WO2019124601A1 - NFAT5 및 NF-kB의 결합 억제제를 유효성분으로 포함하는 백내장 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

NFAT5 및 NF-kB의 결합 억제제를 유효성분으로 포함하는 백내장 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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김성재
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경상대학교병원
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing or treating cataracts comprising an inhibitor of binding of NFAT5 (Nuclear Factor of Activated T Cells 5) and NF-kB (Nuclear Factor-Kappa B) as an active ingredient.
  • NFAT5 Nuclear Factor of Activated T Cells 5
  • NF-kB Nuclear Factor-Kappa B
  • UV ultraviolet
  • NF- ⁇ B transcription factor signaling systems are important regulators in a variety of physiological processes.
  • NF- ⁇ B works by binding to ⁇ B-sequence elements present in hundreds of genes involved in inflammation, immunity, cell proliferation, differentiation, and apoptosis. When stimulated, NF- ⁇ B travels into the nucleus, where target genes that contribute to several important cellular events are transcribed.
  • NF- ⁇ B function depends on the cell type, the nature of active stimulation, and the integrative relationship between NF- ⁇ B signaling and other signaling pathways.
  • UV irradiation in human lens epithelial cells regulates NF- ⁇ B activation, induces NADPH oxidase-mediated reactive oxygen species (ROS) generation, and matrix metalloprotein Ruthenanase upregulation induces HLEC migration.
  • ROS reactive oxygen species
  • matrix metalloprotein Ruthenanase upregulation induces HLEC migration.
  • the cell signaling mechanism after UV-induced NF- ⁇ B activation is still unknown.
  • Nuclear factor 5 of activated T-cells belongs to the signal transcription factor Rel / NF- ⁇ B / NFAT family.
  • the function of NFAT5 is well known in the kidney as a protective factor against hypertonic stress, but many other functions of NFAT5 are still under investigation.
  • NFAT5 is widely expressed in a variety of cell and tissue forms, there have been few reports of NFAT5 expression and function in HLECs until recently.
  • Another object of the present invention is to provide a method for screening therapeutic agents for cataracts, which comprises the step of screening candidate drugs that inhibit the binding of NFAT5 and NF-kB.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cataracts comprising an inhibitor of binding of NFAT5 and NF-kB as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method for treating cancer, comprising the steps of: treating a candidate drug with ultraviolet light-exposed human lens epithelial cells (HLECs); Measuring the degree of binding of NFAT5 and NF-kB in the candidate drug-treated HLECs; And selecting a candidate drug having a reduced degree of NFAT5 and NF-kB binding as compared to a control sample.
  • HLECs ultraviolet light-exposed human lens epithelial cells
  • the present invention relates to a composition for preventing or treating cataracts comprising an inhibitor of binding of NFAT5 (Nuclear Factor of Activated T Cells 5) and NF-kB (Nuclear Factor-Kappa B) as an active ingredient.
  • NFAT5 Nuclear Factor of Activated T Cells 5
  • NF-kB Nuclear Factor-Kappa B
  • Figure 1 shows cell viability and ROS production of HLE-B3 cells after UVB irradiation (actual magnification, x 100).
  • HLE-B3 cells exhibited a typical picture of a HLE-B3 cells were confirmed to treatment by increasing the UVB (5, 10, 15, 20, 30 and 40 mJ / cm 2), using a phase contrast microscope.
  • B The effect of UVB irradiation on mitochondrial dehydrogenase activity in HLE-B3 cells was determined by CCK-8 assay. The viability of the control (untreated) cells was determined as 100%, and the viability of the control cells was shown. Data are expressed as a percentage (mean ⁇ SD) for untreated control cells.
  • C HLE-B3 cells were treated as indicated by UVB and cultured for 8 hours. ROS production was confirmed by measuring oxidized DCF fluorescence (au, arbitrary units). ** p ⁇ 0.01 versus control.
  • Fig. 2 shows the results of qPCR analysis of NFAT5 after UVB irradiation.
  • A HLE-B3 cells were treated with increasing UVB (5, 10, 15 and 20 mJ / cm 2 ) and RT-qPCR was used to confirm the mRNA level of NFAT5.
  • B HLE-B3 cells were treated with UVB at 10 mJ / cm 2 and mRNA levels of NFAT5 were confirmed at various time points using RT-qPCR. The RT-qPCR results were expressed as mean ⁇ SD for at least three independent experiments. * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01 versus control.
  • FIG. 3 shows that UVB irradiation increases the protein expression levels of NFAT5 and a-SMA in HLE-B3 cells.
  • A, C, E HLE-B3 cells were treated by irradiation with the indicated UVB and incubated for the indicated times. Cell lysates were prepared and analyzed by immunoblotting with labeled antibodies. ⁇ -actin was used as a control for the loading protein.
  • B, D concentrations were measured by ImageJ software. Relative NFAT5 and phosphorylated NF- ⁇ B (p-NF- ⁇ B) band intensities were standardized for ⁇ -actin and quantified as control. The levels of NFAT5 and phosphorylated NF- ⁇ B were measured using Student's t-test and expressed as mean ⁇ SD. * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01 versus control.
  • FIG. 4 shows that UVB irradiation induces Nuclear-cytoplasmic potentials of NFAT5 and NF-KB in HLE-B3 cells.
  • HLE-B3 cells were irradiated with UVB (10 mJ / cm 2 ) for 8 hours and cytoplasmic and nuclear fractions were harvested.
  • NFAT5 and NF- ⁇ B p65 protein levels were measured by Western blotting.
  • Alpha-tubulin or lamin A / C levels were used as either cytoplasmic or nuclear loading controls, respectively.
  • the band intensities of NFAT5 and NF- ⁇ B p65 were quantified using ImageJ and normalized to ⁇ -tubulin and lamin A / C loading controls for cytoplasm and nucleus, respectively.
  • (C) Immunofluorescence analysis of UVB-mediated NFAT5 and NF- ⁇ B p65 nuclear potentials. A HLE-B3 cells indicated time intervals were exposed to 10 mJ / cm 2 UVB. NFAT5 and NF- ⁇ B p65 were probed with primary anti-NFAT5 and anti-NF- ⁇ B p65 antibodies, respectively, and visualized with a goat anti-mouse FITC and a goat anti-rabbit TRITC-conjugated secondary antibody, respectively. Nuclei were stained with DAPI. Images were displayed using confocal fluorescence microscopy. scale bar 10 ⁇ m.
  • Figure 5 shows that NFAT5 co-locates and interacts with NF-kB in the nucleus.
