WO2019172681A1 - 비소세포폐암의 표피성장인자 수용체 표적 항암제에 대한 민감성 증진용 조성물 - Google Patents

비소세포폐암의 표피성장인자 수용체 표적 항암제에 대한 민감성 증진용 조성물 Download PDF

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WO2019172681A1
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lung cancer
small cell
cell lung
egfr
tki
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PCT/KR2019/002659
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이지연
김재환
김다솜
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고려대학교 산학협력단
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    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to a composition for enhancing sensitivity to epidermal growth factor receptor target anticancer agent of non-small cell lung cancer.
  • the present invention is a non-small cell lung cancer exhibiting resistance to tyrosine kinase inhibitor (TKI) of the epidermal growth factor receptor (EGFR) comprising a rhubarb extract or its component berberine as an active ingredient. It relates to a composition for preventing, treating, or enhancing a therapeutic effect.
  • TKI tyrosine kinase inhibitor
  • Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths worldwide.
  • the most common form of lung cancer is non small cell lung carcinoma (NSCLC), which accounts for 80% of all lung cancers.
  • NSCLC non small cell lung carcinoma
  • the incidence and mortality rate is increasing every year. According to the National Cancer Information Center, the incidence rate is 4th, but mortality rate is 1st.
  • lung cancer has doubled in the last 30 years through the development and application of various angle treatments such as surgery, chemotherapy and radiation therapy, lung cancer has a 15-year survival rate of around 15% due to the difficulty of early detection. Is not very good. Accordingly, there is a need for development of drugs and technologies that can be actively used for prevention and treatment along with biological basic knowledge of lung cancer.
  • TKIs epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors
  • a combination of drugs that may exhibit synergistic effects may be used.
  • the combination of conventional chemical drugs are highly toxic to normal cells as well as cancer cells may affect not only cancer cells but also normal cells.
  • Natural products have minimal toxicity to normal cells, but may have anticancer effects specific to cancer cells. And since natural products are not monolithic and their toxicity is relatively weak, they can be a very effective approach when used as a combination therapy or adjuvant.
  • Coptis chinesis is a natural product belonging to the family of Mia ash family, cold nature, bitter taste and no poison. It brightens the eyes and stops tears from coming out, soothing the liver and removing heat poisoning. Your eyes become red and hard to see, but put them in your eyes when you are sick. It is written in the main text that it is surprising to treat heart pounding, anxiety, to help the phlegm, to treat the mouth and to get rid of children's sickness (drying disease). It is known to contain alkaloids (berberine), phenulic acid, and chlorogenic acid. These rhubarb extracts are known to be effective in treating allergies or inflammation, improving skin aging, and preventing respiratory diseases.
  • the present inventors have completed the present invention by continuing to study the drug sensitivity of lung cancer in which resistance to EGFR target anticancer drugs has occurred.
  • An object of the present invention is to provide a composition for preventing, treating, or enhancing a therapeutic effect of non-small cell lung cancer exhibiting resistance to an EGFR tyrosine kinase inhibitor.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for inhibiting resistance to EGFR tyrosine kinase inhibitors of non-small cell lung cancer.
  • the present invention provides a composition for the prevention or treatment of non-small cell lung cancer that exhibits resistance to epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitors, comprising a rye extract as an active ingredient.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • non-small cell lung cancer is a malignant cell that develops from epithelial cells of the lung and is a tumor cell observed by an observer, for example, a histopathologist under a microscope. Are classified according to their size and shape.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • tyrosine kinase inhibitor is an EGFR target anticancer agent, which selectively binds to tyrosine kinase in the EGFR intracellular domain and inhibits ATP binding, thereby signaling a lower signal. Block the path.
  • non-small cell lung cancer that exhibits resistance to EGFR-TKI means that non-small cell lung cancer cells show resistance or resistance to EGFR-TKI (EGFR-TKI-R) and EGFR-TKI is no longer treated.
  • non-small cell lung cancer exhibiting resistance to EGFR-TKI is also described as EGFR-TKI-R non-small cell lung cancer, EGFR-TKI-R lung cancer, TKI-R non-small cell lung cancer.
  • the EGFR-TKI can include any known one in the art. Specifically, Gefitinib, Erlotinib Afatinib, Daconitib, osimertinib, Ceritinib, CI-1033 (Canertinib), HKI-272 (Neratinib) or pharmaceutically acceptable salts thereof may be included, but is not necessarily limited thereto.
  • the non-small cell lung cancer may be squamous cell cancer, large cell cancer, or adenocarcinoma.
  • the sulfur extract may include berberine or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the berberine is a compound known as a component isolated from the extract of the yellow lotus.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising: i) yellow lotus extract; And ii) an epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitor (TKI) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, an EGFR tyrosine kinase inhibitor (EGFR) of non-small cell lung cancer.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • TKI epidermal growth factor receptor
  • TKI epidermal growth factor receptor
  • TKI epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • TKI tyrosine kinase inhibitor
  • EGFR-TKI The meaning and type of the non-small cell lung cancer, EGFR-TKI are as described above.
  • the i) sulfur extract is, ii) a substance that increases the sensitivity of non-small cell lung cancer to EGFR-TKI.
  • the term "increase sensitivity” means that the resistance of non-small cell lung cancer cells to EGFR-TKI is increased, thereby increasing the sensitivity of the cancer cells to the anticancer agent (EGFR-TKI), thereby increasing the effect of the anticancer agent. do.
  • This can increase the treatment efficiency of EGFR-TKI therapeutics, and when combined with cancer treatment, EGFR-TKI sensitivity of cancer cells can be enhanced to reduce the killing and proliferation of cancer cells while reducing the amount of conventional EGFR-TKI. Will be.
  • the non-small cell lung cancer may be resistant to EGFR-TKI.
  • the sulfur extract may include berberine or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention may provide a method for preventing, treating, or enhancing the therapeutic effect of EGFR-TKI-R non-small cell lung cancer, comprising administering a barberry extract, berberine, or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a subject.
  • the extract of the barberry, berberine, or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be administered to the subject simultaneously, separately, or sequentially with TKI to significantly increase the therapeutic effect of NSCLC.
  • it can enhance the therapeutic effect of non-small cell lung cancer resistant to EGFR-TKI.
  • the term “individual” means a subject in need of treatment of non-small cell lung cancer, and more specifically, a human or non-human primate or mouse in need of treatment of non-small cell lung cancer resistant to TKI. , Mammals such as dogs, cats, horses and cows.
  • “prophylaxis” means all actions that delay the development of non-small cell lung cancer by inhibiting hyperproliferation of lung epithelial cells by administration of the composition according to the present invention
  • “treatment” is a pharmaceutical according to the present invention
  • the composition improves or beneficially changes the symptoms of non-small cell lung cancer
  • “improvement” means that the parameters related to non-small cell lung cancer, such as the extent of symptoms, by the administration of the composition according to the present invention.
  • the term “enhancing treatment” means a synergistic effect of the composition according to the present invention in combination with an EGFR target anticancer agent (especially TKI) for the treatment of non-small cell lung cancer. ) Means that the therapeutic effect is enhanced than administration of the EGFR target anticancer agent alone.
  • the composition of the invention may comprise i) sulfur extract and ii) EGFR-TKI in the same container, or each in a separate container.
  • the sulfur extract of the present invention inhibits EGFR phosphorylation activity (pEGFR) in lung cancer cells resistant to EGFR-TKI and inhibits the activity of AKT / pAKT, which is a downstream signaling system of EGFR, as well as inhibiting cell viability. Cell mobility and invasiveness are also effectively inhibited.
  • pEGFR EGFR phosphorylation activity
  • the extract of the present invention induces apoptosis, and inhibits the expression of the antiapoptotic proteins Bcl-2, Mcl-1, and Bcl-xl to inhibit caspase 3 and PARP (Poly ADP ribose polymerase). It was confirmed that the cell death was effectively induced through cleavage.
  • the extract of L. oleracea shows a particularly effective anti-cancer effect of non-small cell lung cancer and non-small cell lung cancer (EGFR-TKI-R non-small cell lung cancer) cell line.
