WO2023080263A1

WO2023080263A1 - 백내장 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: WO2023080263A1
Application number: PCT/KR2021/015663
Authority: WO
Inventors: 김성재
Original assignee: 경상국립대학교병원
Priority date: 2021-11-02
Filing date: 2021-11-02
Publication date: 2023-05-11

Abstract

본 발명은 백내장 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, NFAT5 mRNA 또는 단백질의 발현을 증가시키는 물질을 포함하여 고삼투압 스트레스에 노출된 수정체 상피세포의 괴사를 억제하고 염증성 사이토카인 발현을 억제하여 백내장을 효과적으로 예방하고 치료할 수 있다.

Description

백내장 예방 또는 치료용 약학 조성물

본 발명은 백내장 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

백내장은 전 세계적으로 실명의 주요 원인이며 50세 이상의 사람들에게 영향을 미친다. 백내장 수술의 성과는 최근 몇 년 동안 크게 증가하였다. 백내장 형성의 병태생리학을 이해하는 것은 공중 보건과 의학적 지식을 향상시키는 데 중요하다. 역학 연구는 나트륨 섭취가 백내장의 발병에 중요한 역할을 한다는 것을 보여주었다. 동물 모델에서 높은 나트륨 섭취는 백내장을 유발하였다. 염분 섭취와 배설의 균형에 따라 달라지는 혈장 염 농도는 혈장 삼투압 농도를 결정하는 가장 중요한 요소이다. 또한, 총 체수분의 결핍은 노인에게서 흔한 증상이다. 입원환자 및 장기요양원의 탈수 유병률은 80%에 이르는 것으로 보고되었다.

삼투압 스트레스는 신장, 피부, 호흡 기관 및 눈에 영향을 미치며 이러한 기관의 조직 손상을 일으키는 중요한 기전이다. 그러나 삼투압 스트레스에 노출된 렌즈에서 백내장 형성으로 이어지는 세포 과정은 완전히 이해되지 않았다. 세포외 삼투압이 높으면 누수가 발생하여 세포 수축이 일어나며, 이는 세포 사멸의 초기 현상이다. 그러나 적응 메커니즘은 삼투압 균형을 회복하고 삼투압 스트레스에 노출되었을 때 세포가 생존할 수 있도록 한다.

최근 연구에 따르면 백내장 형성은 수정체 상피에서 시작된다. 따라서, 고삼투압 스트레스에 대한 방어에서 수정체 상피 세포의 역할과 손상/손상이 발생하는 메커니즘에 대한 연구가 필요하다.

본 발명은 백내장 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 백내장 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

1. NFAT5(Nuclear Factor of Activated T Cells 5) mRNA 또는 단백질의 발현을 증가시키는 물질을 포함하는 백내장 예방 또는 치료용 조성물.

2. 위 1에 있어서, 상기 물질은 핵산, 뉴클레오티드, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 당, 지질 또는 화합물인, 백내장 예방 또는 치료용 조성물.

3. 위 1에 있어서, 상기 백내장은 고삼투압 스트레스로 유발된 것인, 백내장 예방 또는 치료용 조성물.

4. 개체로부터 분리된 시료에 후보물질을 처리하여, 상기 시료의 NFAT5(Nuclear Factor of Activated T Cell)의 발현을 대조군 대비 증가시키는

후보물질을 선별하는 단계;를 포함하는 백내장 치료제 스크리닝 방법.

5. 위 4에 있어서, 상기 시료는 수정체 상피세포인, 백내장 치료제 스크리닝 방법.

6. 위 4에 있어서, 상기 물질은 핵산, 뉴클레오티드, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 당, 지질 또는 화합물인, 백내장 치료제 스크리닝 방법.

7. 위 4에 있어서, 상기 백내장은 고삼투압 스트레스로 유발된 것인, 백내장 치료제 스크리닝 방법.

도 1은 NFAT5 KO 세포주의 생성 결과를 확인한 것이다.

도 2는 인간 수정체 상피세포(HLE-B3)의 생존력에 대한 고삼투압 스트레스의 영향을 확인한 것이다.

도 3은 HLE-B3세포에서 NFAT5 발현에 대한 삼투압 스트레스의 영향을 확인한 것이다.

