CN101802000A - 转基因小鼠 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了转基因非人动物，特别是编码参与Aβ肽相关疾病的Aβ肽蛋白的转基因小鼠。本发明另外提供了包含编码Aβ肽的转基因的细胞和细胞系。本发明进一步提供了评估影响Aβ肽的物质的方法和组合物，用于治疗肽相关疾病的组合物中。

Description

转基因小鼠
本发明一般性涉及转基因小鼠以及筛选和治疗疾病、特别是Aβ肽相关疾病的方法和组合物。
本发明特别涉及Aβ肽和QPCT(即谷氨酰胺酰肽环化转移酶(glutaminyl peptide cyclotransferase))以及QPCT-样酶(QPCTL)，也称作谷氨酰胺酰环化酶(glutaminyl cyclase)(QC，EC 2.3.2.5)，其催化N-末端谷氨酰胺残基的分子内环化为焦谷氨酸(5-氧-脯氨酸，pGlu*)并释放氨，以及催化N-末端谷氨酸残基分子内环化为焦谷氨酸并释放水。
在阿尔茨海默病(AD)中发现的斑块中，仅少部分Aβ肽以N-末端天冬氨酸起始(AβN1D)。大多数肽起始于位置3焦谷氨酸(AβN3(pGlu))(Kuo，Y.M.，Emmerling，M.R.，Woods，A.S.，Cotter，R.J.& Roher，A.E.Isolation，chemical characterization，and quantitation of Abeta 3-pyroglutamyl peptidefrom neuritic plaques and vascular amyloid deposits.Biochem Biophys ResCommun 237，188-191.(1997)；Saido，T.C.，et al.Dominant and differentialdeposition of distinct beta-amyloid peptide species，AbetaN3(pE)，in senileplaques.Neuron 14，457-466(1995))，以及在位置42结束。与以N-末端谷氨酸起始的Aβ(AβN3E)相比，以N-末端谷氨酰胺起始的Aβ(AβN3Q)是谷氨酰胺酰环化酶(QC)更好的底物(Schilling，S.，Hoffmann，T.，Manhart，S.，Hoffmann，M.& Demuth，H.U.Glutaminyl cyclases unfold glutamyl cyclaseactivity under mild acid conditions.FEBS Lett 563，191-196(2004)；Cynis，H.，et al.Inhibition of glutaminyl cyclase alters pyroglutamate formation inmammalian cells.Biochim Biophys Acta 1764，1618-1625(2006))。
与全长Aβ相比，Aβ(N3pGlu)具有更高的聚集倾向(He，W.& Barrow，C.J.The Abeta 3-pyroglutamyl and 11-pyroglutamyl peptides found in senile plaquehave greater beta-sheet forming and aggregation propensities in vitro thanfull-length Abeta Biochemistry，38，10871-10877(1999)；Schilling，S.，et al.，On the seeding and oligomerization of pGlu-amyloid peptides(in vitro)，Biochemistry，45，12393-12399(2006))和稳定性(Kuo，Y.M.，Webster，S.，Emmerling，M.R.，De Lima，N.& Roher，A.E.Irreversibledimerization/tetramerization and post-translational modifications inhibitproteolytic degradation of Abeta peptides of Alzheimer′s disease.BiochimBiophys Acta 1406，291-298(1998))，且示出增加的毒性(Russo，C.，et al.Pyroglutamate-modified amyloid-peptides-A N3(pE)-strongly affect culturedneuron and astrocyte survival，Journal of Neurochemistry 82，1480-1489(2002))。然而，其它研究报道Aβ(N3pGlu-40)和Aβ(N3pGlu-42)的毒性与Aβ(N1D-40)和AβN1D-42)的毒性相似(Tekirian，T.L.，Yang，A.Y.，Glabe，C.&Geddes，J.W.Toxicity of pyroglutaminated amyloid beta-peptides 3(pE)-40and-42 is similar to that of Abeta1-40 and-42，J Neurochem 73，1584-1589(1999))，以及Aβ(N3pGlu)不是AD脑中的主要变体(Lemere，C.A.，et al.Sequence of deposition of heterogeneous amyloid beta-peptides and APO E inDown syndrome：implications for initial events in amyloid plaque formation，Neurobiol Dis 3，16-32(1996))。Schilling等已经表明焦谷氨酸修饰的肽在最初Aβ聚集体形成中展示直至250倍的加速(Schilling，S.，et al.，On theseeding and oligomerization of pGlu-amyloid peptides(in vitro)，Biochemistry，45，12393-12399(2006))，并且提供体外证据表明在Aβ位置3的谷氨酸的环化由谷氨酰胺酰环化酶(QC)驱动(Schilling，S.，Hoffmann，T.，Manhart，S.，Hoffmann，M.& Demuth，H.U.glutaminyl cyclases unfold glutamyl cyclasesactivity under mild acid conditions，FEBS Lett 563，191-196(2004)；Cynis，H.，et al.Inhibition of glutaminyl cyclase alters pyroglutamate formation inmammalian cells，Biochim Biophys Acta，1764，1618-1625(2006))。QC抑制导致Aβ(N3pGlu)形成显著降低，示出QC-活性在含有焦谷氨酸的肽的细胞成熟期间的重要性(Cynis，H.，et al.Inhibition of glutaminyl cyclases alterspyroglutamate formation in mammalian cells，Biochim Biophys Acta 1764，1618-1625(2006))。已经报道APP转基因小鼠模型示出无Aβ(N3pGlu)水平(Kuo，Y.M.，et al.Comparative analysis of amyloid-beta chemical structure andamyloid plaque morphology of transgenic mouse and Alzheimer′s disease brains.J Biol Chem 276，12991-12998(2001))或低Aβ(N3pGlu)水平(Guntert，A.，Dobeli，H.& Bohrmann，B.High sensitivity analysis of amyloid-beta peptidecomposition in  amyloid deposits from human and PS2APP mouse  brain.Neuroscience.143，461-475(2006))，这与APP/PS1KI小鼠相反，该小鼠具有相当大量的Aβ(N3pGlu)，这由对全脑裂解物的2D-凝胶电泳检测到(Casas，C.，et al.Massive CA1/2 Neuronal Loss with Intraneuronal and N-TerminalTruncated A{beta}42 Accumulation in a Novel Alzheimer Transgenic Model.Am J Pathol 165，1289-1300(2004))以及通过在神经元和斑内的免疫组织化学检测到(Wirths，O.，Weis，J.，Kayed，R.，Saido，T.C.& Bayer，T.A.Age-dependent axonal degeneration in an Alzheimer mouse model，NeurobiolAging 8，online version(2006))。APP/PS1KI小鼠发生脑和脊髓中年龄依赖性轴突变性(Wirths，O.，Weis，J.，Kayed，R.，Saido，T.C.& Bayer，T.A.Age-dependent axonal degeneration in an Alzheimer mouse model，NeurobiolAging 8，online version(2006))，在10月龄在CA1中50％神经元丧失(Casas，C.，et al.Massive CA1/2 Neuronal Loss with Intraneuronal and N-TerminalTruncated A{beta}42 Accumulation in a Novel Alzheimer Transgenic Model.Am J Pathol 165，1289-1300(2004))，在6月龄工作记忆和运动性能不足(Wirths，O.，Breyhan，H.，Schafer，S.，Roth，C.& Bayer，T.A.Deficits inworking memory and motor performance in the APP/PS1ki mouse model forAlzheimer′s disease，Neurobiol Aging 8，8(2007))。在2-6个月之间的年龄，Aβ(N3pGlu)聚集速度高于未修饰的Aβ(N1D)的聚集速度。尽管有提示，但是由于N-截短的Aβ肽的较高异质性而难以使Aβ(N3pGlu)沉积与在这个模型中观测到的CA1神经元丧失相关联(Casas，C.，et al.Massive CA1/2Neuronal Loss with Intraneuronal and N-Terminal Truncated A{beta}42Accumulation in a Novel Alzheimer Transgenic Model.Am J Pathol 165，1289-1300.(2004))。
谷氨酰胺酰环化酶(QC，EC 2.3.2.5)在伴随氨释放下催化N-末端谷氨酰胺残基分子内环化为焦谷氨酸(pGlu*)。QC首先由Messer在1963年从热带植物Carica papaya的乳胶中分离(Messer，M.1963 Nature 4874，1299)。24年后，在动物垂体中发现相应的酶活性(Busby，W.H.J.et al.1987J Biol Chem262，8532-8536；Fischer，W.H.and Spiess，J.1987 Proc Natl Acad Sci U S A 84，3628-3632)。对于哺乳动物QC，针对TRH和GnRH前体已经示出N末端Gln由QC转化为pGlu(Busby，W.H.J.et al.1987J Biol Chem 262，8532-8536；Fischer，W.H.and Spiess，J.1987 Proc Natl Acad Sci U S A 84，3628-3632)。另外，QC的最初定位实验表明与其推定的催化产物在牛垂体中的共同定位，进一步改善在肽激素合成中的推测的功能(Bockers，T.M.etal.1995 J Neuroendocrinol 7，445-453)。相反，植物QC的生理学功能还不太清楚。在得自C.papaya的酶的情况中，推测其在植物的病原性微生物防御中的作用(El Moussaoui，A.et al.2001 Cell Mol Life Sci 58，556-570)。最近通过序列对比鉴别了得自其它植物的推定的QC(Dahl，S.W.et al.2000Protein Expr Purif 20，27-36)。然而，这些酶的生理学功能还不明确。
从植物和动物获知的QC示出对于底物N末端位置中的L-谷氨酰胺的严格特异性，且发现它们的动力学行为服从Michaelis-Menten等式(Pohl，T.et al.1991 Proc Natl Acad Sci U S A 88，10059-10063；Consalvo，A.P.et al.1988 Anal Biochem 175，131-138；Gololobov，M.Y.et al.1996 Biol ChemHoppe Seyler 377，395-398)。然而来自C.papaya的QC与来自哺乳动物的高保守的QC的一级结构对比未表明任何序列同源(Dahl，S.W.et al.2000Protein Expr Purif 20，27-36)。尽管植物QC看起来属于新的酶家族(Dahl，S.W.et al.2000 Protein Expr Purif 20，27-36)，但是发现哺乳动物QC具有与细菌氨基肽酶显著同源的序列(Bateman，R.C.et al.2001 Biochemistry 40，11246-11250)，由此推断植物和动物的QC具有不同的进化源。
EP 02 011 349.4揭示了编码昆虫谷氨酰胺酰环化酶的多核苷酸，以及由其编码的多肽。这个申请进一步提供了包含具有该发明多核苷酸的表达载体的宿主细胞。分离的多肽和包含昆虫QC的宿主细胞用于筛选降低谷氨酰胺酰环化酶活性的制剂的方法中。这种制剂被描述为可用作杀虫剂。
本发明的主题特别用于Aβ-相关疾病的领域，这种疾病的一个实例是阿尔茨海默病。阿尔茨海默病(AD)特征在于与营养不良的神经元、反应性星形胶质细胞和小胶质细胞密切相关的胞外淀粉样斑块的异常聚集(Terry，R.D.and Katzman，R.1983 Ann Neurol 14，497-506；Glenner，G.G.and Wong，C.W.1984Biochem Biophys Res Comm 120，885-890；Intagaki，S.et al.1989J Neuroimmunol 24，173-182；Funato，H.et al.1998 Am J Pathol 152，983-992；Selkoe，D.J.2001 Physiol Rev 81，741-766)。淀粉样-β(简写为Aβ)肽是老年斑的主要成分，且认为其直接参与AD的发病和进展，这个假说由遗传学研究支持(Glenner，G.G.and Wong，C.W.1984Bioehem Biophys Res Comm120，885-890；Borchelt，D.R.et al.1996 Neuron 17，1005-1013；Lemere，C.A.et al.1996 Nat Med 2，1146-1150；Mann，D.M.and Iwatsubo，T.1996Neurodegeneration 5，115-120；Citron，M.et al.1997 Nat Med 3，67-72；Selkoe，D.J.2001 Physiol Rev 81，741-766)。Aβ是由β-淀粉样前体蛋白(APP)的蛋白酶解产生的(Kang，J.et al.1987 Nature 325，733-736；Selkoe，D.J.1998Trends Cell Biol 8，447-453)，其相继在Aβ的N末端被β-分泌酶裂解以及在C末端被γ-分泌酶裂解(Haass，C.and Selkoe，D.J.1993 Cell 75，1039-1042；Simons，M.et al.1996 J Neurosci 16899-908)。除了在N末端以L-Asp起始的主要Aβ肽之外(Aβ1-42/40)，在老年斑中出现大量异质性N-末端截短形式。据报道这些缩短的肽与全长同种型相比在体外更具神经毒性且更迅速聚集(Pike，C.J.et al.1995J Biol Chem 270，23895-23898)。已知N-截短的肽在早期发作的家族AD(FAD)对象中过量产生(Saido，T.C.et al.1995 Neuron14，457-466；Russo，C，et al.2000 Nature 405，531-532)，以及在Down′s综合征(DS)脑中早期出现并随着年龄增加(Russo，C.et al.1997 FEBS Lett 409，411-416，Russo，C.et al.2001 Neurobiol Dis 8，173-180；Tekirian，T.L.et al.1998 J Neuropathol Exp Neurol 57，76-94)。最后，它们的量反映了疾病的进展严重程度(Russo，C.et al.1997 FEBS Lett 409，411-416；Guntert，A.et al.2006 Neuroscience 143，461-475)。其它的翻译后过程可通过位置1和7的天冬氨酸的异构化或外消旋转化以及通过残基3和11的谷氨酸的环化进一步修饰N-末端。在位置3含有焦谷氨酸的同种型[AβN3(pGlu)-40/42]代表老年斑中主要形式的N-截短种类-占Aβ总量的大约50％(Mori，H.et al.1992 JBiol Chem 267，17082-17086，Saido，T.C.et al.1995 Neuron 14，457-466；Russo，C.et al.1997 FEBS Lett 409，411-416；Tekirian，T.L.et al.1998 JNeuropathol Exp Neurol 57，76-94；Geddes，J.W.et al.1999 Neurobiol Aging20，75-79；Harigaya，Y.et al.2000 Biochem Biophys Res Commun 276，422-427)，其也存在于前淀粉样损害中(Lalowski，M.et al.1996 J Biol Chem271，33623-33631)。AβN3(pE)肽的积累可能是由于增强聚集及赋予对大多数氨基肽酶抗性的结构修饰所致(Saido，T.C.et al.1995 Neuron 14，457-466；Tekirian，T.L.et al.1999 J Neurochem 73，1584-1589)。这种证据提供了AβN3(pE)肽在AD发病中起关键作用的线索。然而，对于其神经毒性和聚集性质所知甚少(He，W.and Barrow，C.J.1999 Biochemistry 38，10871-10877；Tekirian，T.L.et al.1999 J Neurochem 73，1584-1589)。此外，这些同种型对于胶质细胞的作用以及胶质细胞对于这些肽的应答完全未知，尽管激活的胶质细胞与老年斑严格相关且可能积极促进了淀粉样沉积物的积累。在近年来的研究中，在神经元和神经胶质细胞培养物中研究了Aβ1-42、Aβ1-40、[pGlu3]Aβ3-42、[pGlu3]Aβ3-40、[pGlu11]Aβ11-42和[βGlu11]Aβ11-40肽的毒性、聚集性质以及分解代谢，示出焦谷氨酸修饰加剧Aβ-肽的毒性性质，且还抑制其由培养的星形胶质细胞的降解。Shirotani等研究了在体外感染Sindbis病毒的原代皮质神经元中[pGlu3]Aβ肽的产生。他们构建了淀粉样前体蛋白互补DNA，其通过氨基酸取代和缺失编码[pGlu3]Aβ的潜在前体。对于一个起始是N-末端谷氨酰胺残基而不是天然前体中的谷氨酸的人工前体而言，推测是自发转化或者通过谷氨酰胺酰环化酶转化为焦谷氨酸。在[pGlu3]Aβ的天然前体中位置3的N-末端谷氨酸的环化机制在体外、原位或体内均未被确定(Shirotani，K.et al.2002NeuroSci Lett 327，25-28)。
发明概述
本发明包含用于Aβ肽相关疾病的非人转基因动物特别是哺乳动物模型的方法和组合物。特别地，本发明包含过表达Aβ-肽的非人转基因动物模型。
本发明人产生了表达SEQ ID No：1所示Aβ3E-42的转基因小鼠品系(tgN3E-42)或者表达SEQ ID No：2所示AβN3Q-42的转基因小鼠品系(tgN3Q-42)。在tgN3Q-42小鼠脑中观测到最高水平AβN3(pGlu)。在许多脑部区域中观测到强表达，包括海马CA1神经元以及对于tgN3Q-42在小脑Purkinje细胞。TgN3Q-42小鼠产生大量Purkinje细胞变性，星形胶质细胞和小胶质细胞激活以及严重神经学表型，导致过早死亡。年轻的(直至4周龄)tgN3E-42纯合小鼠示出无明显神经病变，然而在tgN3E-42纯合小鼠(3月龄)中，使用两种不同抗体通过免疫组织化学方法在许多脑部区域中观测到Aβ强表达。这些区域包括海马CA1区，以及各个脑干区域。使用针对Aβ的抗体4G8在纯合和野生型动物中发现Purkinje细胞染色，而用针对Aβ的抗体6E10标记的切片未示出任何免疫反应性。对Aβ(N3pGlu-42)的免疫组织化学分析在CA1和脑干中示出相似染色模式，但是在CA3中额外示出标记。这些数据确证CA1形态学中的明显改变。
对神经胶质和Aβ(N3pGlu-42)进行双免疫荧光染色表明在tgN3E-42小鼠的CA1区域中显著增高的神经胶质数目(图3)。纯合的tgN3E-42小鼠示出神经变性组合情绪改变(图8)、认知障碍(图9A、图9B和图9C)及由于运动障碍导致的体重减轻(图10)的进展性表型。这些发现显然表明Aβ(N3pGlu-42)形成与组织病理学的关系。最重要的是，本文描述的模型首次在几周的年龄显著积累Aβ(N3pGlu-42)，伴随神经元丧失。这些独特的结果使在转基因小鼠中应用的转基因策略成为研究不同的淀粉样肽的神经毒性性质的优异方法。本文描述的前原-策略(prepro-strategy)因此可用于其它肽如ADan、Abri或者Aβ-相关肽。
在与小鼠谷氨酰胺酰环化酶(QC)转基因小鼠杂交繁育后，杂合tgN3E-42小鼠中Aβ(N3pGlu-42)水平显著升高，示出原则上QC可催化谷氨酸在体内转化为焦谷氨酸。这些数据表明Aβ(N3pGlu-42)在神经元内的增加的积累足以产生变性和共济失调，且表明可建立由于焦谷氨酸形成导致的神经变性的小鼠模型。
本发明进一步包含筛选调节Aβ-肽相关疾病的生物活性剂的组合物和方法，所述疾病包括但不限于轻度认知障碍(MCI)、阿尔茨海默病(AD)、脑淀粉样血管病、Lewy体痴呆、唐氏综合征中的神经变性、遗传性脑出血伴淀粉样变(hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis，荷兰型)、家族性丹麦型痴呆(Familial Danish Dementia)、家族性英国型痴呆(Familial BritishDementia)、伴有或不伴有幽门螺杆菌感染的溃疡性疾病和胃癌、病原性精神病症(pathogenic psychotic conditions)、精神分裂症、不育症、瘤形成、炎症性宿主应答、癌症、银屑病、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、再狭窄、肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、获得性免疫缺陷综合征、移植排斥、亨廷顿舞蹈症(HD)、受损的体液和细胞介导的免疫应答、内皮中白细胞粘附和迁移过程、摄食减少、睡眠-觉醒(sleep-wakefulness)、能量代谢的稳态调节受损、自主功能受损、激素平衡受损和体液调节受损以及关岛帕金森-痴呆复合征(Guam Parkinson-Dementia complex)。本发明另一方面包含用于筛选QC和/或QPCTL抑制剂的方法和组合物。
此外，本发明包含治疗和/或预防Aβ-肽相关疾病的方法和组合物，特别是抑制Aβ-肽相关毒性和/或聚集倾向的方法和组合物。
因此，本发明的一个目的是提供过表达特定Aβ-肽的转基因动物。
本发明的另一目的是提供编码特定Aβ-肽的DNA构建体。
本发明的再一目的是提供与启动子连接的编码Aβ-肽的DNA构建体。
本发明的另一目的是提供非人转基因动物模型系统。
本发明的再一目的是提供非人转基因动物模型系统，用以在特定组织类型中研究Aβ-肽的体内和体外调节和作用。
本发明的另一目的是提供产生转基因动物的方法，所述转基因动物过表达淀粉样肽ADan和ABri。
另外，先前的抑制研究示出人和小鼠QC是金属依赖性转移酶。QC脱辅基酶可以由锌离子最有效地再活化，且锌依赖性氨基肽酶的金属结合基序也存在于人QC中。与活性位点结合的金属相互作用的化合物是强力抑制剂。
先前示出重组人QC以及得自脑提取物的QC活性催化N-末端谷氨酰胺酰以及谷氨酰环化。最惊人的是发现QC-催化的Glu1-转化在大约pH 6.0最有利，而Gln1-转化为pGlu-衍生物在最佳pH为大约8.0时出现。由于pGlu-Aβ-相关肽的形成可以受重组人QC和得自猪垂体提取物的QC活性的抑制作用抑制，因此酶QC在治疗例如阿尔茨海默病的药物开发中是靶位。
通过给予哺乳动物Aβ-肽活性的效应物，可以防止或者减轻或者治疗选自如下的病症：轻度认知障碍(MCI)、阿尔茨海默病(AD)、脑淀粉样血管病、Lewy体痴呆、唐氏综合征中的神经变性、遗传性脑出血伴淀粉样变(荷兰型)、家族性丹麦型痴呆、家族性英国型痴呆、伴有或不伴有幽门螺杆菌感染的溃疡性疾病和胃癌、病原性精神病症、精神分裂症、不育症、瘤形成、炎症性宿主应答、癌症、银屑病、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、再狭窄、肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、获得性免疫缺陷综合征、移植排斥、亨廷顿舞蹈症(HD)、受损的体液和细胞介导的免疫应答、内皮中白细胞粘附和迁移过程、摄食减少、睡眠-觉醒、能量代谢的稳态调节受损、自主功能受损、激素平衡受损和体液调节受损。
进一步地，通过给予哺乳动物Aβ-肽活性的效应物，可以刺激胃肠道细胞增殖，优选胃粘膜细胞、上皮细胞的增殖，产酸壁细胞以及分泌组胺的肠嗜铬样细胞的急性酸分泌和分化。
此外，通过给予哺乳动物Aβ-肽活性的效应物，可以抑制骨髓祖细胞的增殖。
另外，给予Aβ-肽抑制剂可导致雄性生育能力抑制。
本发明提供了用于肠道外给予、肠道内给予或者口服给予的药物组合物，所述药物组合物包含Aβ-肽的至少一种效应物组合常用载体和/或赋形剂。
附图简述
通过附图可以进一步理解本发明的这些及其它方面。
图1：产生转基因小鼠的构建体及在2月龄小鼠脑中的表达谱。(a)，AβN1-42在位置1具有天冬氨酸(D)而起始，AβN3E-42在位置3具有谷氨酸(E)而起始以及AβN3Q-42在位置3具有谷氨酰胺(Q)而起始。N-截短的AβN3E-42和AβN3Q-42肽可以通过QC活性转化产生AβN3(pE)-42。(b)，转基因载体的示意图。tgN3E-42和tgN3Q-42转基因小鼠表达在Thy1启动子控制下的Aβ(N3E-42)或者Aβ(N3Q-42)，且与小鼠TRH的前原肽(prepro-peptide)(氨基酸:甲硫氨酸1-精氨酸76)融合。QC转基因小鼠表达在CAG启动子控制下的小鼠QC小基因(mQPCT)。对野生型(N＝6)、QC(N＝6)、tgN3E-42(N＝9)、tgN3E-42/QC(N＝9)和tgN3Q-42(N＝4)小鼠脑半球裂解物中的Aβ(x-42)和Aβ(N3pGlu-42)进行ELISA分析(c-e)。(c)，与野生型对照组相比，在tgN3E-42小鼠中发现Aβ(x-42)水平显著增加(P＜0.0001)。与tgN3E-42(P＜0.0001，未配对t-检验)和tgN3E-42-QC双转基因小鼠(P＜0.0001，未配对t-检验)相比，tgN3Q-42示出最高水平的Aβ(x-42)。(d)与单独tgN3E-42表达相比，tgN3E-42-QC双转基因小鼠水平增加。与tgN3E-42(P＜0.0001，未配对t-检验)和tgN3E-42-QC双转基因(P＜0.0001，未配对t-检验)小鼠相比，tgN3Q-42小鼠示出最高水平Aβ(N3pGlu-42)。(e)对于Aβ(N3pGlu-42)与总Aβ(x-42)的比率也是如此。所有小鼠均是2月龄。数值是平均值±s.e.m.，*P＜0.05。***P＜0.001。
图2：tgN3Q-42转基因小鼠的鉴定。(a)，(b)野生型(WT)和tgN3Q-42小鼠的图片，示出tgN3Q-42小鼠一般较小且表现出弯曲姿势(b)。(c)tgN3Q-42脑的目测检验表明与年龄匹配的野生型同窝出生的小鼠(2月龄)相比萎缩的小脑。(d)与年龄匹配的野生型同窝出生的小鼠(2月龄小鼠)相比，雌性和雄性tgN3Q-42小鼠均示出体重减轻(未配对t-检验)。(e)与野生型同窝出生小鼠相比，tgN3Q-42小鼠显示显著降低的存活率(P＝0.0002；Logrank Test)。数值是平均值±s.e.m.，***P＜0.001。
图3A：tgN3Q-42小鼠的免疫组织化学染色。(a)使用抗体4G8进行免疫染色表明在海马的CA1锥体层中的强Aβ积累(插图示出在低倍显微镜下海马概观)，而使用抗Aβ(N3pGlu)的抗体仅检测到有限的免疫反应性(b)。(c)通过4G8染色示出的丘脑中细胞外弥漫性Aβ沉积。(d-e)小脑中Aβ染色(4G8)限于Purkinje细胞。(f-g)通过抗Aβ(N3pGlu)的抗体示出大多数Purkinje细胞积累以焦谷氨酸起始N-截短的Aβ。(h)GFAP染色表明tgN3Q-42小鼠中Bergmann神经胶质的显著染色，而野生型动物(i)持续阴性。小胶质细胞标志物Iba1表明在tgN3Q-42小鼠中围绕Purkinje细胞及在白质束中的小胶质细胞群(j)，而在野生型同窝出生的小鼠中则没有(k)。(l)用4G8和抗遍在蛋白对Purkinje细胞进行双重染色。注意在4G8阳性Purkinje细胞中的丰富的遍在蛋白免疫反应性，这是变性的标志物。
图3B：纯合的tgN3E-42表达小鼠的免疫组织化学和免疫荧光染色。(a)-(d)：海马CA1区域的4G8染色示出仅在转基因小鼠(a)和(c)的CA1层中的Aβ积累，野生型小鼠，(b)，(d)tgN3E-42纯合小鼠)。(e)，(f)：抗Aβ(N3pGlu)的抗体表明仅在转基因小鼠(e)，tgN3E-42纯合小鼠的海马的CA1锥体层中的强Aβ积累；(f)，野生型小鼠)。tgN3E-42纯合小鼠与野生型小鼠的CA1形态学对比表明在转基因小鼠的这个区域(g)，(h)中神经元丧失，(g)，野生型小鼠；(h)，tgN3E-42纯合转基因小鼠)。双重免疫荧光染色示出tgN3E-42纯合小鼠与野生型小鼠相比CA1中神经胶质细胞数目显著增加(i)，(j)。
图4：在位置3具有焦谷氨酸而起始的Aβ(AβN3(pE))的形成由谷氨酰胺酰环化酶(QC)催化。N-末端以在位置3具有谷氨酸(AβN3E)或谷氨酰胺(AβN3Q)而起始的Aβ可作为QC底物以产生AβN3(pE)。在体外已经示出焦谷氨酸从N-末端谷氨酸的转化较慢，而相反的是从谷氨酰胺形成焦谷氨酸是快速酶促过程(Schilling，S.，Hoffmann，T.，Manhart，S.，Hoffmann，M.&Demuth，H.U.Glutaminyl cyclases unfold glutamyl cyclases activity under mildacid conditions.FEBS Lett 563，191-196(2004))。这个观测结果在细胞培养中证实(Cynis，H.，et al.Inhibition of Glutaminyl cyclases alters pyroglutamateformation in mammalian cells.Biochim Biophys Acta 1764，1618-1625(2006))，且根据本发明在体内脑中出现。此外，细胞培养物中QC的药物学抑制导致AβN3(pE)水平降低(Cynis，H.，et al.Inhibition of glutamylcyclases alters pyroglutamate formation in mammalian cells.Biochim BiophysActa 1764，1618-1625(2006))。
