIT의 발현에 영향을 주는지 조사하였다. 먼저, TAZ를 과발현하는 mIMCD-3 세포를 수립하였다. 구체적으로, mIMCD-3 세포를 바이러스 발현 flag-TAZ 또는 작은 헤어핀(small hairpin) TAZ RNA를 이용하여 실시예 <4-1>과 동일한 방법으로 실시하여, 형질전환된 세포주를 수립하였다. 다음으로, 실시예 <1-3>에 기재된 바와 같이 면역블랏하였다.

그 결과, TAZ를 형질전환하여 수립한 TAZ 과발현 안정화 세포에서 TAZ는 대조군인 mIMCD-3 세포에 비해 과발현하는 반면, NFAT5/TonEBP 발현은 두 개 세포 클론에서 유사하였고, 장력 자극(challenges)에 의해 바뀌지 않는 것을 확인하였다(도 6A).

<6-1> 실시간 PCR 분석( Real - time PCR analysis )을 통한 TAZ 에 의한 고장성조건에 서 삼투조절물질의 축적 유전자의 발현 확인

TAZ 과발현 안정화세포 및 대조군 mIMCD-3 세포로부터 TRIzol(Gibco-BRL, Invitrogen)를 이용하여 전체 RNA를 분리하였으며, cDNA 합성을 위해 역전사에 이용하였다. 실시간 PCR 반응을 SYBR Green pre-mix buffer 및 ABI-Prism 7300 sequence detector(Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA) 함께 수행하였다. 상대적인 발현 수준을 β-액틴(β-actin)에 대한 Ct 값에 대해 평준화한 후 확인하였다. 유전자 특이적 프라이머는 하기와 같다: BGT1, 5'-ctgggagagacgggttttgggtattacatc-3'(서열번호 4), 5'-ggaccccaggtcgtggat-3'(서열번호 5); SMIT, 5'-ccgggcgctctatgacctggg-3'(서열번호 6), 5'-caaacagagaggcaccaatcg-3'(서열번호 7); 및 β-actin, 5'-agagggaaatcgtgcgtgac-3'(서열번호 8), 5'-caatagtgatgacctggccgt-3'(서열번호 9).

그 결과, 상기 BGT1 및 SMIT의 상대적인 발현은 대조군 세포에서 고장성에 의해 증가하였으나, 고장성으로 자극된 TAZ 안정화 세포에서 현저히 약화된 것을 확인하였다(도 6B).

또한, 수립된 TAZ 넉다운(knockdown)(shTAZ) 및 대조군(shcon)세포를 등장성 및 고장성 조건에서 4 시간 동안 자극한 후에, TAZ, NFAT5/TonEBP 및 액틴의 단백질 수준을 실시예 <1-3>의 면역블랏으로 확인하였다.

그 결과, TAZ 넉다운(knockdown) 세포에서 TAZ의 발현이 감소된 것을 확인하였다(도 6C).

또한, TAZ 넉다운(knockdown)(shTAZ) 및 대조군(shcon)세포를 수립하고, 등장성 및 고장성 조건에서 4 시간 동안 자극한 후에, BGT1 및 SMIT의 발현 수준을 실시예 <6-1>의 실시간 PCR 분석으로 확인하였다.

그 결과, BGT1 및 SMIT의 발현은 등장성 및 고장성 조건에서 TAZ 발현의 감소에 의해 점차적으로 증가하였다(도 6D).

<6-2> 실시간 세포 관측( Real - time cell monitoring )을 통한 TAZ 에 의한 고장성조건에서 세포 지수의 조절 확인

TAZ의 존재 여부에 따른 세포 지수를 확인하고자, TAZ 넉다운(knockdown)(shTAZ) 및 대조군(shcon)세포를 수립하고, 24시간 동안 실시간으로 세포를 관측하였다. 구체적으로, 안정한 mIMCD-3 세포(shcon 및 shTAZ)를 E-Plate 96에 두었고, xCELLigence system(Real-Time Cell Analyzer, Roche, Germany)에서 관측하였다. 하룻밤 동안 생장시킨 후에, 세포를 등장성 또는 고장성 배지에서 배양하였다. 세포 지수 값(CI)를 지속적으로 24시간 동안 매 15분 동안 관측하였다. 2 회의 세 개의 독립적인 실험을 수행하였으며, 2 회의 평균을 제조업자의 지시에 따라 계산하였다(xCELLigence, Roche, Germany).