도 4는 HLE-B3세포에서 NFAT5 KO 세포 생산 및 NFAT5 KO 세포에서 NFAT5의 부재를 확인한 것이다.

도 5 및 6은 NFAT5 WT 세포 및 NFAT5 KO 세포에서 고삼투압 스트레스에 의한 세포 생존의 변화를 확인한 것이다.

도 7 및 8은 HLE-B3 세포의 세포 주기에 대한 고삼투압 스트레스의 영향을 확인한 것이다.

도 9는 NFAT5 WT 세포 및 NFAT5 KO 세포에서 고삼투압 스트레스에 대한 z-VAD 처리 효과 및 pro-apoptotic 및 anti-apoptotic 마커의 변화를 확인한 것이다.

도 10은 NFAT5 KO 및 WT 세포의 고삼투압 스트레스 유도 사멸에 대한 특이적인 괴사 억제제인 necrostatin-1(NEC)의 효과를 확인한 것이다.

도 11은 NFAT5 WT 세포 및 NFAT5 KO 세포에서 RIP1(Ser166) 및 RIP3(Ser227)의 인산화 수준을 비교한 것이다.

도 12는 NFAT5 WT 및 KO 세포주에서 고장성 상태에 24시간 노출 후 qPCR에 의해 염증성 사이토카인의 변화를 측정한 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 백내장 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 NFAT5(Nuclear Factor of Activated T Cells 5) mRNA 또는 그 단백질의 발현을 증가시키는 물질을 포함한다.

상기 물질은 NFAT5 mRNA 또는 그 단백질의 발현을 증가시킬 수 있다면 제한되지 않으며, 예를 들어, 핵산, 뉴클레오티드, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 당, 지질 또는 화합물일 수 있다.

상기 물질은 NFAT5 mRNA 또는 그 단백질의 발현을 증가시킴으로써, 수정체 상피세포의 괴사를 억제하고, 염증성 사이토카인 발현을 억제하여 백내장 예방 또는 치료효과를 얻을 수 있다.

상기 백내장은 고삼투압 스트레스로 유발된 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

조성물에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오즈, 덱스트로즈, 수크로스, 덱스트린, 말토덱스트린, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면 활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제되나, 이에 제한되지 않는다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며 이에 제한되지는 않으나, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.

경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 ㎏당 1 내지 6000 mg, 바람직하게는 60 내지 600 mg을 1회 또는 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다

본 발명은 백내장 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 개체로부터 분리된 시료에 후보물질을 처리하여, 처리 전 대비 상기 시료의 NFAT5(Nuclear Factor of Activated T Cell)의 발현을 증가시키는 후보물질을 선별하는 단계;를 포함한다.

상기 시료는 개체로부터 분리된 수정체 상피세포일 수 있고 보다 구체적으로 인간 수정체 상피세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 수정체 상피세포는 고삼투압 스트레스에 노출된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 후보물질은 새롭게 합성된 또는 공지된 물질로 백내장의 예방 또는 치료에 효과를 나타낼 것으로 기대되는 물질을 제한없이 포함할 수 있고, 예를 들어, 핵산, 뉴클레오티드, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 당, 지질 또는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 상기 후보물질을 상기 시료에 처리하여 NFAT5 mRNA 또는 그 단백질의 발현 수준을 측정한 후, 처리 전 대비 발현이 증가하면, 상기 후보물질을 백내장 예방 또는 치료제 후보물질로 선별할 수 있다.

상기 NFAT5 mRNA 또는 그 단백질이 발현 수준을 측정하는 방법으로서 NFAT5를 코딩하는 유전자의 전사물질인 mRNA의 시료 내 농도 또는 상기 NFAT5 단백질의 시료 내 농도를 측정하는 방법을 택할 수 있으나, 이에 제한되지 아니하고, 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법을 택하여 수행할 수 있다.

상기 mRNA의 시료 내 농도를 측정하는 방법으로서 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블롯팅 (Northern blotting) 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 단백질의 시료 내 농도를 측정하는 방법으로서 상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 면역탁본검사, 샌드위치 측정법(sandwich assay), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색(immunohistochemistry), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS(fluorescence-activated cell sorting), 웨스턴 블롯팅, 유체 세포 측정법(flow cytometry), 효소기질발색법, 항원-항체 응집법 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있고, 바람직하게는 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)를 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 백내장은 고삼투압 스트레스로 유발된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세히 설명하기로 한다.