  • HLE-B3 cells were cultured for 8 hours after UVB irradiation. Cell lysates were obtained and immunoprecipitated with anti-NFTA5 antibody. Immunoprecipitated proteins were analyzed by Western blotting with anti-NF- ⁇ B antibody.
  • B Concentration measurements were performed with ImageJ software and quantitative results were shown. Data were expressed as mean ( ⁇ SD) of 3 replicate experiments. ** p ⁇ 0.01 versus control.
  • C Nuclear extracts of HLE-B3 cells were co-immunoprecipitated with anti-NFAT5 (5 ⁇ g) antibody. The precipitated proteins were separated by 10% SDS-PAGE and analyzed by Western blot with anti-NF- ⁇ B antibody.
  • the present inventors examined the relationship between NFAT5 and NF-kB by confirming the expression, intracellular location and direct interaction of NFAT5 and NF-kB in UV-irradiated HLECs. In other words, we tried to elucidate the precise role of the molecules in the development of cataracts and to derive a new strategy for preventing cataracts.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cataracts comprising an inhibitor of binding of NFAT5 and NF-kB as an active ingredient.
  • the binding inhibitor is selected from the group consisting of an antisense nucleotide, a small interfering RNA (siRNA), a short hairpin RNA (shRNA), a compound, a peptide, a peptide mimetic , An aptamer, an antibody, or a natural product.
  • siRNA small interfering RNA
  • shRNA short hairpin RNA
  • a compound a compound, a peptide, a peptide mimetic , An aptamer, an antibody, or a natural product.
  • the cataract may be by UVB exposure, but is not so limited.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a chemical substance, a nucleotide, an antisense, an siRNA oligonucleotide and a natural product extract as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition or combination preparation of the present invention may be prepared by using pharmaceutically acceptable and physiologically acceptable adjuvants in addition to the active ingredients.
  • the adjuvants include excipients, disintegrants, sweeteners, binders, coating agents, swelling agents, lubricants , A lubricant or a flavoring agent may be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated into a pharmaceutical composition containing at least one pharmaceutically acceptable carrier in addition to the active ingredient for administration.
  • Acceptable pharmaceutical carriers for compositions that are formulated into a liquid solution include sterile water and sterile water suitable for the living body such as saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, One or more of these components may be mixed and used. If necessary, other conventional additives such as an antioxidant, a buffer, and a bacteriostatic agent may be added. In addition, diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants may be additionally added to formulate into injectable solutions, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • compositions of the present invention may be granules, powders, coated tablets, tablets, capsules, suppositories, syrups, juices, suspensions, emulsions, suspending agents or injectable solutions or suspensions .
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may be formulated and administered in a conventional manner via intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, intrasternal, percutaneous, intranasal, inhalation, topical, rectal, ≪ / RTI >
  • the effective amount of the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention means the amount required for prevention or treatment of the disease.
  • the present invention is not limited to the particular type of the disease, the severity of the disease, the kind and amount of the active ingredient and other ingredients contained in the composition, the type of formulation and the patient's age, body weight, general health status, sex and diet, Rate of administration, duration of treatment, concurrent medication, and the like.
  • the composition of the present invention may be administered at a dose of 0.1 ng / kg to 10 g / kg when administered once to several times a day
  • 0.1 ng / kg to 10 g / kg antisense nucleotide, siRNA, shRNAi or miRNA can be administered at a dose of 0.01 ng / kg to 10 g / kg.
  • the present invention also provides a method for treating cancer, comprising the steps of: treating a candidate drug with ultraviolet light-exposed human lens epithelial cells (HLECs); Measuring the degree of binding of NFAT5 and NF-kB in the candidate drug-treated HLECs; And selecting a candidate drug having a reduced degree of NFAT5 and NF-kB binding as compared to a control sample.
  • HLECs ultraviolet light-exposed human lens epithelial cells
  • the degree of binding of NFAT5 and NF-kB can be measured by Immunoprecipitation and Immunoblotting, but is not limited thereto.
  • the ultraviolet light may be UVB, but is not limited thereto.
  • sample drug used in referring to the screening method of the present invention is used to determine whether it affects the expression level of a gene, affects protein expression or activity, or affects binding between proteins Quot; means an unknown candidate substance used in screening.
  • samples include, but are not limited to, chemicals, nucleotides, antisense-RNA, siRNA (small interference RNA) and natural extracts.
  • HLE-B3 cells Human lens epithelial B-3 (HLE-B3) cells, an HLEC cell line immortalized by SV-40 viral transformation, were purchased from the American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, Md.). Fetal bovine serum (FBS) and Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) were purchased from Gibco BRL (Grand Island, NY).
  • FBS Fetal bovine serum
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • HLE-B3 cells were maintained in DMEM supplemented with 20% FBS and 1% antimicrobial solution (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) at 37 ° C with atmospheric composition consisting of 5% CO 2 /95% O 2 . Before the experiment, all cultures used in the assays below were cultured in 60-80% confluence and maintained overnight in serum-free conditions in DMEM.
  • UV irradiation was performed using a CL-1000M UV lamp (UVP, Upland, CA) and observed with a UVX radiometer.
  • the final major UVB wavelength range was 290-320 nm and the emission peak was recorded at 302 nm.
  • HLEB-3 cells were washed twice with phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4. Cells were initially irradiated for several seconds (total energy, 5, 10, 15, 20, 30 and 40 mJ / cm 2, respectively ). After UVB treatment, the cells were rinsed twice with warm PBS and the growth medium was changed. The cells were then further incubated for 24 hours. Finally, a fixed total energy of 10 mJ / cm < 2 > was used for all subsequent experiments.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • HLE-B3 cells were inoculated in 24-well plates at a concentration of 5 ⁇ 10 4 cells per well, and cultured for 24 hours. The next day, the cells were exposed to UVB. After 24 hours of irradiation, cell viability was analyzed using Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan). Briefly, 10 ⁇ l of CCK-8 solution per well was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour under 5% CO 2 wet atmospheric conditions. The amount of formazan dye produced by intracellular dehydrogenase activity was determined by measuring at 450 nm absorbance using a microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, Calif.). Cells were observed with an inverted-phase microscope (Nikon, Tokyo, Japan) in order to determine the phenotypic difference between irradiated and untreated control cells during exposure to varying amounts of UVB.