그 결과, 24시간 동안 실시간 세포 관측은 세포 지수가 대조군 세포(shcon)보다 TAZ 넉다운(knockdown)(shTAZ) 세포에서 대체로 더 높았고, 고장성으로 자극된 shTAZ 세포는 빠르게 증가하는 것을 나타내었다(도 6E). 이러한 결과는 NFAT5/TonEBP의 활성화는 TAZ가 없을 때, 고장성 자극에 의해 촉진될 수 있는 것을 제시한다.

< 실시예 7> TAZ 결핍 세포에서 TAZ 의 회복은 증가된 NFAT5 / TonEBP 활성 억제를 유도하지만, Y316F 는 NFAT5/TonEBP 활성 억제를 유도하지 않는 것을 확인

TAZ의 부족에 의한 NFAT5/TonEBP 활성의 증가가 TAZ 회복에 의해 직접적으로 역전될 수 있는 것을 확인하였다. 먼저, WT 및 KO 마우스를 사육하였다. 구체적인 동물 사육은 다음과 같다. 야생형(Wild type, WT) C57BL/6 마우스를 Jackson Laboratories(Bar Harbor, MN)로부터 구입하였다. TAZ 넉아웃(knockout, KO) 마우스의 제작 방법은 하기와 같다. TAZ Exon 2를 제거하기 위하여 Exon 2를 제거하는 벡터를 제작하였고, 제작된 벡터를 배아줄기세포(embryonic stem cell)에 주입하여 재조합(recombination)된 세포주를 확립하였다. 확립된 세포주를 대리모에 심어 키메라(chimera)를 획득하였다. WT 및 TAZ 넉아웃(knockout, KO) 마우스를 병원균이 없는 조건하에서 유지하였다. 모든 동물 실험은 IACUC 가이드라인에 따라 수행하였으며, 이화여자대학교의 IACUC에 승인을 받았다(ELAGC-09-1017 및 IACUC 2010-13-3). 사육한 후에, TAZ 또는 Y316F 돌연변이의 재도입을 위하여 WT 및 TAZ KO 마우스로부터 MEF 세포를 분리하였다. MEF 세포를 10% 열 불활성화시킨 FBS(HyClone, Logan, UT)를 보충한 DMEM에서 유지하였다.

WT 및 TAZ KO 마이스 MEF 세포를 실시예 <1-3>의 면역블랏으로 분석하였을때, TAZ 발현 여부를 확인하였으며, WT와 비교하였을 때 TAZ KO 마이스에서 TAZ의 발현이 적은 것을 확인하였다(도 7A).

pTonE-luc 리포터 유전자로 MEF를 형질전환 한 후 다른 장력의 배지로 자극하였다. 구체적으로, pTonE-luc 리포터 유전자로 형질전환된 MEF 세포를 NaCl과 함께 2-4 시간 동안 저장성, 등장성 또는 고장성 배지(150, 300, 또는 400 mOsm/Kg H₂O 최종 삼투압농도)에 노출하였다.

그 결과, 고장성 자극은 WT MEF 세포에서 리포터 활성을 증가시켰으나, TAZ KO세포에서 더 큰 영향을 미쳤다(도 7B). 또한, 상기 증가된 TAZ KO 세포에서 pTonE-luc 활성은 WT TAZ의 회복에서 기본적 수준으로 되돌아갔다. 하지만, Y316F TAZ의 도입은 리포터 활성 저해에 다소 효과적이지 않았다(도 7C).