재료 및 방법

1. 세포 배양 및 처리

SV-40의 바이러스 형질전환에 의해 불멸화되는 HLEC 계통인 HLE-B3 세포는 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. 이 세포들은 10% 소태아 혈청과 1% 항균 용액(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 포함하는 최소 필수 배지(MEM; Cat # 11095080; Lot No. 2120598; Gibco, USA)에서 37 ℃에서 5% CO₂에서 유지되었다. 전체 실험에서 배지만을 사용한 경우에는 정상 배지(NM)로 기재하였고, 이 베이스라인 배지에 50, 100, 150 mOsm/L의 NaCl을 첨가하여 고삼투압 스트레스를 가하였다. 배지 자체의 삼투압은 본 연구에서 매우 중요한 영향을 미칠 수 있으므로 2430 Multi-Osmette 자동 샘플링 턴테이블 삼투압계(Precision System Inc., Natick, MA, USA)를 사용하여 일반 배지의 삼투압을 측정하였다. 그 결과, 일반 배지의 삼투압 농도는 291.5 ± 1.0 mOsm/L(n = 4)로 측정되었다. 모든 배양물은 실험 전에 ~80-90% confluency로 성장시켰다. 고삼투압 스트레스를 유도하기 위해 멸균 NaCl(1M)을 배양 배지에 첨가하였다. 세포를 고삼투압 배지에서 24, 48 또는 72시간 동안 배양하였다. 300-450 mOsm/L의 삼투압 범위는 눈물 분해 영역의 삼투압 농도가 각막 앞 눈물층에서 최대 560mOsm/L에 도달할 수 있음을 나타내는 이전 데이터를 기반으로 선택되었다.

2. 세포 생존율 측정

HLE-B3 세포를 24-웰 플레이트에 웰당 5 x 10⁴ 세포의 밀도로 시딩하고 24시간 동안 인큐베이션하였다. 다음 날, 세포를 다양한 삼투압 농도(NM, +50, +100 및 +150 mOsm/L)의 배지에서 여러 시점(24, 48 및 72시간) 동안 배양하였다. 세포 생존율은 CCK-8(Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)을 사용하여 측정하였다. 간단히 말해서, 10 ㎕의 CCK-8 용액을 각 웰에 첨가하고 5% CO₂를 포함하는 가습 분위기에서 37 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. 세포 탈수소효소에 의해 생성된 포르마잔 염료의 양은 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다. 처리된 세포와 대조군 세포 사이의 표현형 차이를 감지하기 위해 도립 현미경(Nikon, Tokyo, Japan)을 사용하여 세포를 관찰하였다.

3. 유세포 분석

세포를 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)로 두 번 세척하고 70% 에탄올로 4℃에서 1시간 동안 고정하고 1 mg/㎖ RNase A(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 처리하고, 50 ㎍/㎖ PI(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 염색하였다. 세포 당 상대적인 DNA 함량은 유세포 분석기(모델 FC500; Beckman Coulter, Brea, CA, USA)를 사용하여 측정되었다. 데이터는 Beckman Coulter Cytomics CXP 소프트웨어(Applied Cytometry Systems, Dinnington, UK)를 사용하여 분석되었다. 결과는 게이트된 세포의 총 수에 대한 백분율로 표시되었다.

4. 형질감염(transfection) 및 루시퍼라아제 분석(Luciferase Assays)

HLE-B3 세포를 Lipofectamine 3000(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 hTonE-GL3 리포터 구조(hTonE-GL3, a gift from Dr. S. N. Ho, University of California at San Diego, La Jolla, CA, USA)로 형질 감염시켰다. hTonE-GL3 구조(0.5㎍)를 10ng의 pRL-CMV(Renilla luciferase)로 공동 형질감염시켰다. 형질감염 후, 세포를 등장성 배지에서 24시간 동안 유지한 다음 고장성 배지로 전환하거나 등장성 배지에서 추가 24시간 동안 유지하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하고 수동 용해 완충액(Promega, Madison, WI, USA)으로 용해시켰다. 추출물에서 Firefly 및 Renilla luciferase 활성은 제조업체의 지침에 따라 Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega, Maddison, WI, USA)을 사용하여 측정되었다. 각 샘플에 대해 Firefly luciferase 활성을 Renilla luciferase 활성으로 나누어 형질감염 효율의 변화를 조절하였다.