图5：在2月龄tgN3Q-42小鼠脑切片中使用Aβ抗体4G8的免疫组织化学染色的概观。在海马CA1神经元、小脑Purkinje细胞、皮质和皮质下区域中观测到丰富染色。
图6示出用于制备进行原核注射的片段的限制策略。示出了用于产生含有转基因(TRH-AβN3Q(3-42)或者TRH-AβN3E(3-42)转基因+Thy1启动子)的7170-bp片段的具有EcoRI限制位点位置的tgN3Q-42质粒的示意图。该图不是按比例描绘的。
图7示出PCR基因分型方法学。示出用于检测随机整合和转基因完整性的引物的定位。图中示出相应的扩增产物大小。粗线表示质粒主链序列。半箭头(Half arrows)表示引物位置。该图不是按比例描绘的。TRH-AβN3E(3-42)转基因构建体具有相同结构。
图8例证了7周龄小鼠在暗光箱中的行为。与野生型同窝出生的小鼠相比，tgN3E-42小鼠示出进入明亮区域的次数显著减少(杂合小鼠p＜0.01，纯合小鼠p＜0.05)，表明tgN3E-42小鼠情绪改变。
图9A示出3月龄tgN3E-42小鼠在恐惧条件装置中的行为：与杂合小鼠和野生型同窝出生小鼠相比，纯合小鼠在情境恐惧下反应为活动增加及僵直(freezing)行为降低。
图9B示出在恐惧条件装置中3月龄tgN3E-42小鼠的行为：与同窝出生小鼠相比纯合tgN3E-42小鼠在线索恐惧条件下反应为活动增加。
图9C示出在恐惧条件装置中3月龄tgN3E-42小鼠的行为：纯合tgN3E-42小鼠示出明显缩短的僵直(freezing)持续时间。图9A、图9B和图9C的结果证实转基因tgN3E-42小鼠的认知下降。
图10示出3月龄的tgN3E-42小鼠的体重。在杂合和纯合小鼠中观测到体重降低，纯合小鼠达到统计学显著。体重降低是由于同种tgN3E-42小鼠的运动缺陷所致，这由于pGlu-Aβ3-42积累和神经元丧失而在年幼发生。
图11示出在杂合和纯合tgN3E-42小鼠脑中荷载的Aβ(x-42)(上图)和pGlu-Aβ(3-42)(下图)。
在从脑中提取之后，通过ELISA在SDS-和甲酸级分中确定Aβ浓度。计算Aβ的总量，且针对脑湿重标准化。仅分析雄性动物(N＝2-6)。纯合的动物积累显著更高浓度的pGlu-Aβ，伴随神经元丧失、记忆力和行为受损。
图12示出在杂合和纯合的tgN3E-42小鼠、tgN3Q-42和APPsw小鼠脑中荷载的pGlu-Aβ(3-42)(上图)和Aβx-42(下图)。
在从脑中提取之后，通过ELISA在SDS-和甲酸级分中确定Aβ浓度。计算Aβ的总量，且针对脑湿重标准化。纯合的tgN3E-42和杂合的tgN3Q-42动物积累显著更高浓度的pGlu-Aβ，伴随神经元丧失、记忆力和行为受损。
图13示出在应用强的强直收缩(tetanus)(时间点0)之后EPSP的长期增强作用。
tgN3E-42纯合小鼠的LTP与野生型小鼠相比显著减少(野生型小鼠vstg小鼠：p＝0.007；tg小鼠：n＝18；野生型小鼠：n＝12；重复测量ANOVA)。类似跟踪代表一个实验在致强直作用之前10分钟(1)和致强直作用之后240分钟(2)的典型记录。
通过下文详细描述将更加理解本发明的其它目的、优势和特征。
发明详述
本发明包含产生用以研究Aβ-肽相关疾病的转基因动物模型的方法和组合物，以及转基因非人动物。本发明特别包含产生过表达Aβ-肽的转基因动物模型的方法和组合物，以及转基因非人动物。本发明进一步包含检测Aβ-肽抑制剂的方法和组合物以及具有Aβ-肽抑制剂的预防/治疗和药物组合物。
本发明还提供了治疗如下病症的新方法：轻度认知障碍(MCI)、阿尔茨海默病、家族性丹麦型痴呆(FDD)、家族性英国型痴呆(FBD)以及唐氏综合征中的神经变性。沉积在阿尔茨海默病和唐氏综合征患者脑中的淀粉样β-肽的N-末端以及沉积在家族性丹麦型痴呆和家族性英国型痴呆中的淀粉样肽Adan和Abri的N-末端具有焦谷氨酸。在FDD中的Adan和FBD中的Abri以及阿尔茨海默病和唐氏综合征中的Aβ的N-末端的pGlu形成已经示出是相关疾病的发生和进展的重要事件，因为修饰的淀粉样β-肽、ADan和Abri示出增强的淀粉样蛋白聚集和毒性的倾向，很可能使疾病的发作和进展恶化(Russo，C.et al.2002 J Neurochem 82，1480-1489；Ghiso，J.et al.2001Amyloid 8，277-284)。
定义
术语“转基因”是指已经掺入宿主基因组中或者能在宿主细胞中自主复制以及能导致一或多个细胞产物表达的DNA节段。举例的转基因能使宿主细胞或者从中产生的动物与相应的非转化的细胞或动物相比具有新的表型。
术语“转基因动物”是指非人动物、通常是哺乳动物，该动物具有在其细胞一部分中作为染色体外元件存在的非内源核酸序列或者稳定整合进其种系DNA中的非内源核酸序列。
术语“构建体”是指重组核酸、通常为重组DNA，其为了特异性核苷酸序列的表达而产生，或者用于构建其它重组核苷酸序列。所述重组核酸可编码例如嵌合或人源化多肽。
多肽在本文是指包含10个以上氨基酸的所有可能的氨基酸序列。
术语“可操纵地连接“是指DNA序列与调节序列以这样的方式连接，由此当合适的分子(例如转录激活蛋白)与调节序列结合时使得基因表达。
术语“可操纵地插入”是指感兴趣的核苷酸序列位于指导导入的感兴趣的核苷酸序列的转录和翻译的核苷酸序列的邻近。
转基因
包含本发明转基因的Aβ-肽多核苷酸包括Aβ-肽cDNA，且应也包括修饰的Aβ-肽cDNA。如本文所用，核酸的“修饰”可包括与参考序列相比一或几个核苷酸的添加、缺失或者取代。核酸的修饰可包括由于遗传密码的简并性而不改变编码的氨基酸序列的取代，或者导致保守取代。这种修饰可相应于有意产生的变化，如加入Poly A尾部，或者相应于在核酸复制期间作为突变产生的变化。
如本文所用，术语“基本相同的核苷酸序列”是指与参考多核苷酸具有足够相同性的DNA，由此其在中等严格或者更高严格杂交条件下与参考核苷酸杂交。与参考核苷酸序列具有“基本相同的核苷酸序列”的DNA与参考核苷酸序列的序列相同性范围可以为至少60％至至少95％。
短语“中等严格杂交条件”是指使得靶核酸与互补核酸结合的条件。杂交的核酸通常具有至少大约60％至至少大约95％的相同性。中等严格条件与如下条件等同：在50％甲酰胺、5×Denhart′s溶液、5×磷酸钠EDTA缓冲液(SSPE)、0.2％SDS(Aldrich)中在大约42℃杂交，随后在大约42℃在0.2×SSPE、0.2％SDS(Aldrich)中洗涤。
高严格杂交条件是指这样的条件，即允许仅那些在大约在65℃在0.018M NaCl中形成稳定杂交体的核酸序列杂交的条件，例如如果杂交体在大约65℃在0.018M NaCl中不稳定，其在高严格条件下也不稳定。高严格条件可例如是在50％甲酰胺、5x Denhart′s溶液、5x SSPE、0.2％SDS中在大约42℃杂交，随后在大约65℃在0.1×SSPE和0.1％SDS中洗涤。
其它合适的中等严格和高严格杂交缓冲液和条件为本领域技术人员熟知，且例如在如下文献中描述：Sambrook et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Press，Plainview，N.Y.(1989)；Ausubel et al.(Current Protocols in Molecular Biology(Supplement 47)，JohnWiley & Sons，New York(1999))。
由本发明的转基因编码的氨基酸序列可以是得自人的Aβ-肽序列，或者得自任何物种、优选鼠物种的Aβ-肽同源物。由本发明的转基因编码的氨基酸序列也可以是Aβ-肽氨基酸序列的片段，只要该片段保留全长Aβ-肽序列的一些或者全部功能即可。所述序列也可以是修饰的Aβ-肽序列。各种取代、缺失或者添加是改变、加入或者缺失一个氨基酸或者少量氨基酸(典型低于10％，更典型低于5％，更典型低于1％)。氨基酸序列的“修饰”包含氨基酸序列的保守取代。本领域熟知提供功能相似的氨基酸的保守取代表。如下六组均包含彼此保守取代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(1)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
只要所述多肽保留Aβ-肽的一些或全部结构和/或功能特性，其序列中可包含其它小修饰。举例的结构或功能特性包括序列相同性或实质相似性、抗体反应性、保守结构域如RNA结合结构域或酸性结构域的存在。
DNA构建体和载体
本发明进一步提供了包含上述Aβ-肽转基因的DNA构建体。如本文所用，术语“DNA”构建体是指DNA分子中遗传元件的特异性排列。除了人Aβ-肽或者其突变形式之外，本发明还提供了使用来自其它物种的多肽以及来自非人哺乳动物的突变的Aβ-肽的DNA构建体。
如果需要，所述DNA构建体可以被工程化为与合适的表达元件如启动子或增强子可操纵地连接，以使得所述DNA构建体中遗传元件在合适细胞或组织中表达。表达控制机制的使用使得可以定向输送和表达感兴趣的基因。例如，本发明的构建体可以使用表达盒构建，所述表达盒包含在5′-3′转录方向的与在脑组织中基因表达相关的转录和翻译起始区、编码突变体或野生型Aβ-肽的DNA，以及在宿主动物中起作用的转录和翻译终止区。也可以存在一或多个内含子。所述转录起始区可以对于宿主动物是内源的或者对于宿主动物是外来或外源的。
本文描述的DNA构建体可以掺入载体中以增殖或者转染进合适细胞中，产生过表达Aβ-肽的突变体非人动物，这些也包含在本发明范围内。本领域技术人员可以基于希望的性质选择载体，例如用于在特定细胞如哺乳动物细胞或者细菌细胞中产生载体。
载体可以含有使可操纵地连接的核酸组织特异性或者可诱导表达的调节元件。本领域技术人员可易于确定使Aβ-肽在希望的组织中表达的合适的组织特异性启动子或增强子。应注意如本文所述的组织特异性表达不需要在除了优选的组织之外的组织中完全无表达。相反，“细胞特异性”或者“组织特异性”表达是指感兴趣的基因的大部分表达是在优选的细胞类型或者组织中。
所述载体中也可以包含各种诱导型启动子或增强子，以表达Aβ-肽或者可以被调节的核酸。这种诱导型系统包括例如四环素诱导系统(Gossen &Bizard，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：5547-5551(1992)；Gossen et al.，Science，268：17664769(1995)；Clontech，Palo Alto，Calif.)；由重金属诱导的金属硫蛋白启动子；应答蜕皮激素或相关类固醇如muristerone的昆虫类固醇激素(No et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：3346-3351(1996)；Yao et al.，Nature，366：476-479(1993)；Invitrogen，Carlsbad，Calif.)；由类固醇如糖皮质激素和雌激素诱导的小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)(Lee et al.，Nature，294：228-232(1981)；以及可由温度改变诱导的热激蛋白启动子；大鼠神经元特异性烯醇酶基因启动子(Forss-Petter，et al.，Neuron 5；197-197(1990))；人β-肌动蛋白基因启动子(Ray，et al.，Genes and Development(1991)5：2265-2273)；人血小板衍生生长因子B(PDGF-B)链基因启动子(Sasahara，et al.，Cell(1991)64：217-227)；大鼠钠离子通道基因启动子(Maue，et al.，Neuron(1990)4：223-231)；人铜-锌过氧化物岐化酶基因启动子(Ceballos-Picot，et al.，Brain Res.(1991)552：198-214)；以及哺乳动物POU结构域调节基因家族成员的启动子(Xi et al.，(1989)Nature 340：35-42)。
调节元件，包括启动子或增强子，根据调节性质可以是组成型或被调节的，且可以在各种组织或者在一种或一些特殊组织中被调节。调节序列或者调节元件与本发明的多核苷酸序列之一可操纵地连接，由此所述多核苷酸序列与所述调节序列之间的物理和功能关系使得所述多核苷酸序列转录。可用于在真核细胞中表达的载体可包括例如调节元件，包括CAG启动子、SV40早期启动子、巨细胞病毒启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)类固醇诱导的启动子、Pgtf、Moloney小鼠白血病病毒(MMLV)启动子、thy-1启动子等等。
如果需要，所述载体可含有选择标记。如本文所用，“选择标记”是指为已经导入选择标记的细胞提供可选择表型的遗传元件。选择标记通常是基因，其基因产物提供对于抑制细胞生长或者杀死细胞的物质的抗性。许多选择标记可用于本发明的DNA构建体中，包括例如Neo、Hyg、hisD、Gpt和Ble基因，如在如下文献中描述：Ausubel et al.(Current Protocols inMolecular Biology(Supplement 47)，John Wiley & Sons，New York(1999))和美国专利No.5,981,830。可用于选择选择标记存在的药物包括例如对于Neo的G418，对于Hyg的潮霉素，对于hisD的组氨醇，对于Gpt的黄嘌呤以及对于Ble的博来霉素(见Ausubel et al，supra，(1999)；美国专利No.5,981,830)。本发明的DNA构建体可掺入阳性选择标记、阴性选择标记或者这两种标记(见例如美国专利No.5,981,830)。
根据本发明优选的是如下DNA构建体和融合蛋白：mTRH-Aβ(N3E-42)，mTRH-Aβ(N3Q-42)。
优选的克隆载体是含有Thy-1序列的pUC18。
非人转基因动物
本发明主要提供了非人转基因动物，其基因组包含编码Aβ-肽的转基因。所述DNA片段可以通过本领域技术人员已知的任何方法整合进转基因动物的基因组中。含有希望的基因序列的DNA分子可以通过任何方法导入多能细胞如ES细胞中，由此使得导入的分子在其同源区经历重组。可以使用的技术包括但不限于磷酸钙/DNA共沉淀法、DNA显微注射进细胞核中、电穿孔、细菌原生质体与完整细胞融合、转染和聚阳离子方法(例如e.g.，polybrene、polyornithine等)。所述DNA可以是单链或双链DNA，线性或环状(见例如Hogan et al.，Manipulating the Mouse Embryo：A LaboratoryManual Cold Spring Harbor Laboratory(1986)；Hogan et al.，Manipulating theMouse Embryo：A Laboratory Manual，second ed.，Cold Spring HarborLaboratory(1994)，美国专利No.5,602,299、5,175,384、6,066,778、4,873,191和6,037,521；retrovirus mediated gene transfer into germ lines(Van der Puttenet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：6148-6152(1985))；gene targeting inembryonic stem cells(Thompson et al.，Cell 56：313-321(1989))；electroporation of embryos(Lo，Mol Cell.Biol.3：1803-1814(1983))；以及sperm-mediated gene transfer(Lavitrano et al.，Cell 57：717-723(1989))。
例如，合子是显微注射的良好靶，显微注射合子的方法为本领域熟知(见US 4,873,191)。
在不同发育阶段的胚胎细胞也可以用于导入转基因以产生转基因动物。根据胚胎细胞的发育阶段使用不同方法。这种转染的胚胎干细胞(ES)可以因此在其导入胚泡阶段胚胎的囊胚腔中之后使胚胎定居且促成所得嵌合动物的种系(见Jaenisch，Science 240：1468-1474(1988)综述)。在将转染的ES细胞导入囊胚腔中之前，如果转基因提供这种选择方式，可以对转染的ES细胞进行各种选择以富集具有整合的转基因的ES细胞比例。或者，可以使用PCR筛选具有整合的转基因的ES细胞。
另外，逆转录病毒感染也可以用于在非人动物中导入转基因。发育中的非人胚胎可以在体外培养成胚泡阶段。在此期间，分裂球可以是进行逆转录病毒感染的靶(Jaenisch，Proc.Nati.Acad.Sci.USA 73：1260-1264(1976))。通过酶处理除去透明带获得分裂球的有效感染(Hogan et al.，supra，1986)。用于导入转基因的病毒载体系统典型是携带转基因的复制缺陷的逆转录病毒(Jahner et al.，Proc.Natl.Acad Sci.USA 82：6927-6931(1985)；Vander Putten et al.，Proc.Natl.Acad Sci.USA 82：6148-6152(1985))。通过在单层产生病毒的细胞上培养所述分裂球可易于且有效地获得转染(Van der Putten，supra，1985；Stewart et al.，EMBO J.6：383-388(1987))。或者，可以在晚期阶段进行感染。可以将病毒或者产生病毒的细胞注射进所述分裂球中(Jahner D.et al.，Nature 298：623-628(1982))。大多数建立者(founder)是嵌合转基因的，因为掺入仅在细胞亚类中发生，形成转基因动物。再者，所述建立者在基因组的不同位置可含有转基因的各种逆转录病毒插入，其在后代中通常是分离的。另外，转基因可以通过妊娠中期胚胎的子宫内逆转录病毒感染导入种系中(Jahner et al.，supra，1982)。本领域技术人员已知的使用逆转录病毒或者逆转录病毒载体产生转基因动物的其它方式包括将逆转录病毒颗粒或者产生逆转录病毒的丝裂霉素C处理的细胞显微注射进受精卵或者早期胚胎的卵周隙中(WO 90/08832(1990)；Haskell and Bowen，Mal.Reprod.Dev.40：386(1995))。
也可以使用任何其它技术将转基因导入非人动物中，例如敲入(knock-in)或者拯救(rescue)技术，以解决本发明的问题。所述敲入技术为本领域熟知，例如Casas et al.(2004)Am J Pathol 165，1289-1300所述。
一旦产生建立者动物，可以使其繁殖、近交、远交或者杂交以产生特定动物群体。举例的这种繁殖策略包括但不限于：具有一个以上整合位点的建立者动物的远交，以建立独立品系；独立品系的近交以产生由于每个转基因的加合表达作用而以更高水平表达转基因的复合转基因动物(compound transgenics)；杂合转基因小鼠的杂交产生对于指定整合位点是纯合的小鼠，以扩大表达且消除需要通过DNA分子筛选动物；独立纯合品系的杂交产生复合的杂合或纯合品系；在不同的近交背景繁殖动物，以检验修饰等位基因对于转基因表达的作用以及表达的作用。
筛选并评估所述转基因动物，以选择具有感兴趣表型的那些动物。最初的筛选可以使用例如Southern印迹分析或者PCR进行，分析动物组织以核实已经发生转基因整合。也可以使用一些技术评定转基因动物的组织中转基因的mRNA表达水平，所述技术包括但不限于对得自动物的组织样品进行Northern印迹分析、原位杂交分析和逆转录酶-PCR(rt-PCR)。合适组织的样品可以通过使用特异于所述转基因的抗体进行免疫细胞化学评估。可进一步鉴定所述转基因非人哺乳动物以鉴别具有可用于本发明方法中的表型的那些动物。特别地，可以使用本文揭示的方法筛选过表达转基因(如QPCT或QPCTL)的转基因非人哺乳动物。例如，可以在荧光显微镜下观测组织切片的荧光存在，表示存在报道基因。
影响Aβ-肽的组织特异性表达的另一种方法是使用组织特异性启动子。合适的组织特异性启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子(肝特异性；Pinkert et al.，(1987)Genes Dev.1：268-277)；淋巴细胞特异性启动子(Calameand Eaton(1988)Adv.Immunol.43：235-275)，特别是T细胞受体启动子(Winoto and Baltimore(1989)EMBO J.8：729-733)以及免疫球蛋白启动子(Banerji et al.，(1983)Cell 33：729-740；Queen and Baltimore(1983)Cell33：741-748)，神经元特异性启动子(例如神经丝蛋白启动子、Thy-1启动子或者Bri-蛋白启动子；Sturchler-Pierrat et al.，(1997)Proc.Natl.Acad Sci.USA94：13287-13292，Byrne and Ruddle(1989)PNAS 86：5473-5477)，胰腺特异性启动子(Edlund et al.，(1985)Science 230：912-916)，心脏特异性表达启动子(α肌浆球蛋白重链启动子，Subramaniam，A，Jones WK，Gulick J，Wert S，Neumann J，and Robbins J.Tissue-specific regulation of the alpha-myosinheavy chain gene promoter in transgenic mice.J Biol Chem 266：24613-24620，1991.)，以及乳腺特异性启动子(例如乳清蛋白启动子；美国专利No.4,873,316和欧洲专利申请公开No.264,166)。
本发明进一步提供了含有本发明的DNA构建体的分离的细胞。所述DNA构建体可以通过任何熟知的转染方法导入细胞中(Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Press，Plainview，N.Y.(1989)；Ausubel et al.，supra，(1999))。或者，所述细胞可以通过从如本文所述产生的突变的非人哺乳动物中分离细胞而获得。因此，本发明提供了分离自本发明Aβ-肽突变体非人哺乳动物、特别是Aβ-肽突变小鼠的细胞。所述细胞可得自纯合的Aβ-肽突变体非人哺乳动物如小鼠，或者杂合的Aβ-肽突变体非人哺乳动物如小鼠。
效应物(Effectors)
如本文所用，效应物被定义为结合酶并增加(促进)或降低(抑制)其体外和/或体内活性的分子。一些酶具有影响其催化活性的分子的结合位点；刺激分子称作激活物。酶甚至可具有多个位点以识别一个以上的激活物或者抑制剂。酶可以检测多种分子的浓度，且使用该信息改变其自身活性。
效应物可以调节酶活性，因为酶可以呈现出活性和无活性构象：激活物是阳性效应物，抑制剂是阴性效应物。效应物不仅在酶的活性位点起作用，而且也在调节位点或者变构位点起作用，该术语用于强调指出调节位点是与催化位点不同的酶元件，且用于区分这种调节形式与在催化位点底物与抑制剂之间的竞争(Darnell，J.，Lodish，H.and Baltimore，D.1990，Molecular Cell Biology 2″d Edition，Scientific American Books，New York，page 63)。
酶抑制剂
可逆的酶抑制剂：包含竞争性抑制剂、非竞争性可逆的抑制剂、慢结合或紧密结合的抑制剂、过渡态类似物以及多底物类似物。
竞争性抑制剂示出：
与酶的非共价相互作用，
与底物竞争酶活性位点。
可逆的酶抑制剂的主要作用机制以及解离常数的定义可以如下文所示：
Figure GPA00001052853100211
K D = K i = k off k on
酶-抑制剂[E-I]复合物的形成阻止底物的结合，因此反应不能进行产生正常生理学产物P。较大的抑制剂浓度[I]导致较大的[E-I]，剩下的底物可以结合的游离酶较少。
非竞争性可逆的抑制剂
在除了活性位点之外的位点(变构结合位点)结合
导致酶的构象变化，降低或终止其催化活性。
慢结合或者紧密结合抑制剂
是竞争性抑制剂，其中抑制剂与酶之间的平衡缓慢达到，
(kon较低)，可能是由于必须在所述酶或抑制剂中发生的构象变化所致，
通常是过渡态类似物，
在与酶浓度相似的浓度是有效的(亚纳摩尔KD值)
由于koff值如此低，因此这些类型的抑制剂“几乎”是不可逆的。
过渡态类似物
是竞争性抑制剂，其模拟催化反应的酶的过渡态。由于降低过渡态的能量而发生酶催化作用，因此过渡态结合有利于底物结合。
多底物类似物
对于包含两或多个底物的反应，可以设计竞争性抑制剂或者过渡态类似物使其含有与所述两或多个底物类似的结构特征。
不可逆的酶抑制剂：驱动未结合的酶和抑制剂与酶抑制剂复合物之间的平衡(E+I←→E-I)一路向右到共价键(～100kcal/mole)，使得抑制作用不可逆。
亲和性标记试剂
活性位点定向的不可逆抑制剂(竞争性不可逆抑制剂)由酶识别(可逆的，特异性结合)，随后共价键形成，
与底物、过渡态或者产物结构相似，使得药物与靶酶之间可以特异性相互作用，
含有反应性官能团(例如亲核物质，-COCH2Br)，使得共价键形成。
如下反应方案描述了具有其靶酶的活性位点定向试剂，其中KD是解离常数，kinactivation是共价键形成速率。
基于机制的酶失活物(也称作自杀抑制剂)是活性位点定向试剂(惰性)，其结合酶活性位点，在此其通过酶催化能力被转化为活性形式(激活)。一旦激活，抑制剂与酶之间形成共价键。
如下反应方案示出基于机制的酶失活物的作用机制，其中KD是解离常数，k2是一旦与酶结合所述抑制剂的激活速率，k3是激活的抑制剂、P与所述酶的解离速率(产物可以仍是活性的)，k4是激活的抑制剂与酶之间共价键形成的速率。
Figure GPA00001052853100222
失活(共价键形成，k4)必须在解离(k3)之前发生，否则现在为反应性的抑制剂释放进环境中。分配比率k3/k4：释放的产物与失活的比率应最小化，以有效地失活该系统及使不希望的副反应最小化。
较大的分配比率(有利解离)导致非特异性反应。
非竞争性酶抑制剂：从非竞争性抑制剂(仅结合ES复合物的抑制剂)的定义中，可以写出如下等式：
Figure GPA00001052853100231
ES复合物解离底物，解离常数等于Ks，而ESI复合物不解离底物(即具有等于0的Ks值)。预期Michaelis-Menten类型酶的Km降低。增加底物浓度导致ESI浓度增加(不能进展为反应产物的复合物)，因此抑制作用不能被除去。
根据本发明优选的是竞争性酶抑制剂。
最优选的是竞争性可逆的酶抑制剂。
术语“ki”或者“KI”和“KD”是结合常数，其描述了抑制剂与酶的结合以及随后从酶中释放。另一测量是“IC50”值，其反映抑制剂浓度，在给定底物浓度产生50％酶活性。
根据本发明优选的是呈现谷氨酰胺酰环化酶活性的酶的抑制剂。更优选地，所述呈现谷氨酰胺酰环化酶活性的酶的抑制剂是竞争性抑制剂。根据本发明更优选的是呈现谷氨酰胺酰环化酶活性的酶的竞争性抑制剂，其是小分子。尤其优选的是呈现谷氨酰胺酰环化酶活性的酶的小分子抑制剂，其结合谷氨酰胺酰环化酶的活性位点金属离子。
如本文所用，术语“QC”包含谷氨酰胺酰环化酶(QC，QPCT)和QC-样(QPCTL)酶。QC与QC-样酶具有相同或相似的酶活性，进一步定义为QC活性。在这方面，QC-样酶可以在其分子结构方面与QC截然不同。
如本文所用，术语“QC活性”定义为在氨释放下N-末端谷氨酰胺残基分子内环化为焦谷氨酸(pGlu*)或者N-末端L-高谷氨酰胺(homoglutamine)或者L-β-高谷氨酰胺分子内环化为环状焦-高谷氨酰胺衍生物。见方案1和2。
方案1：QC对谷氨酰胺的环化
Figure GPA00001052853100241
方案2：QC对L-高谷氨酰胺的环化
如本文所用，术语“EC”包含QC和QC样酶作为谷氨酸环化酶(EC)的副活性(side activity)，进一步定义为EC活性。
如本文所用，术语“EC活性”定义为N-末端谷氨酸残基通过QC分子内环化为焦谷氨酸(pGlu*)。见方案3。
方案3：QC(EC)对不带电谷氨酰肽的N-末端环化作用
Figure GPA00001052853100243
术语“QC-抑制剂”、“谷氨酰胺酰环化酶抑制剂”为本领域技术人员已知，是指抑制谷氨酰胺酰环化酶(QC)的催化活性或者其谷氨酰环化酶(EC)活性的酶抑制剂。
谷氨酰胺酰环化酶抑制剂的效价
鉴于与QC抑制相关，在优选的实施方案中，本发明方法和医学应用使用这样的物质，其对于QC抑制的Ki为10μM或更低，更优选1μM或更低，甚至更优选0.1μM或更低，或者0.01μM或更低，或者最优选0.001μM或更低。事实上，本发明包含Ki值为较低微摩尔、优选纳摩尔及甚至更优选皮摩尔范围的抑制剂。因此，虽然所述活性物质在本文为方便起见描述作“QC抑制剂”，但是应理解这种命名法不限制本发明主题为特定的作用机制。
QC抑制剂的分子量
通常地，本发明方法和医学应用的QC抑制剂是小分子，例如分子量为1000g/mole或更低，500g/mole或更低，优选400g/mole或更低，及甚至更优选350g/mole或更低，以及300g/mole或更低。
肽
如果本发明中提及肽或氨基酸，根据如下常规列表，每个氨基酸残基以单字母或者三字母名称表示，相应于氨基酸的通用名：
氨基酸          单字母符号   三字母符号
丙氨酸          A            Ala
精氨酸          R            Arg
天冬酰胺        N            Asn
天冬氨酸        D            Asp
半胱氨酸        C            Cys
谷氨酰胺        Q            Gln
谷氨酸          E            Glu
甘氨酸          G            Gly
组氨酸          H            His
异亮氨酸        I            Ile
亮氨酸          L            Leu
赖氨酸          K            Lys
甲硫氨酸        M            Met
苯丙氨酸        F            Phe
脯氨酸        P         Pro
丝氨酸        S         Ser
苏氨酸        T         Thr
色氨酸        W         Trp
酪氨酸        Y         Tyr
缬氨酸        V         Val
如本文所用，术语“Aβ-肽”是指选自如下的Aβ-肽：SEQ ID No：1所示Aβ3E-42，SEQ ID No：2所示AβN3Q-42，Aβ(N3pGlu-42)，SEQ ID No：3所示Aβ3E-40，SEQ ID No：4所示AβN3Q-40及Aβ(N3pGlu-42)。
如本文所用，“Aβ-肽相关疾病”是指特征在于Aβ-肽或者由其介导的所有那些疾病、失调或病症。
治疗剂的测定和鉴别
本发明的方法和组合物特别用于评估Aβ-肽的效应物，以及用于开发治疗和预防淀粉样蛋白相关疾病的药物和治疗剂，所述疾病如轻度认知障碍、阿尔茨海默病、唐氏综合征中的神经变性、家族性丹麦型痴呆和家族性英国型痴呆。
本发明的转基因动物或者转基因动物的细胞可用于各种筛选测定中。例如，任何各种怀疑影响Aβ-肽积累的潜在物质以及适当的拮抗剂和封闭治疗剂均可以被筛选，通过给予转基因动物并评定这些物质对于细胞的功能和表型以及对于转基因动物的(神经学)表型的作用进行筛选。