  • ROS reactive oxygen species
  • Intracellular ROS generation was measured using the DCFDA Cellular ROS detection Assay Kit (Abcam, Cambridge, Mass.) According to the manufacturer's instructions. Briefly, HLE-B3 cells were inoculated in a 96-well microplate in 2.5 ⁇ 10 4 cells per well, and was allowed to attach overnight. The cells were washed and reacted with 20 ⁇ M DCFDA at 37 ° C for 45 minutes. After the reaction, the dye-implanted cells were rinsed with serum-free DMEM and processed according to the experimental conditions described. Fluorescence signals were recorded at excitation wavelength 485 nm / emission wavelength 535 nm (GloMax Multi Detection System; Promega, Madison, Wis.). Fluorescence intensity was expressed as relative value (arbitrary unit). Untreated cells were used as controls to measure fluorescence background.
  • ViiA TM 7 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) was used and incubated at 50 ° C. for 2 min; 95 [deg.] C, 10 min; 40 cycles at 94 ° C for 15 s; And 60 [deg.] C for 1 min. GAPDH was used as an internal control. All experiments were repeated three times.
  • Nuclear and cytoplasmic fractions were prepared using NE-PER Reagent (Pierce, Rockford, Ill.) According to the manufacturer's instructions. Briefly, cells were harvested with trypsin-EDTA (Mediatech) and spun at 500 g for 3 min. Cell pellets were resuspended in cytoplasmic extraction reagents (CERI and CERII), mixed rapidly and centrifuged at 16000 g for 5 min at 4 ° C. The cytoplasmic protein fraction was recovered from the supernatant. The pellet was resuspended in a nuclear extraction buffer (NER) at a rapid rate for 40 minutes and the sample was centrifuged at 16000 g for 10 minutes at 4 ° C. The nuclear protein was isolated from the supernatant fraction.
  • NER nuclear extraction buffer
  • Protein concentrations of nuclear and cytoplasmic fractions were determined using BCA analysis.
  • the cytoplasmic and nuclear proteins or whole cell lysates were separated by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) on a 10% polyacrylamide gel and transferred to a nitrocellulose membrane (Millipore, Bedford, MA). (Sigma, St.
  • Cells were seeded onto fresh DMEM / 20% FBS at a density of 5 ⁇ 10 5 cells / ml on 60-mm plates and cultured for 24 hours in 5% CO 2 /95% O 2 environment. Cells were cultured in 60-80% confluence, serum-deficient overnight in DMEM before UVB irradiation, and collected after 8 hours of UVB exposure. Cells were fixed with 4% (w / v) paraformaldehyde for 30 minutes and then permeabilized with phosphate buffered saline containing 0.1% Triton X-100 for 10 minutes at room temperature. Cells were then blocked with 2% normal goat serum in PBS for 1 hour and reacted with relevant primary antibodies for 2 hours.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • TRITC tetramethylrhodamine-5-isothiocyanate
  • NF- ⁇ B p65 and NFAT5 were detected specifically by Western blot using the indicated primary antibody.
  • the nuclear protein was incubated with the above-mentioned primary antibody (5 ⁇ g anti-NFAT5) and 50 ⁇ l protein A / G PLUS-Agarose (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) (Tube Tumbler Rotating Mixer SBS550-2; Select BioProducts, Edison, NJ, USA) at 4 ° C for 2 hours. Normal mouse serum was used as a control. After centrifugation at 5000 x g for 10 minutes at 4 ° C, the co-immunoprecipitated proteins were washed 3 times with PBS. Immunoprecipitated proteins were separated by SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose membranes, and detected by Western blot analysis.
  • UVB-exposed HLE-B3 cells showed a dose-dependent reduction in cell viability as compared to non-irradiated control cells (FIG. 1B).
  • ROS reactive oxygen species
  • NFAT5 mRNA expression was significantly increased (P ⁇ 0.05, P ⁇ 0.01; FIG. 2A) after 24 hours of irradiation with 5 and 10 mJ / cm 2 of UVB compared to unirradiated.
  • NFAT5 expression was significantly increased (P ⁇ 0.05, P ⁇ 0.01; FIG. 2A) after 24 hours of irradiation with 5 and 10 mJ / cm 2 of UVB compared to unirradiated.
  • NFAT5 expression was significantly increased (P ⁇ 0.05, P ⁇ 0.01; FIG. 2A) after 24 hours of irradiation with 5 and 10 mJ / cm 2 of UVB compared to unirradiated.
  • NFAT5 expression was significantly increased (P ⁇ 0.05, P ⁇ 0.01; FIG. 2A) after 24 hours of irradiation with 5 and 10 mJ / cm 2 of UVB compared to unirradiated.
  • NFAT5 expression was significantly increased (P ⁇ 0.05, P
  • UVB activates oxidative pathways that are associated with the development of reactive oxygen species (ROS), which in turn activate the nuclear factor kappa-B (NF-excellentB). Therefore, the present inventors confirmed the effect of UVB on NF-kB activation in UVB-irradiated HLE-B3 cells.
  • ROS reactive oxygen species
  • NF- ⁇ B phosphorylation was increased after 4 hours of treatment (FIGS. 3C and 3D).
  • HLE-B3 cells irradiated with 10 mJ / cm 2 of UVB were harvested 1 to 16 hours after treatment, and EMT mesenchymal cell markers ⁇ -SMA Protein levels were determined by Western blot analysis (Fig. 3E top panel).
  • Fig. 3E top panel EMT mesenchymal cell markers ⁇ -SMA Protein levels
  • UVB irradiation showed a biphasic response to ⁇ -SMA expression, with maximal expression at 10 mJ / cm 2 of UVB, followed by higher doses of UVB (15 and 20 mJ / cm 2 ) Showed low reactivity.
  • the present inventors have UVB (10 mJ / cm 2) 8 hours after the exposure by performing the Western blot analysis and immunofluorescence analysis of cytoplasmic and nuclear fractions, and NFAT5 UVB- induction of NF- ⁇ B The translocation was measured. As shown in Fig. 4A, NFAT5 and NF-kB were displaced to the nucleus in response to UVB irradiation. The relative intensity of the bands was normalized by two loading controls ( ⁇ -tubulin and lamin A / C). Nuclear expression of NFAT5 and NF- ⁇ B p65 proteins in UVB-treated HLE-B3 cells was significantly increased compared to non-irradiated controls (FIG. 4B).
  • NFAT5 The intracellular distribution of NFAT5 in UVB-irradiated HLE-B3 cells was determined by immunofluorescence staining. Immunocytochemical analysis of non-irradiated cells revealed that NFAT5 was present in both cytoplasm and nucleus. However, UVB-irradiated HLE-B3 cells increased NFAT5 and NF- ⁇ B levels in the nucleus in a time-dependent manner (FIG. 4C).