5. NFAT5 KO 세포주의 생성

HLE-B3 세포는 Cas9-red 형광 단백질(RFP) 발현 카세트(Toolgen, Inc., Seoul, Korea)를 포함하는 pRGEN_Cas9_PuroR_RFP_CMV 플라스미드로 형질감염시키고, 형질감염된 세포는 퓨로마이신(1 ㎍/㎖)을 사용하여 선별하였다. 선별 2주 후, 각 클론을 클로닝 실린더(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA)를 사용하여 24-웰 플레이트로 옮겼다. 독립 클론을 분리하고 형광 현미경으로 RFP 발현을 조사하였다. 후속 계대에서 세포는 항생제를 함유하는 성장 배지에서 유지되었다. Knockout Guide Design(Synthego, Redwood City, CA, USA; design. synthego.com)을 사용하여 NFAT5의 7번째 엑손에 있는 DNA를 표적으로 하는 20bp 가이드 RNA 서열을 선택하였다. 총 1.5 x 10⁵개의 클론 유래 Cas9-발현 HLE-B3 세포를 6cm 조직 배양 접시에 시딩하고 70-80% confluency에 도달할 때까지 배양하였다. 세포를 30μM의 crRNA와 tracrRNA의 융합체인(Synthego, Menlo Park, CA, USA) 합성 NFAT5 표적 단일 가이드 RNA로 형질감염시켰다. NFAT5 유전자가 변형된 클론 세포주는 연속 희석을 통해 단일 세포를 분리한 후 확장하여 개별 클론을 얻음으로써 수집하였다. 개별 클론을 4℃에서 20분 동안 RIPA 용해 완충액(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)에서 용해시켰다. 용해물을 16,000g에서 10분 간 원심분리하고 상층액 20㎍을 7.5% SDS-PAGE 겔에서 분획하여 니트로셀룰로오스 막으로 옮기고 항-NFAT5 항체로 면역블롯팅하였다. 게놈 DNA는 편집된 클론과 편집되지 않은 대조군 세포에서 분리되었다. NFAT5의 엑손 7은 NFAT5 특이적 PCR 프라이머를 사용하여 PCR 증폭되었다. PCR 산물은 pGEM-T Easy(Promega, Madison, WI, USA)로 복제되었다. 개별적으로 복제된 앰플리콘은 Sanger 시퀀싱(Bioneer, Seoul, Korea)으로 분석되었다. Cas9 녹아웃에 의한 표적 외 효과를 배제하기 위해 음성 대조군 siRNA로 사용되는 NFAT5 또는 AccuTarget Negative Control siRNA(Bioneer, Seoul, Korea)에 대한 역형질감염에 의해 세포를 siRNA로 형질감염시켰다. 요약하면, 총 부피 100 ㎕ 무혈청 배지에 siRNA(100 nM 최종 농도) 및 1.5 ㎕ Lipofectamine® RNAiMAX를 제조 프로토콜에 따라 제조하고 각 웰(6-웰 플레이트)에 첨가하고 37℃, 5% CO₂에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 siRNA를 제거하고 세포를 정상 성장 배지에서 37℃, 5% CO₂에서 24시간 동안 인큐베이션하였다(도 1). 결과를 간단히 요약하자면, cas9-knockout 세포와 siRNA-knockdown 세포 모두에서 NFAT-1, -2, -3까지의 mRNA 변화에는 영향이 없었으며, TNF-α와 IL-1β의 변화도 두 세포에서 유사한 결과를 나타냈다.

6. 정량적 Real-time PCR

총 RNA는 표시된 시점에 세포에서 추출하고 첫 번째 가닥 cDNA 합성 키트(Applied Biosystems, Framingham, MA, USA)에 제공된 무작위 헥사머 프라이머를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 첫 번째 가닥 cDNA를 합성하였다. 모든 프라이머 및 프로브(NFAT5, Cat # Hs00232437 및 GAPDH, Cat # Hs02758991)는 상업적으로 입수하였다(TaqMan® Gene Expression Assay, Applied Biosystems, Waltham, MA, USA). iCycler 열순환기(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)에서 cDNA 합성에 총 RNA(1㎍)를 사용하였다. qPCR은 Light Cycler 480 Ⅱ(Roche Life Science, Indianapolis, IN, USA)에 의해 iQ Sybr Green 슈퍼믹스 키트(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 사용하여 수행되었다. PCR 프라이머는 NCBI 데이터 뱅크에 보고된 cDNA 서열을 기반으로 합성되었다.