아울러, 시험관 내에서 TAZ가 신장 세포에서 삼투조절물질 유전자의 발현을 억제하기 때문에, TAZ KO 신장에서 삼투조절물질 유전자의 생체 내 발현 수준을 측정하였다. WT 및 TAZ KO 마이스의 신장 수질에서 SMIT 및 BGT1의 상대적인 발현 수준을 실시예 <6-1>의 방법으로 분석하였고, 그 결과, TAZ KO 마이스의 신장에서 심각한 형태학적 결핍에도 불구하고, SMIT 및 BGT1의 발현은 WT 신장에 비해 TAZ KO 신장에서 현저히 증가하는 것을 확인하였다(도 7D).

< 제조예 1> 약학적 제제의 제조

<1-1> 산제의 제조

TAZ 티로신 인산화 억제제 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<1-2> 정제의 제조

TAZ 티로신 인산화 억제제 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<1-3> 캡슐제의 제조

TAZ 티로신 인산화 억제제 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<1-4> 환의 제조

TAZ 티로신 인산화 억제제 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상과 동일한 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

<1-5> 과립의 제조

TAZ 티로신 인산화 억제제 150 ㎎

대두추출물 50 ㎎

포도당 200 ㎎

전분 600 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30 % 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60 ℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

상기에서 보는 바와 같이, 본 발명은 삼투 스트레스로 유발된 신장 장애, 즉, 신질환, 신기능장애 또는 신부전과 같은 질환의 예방 및 치료를 위한 약제의 개발과 이를 이용한 예방 또는 치료 방법 개발, 즉, 단백질 치료제, 발현 및 활성 조절물질, 유전자 치료제 또는 세포 치료제 등에 유용하게 사용될 수 있다.

<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation <120> Pharmaceutical compositions containing inhibitors of TAZ tyrosine phosphorylation as active ingredient for NFAT5/TonEBP activation for prevention and treatment of kidney disorder <130> 12p-04-07 <150> KR10-2011-0064253 <151> 2011-06-30 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 395 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Asn Pro Ser Ser Val Pro His Pro Leu Pro Pro Pro Gly Gln Gln 1 5 10 15 Val Ile His Val Thr Gln Asp Leu Asp Thr Asp Leu Glu Ala Leu Phe 20 25 30 Asn Ser Val Met Asn Pro Lys Pro Ser Ser Trp Arg Lys Lys Ile Leu 35 40 45 Pro Glu Ser Phe Phe Lys Glu Pro Asp Ser Gly Ser His Ser Arg Gln 50 55 60 Ser Ser Thr Asp Ser Ser Gly Gly His Pro Gly Pro Arg Leu Ala Gly 65 70 75 80 Gly Ala Gln His Val Arg Ser His Ser Ser Pro Ala Ser Leu Gln Leu 85 90 95 Gly Thr Gly Ala Gly Ala Ala Gly Gly Pro Ala Gln Gln His Ala His 100 105 110 Leu Arg Gln Gln Ser Tyr Asp Val Thr Asp Glu Leu Pro Leu Pro Pro 115 120 125 Gly Trp Glu Met Thr Phe Thr Ala Thr Gly Gln Arg Tyr Phe Leu Asn 130 135 140 His Ile Glu Lys Ile Thr Thr Trp Gln Asp Pro Arg Lys Val Met Asn 145 150 155 160 Gln Pro Leu Asn His Val Asn Leu His Pro Ser Ile Thr Ser Thr Ser 165 170 175 Val Pro Gln Arg Ser Met Ala Val Ser Gln Pro Asn Leu Ala Met Asn 180 185 190 His Gln His Gln Gln Val Val Ala Thr Ser Leu Ser Pro Gln Asn His 195 200 205 Pro Thr Gln Asn Gln Pro Thr Gly Leu Met Ser Val Pro Asn Ala Leu 210 215 220 Thr Thr Gln Gln Gln Gln Gln Gln Lys Leu Arg Leu Gln Arg Ile Gln 225 230 235 240 Met Glu Arg Glu Arg Ile Arg Met Arg Gln Glu Glu Leu Met Arg Gln 245 250 255 Glu Ala Ala Leu Cys Arg Gln Leu Pro Met Glu Thr Glu Thr Met Ala 260 265 270 Pro Val Asn Thr Pro Ala Met Ser Thr Asp Met Arg Ser Val Thr Asn 275 280 285 Ser Ser Ser Asp Pro Phe Leu Asn Gly Gly Pro Tyr His Ser Arg Glu 290 295 300 Gln Ser Thr Asp Ser Gly Leu Gly Leu Gly Cys Tyr Ser Val Pro Thr 305 310 315 320 Thr Pro Glu Asp Phe Leu Ser Asn Met Asp Glu Met Asp Thr Gly Glu 325 330 335 Asn Ser Gly Gln Thr Pro Met Thr Val Asn Pro Gln Gln Thr Arg Phe 340 345 350 Pro Asp Phe Leu Asp Cys Leu Pro Gly Thr Asn Val Asp Leu Gly Thr 355 360 365 Leu Glu Ser Glu Asp Leu Ile Pro Leu Phe Asn Asp Val Glu Ser Ala 370 375 380 Leu Asn Lys Ser Glu Pro Phe Leu Thr Trp Leu 385 390 395 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence containing TonEBP-binding element <400> 2 cttggtggaa aattaccgct ggt 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence containing TonEBP-binding element <400> 3 aaccagcggt ccttttccac caa 23 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BGTI <400> 4 ctgggagaga cgggttttgg gtattacatc 30 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BGT1 <400> 5 ggaccccagg tcgtggat 18 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIT <400> 6 ccgggcgctc tatgacctgg g 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIT <400> 7 caaacagaga ggcaccaatc g 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin <400> 8 agagggaaat cgtgcgtgac 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin <400> 9 caatagtgat gacctggccg t 21