行为研究也可用于测试潜在的治疗剂，如设计为评定动作技能、学习和记忆缺陷的那些研究。这种测试的一个例子是Morris水迷宫(Morris(1981)Learn Motivat 12：239-260)。此外，行为研究可包括位置移动活动(locomotoractivity)的评估，如用转棒和旷场进行的评估。
本发明的方法可有利地使用分离自纯合或杂合Aβ-肽突变的非人哺乳动物的细胞，用以研究淀粉样积累以及检测潜在的治疗化合物。本发明的方法也可使用表达Aβ-肽的细胞，如转染的细胞系。
过表达Aβ-肽的细胞可用于体外方法中，以筛选作为治疗Aβ相关疾病的潜在治疗剂的化合物。在这种方法中，将化合物与过表达Aβ-肽的细胞、转染的细胞或者衍生自Aβ-肽突变的非人动物的细胞接触，并筛选与Aβ-肽的表达相关的表型变化。细胞测定以及转基因动物中Aβ产生的改变可以通过本领域技术人员熟知的方法评定。
Aβ-融合多肽如Aβ-肽可特别用于这种筛选方法，因为Aβ-肽的表达可以通过荧光强度监测。其它举例的融合多肽包括其它荧光蛋白，或者其修饰物，谷胱甘肽S转移酶(GST)，麦芽糖结合蛋白，聚组氨酸，FLAG等，以及任何类型的附加表位。这种融合多肽可以例如使用特异于该融合多肽的抗体检测。所述融合蛋白可以是完整多肽或者其功能部分，只要该功能部分保留希望的性质如抗体结合活性或者荧光活性即可。
本发明进一步提供了鉴别用于治疗上述疾病的潜在治疗剂的方法。所述方法包括将含有包含编码Aβ-肽的多核苷酸的DNA构建体的细胞与化合物接触，筛选Aβ-肽生成降低的细胞，从而鉴别用于治疗Aβ-肽相关疾病的潜在治疗剂。所述细胞可以分离自具有含有Aβ-肽DNA构建体的有核细胞的转基因非人哺乳动物。或者，所述细胞可含有包含编码具有Aβ-肽的绿色荧光蛋白融合多肽或者其它融合多肽的核酸的DNA构建体。
此外，表达Aβ-肽的细胞可用于初步筛选中，以鉴别作为潜在治疗剂的化合物，所述化合物具有改变Aβ-肽表达相关表型的活性。在使用Aβ-肽突变的非人哺乳动物的体内筛选中，合适的对照细胞可用于对比筛选结果。如果需要，可以使用本发明的Aβ-肽突变的非人哺乳动物在体内进一步检测通过使用表达Aβ-肽的细胞进行的初始体外筛选鉴别的化合物的效力。因此，本发明提供了使用基于细胞的测定筛选大量化合物的方法，例如使用高通量筛选，以及提供了在Aβ-相关疾病的动物模型中进一步检测作为治疗剂的化合物的方法。
QC参与焦谷氨酸的形成，焦谷氨酸有利于淀粉样β-肽的聚集。因此，抑制QC可以不依赖于发生环化的机制而阻止导致阿尔茨海默病和唐氏综合征发生和进展的形成斑的[pGlu3]Aβ3-40/42/43或者[pGlu11]Aβ11-40/42/43的沉淀(precipitation)。
在淀粉样β-肽的位置3、11和22发现谷氨酸。其中位置22(相应于淀粉样前体蛋白APP770的第693位氨基酸，Swissprot entry：P05067)从谷氨酸(E)至谷氨酰胺(Q)的突变已经被描述为所谓的荷兰型脑动脉淀粉样变的突变。
本领域已经描述了在位置3和11具有焦谷氨酸残基的淀粉样β-肽比Aβ1-40/4243更具细胞毒性和疏水性(Saido T.C.2000 Medical Hypotheses54(3)：427-429)。
通过β-分泌酶β-位点淀粉样前体蛋白裂解酶(BACE)在不同位点(Huse J.T.et al.2002 Biol.Chem.277(18)：16278-16284)和/或通过氨基肽酶处理可以产生多个N-末端变化。
目前没有实验证据支持Glu1-肽通过未知的谷氨酰环化酶(EC)经酶转化为pGlu-肽(Garden，R.W.，Moroz，T.P.，Gleeson，J.M.，Floyd，P.D.，Li，L.J.，Rubakhin，S.S.，and Sweedler，J.V.(1999)J Neurochem 72，676-681；HosodaR.et al.(1998)J Neuropathol Exp Neurol.57，1089-1095)。没有鉴别能环化Glu1-肽的这种酶活性，其在弱碱性或者中性pH条件下在N-末端质子化且具有负电荷的Glu1γ-羧酸部分。
QC对Gln1-底物的活性在低于pH 7.0条件下显著降低。相反，看起来Glu1-转化可以在酸性反应条件下发生(例如Iwatsubo，T.，Saido，T.C.，Mann，D.M.，Lee，V.M.，and Trojanowski，J.Q.(1996)Am J Pathol 149，1823-1830所述)。
先前研究了QC在弱酸性条件下是否能识别并转换淀粉样-β肽衍生的肽(WO 2004/098625)。因此，合成并研究了作为酶的潜在底物的肽[Gln3]Aβ1-11a、Aβ3-11a、[Gln3]Aβ3-11a、Aβ3-21a、[Gln3]Aβ3-21a和[Gln3]Aβ3-40。选择这些序列用以模拟天然N-末端和C-末端截短的[Glu3]Aβ肽以及[Gln3]Aβ肽，它们由于翻译后Glu-酰胺化而可能出现。
研究表明木瓜和人QC催化谷氨酰胺酰和谷氨酰环化。显然，QC的主要生理学功能是在激素分泌之前或期间在内分泌细胞中通过谷氨酰胺环化完成激素成熟。已知这种分泌囊泡是酸性pH。因此，这种酶在pH 5.0-7.0范围的副活性可以是其新发现的也环化Glu-Aβ肽的谷氨酰环化酶活性。然而，由于与Gln-转化相比更缓慢地发生Glu-环化，质疑的是谷氨酰环化是否起明显的生理学作用。然而，在神经变性疾病的病理学中，谷氨酰环化是相关的。
对这种酶反应的pH依赖性的研究已经示出未质子化的N-末端是Gln1-肽环化所必需的，因此底物的pKa-值等于QC催化作用的pKa-值。因此，QC稳定未质子化的α-氨基部分对γ-羰基碳的分子内亲核攻击。
与含有N-末端谷氨酰胺的肽存在的一价电荷相反，含有Glu的肽的N-末端Glu残基在中性pH主要是二价电荷。谷氨酸呈现出对于γ-羧基和α-氨基部分分别为大约4.2和7.5的pKa值，即在中性pH及之上，尽管α-氨基氮是部分或全部未质子化及亲核的，γ-羧基基团是未质子化的，因此不产生亲电子羰基活性。因此，分子内环化是不可能的。
然而，在大约5.2-6.5的pH范围内，在其各自pKa值之间，这两个官能团均以非离子化形式存在，浓度为总含有N末端Glu的肽的1-10％(-NH2)或者10-1％(-COOH)。结果，在弱酸性pH范围存在N-末端Glu肽的种类，其携带无电荷的这两个基团，且因此QC可以稳定分子内环化为pGlu-肽的中间体，即如果γ-羧基基团质子化，则羰基碳是足够亲电子的以允许未质子化α-氨基基团的亲核攻击。在这个pH下，羟基离子发挥离去基团的功能。这些假说通过QC催化的Glu-βNA转化获得的pH依赖性数据确证。与QC催化的Gln-βNA的谷氨酰胺转化相反，催化的最佳pH移动到大约pH 6.0的酸性范围，即其中底物分子同时大量携带质子化的γ-羧基和未质子化的α-氨基基团的pH范围。此外，动力学确定的7.55±0.02的pKa值与通过滴定确定的Glu-β3NA的α-氨基基团的值(7.57±0.05)非常一致。
在生理学上，在pH 6.0条件下，QC催化的谷氨酸环化的二级速率常数(或者特异性常数，kcat/KM)与谷氨酰胺环化相比慢1×105-1×106倍。然而，这两个模型底物Glu-βNA和Gln-βNA的非酶转换是可以忽略的，与观测的可以忽略的pGlu-肽形成一致。因此，对于通过QC催化的pGlu-形成，从酶与非酶速率常数比率中可以估计至少108的加速(对比酶催化的二级速率常数与相应的非酶环化作用一级速率常数，对于Gln-和Glu-转化的催化proficiency因子分别为109-1010/M)。从这些数据中推断在体内仅通过酶途径使pGlu-形成似乎是可能的。
由于QC在脑中高度富集，且考虑到最近发现的30μM的(Gln-)TRH-样肽成熟的0.9.分钟的高周转率(Prokal，L.，Prokai-Tatrai，K.，Ouyang，X.，Kim，H.S.，Wu，W.M.，Zharikova，A.，and Bodor，N.(1999)J Med Chem 42，4563-4571)，如果提供相似的反应条件，则可以推测合适的谷氨酸底物的大约100小时的环化半衰期。此外，鉴于QC/EC脑在分泌途径中的区室化和定位，实际的体内酶和底物浓度和反应条件可以更有利于在完整细胞中酶环化。且如果N-末端G1u被转化为Gln，可以预期由QC介导的更快速的pGlu形成。在体外，这两个反应均通过应用QC/EC-活性抑制剂而被抑制。
总之，本领域揭示了在脑中高度富集的人QC很可能是从Glu-Aβ和Gln-Aβ前体中形成淀粉样pGlu-Aβ肽的催化剂，其构成在阿尔茨海默病中发现的50％以上的斑沉积。这些发现鉴别了QC/EC在老年斑形成中起作用，并因此是治疗阿尔茨海默病、唐氏综合征中神经变性、家族性丹麦型痴呆和家族性英国型痴呆的新的药物靶位。
除了在位置1具有天冬氨酸而起始的Aβ(AβN1D)之外，AD脑中大多数淀粉样-β肽在其N-末端引出大的异质性。如上所述，优势种类在位置3具有焦谷氨酸而起始(AβN3(pGlu))。pGlu残基源自谷氨酰胺酰环化酶(QC)对N-末端谷氨酸的环化。然而，N-谷氨酸残基转化为pGlu较慢，因为QC天然转化N-谷氨酰胺底物(图1和图4)。tgN3E-42小鼠中的Aβ(N3E-42)和tgN3Q-42小鼠中的Aβ(N3Q-42)作为与小鼠促甲状腺激素释放激素(mTRH)的前原序列(pre-pro-sequence)的融合蛋白表达(图1b)，通过分泌途径转运(Cynis，H.，et al.Inhibition of glutaminyl cyclase alters pyroglutamateformation in mammalian cells，Biochim Biophys Acta 1764，1618-1625(2006))。对野生型(WT)、QC、tgN3E-42、tgN3E-42-QC双转基因和tgN3Q-42小鼠脑裂解物的Aβ(x-42)和Aβ(N3pGlu-42)进行ELISA量化表明显著差异(图1c-e)。虽然野生型和QC转基因小鼠产生少量内源Aβ(x-42)(WT，1.29±0.91；QC，1.36±0.61pg/mg w.w.)，但是tgN3E-42小鼠产生32.57±2.27 Aβx-42(pg/mg w.w.)，这个结果显著高于野生型小鼠(P＜0.0001)。在tgN3E-42-QC双转基因小鼠中检测到Aβ(x-42)增加倾向，为53.29±10.13(pg/mg w.w.)。TgN3Q-42小鼠与tgN3E-42小鼠(P＜0.0001)和tgN3E-42-QC双转基因小鼠(P＜0.0001)小鼠相比示出Aβ(x-42)增高12倍(410.2±21.52pg/mg w.w)(图1c)。在野生型和QC小鼠中，通过ELISA检测不到AβN3(pGlu)(图1d)。令人感兴趣地，tgN3E-42(1.89±0.16pg/mg w.w.)与tgN3E-42-QC双转基因小鼠(2.34±0.14pg/mg w.w.)之间存在显著差异。tgN3E-42-QC双转基因小鼠产生增加1.2倍量的Aβ(N3pGlu-42)(P＜0.05)。这个结果证实了近来关于QC-催化N-谷氨酸形成的发现(Cynis，H.，et al.Inhibition of glutaminylcyclase alters pyroglutamate formation in mammalian cells，Biochim BiophysActa 1764，1618-1625(2006))。tgN3Q-42小鼠示出与tgN3E-42小鼠相比显著较高的Aβ(N3pGlu-42)水平(53.23±4.59pg/mg w.w)(增加28倍以上；P＜0.0001)。Aβ(N3pGlu-42)与总Aβ(x-42)的比率表明相似结果。TgN3E-42小鼠的该比率为0.06±0.005，相比之下tgN3E-42-QC双转基因小鼠的该比率为0.05±0.005(P＝0.25)。TgN3Q-42小鼠示出明显增加的比率，为0.11±0.015(P＜0.0001)(图1e)。
令人感兴趣地，tgN3Q-42转基因小鼠显现显而易见的肉眼可见异常性，包括生长延迟，小脑萎缩、过早死亡表型(图2)以及明显的神经学缺陷，特征在于丧失运动协调性和共济失调。与对照组(雌性，19.90±0.40g；雄性，24.43±1.23g)相比，tgN3Q-42小鼠在2月龄的体重显著下降(雌性，12.20±0.95g；雄性17.60±0.51g；均是显著的：P＜0.001)。神经学表型类似Purkinje细胞变性小鼠模型的表型。使用Aβ的抗体4G8(表位：氨基酸17-24)，tgN3Q-42小鼠脑切片示出主要在CA1锥体神经元和Purkinje细胞中的强免疫反应性(图3和5)。其它脑部区域中的神经元也是阳性的，但是不太丰富。胞外Aβ沉积不是最主要的染色模式，但是在皮质、海马、小脑、丘脑及其它皮质下区域中也作为弥漫性斑块出现。在小脑分子层、梨状神经元层(piriform)和颗粒(granular)层未检测到斑块，而仅在Purkinje细胞内发现Aβ免疫反应性(图3e，f)。大多数(如果不是全部)Purkinje细胞也是Aβ(N3pGlu)阳性的(图3f，g)。对tgN3Q-42小鼠进行神经病理学分析证实Purkinje细胞的神经变性，其是遍在蛋白(蛋白质降解标记)阳性的(图3l)，且伴随小脑分子层和白质束中富集小胶质细胞和星形胶质细胞增生(图3h-k)。这个结果与年龄依赖性运动受损和小脑萎缩相关(图2c)。
从杂合tgN3E-42(tgN3E-42het)中产生纯合的tgN3E-42动物(tgN3E-42hom)，以增加转基因的表达。事实上，tgN3E-42 hom小鼠与tgN3E-42 het小鼠相比积累显著更高量的pGlu-Aβ(3-42)。Aβ的积累和沉积主要在海马CA1层(图3B)。在4周龄阶段，根据ELISA量化pGlu-Aβ形成达到最大，随后降低至较低浓度(图11)。相反，总Aβ浓度增加直至3月龄。Aβ(N3pGlu)的形成因此加速其它Aβ种类的沉积。因此，使用啮齿动物Aβ的抗体观测CA1层染色。pGlu-Aβ产生增加导致认知下降，如在实施例2所述及图8、9A、图9B和图9C例证的行为测定中观测。因此，tgN3E-42hom代表优异的小鼠模型，用以研究通过QC形成的pGlu-修饰的淀粉样肽的作用，及用以评估目的在于如通过QC抑制而降低Aβ(N3pGlu)的治疗策略。
tgN3E-42het、tgN3E-42hom和tgN3Q-42het小鼠脑中pGlu-Aβ含量对比示出显著差异。在纯合tgN3E-42和杂合tgN3Q-42小鼠中，在其生命的前几周观测到Aβ3(pE)-42的快速形成，tgN3E-42het小鼠和过表达携带Swedish突变的淀粉样前体蛋白的转基因小鼠(APPsw小鼠)则相反(图12)。对比示出tgN3E-42和tgN3Q-42品系的另一重要且独特的特征：脑中pGlu-Aβ含量在几周内达到在现有技术其它小鼠模型例如APPsw小鼠中从未达到的量。例如，在16个月龄的APPsw小鼠中，脑中Aβ(N3pGlu)比1-2月龄的tgN3Q-42或者tgN3E-42hom小鼠低大约4-5倍。然而，这些APPsw小鼠中荷载的总Aβ超过tgN3E-42hom和tgN3Q-42小鼠的100倍以上(图12)。
这个实施例证实转基因策略提供上好的机会以研究不同Aβ肽如Aβ(N3pGlu)在AD病理学中的作用。因此，通过调整转基因，也可以神经元特异性表达其它N-和C-末端Aβ以及研究其神经毒性潜力。
tgN3E-42和tgN3Q-42小鼠最终证实了pGlu-修饰的Aβ肽的神经毒性，因为pGlu-Aβ(3-42)的积累伴随神经元丧失、长期增强(long-term potentiation)和认知障碍。这些组合的特征对于这些动物模型是独特的，因此代表在阿尔茨海默病样病理学啮齿动物模型中的主要进展。
在纯合tgN3E-42小鼠和野生型同窝出生的小鼠中评价海马长期增强(LTP)，以研究行为障碍的生理学基础。在5个月龄，处死tgN3E-42纯合和野生型同窝出生小鼠，制备海马切片用以离体测量LTP。在tgN3E-42纯合小鼠的切片中，LTP显著降低(图13)。在应用首次强直收缩训练(tetanustrain)后不久，与野生型小鼠的fEPSP-slope(在时间点1为251.4±18.8％)相比，其fEPSP-slope显著减小(在时间点1为205.3±13.2％)。tg小鼠fEPSP增强的受损随着时间保持，在LTP测量4小时后仍显著降低(tgN3E-42小鼠：114.0±6.8％；野生型小鼠：157.1±14.0％，在时间点240)。分析刺激强度与所得信号大小之间的相关性(fEPSP-slope)，示出tgN3E-42小鼠与野生型小鼠相比其EPSP slope显著降低(tgN3E-42hom小鼠最大EPSP slope：3.7±0.4mV/ms；野生型小鼠最大EPSP slope：5.6±0.5mV/ms，均为3mV刺激强度)。输入-输出-曲线数值是平均值±S.E.M。
数据表明tgN3E-42小鼠的遗传修饰削弱了基线突触传递及因此的正常神经元功能以及突触可塑性(LTP)。LTP破坏导致海马依赖性记忆功能受损，因为在小鼠脑中该区域的学习和记忆的细胞相关性被破坏。降低的EPSP振幅(amplitude)反映突触丧失，这与在tgN3E-42纯合小鼠中观测到的神经元变性显然一致。
长期证据表明Aβ的进展性大脑沉积在AD的发病机制中起重要作用。因此特别感兴趣的是了解APP的蛋白酶解加工及其负责在Aβ区域的N-末端和C-末端裂解的蛋白酶。具有起自Aβ位置4的苯丙氨酸的主要种类的多个(Ragged)肽已经由Masters等在1985年报道(Masters，C.L.，et al.Amyloid plaque core protein in Alzheimer disease and Down syndrome，ProcNatl Acad Sci U S A 82，4245-4249(1985))。这个发现存在争议，因为没有N-末端序列可得自在含有十二烷基硫酸钠的缓冲液中纯化的核(cores)，提示N-末端被封闭(Selkoe，D.J.，Abraham，C.R.，Podlisny，M.B.& Duffy，L.K.Isolation of Low-Molecular-Weight Proteins from Amyloid Plaque Fibers inAlzheimer′s Disease，Journal of Neurochemistry 46，1820-1834(1986)；Gorevic，P.D.，et al.Isolation and partial characterization of neurofibrillary tangles andamyloid plaque core in Alzheimer′s Disease：immunohistological studies，JNeuropathol Exp Neurol 45，647-664(1986))。在1992年，Mori等对得自AD脑的纯化的Aβ蛋白质进行质谱分析，首次描述了Aβ(N3pGlu)的存在，其解释了测序氨基末端的难度(Mori，H.，Takio，K.，Ogawara，M.& Selkoe，D.J.Mass spectrometry of purified amyloid beta protein in Alzheimer′s Disease.JBiol Chem.267，17082-17086(1992))。他们报道了通过这种方法分离的总Aβ仅10-15％起自在位置3具有Aβ(N3pGlu)。后来逐渐清楚Aβ(N3pGlu)代表了AD和唐氏综合征患者脑中Aβ肽的主要部分(Kuo，Y.M.，Emmerling，M.R.，Woods，A.S.，Cotter，R.J.& Roher，A.E.Isolation，chemicalcharacterization，and quantitation of Abeta 3-pyroglutamyl peptide from neuriticplaques and vascular amyloid deposits，Biochem Biophys Res Commun 237，188-191.(1997)；Saido，T.C.，et al.Dominant and differential deposition ofdistinct beta-amyloid peptide species，Abeta N3(pE)，in senile plaques，Neuron14，457-466(1995)；Piccini，A.，et al.{beta}-Amyloid Is Different in NormalAging and in Alzheimer Disease，J.Biol.Chem.280，34186-34192(2005)；Saido，T.C.，Yamao-Harigaya，W.，Iwatsubo，T.& Kawashima，S.Amino-andcarboxyl-terminal heterogeneity of beta-amyloid peptides deposited in humanbrain，Neurosci Lett 215，173-176(1996)；Kuo，Y.M.，et al.Comparativeanalysis of amyloid-beta chemical structure and amyloid plaque morphology oftransgenic mouse and Alzheimer′s Disease brains，J Biol Chem 276，12991-12998(2001)；Hosoda，R.，et al.Quantification of modified amyloid betapeptides in Alzheimer disease and Down syndrome brains，J Neuropathol ExpNeurol 57，1089-1095(1998)；Harigaya，Y.，et al.Amyloid beta protein startingpyroglutamate at position 3 is a major component of the amyloid deposits in theAlzheimer′s Disease brain，Biochem Biophys Res Commun 276，422-427(2000)；Iwatsubo，T.，Saido，T.C.，Mann，D.M.，Lee，V.M.& Trojanowski，J.Q.，Full-length amyloid-beta (1-42(43))and amino-terminally modified andtruncated amyloid-beta 42(43)deposit in diffuse plaques，Am J Pathol 149，1823-1830(1996)；Miravalle，L.，et al.Amino-Terminally Truncated AbetaPeptide Species Are the Main Component of Cotton Wool Plaques，Biochemistry 44，10810-10821(2005)；Piccini，A.，et al.Association of aPresenilin 1 S170F Mutation With a Novel Alzheimer Disease MolecularPhenotype，Arch Neurol.64，738-745.(2007)；Russo，C.，et al.Heterogeneity ofwater-soluble  amyloid beta-peptide in Alzheimer′s Disease and Down′ssyndrome brains，FEBS Lett 409，411-416.(1997)；Guntert，A.，Dobeli，H.&Bohrmann，B.High sensitivity analysis of amyloid-beta peptide composition inamyloid deposits from human and PS2APP mouse brain，Neuroscience，143，461-475(2006)；Tekirian，T.L.，et al.N-terminal heterogeneity of parenchymaland cerebrovascular Abeta deposits，J Neuropathol Exp Neurol 57，76-94(1998))。N-末端缺失通常增强β-淀粉样肽在体外聚集(Pike，C.J.，Overman，M.J.& Cotman，C.W.Amino-terminal Deletions Enhance Aggregation ofbeta-Amyloid Peptides in Vitro，J.Biol.Chem.270，23895-23898(1995))。
因此，本发明人产生了Aβ3-42转基因小鼠(tgN3E-42)，其表达在N末端具有天然谷氨酸的SEQ ID No：1所示Aβ(N3E-42)，以及表达起自谷氨酰胺的SEQ ID No：2所示Aβ(N3Q-42)的小鼠(tgN3Q-42)。由于N-末端谷氨酸由谷氨酰胺置换，因此所述Aβ肽通过QC活性被转变为焦谷氨酸的速度加快至少5个数量级(Schilling，S.，Hoffmann，T.，Manhart，S.，Hoffmann，M.&Demuth，H.U.Glutaminyl cyclases unfold glutamyl cyclases activity under mildacid conditions.FEBS Lett 563，191-196(2004)；Cynis，H.，et al.Inhibition ofglutaminyl cyclase alters pyroglutamate formation in mammalian cells，BiochimBiophys Acta 1764，1618-1625(2006))。此外，谷氨酸环化为焦谷氨酸是pH依赖性过程。酶促谷氨酰胺转化有利地在pH 7.5进行，而谷氨酸转化在最佳pH 6.5发生。这个发现对于解释导致高毒性焦谷氨酸肽沉积在AD中非常重要。显然，随着Aβ肽的轴突转运，QC及其底物共同定位于酸性区室内，有利于N-谷氨酸底物环化。此外，轴突转运已经示出在AD脑中受损，帮助神经毒性Aβ(N3pGlu)的产生。另外，通过QC特异性抑制剂对QC活性的药物学抑制显著降低了体外Aβ(N3pGlu)水平(Cynis，H.，et al.Inhibitionof Glutaminyl cyclases alters pyroglutamate formation in mammalian cells，Biochim Biophys Acta 1764，1618-1625(2006))。总之，本发明人首先揭示了Aβ(N3pGlu)在诱导严重神经变性的神经毒性淀粉样肽级联中是优势肽，其次这种毒性很可能是由于神经元内Aβ(N3pGlu)聚集所致，最后QC活性调节脑中Aβ(N3pGlu)形成，这使QC成为良好的治疗靶用以防止AD中有害的Aβ(N3pGlu)肽形成。
在这方面，使用如图1和图6所示前原肽表达策略在这个领域是全新的。使用小鼠促甲状腺激素释放激素前原序列，可以在转基因动物中产生不同Aβ种类，如本发明实施例和附图中针对Aβ3E-42和Aβ3Q-42及所得pGlu-形成所示。Aβ序列可以由淀粉样肽的其它序列置换，以鉴定这些肽的病理生理功能。在正常的APP代谢期间，由于β-或γ-分泌酶裂解导致各种Aβ肽形成。根据本发明的策略，可以基于本文所述的前原蛋白加工策略进一步开发转基因动物，所述转基因动物是阿尔茨海默病、家族性英国型痴呆和家族性丹麦型痴呆的模型，通过用相应的淀粉样肽序列置换TRH而产生，如图1、6和7所示。
在另一个实施方案中，本发明包含表达SEQ ID No：3所示Aβ3E-40的转基因小鼠(tgN3E-40)或者表达SEQ ID No：4所示AβN3Q-40的转基因小鼠(tg-N3Q-40)，导致Aβ(N3pGlu-40)形成。
根据本发明优选的是这样的动物模型，其在表达构建体中包含选自Aβ3E-42(SEQ ID No：9)、Aβ3Q-42(SEQ ID No：10)、Aβ3E-40(SEQ ID No：11)和Aβ3Q-40(SEQ ID No：12)的至少一个核苷酸序列，更优选选自Aβ3E-42(SEQ ID No：9)和Aβ3Q-42(SEQ ID No：10)的至少一个核苷酸序列。
在另一个优选的实施方案中，本发明的动物模型包含选自mTRH-Aβ3E-42(SEQ ID No：6)和mTRH-Aβ3Q-42(SEQ ID No：8)的至少一个核苷酸序列。
在另一个优选的实施方案中，本发明的动物模型包含选自Thy-1-mTRH-Aβ3E-42(SEQ ID No：5)和Thy-1-mTRH-Aβ3Q-42(SEQ ID No：7)的至少一个核苷酸序列。
优选的动物模型对于选自如下的至少一个核苷酸序列是杂合的：Thy-1-mTRH-Aβ3E-42(SEQ ID No：5)、Thy-1-mTRH-Aβ3Q-42(SEQ ID No：7)、mTRH-Aβ3E-42(SEQ ID No：6)、mTRH-Aβ3Q-42(SEQ ID No：8)、Aβ3E-42(SEQ ID No：9)、Aβ3Q-42(SEQ ID No：10)、Aβ3E-40(SEQ ID No：11)和Aβ3Q-40(SEQ ID No：12)。
特别优选的是对于选自如下的至少一个核苷酸序列是纯合的动物模型：Thy-1-mTRH-Aβ3E-42(SEQ ID No：5)、Thy-1-mTRH-Aβ3Q-42(SEQ IDNo：7)、mTRH-Aβ3E-42(SEQ ID No：6)、mTRH-Aβ3Q-42(SEQ ID No：8)、Aβ3E-42(SEQ ID No：9)、Aβ3Q-42(SEQ ID No：10)、Aβ3E-40(SEQ ID No：11)和Aβ3Q-40(SEQ ID No：12)。
此外，本发明包含表达重组谷氨酰胺酰环化酶和至少一个Aβ肽的转基因小鼠品系，所述Aβ肽选自SEQ ID No：1所示Aβ3E-42、SEQ ID No：2所示AβN3Q-42、SEQ ID No：4所示Aβ3E-40或者SEQ ID No：4所示AβN3Q-40。这种动物可以通过使表达重组谷氨酰胺酰环化酶的转基因小鼠品系与表达选自SEQ ID No：1所示Aβ3E-42、SEQ ID No：2所示AβN3Q-42、SEQ ID No：3所示Aβ3E-40或者SEQ ID No：4所示AβN3Q-40的至少一个Aβ肽的小鼠品系杂交育种而获得。
优选的杂交育种的小鼠品系表达哺乳动物QC，特别是人或小鼠QC或者木瓜QC。特别优选的是哺乳动物QC，因为通过这些筛选方法鉴别的效应物应用于治疗哺乳动物、特别是人的疾病。
进一步优选的杂交育种小鼠表达QC的同工酶。
呈现出与谷氨酰胺酰环化酶显著的序列同源性的这些同工酶是来自如下动物的谷氨酰胺酰肽环转移酶样蛋白质(QPCTL)：人(进一步命名为人isoQC)(GenBank accession no.NM_017659)，小鼠(GenBank accession no.NM_027455)，食蟹猴(Macaca fascicularis)(GenBank accession no.AB168255)，恒河猴(Macaca mulatta)(GenBank accession no.XM_001110995)，猫(GenBank accession no.XM_541552)，大鼠(GenBankaccession no.XM_001066591)，牛(GenBank accession no.BT026254)，或其具有至少50％/75％序列相同性/相似性、优选70％/85％序列相同性/相似性、最优选90％/95％序列相同性/相似性的类似物。
所述序列在SEQ.ID No：13-23中示出。进一步揭示的是编码这些QPCTL的核酸序列(SEQ.ID No：24-34)。
本发明优选表达QPCTL的杂交育种的小鼠品系，所述QPCTL选自SEQ.ID No：13-15、22和23所示人QPCTL，包括其同种型和剪接型；大鼠QPCTL(SEQ.ID No：19)以及小鼠QPCTL(SEQ.ID No：20)。