7. 웨스턴 블롯 분석

세포를 Halt 포스파타제 억제제 칵테일(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 및 Halt 프로테아제 억제제 칵테일(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)이 보충된 RIPA 용해 완충액에서 용해시키고, 초음파 처리하고, 불용성 파편을 제거하기 위해 4 ℃에서 10분 동안 12,000g에서 원심분리하였다. 세포 용해물의 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트(Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용하여 결정되었다. 전체 세포 용해물을 10% 폴리아크릴아미드 겔에서 SDS-PAGE로 분리하고 니트로셀룰로오스 막(Millipore, Bedford, MA, USA)으로 옮겼다. 5% 무지방 분유로 차단한 후 각 blot은 Bax(sc-493, Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, CA, USA), Bcl-xL(sc-634, Santa Cruz Biotechnology, Inc. , Santa Cruz, CA, USA), Bcl-2(sc-492, Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, CA, USA), RIP1(Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA, USA), phospho-RIP1 (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA), RIP3(Abcam), phospho-RIP3(Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA) 및 β-액틴(Sigma-Aldrich)에 대한 1차 항체와 함께 배양하고, horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit immunoglobulin (Ig)G 또는 anti-mouse IgG(Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA)로 배양하였다. SuperSignal Chemiluminescent Substrate(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 항체 결합을 검출하였다. ChemiDoc Touch Imaging System(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 이미지를 획득하였다. ImageJ 소프트웨어(NIH, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 농도 측정을 수행하였다.

8. DCFDA/H2DCFDA 세포 ROS 분석

세포를 96-웰 세포 배양 플레이트에 2.5 × 10⁵ 세포/웰로 플레이팅하고, 세포를 밤새 부착되도록 하였다. 분석은 DCFDA/H2DCFDA 세포 ROS 분석 키트(ab113851; Abcam, Cambridge, UK)의 프로토콜에 따라 수행되었다. 염색 후, 플레이트는 배지 존재 하에 종말점 모드에서 Ex/Em = 485/535 nm에서 형광 플레이트 판독기(Tecan Systems, Inc., San Jose, CA, USA)에서 즉시 검출되었다.

9. 통계 분석

모든 데이터는 GraphPad Prism 6 소프트웨어(San Diego, CA, USA)를 사용하여 분석되었다. 정량화 가능한 결과는 최소 3개의 독립적인 실험의 평균 ± S.E.M으로 표시하였다. 통계적 유의성은 unpaired two-tailed Student's test 또는 일원 ANOVA 테스트에 이어 Tukey's multiple comparisons test에 의해 결정되었다. p < 0.05인 평가는 유의미한 것으로 간주되었다.

결과

1. 인간 수정체 상피 B-3(HLE-B3) 세포의 생존력에 대한 고삼투압 스트레스의 영향

위상차 현미경으로 형태학적 변화를 조사하였다(도 2A). HLE-B3 세포는 현저한 원형을 나타내었고 배양 기간 및 삼투압 농도가 증가함에 따라 배양 접시에서 결국 분리되었다. 세포는 또한 세포자살(apoptosis)의 전형적인 형태적 특징인 수축(retraction)과 plasma membrane 돌출(blebbing)을 보였다. 요약하면, 삼투압 농도가 증가함에 따라 HLE-B3 세포에서 점진적인 형태학적 변화가 발생하였다. 또한, 고삼투압 스트레스는 대조군 세포와 비교하여 용량 의존적으로 HLE-B3 세포의 생존력 감소를 유도하였다(도 2B).