  • NFAT5 interacts with the NF- ⁇ B protein.
  • Simultaneous immunoprecipitation experiments show that endogenous NFAT5 binds NF- ⁇ B (FIGS. 5A and 5B).
  • NF- ⁇ B was predominantly located in the cytoplasm and only a very low level of NF- ⁇ B p65 was detected in the nucleus (FIG. 4). Since NF- ⁇ B is intensively present in the cytoplasm until activated and translocated to the nucleus, we believe that if NF- ⁇ B binds to NFAT5 in UVB-irradiated cells, NF- ⁇ B may form a complex with NFAT5 .
  • NFAT5 is immunoprecipitated from nuclear extracts of UVB-irradiated cells and binds to NF- ⁇ B p65 in the nucleus (FIG. 5C).

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Abstract

본 발명은 NFAT5(Nuclear Factor of Activated T Cells 5) 및 NF-kB(Nuclear Factor-Kappa B)의 결합 억제제를 유효성분으로 포함하는 백내장 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명자들은 UV-조사된 HLECs에서의 NFAT5 및 NF-κB의 발현, 세포 내 위치 및 직접적인 상호작용에 대해 확인함으로써, NFAT5 및 NF-κB 간의 상관관계를 조사하였다. 즉, 백내장 발병에 있어 상기 분자들의 정확한 역할을 확인하여, 백내장을 예방하고 치료하는데 유용한 치료전략이 될 수 있을 것으로 예상된다.

Description

NFAT5 및 NF-kB의 결합 억제제를 유효성분으로 포함하는 백내장 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 NFAT5(Nuclear Factor of Activated T Cells 5) 및 NF-kB(Nuclear Factor-Kappa B)의 결합 억제제를 유효성분으로 포함하는 백내장 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
백내장은 수정체에 발병하는 흔한 질병으로, 전세계적으로 가역적인 시각 상실의 원인이 되고 있다. 백내장 발병에 대한 병리생리학을 이해하는 것은 현재 의학 지식을 발전시킬 뿐만 아니라, 공중 보건의 목적을 위해서도 중요하다. 백내장 발병에 영향을 미치는 다양한 인자들 중에서, 자외선(ultraviolet; UV) 노출이 많은 관심을 받고 있는데, 이는 수정체가 자외선 복사 에너지로부터의 산화적 손상이 축적되는 사이트로 여겨지기 때문이다. 보고된 바에 따르면, 역학 조사 및 실험 연구에서 UVB 조사가 백내장의 진행과 가장 관련성이 높은 인자로 알려졌다. 하지만, UVB 노출된 수정체에서 백내장 발병을 유도하는 세포적 과정에 대해서는 잘 알려지지 않았다.
핵 인자-카파 B(nuclear factor-kappa B; NF-κB) 전사 인자 신호전달 시스템은 다양한 생리학적 과정에 있어 중요한 조절자이다. NF-κB는 염증, 면역, 세포 증식, 분화 및 세포사멸과 관련된 수백 개의 유전자들에 존재하는 κB-서열 요소에 결합하므로서 효과를 나타낸다. 자극하면, NF-κB는 핵 내로 이동하는데, 여기에서 여러 중요한 세포적 사건에 기여하는 표적 유전자들을 전사시킨다. NF-κB 기능은 세포 형태, 활성 자극의 특성 및 NF-κB 신호전달과 다른 신호전달 경로 간의 통합적인 관계에 따라 달라진다. 최근 연구에 따르면, 인간 수정체 상피세포(human lens epithelial cells; HLECs)에서의 UV 조사는 NF-κB 활성화를 조절하고, NADPH 산화효소-매개 활성산소종(reactive oxygen species; ROS) 발생 및 매트릭스 메탈로프로테이나제 상향조절을 통해 HLEC 이동을 유도하는 것으로 나타났다. 하지만, UV-유도된 NF-κB 활성화 후의 세포 신호전달 기작은 여전히 알려지지 않았다.
활성화된 T-세포의 핵 인자 5(Nuclear factor of activated T cells 5; NFAT5)는 신호 전사 인자인 Rel/NF-κB/NFAT 패밀리에 속한다. NFAT5의 기능은 고장성(hypertonic) 스트레스에 대한 보호 인자로서, 신장에서 잘 알려져 있으나, 이의 다른 여러 기능에 대해서는 여전히 연구 중에 있다. NFAT5는 다양한 세포 및 조직 형태에서 폭넓게 발현되지만, HLECs에서의 NFAT5 발현 및 기능에 대한 보고는 최근까지도 거의 없었다.
본 발명의 목적은 NFAT5 및 NF-kB의 결합 억제제를 유효성분으로 포함하는 백내장 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 NFAT5 및 NF-kB의 결합을 억제하는 후보약물을 선별하는 단계를 포함하는 백내장 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명은 NFAT5 및 NF-kB의 결합 억제제를 유효성분으로 포함하는 백내장 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 자외선 노출된 수정체 상피세포(human lens epithelial cells; HLECs)에 후보약물을 처리하는 단계; 상기 후보약물이 처리된 HLECs에서 NFAT5 및 NF-kB 결합 정도를 측정하는 단계; 및 대조군 시료와 비교하여 상기 NFAT5 및 NF-kB 결합 정도가 감소한 후보약물을 선별하는 단계를 포함하는 백내장 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 NFAT5(Nuclear Factor of Activated T Cells 5) 및 NF-kB(Nuclear Factor-Kappa B)의 결합 억제제를 유효성분으로 포함하는 백내장 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명자들은 UV-조사된 HLECs에서의 NFAT5 및 NF-κB의 발현, 세포 내 위치 및 직접적인 상호작용에 대해 확인함으로써, NFAT5 및 NF-κB 간의 상관관계를 조사하였다. 즉, 백내장 발병에 있어 상기 분자들의 정확한 역할을 확인하여, 백내장을 예방하고 치료하는데 유용한 치료전략이 될 수 있을 것으로 예상된다.