本发明更优选的是表达QPCTL的杂交育种的小鼠品系，所述QPCTL选自SEQ.ID No：13-15所示人QPCTL，包括其同种型；以及小鼠QPCTL(SEQ.ID No：20)。
本发明最优选的是表达QPCTL的杂交育种的小鼠品系，所述QPCTL选自所示人QPCTL(SEQ.ID No：13)和小鼠QPCTL(SEQ.ID No：20)。
在这方面，特别参考US 60/846,244，其特别进一步揭示了QPCTL-同工酶。这个申请在此援引加入本文。
表达重组谷氨酰胺酰环化酶的转基因小鼠品系可以根据US 60/885,649所述程序产生。这个申请的关于表达重组谷氨酰胺酰环化酶的转基因小鼠品系的产生和检测的全部内容援引加入本文。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了使用本发明的动物模型选择的Aβ-肽作用的抑制剂在轻度认知障碍、阿尔茨海默病、唐氏综合征、家族性丹麦型痴呆和家族性英国型痴呆中的应用。
在另一个实施方案中，本发明提供了使用本发明的动物模型选择的Aβ-肽作用的促进剂(promoter)在刺激胃肠道细胞增殖、特别是胃粘膜细胞增殖、上皮细胞增殖、产酸壁细胞和分泌组胺的肠嗜铬样(ECL)细胞的分化及与ECL细胞中组胺合成和贮存相关的基因表达以及通过维持或增加活性[pGlu1]-胃泌素的浓度刺激哺乳动物中的急性酸分泌中的应用。
在另一个实施方案中，本发明提供了使用本发明的动物模型选择的Aβ-肽作用的抑制剂在通过降低无活性[Gln1]胃泌素转化为活性[pGlu1]胃泌素而治疗哺乳动物的伴有或不伴有幽门螺杆菌的十二指肠溃疡疾病和胃癌中的应用。
神经降压素(Neurotensin，NT)是一种参与精神分裂症病理生理学的神经肽，其特异性调节先前证实在这种疾病中被错误调节(misregulated)的神经递质系统。其中测量脑脊液(CSF)NT浓度的临床研究表明一组精神分裂症患者具有降低的CSF NT浓度，该浓度通过有效的抗精神病药物治疗而恢复。存在大量证据吻合NT系统参与抗精神病药物的作用机制。中枢给予NT的行为和生物化学作用明显类似于系统给予抗精神病药物的那些作用，抗精神病药物增加NT神经传递。这些发现引出这样的假说，即NT具有内源抗精神病药物功能。此外，典型和非典型的抗精神病药物不同地改变黑质纹状体和中脑边缘多巴胺末端区内NT神经传递，这些作用分别预示副作用易发生性和效力(Binder，E.B.et al.2001 Biol Psychiatry 50856-872)。
在另一个实施方案中，本发明提供了使用本发明的动物模型选择的Aβ-肽作用的效应物的促进剂在制备抗精神病药物和/或治疗哺乳动物精神分裂症中的应用。所述Aβ-肽作用的效应物保持或者增加活性[pGlu1]神经降压素的浓度。
在精浆中发现受精促进肽(FPP)，这是与促甲状腺激素释放激素(TRH)相关的三肽。近来在体外和体内获得的证据表明FPP在调节精子生育力中起重要作用。特别地，FPP最初刺激不受精的(无能力的)精子“开启”，且变得更迅速可育，但是随后阻止精子获能，由此精子不经历自发性顶体丧失，且因此不失去受精潜力。模拟这些应答，并通过已知调节腺嘌呤环化酶(AC)/cAMP信号转导途径的腺苷而确实增强。FPP和腺苷均已经示出在无能力的细胞中刺激cAMP产生，但是在有能力的细胞中抑制cAMP产生，FPP受体与腺苷受体和G蛋白相互作用，以实现AC的调节。这些事件影响各种蛋白质的酪氨酸磷酸化状态，一些在起始“开启”中起重要，另一些可能参与其自身顶体反应。也在精浆中发现的降钙素和血管紧张素II在体外对于无能力的精子具有相似作用，且可以增强对FPP的应答。这些分子在体内具有相似作用，通过刺激影响生育力及随后维持受精潜力。FPP、腺苷、降钙素和血管紧张素II的可用性降低或者其受体缺陷导致雄性不育(Fraser，L.R.and Adeoya-Osiguwa，S.A.2001Vitam Horm 63，1-28)。
在另一个实施方案中，本发明提供了使用本发明的动物模型选择的Aβ肽作用的抑制剂在制备受精抑制药物和/或降低哺乳动物生育力中的应用。Aβ肽作用的抑制剂降低活性[pGlu1]FPP的浓度，导致阻止精子获能及精细胞失活。相反，可以示出Aβ肽作用的促进剂能刺激雄性生育力以及治疗不育症。
在另一个实施方案中，本发明提供了使用本发明的动物模型选择的Aβ肽作用的抑制剂/促进剂在制备治疗病理生理学状况的药物中的应用，如抑制骨髓祖细胞增殖、瘤形成、宿主炎症反应、癌症、恶性转移、黑素瘤、银屑病、类风湿性关节炎、动脉硬化、再狭窄、肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、移植排斥反应、获得性免疫缺陷综合征、受损的体液和细胞介导的免疫应答、内皮白细胞粘附和迁移。
在另一个实施方案中，本发明提供了使用本发明的动物模型选择的Aβ肽作用的抑制剂/促进剂在制备治疗如下病症的药物中的应用，所述病症为摄食减少和睡眠-觉醒、能量代谢的稳态调节受损、自主功能受损、激素平衡受损以及体液调节受损。
在一些蛋白质中聚谷氨酰胺扩充导致神经变性疾病，如亨廷顿舞蹈症、帕金森氏症以及Kennedy′s病。其机制仍未知。聚谷氨酰胺重复的生物化学性质提示一种可能的解释：在谷氨酰胺酰-谷氨酰胺酰键的内分解裂解及随后焦谷氨酸形成可导致通过增加聚谷氨酰胺酰蛋白质的分解代谢稳定性、疏水性、致淀粉样变性和神经毒性而发病(Saido，T.C.；Med Hypotheses(2000)Mar；54(3)：427-9)。
在另一个实施方案中，本发明提供了使用本发明的动物模型选择的Aβ肽作用的抑制剂/促进剂在制备治疗帕金森氏症和亨廷顿舞蹈症的药物中的应用。
与AβN3pE(3-42)pGlu-致淀粉样变性肽一样，Adan和ABri沉积在患有家族性丹麦型痴呆(FDD)或者家族性英国型痴呆(FBD)的患者脑中。这些痴呆是遗传性疾病，基于在染色体13上编码的Bri蛋白终止密码子中的突变(Vidal，R.，Frangione，B.，Rostagno，A.，Mead，S.，Revesz，T.，Plant，G.&Ghiso，J.(1999)Nature 399，776-781.Ghiso，J.，Revesz，T.，Holton，J.，Rostagno，A.，Lashley，T.，Houlden，H.，Gibb，G.，Anderton，B.，Bek，T.，Bojsen-Moller，M.et al.(2001)Amyloid.8，277-284.)。这个疾病的病理学特征与阿尔茨海默病非常相似，包括脑淀粉样血管病以及神经炎症(Rostagno，A.，Revesz，T.，Lashley，T.，Tomidokoro，Y.，Magnotti，L.，Braendgaard，H.，Plant，G.，Bojsen-Moller，M.，Holton，J.，Frangione，B.et al.(2002)J Biol Chem 277，49782-49790.)。重要的是，沉积的淀粉样肽是N-末端pGlu-修饰的，且FDD中的斑块由pGlu-修饰的Adan和Aβ组成(Tomidokoro，Y.，Lashley，T.，Rostagno，A.，Neubert，T.A.，Bojsen-Moller，M.，Braendgaard，H.，Plant，G.，Holton，J.，Frangione，B.，Revesz，T.et al.(2005)J.Biol.Chem.280，36883-36894.)。所述pGlu-修饰显然加速聚集形成，因为已经描述了可溶的Adan不含有N-末端pGlu(Tomidokoro，Y.，Lashley，T.，Rostagno，A.，Neubert，T.A.，Bojsen-Moller，M.，Braendgaard，H.，Plant，G.，Holton，J.，Frangione，B.，Revesz，T.et al.(2005)J.Biol.Chem.280，36883-36894.)。
在另一个实施方案中，本发明提供了使用本发明的动物模型选择的Aβ肽作用的抑制剂/促进剂在制备治疗家族性英国型痴呆和/或家族性丹麦型痴呆的药物中的应用。
趋化细胞因子(趋化因子)是吸引并激活白细胞的蛋白质，且认为其在炎症中起重要作用。趋化因子通过N-末端半胱氨酸残基的出现而被分为四类(C-、CC-、CXC-和CX3C-趋化因子)。CXC-趋化因子优先作用于中性粒细胞。相反，CC-趋化因子优先吸引单核细胞至炎症部位。单核细胞侵润被认为是许多疾病的关键因素(Gerard，C.and Rollins，B.J.(2001)Nat.Immunol 2，108-115；Bhatia，M.，et al.，(2005)Pancreatology.5，132-144；Kitamoto，S.，Egashira，K.，and Takeshita，A.(2003)J Pharmacol Sci.91，192-196)。作为一个趋化因子家族，MCP家族由四个成员组成(MCP-1-4)，表现出优先吸引单核细胞，但是其潜力不同(Luini，W.，et al.，(1994)Cytokine 6，28-31；Uguccioni，M.，et al.，(1995)Eur J Immunol 25，64-68)。下文示出MCP-1-4的cDNA以及氨基酸序列。
人和啮齿动物MCP-1-4的成熟形式通过谷氨酰胺酰环化酶在翻译后修饰，以具有N-末端焦谷氨酸(pGlu)残基。所述N-末端pGlu修饰使得该蛋白质对氨基肽酶的N-末端降解具有抗性，这是重要的，因为MCP-1-4的趋化能力由其N-末端介导(Van Damme，J.，et al.，(1999)Chem Immunol 72，42-56)。
在另一个实施方案中，本发明提供了使用本发明的动物模型选择的Aβ肽作用的抑制剂/促进剂在制备治疗由MCP-1-4、优选MCP-1介导的疾病药物中的应用，所述疾病例如是慢性和急性炎症，例如类风湿性关节炎，动脉硬化，再狭窄或者胰腺炎。
在另一个实施方案中，本发明提供了通过使用上述选择的测试物质降低或抑制Aβ肽作用的一般方式。
本发明也提供了非人转基因动物，其中所述转基因编码选自AβN3E-42(SEQ ID No：1)、AβN3Q-42(SEQ ID No：2)、AβN3E-40(SEQ ID No：3)和AβN3Q-40(SEQ ID No：4)的至少一个Aβ肽。
本发明也提供了筛选受Aβ-肽生成影响的靶化合物的方法，其中所述方法包括使用本发明的转基因非人动物或者本发明的转基因小鼠评估Aβ-肽在体内对可能的靶化合物的作用。
更优选地，筛选抑制或促进Aβ肽作用的治疗剂的方法包括：
(a)将测试物质给予本发明的转基因小鼠，
(b)评估所述测试物质对于小鼠的神经学表型的作用，以及
(c)选择抑制或促进Aβ肽作用的测试物质。
本发明进一步提供了治疗或预防Aβ肽相关疾病的方法，所述方法包括：
(a)给予在前述筛选方法中选择的测试物质，
(b)监测患者Aβ肽相关疾病的临床指征的降低情况。
本发明优选这样的测试物质，其在前述筛选和/或治疗方法中经鉴别是Aβ肽作用的抑制剂。
所述Aβ肽相关疾病优选是阿尔茨海默病或者唐氏综合征中神经变性。
本文中“Aβ肽作用”是指由Aβ肽直接或间接介导的或者由于Aβ肽的存在而引起的所有改变。这例如但不限于包括神经元和神经学作用、毒性或者免疫接种作用。
本发明的转基因非人动物、特别是小鼠在特定优选的实施方案中也可用于确定起自N-末端Q的Aβ肽与起自N-末端E的Aβ肽之间的差异。鉴于AβN3Q是比AβN3E更好的QC的底物，这样可以有利地推断QC在Aβ肽相关疾病中的作用。
通过上述筛选方法选择的物质可以通过降低Aβ肽作用(阴性效应物，抑制剂)或者通过增加Aβ肽作用(阳性效应物，激活剂)发挥功能。
在本发明的一个实施方案中，优选的是Aβ肽作用的抑制剂。
本发明的化合物可以被转变为酸加成盐，特别是药物可接受的酸加成盐。
本发明的化合物的盐可以是无机盐或有机盐形式。
本发明的化合物可以被转变为并用作酸加成盐，特别是药物可接受的酸加成盐。所述药物可接受的盐通常采取其中碱性侧链用无机酸或有机酸质子化的形式。代表性的有机酸或无机酸包括盐酸、氢溴酸、高氯酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、琥珀酸、顺丁烯二酸、反丁烯二酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、安息香酸、扁桃酸、mandelic，甲基磺酸、羟乙基磺酸，苯磺酸、草酸、双羟萘酸、2-萘磺酸、p-甲苯磺酸、环己氨磺酸、水杨酸、糖精酸或者三氟乙酸。本发明化合物的所有药物可接受的酸加成盐形式均包含在本发明范围内。
鉴于游离化合物与其盐形式化合物之间的密切关系，当在本文中提及化合物时，也包含其相应的盐，只要在这种情况中是可能或适当的即可。
在本发明的化合物具有至少一个手性中心时，其因此可作为对映异构体存在。在所述化合物具有两或多个手性中心时，其可另外作为非对映异构体存在。应理解所有这种异构体及其混合物均包含在本发明范围内。此外，一些晶体形式的化合物可以作为多晶形存在，这些也包含在本发明范围内。另外，一些化合物可以与水(即水合物)或者常用有机溶剂形成溶剂化物，这种溶剂化物也包含在本发明范围内。
所述化合物、包括其盐也可以其水合物形式获得，或者包括用于其结晶化的其它溶剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了预防或治疗特征在于Aβ肽或者由Aβ肽介导的病症的方法，所述方法包括以有效治疗该病症的数量和给药方案给予本发明的任何化合物或者其药物组合物。此外，本发明包括本发明化合物及其相应的药物可接受的酸加成盐形式在制备用于预防或治疗特征在于Aβ肽或者由Aβ肽介导的病症的药物中的应用。所述化合物可以通过任何常规方式给予患者，包括但不限于静脉内、口服、皮下、肌内、皮内、肠道外给予或者组合这些方式给予。
在另一个优选的实施方式中，本发明涉及药物组合物即药物，其含有至少一种本发明的化合物或其盐，任选组合一或多种药物可接受的载体和/或溶剂。
所述药物组合物可例如是肠道外或者肠道内给予配制物形式及含有合适的载体，或者其可以是口服配制物形式，可含有适于口服的合适载体。优选其是口服配制物形式。
根据本发明给予的效应物可以用于可给予的药物配制物或者配制复合物中，作为抑制剂或者组合抑制剂、底物、假底物、QC表达的抑制剂、降低哺乳动物中QC蛋白浓度的这些酶蛋白的结合蛋白或抗体。本发明的化合物使得可以单独对患者和疾病调整治疗，特别可以避免个体不耐性、变态反应和副作用。
所述化合物随着时间也呈现出不同程度的活性。从而为医生的治疗提供机会以不同地响应患者个体情况：一方面他能精确调整治疗作用开始的速度，另一方面可以调整作用的持续时间特别是作用强度。
根据本发明优选的治疗方法代表一种预防或治疗哺乳动物中特征在于Aβ肽或者由Aβ肽介导的病症的新方法。其有利地简化了易受影响的商业应用，且适用于特别是治疗基于哺乳动物中生理学活性Aβ肽的不平衡浓度的疾病，特别适用于人用药物。
所述化合物可有利地以例如药物制备物形式给予，所述药物制备物含有活性成分组合本领域已知的常用添加剂如稀释剂、赋形剂和/或载体。例如，所述药物可以肠道外给予(例如在生理盐水溶液中静脉内注射)，或者肠道内给予(例如用常用载体配制的口服形式)。
根据其内源性稳定性及其生物可利用度，可以每天给予一或多剂化合物，以达到希望的标准化血糖水平。例如，在人体内这个剂量范围可以是大约0.01mg-250.0mg/天，优选大约0.01-100mg化合物/kg体重。
通过给予哺乳动物所述效应物，可以预防或者减轻或者治疗选自如下的病症：轻度认知障碍、阿尔茨海默病(AD)、唐氏综合征、家族性丹麦型痴呆、家族性英国型痴呆、亨廷顿舞蹈症、伴有或不伴有幽门螺杆菌感染的溃疡性疾病和胃癌、病原性精神病症、精神分裂症、不育症、瘤形成、炎症性宿主应答、癌症、银屑病、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、再狭窄、肺纤维化、肝纤维化、肾纤维化、移植排斥、获得性免疫缺陷综合征、受损的体液和细胞介导的免疫应答、内皮中白细胞粘附和迁移、摄食减少、睡眠-觉醒、能量代谢的稳态调节受损、自主功能受损、激素平衡受损和体液调节受损。
再者，通过给予哺乳动物所述效应物，可以刺激胃肠道细胞增殖，优选胃粘膜细胞、上皮细胞的增殖，产酸壁细胞以及分泌组胺的肠嗜铬样细胞的急性胃酸分泌和分化。
另外，给予哺乳动物所述抑制剂可以导致精子细胞功能丧失，因此抑制雄性生育力。因此，本发明提供了调节和控制雄性生育力的方法，以及活性降低效应物在制备雄性避孕药物中的应用。
此外，通过给予哺乳动物所述效应物，可以抑制骨髓祖细胞增殖。
本发明使用的化合物因此可以通过已知方式使用惰性、无毒性药物合适的载体和添加剂或者溶剂转变为常规配制物，如片剂、胶囊、dragées、药丸、栓剂、颗粒剂、气雾剂、糖浆、液体、固体和乳状乳液以及悬浮液和溶液。在每种这些配制物中，治疗有效的化合物优选以大约0.1-80％(重量)、更优选1-50％(重量)总混合物的浓度存在，即以足以获得所述剂量范围的量存在。
所述物质可以以dragées、胶囊、bitable capsules、片剂、滴剂、糖浆或者栓剂或者鼻腔喷雾剂形式用作药物。
所述配制物可有利地例如通过提供活性成分与溶剂和/或载体及任选使用乳化剂和/或分散剂制备，在水用作稀释剂的情况中，可以将有机溶剂任选用作辅助溶剂。
举例的可用于本发明中的赋形剂包括水，无毒有机溶剂如石蜡(例如天然油馏分)，植物油(例如菜籽油、落花生油、芝麻油)，醇(例如乙醇、甘油)，二醇(例如丙二醇、聚乙二醇)；固体载体如天然粉末状矿物质(例如高分散二氧化硅、硅酸盐)，糖(例如粗糖、乳糖和葡聚糖)；乳化剂如非离子和阴离子乳化剂(例如聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯油醚脂肪醇醚、烷基磺酸盐和芳基磺酸盐)，分散剂(例如木质素、亚硫酸盐溶液、甲基纤维素、淀粉和聚乙烯比咯烷酮)和润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石、硬脂酸和十二烷基硫酸钠)以及任选调味剂。
可以通过常用的方式给予药物，优选通过肠道内或者肠道外给药方式、特别是口服。在肠道内给药的情况中，口服片剂除了上述载体之外还可进一步含有添加剂如柠檬酸钠、碳酸钙和磷酸钙，以及各种添加剂如淀粉，优选马铃薯淀粉，明胶等。此外，润滑剂如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石可伴随用于压成片剂。在用于口服的水性悬浮液和/或酏剂情况中，除上述赋形剂之外还可以在活性成分中加入各种调味剂或者色素。
在肠道外给予的情况中，可以使用在合适的液体载体中的活性成分的溶液。一般而言，已经发现在静脉内给予的情况中，给予大约0.01-2.0mg/kg、优选大约0.01-1.0mg/kg体重/天的量有利地获得有效的结果，在肠道内给予的情况中，给予剂量为大约0.01-2mg/kg，优选大约0.01-1mg/kg体重/天。
然而在一些情况中根据实验动物或者患者的体重或者基于给予途径的类型需要偏离指定剂量，但是也基于动物种类及其对于药物的个体应答或者给予的间隔时间确定剂量。因此，在一些情况中可以使用低于上述最小量的剂量，而在其它情况中，可以超出所述上限。在相对大量给予的情况中，推荐将这些量在一天内分成几次给予。对于人用药物给予，提供相同剂量范围。在这种情况中相似地使用上述评注。
关于举例的药物配制物可特别参考WO 2004/098625第50-52页的实施例，所述文献以其全部内容援引加入本文。
上文一般性描述了本发明。通过参考如下实施例可以获得对本发明更全面的理解。这些实施例只是例证本发明，无限制本发明范围之意。尽管本文应用一些特定术语，但是这些术语只是描述本发明而无限制之意。
参考实施例1：人和木瓜QC的制备
宿主菌株和培养基
根据厂商(Invitrogen)指导生长、转化和分析用于表达人QC的巴斯德毕赤酵母株X33(AOX1，AOX2)。根据厂商建议制备巴斯德毕赤酵母需要的培养基，即缓冲的甘油(BMGY)复合培养基或者甲醇(BMMY)复合培养基，以及发酵基础盐培养基。
编码人QC的质粒载体的分子克隆
应用标准分子生物学技术进行所有克隆程序。对于在酵母中表达，使用载体pPICZαB(Invitrogen)。pQE-31载体(Qiagen)用于在大肠杆菌中表达人QC。将起自密码子38的成熟QC的cDNA与质粒编码的6×组氨酸标记符合读框地融合。在使用引物pQCyc-1和pQCyc-2(WO 2004/098625)扩增及亚克隆之后，使用SphI和HindIII限制位点将片段插入表达载体中。
巴斯德毕赤酵母的转化及小规模表达
根据厂商(Qiagen)指导，将质粒DNA在大肠杆菌JM109中扩增及纯化。在使用的表达质粒pPICZαB中，提供三个限制位点以进行线性化。由于SacI和BstXI在QC cDNA内切割，因此选择PmeI进行线性化。将20-30μg质粒DNA用PmeI线性化，通过乙醇沉淀，并溶解于无菌去离子水中。然后根据厂商(BioRad)指导，使用10μg所述DNA通过电穿孔转化感受态巴斯德毕赤酵母细胞。在含有150μg/ml Zeocin的平板中进行选择。使用线性化质粒的一次转化产生几百个转化体。
为了检测进行QC表达的重组酵母克隆，将重组体在含有2ml BMGY的10ml锥形瓶中生长24小时。之后，对酵母进行离心，并重悬于2ml含有0.5％甲醇的BMMY中。通过每24小时加入一次甲醇使这个浓度保持72小时。随后，确定上清中QC活性。融合蛋白的存在通过使用6×组氨酸标记的抗体(Qiagen)通过Western印迹分析证实。选择展示最高QC活性的克隆以进行进一步实验和发酵。
在发酵罐中大规模表达
在5L反应器(Biostat B，B.Braun biotech)中进行QC表达，基本如“Pichia fermentation process guidelines”(Invitrogen)所述进行。简而言之，使细胞在补加微量盐以及甘油作为唯一碳源的发酵基础盐培养基(pH 5.5)中生长。在大约24小时的最初分批培养阶段(batch phase)及随后大约5小时的补料分批培养阶段(fed-batch phase)期间，积聚细胞团。一旦达到细胞湿重为200g/l，则使用甲醇诱导QC表达，应用三步补料方式，全部发酵时间为大约60小时。随后，通过在4℃以6000×g离心15分钟，从含有QC的上清中除去细胞。加入NaOH将pH调节为6.8，所得混浊溶液再次在4℃以37000×g离心40分钟。在持续混浊的情况中，使用纤维素膜(孔径0.45μm)进行额外的过滤步骤。
在巴斯德毕赤酵母中表达的6×组氨酸标记的QC的纯化
组氨酸标记的QC首先通过固定化金属亲和性层析(IMAC)纯化。在典型的纯化中，将1000ml培养上清施加于荷载Ni2+的螯合Sepharose FF柱(1.6×20cm，Pharmacia)，该柱用含有750mM NaCl的50mM磷酸盐缓冲液pH 6.8平衡，流速5ml/min。在用10个柱体积的平衡缓冲液及5个柱体积的含有5mM组氨酸的平衡缓冲液洗涤后，通过转变为含有150mMNaCl和100mM组氨酸的50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.8)洗脱结合的蛋白质。所得洗脱液对20mM Bis-Tris/HCl(pH 6.8)在4℃透析过夜。随后，在用透析缓冲液平衡的Mono Q6柱(BioRad)上进行阴离子交换层析进一步纯化QC。将含有QC的级分加样于所述柱，流速4ml/min。然后用含有100mM NaCl的平衡缓冲液洗涤该柱。通过两个梯度进行洗脱，分别为30或5个柱体积的分别含有240mM和360mMNaCl的平衡缓冲液。收集6ml级分，通过SDS-PAGE分析纯度。集合含有同源QC的级分，通过超滤浓缩。对于长期贮存(-20℃)，加入甘油至终浓度为50％。根据Bradford或者Gill and vonHippel方法(Bradford，M.M.1976Anal Biochem 72，248-254；Gill，S.C.andvon Hippel，P.H.1989Anal Biochem 182，319-326.)量化蛋白质。
QC在大肠杆菌中的表达和纯化
将编码QC的构建体转化进M15细胞(Qiagen)中，并且在选择性LB琼脂平板中在37℃生长。在含有1％葡萄糖和1％乙醇的LB培养基中在室温进行蛋白质表达。当培养物达到大约0.8的OD600时，使用0.1mM IPTG诱导表达过夜。在一次冷冻和解冻循环后，在4℃通过加入在含有300mMNaCl和2mM组氨酸的50mM磷酸盐缓冲液pH 8.0中的2.5mg/ml溶菌酶使细胞裂解大约30分钟。该溶液通过在4℃以37000×g离心30分钟澄清，随后使用玻璃粉(DNA分离)过滤，以及使用纤维素滤膜的两个额外过滤步骤以粗略过滤和精细过滤沉淀物。将上清(大约500ml)以1ml/min流速应用于Ni2+-亲和柱(1.6×20cm)。使用含有150mM NaCl和100mM组氨酸的50mM磷酸盐缓冲液洗脱QC。通过超滤浓缩含有QC的级分。
从木瓜乳胶中纯化QC
根据先前报道的方法加以修改的方法(Zerhouni，S.et al.1989 BiochimBiophys Acta 138，275-290)，使用BioCAD 700E(Perseptive Biosystems，Wiesbaden，Germany)制备木瓜乳胶QC。将50g乳胶溶解于水中，如该文章所述离心。使用甲硫代磺酸S-甲酯(S-methyl methane thiosulfonate)失活蛋白酶，并对所得粗提物进行透析。在透析之后，将全部上清加样于用100mM乙酸钠缓冲液pH 5.0平衡的(21×2.5cm i.d.)SP Sepharose Fast Flow柱中(流速3ml/min)。通过增加乙酸钠缓冲液浓度以2ml/min流速在三个步骤中进行洗脱。第一步是在0.5个柱体积中从0.1M至0.5M乙酸盐缓冲液的线性梯度。第二步是在4个柱体积中缓冲液浓度从0.5M至0.68M的线性增加。在最后的洗脱步骤期间，使用1个柱体积的0.85M缓冲液。集合含有最高酶活性的级分(6ml)。通过超滤将浓度和缓冲液改变为0.02MTris/HCl，pH 8.0(Amicon；滤膜的分子量截断值为10kDa)。
加入硫酸铵以浓缩得自离子交换层析步骤的木瓜酶，至终浓度为2M。将这个溶液应用于用2M硫酸铵、0.02M Tris/HCl(pH 8.0)平衡的(21×2.5cm i.d.)Butyl Sepharose 4Fast Flow柱(流速1.3ml/min)。用降低硫酸铵浓度的三个步骤进行洗脱。在第一个步骤期间，以1.3ml/min流速应用0.5个柱体积的从2M至0.6M硫酸铵、0.02M Tris/HCl(pH 8.0)的线性梯度。第二个步骤是以1.5ml/min流速应用5个柱体积的从0.6M至0M硫酸铵、0.02M Tris/HCl(pH 8.0)的线性梯度。最后的洗脱步骤是以1.5ml/min流速应用2个柱体积的0.02M Tris/HCl(pH 8.0)。集合含有QC活性的所有级分，通过超滤浓缩。所得同质QC在-70℃贮存。使用Bradford方法确定最终蛋白质浓度，与使用牛血清白蛋白获得的标准曲线比较。
参考实施例2：谷氨酰胺酰环化酶活性测定
荧光测定
使用微滴定平板的BioAssay Reader HTS-7000Plus(Perkin Eimer)或者NovoStar(BMG Labtechnologies)阅读器在30℃进行测量。使用H-Gln-βNA通过荧光测定评估QC活性。样品由在含有直至20mM EDTA和适当稀释的QC等份的0.2M Tris/HCl(pH 8.0)中的0.2mM荧光底物、0.25U焦谷氨酰氨基肽酶(Unizyme，Horsholm，Denmark)组成，终体积为250μl。激发/发射波长为320/410nm。通过加入谷氨酰胺酰环化酶开始测定反应。从在测定条件下β-萘胺的标准曲线中确定QC活性。1单位定义为在所述条件下每分钟从H-Gln-βNA中催化形成1μmol pGlu-βNA的QC量。
在第二种荧光测定中，使用H-Gln-AMC作为底物确定QC活性。反应在30℃进行，使用微滴定平板的NOVOStar阅读器(BMG labtechnologies)。样品由在含有5mM EDTA和适当稀释的QC等份的0.05M Tris/HCl(pH 8.0)中的不同浓度的荧光底物、0.1U焦谷氨酰氨基肽酶(Qiagen)组成，终体积为250μl。激发/发射波长为380/460nm。通过加入谷氨酰胺酰环化酶起始测定反应。从在测定条件下7-氨基-4-甲基香豆素的标准曲线中确定QC活性。使用GraFit软件评估动力学数据。
QC的分光光度测定
这个新测定用于确定大多数QC底物的动力学参数。使用连续方法通过分光光度测定法分析QC活性，所述方法是对先前的不连续测定(Bateman，R.C.J.1989J Neurosci Methods 30，23-28)加以调整而得，使用谷氨酸脱氢酶作为辅助酶。样品由相应QC底物、0.3mM NADH、14mMα-酮戊二酸和30U/ml谷氨酸脱氢酶组成，终体积为250μl。通过加入QC开始反应，并通过监测8-15分钟在340nm吸光度的降低进行追踪。
评估最初的速率，以及从在测定条件下氨的标准曲线中确定酶活性。所有样品均在30℃测量，使用微滴定平板的SPECTRAFIuor Plus或者Sunrise(均来自TECAN)阅读器。使用GraFit软件评估动力学数据。
抑制剂测定
对于抑制剂测试，样品组成与上述相同，不同之处是加入推定的抑制化合物。对于QC抑制的快速检测，样品含有4mM相应抑制剂，底物浓度为1KM。对于详细研究抑制作用和确定Ki值，首先研究所述抑制剂对于辅助酶的影响。在每种情况中，对于任一检测的酶均无影响，因此可以可靠地确定QC抑制作用。抑制常数通过用GraFit软件将进展曲线集拟合进用于竞争性抑制的一般方程而评估。
参考实施例3：MALDI-TOF质谱分析
进行基质辅助激光解析/离子化飞行质谱分析，使用具有线性飞行时间分析仪的Hewlett-Packard G2025LD-TOF系统。该仪器装备337nm氮激光器，潜在加速源(5kV)和1.0m飞行管。以阳离子模式运转检测仪，记录信号，使用与个人计算机连接的LeCroy 9350M数字存储示波器滤波。将样品(5μl)与等体积的基质溶液混合。基质溶液使用DHAP/DAHC，通过将30mg2′，6′-二羟基苯乙酮(Aldrich)和44mg柠檬酸氢二铵(Fluka)溶解于1ml在水中的乙腈/0.1％TFA(1/1，v/v)而制备。将小体积(≈1μl)的基质-待分析物-混合物移至探头尖端，并立即在真空室(Hewlett-Packard G2024A sample prepaccessory)内蒸发，以保证快速及均质的样品结晶。
对于长期检测Glu1-环化，将Aβ-衍生的肽在100μl 0.1M乙酸钠缓冲液(pH 5.2)或者0.1M Bis-Tris缓冲液(pH 6.5)中在30℃保温。肽以0.5mM[Aβ3-11a]或者0.15mM[Aβ3-21a]浓度应用，在整个24小时加入0.2U QC。在Aβ3-21a情况中，该测定含有1％DMSO。在不同时间，从测定试管中取样品，使用ZipTips(Millipore)根据厂商指导提取肽，与基质溶液混合(1∶1v/v)，随后记录质谱。阴性对照物不含有QC或者含有热失活的酶。对于抑制剂研究，样品组成与上述相同，不同之处是加入抑制化合物(5mM苯并咪唑或者2mM 1，10-邻二氮杂菲)。
参考实施例4：鼠QPCT
鼠QC的克隆
使用编码推定的mQC的PubMed核苷酸登记号AK017598设计用于分离mQCd开放读框的引物。所述引物序列如下：有义5′ATATGCATGCATGGCAGGCAGCGAAGACAAGC(SEQ ID No：35)；反义5′ATATAAGCTTTTACAAGTGAAGATATTCCAACACAAAGAC(SEQ IDNo：36)。使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)从鼠胰岛腺瘤细胞系β-TC 3细胞中分离总RNA，通过SuperScriptII(Invitrogen)逆转录。随后，在具有Herculase Enhanced DNA-Polymerase(Stratagene)的50μl反应中在生成产物的1∶12.5稀释液上扩增mQC cDNA，插入PCR Script CAM克隆载体(Stratagene)中，及通过测序核实。使用如下引物扩增编码成熟mQC的cDNA片段：5′ATACTCGAGAAAAGAGCCTGGACGCAGGAGAAG(SEQ IDNo：37)(XhoI，有义)和5′ATATCTAGATTACAAGTGAAGATATTCCAAC(SEQ ID No：38)(XbaI，反义)。将消化的片段连接进载体pPICZαB中，在大肠杆菌中增殖，通过测序有义和反义链核实。最后，使用PmeI将表达质粒线性化，沉淀及在-20℃贮存。