2. HLE-B3 세포에서 NFAT5 발현에 대한 삼투압 스트레스의 영향

NFAT5 mRNA 수준은 100 또는 150 mOsm/L NaCl을 각각 24시간 동안 일반 배지에 첨가했을 때 유의하게 증가함을 확인하였다(각각 p = 0.0058, p < 0.0001)(도 3A). 또한, NFAT5 단백질 발현 수준은 24시간 동안 100 및 150 mOsm/L NaCl에 노출되었을 때 NM와 비교하여, 각각 2.4배 및 3.2배 증가하였다(각각 p = 0.0445, p = 0.0286, 도 3B,C). hTonE 부위는 NFAT5에 대한 특이적 결합 부위이며 고삼투압 자극에 대한 반응으로 NFAT5 발현의 유도를 모니터링하는 데 사용되었다. 내인성 NFAT5 단백질의 전사 활성을 측정하기 위해 HLE-B3 세포를 hTonEGL3 리포터 구조로 일시적으로 형질감염시키고 고삼투압 스트레스로 자극하였다. hTonE 리포터는 NaCl로 자극 시 용량 의존적으로 크게 활성화되었다(도 3D).

3. HLE-B3 세포에서 NFAT5 녹아웃 세포 생산 및 고삼투압 스트레스 후 세포 생존의 변화

고삼투압 스트레스에 노출된 HLEC에서 NFAT5의 역할을 결정하기 위해 HLE-B3 세포에서 NFAT5를 녹아웃하기 위해 CRISPR(Clustered, regular interspaced, short, palindromic repeats) RNA 유도 Cas9 뉴클레아제를 사용하였다. 타겟 영역의 Sanger 시퀀싱은 도 4A에 나타내었다. 먼저 Cas9 뉴클레아제(HLE-B3-Cas9)를 구성적으로 발현하는 세포주를 확립하였다. HLE-B3-Cas9 세포는 NFAT5 유전자의 7번째 엑손을 표적으로 하는 단일 가이드 RNA로 일시적으로 형질감염된 다음 클론 확장을 위해 96-웰 플레이트에 단일 세포로 시딩되었다(도 4B). 일부 클론은 웨스턴 블롯 분석을 기반으로 하는 야생형 대조군 세포(NFAT5 WT)와 비교하여 NFAT5 발현(NFAT5 KO)의 완전한 부재를 보여주었다(도 4C). NFAT5의 부재를 확인하기 위해 루시퍼라제 리포터 분석을 수행하였다. NFAT5의 전사 기능은 NFAT5 KO 세포에서 폐지되었다(도 4D, 4E). 다음으로, 우리는 고삼투압 스트레스에 대한 세포 생존력의 변화를 조사하였다. 위상차 현미경으로 형태학적 변화를 조사하였다. NFAT5 KO 세포는 배양 기간 및 삼투압 농도가 증가함에 따라 현저한 원형을 나타내고, 결국 배양 접시에서 분리되었다. 더욱이, 고삼투압 스트레스(24시간 및 48시간 동안 +150 mOsm/L NaCl)는 NFAT5 WT 세포보다 NFAT5 KO 세포에서 더 큰 정도로 세포 사멸을 유도하였다(도 5 및 6).

4. HLE-B3 세포의 세포 주기에 대한 고삼투압 스트레스의 영향

S 단계의 세포 비율은 NFAT5 WT 및 KO 세포에서 24시간 동안 150mOsm/L NaCl의 삼투압 농도를 갖는 배지에서 배양 시 유의하게 감소했지만 48시간 동안 유의하게 감소하지 않았다. 한편, sub-G1기의 세포 비율은 두 그룹에서 24시간 및 48시간 동안 150mOsm/L NaCl의 삼투압 농도를 갖는 배지에서 배양 시 유의하게 증가하였다. 특히, NFAT5 KO 세포의 sub-G1 비율은 WT 세포에 비해 24시간 및 48시간에 약 2배 이상 증가하였다(도 7 및 8).