도 1은 UVB 조사 후, HLE-B3 세포의 세포 생존능 및 ROS 생산을 나타낸다(실제 배율, ×100). (A) HLE-B3 세포는 UVB (5, 10, 15, 20, 30 및 40 mJ/cm2)를 증가시켜 처리하였고, 위상차 현미경을 사용하여 확인한 HLE-B3 세포의 대표적인 사진을 나타냈다. (B) UVB 조사가 HLE-B3 세포에서 미토콘드리아 디하이드로게나제 활성에 미치는 영향을 CCK-8 분석을 통해 측정하였다. 대조군(미처리) 세포의 생존능을 100%로 하였고, 대조군에 대한 생존능을 표시하였다. 데이터는 미처리 대조군 세포에 대한 백분율(mean ± SD)로서 표시하였다. (C) HLE-B3 세포를 UVB로 표시된 바와 같이 처리하였고, 8시간 동안 배양하였다. ROS 생산은 산화된 DCF 형광도(a.u., arbitrary units)를 측정하여 확인하였다. **p < 0.01 versus control.
도 2는 UVB 조사 후, NFAT5의 qPCR 분석 결과를 나타낸다. (A) HLE-B3 세포는 UVB (5, 10, 15 및 20 mJ/cm2)를 증가시켜 처리하였고, RT-qPCR을 이용하여 NFAT5의 mRNA 수준을 확인하였다. (B) HLE-B3 세포는 10 mJ/cm2의 UVB로 처리하였고, RT-qPCR을 이용하여 여러 시점에서 NFAT5의 mRNA 수준을 확인하였다. RT-qPCR 결과는 적어도 3번 이상의 독립적인 실험 결과에 대해 mean ± SD로 표시하였다. *p < 0.05, **p < 0.01 versus control.
도 3은 HLE-B3 세포에서 UVB 조사가 NFAT5 및 α-SMA의 단백질 발현 수준을 증가시킨다는 결과를 나타낸다. (A, C, E) HLE-B3 세포를 표시된 UVB로 조사하여 처리하였고, 표시된 시간동안 배양하였다. 세포 용해물은 준비하였고, 표시된 항체로 면역블랏팅하여 분석하였다. 로딩 단백질에 대한 대조군으로 β-actin을 사용하였다. (B, D) 농도측정은 ImageJ software로 수행하였고, 상대적 NFAT5 및 인산화된 NF-κB (p-NF-κB) 밴드 세기는 β-actin에 대해 표준화하였으며, 대조군을 1로 계산하여 정량화하였다. NFAT5 및 인산화된 NF-κB의 수준은 Student's t-test를 사용하여 측정하였고, mean ± SD로 표시하였다. *p < 0.05, **p < 0.01 versus control.
도 4는 HLE-B3 세포에서 UVB 조사가 NFAT5 및 NF-κB의 핵-세포질 전위를 유도한다는 결과를 나타낸다. (A) HLE-B3 세포는 8시간 동안 UVB(10 mJ/cm2)로 조사하였고, 세포질 및 핵 분획을 수확하였다. NFAT5 및 NF-κB p65 단백질 수준은 웨스턴 블랏팅으로 측정하였다. α-tubulin 또는 lamin A/C 수준은 각각 세포질 또는 핵 로딩 대조군으로 사용되었다. NFAT5 및 NF-κB p65의 밴드 세기는 ImageJ를 사용하여 정량하였고, 세포질 및 핵에 대해서 α-tubulin 및 lamin A/C 로딩 대조군으로 각각 표준화하였다. (B) 핵 내 NFAT5 및 NF-κB p65의 배수 변화는 3번 반복 실험하여 mean ± SD로 표시하였다. (C) UVB-매개 NFAT5 및 NF-κB p65 핵 전위의 면역형광 분석결과를 나타낸다. 표시된 시간 간격으로 HLE-B3 세포를 10 mJ/cm2 UVB에 노출시켰다. NFAT5 및 NF-κB p65는 1차 anti-NFAT5 및 anti-NF-κB p65 항체로 탐침하였고, a goat anti-mouse FITC 및 a goat anti-rabbit TRITC-접합된 2차 항체로 각각 가시화하였다. 핵은 DAPI로 염색하였다. 이미지들은 공초점 형광 현미경을 사용하여 나타냈다. scale bar = 10 μm.
도 5는 핵 내에서 NFAT5가 NF-κB와 동시 위치하고 상호작용한다는 결과를 나타낸다. (A) HLE-B3 세포는 UVB 조사 후, 8시간 동안 배양하였다. 세포 용해물을 얻었고, anti-NFTA5 항체로 면역침전시켰다. 면역침전된 단백질들은 anti-NF-κB 항체로 웨스턴 블랏하여 분석하였다. (B) 농도측정은 ImageJ software로 수행하였고, 정량 결과를 나타냈다. 데이터는 3번 반복 실험의 mean (±S.D.)로 표시하였다. **p < 0.01 versus control. (C) HLE-B3 세포의 핵 추출물은 anti-NFAT5 (5 μg) 항체와 함께 동시-면역침전에 적용하였다. 침전된 단백질들은 10% SDS-PAGE를 통해 분리하였고, anti-NF-κB 항체로 웨스턴 블랏을 통해 분석하였다.
본 발명자들은 UV-조사된 HLECs에서의 NFAT5 및 NF-κB의 발현, 세포 내 위치 및 직접적인 상호작용에 대해 확인함으로써, NFAT5 및 NF-κB 간의 상관관계를 조사하였다. 즉, 백내장 발병에 있어 상기 분자들의 정확한 역할을 확인하여, 백내장을 예방하는데 새로운 전략을 도출하고자 하였다.
본 발명은 NFAT5 및 NF-kB의 결합 억제제를 유효성분으로 포함하는 백내장 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 결합 억제제는 NFAT5 및 NF-kB의 결합을 억제하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA), 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 또는 천연물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 백내장은 UVB 노출에 의한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스, siRNA 올리고뉴클레오타이드 및 천연물 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물 또는 복합 제제는 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대, 성인의 경우, 1일 1회 내지 수회 투여시, 본 발명의 조성물은 1일 1회 내지 수회 투여시, 화합물일 경우 0.1ng/kg~10g/kg, 폴리펩타이드, 단백질 또는 항체일 경우 0.1ng/kg~10g/kg, 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA, shRNAi, miRNA일 경우 0.01ng/kg~10g/kg의 용량으로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 자외선 노출된 수정체 상피세포(human lens epithelial cells; HLECs)에 후보약물을 처리하는 단계; 상기 후보약물이 처리된 HLECs에서 NFAT5 및 NF-kB 결합 정도를 측정하는 단계; 및 대조군 시료와 비교하여 상기 NFAT5 및 NF-kB 결합 정도가 감소한 후보약물을 선별하는 단계를 포함하는 백내장 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 NFAT5 및 NF-kB 결합 정도는 면역침전법(Immunoprecipitation) 및 면역블랏팅(Immunoblotting)으로 측정할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 자외선은 UVB일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 "후보약물"은 유전자의 발현량에 영향을 미치거나, 단백질의 발현 또는 활성에 영향을 미치거나 또는 단백질 사이의 결합에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 후보 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험예>
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 재료
SV-40 바이러스 형질전환에 의해 불멸화된 HLEC 세포주인, 인간 수정체 상피 B-3 (HLE-B3) 세포는 American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD)으로부터 구입하였다. 우태아혈청(Fetal bovine serum; FBS) 및 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)는 Gibco BRL (Grand Island, NY)로부터 구입하였다.