巴斯德毕赤酵母的转化及鼠QC的小规模表达
根据厂商(BioRad)指导，通过电穿孔使用1-2μg质粒DNA转化感受态巴斯德毕赤酵母细胞。在含有100μg/ml Zeocin的平板上进行选择。为了检测重组酵母克隆mQC表达，将重组体在含有2ml BMGY的10ml锥形瓶中生长24小时。之后，对酵母进行离心，并重悬于含有0.5％甲醇的2mlBMMY中。通过每24小时加入一次甲醇使这个浓度保持72小时。随后，确定上清中QC活性。选择展示最高活性的克隆以进行进一步实验和发酵。
鼠QC的大规模表达和纯化
在5L反应器(Biostad B，B.Braun biotech，Melsungen，Germany)中进行mQC表达。在补加微量盐的基础盐培养基pH 5.5中进行发酵。最初，以分批和补料分批阶段用甘油作为唯一碳源积聚生物量大约28小时。根据Invitrogen推荐的三步方式通过补给甲醇起始mQC表达，完整发酵时间为大约65小时。随后，通过分别以6000×g和38000×g离心15分钟和4小时的两次相继的离心步骤从含有mQC的上清中除去细胞和混浊度。为了进行纯化，将发酵肉汤用水稀释至电导率为大约5mS/cm，以逆流方向(15mL/min)施加于用0.05M磷酸盐缓冲液pH 6.4平衡的Streamline SP XL柱(2.5×100cm)中。在以逆流方向用2个柱体积的平衡缓冲液洗涤后，使用含有1.5M NaCl的0.15M Tris缓冲液(pH 7.6)以8mL/min流速正向洗脱蛋白质。集合含有QC的级分，加入硫酸铵至终浓度为1M。所得溶液以4mL/min流速施加于Butyl Sepharose FF柱(1.6x 13cm)。结合的mQC用5个柱体积的含有0.75M硫酸铵的0.05M磷酸盐缓冲液(pH 6.8)洗涤，及用0.05M磷酸盐缓冲液(pH 6.8)以逆流方向洗脱。集合含有mQC的级分，通过用0.025M Tris(pH 7.5)透析过夜以脱盐。之后，加入NaOH将pH调节为8.0，施加于(4.0mL/min)用0.02M Tris(pH 8.1)平衡的Uno Q柱(Bio Rad)。在用平衡缓冲液洗涤后，用含有0.18M NaCl的相同缓冲液洗脱mQC。集合呈现QC活性的级分，加入1M Bis-Tris缓冲液pH 6.0将pH调节为7.4。mQC在4℃稳定直至1个月。为了在长期贮存，加入50％甘油。
实施发明的最好实施方案
实施例1：产生转基因小鼠
转基因小鼠
鼠促甲状腺素释放激素-Aβ融合蛋白mTRH-Aβ(N3E-42)和mTRH(N3Q-42)的生成基本上如别处所述进行(Cynis，H.，et al.Inhibition ofglutaminyl cyclase alters pyroglutamate formation in mammalian cells，BiochimBiophys Acta 1764，1618-1625(2006))。使用标准分子生物学技术将各自cDNA插入含有鼠Thy-1序列的载体pUC18中。鼠QC从胰岛瘤细胞系β-TC3中分离。mQC cDNA克隆进载体pTG-CAG。所有构建体均用测序验证。转基因小鼠通过雄性原核注射受精的C57B16卵母细胞而产生(PNI，由genOway，Lyon，France产生)。注射的卵母细胞然后植入代孕母体以足月发育。所得后代(每个品系3个建立者)经PCR分析进一步鉴定转基因整合并且在与C57B 16野生型小鼠杂交后经RT-PCR鉴定转基因表达(每个品系n＝3-5)。具有最高转基因mRNA表达的品系被选择用于进一步育种和杂交育种实验(命名为tgN3E-42X QC小鼠)。tgN3E-42X QC转基因小鼠表观健康并且不显示神经学异常迹象。tgN3Q-42PNI的3个建立者中仅一个生出后代(tgN3Q-42小鼠模型)。但是，不育建立者中的一个在7个月年龄时在海马CA1层显示神经元丧失及对Aβ(N3pGlu)的神经元免疫反应性，这在其它建立者的后代中也观测到。在这个建立者和其它建立者的后代中观测到相同表型清楚提示观测到的表型不是由于整合作用所致。所有动物均根据德国动物照顾指南进行处理。
DNA构建体的制备
cDNA构建体的质量经在琼脂糖凝胶上电泳一个等份而验证和证实，未观测到降解痕迹。最后，使用消化性BglI，EcoRI，and HindIII限制酶的限制分析产生预期限制图谱。TBA-Tg质粒用EcoRI消化，含有转基因的7170-bp片段从载体骨架中分离。所述7.1kb转基因构建体片段在注射进受精卵母细胞中之前被进一步纯化及稀释。分离的转基因的纯度和浓度经琼脂糖凝胶电泳验证。
PCR基因分型策略
筛选检测转基因的随机整合通过PCR扩增实现。设计了两个PCR(见图7)：
·PCR1设计用于有效检测转基因随机整合事件。选择的引物对允许扩增转基因序列内的短DNA序列，产生特异的505bp PCR产物。
·PCR2设计用于评估转基因整合事件的完整性。选择的引物对允许扩增从启动子的5’区和Thy1基因的3’区延伸的DNA序列，产生特异的6279bp PCR产物。由于Thy1启动子盒衍生自小鼠基因组序列，因此用于研究转基因整合完整性的PCR筛选也导致从内源Thy1基因扩增7413bp的产物。
表1：PCR基因分型tgN3E-42和tgN3Q-42转基因小鼠
  引物名称  引物序列5’-3’  预期PCR大小
  GX3425GX3426   5’-AGTAATGAAGTCACCCAGCAGGGAGG-3’(SEQ ID No：39)5’-TGATCCAGGAATCTAAGGCAGCACC-3’(SEQ ID No：40)   505bp
进行这些测试以监测引物的特异性及PCR反应的灵敏性。一旦建立，则这些PCR条件用于筛选FO代(建立者动物)。
表2：经PCR基因分型tgN3E-42和tgN3Q-42转基因小鼠的方案
  反应混合物   反应步骤   温度/时间   循环
  基因组小鼠DNA   10ng
  引物   2.5pmol   变性   94℃/180s   1x
  dNTP   20μM   变性   94℃/45s   35x
  10x反应缓冲液   1μl   退火   58℃/60s   35x
  MgCl2   2mM   延伸   72℃/60s   35x
  Taq聚合酶   0.5U   完成   72℃/300s   1x
  反应体积   10μl
确定相对转基因拷贝数的方案
表3：确定tgN3E-42和tgN3Q-42转基因小鼠中相对转基因拷贝数的实时PCR
  引物名称   引物序列5’-3’  预期PCR大小
  Aβ3-42-forAβ3-42-rev   5’-TTGAGGAAAGACCTCCAGC-3’(SEQ IDNo：43)5’-CATGAGTCCAATGATTGCACC-3’(SEQ ID No：44)  168bp
等摩尔量的来自分析的转基因动物的染色体DNA用作模板，使用荧光染料SYBR-Green I根据下述方案进行实时PCR：
表4：在tgN3E-42和tgN3Q-42转基因小鼠中的实时PCR的方案
  反应混合物   反应步骤   温度/时间   循环
  基因组DNA   20ng
  引物   15pmol   变性   95℃/600s   1x
  2x反应混合物   12.5μl   变性   94℃/15s   40x
  SYBR-Green I   0.5μl   退火   55℃/30s   40x
  H2O   8μl   延伸   72℃/30s   40x
  反应混合物   反应步骤   温度/时间   循环
  反应体积   25μl   解链曲线   55℃-95℃/30s   1x
表5：用于基因分型表达mQC的转基因小鼠的PCR
  引物名称   引物序列5’-3’  预期PCR大小
  mQC3mQC4   5’-GCCACGGATTCAGCTGTGC-3’(SEQ ID No：41)5’-GAATGTTGGATTTGCTGCTC-3’(SEQ IDNo：42)  302bp
进行这些测试以监测引物的特异性及PCR反应的灵敏性。一旦建立，则这些PCR条件用于筛选FO代(建立者动物)。
表6：用于经PCR基因分型表达mQC的转基因小鼠的方案
  反应混合物   反应步骤
  基因组小鼠DNA   10ng
  引物   10pmol   变性   94℃/180s   1x
  dNTP   20μM   变性   94℃/45s   35x
  10x反应缓冲液   0.1vol   退火   58℃/60s   35x
  MgCl2   2mM   延伸   72℃/60s   35x
  Taq聚合酶   0.5U   完成   72℃/300s   1x
  反应体积   10μl
经RT-PCR量化mRNA的方案
表7：用于量化tgN3E-42和tgN3Q-42转基因小鼠中的mRNA的实时PCR
  引物名称   引物序列5’-3’  预期PCR大小
  Aβ3-42-forAβ3-42-rev   5’-TTGAGGAAAGACCTCCAGC-3’(SEQ ID No：43)5’-CATGAGTCCAATGATTGCACC-3’(SEQ ID No：44)  168bp
将1μg总RNA逆转录并用荧光染料SYBR-Green I根据下述方案进行实时PCR：
表8：用于在tgN3E-42和tgN3Q-42转基因小鼠中进行实时PCR的方案
  反应混合物   反应步骤   温度/时间   循环
  cDNA   1μl(1∶5稀释)
  引物   15pmol   变性   95℃/600s   1x
  2x反应混合物   12.5μl   变性   94℃/15s   40x
  SYBR-Green I   0.5μl   退火   55℃/30s   40x
  H2O   8μl   延伸   72℃/30s   40x
  反应体积   25μl   解链曲线   55℃-95℃/30s   1x
免疫组织化学和组织学
麻醉小鼠并用冰冷的磷酸缓冲盐水(PBS)随后4％低聚甲醛经心脏灌注。小心切下脑样品并在4℃在4％磷酸缓冲的福尔马林中后固定。在4μm石蜡切片上进行免疫组织化学。使用下述抗体：4G8(Aβ17-24，Signet)，GFAP(Chemicon)，Ibal(Waco)，ubiquitin(DAKO)及在第3位具有焦谷氨酸的抗Aβ(Saido，T.C.，et al.Dominant and differential deposition of distinctbeta-amyloid peptide species，Abeta N3(pE)，in senile plaques，Neuron 14，457-466(1995))。生物素化抗兔及抗小鼠第二抗体(1∶200)购自DAKO。用ABC方法使用Vectastain试剂盒(Vector Laboratories)以二氨基联苯胺作为色原显示染色。用苏木精进行复染。对于荧光染色，使用AlexaFluor488和AlexaFluor594缀合的抗体(Molecular Probes)。
对于tgN3E-42小鼠的分析，额外使用了下述抗体用于免疫组织化学鉴定：Aβ/4G8(Acris)，Aβ/6E10(Calbiochem)，Aβ-N3pGlu-42(clone6)，GFAP(DAKO)，NeuN(Chemicon)。生物素化抗兔及抗小鼠第二抗体(1∶250)购自Vector Laboratories。用ABC方法使用Vectastain试剂盒(Vector Laboratories)以二氨基联苯胺作为色原显示染色。对于荧光染色，使用Cy2和Cy3缀合的第二抗体(Dianova)。在荧光免疫染色上进行DAPI核酸染色(MolecularProbes)。
经ELISA量化Aβ(x-42)和Aβ(N3pGlu-42)
脑在冷冻状态下称重并直接在Dounce匀浆机中在2.5ml含有完全蛋白酶抑制剂(Roche)的2％SDS中匀浆。匀浆液超声处理30秒，随后在4℃80000g离心1分钟。取上清并直接在-80℃冷冻。所得沉淀重悬于0.5ml70％甲酸(FA)中并超声处理30秒。甲酸用9.5ml 1M中和，等份直接在-80℃冷冻。对于Aβ(x-42)和Aβ(N3pGlu)ELISA测量以10x稀释度使用甲酸裂解物。对于Aβ(x-42)测量使用10x稀释度甲酸裂解无。对于Aβ(N3pGlu-42)测量使用未稀释FA裂解物。ELISA测量根据厂商方案进行(IBL Co.，Ltd.Japan)。对于统计学分析，累积来自SDS及FA提取的Aβ(x-42)和Aβ(N3pGlu)浓度。
Western印迹分析Aβ(x-42)和Aβ(N3pGlu-42)
用15％脲-PAGE凝胶如别处所述进行N-末端修饰的Aβ肽的电泳分离(Klafki，H.W.，Wiltfang，J.& Staufenbiel，M.(1996)Anal.Biochem.237，24-29)。
蛋白质转移至半干燥条件下的硝基纤维素膜(Roth)。随后，膜用在TB S-T(20mM Tris/HCl；pH 7.5；500mM NaCl，0.05％(v/v)Tween20)中的3％(w/v)奶粉封闭。Aβ肽用单克隆抗Aβ(1-16)抗体6E10(Chemicon)检测。为显色，印迹膜与辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠第二抗体(Cell Signaling)在含有5％(w/v)奶粉的TBS-T中保温，随后用SuperSignal West Pico System(Pierce)根据厂商方案显色。
统计学分析
各组之间的差异用单向方差分析(ANOVA)随后不成对t检验分析。所有数据均以平均值±s.e.m给出。不成对t检验的显著性水平如下给出：***P＜0.001；**P＜0.01；*P＜0.05。存活率经Logrank Test计算。所用计算均用GraphPad Prism version 4.03for Windows(GraphPad Software，San Diego，CA，USA)进行。
实施例2：行为试验
初始筛选：初始筛选采用标准方法以通过观测评估提供行为及功能模式(Rogers D.C.et al.，1997.Behavioral and functional analysis of mousephenotype：SHIRPA，a proposed protocol for comprehensive phenotypeassessment.Mamm Genome，8：711-713)。使用修改的SHIRPA方案在高通量筛选中检查一般健康及可干扰进一步行为测试的特异功能(肌肉及下运动神经元功能，脊髓小脑、感觉、神经精神及自主功能)。
评估从在室笼(home cage)中观察社会行为(“室笼观察”)而开始，然后是单个动物在透明Plexiglas平台中不干扰行为90秒(“个体观察”)。小鼠行为的这个监测随后是一系列小测试以进一步鉴定：听惊跳反射、悬吊行为(hangingbehavior)、视觉置位(visualplacing)、falling行为、翻正反射、姿势反射、负趋地性(negative geotaxis)、吊索(hanging wire)、耳颤搐(ear twitch)、须颤搐(whiskers twitch)和眨眼。最后抓住动物的颈部并检查畸形异常(dysmorphological abnormalities)。为了完成评估，称重动物，然后转移回其室笼。
恐惧条件化：
为研究小鼠中的情境及线索恐惧反射(contextual and cued fearreflexes)，使用商业化计算机控制的“恐惧条件化系统(FCS)”(TSE Systems，Bad Homburg，Germany)。
根据Oliver Stiedl的方案(Stiedl O.et al.，2004Behavioral and autonomicdynamics during contextual fear conditioning in mice.Auton Neurosci.Basicand Clinical 115(1-2)：15-27)选择实验设置。连续两天进行在FCS中的研究并分为3个阶段：
阶段1(训练/条件化试验)：在恒定照明的(～300lx)恐惧条件作用箱内的透明丙烯酸室中进行训练。扬声器提供恒定的白色背景噪音(68db SPL)。停顿270秒后，小鼠被给予听觉信号(cue)(10kHz，75dB SPL)30秒(条件化刺激)。在最后2秒声音给予2秒足底电击(0，7mA，恒定电流；非条件化刺激)。小鼠在电击结束后返回它们的室笼30秒。
阶段2(情境保留)：训练(阶段1)后24小时，动物再次暴露于原始情境并监测行为270秒。
阶段3(音依赖性保留)：在阶段2后1小时在新的情境(类似大小的黑暗丙烯酸箱，由于黑色导致的降低的光强度，平地板代替电击格栅)中测试对条件化刺激(声音)的记忆。在新情境中自由探索270秒后施加与阶段1相同的声音180秒，经FCS自动记录行为。
暗亮箱：
在暗<->亮探索模型中探索活动的自动评估(Crawley J.N.(2007)What′sWrong With My Mouse：Anxiety-Related Behaviors.Wiley，Second Edition，240-241)用PhenoMaster装置(TSE Systems，Bad Homburg，Germany)的暗-亮箱插件进行。插件包括由含有小通道的暗Plexiglas箱不等分分成两个室(室的三分之一和三分之二)的Plexiglas室。较大的室是开放的并光照，而小的室封闭且黑暗。动物逐个置于光照室并允许自由探索2个室10分钟。光电池格栅自动检测小鼠活动(在两个室之间变换次数，每个室中消耗的时间，在每个室中移动的距离)。
学习和记忆分析
Y-迷宫：用三角Y形迷宫评估自发交替率(Spontaneous alternationrates)，所述迷宫从黑色塑料材料构建，臂大小为30cm x 8cm。在20分钟测试期间，每个小鼠随机置于一个臂并允许自由移动通过迷宫(Frenois，F.，Cador，M.，Caille，S.，Stinus，L.& Le Moine，C.(2002)Neural correlates of themotivational and somatic components of naloxone-precipitated morphinewithdrawal.Eur J Neurosci.，16，1377-1389)。交替被定义为相继进入重叠三联体设置(overlapping triplet sets)中的3个臂。一旦小鼠四个爪均进入一个臂时进入被定义为是相继的。交替百分比被计算为实际与可能的交替的比率。为了消除气味线索，迷宫用含有30％乙醇、60％水和10％无味香皂的溶液清洗。
十字迷宫：十字迷宫由黑色塑料材料构成(臂大小：长30.0cm，宽8.0cm，壁高15.0cm)。相邻臂成90°。四个臂从8.0平方厘米的中心空间伸出。因此，动物经中心空间进入臂。在20.0分钟测试期间，每个小鼠最初随机置于一个臂中并允许自由穿过迷宫。各个臂被标记为1-4。交替被定义为在重叠四联体设置上的连续入口处进入4个不同的臂(例如2，3，4，1或4，2，3，1，但非1，2，3，2)。一旦小鼠四个爪均进入一个臂时进入被定义为是相继的。交替百分比被计算为在观察期间实际与总体进行的交替的比率。为了消除气味线索，在每次试验后迷宫用含有30％乙醇、60％水和10％无味香皂的溶液清洗。测试在中等白光条件下进行。更短的测试时间框架即10分钟是可以的。
T-迷宫连续交替任务(continuous alternation task)(T-CAT)：根据Gerlai(Gerlai，R.(1998)A new continuous alternation task in T-maze detectshippocampal dysfunction in mice.A strain comparison and lesion study.BehavBrain Res.，95，91-101)提供的方法使用T迷宫。该装置由黑色塑料材料制成，有黑色地板和闸门(guillotine door)。小鼠测试由一个单节测试组成，其从1个强迫选择(forced-choice)试验开始，随后是14个自由选择试验。(i)强迫选择试验：在第一个试验中，两个目的臂之一通过降下闸门而阻断。在小鼠从起始臂释放后，它会探索迷宫，进入开放臂并返回起始位置。一旦小鼠返回起始臂，立即降下闸门，动物被限制5秒。(ii)自由选择试验：在打开起始臂的门之后，动物自由选择两个目的臂，因为所有闸门都是开放的。一旦小鼠进入一个目的臂，就将另一个目的臂关闭。当小鼠返回起始臂时，在起始臂限制5秒后开始下一个自由选择试验。30分钟后或者14个自由选择试验进行后终止测试session。在认为期间动物从未被拿起，并且实验人员不知道被测试动物的基因型。对每个动物计算交替率，其是将交替选择次数除以总选择次数。在给定时间框架内进行少于8次选择的动物被排除在分析之外。
Morris水迷宫：在典型样式中，小鼠被置于小水池后端首先避免应激，并且面向水池侧以避免偏倚，其含有藏在在水面下几毫米的逃脱平台。视觉线索如着色形状被置于水池周围使动物一目了然。水池通常直径为4-6英尺，深2英尺。水线上的侧壁防止小鼠被实验室活动分散注意力。当被释放时，小鼠在水池中游泳以寻找出口，记录各项参数，包括在水池每个象限耗费的时间，到达平台所需的时间(潜伏期)，及总行走距离。小鼠从水中的逃脱增强了其迅速发现平台的愿望，在后续试验(平台在相同位置)中小鼠能够更快速定位平台。发生这种行为改善是因为小鼠已经学习到隐藏平台的位置与明显的视觉线索相关。在足够练习后，有技能的小鼠可以从任何释放点直接游泳到平台。
运动行为分析
抱紧测试(Clasping Test)：为测试抱紧行为，小鼠吊尾30秒，记录下肢抱紧时间。0秒抱紧被记为0分，1-10秒被记为1分，10-20秒被记为2分，抱紧20秒以上被记为3分(Nguyen，T.，Hamby，A.& Massa，S.M.(2005)Clioquinol down-regulates mutant huntingtin expression in vitro and mitigatespathology in a Huntington′s disease mouse model.Proc Natl Acad Sci U S A.，102，11840-11845)。
足迹分析：为获得足迹，后爪用蓝色无毒墨水标记。将动物置于暗通道(30cm x 7cm直径)的一端，暗通道通向封闭箱。通道地面铺白纸。使动物行走到通道另一端，在这取出它们并放到它们的室笼中。最低2个不停留通过是需要的。步幅长度是通过测量每步之间距离而确定，并计算平均步幅长度(Barlow，C.，Hirotsune，S.，Paylor，R.，Liyanage，M.，Eckhaus，M.，Collins，F.，Shiloh，Y.，Crawley，J.N.，Ried，T.，Tagle，D.& Wynshaw-Boris，A.(1996)Atm-deficient mice：a paradigm of ataxia telangiectasia.Cell.，86，159-171).
平衡木：平衡和一般运动功能用平衡木任务评估。1cm dowel横杆附着在两个超出带垫表面之上44cm的支持柱上。在所述50cm长横杆的每一端附着一9x 15cm逃脱平台。动物被置于横杆中心并释放。每个动物在一天测试中进行3个试验。记录动物停留在横杆上的时间，将所有3个试验所得的距跌落的潜伏时间被平均。如果动物在整个60秒试验中均停留在横杆上或者逃脱到一个平台上，则记录60秒最大时间(Arendash，G.W.，Gordon，M.N.，Diamond，D.M.，Austin，L.A.，Hatcher，J.M.，Jantzen，P.，DiCarlo，G.，Wilcock，D.& Morgan，D.(2001)Behavioral assessment of Alzheimer′stransgenic mice following long-term Abeta vaccination：task specificity andcorrelations between Abeta deposition and spatial memory.DNA Cell Biol.，20，737-744)。
吊绳任务：作为敏捷性和抓握强度的测试，将3mm线绳悬挂在平衡木装置的带垫表面上方35cm处。使动物用它们的前爪抓紧绳子并释放。在一个60秒试验期间使用0-5等级体系评估每个动物在这个任务中的行为表现：0＝不能留在绳上；1＝仅前爪或后爪悬吊；2＝与1一样，但试图爬上绳；3＝坐在绳上并且能够保持平衡；4＝四爪和尾巴绕绳并水平运动；5＝逃脱(Moran，P.M.，Higgins，L.S.，Cordell，B.& Moser，P.C.(1995)Age-relatedlearning deficits in transgenic mice expressing the 751-amino acid isoform ofhuman beta-amyloid precursor protein.Proc Natl Acad Sci U S A，92，5341-5345)。
垂直抓紧悬吊任务(Vertical Grip Hanging Task).通过将动物悬挂在wire bar上(40x 20cm面积，1mm金属丝间隔1cm)而测试动物的神经肌肉异常(平衡和肌肉强度)。在小鼠被置于bar上并头朝下时(高度30cm)，测量60秒内距跌落的潜伏时间(Erbel-Sieler，C.，Dudley，C.，Zhou，Y.，Wu，X.，Estill，S.J.，Han，T.，Diaz-Arrastia，R.，Brunskill，E.W.，Potter，S.S.& McKnight，S.L.(2004)Behavioral and regulatory abnormalities in mice deficient in theNPAS1 and NPAS3 transcription factors.Proc Natl Acad Sci U S A.，101，13648-13653)。
转棒：用加速转棒(TSE-Systems，Germany)测试运动学习和协调。转棒具有3.5cm的轴直径和黑色橡皮表面。每个小鼠进行每日6个试验，连续2天。将小鼠置于平衡木上，脸转离实验者视野。它们在鼓(其围绕垂直轴以增加速度旋转)上需向前运动，被强迫连续调整它们的运动时间。在每个试验开始时，小鼠被置于不活动的鼓上，鼓在360秒试验期间被加速到48rpm的速度。记录动物跌落棒的时间，360秒后截断(Dere，E.，DeSouza-Silva，M.A.，Frisch，C.，Teubner，B.，Sohl，G，Willecke，K.& Huston，J.P.(2003)Connexin30-deficient mice show increased emotionality and decreasedrearing activity in the open-field along with neurochemical changes.Eur JNeurosci.，18，629-638)。用二因素ANOVA(基因型x训练天数)进行分析，随后Bonferroni post hoc检验。
强迫游泳测试：强迫游泳测试与Morris水迷宫中的搜索测试(probetest)相同进行(Spittaels，K.，Van den Haute，C.，Van Dorpe，J.，Bruynseels，K.，Vandezande，K.，Laenen，I.，Geerts，H.，Mercken，M.，Sciot，R.，Van Lommel，A.，Loos，R.& Van Leuven，F.(1999)Prominent axonopathy in the brain and spinalcord of transgenic mice overexpressing four-repeat human tau protein.Am JPathol，155，2153-2165)。简而言之，直径110cm的水池填充20cm高的不透明水并保持在22℃。在一个60秒试验中将小鼠放在水池中央，用计算机自动化追踪系统(VideoMot2，TSE-Systems)测量总游泳距离和游泳速度。
旷场(Open Field)：用旷场测试评估探索行为和运动活动(locomotoractivity)。小鼠用旷场箱进行测试，旷场箱由灰色塑料制成，具有50x 50cm表面积和38cm高的墙壁。通过自动化追踪系统进行监测，该系统配有直立(rearing)指示器，其包括32个红外传感器以监测直立活动(verticalactivity)(VideoMot2，TSE-Systems，Germany)。在5分钟期间记录的行为参数是(i)跑步速度及总行走距离，(ii)在中心部分(20x 20cm)消耗的时间比总时间，(iii)直立事件：动物后腿站立而前腿悬空或靠墙的次数(直立活动的测量)(Dere，E.，De Souza-Silva，M.A.，Frisch，C.，Teubner，B.，Sohl，G，Willecke，K.& Huston，J.P.(2003)Connexin30-deficient mice show increasedemotionality and decreased rearing activity in the open-field along withneurochemical changes.Eur JNeurosci.，18，629-638)。
高架十字迷宫(Elevated Plus-Maze).装置：高架十字迷宫根据Lister(1987)的描述建造。其具有黑色Plexiglas地面，具有5x 5cm中心方平台，从该平台放射出2个具有0.25cm高边缘的45x 5cm开放臂，和2个具有由透明Plexiglas制成的40cm高的壁的45x 5cm封闭臂。沿4个臂的每一个臂的一半画白线，由此测量位置移动(locomotion)。装置在十字胶合板基座上升高到地面上方45cm。装置置于用60瓦红灯泡照明的2x 5m实验室房间中。
程序：小鼠在它们的室笼中被携带进测试房间。所有时间均通过其尾巴根部拿小鼠。将小鼠一次一个置于十字迷宫的中心区面向开放臂。然后使小鼠探索装置5分钟。静静坐在离装置约1m远的观察者记录动物在迷宫上的行为。位于迷宫中心上方150cm的摄像机也记录行为。用LimeLight评分行为。5分钟后，通过尾巴根部手拿而移走小鼠返回其室笼。迷宫然后在各测试之间用70％乙醇溶液清洗并干燥。
记录的行为包括：
1.开放臂进入：动物进入开放臂的频率。小鼠全部4个爪都在臂中计为1次进入。
2.封闭臂进入：动物进入封闭臂的频率。小鼠全部4个爪都在臂中计为1次进入。
3.开放臂停留时间：动物待在开放臂中的时间长度。
4.封闭臂停留时间：动物待在封闭臂中的时间长度。
5.中心区进入：动物全部4个爪进入中心区的频率。
6.中心区停留时间：动物待在中心区中的时间长度。
7.头下探(Head dipping)：动物超过开放臂侧面朝地面低头的频率。
8.Stretch attend姿势：动物向前伸头和肩然后缩回原始位置的频率。
9.直立：动物后腿站立或用前爪靠在迷宫墙壁上的次数。
10.不探索行为(Nonexploratory behaviour)：理毛(Grooming)或小鼠在任何时候均不活动。
11.撒尿：尿积水或条痕数。
12.大便：产生的大便数。
13.位置移动：动物跨过开放臂和封闭臂上的划线的次数。
从这些结果计算每个动物基于总臂进入的开放臂和封闭臂进入的百分比。计算在5分钟测试中停留在开放臂和封闭臂中的时间百分比。避开开放臂的指数(Trullas，R.，& Skolnick，P.1993.Differences in fear motivatedbehaviors among inbred mouse strains.Psychopharmacology，111，323-331)计算为[100-(％在开放臂上的时间+％开放臂进入)\2]。
序列表
<110>前体生物药物股份公司
 