Claims (12)

1. 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 TAZ(Transcriptional Coactivator with PDZ-binding motif)의 316번째 티로신 인산화 억제제로서 제니스타인, STI-571 및 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 TAZ의 316번째 티로신 인산화된 단백질에 대한 항체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 유효성분으로 함유하는 삼투 스트레스로 유발된 신장 장애의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 삼투 스트레스로 유발된 신장 장애는 신질환, 신기능장애 및 신부전으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
   
3. 삭제
4. 삭제
5. 제 1항에 있어서, 상기 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 TAZ의 316번째 티로신 인산화 억제제로서 제니스타인, STI-571 및 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 TAZ의 316번째 티로신 인산화된 단백질에 대한 항체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나는 NFAT5/TonEBP의 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
   
6. 삭제
7. 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 TAZ의 316번째 티로신 인산화 억제제로서 제니스타인, STI-571 및 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 TAZ의 316번째 티로신 인산화된 단백질에 대한 항체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 포유류를 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신장 조직 내 삼투압 농도에 의한 스트레스(osmolarity stress)의 억제 방법.
   
8. 제 7항에 있어서, 상기 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 TAZ의 316번째 티로신 인산화 억제제로서 제니스타인, STI-571 및 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 TAZ의 316번째 티로신 인산화된 단백질에 대한 항체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나는 NFAT5/TonEBP의 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
   
9. 1) 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 TAZ 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;
   2) 단계 1)의 세포주에서 TAZ 단백질의 316번째 티로신 인산화 수준을 측정하는 단계; 및
   3) 단계 2)의 TAZ 단백질의 316번째 티로신 인산화 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 삼투 스트레스로 유발된 신장 장애의 예방 및 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
   
10. 제 9항에 있어서, 단계 2)의 단백질의 316번째 티로신 인산화 수준은 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블롯(Western Blot) 및 RT-PCR로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
    
11. 1) TAZ 및 TonEBP 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;
    2) 단계 1)의 세포주에서 TAZ 및 TonEBP의 결합 활성을 측정하는 단계; 및
    3) 단계 2)의 TAZ 및 TonEBP 결합 활성 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 삼투 스트레스 유발 신장애의 예방 및 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
    
12. 제 11항에 있어서, 단계 2)의 결합 활성은 웨스턴 블롯(Western Blot), 면역침강법, SDS-PAGE 및 효소면역분석(ELISA)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
    
    
    
    
    
    
    

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