2. 세포 배양
HLE-B3 세포는 20% FBS 및 1% 항균 용액(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)이 첨가된 DMEM에서, 5% CO2/95% O2로 구성된 대기조성으로 37℃에서 유지하였다. 실험 전, 아래 분석에 사용된 모든 배양은 60-80% 컨플루언스(confluence)하게 배양하였고, DMEM에서 무혈청 조건으로 밤새도록 유지하였다.
3. HLE -B3 세포의 UVB 조사
UV 조사는 CL-1000M UV lamp (UVP, Upland, CA)를 사용하여 수행하였고, UVX radiometer로 관측하였다. 최종 주요 UVB 파장 범위는 290-320 nm 였고, 방출 피크는 302 nm에서 기록되었다. UVB 노출 전, HLEB-3 세포는 pH 7.4의 따뜻한 인산 완충 식염수(phosphate-buffered saline; PBS)로 2번 씻어냈다. 세포들은 초기에 수초 동안 조사되었다(전체 에너지, 각각 5, 10, 15, 20, 30 및 40 mJ/cm2). UVB 처리 후, 세포들은 따뜻한 PBS로 2번 씻어냈고, 성장 배지를 교환하였다. 그 후, 세포들을 24시간 동안 추가적으로 배양하였다. 최종적으로, 10 mJ/cm2의 고정된 전체 에너지가 이후 모든 실험에 사용되었다.
4. 세포 생존능 측정
HLE-B3 세포는 웰 당 5 × 104 세포 농도로 24-웰 플레이트에 접종되었고, 24시간 동안 배양하였다. 다음 날, 세포들은 UVB에 노출되었다. 조사 24시간 후, 세포 생존능을 Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)을 이용하여 분석하였다. 간단히 설명하면, 웰 당 10 μl의 CCK-8 용액을 첨가하였고, 5% CO2 습윤 대기 조건하에서, 1시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 세포 내 디하이드로게나제 활성에 의해 발생하는 포르마잔 염료의 양은 microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 이용하여 450 nm의 흡광도에서 측정하여 확인하였다. 다양한 양의 UVB에 노출시키는 동안, 조사된 세포 및 조사되지 않은 대조군 세포 사이의 표현형 차이를 확인하기 위해서, 세포들을 역상 현미경(Nikon, Tokyo, Japan)으로 관측하였다.
5. 세포 내 활성산소종 (reactive oxygen species; ROS )의 측정
세포 내 ROS 발생은 DCFDA Cellular ROS detection Assay Kit (Abcam, Cambridge, MA)를 사용하여, 제조사의 지시에 따라 측정하였다. 간단히 설명하면, HLE-B3 세포는 96-웰 마이크로플레이트에 웰 당 2.5 × 104 세포로 접종하였고, 밤새 부착되도록 하였다. 세포들을 씻어낸 후, 20 μM DCFDA로 37℃에서 45분 동안 반응시켰다. 반응 후, 염료-삽입된 세포들을 무혈청 DMEM으로 씻어냈고, 기재된 실험 조건으로 처리하였다. 형광 신호는 여기 파장 485 nm/방출 파장 535 nm에서 기록하였다(GloMax Multi Detection System; Promega, Madison, WI). 형광 세기는 상대 수치(임의 단위)로 표시하였다. 미처리 세포들은 형광 배경을 측정하기 위한 대조군으로 사용되었다.
6. 정량적 RT-PCT 분석
각각 분화된 골막세포(periosteal cells)로부터 표시된 시간에 따라 전체 RNA를 추출하였고, first-strand cDNA synthesis kit (Applied Biosystems, Framingham, MA, USA)에서 제공한 random hexamer primers을 사용하여 제조사의 지시에 따라 첫번째 가닥 cDNA를 합성하였다. 모든 프라이머 및 탐침 (GAPDH Cat # Hs02758991-g1; NFAT5 Cat # Hs00232437)은 상업적으로 구입하였고(TaqMan® Gene Expression Assay, Applied Biosystems, Framingham, MA, USA), 제조사의 지시에 따라 kit를 사용하여 증폭하였다(TaqMan® Gene Expression Master Mix, Applied Biosystems, Framingham, MA, USA). 증폭은 다음의 조건하에서 수행하였다. 96-웰 플레이트 내에서, ViiA™ 7 Real-Time PCR System (Applied Biosystems)을 사용하였고, 50℃, 2 min; 95℃, 10 min; 40 cycles at 94℃, 15 s; 및 60℃, 1 min으로 수행하였다. GAPDH는 내부 대조군으로 사용하였다. 모든 실험은 3번 반복하여 수행하였다.
7. 핵 및 세포질 추출물 제조 및 웨스턴 블랏 분석
핵 및 세포질 분획은 NE-PER Reagent (Pierce, Rockford, IL)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 제조하였다. 간단히 설명하면, 세포들은 trypsin-EDTA (Mediatech)로 수확하였고, 500 g로 3분 동안 회전시켰다. 세포 펠렛은 세포질 추출 시약(cytoplasmic extraction reagents; CERI 및 CERII)으로 재현탁시켰고, 빠른 속도로 혼합하였으며, 16000 g로 4℃에서 5분 동안 원심분리하였다. 세포질 단백질 분획을 상등 분획으로부터 회수하였다. 펠렛은 핵 추출 완충액(nuclear extraction buffer; NER)에서 40분 동안 빠른 속도로 혼합하여 재현탁시켰고, 샘플은 16000 g로 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 상등 분획으로부터 핵 단백질을 분리하였다. 핵 및 세포질 분획의 단백질 농도는 BCA 분석을 사용하여 측정하였다. 세포질 및 핵 단백질, 또는 전체 세포 용해물은 10% 폴리아크릴아미드 젤에서 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis; SDS-PAGE)으로 분리하였고, 니트로셀룰로스 멤브레인(Millipore, Bedford, MA)으로 옮겼다. NF-κB p65, phosphor-NF-κB, NFAT5, lamin A/C (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), β-actin, α-tubulin (Sigma, St. Louis, MO) 및 α-SMA (Abcam, Cambridge, MA)에 대한 1차 항체들과 함께 멤브레인을 반응시킨 후, 겨자무 퍼록시다제-접합된 anti-rabbit immunoglobulin (Ig) G 또는 anti-mouse IgG (Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA)로 반응시켰다. 항체 결합은 enhanced chemiluminescence Western blotting detection reagents (Amersham, Pittsburgh, PA)를 이용하여 검출하였다. 이미지는 ChemiDoc Touch Imaging System (Bio-Rad, Hercules, CA)으로 얻었으며, 농도측정은 ImageJ software (NIH, Bethesda, MD, USA)로 수행하였다.