<120>转基因小鼠
 
<130>PBD 00066/WO
 
<150>US 60/971,631
<151>2007-09-12
 
<160>44
 
<170>PatentIn version 3.5
 
<210>1
<211>40
<212>PRT
<213>Artificial sequence
 
<220>
<223>Synthetic peptide
 
<400>1
 
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Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu
            20                  25                  30
Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
        35                  40
 
<210>2
<211>40
<212>PRT
<213>Artificial sequence
 
<220>
<223>Synthetic peptide
 
<400>2
 
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1               5                   10                  15
Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu
            20                  25                  30
Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
        35              40
 
<210>3
<211>38
<212>PRT
<213>Artificial sequence
 
<220>
<223>Synthetic peptide
 
<400>3
 
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1               5                   10                  15
Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu
            20               25               30
Met Val Gly Gly Val Val
        35
 
<210>4
<211>38
<212>PRT
<213>Artificial sequence
 
<220>
<223>Synthetic peptide
 
<400>4
 
Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val
1               5                   10                  15
Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu
            20                  25                  30
Met Val Gly Gly Val Val
        35
 
<210>5
<211>7176
<212>DNA
<213>Artificial sequence
 
<220>
<223>Synthetic nucleotide
 
<400>5
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<210>6
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<212>DNA
<213>Artificial sequence
 
<220>
<223>Synthetic nucleotide
 
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<210>7
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<212>DNA
<213>Artificial sequence
 
<220>
<223>Synthetic nucleotide
 
<400>7
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Met Ala Gly Gly Arg His Arg Arg Val Val Gly Thr Leu His Leu Leu
1               5                   10                  15
Leu Leu Val Ala Ala Leu Pro Trp Ala Ser Arg Gly Val Ser Pro Ser
            20                  25                  30
Ala Ser Ala Trp Pro Glu Glu Lys Asn Tyr His Gln Pro Ala Ile Leu
        35                  40                  45
Asn Ser Ser Ala Leu Arg Gln Ile Ala Glu Gly Thr Ser Ile Ser Glu
    50                  55                  60
Met Trp Gln Asn Asp Leu Gln Pro Leu Leu Ile Glu Arg Tyr Pro Gly
65                  70                  75                  80
Ser Pro Gly Ser Tyr Ala Ala Arg Gln His Ile Met Gln Arg Ile Gln
                85                  90                  95
Arg Leu Gln Ala Asp Trp Val Leu Glu Ile Asp Thr Phe Leu Ser Gln
            100                 105                 110
Thr Pro Tyr Gly Tyr Arg Ser Phe Ser Asn Ile Ile Ser Thr Leu Asn
        115                 120                 125
Pro Thr Ala Lys Arg His Leu Val Leu Ala Cys His Tyr Asp Ser Lys
    130                 135                 140
Tyr Phe Ser His Trp Asn Asn Arg Val Phe Val Gly Ala Thr Asp Ser
145                 150                 155                 160
Ala Val Pro Cys Ala Met Met Leu Glu Leu Ala Arg Ala Leu Asp Lys
                165                 170                 175
Lys Leu Leu Ser Leu Lys Thr Val Ser Asp Ser Lys Pro Asp Leu Ser
            180                 185                 190
Leu Gln Leu Ile Phe Phe Asp Gly Glu Glu Ala Phe Leu His Trp Ser
        195                 200                 205
Pro Gln Asp Ser Leu Tyr Gly Ser Arg His Leu Ala Ala Lys Met Ala
    210                 215                 220
Ser Thr Pro His Pro Pro Gly Ala Arg Gly Thr Ser Gln Leu His Gly
225                 230                 235                 240
Met Asp Leu Leu Val Leu Leu Asp Leu Ile Gly Ala Pro Asn Pro Thr
                245                 250                 255
Phe Pro Asn Phe Phe Pro Asn Ser Ala Arg Trp Phe Glu Arg Leu Gln
            260                 265                 270
Ala Ile Glu His Glu Leu His Glu Leu Gly Leu Leu Lys Asp His Ser
        275                 280                 285
Leu Glu Gly Arg Tyr Phe Gln Asn Tyr Ser Tyr Gly Gly Val Ile Gln
    290                 295                 300
Asp Asp His Ile Pro Phe Leu Arg Arg Gly Val Pro Val Leu His Leu
305                 310                 315                 320
Ile Pro Ser Pro Phe Pro Glu Val Trp His Thr Met Asp Asp Asn Glu
                325                 330                 335
Glu Asn Leu Asp Glu Ser Thr Ile Asp Asn Leu Asn Lys Ile Leu Gln
            340                 345                 350
Val Phe Val Leu Glu Tyr Leu His Leu
        355                 360
 
<210>14
<211>382
<212>PRT
<213>human
 
<400>14
 
Met Arg Ser Gly Gly Arg Gly Arg Pro Arg Leu Arg Leu Gly Glu Arg
1               5                   10                  15
Gly Leu Met Glu Pro Leu Leu Pro Pro Lys Arg Arg Leu Leu Pro Arg
            20                  25                  30
Val Arg Leu Leu Pro Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Gly Ser Ala Phe
        35                  40                  45
Tyr Thr Ile Trp Ser Gly Trp His Arg Arg Thr Glu Glu Leu Pro Leu
    50                  55                  60
Gly Arg Glu Leu Arg Val Pro Leu Ile Gly Ser Leu Pro Glu Ala Arg
65                  70                  75                  80
Leu Arg Arg Val Val Gly Gln Leu Asp Pro Gln Arg Leu Trp Ser Thr
                85                  90                  95
Tyr Leu Arg Pro Leu Leu Val Val Arg Thr Pro Gly Ser Pro Gly Asn
            100                 105                 110
Leu Gln Val Arg Lys Phe Leu Glu Ala Thr Leu Arg Ser Leu Thr Ala
        115                 120                 125
Gly Trp His Val Glu Leu Asp Pro Phe Thr Ala Ser Thr Pro Leu Gly
    130                 135                 140
Pro Val Asp Phe Gly Asn Val Val Ala Thr Leu Asp Pro Arg Ala Ala
145                 150                 155                 160
Arg His Leu Thr Leu Ala Cys His Tyr Asp Ser Lys Leu Phe Pro Pro
                165                 170                 175
Gly Ser Thr Pro Phe Val Gly Ala Thr Asp Ser Ala Val Pro Cys Ala
            180                 185                 190
Leu Leu Leu Glu Leu Ala Gln Ala Leu Asp Leu Glu Leu Ser Arg Ala
        195                 200                 205
Lys Lys Gln Ala Ala Pro Val Thr Leu Gln Leu Leu Phe Leu Asp Gly
    210                 215                 220
Glu Glu Ala Leu Lys Glu Trp Gly Pro Lys Asp Ser Leu Tyr Gly Ser
225                 230                 235                 240
Arg His Leu Ala Gln Leu Met Glu Ser Ile Pro His Ser Pro Gly Pro
                245                 250                 255
Thr Arg Ile Gln Ala Ile Glu Leu Phe Met Leu Leu Asp Leu Leu Gly
            260                 265                 270
Ala Pro Asn Pro Thr Phe Tyr Ser His Phe Pro Arg Thr Val Arg Trp
        275                 280                 285
Phe His Arg Leu Arg Ser Ile Glu Lys Arg Leu His Arg Leu Asn Leu
    290                 295                 300
Leu Gln Ser His Pro Gln Glu Val Met Tyr Phe Gln Pro Gly Glu Pro
305                 310                 315                 320
Phe Gly Ser Val Glu Asp Asp His Ile Pro Phe Leu Arg Arg Gly Val
                325                 330                 335
Pro Val Leu His Leu Ile Ser Thr Pro Phe Pro Ala Val Trp His Thr
            340                 345                 350
Pro Ala Asp Thr Glu Val Asn Leu His Pro Pro Thr Val His Asn Leu
        355                 360                 365
Cys Arg Ile Leu Ala Val Phe Leu Ala Glu Tyr Leu Gly Leu
    370                 375                 380
 
<210>15
<211>364
<212>PRT
<213>human
 
<400>15
 
Met Glu Pro Leu Leu Pro Pro Lys Arg Arg Leu Leu Pro Arg Val Arg
1               5                   10                  15
Leu Leu Pro Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Gly Ser Ala Phe Tyr Thr
            20                  25                  30
Ile Trp Ser Gly Trp His Arg Arg Thr Glu Glu Leu Pro Leu Gly Arg
        35                  40                  45
Glu Leu Arg Val Pro Leu Ile Gly Ser Leu Pro Glu Ala Arg Leu Arg
    50                  55                  60
Arg Val Val Gly Gln Leu Asp Pro Gln Arg Leu Trp Ser Thr Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Leu Leu Val Val Arg Thr Pro Gly Ser Pro Gly Asn Leu Gln
                85                  90                  95
Val Arg Lys Phe Leu Glu Ala Thr Leu Arg Ser Leu Thr Ala Gly Trp
            100                 105                 110
His Val Glu Leu Asp Pro Phe Thr Ala Ser Thr Pro Leu Gly Pro Val
        115                 120                 125
Asp Phe Gly Asn Val Val Ala Thr Leu Asp Pro Arg Ala Ala Arg His
    130                 135                 140
Leu Thr Leu Ala Cys His Tyr Asp Ser Lys Leu Phe Pro Pro Gly Ser
145                 150                 155                 160
Thr Pro Phe Val Gly Ala Thr Asp Ser Ala Val Pro Cys Ala Leu Leu
                165                 170                 175
Leu Glu Leu Ala Gln Ala Leu Asp Leu Glu Leu Ser Arg Ala Lys Lys
            180                 185                 190
Gln Ala Ala Pro Val Thr Leu Gln Leu Leu Phe Leu Asp Gly Glu Glu
        195                 200                 205
Ala Leu Lys Glu Trp Gly Pro Lys Asp Ser Leu Tyr Gly Ser Arg His
    210                 215                 220
Leu Ala Gln Leu Met Glu Ser Ile Pro His Ser Pro Gly Pro Thr Arg
225                 230                 235                 240
Ile Gln Ala Ile Glu Leu Phe Met Leu Leu Asp Leu Leu Gly Ala Pro
                245                 250                 255
Asn Pro Thr Phe Tyr Ser His Phe Pro Arg Thr Val Arg Trp Phe His
            260                 265                 270
Arg Leu Arg Ser Ile Glu Lys Arg Leu His Arg Leu Asn Leu Leu Gln
        275                 280                 285
Ser His Pro Gln Glu Val Met Tyr Phe Gln Pro Gly Glu Pro Phe Gly
    290                 295                 300
Ser Val Glu Asp Asp His Ile Pro Phe Leu Arg Arg Gly Val Pro Val
305                 310                 315                 320
Leu His Leu Ile Ser Thr Pro Phe Pro Ala Val Trp His Thr Pro Ala
                325                 330                 335
Asp Thr Glu Val Asn Leu His Pro Pro Thr Val His Asn Leu Cys Arg
            340                 345                 350
Ile Leu Ala Val Phe Leu Ala Glu Tyr Leu Gly Leu
        355                 360
 
<210>16
<211>382
<212>PRT
<213>Macaca fascicularis
 
<400>16
 
Met Arg Ser Gly Gly Arg Gly Arg Pro Arg Leu Arg Leu Gly Glu Arg
1               5                   10                  15
Gly Val Met Glu Pro Leu Leu Pro Pro Lys Arg Arg Leu Leu Pro Arg
            20                  25                  30
Val Arg Leu Leu Pro Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Gly Ser Ala Phe
        35                  40                  45
Tyr Thr Ile Trp Ser Gly Trp His Arg Arg Thr Glu Glu Leu Pro Leu
    50                  55                  60
Gly Arg Glu Leu Arg Val Pro Leu Ile Gly Ser Leu Pro Glu Ala Arg
65                  70                  75                  80
Leu Arg Arg Val Val Gly Gln Leu Asp Pro Gln Arg Leu Trp Gly Thr
                85                  90                  95
Tyr Leu Arg Pro Leu Leu Val Val Arg Thr Pro Gly Ser Pro Gly Asn
            100                 105                 110
Leu Gln Val Arg Lys Phe Leu Glu Ala Thr Leu Arg Ser Leu Thr Ala
        115                 120                 125
Gly Trp His Val Glu Leu Asp Pro Phe Thr Ala Ser Thr Pro Leu Gly
    130                 135                 140
Pro Val Asp Phe Gly Asn Val Val Ala Thr Leu Asp Pro Gly Ala Ala
145                 150                 155                 160
Arg His Leu Thr Leu Ala Cys His Tyr Asp Ser Lys Leu Phe Pro Pro
                165                 170                 175
Gly Ser Thr Pro Phe Val Gly Ala Thr Asp Ser Ala Val Pro Cys Ala
            180                 185                 190
Leu Leu Leu Glu Leu Ala Gln Ala Leu Asp Leu Glu Leu Ser Arg Ala
        195                 200                 205
Lys Glu Gln Ala Ala Pro Val Thr Leu Gln Leu Leu Phe Leu Asp Gly
    210                 215                 220
Glu Glu Ala Leu Lys Glu Trp Gly Pro Lys Asp Ser Leu Tyr Gly Ser
225                 230                 235                 240
Arg His Leu Ala Gln Leu Met Glu Ser Ile Pro His Ser Pro Gly Pro
                245                 250                 255
Thr Arg Ile Gln Ala Ile Glu Leu Phe Met Leu Leu Asp Leu Leu Gly
            260                 265                 270
Ala Pro Asn Pro Thr Phe Tyr Ser His Phe Pro Arg Thr Val Arg Trp
        275                 280                 285
Phe His Arg Leu Arg Ser Ile Glu Lys Arg Leu His Arg Leu Asn Leu
    290                 295                 300
Leu Gln Ser His Pro Gln Glu Val Met Tyr Phe Gln Pro Gly Glu Pro
305                 310                 315                 320
Phe Gly Ser Val Glu Asp Asp His Ile Pro Phe Leu Arg Arg Gly Val
                325                 330                 335
Pro Val Leu His Leu Ile Ser Thr Pro Phe Pro Ala Val Trp His Thr
            340                 345                 350
Pro Ala Asp Thr Glu Ala Asn Leu His Pro Pro Thr Val His Asn Leu
        355                 360                 365
Ser Arg Ile Leu Ala Val Phe Leu Ala Glu Tyr Leu Gly Leu
    370                 375                 380
<210>17
<211>382
<212>PRT
<213>Macaca mulatta
 