  • the extract of the L. hull and / or EGFR-TKI-R lung cancer cell treatment, adjuvant therapy of EGFR-TKI, or EGFR-TKI can be applied as a combination therapy.
  • composition of the present invention may be provided in various forms selected from pharmaceutical compositions or functional food compositions.
  • the pharmaceutical composition may include a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the sulfur extract.
  • pharmaceutically acceptable carriers are lactose, textose, sucrose, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, sorbitol, mannitol, starch, gelatin, polyvinylpyrrolidone, cellulose, silicic acid commonly used in pharmaceutical formulations. Calcium, microcrystalline cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, calcium silicate, microcrystalline cellulose and the like. However, it is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition may further include a sweetener, lubricant, wetting agent, flavoring agent, sweetening agent, flavoring agent, emulsifier, suspending agent, preservative, and the like as an additive.
  • the method of administration of the pharmaceutical composition is determined according to the degree of symptoms, and in general, a topical administration method is recommended.
  • the dosage of the active ingredient in the pharmaceutical composition may vary depending on conditions of disease, age, sex, weight, route of administration, etc., and may be administered from one time to several times daily.
  • the pharmaceutical composition may be administered to various mammals such as mice, rats, domestic animals, humans, and the like. All modes of administration can be expected, for example by oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural, rectal or cerebrovascular injections.
  • the pharmaceutical composition may be prepared in unit dose form by formulation with a pharmaceutically acceptable carrier and excipient or may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion, or may be in the form of an exercicide, a granule, a tablet, a warning agent, an excipient, a powder, a lotion, an ointment.
  • Oral dosage forms containing the composition of the present invention as an active ingredient may be formulated as tablets, troches, lozenges, water-soluble or oily suspensions, preparation powders or granules, emulsions, hard or soft capsules, syrups or elixirs.
  • Formulated into tablets and capsules such as lactose, sorbitol, saccharose, mannitol, starch, amylopectin, binders such as cellulose or gelatin, excipients such as dicalcium phosphate, disintegrants such as corn starch or sweet potato starch, magnesium stearate It may include a lubricating oil, such as calcium stearate, sodium stearyl fumarate or polyethylene glycol wax, and in the case of a capsule, it may further contain a liquid carrier such as fatty oil in addition to the above-mentioned materials.
  • a lubricating oil such as calcium stearate, sodium stearyl fumarate or polyethylene glycol wax
  • Formulations for parenteral administration comprising the composition of the present invention as an active ingredient may be used in the form of injections such as subcutaneous injection, intravenous injection or intramuscular injection, suppository injection method or aerosol for inhalation through the respiratory system. It can be formulated as.
  • the compositions of the present invention may be mixed in water with stabilizers or buffers to prepare solutions or suspensions, which may be formulated for unit administration of ampoules or vials.
  • solutions or suspensions which may be formulated for unit administration of ampoules or vials.
  • a rectal composition such as suppositories or body enema including conventional suppository bases such as cocoa butter or other glycerides.
  • a propellant or the like may be combined with the additives to disperse the dispersed dispersion or wet powder.
  • composition of this invention is a functional food composition
  • the therapeutically effective amount of the sulfur extract may be administered simultaneously or sequentially with EGFR-TKI.
  • the therapeutically effective amount means an amount that effectively enhances the sensitivity of the tumor in cancer cells to EGFR-TKI. It will be apparent to those skilled in the art that a suitable total daily dose may be determined by the practitioner within the correct medical judgment.
  • the specific therapeutically effective amount for a particular patient may be based on the specific composition, including the type and severity of the reaction to be achieved, whether or not other agents are used in some cases, the age, weight, general health, sex and diet of the patient, time of administration, It is desirable to apply differently depending on various factors including the route of administration and the rate of release of the composition, the duration of treatment, and the radiation dose to be irradiated and similar factors well known in the medical arts.
  • the effective amount of the composition for enhancing radiation sensitivity suitable for the purpose of the present invention is preferably determined in consideration of the above-mentioned matters.
  • the daily dose of the composition of the present invention may be, for example, 0.0001-100 mg / kg.
  • the rhubarb extract of the present invention and its one component, berberine have no or little side effects as a drug derived from natural products, and the composition containing the rhubarb extract or berberine reduces the viability and invasiveness of EGFR-TKI resistant lung cancer cells and reduces the expression of anti-cell death factor. Inhibition promotes apoptosis of cancer cells, and especially when used in conjunction with TKI for the treatment of TKI resistant non-small cell lung cancer. Accordingly, the composition of the present invention can be used in combination with an EGFR target anticancer agent to provide a combination therapy for the treatment of EGFR-TKI-R non-small cell lung cancer, which is more economical and has reduced drug side effects.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of an in vivo experimental method according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 shows the results of MTT analysis of (EGFR-TKI-R) non-small cell lung cancer cells resistant to (EGFR-TKI) EGFR-TKI according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3a confirms that the mobility of EGFR-TKI-R non-small cell lung cancer cells according to an embodiment of the present invention is inhibited
  • Figure 3b confirms that the invasiveness of EGFR-TKI-R non-small cell lung cancer cells is reduced.
  • 4 to 8 is a result of apoptosis induced EGFR-TKI-R non-small cell lung cancer cells according to an embodiment of the present invention.
  • 9 to 10 are the results confirming the synergistic effect when co-treatment with the rhubarb extract and EGFR-TKI according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 11 shows the results of the MTT analysis when treated with berberine in accordance with an embodiment of the present invention.
  • Figure 12 shows the results of confirming the anticancer effect of the extract of rhubarb in vivo.
  • Lyophil extracts were dissolved in RPMI at a concentration of 1000 ug / mL for in vitro cell experiments, and dissolved in DMSO at 6 mg / mL for in vivo animal experiments.
  • EGFR-TKI Gefitinib
  • Antibodies to EGFR, AKT, p-AKT, Caspase 3, PARP were purchased from Cell signaling technology.
  • Antibodies against p-EGFR, MET, BCL2, MCL-1, BCL-xl and ⁇ -actin were purchased from Santa Cruz Biotechnology.
  • Secondary antibodies, goth anti-mouse IgG and goth anti-rabbit IgG, were purchased from Santa Cruz biotechnology.
  • PC9, PC9GR, A549, A549GR, and HCC827 were each provided by Dr. Jin-Kyung Roh of Asan Hospital, University of Ulsan. HCC828GRKU was built by Korea University. Wherein the PC9GR, A549GR, and HCC827GRKU cells are in turn PC9, A549, and HCC827 zeftinib resistant non-small cell lung cancer cell lines, respectively. Berberine was purchased from Sigma.
  • FBS fetal bovin serum, Welgene
  • penicillin / streptomycin penicillin / Streptomycin
  • MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2yl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) assay.
  • Cells (1 ⁇ 10 3 ) are seeded in 96-well cell culture plates and cultured overnight, and then treated or not treated with the corresponding reagent EGFR-TKI (zeftinib) or rhubarb extract or berberine.
  • EGFR-TKI zeftinib
  • rhubarb extract or berberine 50 uL of MTT solution (0.5 mg / ml) (Sigma-aldrich) is added.
  • DMSO dimethyl Sulfoxide
  • Absorbance at 570 nm was specified using a microplate reader (SpectraMax Plus 384).
  • the drug combination effect was measured by calculating the Fa (fraction affected) and CI (combinatin index) values using CompuSyn Software (www.combosyn.com).
  • a CI value of ⁇ 1 means a complementary (synergy) effect, a value of 1 means addicitve, and a value of 1 means antithesis.
  • Cell migration was performed using wound healing analysis.
  • Cells ( 5 ⁇ 10 5 ) are seeded in 6-well plates and incubated for 24 hours, followed by scraping the worms with sterile micropipette tips. The cells are washed with PBS and then a fixed amount of drug (Rhubarb extract of Example 1-1) is added. From this point of view, the degree of healing of the wound for a predetermined time was observed under a microscope, and then the degree of healing of the wound was compared.