8. 면역세포화학( Immunocytochemistry )
세포들을 60-mm 플레이트 상에 5 × 105 cells/ml의 밀도로 새로운 DMEM/20% FBS에 접종하였고, 5% CO2/95% O2 환경에서 24시간 동안 배양하였다. 세포들을 60-80% 컨플루언스(confluence)하게 배양한 후, UVB 조사 전에 DMEM에서 밤새도록 혈청-결핍시켰고, UVB 노출 8시간 후 수집하였다. 세포들을 4% (w/v) 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 30분 동안 고정시킨 후, 0.1% Triton X-100이 함유된 인산 완충된 식염수로 상온에서 10분 동안 투과시켰다. 그 후, 세포들을 PBS에 녹인 2% 정상 염소 혈청으로 1시간 동안 차단시켰고, 관련 1차 항체들로 2시간 동안 반응시켰다. PBS에서 씻어낸 후, 세포들을 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate; FITC)-접합된 goat anti-mouse IgG goat 항체 또는 테트라메틸로다민-5-이소티오시아네이트(tetramethylrhodamine-5-isothiocyanate; TRITC)-접합된 2차 anti-rabbit IgG goat 항체와 함께 추가적으로 반응시켰다. 형광 이미지들은 confocal microscope system (FV1000, Olympus)을 이용하여 488/520 nm (FITC) 또는 543/570 nm (TRITC)의 여기/방출 파장에서 얻어냈다. 세포 핵은 DAPI로 대비염색하였다.
9. 면역침전법
세포들을 100-mm 직경 배양 접시에서 배양하였고, 균질화 완충액에서 용해시켰다. 그 후, 용해물을 10 μl mouse anti-NFAT5 IgG 또는 rabbit anti-NF-κB p65 IgG로 4℃에서 밤새도록 반응시켰다. 단백질 A-아가로스 비드로 1시간 동안 반응시킨 후, 면역침전물을 Laemmli 완충액에서 재현탁시켰고, 이를 10% 폴리아크릴아미드 젤 전기영동에 적용하였으며, 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮겼다. NF-κB p65 및 NFAT5는 표시된 1차 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 통해 특이적으로 검출되었다. 핵에서 NFAT5 및 NF-κB 사이의 결합을 측정하기 위해, 핵 단백질은 상기 언급된 1차 항체 (5 μg anti-NFAT5) 및 50 μl protein A/G PLUS-Agarose (Santa Cruz Biotechnology, Inc.)와 함께 회전 장치(Tube Tumbler Rotating Mixer SBS550-2; Select BioProducts, Edison, NJ, USA) 상에서 4℃, 2시간 동안 반응시켰다. 정상 마우스 혈청을 대조군으로 사용하였다. 5000 × g로 4℃에서 10분 동안 원심분리한 후, 동시-면역침전된 단백질을 PBS로 3번 씻어냈다. 면역침전된 단백질은 SDS-PAGE로 분리하였으며, 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮겼고, 웨스턴 블랏 분석을 통해 검출하였다.
10. 통계분석
정량 결과는 적어도 3번 이상 독립적인 실험을 통해 평균 ± 표준편차(standard deviation; SD)로 나타냈다. 통계적 유의성은 Student's t-test를 통해 측정하였다. p 수치 < 0.05는 통계적 유의성이 있은 것으로 판단하였다.
< 실시예 1> HLE -B3 세포에서 UVB 조사가 세포 생존능 및 ROS 생산에 미치는 영향
세포들을 60-mm 플레이트에서 60-80% 컨플루언스(confluence)에 도달할 때까지 배양한 후, 다양한 에너지 수준(5, 10, 15, 20, 30 및 40 mJ/cm2)의 UVB 빛을 처리하였다. 본 발명자들은 위상차 현미경을 사용하여 UVB-조사된 HLE-B3 세포에서 형태학적 변화를 관측하였다. 조사 24시간 후, 비-조사 배양된 HLE-B3 세포는 전체 배양 기간 동안 아무런 형태학적 변화를 나타내지 않았으나(도 1A 상단 왼쪽), UVB-처리된 세포는 두드러지게 회전하는 것으로 나타났고, 결국 배양 접시에서 떨어졌다. 또한, 이들은 세포 수축 및 세포막 수포화와 함께 전형적인 세포사멸 형태를 나타냈다(도 1A). 종합하면, UVB 조사의 에너지 수준 증가는 점차적인 형태학적 변화를 유도하였다. 또한, UVB-노출된 HLE-B3 세포에 대한 CCK-8 분석 결과, 세포 생존능에 있어 비-조사된 대조군 세포와 비교하여 용량-의존적 감소를 나타냈다(도 1B). 다음으로, 본 발명자들은 HLE-B3 세포에서 세포 내 활성 산소종(reactive oxygen species; ROS)의 발생에 있어 UVB의 효과를 분석하였다. 15 내지 20 mJ/cm2 범위의 UVB가 ROS 생산에 있어 유의성 있는 증가를 유도하였다(도 1C). 상기 반응은 15 및 20 mJ/cm2에서의 UVB에 의존적이었다.
< 실시예 2> UVB 조사가 NFAT5의 mRNA 발현 수준에 미치는 영향
HLE-B3 세포에서 UVB 조사가 NFAT5 mRNA 발현에 미치는 영향을 정량적 RT-PCR(quantitative RT-PCR; qPCR)로 확인하였다. NFAT5 mRNA 발현은 비조사한 경우에 비해 5 및 10 mJ/cm2의 UVB를 조사하고 24시간 후에 유의성 있게 증가하였다(각각 P < 0.05, P < 0.01; 도 2A). 하지만, 15 및 20 mJ/cm2로 조사한 세포 및 비-조사된 대조군 세포 사이에는 NFAT5 발현에 유의성 있는 차이가 없었다. 최적 용량(10 mJ/cm2)의 UVB로 조사된 세포에서는 24시간에 측정된 NFAT5 발현에 유의성 있는 증가가 나타났다(P < 0.01, 도 2B).