<400>17
 
Met Arg Ser Gly Gly Arg Gly Arg Pro Arg Leu Arg Leu Gly Glu Arg
1               5                   10                  15
Gly Val Met Glu Pro Leu Leu Pro Pro Lys Arg Arg Leu Leu Pro Arg
            20                  25                  30
Val Arg Leu Leu Pro Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Gly Ser Ala Phe
        35                  40                  45
Tyr Thr Ile Trp Ser Gly Trp His Arg Arg Thr Glu Glu Leu Pro Leu
    50                  55                  60
Gly Arg Glu Leu Arg Val Pro Leu Ile Gly Ser Leu Pro Glu Ala Arg
65                  70                  75                  80
Leu Arg Arg Val Val Gly Gln Leu Asp Pro Gln Arg Leu Trp Gly Thr
                85                  90                  95
Tyr Leu Arg Pro Leu Leu Val Val Arg Thr Pro Gly Ser Pro Gly Asn
            100                 105                 110
Leu Gln Val Arg Lys Phe Leu Glu Ala Thr Leu Arg Ser Leu Thr Ala
        115                 120                 125
Gly Trp His Val Glu Leu Asp Pro Phe Thr Ala Ser Thr Pro Leu Gly
    130                 135                 140
Pro Val Asp Phe Gly Asn Val Val Ala Thr Leu Asp Pro Gly Ala Ala
145                 150                 155                 160
Arg His Leu Thr Leu Ala Cys His Tyr Asp Ser Lys Leu Phe Pro Pro
                165                 170                 175
Gly Ser Thr Pro Phe Val Gly Ala Thr Asp Ser Ala Val Pro Cys Ala
            180                 185                 190
Leu Leu Leu Glu Leu Ala Gln Ala Leu Asp Leu Glu Leu Ser Arg Ala
        195                 200                 205
Lys Glu Gln Ala Ala Pro Val Thr Leu Gln Leu Leu Phe Leu Asp Gly
    210                 215                 220
Glu Glu Ala Leu Lys Glu Trp Gly Pro Lys Asp Ser Leu Tyr Gly Ser
225                 230                 235                 240
Arg His Leu Ala Gln Leu Met Glu Ser Ile Pro His Ser Pro Gly Pro
                245                 250                 255
Thr Arg Ile Gln Ala Ile Glu Leu Phe Met Leu Leu Asp Leu Leu Gly
            260                 265                 270
Ala Pro Asn Pro Thr Phe Tyr Ser His Phe Pro Arg Thr Val Arg Trp
        275                 280                 285
Phe His Arg Leu Arg Ser Ile Glu Lys Arg Leu His Arg Leu Asn Leu
    290                 295                 300
Leu Gln Ser His Pro Gln Glu Val Met Tyr Phe Gln Pro Gly Glu Pro
305                 310                 315                 320
Phe Gly Ser Val Glu Asp Asp His Ile Pro Phe Leu Arg Arg Gly Val
                325                 330                 335
Pro Val Leu His Leu Ile Ser Thr Pro Phe Pro Ala Val Trp His Thr
            340                 345                 350
Pro Ala Asp Thr Glu Ala Asn Leu His Pro Pro Thr Val His Asn Leu
        355                 360                 365
Ser Arg Ile Leu Ala Val Phe Leu Ala Glu Tyr Leu Gly Leu
    370                 375                 380
 
<210>18
<211>383
<212>PRT
<213>Canis familiaris
 
<400>18
 
Met Pro Ser Gly Gly Arg Gly Arg Ser Arg Leu Arg Leu Gly Glu Arg
1               5                   10                  15
Gly Leu Leu Glu Pro Pro Ser Pro Pro Lys Arg Arg Leu Leu Pro Arg
            20                  25                  30
Ala His Phe Leu Pro Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ala Ser Ala
        35                  40                  45
Thr Tyr Thr Ile Trp Ser Gly Trp His His Gln Thr Glu Glu Leu Pro
    50                  55                  60
Arg Gly Arg Glu Leu Arg Gly Arg Leu Ile Gly Ser Leu Ser Glu Ala
65                  70                  75                  80
Arg Leu Arg Arg Val Val Gly Gln Leu Asp Pro His Arg Leu Trp Asn
                85                  90                  95
Thr Tyr Leu Arg Pro Leu Leu Val Val Arg Thr Pro Gly Ser Pro Gly
            100                 105                 110
Asn Leu Gln Val Arg Lys Phe Leu Glu Ala Thr Leu Arg Thr Leu Thr
        115                 120                 125
Ala Gly Trp His Val Glu Leu Asp Pro Phe Thr Ala Leu Thr Pro Leu
    130                 135                 140
Gly Pro Leu Asp Phe Gly Asn Val Val Ala Thr Leu Asp Pro Gly Ala
145                 150                 155                 160
Ala Arg His Leu Thr Leu Ala Cys His Tyr Asp Ser Lys Leu Phe Ala
                165                 170                 175
Ser Glu Ser Val Pro Phe Val Gly Ala Thr Asp Ser Ala Val Pro Cys
            180                 185                 190
Ala Leu Leu Leu Glu Leu Ala Gln Ala Leu Asp Arg Glu Leu Ser Arg
        195                 200                 205
Ala Lys Glu Gln Glu Ala Pro Val Thr Leu Gln Leu Leu Phe Leu Asp
    210                 215                 220
Gly Glu Glu Ala Leu Lys Glu Trp Gly Pro Thr Asp Ser Leu Tyr Gly
225                 230                 235                 240
Ser Arg His Leu Ala Gln Leu Met Glu Ser Ala Pro His Ser Pro Gly
                245                 250                 255
Pro Thr Arg Ile Gln Ala Ile Glu Leu Phe Met Leu Leu Asp Leu Leu
            260                 265                 270
Gly Ala Pro Asn Pro Asn Phe Tyr Ser His Phe Pro His Thr Ala Arg
        275                 280                 285
Trp Phe His Arg Leu Arg Ser Ile Glu Lys Arg Leu His Arg Met Asn
    290                 295                 300
Leu Leu Gln Ser His Pro Gln Glu Val Met Tyr Phe Gln Pro Gly Glu
305                 310                 315                 320
Pro Pro Gly Ser Val Glu Asp Asp His Ile Pro Phe Leu Arg Arg Gly
                325                 330                 335
Val Pro Val Leu His Leu Ile Ser Met Pro Phe Pro Ser Val Trp His
            340                 345                 350
Thr Pro Asp Asp Ser Glu Ala Asn Leu His Pro Pro Thr Val His Asn
        355                 360                 365
Leu Ser Arg Ile Leu Ala Val Phe Leu Ala Glu Tyr Leu Gly Leu
    370                 375                 380
 
<210>19
<211>383
<212>PRT
<213>Rattus norvegicus
 
<400>19
 
Met Ser Pro Ala Ser Arg Gly Arg Ser Arg Gln Arg Leu Gly Asp Arg
1               5                   10                  15
Gly Leu Met Lys Pro Pro Ser Leu Ser Lys Arg Arg Leu Leu Pro Arg
            20                  25                  30
Val Gln Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ala Leu Gly Leu Ala
        35                  40                  45
Phe Tyr Ile Val Trp Asn Ser Trp His Pro Gly Val Glu Glu Val Ser
    50                  55                  60
Arg Ser Arg Asp Leu Arg Val Pro Leu Ile Gly Ser Leu Ser Glu Ala
65                  70                  75                  80
Lys Leu Arg Leu Val Val Gly Gln Leu Asp Pro Gln Arg Leu Trp Gly
                85                  90                  95
Thr Phe Leu Arg Pro Leu Leu Ile Val Arg Pro Pro Gly Ser Pro Gly
            100                 105                 110
Asn Leu Gln Val Arg Lys Phe Leu Glu Ala Thr Leu Gln Ser Leu Ser
        115                 120                 125
Ala Gly Trp His Val Glu Leu Asp Pro Phe Thr Ala Ser Thr Pro Leu
    130                 135                 140
Gly Pro Leu Asp Phe Gly Asn Val Val Ala Thr Leu Asp Pro Gly Ala
145                 150                 155                 160
Ala Arg His Leu Thr Leu Ala Cys His Tyr Asp Ser Lys Phe Phe Pro
                165                 170                 175
Pro Gly Leu Pro Pro Phe Val Gly Ala Thr Asp Ser Ala Val Pro Cys
            180                 185                 190
Ala Leu Leu Leu Glu Leu Val Gln Ala Leu Asp Val Met Leu Ser Arg
        195                 200                 205
Ile Lys Gln Gln Ala Ala Pro Val Thr Leu Gln Leu Leu Phe Leu Asp
    210                 215                 220
Gly Glu Glu Ala Leu Lys Glu Trp Gly Pro Lys Asp Ser Leu Tyr Gly
225                 230                 235                 240
Ser Arg His Leu Ala Gln Ile Met Glu Ser Ile Pro His Ser Pro Gly
                245                 250                 255
Pro Thr Arg Ile Gln Ala Ile Glu Leu Phe Val Leu Leu Asp Leu Leu
            260                 265                 270
Gly Ala Pro Ser Pro Ile Phe Phe Ser His Phe Pro Arg Thr Ala Arg
       275                 280                 285
Trp Phe Gln Arg Leu Arg Ser Ile Glu Lys Arg Leu His Arg Leu Asn
    290                 295                 300
Leu Leu Gln Ser His Pro Gln Glu Val Met Tyr Phe Gln Pro Gly Glu
305                 310                 315                 320
Pro Pro Gly Pro Val Glu Asp Asp His Ile Pro Phe Leu Arg Arg Gly
                325                 330                 335
Val Pro Val Leu His Leu Ile Ala Met Pro Phe Pro Ala Val Trp His
            340                 345                 350
Thr Pro Ala Asp Thr Glu Ala Asn Leu His Pro Pro Thr Val His Asn
        355                 360                 365
Leu Ser Arg Ile Leu Ala Val Phe Leu Ala Glu Tyr Leu Gly Leu
    370                 375                 380
 
<210>20
<211>383
<212>PRT
<213>Mus musculus
 
<400>20
 
Met Ser Pro Gly Ser Arg Gly Arg Pro Arg Gln Arg Leu Glu Asp Arg
1               5                   10                  15
Gly Leu Met Lys Pro Pro Ser Leu Ser Lys Arg Arg Leu Leu Pro Arg
            20                  25                  30
Val Gln Phe Leu Pro Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ala Met Gly Leu Ala
        35                  40                  45
Phe Tyr Ile Val Trp Asn Ser Trp His Pro Gly Val Glu Glu Met Ser
    50                  55                  60
Arg Ser Arg Asp Leu Arg Val Pro Leu Ile Gly Ser Leu Ser Glu Ala
65                  70                  75                  80
Lys Leu Arg Leu Val Val Gly Gln Leu Asp Pro Gln Arg Leu Trp Gly
                85                  90                  95
Thr Phe Leu Arg Pro Leu Leu Ile Val Arg Pro Pro Gly Ser Ser Gly
            100                 105                 110
Asn Leu Gln Val Arg Lys Phe Leu Glu Ala Thr Leu Gln Ser Leu Ser
        115                 120                 125
Ala Gly Trp His Val Glu Leu Asp Pro Phe Thr Ala Ser Thr Pro Leu
    130                 135                 140
Gly Pro Leu Asp Phe Gly Asn Val Val Ala Thr Leu Asp Pro Gly Ala
145                 150                 155                 160
Ala Arg His Leu Thr Leu Ala Cys His Tyr Asp Ser Lys Phe Phe Pro
                165                 170                 175
Pro Gly Leu Pro Pro Phe Val Gly Ala Thr Asp Ser Ala Val Pro Cys
            180                 185                 190
Ala Leu Leu Leu Glu Leu Val Gln Ala Leu Asp Ala Met Leu Ser Arg
        195                 200                 205
Ile Lys Gln Gln Ala Ala Pro Val Thr Leu Gln Leu Leu Phe Leu Asp
    210                 215                 220
Gly Glu Glu Ala Leu Lys Glu Trp Gly Pro Lys Asp Ser Leu Tyr Gly
225                 230                 235                 240
Ser Arg His Leu Ala Gln Ile Met Glu Ser Ile Pro His Ser Pro Gly
                245                 250                 255
Pro Thr Arg Ile Gln Ala Ile Glu Leu Phe Val Leu Leu Asp Leu Leu
            260                 265                 270
Gly Ala Ser Ser Pro Ile Phe Phe Ser His Phe Pro Arg Thr Ala Arg
        275                 280                 285
Trp Phe Gln Arg Leu Arg Ser Ile Glu Lys Arg Leu His Arg Leu Asn
    290                 295                 300
Leu Leu Gln Ser His Pro Gln Glu Val Met Tyr Phe Gln Pro Gly Glu
305                 310                 315                 320
Pro Pro Gly Pro Val Glu Asp Asp His Ile Pro Phe Leu Arg Arg Gly
                325                 330                 335
Val Pro Val Leu His Leu Ile Ala Thr Pro Phe Pro Ala Val Trp His
            340                 345                 350
Thr Pro Ala Asp Thr Glu Ala Asn Leu His Pro Pro Thr Val His Asn
        355                 360                 365
Leu Ser Arg Ile Leu Ala Val Phe Leu Ala Glu Tyr Leu Gly Leu
    370                 375                 380
 
<210>21
<211>383
<212>PRT
<213>Bos taurus
 
<400>21
 
Met Pro Ser Gly Gly Arg Gly Arg Pro Arg Leu Gln Val Gly Glu Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Leu Glu Arg Pro Ser Pro Pro Lys Arg Arg Leu Ile Pro Arg
            20                  25                  30
Ala Gln Leu Leu Pro Gln Leu Leu Leu Ala Leu Thr Val Ala Ser Val
        35                  40                  45
Phe Tyr Thr Ile Trp Arg Ile Trp His Ser Gln Thr Glu Glu Leu Pro
    50                  55                  60
Leu Gly Arg Glu Leu Arg Gly Pro Leu Ile Gly Ser Leu Pro Glu Ala
65                  70                  75                  80
Arg Val Arg Arg Val Val Gly Gln Leu Asp Pro His Arg Leu Trp Asn
                85                  90                  95
Thr Phe Leu Arg Pro Leu Leu Val Val Arg Thr Pro Gly Ser Pro Gly
            100                 105                 110
Asn Leu Gln Val Arg Lys Phe Leu Glu Ala Thr Leu Arg Thr Leu Ser
        115                 120                 125
Ala Gly Trp His Ile Glu Leu Asp Ser Phe Thr Ala Ser Thr Pro Val
    130                 135                 140
Gly Pro Leu Asp Phe Ser Asn Val Val Ala Thr Leu Asp Pro Gly Ala
145                 150                 155                 160
Ala Arg His Leu Thr Leu Ala Cys His Tyr Asp Ser Lys Leu Phe Pro
                165                 170                 175
Ser Asp Ser Ala Pro Phe Val Gly Ala Thr Asp Ser Ala Val Pro Cys
            180                 185                 190
Ser Leu Leu Leu Glu Leu Ala Gln Ala Leu Asp Gln Glu Leu Gly Lys
        195                 200                 205
Ala Lys Glu Arg Ala Ala Pro Met Thr Leu Gln Leu Ile Phe Leu Asp
    210                 215                 220
Gly Glu Glu Ala Leu Lys Gln Trp Gly Pro Lys Asp Ser Leu Tyr Gly
225                 230                 235                 240
Ser Arg His Leu Ala Gln Leu Met Glu Ser Thr Pro His Gly Leu Gly
                245                 250                 255
Ser Thr Arg Ile Gln Ala Ile Glu Leu Phe Met Leu Leu Asp Leu Leu
            260                 265                 270
Gly Ala Pro Asn Pro Thr Phe Tyr Ser His Phe Pro Arg Thr Ala Arg
        275                 280                 285
Trp Phe His Arg Leu Arg Ser Ile Glu Lys Arg Leu His Arg Leu Asn
    290                 295                 300
Leu Leu Gln Ser His Pro Trp Glu Val Met Tyr Phe Gln Thr Gly Glu
305                 310                 315                 320
Pro Pro Gly Ser Val Glu Asp Asp His Ile Pro Phe Leu Arg Arg Gly
                325                 330                 335
Val Pro Val Leu His Leu Ile Ala Thr Pro Phe Pro Ser Val Trp His
            340                 345                 350
Thr Ser Asp Asp Ser Glu Ala Asn Leu His Pro Pro Thr Val His Asn
        355                 360                 365
Leu Ser Arg Ile Leu Ala Val Phe Leu Ala Glu Tyr Leu Gly Leu
    370                 375                  380
 
<210>22
<211>481
<212>PRT
<213>human
 
<400>22
 
Val Trp Tyr Arg Phe Gln Gly Lys Ala Ala Met Arg Ser Gly Gly Arg
1               5                   10                  15
Gly Arg Pro Arg Leu Arg Leu Gly Glu Arg Gly Leu Met Glu Pro Leu
            20                  25                  30
Leu Pro Pro Lys Arg Arg Leu Leu Pro Arg Val Arg Leu Leu Pro Leu
        35                  40                  45
Leu Leu Ala Leu Ala Val Gly Ser Ala Phe Tyr Thr Ile Trp Ser Gly
    50                  55                  60
Trp His Arg Arg Thr Glu Glu Leu Pro Leu Gly Arg Glu Leu Arg Val
65                  70                  75                  80
Pro Leu Ile Gly Ser Leu Pro Glu Ala Arg Leu Arg Arg Val Val Gly
                85                  90                  95
Gln Leu Asp Pro Gln Arg Leu Trp Ser Thr Tyr Leu Arg Pro Leu Leu
            100                 105                 110
Val Val Arg Thr Pro Gly Ser Pro Gly Asn Leu Gln Val Arg Lys Phe
        115                 120                 125
Leu Glu Ala Thr Leu Arg Ser Leu Thr Ala Gly Trp His Val Glu Leu
    130                 135                 140
Asp Pro Phe Thr Ala Ser Thr Pro Leu Gly Pro Val Asp Phe Gly Asn
145                 150                 155                 160
Val Val Ala Thr Leu Asp Pro Arg Ala Ala Arg His Leu Thr Leu Ala
                165                 170                 175
Cys His Tyr Asp Ser Lys Leu Phe Pro Pro Gly Ser Thr Pro Phe Val
            180                 185                 190
Gly Ala Thr Asp Ser Ala Val Pro Cys Ala Leu Leu Leu Glu Leu Ala
        195                 200                 205
Gln Ala Leu Asp Leu Glu Leu Ser Arg Ala Lys Lys Gln Ala Ala Pro
    210                 215                 220
Val Thr Leu Gln Leu Leu Phe Leu Asp Gly Glu Glu Ala Leu Lys Glu
225                 230                 235                 240
Trp Gly Pro Lys Asp Ser Leu Tyr Gly Ser Arg His Leu Ala Gln Leu
                245                 250                 255
Met Glu Ser Ile Pro His Ser Pro Gly Pro Thr Arg Ile Gln Ala Ile
            260                 265                 270
Glu Leu Phe Met Leu Leu Asp Leu Leu Gly Ala Pro Asn Pro Thr Phe
        275                 280                 285
Tyr Ser His Phe Pro Arg Thr Val Arg Trp Phe His Arg Leu Arg Ser
    290                 295                 300
Ile Glu Lys Arg Leu His Arg Leu Asn Leu Leu Gln Ser His Pro Gln
305                 310                 315                 320
Glu Val Met Tyr Phe Gln Pro Gly Glu Pro Phe Gly Ser Val Glu Asp
                325                 330                 335
Asp His Ile Pro Phe Leu Arg Arg Gly Val Pro Val Leu His Leu Ile
            340                 345                 350
Ser Thr Pro Phe Pro Ala Val Trp His Thr Pro Ala Asp Thr Glu Val
        355                 360                 365
Asn Leu His Pro Pro Thr Val His Asn Leu Cys Arg Ile Leu Ala Val
    370                 375                 380
Phe Leu Ala Glu Tyr Leu Gly Leu Arg Ala Trp Pro Met Thr Val Glu
385                 390                 395                 400
Arg Thr Val Arg Glu Lys Val Pro Ala Gly Ala Ser Glu Ala Gln Ala
                405                 410                 415
Gly Ser Ala Gly Val Leu Val Cys Pro Phe His Thr Phe Val Ser Leu
            420                 425                 430
Cys Tyr Asn Trp Lys Thr Phe Phe Leu Leu Ile Val Ser Ser Cys His
        435                 440                 445
Pro Ser Arg Thr Gly Lys Arg Pro Leu Trp Asp Asp Ser Gln Arg Asn
    450                 455                 460
Lys Asn Leu Leu Pro Pro Gln Arg Thr Leu Gly Pro Lys Val Cys Arg
465                 470                 475                 480
Asp
 
<210>23
<211>359
<212>PRT
<213>human
 
<400>23
 
Ala Ala Met Arg Ser Gly Gly Arg Gly Arg Pro Arg Leu Arg Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Gly Leu Met Glu Pro Leu Leu Pro Pro Lys Arg Arg Leu Leu
            20                  25                  30
Pro Arg Val Arg Leu Leu Pro Leu Leu Leu Ala Leu Ala Val Gly Ser
        35                  40                  45
Ala Phe Tyr Thr Ile Trp Ser Gly Trp His Arg Arg Thr Glu Glu Leu
    50                  55                  60
Pro Leu Gly Arg Glu Leu Arg Val Pro Leu Ile Gly Ser Leu Pro Glu
65                  70                  75                  80
Ala Arg Leu Arg Arg Val Val Gly Gln Leu Asp Pro Gln Arg Leu Trp
                85                  90                  95
Ser Thr Tyr Leu Arg Pro Leu Leu Val Val Arg Thr Pro Gly Ser Pro
            100                 105                 110
Gly Asn Leu Gln Val Arg Lys Ala Ala Pro Val Thr Leu Gln Leu Leu
        115                 120                 125
Phe Leu Asp Gly Glu Glu Ala Leu Lys Glu Trp Gly Pro Lys Asp Ser
    130                 135                 140
Leu Tyr Gly Ser Arg His Leu Ala Gln Leu Met Glu Ser Ile Pro His
145                 150                 155                 160
Ser Pro Gly Pro Thr Arg Ile Gln Ala Ile Glu Leu Phe Met Leu Leu
                165                 170                 175
Asp Leu Leu Gly Ala Pro Asn Pro Thr Phe Tyr Ser His Phe Pro Arg
            180                 185                 190
Thr Val Arg Trp Phe His Arg Leu Arg Ser Ile Glu Lys Arg Leu His
        195                 200                 205
Arg Leu Asn Leu Leu Gln Ser His Pro Gln Glu Val Met Tyr Phe Gln
    210                 215                 220
Pro Gly Glu Pro Phe Gly Ser Val Glu Asp Asp His Ile Pro Phe Leu
225                 230                 235                 240
Arg Arg Gly Val Pro Val Leu His Leu Ile Ser Thr Pro Phe Pro Ala
                245                 250                 255
Val Trp His Thr Pro Ala Asp Thr Glu Val Asn Leu His Pro Pro Thr
            260                 265                 270
Val His Asn Leu Cys Arg Ile Leu Ala Val Phe Leu Ala Glu Tyr Leu
        275                 280                 285
Gly Leu Arg Ala Trp Pro Met Thr Val Glu Arg Thr Val Arg Glu Lys
    290                 295                 300
Val Pro Ala Gly Ala Ser Glu Ala Gln Ala Gly Ser Ala Gly Val Leu
305                 310                 315                 320
Val Cys Pro Phe His Thr Phe Val Ser Leu Cys Tyr Asn Trp Lys Thr
                325                 330                 335
Phe Phe Leu Leu Ile Val Ser Ser Cys His Pro Ser Arg Thr Gly Lys
            340                 345                 350
Arg Pro Leu Trp Asp Asp Ser
        355
 
<210>24
<211>1086
<212>DNA
<213>human
 
<400>24
atggcaggcg gaagacaccg gcgcgtcgtg ggcaccctcc acctgctgct gctggtggcc     60
gccctgccct gggcatccag gggggtcagt ccgagtgcct cagcctggcc agaggagaag    120
aattaccacc agccagccat tttgaattca tcggctcttc ggcaaattgc agaaggcacc    180
agtatctctg aaatgtggca aaatgactta cagccattgc tgatagagcg atacccggga    240
tcccctggaa gctatgctgc tcgtcagcac atcatgcagc gaattcagag gcttcaggct    300
gactgggtct tggaaataga caccttcttg agtcagacac cctatgggta ccggtctttc    360
tcaaatatca tcagcaccct caatcccact gctaaacgac atttggtcct cgcctgccac    420
tatgactcca agtatttttc ccactggaac aacagagtgt ttgtaggagc cactgattca    480
gccgtgccat gtgcaatgat gttggaactt gctcgtgcct tagacaagaa actcctttcc    540
ttaaagactg tttcagactc caagccagat ttgtcactcc agctgatctt ctttgatggt    600
gaagaggctt ttcttcactg gtctcctcaa gattctctct atgggtctcg acacttagct    660
gcaaagatgg catcgacccc gcacccacct ggagcgagag gcaccagcca actgcatggc    720
atggatttat tggtcttatt ggatttgatt ggagctccaa acccaacgtt tcccaatttt    780
tttccaaact cagccaggtg gttcgaaaga cttcaagcaa ttgaacatga acttcatgaa    840
ttgggtttgc tcaaggatca ctctttggag gggcggtatt tccagaatta cagttatgga    900
ggtgtgattc aggatgacca tattccattt ttaagaagag gtgttccagt tctgcatctg    960
ataccgtctc ctttccctga agtctggcac accatggatg acaatgaaga aaatttggat   1020
gaatcaacca ttgacaatct aaacaaaatc ctacaagtct ttgtgttgga atatcttcat   1080
ttgtaa                                                              1086
 
<210>25
<211>1149
<212>DNA
<213>human
 
<400>25
atgcgttccg ggggccgcgg gcgaccccgc ctgcggctgg gggaacgtgg cctcatggag     60
ccactcttgc cgccgaagcg ccgcctgcta ccgcgggttc ggctcttgcc tctgttgctg    120
gcgctggccg tgggctcggc gttctacacc atttggagcg gctggcaccg caggactgag    180
gagctgccgc tgggccggga gctgcgggtc ccattgatcg gaagcctccc cgaagcccgg    240
ctgcggaggg tggtgggaca actggatcca cagcgtctct ggagcactta tctgcgcccc    300
ctgctggttg tgcgaacccc gggcagcccg ggaaatctcc aagtcagaaa gttcctggag    360
gccacgctgc ggtccctgac agcaggttgg cacgtggagc tggatccctt cacagcctca    420
acacccctgg ggccagtgga ctttggcaat gtggtggcca cactggaccc aagggctgcc    480
cgtcacctca cccttgcctg ccattatgac tcgaagctct tcccacccgg atcgaccccc    540
tttgtagggg ccacggattc ggctgtgccc tgtgccctgc tgctggagct ggcccaagca     600
cttgacctgg agctgagcag ggccaaaaaa caggcagccc cggtgaccct gcaactgctc     660
ttcttggatg gtgaagaggc gctgaaggag tggggaccca aggactccct ttacggttcc     720
cggcacctgg cccagctcat ggagtctata cctcacagcc ccggccccac caggatccag     780
gctattgagc tctttatgct tcttgatctc ctgggagccc ccaatcccac cttctacagc     840
cacttccctc gcacggtccg ctggttccat cggctgagga gcattgagaa gcgtctgcac     900
cgtttgaacc tgctgcagtc tcatccccag gaagtgatgt acttccaacc cggggagccc     960
tttggctctg tggaagacga ccacatcccc ttcctccgca gaggggtacc cgtgctccat    1020
ctcatctcca cgcccttccc tgctgtctgg cacacccctg cggacaccga ggtcaatctc    1080
cacccaccca cggtacacaa cttgtgccgc attctcgctg tgttcctggc tgaatacctg    1140
gggctctag                                                            1149
 