  • Infiltration analysis was performed using transwell chambers with a polycarbonate nucleopore membrane (Costar). Precoated filters [6.5 mm in diameter, 8- ⁇ m pore size, Matrigel (100 ⁇ g / cm 2)] were rehydrated with 100 ⁇ l medium. Next, 1 *? * 5 cells were seeded at the top of each chamber, while the bottom was filled with 600 ⁇ l of the medium. After incubation at 37 ° C. for 24 hours, non-invasive cells on the filter top surface were removed with a cotton swab, the invaded cells on the filter bottom surface were fixed and hematoxylin / eosin stained. Invasiveness was measured by counting cells in five random microscope regions per well, and the chipping range was expressed as the average number of cells per microscope region.
  • Cell death was performed by terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling analysis.
  • Cells were inoculated onto the cover slide containing the complete medium, and the addition of the rhubarb extract was added or not. After 24 and 48 hours of incubation, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde at 4 ° C. for 10 minutes and washed twice with PBS at room temperature. Cells were then permeated for 5 minutes at room temperature with 0.2% Triton X-100 dissolved in PBS and washed twice with PBS. Stained cells were identified under fluorescence microscopy according to the manufacturer's protocol (DeadEnd TM Fluorometric TUNEL System; Promega).
  • RNA 1 ⁇ g / ⁇ l was isolated from cells using TRIzol (Molecular Research Center) according to the manufacturer's protocol. Complimentary DNA (cDNA) was synthesized using cDNA synthesis kit (Applied biosystmes). Oligonucleotide primer sequences are as follows:
  • BCL2 sense: 5'-AAGGGGGAAACACCAGAATC-3 '(SEQ ID NO: 1),
  • BCL2 antisense 5'-ATCCTTCCCAGAGGAAAAGC-3 '(SEQ ID NO: 2);
  • MCL-1antisense 5′-CCTCTTGCCACTTGCTTTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 4),
  • GAPDH antisense 5′-CGATTTCCCGCTCGGCCGTGG-3 ′ (SEQ ID NO: 6).
  • Bio-Rad protein assay reagent Bio-Rad was used to measure the concentration of the protein.
  • Total protein aliquots (30 mg protein / lane) were separated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and nitrocellulose at 100 V for 2 hours. Electrophoresis was carried out to the membrane (Millipore).
  • the membrane was blocked at room temperature for 1 hour with 5% BSA dissolved in TBST [20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 137 mM NaCl, and 0.01% Tween 20], and then reacted at 4 ° C. overnight with primary antibody. After washing the membrane intensively with TBST, the membrane was probed for 1 hour at room temperature with a secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase. After three washes for 15 minutes with TBST, the membrane was visualized by chemiluminescence (Amersham) according to the manufacturer's protocol.
  • the maintenance and incubation of zebrafish and their embryos were tested according to standard maintenance procedures.
  • the zebrafish model used in the experiment was Tg (Flk1: EGFP), a transformation model in which green fluorescence was expressed in vascular endothelial cells.
  • Staining of lung cancer cells to be introduced into zebrafish was stained using a CM-Dil fluorescent dye that stains the fat of the cells. The cells were stained for 4 minutes at 37 ° C. in DPBS containing CM-Dil (4 ng / ml) at 4 ° C. for 15 minutes. Stained cells were centrifuged at 1000 rpm for 3 minutes and then introduced into zebrafish embryos in RPMI 1640 cell culture medium.
  • the stained cells were injected into the microglass needle and about 50 cells were introduced into zebrafish embryos using a Pneumatic PicoPump (WPI).
  • the zebrafish used at this time is 2 days post fertilization (dpf).
  • Confocal microscopy Zeiss LSM700, Carl
  • CM-Dil up to 96 hours (4 dpi) with [1 day post injection (dpi)] treatment of rhubarb and zetininib at 24 hour intervals 24 hours after cancer cell introduction Zeiss
  • CM-Dil The spread of cancer cells stained with CM-Dil was measured by Image J software (NIH, Bethesda, MD, USA) and analyzed in comparison with the group not treated with drugs of nasturtium or zeftinib (FIG. 1).
  • the present inventors first tested the effect of rhubarb extract on the viability, mobility and invasiveness of lung cancer, EGFR-TKI-R lung cancer cells and normal bronchial epithelial cells.
  • IC50 half maximal inhibitory concentration
  • wound healing analysis and invasiveness analysis were used as a method for determining whether the extracts of the yellow lotus have the effect of inhibiting the mobility and invasiveness of the cells, which are characteristic of cancer cells.
  • the mobility of the cells was confirmed that the mobility of the cells was inhibited through the slowing of the wound healing rate in a concentration-dependent and treatment time-dependent manner ( Figure 3a).
  • the invasiveness of EGFR-TKI-R lung cells also decreased in a concentration-dependent manner ( Figure 3b).
  • Rhizome Extract Arrests G2 / M Phase in the EGFR-TKI-R Lung Cancer Cell Cycle and Induces Apoptosis
  • Lactobacillus extract inhibits EGFR-AKT signaling system and the expression of Mcl-1, Bcl-2 and Bcl-xl which are antiapoptotic proteins in EGFR-TKI_R lung cancer cells to inhibit cell survival and apoptosis Induce
  • Rhubarb Extract Synergically Increases Sensitivity of EGFR-TKI in EGFR-TKI-R Lung Cancer Cells
  • berberine which is an alkylating substance, which is considered as an active ingredient in the extract of the rye, using MTT, it was confirmed that inhibiting the survival of lung cancer cells (FIG. 11).
  • berberine can be seen that the cell survival inhibition in EGFR-TKI-R lung cancer cell line as well as general lung cancer cell line.
  • the effect of killing cells in normal bronchial epithelial cells is insignificant. It was confirmed that specifically inhibiting the activity of the EGFR / AKT signaling system in R lung cancer cells to inhibit cell survival and induce apoptosis pathway by inhibiting the expression of Bcl-2, Mcl-1, Bcl-xL.
  • the extract can be used in parallel with EGFR-TKI to enhance the sensitivity of EGFR-TKI in lung cancer and EGFR-TKI-R lung cancer cells.
  • the present inventors completed the present invention by investigating whether rhubarb extract has an anticancer effect specifically for EGFR-TKI-R lung cancer cells and can enhance the effect of EGFR-TKI when used concurrently with EGFR-TKI. .
  • the present inventors have anti-cancer effects by inhibiting cell survival and inducing apoptosis of lung cancer and EGFR-TKI-R lung cancer cells with little effect on the survival of normal bronchial epithelial cells, and simultaneously with EGFR-TKI When used, it was confirmed to enhance the efficacy of EGFR-TKI.
  • composition comprising the rhubarb extract of the present invention or berberine as one component thereof reduces the viability and invasiveness of EGFR-TKI resistant lung cancer cells and inhibits the expression of anti-cell death factors to promote sandpaper death of cancer cells, in particular with TKI. When used, it shows a markedly increased anticancer effect, and it is expected that the compositions of the present invention will be used as novel therapeutic agents and / or therapeutic aids for advanced non-small cell lung cancer.

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Abstract

본 발명은 황련 추출물을 유효성분으로 포함하는, 표피성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor: EGFR) 티로신 키나아제 억제제에 내성을 나타내는 비소세포폐암의 예방 또는 치료용 조성물에 대한 것이다.

Description

비소세포폐암의 표피성장인자 수용체 표적 항암제에 대한 민감성 증진용 조성물
본 발명은 비소세포폐암의 표피성장인자 수용체 표적 항암제에 대한 민감성 증진용 조성물에 대한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 황련 추출물 또는 이의 일 성분인 베르베린을 유효성분으로 포함하는 표피성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor: EGFR)의 티로신 키나아제 억제제(tyrosine kinase inhibitor: TKI) 에 내성을 나타내는 비소세포폐암의 예방, 치료, 또는 치료효과 증진용 조성물에 대한 것이다.
폐암은 세계적으로 암 관련 사망의 주요 원인이다. 가장 일반적인 형태의 폐암은 비소세포폐암(non small cell lung carcinoma: NSCLC)으로 모든 폐암의 80%를 차지한다. 국내에서도 매년 발생 빈도와 사망률이 증가하고 있는 질환으로, 국가 암정보 센터에 의하여 발병률은 4위이나 사망률은 1위로 조사된다.