< 실시예 3> UVB 조사가 NFAT5 , NF - κB 및 α- SMA 단백질 발현에 미치는 영향
UVB 조사가 NFAT5 발현을 유도하는지 확인하기 위해서, HLE-B3 세포를 다양한 용량의 UVB (5, 10, 15 및 20 mJ/cm2)로 처리하였고, 24시간 동안 배양하였다. 세포 용해물을 수집하거나, UVB (10 mJ/cm2)로 처리하였고, 배양하였다. 세포 용해물들을 다양한 시점에서 수집하였다. 세포 용해물을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏 분석에 적용하였다. 용량-의존적 방법으로 UVB-유도된 NFAT5 발현은 10 mJ/cm2의 UVB에서 최대 발현이 관측되었다(도 3A 및 B). NFAT5 단백질 발현은 10 mJ/cm2의 UVB 조사 2시간 후 증가하였다(도 3C). UVB는 활성 산소종(reactive oxygen species; ROS) 발생과 관련되어 있는 산화 경로를 활성화시키는데, 이는 이후에 핵 인자 카파-B(nuclear factor kappa-B; NF-кB)를 활성화시킨다. 따라서, 본 발명자들은 UVB-조사된 HLE-B3 세포에서 UVB가 NF-κB 활성화에 미치는 영향을 확인하였다. HLE-B3 세포에 10 mJ/cm2의 UVB를 조사하면, 처리 4시간 후에 NF-κB 인산화를 증가시켰다(도 3C 및 3D). HLE-B3 세포에서 UVB 조사가 EMT를 유도하는지 확인하기 위해서, 10 mJ/cm2의 UVB로 조사된 HLE-B3 세포를 처리 1 내지 16시간 후 수확하였고, EMT의 중간엽 세포 마커인 α-SMA 단백질 수준을 웨스턴 블랏 분석을 통해 측정하였다(도 3E 상단 패널). 본 발명자들은 조사 후 2 내지 16시간 사이에, 조사된 세포에서의 α-SMA 단백질 수준이 비-조사된 대조군에 비해 높다는 것을 확인하였다. 또한, 5 내지 20 mJ/cm2의 UVB에 대해 용량 의존성을 확인하였다(도 3E 하단 패널). 여러 용량의 UVB 조사는 α-SMA 발현에 있어 이상성(biphasic) 반응을 나타냈는데, 최대 발현은 10 mJ/cm2의 UVB에서 나타났고, 이후 더 높은 용량의 UVB(15 및 20 mJ/cm2)에서는 낮은 반응성을 나타냈다.
< 실시예 4> NFAT5 및 NF - κb의 UVB -유도된 핵 전위(nuclear translocation)
신호 전달 경로를 좀 더 확인하기 위해서, 본 발명자들은 UVB (10 mJ/cm2) 노출 8시간 후에 세포질과 핵 분획의 웨스턴 블랏 분석 및 면역형광 분석을 수행하여, NFAT5 및 NF-κB의 UVB-유도된 전위(translocation)를 측정하였다. 도 4A에 나타낸 바와 같이, NFAT5 및 NF-κB는 UVB 조사에 반응하여 핵으로 전위되었다. 밴드의 상대적 세기는 2개의 로딩 대조군(α-tubulin 및 lamin A/C)에 의해 표준화되었다. UVB-처리된 HLE-B3 세포에서의 NFAT5 및 NF-κB p65 단백질의 핵 내 발현은 비-조사된 대조군에 비해 상당히 증가하였다(도 4B). UVB-조사된 HLE-B3 세포에서 NFAT5의 세포 내 분포는 면역형광 염색을 통해 측정하였다. 비-조사된 세포의 면역세포화학 분석 결과, NFAT5는 세포질 및 핵에 모두 존재하였다. 하지만, UVB 조사된 HLE-B3 세포는 시간 의존적 방식에 따라 핵 내 NFAT5 및 NF-κB 수준이 증가되었다(도 4C).
< 실시예 5> 핵 내에서 NFAT5 및 NF - κb 간의 상호작용
다음으로, 본 발명자들은 NFAT5가 NF-κB 단백질과 상호작용하는지 확인하였다. 동시 면역침전 실험 결과, 내재성 NFAT5는 NF-κB와 결합하는 것으로 나타났다(도 5A 및 5B). 비-조사된 세포에서 NF-κB는 주로 세포질에 위치하였는데, 핵 내에서는 매우 낮은 수준의 NF-κB p65만이 검출되었다(도 4). NF-κB는 활성화되어 핵으로 전위될 때까지 세포질에 집중적 존재하므로, 본 발명자들은 UVB-조사된 세포에서 NF-κB가 NFAT5와 결합한다면, 핵 내에서 NF-κB가 NFAT5와 복합체를 형성할 수도 있다고 추측하였다. 이에, 본 발명자들은 UVB-조사된 세포의 핵 추출물로부터 NFAT5를 면역침전시켰고, 핵 내에서 NF-κB p65와 결합한다는 것을 밝혀냈다(도 5C).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (6)

  1. NFAT5 및 NF-kB의 결합 억제제를 유효성분으로 포함하는 백내장 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 결합 억제제는 NFAT5 및 NF-kB의 결합을 억제하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA), 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 백내장 예방 또는 치료용 약학조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 백내장은 UVB 노출에 의한 것을 특징으로 하는 백내장 예방 또는 치료용 약학조성물.
  4. 자외선 노출된 수정체 상피세포(human lens epithelial cells; HLECs)에 후보약물을 처리하는 단계;
    상기 후보약물이 처리된 HLECs에서 NFAT5 및 NF-kB 결합 정도를 측정하는 단계; 및
    대조군 시료와 비교하여 상기 NFAT5 및 NF-kB 결합 정도가 감소한 후보약물을 선별하는 단계를 포함하는 백내장 치료제 스크리닝 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 NFAT5 및 NF-kB 결합 정도는 면역침전법(Immunoprecipitation) 또는 면역블랏팅(Immunoblotting)으로 측정하는 것을 특징으로 하는 백내장 치료제 스크리닝 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 자외선은 UVB인 것을 특징으로 하는 백내장 치료제 스크리닝 방법.
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