<210>26
<211>1145
<212>DNA
<213>human
 
<400>26
atgcgttccg ggggccgcgg gcgaccccgc ctgcggctgg gggaacgtgg atggagccac     60
tcttgccgcc gaagcgccgc ctgctaccgc gggttcggct cttgcctctg ttgctggcgc    120
tggccgtggg ctcggcgttc tacaccattt ggagcggctg gcaccgcagg actgaggagc    180
tgccgctggg ccgggagctg cgggtcccat tgatcggaag cctccccgaa gcccggctgc    240
ggagggtggt gggacaactg gatccacagc gtctctggag cacttatctg cgccccctgc    300
tggttgtgcg aaccccgggc agcccgggaa atctccaagt cagaaagttc ctggaggcca    360
cgctgcggtc cctgacagca ggttggcacg tggagctgga tcccttcaca gcctcaacac    420
ccctggggcc agtggacttt ggcaatgtgg tggccacact ggacccaagg gctgcccgtc    480
acctcaccct tgcctgccat tatgactcga agctcttccc acccggatcg accccctttg    540
taggggccac ggattcggct gtgccctgtg ccctgctgct ggagctggcc caagcacttg    600
acctggagct gagcagggcc aaaaaacagg cagccccggt gaccctgcaa ctgctcttct    660
tggatggtga agaggcgctg aaggagtggg gacccaagga ctccctttac ggttcccggc    720
acctggccca gctcatggag tctatacctc acagccccgg ccccaccagg atccaggcta    780
ttgagctctt tatgcttctt gatctcctgg gagcccccaa tcccaccttc tacagccact    840
tccctcgcac ggtccgctgg ttccatcggc tgaggagcat tgagaagcgt ctgcaccgtt    900
tgaacctgct gcagtctcat ccccaggaag tgatgtactt ccaacccggg gagccctttg    960
gctctgtgga agacgaccac atccccttcc tccgcagagg ggtacccgtg ctccatctca   1020
tctccacgcc cttccctgct gtctggcaca cccctgcgga caccgaggtc aatctccacc   1080
cacccacggt acacaacttg tgccgcattc tcgctgtgtt cctggctgaa tacctggggc   1140
tctag                                                               1145
 
<210>27
<211>1149
<212>DNA
<213>Macaca fascicularis
 
<400>27
atgcgttccg ggggccgcgg gcggccccgc ctgcggctag gggaacgtgg cgttatggag     60
ccactcttgc ccccgaagcg ccgcctgcta ccgcgggttc ggctcttgcc cctgttgctg    120
gcgctggccg tgggctcggc gttctacacc atttggagcg gctggcaccg caggactgag    180
gagctgccgc tgggccggga gctgcgggtc ccgttgatcg gaagccttcc cgaagcccgg    240
ctgcggaggg tggtgggaca actggaccca cagcgtctct ggggcactta tctgcgcccc    300
ctgctggttg tgcgaacccc aggcagcccg ggaaatctcc aagtcagaaa gttcctggag    360
gccacgctgc ggtccctgac agcaggttgg cacgtggagc tggatccctt cacagcctcg    420
acgcccctgg ggccagtgga ctttggcaat gtggtggcca cgctggaccc gggggctgcc    480
cgtcacctca cccttgcctg ccattatgac tcgaagctct tcccacccgg atcgaccccg    540
tttgtagggg ccacggactc ggctgtgccc tgtgccctgc tgctggagct ggcccaggca    600
cttgacctgg agctgagcag ggccaaagaa caggcagccc cggtgaccct gcaactgctc    660
ttcctggatg gtgaagaggc gctgaaggag tggggaccca aggactccct ttacggttcc    720
cggcacctgg cccagctcat ggagtctata cctcatagcc ccggccccac caggatccag    780
gctattgagc tctttatgct tcttgatctc ctgggagccc ccaatcccac cttctacagc    840
cacttccctc gcacggtccg ctggttccat cggctgagaa gcattgagaa gcgtctgcac    900
cgtttgaacc tgctgcagtc tcatccccag gaagtgatgt acttccaacc cggggagccc    960
ttcggctctg tggaagacga ccacatcccc ttcctccgca gaggggtccc cgtgctccat   1020
ctcatctcta cgcccttccc tgctgtctgg cacacccctg cggacacaga ggccaatctc   1080
cacccgccca cggtacacaa cttaagccgc attctggccg tgttcctggc tgaatacctg   1140
gggctctag                                                           1149
 
<210>28
<211>1149
<212>DNA
<213>Macaca mulatta
 
<400>28
atgcgttccg ggggccgcgg gcggccccgc ctgcggctag gggaacgtgg cgttatggag     60
ccactcttgc ccccgaagcg ccgcctgcta ccgcgggttc ggctcttgcc cctgttgctg    120
gcgctggccg tgggctcggc gttctacacc atttggagcg gctggcaccg caggactgag    180
gagctgccgc tgggccggga gctgcgggtc ccgttgatcg gaagccttcc cgaagcccgg    240
ctgcggaggg tggtgggaca actggaccca cagcgtctct ggggcactta tctgcgcccc    300
ctgctggttg tgcgaacccc aggcagcccg ggaaatctcc aagtcagaaa gttcctggag    360
gccacgctgc ggtccctgac agcaggttgg cacgtggagc tggatccctt cacagcctcg    420
acgcccctgg gcccagtgga ctttggcaat gtggtggcca cgctggaccc gggggctgcc    480
cgtcacctca cccttgcctg ccattatgac tcgaagctct tcccacccgg atcgaccccg    540
tttgtagggg ccacagactc ggctgtgccc tgtgccctgc tgctggagct ggcccaggca    600
cttgacctgg agctgagcag ggccaaagaa caggcagccc cggtgaccct gcaactgctc    660
ttcctggatg gtgaagaggc gctgaaggag tggggaccca aggactccct ttacggttcc    720
cggcacctgg cccagctcat ggagtctata cctcatagcc ccggccccac caggatccag    780
gctattgagc tctttatgct tcttgatctc ctgggagccc ccaatcccac cttctacagc    840
cacttccctc gcacggtccg ctggttccat cggctgagaa gcattgagaa gcgtctgcac    900
cgtttgaacc tgctgcagtc tcatccccag gaagtgatgt acttccaacc cggggagccc    960
tttggctctg tggaagacga ccacatcccc ttcctccgca gaggggtccc cgtgctccat   1020
ctcatctcta cgcccttccc tgctgtctgg cacacccctg cggacacaga ggccaatctc   1080
cacccgccca cggtacacaa cttaagccgc attctggccg tgttcctggc tgaatacctg   1140
gggctctag                                                           1149
 
<210>29
<211>1152
<212>DNA
<213>Canis familiaris
 
<400>29
atgccttccg ggggccgcgg gcggtcccgg ctacggctcg gggaacgtgg cctcttggag     60
ccgccctccc cgcccaagcg ccgcctgctc ccgcgggcgc acttcttgcc tctgcttctg    120
ctggccctgg ccctggcttc ggcgacctac accatctgga gcggctggca ccaccagact    180
gaggagctgc cgcggggccg ggagctgcgg ggccgcttga tcggaagcct ctccgaagcc    240
cggctgcggc gggtggtggg gcaactggac ccacaccgtc tctggaacac ttatctgcgc    300
cccctgctgg ttgtgcggac cccgggcagc cccggcaatc tccaagtcag aaagttcctg    360
gaggctacac tacggacctt gacagcaggc tggcatgtgg aactggaccc cttcacagcc    420
ttgacacccc tggggccact ggactttggc aatgtggtgg ccacgctgga cccaggggct    480
gcccgtcacc tcacccttgc ctgccattat gactccaagc tcttcgcatc tgagtcggtt    540
ccctttgtgg gggcaacaga ttcggctgta ccttgcgccc tgctgctgga gctggctcag    600
gccctcgaca gggagttgag tagggccaag gagcaggaag ccccggtgac tctgcagctg    660
ctctttttgg atggtgaaga agcactgaag gagtggggac ccacagactc cctctatggc    720
tcccggcacc tggcccagct catggagtct gcaccccaca gcccgggccc caccaggatc    780
caggctatcg agctcttcat gctccttgat ctcctgggtg ccccgaatcc aaacttctac    840
agtcacttcc ctcatacagc ccgctggttc catcggctga ggagcatcga gaagcgcctt    900
caccgcatga acctgctgca gtctcatccc caggaagtga tgtacttcca gcccggggag    960
ccccctggtt ctgtggaaga tgaccacatc cccttcctcc gccgaggggt ccctgtgctc   1020
cacctcatct ccatgccctt cccctccgtc tggcacaccc ccgatgactc tgaggccaac   1080
ctgcacccac ccaccgtaca caatctgagc cgcatcctcg ccgtgttcct ggccgaatat   1140
ctggggctct ag                                                       1152
 
<210>30
<211>1152
<212>DNA
<213>Rattus norvegicus
 
<400>30
atgagtccgg ccagccgcgg gcggtctcgg cagcggctcg gggatcgcgg cctcatgaaa     60
ccaccctcac tttccaagcg ccgtcttctg ccgcgggtgc agctcctgcc cctgctgctg    120
ctggcgctgg ccctgggctt ggctttttat atcgtctgga atagctggca ccctggggtt    180
gaggaggtat cacggagccg ggatctgcgg gtcccgctga tcggaagcct ttcagaagcc    240
aagctgcggc ttgtggtagg gcagctggat ccacagcgtc tctggggaac ttttctgcgt    300
cccttgttga ttgtacgacc cccaggtagt cctggcaatc tccaagtgag aaagttcctg    360
gaggctacgt tgcagtccct atcggcaggc tggcacgtgg aactggaccc attcacagcc    420
tcaaccccct tggggccact ggacttcggg aacgtggtgg ccacccttga cccaggagct    480
gcccgtcacc tcaccctcgc ctgccattat gactctaagt tcttccctcc tgggttaccc    540
ccctttgtgg gggccacaga ttcagccgtg ccctgtgccc tgcttctgga gttagtccag    600
gcccttgatg tcatgctgag cagaatcaag cagcaggcag caccagtgac cctgcagctg    660
ctcttcttgg acggggagga ggcactgaag gagtggggac caaaggactc cctctatggt    720
tcccggcacc tagctcagat catggagtct ataccgcaca gccctggccc caccaggatc    780
caggctattg agctctttgt ccttcttgac cttctgggag cgcccagtcc aatcttcttc    840
agtcacttcc cccgcacagc ccgctggttc caacgactgc ggagcatcga gaagcgcctt    900
caccgtctga acctactgca gtctcacccc caggaagtga tgtacttcca acccggggag    960
ccccctggcc ctgtggaaga tgaccacatc cccttccttc gcagaggggt cccggtgctc   1020
cacctcattg cgatgccctt ccctgccgtg tggcacacac ctgctgacac tgaggctaac   1080
ctccacccgc ccacggtgca caacctgagc cgcatcctcg ccgtgttcct ggctgagtac   1140
ctgggtctct ag                                                       1152
 
<210>31
<211>1152
<212>DNA
<213>Mus musculus
 
<400>31
atgagtcccg ggagccgcgg gcggccccgg cagcggctcg aggatcgtgg cctcatgaaa     60
ccaccctcac tttccaagcg ccgtcttctg ccgcgagtgc agttcctgcc cctgctgctg    120
ctggcgctgg ctatgggctt ggctttctat atcgtctgga acagctggca ccctggggtt    180
gaggagatgt cacggagccg ggatctgcgg gtcccgctga tcggaagcct ttcagaagcc    240
aagctgcggc tggtggtagg gcagctggat ccgcagcgtc tctggggaac tttcctgcgt    300
cccttattga ttgtgcgacc cccgggtagt tctggcaatc tccaagtgag aaagttcctg    360
gaggctacgt tgcagtccct gtcggcaggc tggcatgttg aactggaccc attcacggcc    420
tcaaccccct tggggccact ggacttcggg aacgtggtgg ccacacttga cccaggagct    480
gcccgtcacc tcaccctcgc ctgccattat gactctaagt tcttccctcc ggggttgccc    540
ccctttgtgg gggccacaga ttcagctgtg ccctgtgccc tgcttctgga gttggtccag    600
gcccttgatg ccatgctgag cagaatcaag cagcaggcag caccggtgac cctgcagctg    660
cttttcttgg atggggagga ggcactgaag gagtggggac caaaggactc cctctatggc    720
tcccggcacc tagctcagat catggagtct ataccacaca gccctggccc caccaggatc    780
caggctattg agctctttgt cctcctcgac cttctgggag catccagtcc gatcttcttc    840
agtcacttcc ctcgcacagc ccgctggttc cagcgactga ggagcattga gaagcgcctt    900
caccggctga acctactgca gtctcacccc caggaagtga tgtacttcca acccggggag    960
ccccccggcc ctgtggaaga tgaccacatc cccttccttc gcagaggggt cccggtgctc    1020
cacctcattg ccacgccctt ccctgctgtg tggcacacac ctgctgacac cgaggccaac    1080
ctccacccac ccactgtgca taacctgagc cgcatccttg ctgtgttcct ggccgagtac    1140
ctgggactct ag                                                        1152
 
<210>32
<211>1152
<212>DNA
<213>Bos taurus
 
<400>32
atgccttccg ggggccgcgg gcggccccgg ctccaggtcg gggaacgcag ccttttggag     60
cgaccctcac cgcccaagcg ccgcctgata ccgcgggcac agctgttgcc ccagctgctg    120
ctggctctga cggtagcctc ggtgttctat accatttgga ggatctggca tagccagact    180
gaagagctac cgctggggcg ggagctgcgg ggccctttga tcggaagcct ccccgaagct    240
cgggtgcgga gggtagtggg gcaactggac cctcaccgtc tctggaacac tttcctgcgc    300
cctctgctgg ttgtacggac tccgggcagc ccgggcaatc tccaagtgag aaagttcctg    360
gaggctacgc tgcggacact ttcagcaggc tggcatatag aactcgactc cttcactgcc    420
tccacacccg tggggccatt ggacttcagc aatgtggtgg ccacgctgga cccaggggct    480
gcccgccacc ttacccttgc ctgccattat gactccaagc tcttcccatc tgactcagcc    540
ccctttgtgg gggccacgga ttcggcagtg ccttgctccc tgctactgga gctggcccaa    600
gcccttgacc aggagctggg caaagccaag gagagggcag cgccaatgac cttgcagctg    660
atcttcctgg atggtgaaga ggcactgaag cagtggggac ccaaggactc gctttatggc    720
tcccggcacc tggcccagct catggagtct acaccccacg gcctgggctc caccaggatc    780
caggctattg agctctttat gcttcttgat ctcctgggag cccccaaccc gaccttctac    840
agtcacttcc ctcgcacggc ccgctggttc catcggctca ggagcattga gaagcgcctg    900
caccgtctga acctcctgca gtctcatcct tgggaagtga tgtacttcca gaccggggag    960
ccccccggct ccgtggaaga cgaccacatc ccgttcctcc gccgaggagt tcccgtgctc   1020
cacctcatcg ccacaccctt cccctctgtc tggcacacgt ccgatgactc cgaggccaac   1080
ctgcacccac ccacggtaca caacctgagc cgcatcctgg ccgtgttcct ggctgagtac   1140
ctggggctct ag                                                       1152
 
<210>33
<211>1457
<212>DNA
<213>human
 
<400>33
gtctggtaca ggtttcaggg caaagcggcc atgcgttccg ggggccgcgg gcgaccccgc     60
ctgcggctgg gggaacgtgg cctcatggag ccactcttgc cgccgaagcg ccgcctgcta    120
ccgcgggttc ggctcttgcc tctgttgctg gcgctggccg tgggctcggc gttctacacc    180
atttggagcg gctggcaccg caggactgag gagctgccgc tgggccggga gctgcgggtc    240
ccattgatcg gaagcctccc cgaagcccgg ctgcggaggg tggtgggaca actggatcca    300
cagcgtctct ggagcactta tctgcgcccc ctgctggttg tgcgaacccc gggcagcccg    360
ggaaatctcc aagtcagaaa gttcctggag gccacgctgc ggtccctgac agcaggttgg    420
cacgtggagc tggatccctt cacagcctca acacccctgg ggccagtgga ctttggcaat    480
gtggtggcca cactggaccc aagggctgcc cgtcacctca cccttgcctg ccattatgac    540
tcgaagctct tcccacccgg atcgaccccc tttgtagggg ccacggattc ggctgtgccc    600
tgtgccctgc tgctggagct ggcccaagca cttgacctgg agctgagcag ggccaaaaaa    660
caggcagccc cggtgaccct gcaactgctc ttcttggatg gtgaagaggc gctgaaggag    720
tggggaccca aggactccct ttacggttcc cggcacctgg cccagctcat ggagtctata    780
cctcacagcc ccggccccac caggatccag gctattgagc tctttatgct tcttgatctc    840
ctgggagccc ccaatcccac cttctacagc cacttccctc gcacggtccg ctggttccat    900
cggctgagga gcattgagaa gcgtctgcac cgtttgaacc tgctgcagtc tcatccccag    960
gaagtgatgt acttccaacc cggggagccc tttggctctg tggaagacga ccacatcccc   1020
ttcctccgca gaggggtacc cgtgctccat ctcatctcca cgcccttccc tgctgtctgg   1080
cacacccctg cggacaccga ggtcaatctc cacccaccca cggtacacaa cttgtgccgc   1140
attctcgctg tgttcctggc tgaatacctg gggctctagc gtgcttggcc aatgactgtg   1200
gagaggactg tgagagagaa ggtcccagcg ggggccagtg aagctcaggc aggatctgcc   1260
tagggtgtgc tggtttgtcc ttttcatacc tttgtctcct aattgtgcta caattggaag   1320
accttctttc ttttgattgt ctcaagctgc cacccttcaa ggacagggaa gagaccactg   1380
tgggatgaca gccagaggaa taagaacttg ctccctcccc agaggtaaac acttggtcca   1440
aaggtttgca gggacca                                                  1457
 
<210>34
<211>1088
<212>DNA
<213>human
 
<400>34
agcggccatg cgttccgggg gccgcgggcg accccgcctg cggctggggg aacgtggcct     60
catggagcca ctcttgccgc cgaagcgccg cctgctaccg cgggttcggc tcttgcctct    120
gttgctggcg ctggccgtgg gctcggcgtt ctacaccatt tggagcggct ggcaccgcag    180
gactgaggag ctgccgctgg gccgggagct gcgggtccca ttgatcggaa gcctccccga    240
agcccggctg cggagggtgg tgggacaact ggatccacag cgtctctgga gcacttatct    300
gcgccccctg ctggttgtgc gaaccccggg cagcccggga aatctccaag tcagaaaggc    360
agccccggtg accctgcaac tgctcttctt ggatggtgaa gaggcgctga aggagtgggg    420
acccaaggac tccctttacg gttcccggca cctggcccag ctcatggagt ctatacctca    480
cagccccggc cccaccagga tccaggctat tgagctcttt atgcttcttg atctcctggg    540
agcccccaat cccaccttct acagccactt ccctcgcacg gtccgctggt tccatcggct    600
gaggagcatt gagaagcgtc tgcaccgttt gaacctgctg cagtctcatc cccaggaagt    660
gatgtacttc caacccgggg agccctttgg ctctgtggaa gacgaccaca tccccttcct    720
ccgcagaggg gtacccgtgc tccatctcat ctccacgccc ttccctgctg tctggcacac    780
ccctgcggac accgaggtca atctccaccc acccacggta cacaacttgt gccgcattct    840
cgctgtgttc ctggctgaat acctggggct ctagcgtgct tggccaatga ctgtggagag     900
gactgtgaga gagaaggtcc cagcgggggc cagtgaagct caggcaggat ctgcctaggg     960
tgtgctggtt tgtccttttc atacctttgt ctcctaattg tgctacaatt ggaagacctt    1020
ctttcttttg attgtctcaa gctgccaccc ttcaaggaca gggaagagac cactgtggga    1080
tgacagcc                                                             1088
 
<210>35
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial sequence
 
<220>
<223>DNA Primer
 
<400>35
atatgcatgc atggcaggca gcgaagacaa gc                        32
 
<210>36
<211>40
<212>DNA
<213>Artificial sequence
 
<220>
<223>DNA Primer
 
<400>36
atataagctt ttacaagtga agatattcca acacaaagac                40
 
<210>37
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial sequence
 
<220>
<223>DNA Primer
 
<400>37
atactcgaga aaagagcctg gacgcaggag aag                       33
 
<210>38
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial sequence
 
<220>
<223>DNA Primer
 
<400>38
atatctagat tacaagtgaa gatattccaa c                         31
 
<210>39
<211>26
<212>DNA
<213>Artificial sequence
 
<220>
<223>PCR primer
 
<400>39
agtaatgaag tcacccagca gggagg                               26
 
<210>40
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial sequence
 
<220>
<223>PCR primer
 
<400>40
tgatccagga atctaaggca gcacc                     25
 
<210>41
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial sequence
 
<220>
<223>PCR primer
 
<400>41
gccacggatt cagctgtgc                            19
 
<210>42
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial sequence
 
<220>
<223>Synthetic peptide
 
<400>42
gaatgttgga tttgctgctc                           20
 
<210>43
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial sequence
 
<220>
<223>Synthetic nucleotide
 
<400>43
ttgaggaaag acctccagc                            19
 
<210>44
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial sequence
 
<220>
<223>Synthetic nucleotide
 
<400>44
catgagtcca atgattgcac c                         21

Claims (37)

1.过表达Aβ肽的转基因非人动物，其包含含有编码Aβ肽的DNA转基因的细胞。
2.权利要求1的转基因非人动物，其中所述动物对于所述转基因是杂合的。
3.权利要求1的转基因非人动物，其中所述动物对于所述转基因是纯合的。
4.权利要求1-3任一项的转基因非人动物，其中所述动物是小鼠。
5.权利要求1-4任一项的转基因非人动物，其中所述转基因是鼠来源的。
6.权利要求1-4任一项的转基因非人动物，其中所述转基因是人来源的。
7.权利要求1-6任一项的转基因非人动物，其中所述转基因是重组基因。
8.权利要求7的转基因非人动物，其中所述重组基因编码嵌合或人源化多肽。
9.权利要求1-8任一项的转基因非人动物，其中所述转基因编码AβN3E-42(SEQ ID No：1)、AβN3Q-42(SEQ ID No：2)、AβN3E-40(SEQ IDNo：3)和AβN3Q-40(SEQ ID No：4)中的至少一个。
10.权利要求1-8任一项的转基因非人动物，其中所述转基因编码AβN3E-42(SEQ ID No：1)和AβN3Q-42(SEQ ID No：2)中的至少一个。
11.权利要求1-10任一项的转基因非人动物，其中所述转基因与组织特异性启动子可操纵地连接。
12.权利要求1-11任一项的转基因非人动物，其另外包含含有编码谷氨酰胺酰环化酶或者谷氨酰胺酰-肽环转移酶样蛋白的DNA转基因的细胞。
13.权利要求12的转基因非人动物，其中所述谷氨酰胺酰环化酶或者谷氨酰胺酰-肽环转移酶样蛋白质选自人isoQC(SEQ ID No：14或15)、小鼠(SEQ ID No：20)、Macaca fascicularis(SEQ ID No：16)、Macaca mulatta(SEQID No：17)、猫(SEQ ID No：18)、大鼠(SEQ ID No：19)、牛(SEQ ID No：21)，或其具有至少50％/75％序列相同性/相似性的类似物。
14.权利要求12或13的转基因非人动物，其中所述谷氨酰胺酰环化酶或者谷氨酰胺酰-肽环转移酶样蛋白质是SEQ.ID No：13-15、22或23所示人QC或isoQC、大鼠QC(SEQ.ID No：19)或者小鼠(SEQ.ID No：20)的同种型或者剪接型。
15.权利要求12-14任一项的转基因非人动物，其中所述谷氨酰胺酰环化酶或者谷氨酰胺酰-肽环转移酶样蛋白质是SEQ.ID No：13或SEQ.ID No：20之一。
16.筛选抑制或促进Aβ肽体内作用的生物活性物质的方法，包括：
a)将测试物质给予权利要求1-15任一项的非人动物，和
b)确定所述物质对于产生的Aβ肽作用的作用。
20.权利要求16-19任一项的方法，其中所述转基因是鼠来源的。
21.权利要求16-19任一项的方法，其中所述转基因是人来源的。
22.权利要求16-21任一项的方法，其中所述转基因是重组基因。
23.权利要求22的方法，其中所述重组转基因编码嵌合或人源化多肽。
24.权利要求16-23任一项的方法，其中所述转基因编码AβN3E-42(SEQ ID No：1)、AβN3Q-42(SEQ ID No：2)、AβN3E-40(SEQ ID No：3)和/或AβN3Q-40(SEQ ID No：4)。
25.权利要求16-24任一项的方法，其中所述转基因编码AβN3E-42(SEQ ID No：1)和/或AβN3Q-42(SEQ ID No：2)。
26.衍生自权利要求1-15任一项的转基因非人动物的细胞或细胞系。
27.转基因小鼠，其包含编码Aβ肽的转基因核苷酸序列，所述转基因核苷酸序列与启动子可操纵地连接，整合进小鼠基因组中，其中所述小鼠表现出可以用Aβ肽作用的Aβ肽抑制剂逆转或减轻的表型。
28.权利要求27的小鼠，其中所述小鼠过表达Aβ肽。
29.权利要求27或28的小鼠，其中所述小鼠对于Aβ肽是杂合的。
30.权利要求27或28的小鼠，其中所述小鼠对于Aβ肽是纯合的。
31.权利要求27或28的小鼠，其中所述转基因序列编码鼠Aβ肽。
32.权利要求27或28的小鼠，其中所述转基因序列编码人Aβ肽。
33.权利要求27-32任一项的小鼠，其中所述转基因编码AβN3E-42(SEQ ID No：1)、AβN3Q-42(SEQ ID No：2)、AβN3E-40(SEQ ID No：3)和/或AβN3Q-40(SEQ ID No：4)。
34.权利要求27-33任一项的小鼠，其中所述转基因编码AβN3E-42(SEQ ID No：1)和/或AβN3Q-42(SEQ ID No：2)。
35.筛选抑制或促进Aβ肽作用的治疗剂的方法，包括：
a)将测试物质给予权利要求27-34任一项的转基因小鼠，
b)评估所述测试物质对于小鼠神经学表型的作用，和
c)选择抑制或促进Aβ肽作用的测试物质。
36.治疗或预防Aβ肽相关疾病的方法，包括：
a)给予权利要求35的选择的测试物质，和
b)监测患者的Aβ肽相关疾病的临床指标的降低。
37.权利要求36的方法，其中所述Aβ肽相关疾病是阿尔茨海默病。
38.包含权利要求36的选择的测试物质的药物组合物。
39.权利要求36的选择的测试物质在制备治疗和/或预防Aβ肽相关疾病的药物中的应用。
40.筛选受Aβ肽产生影响的靶化合物的方法，所述方法包括使用权利要求1-15任一项的转基因非人动物或者权利要求27-34任一项的转基因小鼠评估Aβ肽在体内对于可能的靶化合物的作用。
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