폐암은 수술과 항암제 및 방사선 요법 등의 다양한 각도의 치료법 개발과 적용으로 생존률이 지난 30년 동안 2배로 증가하고 있음에도 불구하고, 폐암은 조기 발견이 어렵다는 문제점 때문에 5년 생존률이 15% 내외이고 그 예후가 매우 좋지 못하다. 따라서 폐암의 생물학적 기초지식과 더불어 예방 및 치료에 적극 활용할 수 있는 약물 및 기술의 개발이 요구되고 있다.
현재 폐암에서는 다양한 표피성장인자수용체 (EGFR) 타이로신 키나아제 억제제(TKI)인 제프티닙(Gefitinib), 에를로티닙(Eerlotinib), 아파티닙(Afatinib), 오시메르티닙(Osimertinib) 등이 개발되어, EGFR 유전자에 돌연변이를 갖는 폐암 환자들에게 치료에 획기적이 효과를 보여주고 있다.
그러나 이러한 암의 초기 반응에도 불구하고 6개월에서 1년 내에 암세포가 치료에 저항성을 획득한다는 면에서 새로운 문제점을 극복해야하는 필요성이 제시되고 있다. 이러한 저항성의 획득 기전으로는 EGFR에 2차적인 돌연변이 획득, 다양한 세포내 다른 신호전달경로의 활성화, 세포사의 회피, 암 조직 내 미세 환경 변화 등 다양한 기전들이 규명되고 있다.
이러한 저항성 기전을 극복하기 위한 치료법으로 시너지 효과를 보일 수 있는 약물을 조합하는 방법을 이용할 수 있다. 하지만, 종래 화학 약물의 조합은 암세포뿐만이 아니라 정상세포에도 독성이 높아져 암세포뿐만이 아니라 정상세포에도 영향을 미칠 수 있다.
천연물은 정상세포에는 최소한의 독성을 가지지만 암세포 특이적으로 항암 효과를 나타낼 수 있다. 그리고 천연물은 그 자체로 단일물질이 아니면서 독성은 상대적으로 매우 약하기 때문에 약물 조합치료나 보조제로 사용할 경우 매우 효과적인 접근법이 될 수 있다.
한편, 황련(Coptis chinesis)은 미아재비과에 속하는 천연물로서, 성질이 차고 맛은 쓰며 독이 없다. 눈을 밝게 하고 눈물이 나오는 것을 멎게 하며, 간을 진정시키고 열독을 제거한다. 눈이 붉어지면서 잘 보이지 않고 아플 때 눈에 넣는다. 놀라서 가슴이 두근거리는 것과 번조를 치료하고 담을 도와주며 입이 허는 것을 치료하고 소아의 감병(마르는 병)을 없앤다고 동의보감 본초문에 적혀있다. 주요성분으로 알카로이드 (베르베린), 페눌산, 클로로겐산 등이 포함되어 있다고 알려져 있다. 이러한 황련 추출물은 알러지나 염증 치료, 피부노화 개선, 그리고 호흡기 질환이나 예방효과가 있는 것으로 알려져 있다.
이에 본 발명자는 EGFR 표적 항암제에 내성이 생긴 폐암의 약물 민감성을 증신시키기 위해 연구를 계속하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 EGFR 티로신 키나아제 억제제에 내성을 나타내는 비소세포폐암의 예방, 치료, 또는 치료효과 증진용 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 비소세포폐암의 EGFR 티로신 키나아제 억제제에 대한 내성 저해용 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 황련 추출물을 유효성분으로 포함하는, 표피성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor: EGFR) 티로신 키나아제 억제제에 내성을 나타내는 비소세포폐암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "비소세포폐암"은 폐의 상피 세포(epithelial cells)로부터 발생하는 악성 종양(malignant cell)으로서, 현미경 하에서 관찰자, 예를 들면, 조직병리학자(histopathologist)에 의하여 관찰된 종양 세포의 크기 및 모양에 따라 분류된 것이다.
본 발명에서 용어, “표피성장인자 수용체(EGFR)”는 비소세포폐암(NSCLC, non small cell lung carcinoma)의 약 50~80%에서 과발현되며, 과발현이 있는 경우 예후가 불량하다.
본 발명에서 용어 “티로신 키나아제 억제제(tyrosine kinase inhibitor) (EGFR-TKI)”는 EGFR 표적 항암제로, EGFR 세포내 도메인(intracellular domain)의 티로신 키나아제에 선택적으로 결합하여 ATP가 결합하는 것을 억제함으로써 하위 신호경로를 차단한다.
상기 용어들은 모두 본 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 알려져 있다.
본 발명에서 상기 “EGFR-TKI에 내성을 나타내는 비소세포폐암”이란, 비소세포폐암 세포가 EGFR-TKI에 대한 저항성 혹은 내성 (resistance)을 나타내어(EGFR-TKI-R) EGFR-TKI이 더 이상 치료 효과를 나타내지 못하는 비소세포 폐암을 의미한다.
본 발명에서 상기 “EGFR-TKI에 내성을 나타내는 비소세포폐암”은 EGFR-TKI-R 비소세포폐암, EGFR-TKI-R 폐암, TKI-R 비소세포폐암으로 기재하기도 한다.
상기 EGFR-TKI는 이 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 포함될 수 있다. 구체적으로, 제프티닙 (Gefitinib), 에를로티닙 (Erlotinib) 아파티닙 (Afatinib), 다코니팁(Daconitib), 오시메르티닙(osimertinib), 세리티닙(Ceritinib), CI-1033(Canertinib), HKI-272(Neratinib) 또는 이들의 약학적으로 허용되는 염이 포함될 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 비소세포폐암은 편평세포암, 대세포암, 또는 선암일 수 있다.
상기 황련 추출물은 베르베린(berberine) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. 상기 베르베린은 황련 추출물에서 분리된 성분으로 알려진 화합물이다.
다른 측면에서, 본 발명은 i) 황련 추출물; 및 ii) 표피성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor: EGFR) 티로신 키나아제 억제제(tyrosine kinase inhibitor: TKI) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 비소세포폐암의 EGFR 티로신 키나아제 억제제(EGFR-TKI)에 대한 내성 저해용 조성물을 제공한다.
상기 비소세포폐암, EGFR-TKI의 의미 및 종류는 앞서 설명한 바와 같다.
상기 i) 황련 추출물은, 상기 ii) EGFR-TKI에 대한 비소세포폐암의 민감성을 증가시키는 물질이다.
본 발명에서 상기 용어“민감성(sensitivity) 증가”란, EGFR-TKI에 대해 비소세포폐암 세포의 내성을 억제함으로써, 항암제(EGFR-TKI)에 대한 암세포의 민감도를 증가시켜 항암제의 효과를 높이는 것을 의미한다. 이를 통해 EGFR-TKI 치료제 치료 효율을 상승시킬 수 있으므로, 암 치료시 병행처리하면 암세포의 EGFR-TKI 민감성이 증진되어 기존의 EGFR-TKI의 사용량을 감소시키면서 암세포의 살상 효과 및 증식 억제 효과를 낼 수 있게 된다.
상기 비소세포폐암은 EGFR-TKI에 내성을 나타내는 것일 수 있다.
상기 황련 추출물은 베르베린 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다.
비소세포폐암에 돌연변이 등이 생기면 EGFR-TKI에 대한 저항성(내성) (EGFR-TKI-R) 을 나타내어, EGFR-TKI이 폐암 치료에 더 이상 유효하지 않다. 본 발명은 이러한 내성을 나타내는 비소세포폐암의 치료를 위해, EGFR-TKI 치료 효과를 상승적으로 향상시킬 수 있는 황련 추출물을 함께 사용하였다.