5. 수정체 상피 세포의 고삼투압 스트레스로 인한 죽음의 특성화

NFAT5 KO 및 WT 세포주를 사용하여 HLE-B3 세포의 고삼투압 스트레스 유도 사멸에 대한 NFAT5의 역할을 조사하였다. 고삼투압 스트레스에 노출된 두 세포주의 생존력은 스트레스를 받지 않은 대조군 세포보다 현저히 낮았다. 예상대로 NFAT5 KO 세포는 NFAT5 WT 세포보다 삼투압 스트레스에 더 민감하였다(도 9A). caspase 억제제인 z-VAD-fmk 전처리는 NFAT5 WT 세포와 NFAT5 KO 세포의 고삼투압 스트레스 매개 생존율 감소를 유의하게 약화시켰지만 z-VAD 처리 효과는 두 그룹 사이에 차이가 없었다(도 9A). 다음으로, 고삼투압 스트레스가 NFAT5 WT 세포의 세포자살을 유도하는 메커니즘을 조사하기 위해 Bax, Bcl-2 및 Bcl-xl을 포함한 Bcl-2 계열 구성원의 내인성 발현을 조사하였다. 정량적 PCR 및 웨스턴 블롯 분석은 NFAT5 WT 및 NFAT5 KO 세포에서 48시간 동안 고삼투압 스트레스(+150 mOsm/L NaCl) 후 항-세포자살 Bcl-2 및 Bcl-xl 발현이 감소되었음을 보여주었다(도 9B-F). 그러나 두 그룹 사이의 pro-apoptotic 및 anti-apoptotic 마커의 이러한 변화는 통계적으로 유의하지 않았다(도 9B-F).

그런 다음, NFAT5 KO 및 WT 세포의 고삼투압 스트레스 유도 사멸에 대한 특이적인 괴사 억제제인 necrostatin-1(NEC)의 효과를 조사하였다. NEC 전처리는 NFAT5 KO 세포의 고삼투압 스트레스 유도 사멸을 유의하게 차단했지만 NFAT5 WT 세포는 유의하게 차단하지 않았다(도 10). 세포 괴사의 시작은 수용체 상호작용 단백질 키나아제 1(RIP1)과 RIP3가 필요하다. RIP1과 RIP3는 각각 Ser166과 Ser227 잔기의 교차 인산화를 유도한다. 따라서 RIP1과 RIP3의 인산화 상태는 protein kinase 활성과 밀접한 관련이 있다. 세포 괴사의 발생을 확인하기 위해 웨스턴 블롯 분석에 의해 이들 단백질의 발현과 인산화를 감지하였다. RIP1(Ser166) 및 RIP3(Ser227)의 인산화 수준은 WT 세포에 비해 NFAT5 KO 세포에서 상향 조절되었다(도 11).

6. 고장성(Hypertonic) 조건에 노출된 후 qPCR에 의한 염증성 사이토카인의 변화

NFAT5 WT 및 KO 세포주에서 고장성 상태에 24시간 노출 후 qPCR에 의해 염증성 사이토카인의 변화를 측정하였다(도 12). WT 세포에서 고삼투압 스트레스에 노출되었을 때, TNF-α, IL-1α, IL-1β 및 IL-6에서 통계적으로 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 또한, WT 세포에 비해 KO 세포의 정상 배지에서 TNF-α, IL-β 및 IL-6의 mRNA 수준이 증가하여 NFAT5가 염증 유도에 일정한 역할을 함을 알 수 있었다. 또한, NFAT5 KO 세포주에서 고장성 상태에 노출될 때 IL-1α 및 IL-1β가 증가하는 것으로 확인되었다.

Claims

NFAT5(Nuclear Factor of Activated T Cells 5) mRNA 또는 단백질의 발현을 증가시키는 물질을 포함하는 백내장 예방 또는 치료용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 물질은 핵산, 뉴클레오티드, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 당, 지질 또는 화합물인, 백내장 예방 또는 치료용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 백내장은 고삼투압 스트레스로 유발된 것인, 백내장 예방 또는 치료용 조성물.
개체로부터 분리된 시료에 후보물질을 처리하여, 상기 시료의 NFAT5(Nuclear Factor of Activated T Cell)의 발현을 대조군 대비 증가시키는

후보물질을 선별하는 단계;를 포함하는 백내장 치료제 스크리닝 방법.
청구항 4에 있어서, 상기 시료는 수정체 상피세포인, 백내장 치료제 스크리닝 방법.
청구항 4에 있어서, 상기 물질은 핵산, 뉴클레오티드, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 당, 지질 또는 화합물인, 백내장 치료제 스크리닝 방법.
청구항 4에 있어서, 상기 백내장은 고삼투압 스트레스로 유발된 것인, 백내장 치료제 스크리닝 방법.