따라서, 본 발명은 황련 추출물, 베르베린, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 EGFR-TKI-R 비소세포폐암의 예방, 치료, 또는 치료효과 증진 방법을 제공할 수 있다. 이때, 황련 추출물, 베르베린, 또는 이의 약학적으로 허용가능함 염을 TKI와 동시에(simultaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(sequential)으로 개체에 투여하여 비소세포폐암의 치료효과를 현저하게 증가시킬 수 있으며, 특히 EGFR-TKI에 내성을 갖는 비소세포폐암의 치료효과를 증진시킬 수 있다.
본 발명에서 “개체”란 비소세포폐암의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로 TKI에 내성을 갖는 비소세포폐암의 치료를 필요로 하는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명에서 “예방”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 폐의 상피세포의 과증식 등을 억제하여 비소세포폐암의 발생을 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 비소세포폐암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하고, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 비소세포폐암과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미하며, “치료 증진”이란 본 발명에 따른 조성물이 비소세포폐암의 치료를 위한 EGFR 타겟항암제(특히, TKI)와 병용투여 되어 각각의 항암효과를 합한 것 이상의 시너지 효과(synergic effect)를 나타내는 것으로서 EGFR 타겟항암제 단독의 투여보다 그 치료효과가 증진되는 것을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 조성물은 i) 황련 추출물 및 ii) EGFR-TKI을 동일한 용기에 포함하거나, 또는 각각 별개의 용기에 포함할 수 있다.
본 발명의 황련 추출물은 EGFR-TKI에 내성이 있는 폐암 세포에서 EGFR의 인산화에 의한 활성 (pEGFR)을 억제하여 EGFR의 하위 신호전달계인 AKT/pAKT의 활성을 저해하여 세포의 생존력을 저해할 뿐만 아니라 세포의 이동성과 침윤성 역시 효과적으로 저해한다.
또한, 본 발명의 황련 추출물은 세포사멸을 유도하는데, 이 항세포사멸 (antiapoptotic) 단백질인 Bcl-2, Mcl-1, Bcl-xl의 발현을 저해하여 caspase 3, PARP(Poly ADP ribose polymerase)의 분해(cleavage)를 통하여 세포사멸을 효과적으로 유도하는 것을 확인하였다.
이러한 결과들은 황련 추출물이 비소세포폐암 및 EGFR-TKI에 내성이 있는 비소세포폐암(EGFR-TKI-R 비소세포폐암) 세포주 특이적으로 효과적인 항암 효과를 보임을 알 수 있다. 또한 상기 황련 추출물은 폐암 및/또는 EGFR-TKI-R 폐암 세포의 치료제, EGFR-TKI의 보조 치료제, 또는 EGFR-TKI와 함께 복합치료제로 적용이 가능함을 보여준다.
본 발명의 조성물은 약제학적 조성물 또는 기능성 식품 조성물 중에서 선택된 다양한 형태로 제공될 수 있다
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물인 경우, 상기 약제학적 조성물은 황련 추출물 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이러한 약제학적으로 허용되는 담체는 약품 제제시에 통상적으로 이용되는 락토스, 텍스트로스, 수크로스, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 솔비톨, 만니톨, 전분, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스 등을 포함할 수 있다. 하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 약학적 조성물은 첨가제로서 감미제, 윤활제, 습윤제, 향미제, 감미제, 향미제, 유화제,현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 증상 정도에 따라 투여 방법이 결정되는데, 일반적으로는 국소 투여 방식이 추천된다. 또한, 상기 약학적 조성물 중 유효성분의 투여량은 질병의 정도, 환자의 나이, 성별, 체중, 투여경로등의 조건에 따라 달라질 수 있으며, 일일 1회 부터 수회까지 투여할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 생쥐, 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막, 직장 또는 뇌혈관 내주사에 의해 투여될 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때, 제형은 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엘렉시르제,과립제, 정제, 경고제, 엑스제, 분말제, 로션제, 연고제 등의 형태일 수 있다.
본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐등의 제형으로 제제화하기 위해서는 락토오스, 솔비톨, 사카로오스, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제등의 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 좌제로 주입하기 위해서는 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 체료 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물이 기능성 식품 조성물인 경우, 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다.
본 발명의 황련 추출물이 EGFR-TKI과 병용 투여될 경우, 상기 황련 추출물은 치료적으로 유효한 양이 EGFR-TKI과 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
상기 치료적으로 유효한 양은 EGFR-TKI에 대해 암세포 내의 종양의 민감성을 효과적으로 증진시키는 양을 의미한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 및 조사되는 방사선량을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 방사선 민감성 증진용 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다. 본 발명의 조성물의 1일 투여량은 예컨대 0.0001-100 ㎎/㎏일 수 있다
본 발명의 황련 추출물 및 이의 일 성분인 베르베린은 천연물 유래 약물로서부작용이 없거나 적으며, 황련 추출물 또는 베르베린을 포함하는 조성물은 EGFR-TKI 내성 폐암 세포의 생존력 및 침윤성 감소시키며 항세포사멸인자의 발현을 억제시켜 암세포의 사포사멸을 촉진시키고, 특히 TKI 내성 비소세포폐암의 치료를 위해 TKI와 함께 사용되는 경우 현저하게 증가된 항암효과를 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 EGFR 표적 항암제와 함께 사용되어 보다 경제적이고 약물 부작용이 감소된 EGFR-TKI-R 비소세포폐암의 치료를 위한 복합치료제로 제공될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 in vivo 실험 방법의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 EGFR-TKI에 저항성(내성)이 있는(EGFR-TKI-R) 비소세포폐암 세포의 MTT 분석 결과이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 EGFR-TKI-R 비소세포폐암 세포의 이동성이 억제됨을 확인한 것이고, 도 3b는 EGFR-TKI-R 비소세포폐암 세포의 침윤성이 감소됨을 확인한 것이다.
도 4 내지 도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 EGFR-TKI-R 비소세포폐암 세포의 세포사멸이 유도된 결과이다.
도 9 내지 도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 황련 추출물과 EGFR-TKI을 병용 처리한 경우의 상승 효과를 확인한 결과이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 베르베린을 처리한 경우의 MTT 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 in vivo에서 황련 추출물의 항암효과를 확인한 결과이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시를 보다 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명은 다수의 상이한 형태로 구현될 수 있고, 기술된 실시 예에 제한되지 않음을 이해하여야 한다. 하기에 설명되는 본 발명의 실시 예는 당업자에게 본 발명의 사상을 충분하게 전달하기 위한 것임에 유의하여야 한다.
실시예 1: 실험 방법 및 재료
1-1: 황련 추출물의 제조
동국대학교 일산병원(Kyunggi-do, South Korea)에서 구입하여 동국대학교 김은정 교수(한의학전공)의 감정 하에 선별된 황련을 정선하여 사용하였다. 황련 10g을 환류 냉각관을 부착한 3L 원형 플라스크에 담고 10배수(w/v)의 용매(물, 에탄올)를 가하여 실온에 24시간 두어 추출한 후, 4시간 동안 끓는점 이하의 온도(열수 추출은 90℃, 에탄올 추출은 70℃)에서 추출하였다. 추출액은 0.2μm 포어 크기의 와트판 페이퍼를 이용하여 여과하고, 여과액은 회전식 진공농축기(EYELA, Japan)를 이용하여 감압농축하였다. 이후 동결건조기(EYELA, Japan)를 사용하여 동결건조하여 시료로 사용하였다. 얻어진 추출물의 무게와 수율은 에탄올용매 1.26g/12.6% 이었다. 동결 건조한 황련추출물은 in vitro 세포 실험을 위해서는 1000ug/mL 의 농도로 RPMI에 녹였고, in vivo 동물 실험을 위해서는 6mg/mL의 농도로 DMSO에 녹여서 각 실험의 농도에 맞게 조정하여 이용하였다.
1-2: 시약
EGFR-TKI, 제프티닙 (Gefitinib)은 Selleck chemical로부터 구입하였다. EGFR, AKT, p-AKT, Caspase 3, PARP에 대한 항체는 Cell signaling technology로부터 구입하였다. p-EGFR, MET, BCL2, MCL-1, BCL-xl과 β-actin에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology로부터 구입하였다. 2차 항체인 고트 항-마우스 IgG와 고트 항-토끼 IgG는 Santa Cruz biotechnology로부터 구입하였다.
1-3: 세포 배양
인간 정상 폐 상피세포주인 BEAS-2B 및 인간 비소세포폐암 세포주 PC9, PC9GR, A549, A549GR, HCC827 은 각각 울산대학교 아산병원 노진경 박사로부터 제공받았다. HCC828GRKU는 고려대학교에서 구축하였다. 여기서 PC9GR, A549GR, 및 HCC827GRKU 세포는 각각 차례대로 PC9, A549, 및 HCC827 제프티닙 저항성 비소세포폐암 세포주이다. 베르베린은 시그마로부터 구입하였다. 10% FBS (fetal bovin serum, Welgene)과 1% 페니실린/스트렙토마이신 (penicillin/streptomycin)이 첨가된 RPMI 배지 (Welgene)에서 5% CO2 배양기로 37℃에서 세포를 유지하며 배양하였다.
1-4: 세포 생존 및 약물의 독성 분석
세포 생존률은 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) 분석을 이용하여 수행하였다. 세포 (1x103)를 96웰 세포배양 플레이트에 접종하여 하루 밤을 배양한 후 해당하는 시약인 EGFR-TKI (제프티닙) 또는 황련 추출물 또는 베르베린을 처리 또는 처리하지 않는다. 세포배양 시작 72시간 후에 50uL의 MTT 용액 (0.5mg/ml) (Sigma-aldrich)를 첨가한다. 추가로 4시간 배양한 후에 MTT용액을 제거하고 dimethyl Sulfoxide (DMSO)를 추가하였다. 마이크로 플레이터 리더 (SpectraMax Plus 384)를 이용하여 570nm의 흡광도를 특정하였다. 약물 조합효과는 CompuSyn Software(www.combosyn.com)를 이용하여 Fa(fraction affected)와 CI (combinatin index) 값을 구하여 측정되었다. CI 값이 <1 경우 상호보완 (시너지) 효과 , 1인 경우 추가 (addicitve), >1인 경우 반대 (antagonism)를 의미한다.
1-5: 세포 이동 분석
세포 이동은 창상치유(wound healing) 분석을 이용하여 수행하였다. 세포 (5x105)를 6 웰 플레이트에 접종한 후 24 시간 배양한 후, 멸균된 마이크로파이펫 팁으로 단충인 세포를 긁는다. 세포를 PBS로 씻어낸 후 정해진 양의 약물(실시예1-1의 황련 추출물)을 첨가한다. 이 시점을 기준점으로 하여 정해진 시간 동안 창상이 치유되는 정도를 현미경으로 관찰한 후, 창상이 치유되는 정도를 비교하였다.
1-6: 세포 침윤 분석
Polycarbonate nucleopore membrane (Costar)을 가진 트랜스웰 챔버(transwell chambers)를 이용하여 침윤 분석을 수행하였다. 미리 코팅된 필터 [6.5mm in diameter, 8-㎛ pore size, Matrigel (100 ㎍/cm2)]는 100㎕ 배지로 재수화하였다. 다음으로, 1*?*5세포를 각 챔버의 상단에 접종한 반면, 하단에는 상기 배지 600㎕를 채웠다. 37℃에서 24 시간 동안 배양한 후, 필터 상단 표면상의 비침습된 세포는 면봉으로 걷어냈고, 필터 하단 표면상의 침습된 세포는 고정시켰으며, 헤마톡실린/에오신 염색하였다. 침습성은 웰 당 5개 임의의 현미경 영역에서 세포를 계수하여 측정하였고, 칩습 범위는 현미경 영역 당 세포의 평균 개수로 나타냈다.
1-7: 유세포 분석
세포 주기 분포를 시험하기 위해서, 단일세포로 해리된 세포들은 75% 에탄올로 고정시켰고, 적어도 1시간 이상 -20℃에서 반응시켰으며, PBS로 세 번 씻어냈다. 그 후, 0.1 mg/mL RNase-A, 50 mg/mL 프로피디움 이오다이드(propidium iodide) 및 0.05% Triton X-100이 포함된 PBS에 상온에서 40분 동안 재현탁하였고, PBS로 씻어낸 후, FACS Canto 2 (Becton Dickinson)로 분석하였다.
1-8: 세포 사멸 분석
세포 사멸은 말단 디옥시뉴클레오디딜 전이효소 dUTP 닉-말단 표지(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling) 분석에 의해서 수행되었다. 완전배지가 함유된 커버슬라이드에 세포를 접종하였고, 황련 추출물을 첨가 또는 미첨가하였다. 배양 24, 48시간 후, 세포들을 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 4℃에서 10분 동안 고정시켰고, 상온에서 PBS로 2번 씻어냈다. 그 후, 세포들을 PBS에 녹인 0.2% Triton X-100으로 상온에서 5분 동안 투과시켰고, PBS로 2번 씻어냈다. 염색된 세포들은 제조사의 프로토콜에 따라 형광 현미경으로 확인하였다(DeadEndTM Fluorometric TUNEL System; Promega).
1-8: 역전사-중합효소 연쇄반응
총 RNA(1 ㎍/㎕)는 제조사의 프로토콜에 따라 TRIzol (Molecular Research Center)을 이용하여 세포로부터 분리하였다. 상보적 DNA (Complimentary DNA; cDNA) 는 cDNA 합성 키트 (Applied biosystmes)를 이용하여 합성하였다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머 서열은 다음과 같다:
BCL2 sense: 5′-AAGGGGGAAACACCAGAATC-3′(서열번호 1),
BCL2 antisense: 5′-ATCCTTCCCAGAGGAAAAGC-3′(서열번호 2);
MCL-1 sense: 5′-TGCTGGAGTAGGAGCTGGTT-3′(서열번호 3),
MCL-1antisense: 5′-CCTCTTGCCACTTGCTTTTC-3′(서열번호 4),
Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) sense: 5′-GCCATCGTCACCAACTGGGAC-3′(서열번호 5),
GAPDH antisense: 5′-CGATTTCCCGCTCGGCCGTGG-3′(서열번호 6).
1-8: 웨스턴 블랏 분석
세포는 1×버퍼 [50mM Tris-HCl, pH 7.4, 100mM NaCl, 5mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid ), 0.5% Nonidet P-40 및 protease inhibitor cocktail tablet (Roche)]에 용해시켰고, Bio-Rad protein assay reagent (Bio-Rad)로 단백질의 농도를 측정하였다. 총 단백질 분주물 (aliquot) (30mg protein/lane)은 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis; SDS-PAGE)으로 분리하였고, 100 V에서 2시간 동안 니트로셀룰로스 멤브레인 (Millipore)으로 전기이동시켰다. 멤브레인은 TBST [20mM Tris-HCl (pH 7.6), 137mM NaCl, and 0.01% Tween 20]에 녹인 5% BSA로 1시간 동안 상온에서 차단한 후, 1차 항체로 밤새도록 4℃에서 반응시켰다. 멤브레인을 TBST을 이용하여 집중적으로 씻어낸 후, 멤브레인을 과산화효소(horseradish peroxidase)로 접합된 2차 항체로 상온에서 1시간 동안 탐침 (probe)시켰다. TBST로 15분 동안 세 번 씻어낸 후, 멤브레인은 제조사의 프로토콜에 따라 화학발광(Amersham)에 의해 가시화되었다.
1-9: 제브라피쉬(Zebra fish)를 이용한 제노그라프트 (Xenograft) 모델에서 생체내 (i n vivo ) 황련 추출물의 효능 분석
제브라피쉬와 그 배아의 유지와 배양은 표준유지과정을 따라 실험하였다. 실험에서 사용된 제브라피쉬 모델은 혈관내피세포에서 초록빛 형광이 발현되는 형질전환 모델인 Tg (Flk1:EGFP) 을 사용하였다. 제브라피쉬으로 도입되는 폐암 세포의 염색은 세포의 지방질을 염색하는 CM-Dil 형광염색물질을 이용하여 염색하였다. 세포는 CM-Dil (4 ng/ml) 이 포함된 DPBS에 37℃에서 4분 후, 4℃에서 15분간 염색 반응을 진행하였다. 염색된 세포는 1000rpm에서 3분 동안 원심분리 후 RPMI 1640 세포배양액에 넣어 제브라피쉬 배아에 도입하였다. 이를 위해 염색된 세포를 미세유리바늘에 주입하고 압축피코펌프 (Pneumatic PicoPump, WPI) 를 이용하여 제브라피쉬 배아에 50개 정도의 세포를 도입하였다. 이 때 사용되는 제브라피쉬는 수정 후 2일 [2 day post fertilization (dpf)] 차 상태이다. 암 세포 도입 24시간 후 [1 day post injection (dpi)]부터 황련 및 제프티닙을 24시간 간격으로 처리하면서 96시간 (4dpi)까지 CM-Dil로 염색된 암 세포를 공초점 현미경 (Zeiss LSM700, Carl Zeiss) 을 이용하여 관찰하였다. CM-Dil로 염색된 암 세포가 퍼진 범위를 Image J 소프트웨어로 (NIH, Bethesda, MD, USA)로 측정하여 황련이나 제프티닙의 약물을 처리하지 않은 군과 비교하여 분석하였다 (도 1).
1-10: 통계 분석
통계 분석은 독립 표본 t-test을 이용하여 수행하였다. 편차는 P < 0.05에서 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판단하였다.
실시예 2: 결과
2-1: 황련 추출물에 의한 EGFR-TKI-R 폐암 세포의 생존력 및 이동성 억제
본 발명자들은 우선 폐암, EGFR-TKI-R 폐암 세포 및 정상 기관지 상피 세포의 생존력, 이동성과 침윤성에 대한 황련 추출물의 효과를 시험하였다. 세포의 생존력을 특정하기 위한 방법으로는 잘 알려진 MTT 분석을 이용하여 IC50(half maximal inhibitory concentration ) 값을 측정하였다. 정상 기관지 상피 세포에서는 100mg/ml의 농도에도 약 80%의 세포가 생존하는 반면 (IC50:178ug/ml 이상), 폐암 세포주 각각의 IC50 는 약 70 ug/ml, 30ug/ml, 70ug/ml 이였고, 이 폐암 세포주를 이용하여 구축된 EGFR-TKI-R 폐암 세포의 IC50는 각각 약 33ug/ml, 20ug/ml, 33ug/ml 로 EGFR-TKI-R 폐암 세포의 생존 억제능이 가장 효과적임을 확인하였다(도 2).
또한 황련 추출물이 암세포의 특징인 세포의 이동성 및 침윤성을 억제하는 효과가 있는지를 측정하기 위한 방법으로는 창상치유 (wound healing) 분석과 침윤성 분석을 이용하였다. 세포의 이동성은 황련 추출물의 농도 의존적 그리고 처리 시간 의존적으로 창상이 치유되는 속도가 느려짐을 통하여 세포의 이동성이 억제됨을 확인하였다(도 3a). 또한, 황련의 농도 의존적으로 EGFR-TKI-R 폐세포의 침윤성 역시 감소함을 확인하였다(도 3b). 이러한 결과는 황련 추출물이 폐암과 EGFR-TKI-R 폐암 세포의 생존력, 이동성 및 침윤성을 효과적으로 억제한다는 것을 나타낸다.
2-2: 황련 추출물은 EGFR-TKI-R 폐암 세포주기 중 G2/M기를 정지 (arrest)시키며 세포사멸을 유도
본 발명자들은 황련 추출물이 EGFR-TKI-R 폐암 세포의 사멸을 유도하는지 시험하였다. 세포주기 분석 결과, 황련 추출믈의 처리가 EGFR-TKI-R 폐암 세포에서 시간 의존적으로 subG1의 분획이 증가하였다(도 4a 및 도 4b). 광학현미경 하에서 황련추출물을 처리한 후 관찰한 결과, 황련 추출물을 처리하지 않은 세포에 비하여 황련 추출물을 처리한 세포가 죽어가는 것을 확인하였다(도 5a 및 5b). 이러한 결과를 면역세포화학 분석으로 확인한 결과, 황련 추출물은 말단 디옥시뉴클레오디딜 전이효소 dUTP 닉-말단 표지 (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling)-양성 세포의 수를 향상시킨 것으로 나타났다 (도 6). 이러한 결과는 황련 추출물이 적어도 부분적으로는 EGFR-TKI-R 폐암 세포에서 세포사멸을 유도한다는 것을 나타낸다.
2-3: 황련 추출물은 EGFR-TKI_R 폐암 세포에서 EGFR-AKT 신호전달계와 항세포사멸 단백질(antiapoptotic protein)인 Mcl-1, Bcl-2, Bcl-xl 발현 억제하여 세포의 생존을 억제하고 세포사멸을 유도
황련 추출물에 의한 EGFR-TKI-R 폐암 세포에서 생존 억제와 세포사멸을 유도하는 근본적인 분자 기작을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 세포 생존과 세포사멸과 관련된 중요한 신호 분자들의 발현 패턴을 조사하였다. 먼저, 모 폐암세포(PC9, A549, HCC827)와 비교하여 EGFR-TKI_R 폐암 세포(PC9GR, A549GR, HCC827GRKU)에서 발현이 변화한 인자를 웨스턴 블럿으로 조사하였더니 EGFR 신호전달계의 하위 신호전달 인자인 AKT, AKT의 활성화 상태인 인산화된 pAKT와 항세포사멸분자인 bcl-2 family중 Mcl-1이나 Bcl-2의 발현이 증가한 것을 관찰 하였다(도 7). 황련 추출물을 EGFR-TKI-R 폐암 세포에 처리 하였더니 시간 및 농도 의존적으로 EGFR 및 AKT 신호전달계의 인자와 그 활성인자인 pEGFR과 pAKT의 발현을 억제하여 세포 생존을 억제하였고, EGFR-TKI-R 폐암 세포에서 증가한 Mcl-1과 Bcl-2 뿐만이 아니라 bcl-xl의 발현을 억제하여 caspase 3와 PARP의 cleavage form을 증가시키면서 세포사멸을 유도하는 것을 확인하였다 (도 8).
2-4: 황련 추출물은 EGFR-TKI-R 폐암 세포의 EGFR-TKI의 상호보완적으로(synergically) 민감도를 증가시킴
황련 추출물이 EGFR-TKI-R 폐암 세포의 생존을 억제하고 특히 세포사멸을 유도하기 때문에, 폐암 세포가 저항성을 보이는 약물인 EGFR-TKI에 대한 민감도를 증가시킬 수 있는지 시험하였다. 본 발명자들은 황련 추출물과 EGFR-TKI를 선별된 농도에서 단일 혹은 조합하여 처리하여 세포의 생존능을 MTT 분석에 의하여 관찰한 결과, 조합하여 처리한 경우에 훨씬 더 세포의 생존능이 감소하는 것을 확인 하였다. 또한 이러한 생존능 저하가 EGFR/AKT 신호전달계인자와 항세포사멸인자의 Mcl-1, Bcl-2의 감소를 유도하는 것을 웨스턴 블럿으로 확인하였다(도 9). 이러한 약물의 조합이 상호 보완적인지(synergeical) 검증하기 위하여 Fa-CI Plot (Chu-Talalay Plot; www.combosyn.com) 중앙 효과(median effect) 분석을 시행하였다. 이러한 분석을 통하여 조합 인덱스 (combination index)를 산출한 결과 1보다 적은 것을 통하여 황련 추출물과 EGFR-TKI의 조합은 시너지 효과가 있음을 확인하였다 (도 10).
2-5: 황련 추출물 중 알킬레이팅 물질인 베르베린(berberin)의 항암효과
황련 추출물 중 유효성분으로 생각되는알킬에이팅 물질인 베르베린의 세포 생존 억제 효과를 MTT를 이용하여 분석한 결과 폐암 세포의 생존을 억제하는 것을 확인하였다(도 11). 특히 베르베린은 일반 폐암 세포주 뿐만 아니라 EGFR-TKI-R 폐암 세포주에서도 세포 생존 억제능이 뛰어남을 알 수 있다.
본 발명은 황련 추출물 및 베르베린이 폐암 세포 및 EGFR-TKI-R 폐암 세포에서 암세포 특이적으로 항암 효과를 보이는지 확인한 결과, 정상 기관지 상피 세포에서는 세포를 죽이는 효과가 매우 미비하지만, 폐암 및 EGFR-TKI-R 폐암 세포에서 특이적으로 EGFR/AKT 신호전달계의 활성을 억제하여 세포생존을 억제하고 Bcl-2, Mcl-1, Bcl-xL의 발현을 억제하여 세포사멸 경로를 유도하는 것을 확인하였다. 또한, EGFR-TKI와 황련 추출물을 동시에 처리하였을 경우 상호 보완 시너지)효과가 있음을 확인하였다. 따라서, 황련 추출물은 폐암 및 EGFR-TKI-R 폐암세포에서 EGFR-TKI의 민감성 증진을 위하여 EGFR-TKI 와 병행하여 사용될 수 있다.
본 발명자들은 황련 추출물이 EGFR-TKI-R 폐암 세포 특이적으로 항암 효과가 있는지와 기존에 사용하고 있는 EGFR-TKI와 동시 사용시 EGFR-TKI의 효과를 증진시킬 수 있는지를 조사하여 본 발명을 완성하였다. 본 발명자들은 황련 추출물이 정상 기관지 상피세포의 생존에는 거의 영향을 미치지 않고 폐암과 EGFR-TKI-R 폐암 세포 특이적으로 세포생존을 억제하고 세포사멸을 유도하여 항암 효과를 나타내며, EGFR-TKI와 동시에 사용하였을 경우 EGFR-TKI의 효능을 증진시키는 것을 확인하였다.
2-6: in vivo 제브라피쉬 제노그라프는 모델에서 황련 추출물의 항암효과
황련 추출물이 in vitro 세포주 모델 뿐만 아니라, in vivo 모델에서도 EGFR-TKI-R 폐암세포에 항암효과를 나타내는지 시험하였다. 본 발명자들은 황련 추출물 또는 제프티닙을 선별된 농도에서 EGFR-TKI-R 세포가 이식된 제브라피쉬에 처리하여 제브라피쉬 개체의 생존력과 이식된 암세포의 분포를 관찰하였다. 그 결과, 암세포의 분포도는 제프티닙 뿐만 아니라 황련 추출물 역시 유의하게 암세포의 분포를 저해하는 것을 확인하였다 (도 12a). 하지만, 약물 처리가 되지 않은 비교군에 비하여 제프티닙을 처리한 군은 개체의 생존률이 감소한 것에 비하여 황련 추출물을 처리한 군은 개체의 생존률이 감소하지 않았다 (도 12b). 상기 결과에 따라 황련 추출물이 제프티닙에 비하여 세포에 독성이 적어 약물부작용을 감소시킬 수 있음을 알 수 있다..
이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 도시하고 설명하였지만, 본 발명은 상술한 특정의 실시예에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변형 실시가 가능한 것은 물론이고, 이러한 변형 실시들은 본 발명의 기술적 사상이나 전망으로부터 개별적으로 이해되어서는 안될 것이다.
본 발명의 황련 추출물 또는 이의 일 구성성분인 베르베린을 포함하는 조성물은 EGFR-TKI 내성 폐암 세포의 생존력 및 침윤성 감소시키며 항세포사멸인자의 발현을 억제시켜 암세포의 사포사멸을 촉진시키고, 특히 TKI와 함께 사용되는 경우 현저하게 증가된 항암효과를 나타내는바, 본 발명의 조성물이 진행성 비소세포폐암의 새로운 치료제 및/또는 치료보조제로 이용될 것으로 기대된다.

Claims (17)

  1. 황련(Coptis chinesis) 추출물을 유효성분으로 포함하는 비소세포폐암 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 비소세포폐암은 표피성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor: EGFR) 티로신 키나아제 억제제(tyrosine kinase inhibitor: TKI)에 내성을 갖는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 티로신 키나아제 억제제는 제프티닙(Gefitinib), 에를로티닙 (Erlotinib), 아파티닙(Afatinib), 다코니팁(Daconitib), 오시메르티닙(osimertinib), 세리티닙(Ceritinib), CI-1033(Canertinib), HKI-272(Neratinib), 및 이들의 약학적으로 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 비소세포폐암은 편평세포암, 대세포암, 및 선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 암인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 황련 추출물은 표피성장인자 수용체 또는 AKT(Protein kinase B: PKB)의 인산화를 억제하거나, 항세포사멸인자(anti-apoptotic protein)인 Bcl2, Mcl1 및 Bcl-xl의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  5. 베르베린(Berberine) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 비소세포폐암 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 비소세포폐암은 표피성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor: EGFR) 티로신 키나아제 억제제(tyrosine kinase inhibitor: TKI)에 내성을 갖는 것을 특징으로 하는, 비소세포폐암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 베르베린은 황련(Coptis chinesis) 추출물에서 획득되는 것을 특징으로 하는, 비소세포폐암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 티로신 키나아제 억제제는 제프티닙(Gefitinib), 에를로티닙 (Erlotinib), 아파티닙(Afatinib), 다코니팁(Daconitib), 오시메르티닙(osimertinib), 세리티닙(Ceritinib), CI-1033(Canertinib), HKI-272(Neratinib), 및 이들의 약학적으로 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 비소세포폐암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 비소세포폐암은 편평세포암, 대세포암, 및 선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 암인 것을 특징으로 하는, 비소세포폐암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 황련(Coptis chinesis) 추출물을 유효성분으로 포함하는 표피성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor: EGFR) 티로신 키나아제 억제제(tyrosine kinase inhibitor: TKI) 내성 비소세포폐암 치료 증진용 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 황련 추출물은 표피성장인자 수용체의 티로신 키나아제 억제제에 대한 내성을 억제시켜 비소세포폐암의 티로신 키나아제 억제제에 대한 민감성을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 표피성장인자 수용체 티로신 키나아제 억제제 내성 비소세포폐암 치료 증진용 약학적 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 티로신 키나아제 억제제는 제프티닙(Gefitinib), 에를로티닙 (Erlotinib), 아파티닙(Afatinib), 다코니팁(Daconitib), 오시메르티닙(osimertinib), 세리티닙(Ceritinib), CI-1033(Canertinib), HKI-272(Neratinib), 및 이들의 약학적으로 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 표피성장인자 수용체 티로신 키나아제 억제제 내성 비소세포폐암 치료 증진용 약학적 조성물.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 조성물은 티로신 키나아제 억제제와 동시에(simultaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(sequential)으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 표피성장인자 수용체 티로신 키나아제 억제제 내성 비소세포폐암 치료 증진용 약학적 조성물.
  13. 황련(Coptis chinesis) 추출물, 베르베린(Berberine) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 표피성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor: EGFR) 티로신 키나아제 억제제(tyrosine kinase inhibitor: TKI) 내성 비소세포폐암의 예방 또는 개선용 기능성 식품 조성물.
  14. 황련(Coptis chinesis) 추출물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 표피성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor: EGFR) 티로신 키나아제 억제제(tyrosine kinase inhibitor: TKI) 내성 비소세포폐암의 예방, 치료, 또는 치료효과 증진 방법.
  15. 베르베린(Berberine) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 표피성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor: EGFR) 티로신 키나아제 억제제(tyrosine kinase inhibitor: TKI) 내성 비소세포폐암의 예방, 치료, 또는 치료효과 증진 방법.
  16. 표피성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor: EGFR) 티로신 키나아제 억제제(tyrosine kinase inhibitor: TKI) 내성 비소세포폐암의 예방, 치료, 또는 치료효과 증진을 위한 약제를 생산하기 위한 황련(Coptis chinesis) 추출물의 용도.
  17. 표피성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor: EGFR) 티로신 키나아제 억제제(tyrosine kinase inhibitor: TKI) 내성 비소세포폐암의 예방, 치료, 또는 치료효과 증진을 위한 약제를 생산하기 위한 베르베린(Berberine) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용도.
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